Verso il futuro con l’ingegneria genetica

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1. Mantenere le cellule competenti di E.coli Ampicillina sensibili in ghiaccio, per un paio di minuti, prima dell’aggiunta del DNA plasmidico.

Per ogni trasformazione batterica usare 50μl di cellule competenti.

2. Aggiungere 50 ng di DNA plasmidico (pGEX-KT con resistenza all’ampicillina) alle cellule e incubare in ghiaccio per 30min. Effettuare un controllo negativo senza aggiungere DNA plasmidico ai 50 μl di cellule.

3. Incubare le cellule a 42 °C per 40sec (shock termico) per far in modo di dilatare i pori della membrana e facilitare l’entrata del DNA plasmidico nella cellula batterica.

 

4. Incubare le cellule in ghiaccio per 2min in modo tale da richiudere i pori della membrana.

 

5. Aggiungere alle cellule batteriche 250 μl di LB fresco(senza antibiotico) e incubare in agitazione a 37 °C per 40min. Si fanno crescere le cellule su un terreno normale. Si effettua l’incubazione a 37 °C per 40min perché serve alle cellule per riprendersi dopo lo shock termico, iniziare un ciclo di replicazione e permettere l’espressione del gene per la resistenza all’ampicillina

 

6. Allestire delle piastre con il terreno LB agarizzato contenente

50g/mL di ampicillina.

Mettere in piastra di LBagar+AMP volumidifferenti di sospensione cellulare e cioè:- 5 μl di cellule trasformate- 10 μl di cellule trasformate - 50 μl di cellule trasformate - 100 μl di cellule trasformatePiastrare anche:- 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su

piastre LBagar+AMP(controllo negativo) - 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su

piastre LB agar (controllo positivo: in assenza di ampicillina si verifica la crescita di E.coli e si valuta la qualità delle cellule competenti.

7. Distribuire le cellule sulla superficie del terreno usando una spatola sterile ad L.

8. Incubare a 37°C per 24 ore. 9. Osservare le piastre delle cellule

trasformate seminate in LB agar + Amp e contare le colonie per poter calcolare l’efficienza di trasformazione. Osservare le piastre dei controlli.