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Hematologia

Marcos K. FleuryLaboratório de HemoglobinasFaculdade de Farmácia - UFRJ

mkfleury@ufrj.br

• Coleta com anticoagulante adequado.

• Identificação do paciente.

• Rotulagem prévia dos frascos de coleta.

• Posição do paciente – sentado ou deitado.

• Imobilização correta de crianças.

• Uso de luvas durante a coleta.

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• Coleta de material preferencialmente da fossa antecubital (cubital mediana,

cefálica ou basílica).

• Desinfecção da pele com etanol a 70%.

• O garroteamento deve se estender por, no máximo, 1 minuto.

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• Coleta a vácuo ou com seringa.

(0,9 mm e 0,8 mm para adultos e 0,7 mm e

0,6 mm para as crianças).

• Pressão negativa mínima.

• Liberar o garrote antes de retirar a agulha.

• Pressionar o local da punção com o braço esticado.

• Homogeneizar o material por inversão (4 ou 5 vezes) .

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• Quando se usa uma sequência de tubos o anticoagulante de um pode

contaminar o subsequente.

Heparina – interfere nos testes de coagulação.

EDTA – interfere na dosagem de cálcio.

Fluoreto de sódio – interfere nos testes hematológicos.

• Não coletar sangue acima de local de infusão venosa.

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• Sequência recomendada (CLSI, 1998)

Tubos para hemocultura.

Tubos secos (soro)

Tubo com citrato de sódio.

Tubos com gel separador / tubos secos.

Tubos com heparina.

Tubos com EDTA

Tubos com fluoreto de sódio.

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Sangue capilar

• Preferencialmente colhido da superfície plantar do calcanhar em bebês ou

crianças até dois anos.

• Em crianças maiores ou adultos a coleta deve ser feita na superfície

palmar das falanges distais dos dedos.

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Sangue capilar

• O dedo médio ou o anular são os preferidos.

• Em adultos a picada deve ultrapassar 1,5 mm de profundidade .

• Lancetas mais curtas devem ser usadas em RN e prematuros.

• A primeira gota de sangue deve ser desprezada.

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Sangue de cordão umbilical

• Coleta com seringa e agulha.

• Limpeza do sangue da superfície.

• Evitar a “ordenha” para não contaminar o material com a geléia de Wharton

(hemaglutinação).

• Os parâmetros hematológicos são

diferentes do sangue venoso de RN.

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Anticoagulantes e contêineres.

• Anticoagulante de escolha – K2EDTA, K3EDTA e o Na2EDTA.

• K2EDTA seco ou em solução, em concentração final de 1,5 a 2,2 mg/ml

(ICSH) .

• Evitar o excesso de EDTA → morfologia e eritrócitos.

• K3EDTA causa desidratação dos eritrócitos.

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Padronização dos procedimentos.

• Toda amostra é considerada como potencialmente infectante.

• Uso de luvas pelo coletador em qualquer circunstância.

• As luvas devem ser trocadas a cada paciente.

• O sistema a vácuo é preferível ao de seringas.

• Se a transferência de material for necessária, não retirar a tampa do tubo.

• O tubo não deve ser segurado com a mão durante a transferência.

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Ferimentos com agulhas

• Hepatite B – pacientes Hbe-positivo de 7 a 30%.

• Hepatite C – Frequência de transmissão de 0 a 10%.

• HIV – Frequência de transmissão é de 0,46%.

• Outras infecções – malária, criptococose, tuberculose, febre hemorrágica

viral e dengue.

Vacina anti-HBV.

Profilaxia anti-retroviral (HIV).

Interferon (hepatite C).

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2. Preparo da distensão de sangue

Amostra

• Pode ser feita com sangue sem anticoagulante venoso ou capilar, ou com

EDTA.

• O EDTA impede a agregação plaquetária – distribuição homogênea.

• Sangue capilar apresenta grumos plaquetários.

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2. Preparo da distensão de sangue

Amostra

• Distensões sem anticoagulantes são isentas de artefatos .

• Boa Prática – Anotar hora da coleta e hora da confecção da lâmina.

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2. Preparo da distensão de sangue• Lâminas limpas desengorduradas e não devem ser porosas – coloração de

fundo

• Uso de luvas.

• A rolha do tubo não deve ser usada como

conta-gotas.

• O sangue deve ser manipulado com um

capilar.

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2. Preparo da distensão de sangue

Bain B, 4ª Ed. 2007

Colocação de uma gota de sangue na extremidade da lâmina

Ângulo de 25o a 30o aplicado na frente da gota.

Movimento suave e uniforme.

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2. Preparo da distensão de sangue

• Amostras mais viscosas (hematócrito alto) necessitam de um ângulo mais

agudo para uma película mais fina.

• Amostras menos viscosas (mais anêmicas) o ângulo da distensora deverá

ser mais obtuso.

• A técnica deve produzir uma película de sangue com uma cauda reta.

• A distensora deve ser limpa após cada utilização.

• Identificação correta do material.

• A secagem deve ser rápida.

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Área mais fina Área mais grossa

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3. Coloração

• Vários corantes estão disponíveis Wright, Giemsa, May- Grünwald.

• Todos estão baseados no método de Romanowsky (eosina + azul de

metileno).

• Os azures conferem aos ácidos nucléicos , às nucleoproteínas e ao

grânulos basófilos a coloração azul.

• A eosina confere a cor laranja à hemoglobina, aos grânulos eosinofílicos e

combinado á proteínas confere um gradiente de tons de azul a várias

estruturas.

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3. Coloração• A coloração deve ser feita em pH correto.

• pH muito baixo → leucócitos pálidos com grânulos vermelhos.

• pH alto → impregnação de corante básico, impede a visualização de

policromatofilia, os grânulos eosinófilos ficam acinzentados.

• O pH ideal deve estar entre 6,4 e 7,2.

• Os corantes devem ser filtrados .

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3. ColoraçãoComponentes celulares Cor

Cromatina (incluindo Howell-Jolly) Púrpura

Grânulos promielocíticos e bastonete de Auer Vermelho –púrpura

Citoplasma de linfócitos Azul

Citoplasma de monócitos Azul-acinzentado

Citoplasma rico em RNA Azul escuro

Corpos de Döhle Azul-acinzentado

Grânulos de neutrófilos e linfócitos Púrpura claro ou roxo

Grânulos basofílicos Azul ou negro

Grânulos eosinofílicos Laranja

Eritrócitos Rosado

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Hematologia Básica

Sistema Hematopoético

Baço

FígadoRins

Sangue Medula Óssea

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Stem Cell

Stem Cells Mielóide Stem Cell Linfóide

Progenitores Unipotentes

BasófilosEosinófilosNeutrófilosMonócitos

Linfócitos

EritrócitosPlaquetas

Hematologia Básica

Componentes celulares

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• PlasmaMecanismo de transporte

• 90-92% água.

• 6-7% proteínas

• 2-3%

– Gorduras

– Carbo-hidratos (glicose)

– Eletrólitos

– Gases (O2, CO2)

– Mensageiros químicos

Hematologia Básica

Proteínas7%

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Hematologia Básica

• Hemácias

• Hemoglobina – Molécula transportadora de O2

– Composta de 4 subunidades:

» Globina (1 molécula de O2)

» Heme (ferro)

– Totalmente saturada = 4 subunidades de globina com O2

» cada grama de hemoglobina = 1,34 ml O2

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Hem

ácia

s :

45

%P

lasm

a: 5

4%

Hem

atócrito

Hematologia Básica

• Produção de eritrócitos

– Eritropoese

• Eritropoietina

– Análise laboratorial das hemácias

• Contagem de hemácias

• Hematócrito

• Hemoglobina

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• Leucócitos

– Leucometria

• Normal 5,0 a 9,0 x 109/l

– Leucopoese

• Granulócitos– Neutrófilos– Basófilos– Eosinófilos

• Monócitos• Linfócitos

Hematologia Básica

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Hematologia Básica

• Leucócitos

• Marginação

• Fagocitose

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Hematologia Básica

• Leucócitos

- Imunidade

• Linfócitos T – imunidade celular

• Linfócitos B – imunidade humoral

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Imunidade humoral

• Um macrófago fagocita um determinado antígeno e processa-o. O determinante antigênico liga-se a uma proteína e é apresentado à superfície do macrófago;

• O determinante antigênico é reconhecido linfócitos T auxiliares;

• O clone de linfócitos B é ativado e sofre multiplicação;

• Os linfócitos B diferenciam-se em plasmócitos (produzem anticorpos) e em células de memória (atuam na segunda resposta imunitária);

• Os anticorpos interagem com o antígeno e levam à sua destruição;

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Imunidade celular

• Os determinantes antigênicos são reconhecidos pelos linfócitos T auxiliares;

• Os linfócitos T auxiliares diferenciam-se em linfócitos T citotóxicos e linfócitos T de memória. Liberam mediadores químicos que estimulam a fagocitose, a produção de interferon e a produção de anticorpos pelos linfócitos B;

• Os linfócitos T citotóxicos ligam-se às células estranhas e libertam perforina (proteína que provoca a lise celular);

• Os linfócitos T de memória desencadeiam uma resposta mais rápida e vigorosa num segundo contato com o mesmo antígeno.

Hematologia Básica

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Ag 1ª Exposição

Macrófagos

Células apresentadorasde antígeno

Linfócitos THelper

Linfócitos B Linfócitos Tcitotóxicos

Plasmócitos

Anticorpos

Células Bde memória

Linfócitos TCitotóxicos

ativos

Ativação

direta

Ag presentes em células

Infectadas ativam diretamente

Ag 2ª Exposição

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Técnicas Básicasφφ

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plasma

hemácias

X cm

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Hematologia Básica

Técnicas básicas• Hematócrito – fração ocupada pelos eritrócitos em

uma coluna de sangue centrifugado expresso como

fração decimal volume/volume.

Hematócrito - Representa o percentual de células vermelhas na amostra de sangue.VN: 39 a 48%

É determinado por meio de centrifugação a uma velocidade de 10.000 a 15.000 g por 5 minutos de um capilar preenchido com sangue.

Pode ser usado sangue com EDTA ou heparina.

Pode apresentar uma variação de 2 a 3% em relação aos equipamentos automatizados.

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Hematologia Básica

Técnicas básicas

• Hemoglobina – medida por colorimetria sendo expressa como uma fração decimal massa/volume.

A dosagem é feita pela dissolução de um volume de sangue em diluente que lisa as hemácias produzindo uma solução de hemoglobina. VN: 13,0 a 16,0 g/dl

A dosagem é feita por densidade ótica (ou absorvância) em 540 nm.

O método recomendado pelo ICSH é o da cianometehemoglobina.

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Hematologia BásicaTécnicas básicas

• Contagem de eritrócitos – Contados automaticamente permite uma estimativa do volume globular correlacionando-a ao hematócrito. Expressa como número de células por unidade de volume.

• Realizada em contadores automatizados pelo método de impedância.VN: 4,30 a 5,60 x 1012/l

Os equipamentos contam de 20.000 a 50.000 células melhorando a reprodutibilidade.

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Hematologia Básica

Técnicas básicas

• Contagem de leucócitos – contados em câmara (hemocitômetro) ou automaticamente. Expressos em número de células por unidade de volume.

VN – 5 a 9 x 109/l

Na contagem manual é difícil distingui-los dos eritroblastos.

Amostras leucopênicas devem ser contadas manualmente.

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Hematologia Básica

Técnicas básicas

• Contagem manual de leucócitos.

N = no de células contadas nos 4 quadrantes.D = diluição empregada (1:20)V = volume total contado.

Se 200 células forem contadas:

200 x (10 x 20) /4 = 10.000 /mm3

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Hematologia Básica

Técnicas básicas

• Contagem de plaquetas – Contadas por microscopia ótica ou automaticamente são expressas como número de células por unidade de volume.

VN de 150 a 450 x 109/l

As técnicas manuais incluem metodologias usando sangue total ou plasma rico em plaquetas sedimentado ou centrifugado.

O tamanho das plaquetas pode interferir nas contagens.

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Hematologia Básica

Técnicas básicas

Índices hematimétricos - calculados a partir dos dados relativos a série vermelha

• Volume globular médio (VGM) - VN: 80 a 96 fL.

VGM (fL) = Ht (%) x 10Hm (milhões/µl)

• Hemoglobina globular média (HGM) – VN: 27 a 32 pg

HGM (pg) = Hb (g/dl) x 10Hm (milhões/µl)

• Concentração de Hemoglobina globular média (CHGM) – VN: 31 a 35%

CHGM (g/dl ou %) = Hb (g/dl) x 100Ht (%)

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Hematologia Básica

Técnicas básicas

• Contagem de reticulócitos – Podem ser contados manualmente ou por métodos automatizados.

Os métodos manuais carecem de reprodutibilidade devido ao pequeno número de células contadas.

As metodologias automatizadas podem classificar os reticulócitos de acordo com o grau de maturação da célula além de calcular os índices hematimétricos.

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Hematologia Básica

Técnicas básicas

• Contagem diferencial de leucócitos – é a especificação dos tipos leucocitários expressa em percentagem.

O ICSH preconiza a expressão dos resultados em valores absolutos.

Distribuição desigual dos leucócitos na lâmina.

Neutrófilos – final da lâmina.Monócitos - nas bordas ao longo de toda a lâmina.Blastos e células imaturas – concentram-se nos bordos.

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Alterações dos Leucócitos.Alterações dos Leucócitos.

Eosinofilia ( > 700 cels. /mm3)

• Alergias - asma brônquica, urticária e dermatite herpetiforme.

• Infestações parasitárias - esquistossomose e a estrongiloidíase.

• Doenças hematológicas - LMC, PV, anemia perniciosa.

• Doenças malignas - principalmente com metástases ou necrose.

Eosinopenia

• Infecções - com neutrofilia e processos inflamatórios.

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Linfocitose (> 4.000 cels. / mm3).

• Infecções agudas: coqueluche, viroses inespecíficas, hepatite e mononucleose.

• Infecções crônicas: brucelose, tuberculose, sífilis secundária e congênita.

• Doenças hematológicas: LLC, LLA, alguns linfomas e tricoleucemia.

• Linfocitose relativa: exantemas, caxumba, rubéola, neutropenia e na convalescença de

infecções agudas.

Alterações dos Leucócitos.Alterações dos Leucócitos. φφF

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Linfocitopenia (< 1.500 cels. / mm3).

• Infecções agudas: pneumonia, tuberculose ativa.

• Doenças do colágeno: LES, artrite reumatóide.

• Deficiência imunológica: inclusive por HIV.

• Outras causas: necrose do pâncreas, radiação, quimioterapia, uso de esteróides.

Alterações dos Leucócitos.Alterações dos Leucócitos. φφF

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Atipia linfocitária.

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Atipia linfocitária.

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Atipia linfocitária.

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Atipia linfocitária.

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• Infecções agudas: causadas por cocos, bacilos, fungos, parasitas e algumas viroses

(poliomielite, herpes zoster e catapora).

• Danos teciduais: decorrentes de queimaduras, cirurgias, infarto, gota e reações de

hipersensibilidade.

• Intoxicações metabólicas: (uremia e cetoacidose diabética)

• Envenenamento: por drogas , agentes químicos e veneno de insetos.

Neutrofilia (> 7.000 cels. / mm3)

Alterações dos Leucócitos. φφF

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• Hemorragia aguda.

• Hemólise aguda.

• Fisiológica: causada por exercício físico e gravidez e no neonato.

• Tumores: especialmente hepáticos e gastro-intestinais.

• Neoplasias hematológicas: principalmente a LMC e policitemia vera.

• Outras causas: como em decorrência da administração de corticóides e de fatores de

crescimento.

Neutrofilia (> 7.000 cels. /mm3)

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Neutrofilia na infecção bacteriana.

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PCPCNormal.CM CA

Mobilização do pool marginal.

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CM CA

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PCPC

Aumento da proliferação.

Liberação do compartimentode armazenamento.

CM CA

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Fases do hemograma infeccioso.

++++++++++++++++++++++++++BlastosBlastos↑↑

NeutropeniaNeutropenia

77

++++++++++++++++++++++++++BlastosBlastos↑↑ ↑↑66

++++++++++++++++++++++++++BlastosBlastos↑↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑55

++++++++++++++++Pró-mielócito(blastos)

↑↑ ↑↑ ↑↑44

----++++++MielócitoMielócito↑↑ ↑↑33

--------++BastãoBastão↑↑22

------------↑↑11

Degeneração Degeneração nuclearnuclear

C. de C. de DöhleDöhle

VacúolosVacúolosGranulação Granulação tóxicatóxica

Granulação Granulação grosseiragrosseira

Desvio à Desvio à esquerdaesquerda

LeucócitosLeucócitosFaseFaseφφ

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Infecção bacteriana. φφF

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φφ Fleury Fleury φφ Fleury Fleury

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Neutropenia ( < 1.500 cels. /mm3)

• Infecções virais: citomegalovirus, dengue, EBV, hepatite, caxumba e febre amarela.

• Infecções bacterianas: brucelose, tuberculose, febre tifóide.

• Infecções parasitárias: leishmaniose e malária.

• Induzida por drogas: dipirona, barbitúricos, quinino, diazepina etc.

• Nutricionais: anemia megaloblástica.

Alterações dos Leucócitos.Alterações dos Leucócitos. φφF

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Monocitose (> 950 cels. / mm3).

• Infecções bacterianas: tuberculose, endocardite, sífilis, brucelose.

• Recuperação: de infecções bacterianas e agranulocitose.

• Parasitoses: malária, D. de Chagas e calazar.

• Doenças hematológicas: linfomas, leucemia monocítica, mieloma.

• Neoplasias: carcinoma de ovário, estômago e mama.

• Doenças do colágeno: LES e artrite reumatóide.

Monocitopenia.

• Infecção: por HIV e nos casos de LLC.

Alterações dos Leucócitos. φφF

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Hem

atolo

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φφ Fleury Fleury φφ Fleury Fleury