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1 División de Ciencias Básicas e Ingeniería Licenciatura en Química Área de Biofisicoquímica INFORME DEL PROYECTO ll Proponer mutaciones en la molécula de β-glucosidasa b de panibacillus polymyxa para aumentar la resistencia térmica.ALUMNA: SIERRA VICENTE CRUZ AURELIA MATRICULA 96324217 ASESOR: Dra. Jaqueline Zuñiga Padilla México, D. F. a 17 de Diciembre de 2008 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

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División de Ciencias Básicas e Ingeniería Licenciatura en Química

Área de Biofisicoquímica

INFORME DEL PROYECTO ll

“Proponer mutaciones en la molécula de β-glucosidasa b de panibacillus polymyxa para aumentar la resistencia térmica.”

ALUMNA:

SIERRA VICENTE CRUZ AURELIA

MATRICULA

96324217

ASESOR:

Dra. Jaqueline Zuñiga Padilla

México, D. F. a 17 de Diciembre de 2008

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADD AAUUTTÓÓNNOOMMAA MMEETTRROOPPOOLLIITTAANNAA UUNNIIDDAADD IIZZTTAAPPAALLAAPPAA

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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD: IZTAPALAPA

DIVISION: CIENCIAS BASICAS E INGENIERIA

GRADO: LICENCIATURA EN QUIMICA

TITULO DEL TRABAJO: PROPONER MUTACIONES EN LA MOLECULA DE β GLUCOSIDASA B DE PAENIBACILLUS POLIMYXA PARA AUMENTAR SU RESISTENCIA TERMICA, CON EL USO DE HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS

NOMBRE DEL PARTICIPANTE: CRUZ AURELIA SIERRA VICENTE

NOMBRE DEL ASESOR: DRA. JAQUELINE PADILLA ZUÑIGA

Firma

LUGAR Y FECHA DE LA DEPARTAMENTO DE QUIMICA REALIZACION DEL TRABAJO: ÁREA DE BIOFISICOQUÌMICA México D, F a 17 de Diciembre de 2008

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INTRODUCCIÓN Una característica fundamental de las proteínas es su secuencia de aminoácidos pues es la que determina sus propiedades químicas y biológicas. Una función importante que desempeñan las proteínas es el ser los instrumentos moleculares mediante los cuales se expresa la información genética para preservar las características de los miembros de una especie, esto les ha permitido adaptarse a entornos ambientales muy diversos y extremos, tales como temperaturas bajas o elevadas, sistemas acuosos con alta salinidad o bajo pH, por solo citar algunos. La similitud entre estructuras primarias de diferentes proteínas puede ser un indicativo de un antepasado común, así mismo, una diferencia puede reflejar la adaptación de proteínas íntimamente emparentadas frente a diferentes presiones de selección (evolución divergente). Las proteínas que han evolucionado de un ancestro común se denominan homólogas, las cuales tienen la misma función biológica pero diferente secuencia de aminoácidos. En la actualidad se realizan investigaciones para un mayor entendimiento de los factores de estabilidad involucrados en la adaptación a ambientes inusuales. Dentro de estos factores ambientes inusuales se encuentran las temperaturas elevadas en las que solamente las proteínas termorresistentes, es decir, aquéllas que se han obtenido de organismos que son capaces de tolerar temperaturas entre 65°C y 110° y subsistir adecuadamente (organismos termófilos), pueden desarrollar funciones biológicas normales. Otros organismos se desarrollan naturalmente en un intervalo de temperatura de 20-40 °C y son llamados mesófilos. Después de analizar la secuencia de proteínas homólogas, pertenecientes a organismos mesófilos y termófilos, se observó que la diferencia en la composición de aminoácidos está principalmente localizada en la superficie de la proteína, la cual se caracteriza por la presencia de un gran número de residuos polares y de residuos cargados potencialmente los cuales forman pares iónicos [1]. Una enzima termófila comparte del 20 al 30 % de su secuencia de aminoácidos con sus homólogas adaptadas a climas más fríos. La información acumulada hasta la fecha indica que la naturaleza no cuenta con una sola estrategia para lograr la estabilización térmica, por lo que no ha sido posible identificar un factor específico como principal responsable de ella la estabilidad térmica [2]. Esto es debido probablemente a que la estabilidad de las proteínas esté determinada por una multitud de interacciones débiles tanto locales como de largo alcance, y a que existe un fino balance entre los diferentes factores contribuyentes [1] Durante la evolución las sustituciones más frecuentes en la estructura primaria de las proteínas son del tipo conservativo (químicamente equivalente) es decir, aquéllas en las que se mantienen las propiedades fisicoquímicas en cadenas laterales. En este tipo de proteínas, los aminoácidos esenciales para su función se conservan a lo largo del tiempo; mientras que aquellos residuos de aminoácido menos importantes para la función pueden ser susceptibles a cambios debidos quizá, al proceso adaptativo que hayan sufrido los diversos organismos en su hábitat [3]. La localización de estos residuos en un conjunto grande de proteínas homólogas que comparten una misma función biológica, podría proporcionarnos información valiosa para trazar el camino evolutivo que condujo a estas proteínas hasta su actual composición y secuencia. Generalmente se acepta que la estructura tridimensional de una proteína nativa está codificada en su secuencia de aminoácidos y responde al ambiente natural en el que se desempeña la función biológica. Sin embargo la forma en que se encuentra codificada la estabilidad de una proteína en su estructura primaria, y la contribución de los residuos de aminoácidos individuales en la estabilidad de una proteína nativa, son temas aún

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escasamente conocidos [5]. Las propiedades de las proteínas termófilas han sido examinadas extensamente en las últimas dos décadas. En particular se ha investigado si las propiedades termófilas pueden detectarse a nivel de aminoácidos en forma específica. Un enfoque para realizar este estudio ha sido analizar la composición de aminoácidos de proteínas termófilas por comparación con su contraparte mesófila [6]. La aplicación industrial de las enzimas que pueden resistir condiciones hostiles ha sido mejorada por numerosas investigaciones en los últimos años, sobre todo debido a que la actividad catalítica de las enzimas depende de la integridad de su conformación proteica nativa. El uso industrial de enzimas está frecuentemente limitado por la falta de estabilidad a diferentes condiciones del medio en las que realizan su función [4]. Esto ha llevado a buscar nuevas rutas de estabilización de proteínas, teniendo como uno de los resultados el incremento de termoestabilidad. Actualmente estas biomoléculas son utilizadas ampliamente en diferentes procesos industriales como: fermentaciones, producción de medicamentos, elaboración de alimentos enlatados, en la fabricación de detergentes, la degradación de agentes contaminantes del medio ambiente, como componentes de biosensores, etc. Algunas enzimas pueden ser aisladas de organismos mesófilos, y dentro de éstas encontramos a la β-glucosidasa, la cual es clave para el metabolismo de carbohidratos en arqueas, bacterias y células eucarióticas. La amplia variedad de sustratos que pueden ser degradados por esta enzima la hacen una herramienta poderosa para muchas aplicaciones dentro de la industria alimentaría. Existen dos tipos de β-glucosidasa, la β-glucosidasa A (βglA) y la β-glucosidasa B (βglB); ambas enzimas son producidas por la bacteria Paenibacillus polymyxa que es un organismo mesófilo. La primera es una enzima formada por 8 subunidades idénticas de 448 residuos de aminoácidos, presentando una estructura de barril (α⁄β)8. La βglB es una enzima monomérica con 448 residuos de aminoácido, y una masa de 51.5 kDa. La estructura tridimensional de ambas enzimas ha sido determinada por difracción de rayos X [7] y sus códigos pbd son: 2O9P y 2O9T, respectivamente. En la figura 1 se muestra una representación simplificada de la molécula de βglB.

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Figura 1.Representación en listones de la enzima β-glucosidasa B de Paenibacillus polymyxa donde puede apreciarse el arreglo de barril (α⁄β)8. Una enzima mesófila podría, en principio, ser transformada en termófila mediante una adecuada selección de los residuos que forman su cadena. Esto ya se ha realizado experimentalmente sobre la molécula de βglB en estudios anteriores, en los cuales se ha obligado al Paenibacillus polymyxa a sobrevivir en condiciones de temperatura mayores a las óptimas [7]. Tal situación fuerza a la maquinaria celular del organismo a mutar los residuos necesarios para desarrollar termorresistencia. Estos experimentos, conocidos con el nombre de evolución dirigida, permiten identificar lo que la célula cambia espontáneamente en la secuencia de aminoácidos para lograr adaptarse a la modificación extrema del medio. Aunque se han obtenido resultados muy relevantes, sería interesante proponer, mediante análisis de secuencias múltiples comparativos entre proteínas mesófilas y termófilas homólogas a βglB, y el empleo de herramientas bioinformáticas, para obtener las posibles mutantes de esta enzima que posean propiedades termorresistentes. Ello implica emplear un método de diseño racional para incrementar la resistencia a la temperatura de la βglB, y así poder utilizar a esta enzima en aplicaciones biotecnológicas que requieran el desempeño de su función biológica, pero en condiciones de trabajo extremas. Entre las herramientas bioinformáticas que actualmente pueden ser empleadas para llevar a cabo el diseño racional sobre la molécula de βglB, se pueden mencionar diferentes servidores gratuitos en Internet que manejan secuencias de aminoácidos de proteínas de interés y las analizan para identificar moléculas afines que permitan hacer los grupos de secuencias homólogas para construir con ellos alineamientos múltiples. El análisis de estos alineamientos es de utilidad para encontrar las regiones variables, así como las más conservadas, en esos grupos de proteínas. Como se había mencionado en párrafos anteriores, las zonas de conservación contienen los aminoácidos importantes para mantener la estabilidad y/o la función biológica. En cambio, las regiones variables,

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podrían indicar los sitios que las moléculas emparentadas tienen libertad de mutar para adaptarse a las exigencias de un entorno cambiante. La identificación de estas regiones variables es de la mayor importancia cuando se trata de abordar un estudio de diseño racional, como el que nos ocupa en este trabajo. Dentro del grupo de herramientas bioinformáticas, un proceso importante llamado minimización de energía, permite que una molécula que se visualiza en una computadora, sea representativa de las moléculas en solución que se manejan en la realidad. Este proceso tiene como objetivo el modificar las posiciones espaciales de cada uno de los átomos que integran a una molécula, de modo que la energía potencial total (Epot) alcance su valor más bajo. En este punto se considera que la molécula estudiada está libre de tensiones y que su conformación es la que mantiene una molécula estudiada en el medio celular. La minimización de energía de una molécula consiste en encontrar el conjunto de coordenadas atómicas que corresponde al mínimo local de la función de energía potencial empleada por el campo de fuerzas. Este proceso se realiza aplicando técnicas de optimización, que determinan la conformación de la molécula en la cual, la resultante de las fuerzas que se ejercen sobre los átomos sea cero. La energía potencial de un sistema molecular puede calcularse, mediante un modelo de física clásica, como la contribución aditiva de varias interacciones que están descritas en la siguiente ecuación:

E pot =E enlace + E ángulo + E inversión + E torsión + E vdw + Eele

Donde: E enlace = energía de estiramiento y compresión del enlace entre dos átomos. E ángulo = energía debida a la distorsión del ángulo que forman los enlaces entre tres Átomos unidos covalentemente. E inversión = energía que debe suministrarse para cambiar la configuración de un isómero. E torsión = energía debida a la distorsión de los ángulos diedro de la molécula E vdw = energía de van der Waals. E ele = energía electrostática.

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Figura 4.- Diagrama de Venn con códigos de una letra para identificar a los 20 aminoácidos proteicos.

Los aminoácidos se clasifican habitualmente según las propiedades de su cadena lateral

• Neutros polares, polares o hidrófilos : Serina (Ser,S), Treonina (Thr,T), Cisteína (Cys,C), Asparagina (Asn,N), Glutamina (Gln,Q) y Tirosina (Tyr,Y).

• Neutros no polares, apolares o hidrófobos: Glicina (Gly,G), Alanina (Ala,A), Valina (Val,V), Leucina (Leu,L), Isoleucina (Ile,I), Metionina (Met,M), Prolina (Pro,P), Fenilalanina (Phe,F) y Triptófano (Trp,W).

• Con carga negativa, o ácidos: Ácido aspártico (Asp,D) y Ácido glutámico (Glu,E).

• Con carga positiva, o básicos: Lisina (Lys,K), Arginina (Arg,R) e Histidina (His,H).

• Aromáticos: Fenilalanina (Phe,F), Tirosina (Tyr,Y) y Triptofano (Trp,W) (ya incluidos en los grupos neutros polares y neutros no polares).

Símbolos de Símbolos de una letra.una letra.

A A ––AlaninaAlaninaCC-- CisteínaCisteínaDD--AcidoAcidoaspárticoaspárticoEE-- Ácido Ácido glutámicoglutámicoFF--FenilalaninaFenilalaninaGG--GlicinaGlicinaHH--HistidinaHistidinaII--IsoleucinaIsoleucinaKK-- LisinaLisinaLL--LeucinaLeucinaMM--MetioninaMetioninaNN--AsparaginaAsparaginaPP--ProlinaProlinaQQ--GlutaminaGlutaminaRR--ArgininaArgininaSS--SerinaSerinaTT--TreoninaTreoninaVV--ValinaValinaWW--TriptófanoTriptófanoYY-- TirosinaTirosina

POLARES

CARGADOS POSITIVOS

NO POLARES

CARGADOS NEGATIVAMENTE

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OBJETIVO GENERAL El objetivo de este trabajo es proponer mutaciones en la molécula de β-glucosidasa B de Paenibacillus polymyxa, con aproximaciones teóricas, para aumentar la resistencia térmica de esta enzima OBJETIVOS PARTICULARES 1) Comparar grupos de secuencias de proteínas termófilas y mesófilas para identificar las mutaciones sobre la estructura de la βglB que podrían conferir a esta molécula propiedades termorresistentes. 2) Generar modelos tridimensionales, por computadora, de mutantes de βglB que resulten del análisis comparativo de grupos de proteínas mesófilas y termófilas homólogas a la enzima bajo estudio. 3) Calcular la energía potencial asociada a cada mutante para identificar aquellas variantes que pudieran producir una molécula de βglB estable, e incluso, termorresistente.

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METODOLOGÍA Y RESULTADOS 1.-Búsqueda de la secuencia de aminoácidos de la βglB de Paenibacillus polymyxa

Para iniciar el desarrollo del presente trabajo, era necesario tener la secuencia de aminoácidos de la proteína bajo estudio, la β-glucosidasa B (βglB) de Paenibacillus polymyxa; la búsqueda de la secuencia de aminoácidos, se realizó empleando la página disponible en Internet, como el servidor, ExPASy Proteomics Server (I), en el cual se tiene acceso directo a la base de datos Swiss-Prot and TrEMBL (II), que contiene miles secuencias de proteínas; traducidas del genoma de diversos organismos, las cuales fueron obtenidas por secuenciación experimental en diversas partes del mundo.

La búsqueda de la secuencia de la proteína bajo estudio, se realizó anotando el nombre del organismo Paenibacillus polymyxa en la ventana de diálogo de la base de datos Swiss-Prot and TrEMBL. Esta ventana se encuentra en la parte superior de la página principal del servidor ExPASy Proteomics Server, una vez anotado el nombre del organismo se obtiene como resultado una lista de los archivos existentes en esta base de datos que contienen el nombre escrito. Así se obtuvo un listado en donde se encontró la opción βglB de Paenibacillus polymyxa la cual contiene los 448 aminoácidos que componen a la secuencia de la proteína de interés, en código de una letra. A continuación se presenta esta secuencia en formato FASTA, el cual es requerido como entrada por diversos programas de análisis bioinformático.

Secuencia de βglB en formato FASTA

>gi|80133|pir||JW0038 beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) B - Bacillus polymyxa MSENTFIFPATFMWGTSTSSYQIEGGTDEGGRTPSIWDTFCQIPGKVIGGDCGDVACDHFHHFKEDVQLM KQLGFLHYRFSVAWPRIMPAAGIINEEGLLFYEHLLDEIELAGLIPMLTLYHWDLPQWIEDEGGWTQRET IQHFKTYASVIMDRFGERINWWNTINEPYCASILGYGTGEHAPGHENWREAFTAAHHILMCHGIASNLHK EKGLTGKIGITLNMEHVDAASERPEDVAAAIRRDGFINRWFAEPLFNGKYPEDMVEWYGTYLNGLDFVQP GDMELIQQPGDFLGINYYTRSIIRSTNDASLLQVEQVHMEEPVTDMGWEIHPESFYKLLTRIEKDFSKGL PILITENGAAMRDELVNGQIEDTGRHGYIEEHLKACHRFIEEGGQLKGYFVWSFLDNFEWAWGYSKRFGI

VHINYETQERTPKQSALWFKQMMAKNGF

2-Búsqueda de las secuencias de proteínas homólogas a βglB.

Como segundo paso del trabajo se realizó la búsqueda de proteínas con parecido a la secuencia de βglB de Paenibacillus polymyxa es decir, la tarea fue identificar de una base de datos de secuencias, un grupo de proteínas semejantes a la proteína bajo estudio. Para esto se hizo uso del programa BLAST (III), el cual es una herramienta muy usada como buscador de proteínas homólogas a una proteína de interés. Esta búsquedad la realiza por comparación de la secuencia de aminoácidos buscada con todas las existentes en su enorme base de datos. Para iniciar la búsqueda en BLAST se emplea la secuencia de βglB en formato FASTA es la que corresponde a βglB de Paenibacillus polymyxa, que con anterioridad se anotó.

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La lista las proteínas homólogas a β-glB obtenidas con el servidor del programa BLAST , se presenta en la Fig. 2. Cada renglón corresponde a una proteína homóloga alineada con la β-glB (línea verde). El color amarillo de las barras representa similitud en un intervalo de 50- 65% de homólogia entre las proteínas de este conjunto y la βglB. Los códigos que aparecen en el margen izquierdo de la lista de proteínas homólogas, pertenecen a la clave de acceso a la base de datos Swiss-Prot de cada proteína. A la derecha se muestra en gris la porción de la cadena de aminoácidos que presenta homología con la proteína de referencia, en este estudio, la βglB de Paenibacillus polymyxa. A continuación de esta lista de homólogas se realiza una clasificación para formar dos grupos de proteínas mesófilas y termófilas con ayuda del servidor ENTREZ Genome Proyect que se describe a continuación.

Figura 2.-Salida del programa BLAST donde se muestran las proteínas homólogas a βglB encontradas por este programa en su base de datos.

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3.- Identificación de proteínas termófilas y mesófilas de βglb en sus secuencias homólogas, empleando el servidor ENTREZ Genome Proyect A través de un análisis de la lista obtenida de la salida de BLAST que tiene una liga para acceder a una extensa información disponible para cada una de las proteínas homólogas a βglB, nos encontramos con la presencia de microorganismos cuyos nombres sistemáticos no permitían una fácil clasificación de ellos en mesófilos y termófilos. Para llevar a cabo esta clasificación se empleó el servidor ENTREZ Genome Proyect, al que puede accederse desde la página de Pub Med del NCBI (IV). Este servidor contiene información en su base de datos que incluye una vasta cantidad de microorganismos clasificados por su hábitat y su temperatura óptima de crecimiento. Para iniciar la búsqueda es suficiente con ingresar el nombre sistemático del microorganismo de interés. La búsqueda se realizó para cada una de las proteínas de la salida de BLAST, y la información generada por el programa de Genome Proyect permitió la clasificación de las proteínas citadas de acuerdo a los grupos requeridos. A continuación se presenta la salida de BLAST donde se indica el tipo de microorganismo al que pertenece cada proteína. Como resultado de esta clasificación se obtuvieron 16 secuencias de proteínas mesófilas y 16 secuencias de proteínas termófilos, todas ellas homologas a la βglb las cuales se identifican a continuación en la figura 3. P22505 BGLB_PAEPO Beta-glucosidase B (Gentiobia... 957 0.0 MESOFILO B0KCV1 THEP3 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Teth39_1927] [Th... 512 e-143 TERMOFILO Q60026 THEBR Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [cglT] [Thermoana... 511 e-143 NO ESTA B0KDF9 THEP3 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Teth39_2054] [Th... 511 e-143 TERMOFILO Q8RCQ8 THETN Beta-glucosidase/6-phospho-beta-glucosidase/beta... 510 e-143 TERMOFILO Q0R5R7 ALIAC Beta-glycosidase (EC 3.2.1.-) [glyB] [Alicycloba... 504 e-141 TERMOFILO Q9KBK3 BACHD Beta-glucosidase [bglA] [Bacillus halodurans] 446 e-123 MESOFILO A5UZB6 ROSS1 Beta-glucosidase. Glycosyl Hydrolase family 1. (... 446 e-123 TERMOFILO A7NGQ8 ROSCS Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Rcas_0521] [Rose... 444 e-123 NO ESTA Q2ADJ1 9FIRM Glycoside hydrolase, family 1 [HoreDRAFT_0425] [... 442 e-122 NO ESTA B2Q9U3 9BACL Beta-galactosidase (EC 3.2.1.21) [EAT1bDRAFT_081... 436 e-120 TERMOFILO A9AYT4 HERA2 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Haur_2422] [Herp... 431 e-119 MESOFILO Q8GKQ8 9THEM Beta-glucosidase [bglA] [Fervidobacterium sp. YNP] 431 e-119 NO ESTA Q2WGB4 9BACL Beta-glucosidase [bglA] [Paenibacillus sp. HC1] 429 e-118 NO ESTA A3KK08 STRAM Putative beta-glucosidase [SAML1057] [Streptomyc... 429 e-118 MESOFILO Q1CY46 MYXXD Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [MXAN_6555] [Myxo... 428 e-118 MESOFILO Q1AUD7 RUBXD Beta-glucosidase. Glycosyl Hydrolase family 1. (... 428 e-118 TERMOFILO A4X576 SALTO Beta-glucosidase. Glycosyl Hydrolase family 1. (... 428 e-118 MESOFILO A0R2K0 MYCS2 Beta-glucosidase A (EC 3.2.1.21) [MSMEG_5142] [M... 428 e-118 MESOFILO Q47RE2 THEFY Beta-glucosidase. Glycosyl Hydrolase family 1. (... 427 e-118 TERMOFILO Q9LAV5 THEFU Beta-glucosidase BglC [bglC] [Thermomonospora fu... 427 e-118 TERMOFILO A5KVQ8 9GAMM Putative uncharacterized protein [VSWAT3_17593] ... 426 e-117 NO ESTA A3XS65 9VIBR Putative uncharacterized protein [MED222_10933] ... 424 e-117 NO ESTA Q1J2J3 DEIGD Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Dgeo_2862] [Dein... 423 e-116 MESOFILO A3UQH3 VIBSP Putative uncharacterized protein [V12B01_19076] .. 423 e-116 MESOFILO Q9K440 STRCO Putative beta-glucosidase [SCO1059] [Streptomyce.. 422 e-116 MESOFILO A8LZF3 SALAI Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Sare_0390] [Sali... 422 e-116 MESOFILO A7HN90 FERNB Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Fnod_1530] [Ferv... 422 e-116 TERMOFILO Q53EH2 CLOCL Beta-glucosidase A [bglA] [Clostridium cellulovo... 422 e-116 NO ESTA P22073 BGLA_PAEPO Beta-glucosidase A (EC 3.2.1.21) (BGA) (Gen... 421 e-116 MESOFILO A9AYR3 HERA2 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Haur_2401] [Herp... 420 e-115 MESOFILO A8LUQ2 SALAI Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Sare_1509] [Sali... 419 e-115 MESOFILO A6GCT8 9DELT Beta-glucosidase [PPSIR1_18647] [Plesiocystis pa... 419 e-115 MESOFILO Q9ZNN7 BACSP Beta-glucosidase [beta-glucosidaseA] [Bacillus sp] 417 e-115 NO ESTA A6WF35 KINRD Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Krad_3961] [Kine... 416 e-114 MESOFILO A9F279 SORC5 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [bglA2] [Sorangiu... 416 e-114 MESOFILO B1VSM7 STRGG Putative beta-glucosidase [SGR_752] [Streptomyce... 414 e-114 MESOFILO A4X1R1 SALTO Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Strop_0326] [Sal... 412 e-113 MESOFILO B1VL16 STRGG Putative beta-glucosidase [SGR_3215] [Streptomyc... 411 e-113 MESOFILO Q9F3B7 STRCO Putative beta-glucosidase [SCO7558] [Streptomyce... 408 e-112 MESOFILO Q0GMU3 9BACT Beta-glucosidase [bglA] [uncultured bacterium] 408 e-112 NO ESTA

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A5CPC2 CLAM3 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.-) [bglJ] [Clavibacte... 407 e-112 MESOFILO A6AMQ2 VIBHA Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [A1Q_4038] [Vibri... 407 e-111 MESOFILO A7N5G4 VIBHB Putative uncharacterized protein [VIBHAR_06938] ... 405 e-111 MESOFILO P26208 BGLA_CLOTH Beta-glucosidase A (EC 3.2.1.21) (Gentiobia.. 404 e-111 TERMOFILO Q7MG41 VIBVY Putative uncharacterized protein VVA0128 [VVA012... 404 e-111 MESOFILO B0RIF2 CLAMS Putative beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [CMS0142... 404 e-111 MESOFILO Q8D4K7 VIBVU Beta-glucosidase/6-phospho-beta-glucosidase/beta... 404 e-111 MESOFILO A6W3B1 MARMS Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Mmwyl1_4295] [Ma... 404 e-111 MESOFILO Q2S749 HAHCH Beta-glucosidase/6-phospho-beta-glucosidase/beta... 403 e-110 MESOFILO Q47PF5 THEFY Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Tfu_1629] [Therm... 402 e-110 TERMOFILO Q59976 STRSQ Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [bgl3] [Streptomy... 402 e-110 NO ESTA B1VW56 STRGG Putative beta-glucosidase [SGR_4738] [Streptomyc... 402 e-110 MESOFILO Q03506 BGLA_BACCI Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) (Gentiobiase... 401 e-110 NO ESTA A0AC59 STRAM Putative beta-glucosidase [SAMR0353] [Streptomyc... 401 e-110 MESOFILO A3KIN3 STRAM Putative beta-glucosidase [SAML0581] [Streptomyc... 400 e-109 MESOFILO Q82M59 STRAW Putative beta-glucosidase [bglC1] [Streptomyces ... 400 e-109 MESOFILO A8S1H9 9CLOT Putative uncharacterized protein [CLOBOL_05977] ... 399 e-109 MESOFILO A3TGZ0 9MICO Putative beta-glucosidase [JNB_08014] [Janibacte... 398 e-109 NO ESTA Q8CJM3 STRCO Putative beta-glucosidase [SCO6604] [Streptomyce... 396 e-108 MESOFILO A4AFR4 9ACTN Putative beta-glucosidase [A20C1_08068] [marine ... 391 e-107 MESOFILO Q9F3I3 STRCO Putative cellobiose hydrolase [SCO2798] [Strepto... 391 e-107 MESOFILO B2TFW7 BURPP Beta-galactosidase (EC 3.2.1.21) [Bphyt_5888] [B... 390 e-106 MESOFILO A6LNI1 THEM4 Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Tmel_1638] [Ther... 390 e-106 TERMOFILO Q8GHE5 THECA Beta-glycosidase [Thermus caldophilus] 389 e-106 NO ESTA Q8GEB2 THEFI Beta-glycosidase [Thermus filiformis] 389 e-106 NO ESTA Q8GEB1 9DEIN Beta-glycosidase [Thermus sp. IB-21] 389 e-106 NO ESTA A4AK24 9ACTN Putative beta-glucosidase [A20C1_00230] [marine ... 389 e-106 MESOFILO A8WAC9 THETH Beta-glycosidase [b-gly] [Thermus thermophilus] 388 e-106 TERMOFILO B1VZ46 STRGG Putative beta-glucosidase [SGR_1972] [Streptomyc... 388 e-106 MESOFILO Q9L794 9DEIN Beta-glycosidase (EC 3.2.1.21) [Thermus nonprote... 387 e-106 NO ESTA B2JNV8 BURP8 Beta-galactosidase (EC 3.2.1.21) [Bphy_5434] [Bu... 387 e-106 MESOFILO Q21ZG0 RHOFD Beta-glucosidase. Glycosyl Hydrolase family 1. (... 387 e-106 MESOFILO Q08S20 STIAU Beta-glucosidase A (EC 3.2.1.21) [STIAU_7449] [S... 387 e-106 MESOFILO A0XZR8 9GAMM Beta-glucosidase [ATW7_07854] [Alteromonadales b... 386 e-105 MESOFILO Q13PT6 BURXL Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Bxeno_B0935] [Bu... 384 e-105 NO ESTA B1XZK8 LEPCP Beta-galactosidase (EC 3.2.1.21) [Lcho_4320] [Le... 383 e-104 MESOFILO B1FT15 9BURK Beta-galactosidase (EC 3.2.1.21) [BgramDRAFT_012... 383 e-104 MESOFILO A8L4K2 FRASN Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) [Franean1_5462] [... 383 e-104 NO ESTA A4BJP2 9GAMM Putative uncharacterized protein [MED297_06569] ... 383 e-104 NO ESTA B2QQB6 9CHLR Beta-galactosidase precursor (EC 3.2.1.21) [Chy4... 382 e-104 TERMOFILO A9WAY6 CHLAA Beta-galactosidase precursor (EC 3.2.1.21) [Caur... 382 e-104 TERMOFILO

Figura 3.- Salida de BLAST de las proteínas homólogas a βglB con su clasificación de termófilos en (color negro) y mesófilos (color rojo). La leyenda “ NO ESTA” significa que el microorganismo no se encuentra

depositado en la base de datos Genome Project

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4. Alineamientos múltiples de las secuencias de proteínas homólogas a βglB realizadas con

CLUSTALW

Un alineamiento de secuencias de aminoácidos consiste en colocar secuencia de aminoácidos de tal forma que número de coincidencias de sus residuos sea máximo. El alineamiento puede hacerse para un par de secuencias, o sobre muchas de ellas, el cual es llamado alineamiento múltiple. A continuación se describen los aspectos básicos del programa CLUSTALW (V). La información básica que el programa proporciona es la identificación de regiones de secuencia conservadas. Esto es muy útil en el diseño de experimentos para probar y modificar la función de proteínas específicas, en la predicción de la función y la estructura de proteínas y en la identificación de los nuevos miembros de familias de proteínas. Produce resultados de alineamientos con significado biológico de secuencias divergentes. Calcula la mejor coincidencia para las secuencias seleccionadas, alineándolas para que las identidades, similitudes y diferencias puedan ser fácilmente identificadas. Este alineamiento permite determinar cuáles son las posiciones conservadas y cuáles las variables. Además el alineamiento permite determinar el porcentaje de identidad en las secuencias de las proteínas, así como asignar las disminuciones de puntaje por pérdidas de residuos que representa simbólicamente con guiones donde la secuencia se tuvo que fragmentar para encontrar un mejor alineamiento y darle un mejor puntaje basado en la similitud de los residuos. Donde los asteriscos que se encuentran en la parte de abajo del alineamiento indican la conservación del residuo y los guiones las inserciones o perdidas de residuos.

El alineamiento obtenido por CLUSTALW para las secuencias homólogas a βglB de Paenibacillus polymyxa, se construyó por separado, para obtener una salida para proteínas mesófilas y termófilos estas se muestran a continuación la alineación de los mismos. A continuación se utilizó el diagrama de Veen para distinguir por colores las propiedades de las cadenas laterales de los aminoácidos.

No polares Cargados Polares Cargados Negativamente Positivamente |Q47RE2|Q47RE2_THEFY MTSQSTTPLGNLEETPKPDIRFPSDFVWGVATASFQIEGSTTADGRGPSI 50 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU MTSQSTTPLGNLEETPKPDIRFPSDFVWGVATASFQIEGSTTADGRGPSI 50 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY -MSNDHLP------------EFPAGFWFGAATASYQIEGAVHADGRGPSI 37 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD -------------------MRFPEGFLWGAATAAYQVEGAVGEGGRGPSI 31 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 ----------------MTTRRFPQGFLWGSATAAFQIEGATREDGRGESI 34 |A8WAC9|A8WAC9_THETH ----------------MTEN--AEKFLWGVATSAYQIEGATQEDGRGPSI 32 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR ---------------MSNDIRFPSDFLWGAATAAYQIEGAWNEDGKGESI 35 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA ---------------MSNDIRFPSDFLWGAATAAYQIEGAWNEDGKGESI 35 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 ------------------MIKFPKDFLWGTATSSYQIEGAVNEDGRTPSI 32 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 ------------------MAKFPRDFVWGTATSSYQIEGAVNEDGRTPSI 32 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN ---------------MIELVKFPKDFTWGVATSSYQIEGAVNEDGRTPSI 35 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL -------------------MHFKKDFVFGTATSSYQIEGAHNEGGRTPSI 31 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC ---------------MREMRKFPEGFVWGTATASYQVEGAAREGGRGRSI 35 |A7HN90|A7HN90_FERNB ---------------MIKRSDFPKDFLFGTATAAYQIEGAAKEDGKGPSI 35 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 --------------MKIKRSDFPKEFIFGTATSAYQIEGAAFEDGKEPSI 36 |P26208|BGLA_CLOTH ----------------MSKITFPKDFIWGSATAAYQIEGAYNEDGKGESI 34 * :* **:::*:**: .*: ** |Q47RE2|Q47RE2_THEFY WDTFCATPGKVENGDTGDPACDHYNRYRDDVALMRELGVGAYRFSIAWPR 100 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU WDTFCATPGKVENGDTGDPACDHYNRYRDDVALMRELGVGAYRFSIAWPR 100

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|Q47PF5|Q47PF5_THEFY WDTYSHTPGLVLNGDTGDVACDHYHRYPEDVELLRRLGVDAYRFSIAWPR 87 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD WDTFSHTPGRVYRGDTGDVACDHYHRLEEDLDLMARFGLGAYRFSVAWPR 81 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 WDRFCATPGKVLNGDTGDPACDHYHRWRDDITLMKSLGLQAYRFSIAWPR 84 |A8WAC9|A8WAC9_THETH WDTFARRPGAIRDGSTGEPACDHYHRYEEDIALMQSLGVGVYRFSVAWPR 82 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR WDRFVRRPGVIANGDTGDIACDHYHRYEEDLDHMAALGLKAYRFSISWPR 85 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA WDRFVRRPGVIANGDTGDIACDHYHRYEEDLDHMAALGLKAYRFSISWPR 85 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 WDTFSKTEGKTYNGHTGDVACDHYHRYKEDVEILKEIGVKAYRFSIAWPR 82 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 WDTFSKTEGKTYKGHTGDVACDHYHRYKEDVEILKEIGVKAYRFSIAWPR 82 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN WDTFSKTEGKTYQGHTGDVACDHYHRYKEDVQIMKEIGVKAYRFSIAWPR 85 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL WDMFCDIDGRVFEKHNGDVACDHYHRYEEDIKHIKKLGVDTYRFSIAWPR 81 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC WDTFSHTPGKVAEGHTGDVACDHYHRYQDDVRLMKELGISSYRFSIAWPR 85 |A7HN90|A7HN90_FERNB WDVFSHTPGKTFNGDTGDIACDHYHRFKEDVAIMKEIGLNAYRFSISWPR 85 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 WDIFSHEKGNVKNMENSDVACDHYYRFEEDVELMSQLGLDAYRFSISWPR 86 |P26208|BGLA_CLOTH WDRFSHTPGNIADGHTGDVACDHYHRYEEDIKIMKEIGIKSYRFSISWPR 84 ** : * ..: ***** * :*: : :*: ****::*** |Q47RE2|Q47RE2_THEFY IQPEGKGTPVEAGLDFYDRLVDCLLEAGIEPWPTLYHWDLPQALEDA-GG 149 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU IQPEGKGTPVEAGLDFYDRLVDCLLEAGIEPWPTLYHWDLPQALEDA-GG 149 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY VMPTGSGDVNQRGLDFYDRLVDALLEAGITPVPTLYHWDLPQALEDA-GG 136 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD IQPEGRGPANRSGLDFYRRLVEGLGERGIEPVLTLYHWDLPQALEDQ-GG 130 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 IIPQGRGQVNPAGLDFYDRLVDGLLDAGIRPFVTLYHWDLPQALEDA-GG 133 |A8WAC9|A8WAC9_THETH ILPEGRGRINPKGLAFYDRLVDRLLAAGITPFLTLYHWDLPQALEDR-GG 131 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR IFPTGSGQPNQRGLDFYRRLIDGLHRRHILPVATLYHWDLPQALEDR-GG 134 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA IFPTGSGQPNQRGLDFYRRLIDGLHRRHILPVATLYHWDLPQALEDR-GG 134 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 IFPEE-GKYNPKGMDFYKRLIDELLKKDIMPTATIYHWDLPQWAYDKGGG 131 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 IFPEE-GKYNPKGMDFYKKLIDELQKRDIVPAATIYHWDLPQWAYDKGGG 131 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN IFPEE-GKYNPKGMDFYKRLVDELLKREIIPVATIYHWDLPQWAYEKNGG 134 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL IFPAK-GEYNPEGMAFYKNLALCLREEGIKPAVTIYHWDLPMWAHEE-GG 129 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC VMPEK-GRVWVKGLDFYKRLATALLEHGIRPAATMYHWDLPQWMEDE-GG 133 |A7HN90|A7HN90_FERNB VMQDG-KNINQKGIDFYNRLVDELLENDIIPFITLYHWDLPYALYEK-GG 133 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 VLNKN-GKKNQKGIDFYNRLVDKLLEKNIIPFITLYHWDLPYYLYEK-GG 134 |P26208|BGLA_CLOTH IFPEGTGKLNQKGLDFYKRLTNLLLENGIMPAITLYHWDLPQKLQDK-GG 133 : *: ** .* * * * *:****** : ** |Q47RE2|Q47RE2_THEFY WPNRDTAKRFADYAEIVYRRLGDRITNWNTLNEPWCSAFLGYASGVHAPG 199 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU WPNRDTAKRFADYAEIVYRRLGDRITNWNTLNEPWCSAFLGYASGVHAPG 199 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY WRSRSTAEHFAAYTRAVVARLGDRIRHWITLNEPFCSAFLGYAVGRHAPG 186 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD WTSRQTSERFAEYAALVYEALGGSVRFWITLNEPWVSAWMGYGLGVHAPG 180 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 WPARDTASAFADYADVVVRRLGDRVKHWITLNEPWCSAFLGYWTGDHAPG 183 |A8WAC9|A8WAC9_THETH WRSRETAFAFAEYAEAVARTLADRVPFFATLNEPWCSAFLGHWTGEHAPG 181 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR WTQRDTALRFAEYADYLFRTIGGEVALWATHNEPFIQAFYGYGNGENAPG 184 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA WTQRDTALRFAEYADYLFRTIGGEVALWATHNEPFIQAFYGYGNGENAPG 184 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 WLNRDSVKWYVEYATKLFEELGDVIPLWITHNEPWCSSILSYGIGEHAPG 181 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 WLNRESIKWYVEYATKLFEELGDAIPLWITHNEPWCSSILSYGIGEHAPG 181 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN WLNRESVKWYVEYASKLFEELGDVIPLWITHNEPWCSSILSYGIGEHAPG 184 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL WVNRESVDWFLDYAKVCFEELDDIVDSWITHNEPWCAGFLGYHVGVHAPG 179 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC WNSRETVSRFLEYSEILFRELGDLVPMWITHNEPWCASILGYGIGVHAPG 183 |A7HN90|A7HN90_FERNB WLNDDIAMYFRAYATLMFNELGDRVKHWITLNEPWCSSFLGYFTGEHAPG 183 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 WVNDDIALYFRDYAAMMFELLGDRVKHWITLNEPWCSAFLGYYMGIHAPG 184 |P26208|BGLA_CLOTH WKNRDTTDYFTEYSEVIFKNLGDIVPIWFTHNEPGVVSLLGHFLGIHAPG 183 * . : *: : . : : * *** . .: * :*** |Q47RE2|Q47RE2_THEFY RQEPAAALAAAHHLMLGHGLAAAVMRDLAGQAGR----SVRIGVAHNQTT 245 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU RQEPAAALAAAHHLMLGHGLAAAVMRDLAGQAGR----SVRIGVAHNQTT 245 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY AREGTPALAAAHHLLLAHGLAVQELR--AADAG-------EVGITLNPDR 227 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD RRSTADALAATHHLLLGHGLALEALRALGGGGR--------LGITLNLSP 222 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 VR-EGPVLAAAHHLLLGHGLALAALR----AAYP----DVQAGITLNFSP 224 |A8WAC9|A8WAC9_THETH LRNLEAALRAAHHLLLGHGLAVEALR----AAG-----AKRVGIVLNFAP 222 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR KRVPWRVLAVVHHLLLSHGLAVSAFRAARPQAVRSDMPSPQIGIVLMIWP 234 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA KRVPWRVLAVVHHLLLSHGLAVSAFRAARPQAVRSDMPSPQIGIVLMIWP 234 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 HKNYREALIAAHHILLSHGEAVKAFREMNIKGS-------KIGITLNLTP 224 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 HKNYREALIAAHHILLSHGEAVKAFREMNIKGS-------KIGITLNLTP 224 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN HKDWREALIAAHHILLSHGEAVKVFRDMNLKGA-------QIGITLNLTP 227 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL HRDMNEAVRAVHHILLSHGKAVELLKREMTSTT-------PIGITLNLSP 222 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC LKDWRRAYRAAHHLLLSHGQAVRLYRELGLPG--------EIGITLNLTP 225 |A7HN90|A7HN90_FERNB HQNLQEALIAAHNLLRSHGHAVQAFREEVRDG--------KIGLTNVVTK 225 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 HKDINEALKAAHNLLRAHGYAVGVFREIVKDG--------KVGITNVVMK 226 |P26208|BGLA_CLOTH IKDLRTSLEVSHNLLLSHGKAVKLFREMNIDA--------QIGIALNLSY 225 : . *::: .** * : *:. |Q47RE2|Q47RE2_THEFY VRPYTDSEADRDAARRIDALRNRIFTEPLVKGRYPEDLIEDVAA-VTDYS 294 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU VRPYTDSEADRDAARRIDALRNRIFTEPLVKGRYPEDLIEDVAA-VTDYS 294 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY ILPASDSAADRAAADRAETLHNRVWFDPLFAGRYPANEADVWGE-LADGS 276 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD VRAASAEPADAEAARRVDGNANRLYLDPLFRGSYPQDMLEHYRG-ASDFS 271 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 ADPASDSDADRAAAWRYDGFFNRWYLDPLYRGTYPEDMLQLYAR-LGQTP 273

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|A8WAC9|A8WAC9_THETH VYGE-----DPEAVDVADRYHNRYFLDPILGRGYPESPFQDPP-----PT 262 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR QYPASQRIADQKAAQRIDGIMNRLFLEPLFCRRYPADMIDHFAR-RLVFA 283 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA QYPASQRIADQKAAQRIDGIMNRLFLEPLFCRRYPADMIDHFAR-RLVFA 283 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 AYPASEKEEDKLAAQYADGFANRWFLDPIFKGNYPEDMMELYSKIIGEFD 274 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 AYPASEKEEDKLAAQYADGFANRWFLDPIFKGNYPEDMMELYSKIIGEFD 274 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN AYPASEKEEDKLAVQYADGFANRWFLDPIFKGNYPEDMMELYSKIIGEFD 277 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL MYAKTDSANDRLAMNNADGYSNRWFLDPVFKGEYPVDMMNLFSKYVHNFD 272 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC VYAATPNPEDLAAADRQDMFQNRWFLDPVLRGEYPEELLHRVDQVVGGFD 275 |A7HN90|A7HN90_FERNB VEPGDSRPESFFVASLVDKVINAWFHDPVIFGKYPEEAVKNYVEMGLNV- 274 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 VEPANEVEEDYQMAVLVDEFINGWFHDPVVFGKYPENAKGVFGKLGIRT- 275 |P26208|BGLA_CLOTH HYPASEKAEDIEAAELSFSLAGRWYLDPVLKGRYPENALKLYKKKGIELS 275 . . : :*: ** . |Q47RE2|Q47RE2_THEFY FVQDGDLKTISANLDMMGVNFYNPSWVSGNRENGGSDRLPDEGYSPSVGS 344 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU FVQDGDLKTISANLDMMGVNFYNPSWVSGNRENGGSDRLPDEGYSPSVGS 344 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY YRRDGDLEIIGQPLDFLGINYYRPLKVAD-----GPLTEADPARRTAVDI 321 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD FVRDGDLQRISAPVDFLGVNYYMRHTVRAAP--GGGVRGPSTGMRFG-EL 318 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 PVQPDDMRIIAVPMDFLGVNYYSRAVIRD---------DPQAG-----GL 309 |A8WAC9|A8WAC9_THETH PILSRDLELVARPLDFLGVNYY--APVRV---------APGTG-----PL 296 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR PIQPGDFEIIGQPIDFLGINTYTRLLNAFTWR---------------EPF 318 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA PIQPGDFEIIGQPIDFLGINTYTRLLNAFTWR---------------EPF 318 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 FIKEGDLETISVPIDFLGVNYYTRSIVKYN--------------EDSMLK 310 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 FIKEGDLETISVPIDFLGVNYYTRSIVKYD--------------EDSMLK 310 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN FIREGDLETISVPIDFLGVNYYTRSIVKYN--------------EDSMLK 313 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL FIQPGDMETISTACDFFGINFYSRGIVEFN--------------AANDFL 308 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC AVKPGDLDVIATPIDFLGVNYYTRAVVADDP-------------SEPLLS 312 |A7HN90|A7HN90_FERNB --PDNDFDIISTPIDFFGVNYYTRTLVVFDE-------------TNPMKF 309 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 --YDNDLDIISVPIDFFGVNYYTRQLVTYDP-------------DEPFMY 310 |P26208|BGLA_CLOTH F-PEDDLKLISQPIDFIAFNNYSSEFIKYDP-------------SSESGF 311 *: :. *::..* * |Q47RE2|Q47RE2_THEFY EHVVEVDPGLPVTAMGWPIDPTGLYDTLTRLANDYPGLP-LYITENGAAF 393 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU EHVVEVDPGLPVTAMGWPIDPTGLYDTLTRLANDYPGLP-LYITENGAAF 393 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY RAHQQRFDGVRHTAMDWPVVPESFTDLLLDLTERYPNLPPIYITENGSAE 371 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD GAETVLPEGVGTTAMGWPVEPDGLAEILVRVKEEYRDLP-VFVTENGCAV 367 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 RYAHERPEGE-YTHMDWEVHPDSLRRLLERLHAEYAPGV-LYITENGAAY 357 |A8WAC9|A8WAC9_THETH PVRYLPPEGP-VTAMGWEVYPEGLYHLLKRLGRE-VPWP-LYITENGAAY 343 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR TMAKQVPGPLPKTAMGWEIYPDCIVEALQK-ARSYTSLP-LYITENGAAF 366 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA TMAKQVPGPLPKTAMGWEIYPDCIVEALQK-ARSYTSLP-LYITENGAAF 366 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 AEN--VPGPGKRTEMGWEISPESLYDLLKRLDREYTKLP-MYITENGAAF 357 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 AEN--VPGPGKRTEMGWEISPESLYDLLKRLDREYTKLP-MYITENGAAF 357 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN AEN--VPGPGKKTEMGWEISPESLYDLLKRLDREYTKLP-MYITENGVAF 360 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL KAD--AYSDYEKTGMGWDIAPNEFKDLIRRLRAEYTDLP-IYITENGAAF 355 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC VRH--VPGEGPRTEMDWEVYPDGLYDLLSRLRRDYGDIP-IYITENGAAF 359 |A7HN90|A7HN90_FERNB S---YVSGDLPKTEMGWEIYPQGLFDMLIYLKERYRLP--LYITENGMAG 354 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 K---IVPGNLPKTEMGWEVYPSGLYDMLKKLYIRYRLP--LYITENGMAG 355 |P26208|BGLA_CLOTH SPANSILEKFEKTDMGWIIYPEGLYDLLMLLDRDYGKPN-IVISENGAAF 360 * *.* : * : : : ::*** * |Q47RE2|Q47RE2_THEFY EDKVV---DGAVHDTERIAYLDSHLRAAHAAIEAGVPLKGYFAWSFMDNF 440 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU EDKVV---DGAVHDTERIAYLDSHLRAAHAAIEAGVPLKGYFAWSFMDNF 440 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY HDVVSP--DGRVHDTDRIAYLNDHLHALAAAIRAGVDVRGYFVWSLLDNF 419 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD HDYIDP--EGEVNDVERVAYLDAHLRAAHAALERGVDLRGYMVWSLLDNF 415 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 PDEIAP--DGGVHDPDRIRYIARHLVACHDAITAGVPLRGYFVWSLMDNF 405 |A8WAC9|A8WAC9_THETH PDLWTG--EAVVEDPERVAYLEAHVEAALRAREEGVDLRGYFVWSLMDNF 391 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR DDPAPGPSDQVVEDPQRVAYLQSHIEACRRAIAAGIDLRGYFVWTLLDNF 416 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA DDPAPGPSDQVVEDPQRVAYLQSHIEACRRAIAAGIDLRGYFVWTLLDNF 416 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 KDEVTE--DGRVHDDERIEYIKEHLKAAAKFIGEGGNLKGYFVWSLMDNF 405 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 KDEVTE--DGRVHDDERIEYIKEHLKAAAKFIGEGGNLKGYFVWSLMDNF 405 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN KDEVTE--DGRVHDYERIEYIKEHLKAIARFIEEGGNLKGYFVWSLLDNF 408 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL -DDVLE--NGEVHDDNRIDYVRQHLEAVSDLNDEGMNIQGYYLWSLMDNF 402 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC DDRVQ---DGGVHDADRVAYLAGHFAAAHRFLEEGGNLRGYYVWSLMDNF 406 |A7HN90|A7HN90_FERNB PDKVE---NGKVIDDYRIEYLEKHFEKALEAINAGVNLKGYFIWSLLDNF 401 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 PDKLE---GGLVKDTYRIDYLMKHFEMALKAINDGIDLRGYFIWSLMDNF 402 |P26208|BGLA_CLOTH KDEIGS--NGKIEDTKRIQYLKDYLTQAHRAIQDGVNLKAYYLWSLLDNF 408 * : * *: *: :. * ::.* *:::*** |Q47RE2|Q47RE2_THEFY EWALGYGKRFGIVHVDYESQTRTVKDSGWWYSRVMRNGGIFGQE------ 484 |Q9LAV5|Q9LAV5_THEFU EWALGYGKRFGIVHVDYESQTRTVKDSGWWYSRVMRNGGIFGQE------ 484 |Q47PF5|Q47PF5_THEFY EWAFGYERRFGIVRVDYDTLERLPKDSYFWYQRLIEHHRARHRG------ 463 |Q1AUD7|Q1AUD7_RUBXD EWAEGYSKRFGLVYVEYGSQRRVPKRSARWYAAVIRRGGPEG-------- 457 |A5UZB6|A5UZB6_ROSS1 EWAFGYSRRFGIIYVDYATQRRILKDSALFMRQVIAANAVEEG------- 448 |A8WAC9|A8WAC9_THETH EWAFGYTRRFGLYYVDFPSQRRIPKRSALWYRERIARAQT---------- 431 |B2QQB6|B2QQB6_9CHLR EWAKGYSKRFGIIYTDYTTQRRVWKRSAFVYRDIIARNGLFGNESS---- 462 |A9WAY6|A9WAY6_CHLAA EWAKGYSKRFGIIYTDYTTQRRVWKRSAFVYRDIIARNGLFGNESS---- 462 |B0KCV1|B0KCV1_THEP3 EWAHGYSKRFGIVYVDYETQKRILKDSALWYKEVIQK------NSIE--- 446 |B0KDF9|B0KDF9_THEP3 EWAHGYSKRFGIVYVDYTTQKRILKDSALWYKEVILD------DGIED-- 447 |Q8RCQ8|Q8RCQ8_THETN EWAHGYSKRFGIVYVDYETQKRILKDSAFWYKGVIEK------GVIE--- 449 |B2Q9U3|B2Q9U3_9BACL EWSFGYEKRFGILYIDFETQERIWKDSAKWYAGVIADHKAKHADSVEA-- 450 |Q0R5R7|Q0R5R7_ALIAC EWAFGYTKRFGIVYVDYDTLARIPKDSYFWYQRVIREGGLVPAEPAETAR 456 |A7HN90|A7HN90_FERNB EWAYGYSKRFGIVYVDYNTQKRILKKSAQWLKEFLRS------------- 438 |A6LNI1|A6LNI1_THEM4 EWAEGYSKRFGIIYVDYSTQKRYFKDSALWLKDFLNS------------- 439

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|P26208|BGLA_CLOTH EWAYGYNKRFGIVHVNFDTLERKIKDSGYWYKEVIKNNGF---------- 448 **: ** :***: :: : * * * :

Figura 5.-Este alineamiento múltiple generado por CLUSTALW de termófilos donde los asteriscos que se encuentran en la parte de abajo del alineamiento indican la conservación del residuo y los guiones las inserciones o perdidas de residuos. Q9KBK3_BACHD --MSII---------------QFPKEMKWGVATASYQIEGAINAGGRGASIWDVFAKTPG 43 BGLA_PAEPO --MTIF---------------QFPQDFMWGTATAAYQIEGAYQEDGRGLSIWDTFAHTPG 43 BGLB_PAEPO MSENTF---------------IFPATFMWGTSTSSYQIEGGTDEGGRTPSIWDTFCQIPG 45 A3KK08_STRAM --MSEYP--------------SFPPGFVLGAATASYQIEGAAREDGRGPSIWDTYSHTPG 44 Q9K440_STRCO --MSEYP--------------GFPPGFVFGAATASYQIEGAATEDGRGPSIWDTYSRTPG 44 A4X576_SALTO --MSNPASPPAVGVLAERPPLAFPPGFLWGAATAAYQIEGAATAGGRTPSIWDTFSHTPG 58 A8LUQ2_SALAI --MSNPASPPVVGVLAERPPLTFPPGFLWGAATAAYQIEGAATEGGRTPSIWDTFSHTPG 58 A0R2K0_MYCS2 --MSQPDR-----------TLGFPDGFVWGTATASYQIEGAVTAGGRAPSIWDTFSHKPG 47 A8LZF3_SALAI --MS---------------ELRFPDNFRWGAATAAYQIEGATRDDGRGPSIWDTFSRTPG 43 Q1J2J3_DEIGD --MTQTRPAP-----DTLRRSDFPAGFTFGIATSAYQIEGATSEDGRGPSIWDTFCREPG 53 A9AYR3_HERA2 --MTQR---------------AFPSDFLWGSATSSYQIEGAAFADGRSESIWDRFCKQPG 43 A6GCT8_9DELT --MTDH---------------AFPEDFVWGVATSCYQIEGAAQEDGRGESIWDRFAATPG 43 Q1CY46_MYXXD ----MR---------------QFPNDFLWGVATSAFQIEGATSADGRGESIWDRFAATPG 41 A9AYT4_HERA2 --MTTVEQ-------------HFPADFMWGTATSSYQIEGAVHEDGRGESIWDRFSHTPG 45 A5KVQ8_9GAMM --MNKFQLPS--------DSKLRSKEFLFGVATSSYQIEGGVEEGGRTPSIWDTFCKKPG 50 A3UQH3_VIBSP --MNKYQLPS--------DSKLRSKEFVFGVATSSYQIEGGVEEGGRTPSIWDTFCKTPG 50 . : * :*:.:****. .** **** :. ** Q9KBK3_BACHD KVKNGDNGDVACDSYHRYEEDIEIMKDLGVDMYRFSVAWPRIFPNGTGEVSREGLDYYHR 103 BGLA_PAEPO KVFNGDNGNVACDSYHRYEEDIRLMKELGIRTYRFSVSWPRIFPNGDGEVNQEGLDYYHR 103 BGLB_PAEPO KVIGGDCGDVACDHFHHFKEDVQLMKQLGFLHYRFSVAWPRIMP-AAGIINEEGLLFYEH 104 A3KK08_STRAM LVANGDTGDVACDHYHRYREDVALLRDLGVDSYRFSIAWPRIVPEGSGAVNPKGLDFYSR 104 Q9K440_STRCO LVVNGDTGDVACDHYHRYPEDVALLRDLGVDSYRFSIAWPRIVPDGSGAVNPKGLDFYSR 104 A4X576_SALTO RVVAGHTGDVACDHYHRLDSDVALMAELGLRSYRFSVSWPRVQPGGTGPINQEGLDFYRR 118 A8LUQ2_SALAI RVVAGHTGDVACDHYHRLDRDVALMAELGLRSYRFSVSWSRVQPGGHGPVNQEGLDFYRR 118 A0R2K0_MYCS2 AVHNGDNGDVADDHYHRYREDVGLLADLGVTHYRFSLAWPRLQPDGKGPINTEGLDFYQR 107 A8LZF3_SALAI KVHQGQTGDVACDHYHRFADDVELMAELGLGAYRFSVSWPRVQPDGTGPINPRGLDFYDR 103 Q1J2J3_DEIGD RIRDGSSGDVACDHYHRWEADLDLIAALGVNAYRFSVAWPRVQPDGRGPVNAAGLDFYER 113 A9AYR3_HERA2 AILDQSNGDIACDHYNRYRDDVALMARLGLQAYRFSVAWPRVLPNGRGAVNQAGLDFYRR 103 A6GCT8_9DELT KVIDGSSGAVACDHYHRYVEDVALMKSLNVPAYRFSIAWPRVVPAGRGAVNQKGLDFYSR 103 Q1CY46_MYXXD KISDGSDGKVACDHYHRWREDVALMRWLGVKSYRFSVAWPRVLPTGRGAVNAAGLDFYSR 101 A9AYT4_HERA2 KTKFGQTGDIACDHYHRYPEDLDLMRELGLGSYRFSLAWPRLFPEGKGKINQAGLDFYKR 105 A5KVQ8_9GAMM KVDNGDNGDVACDHYHLWQQDIEMIQGLGVDAYRLSIAWPRILP-QDGVVNQQGLEFYEQ 109 A3UQH3_VIBSP KVDNGDNGDVACDHYHLWQQDIEMIQGLGVDAYRLSIAWPRILP-QDGVVNQQGLEFYGQ 109 * :* * :: *: :: *.. **:*::*.*: * * :. ** :* : Q9KBK3_BACHD LVDRLTENGIQPMCTLYHWDLPQALQEKGGWDNRDTIDAFVRYAEVMFKEFGDKINHWIT 163 BGLA_PAEPO VVDLLNDNGIEPFCTLYHWDLPQALQDAGGWGNRRTIQAFVQFAETMFREFHGKIQHWLT 163 BGLB_PAEPO LLDEIELAGLIPMLTLYHWDLPQWIEDEGGWTQRETIQHFKTYASVIMDRFGERINWWNT 164 A3KK08_STRAM LVDELLAAGIEPAATLYHWDLPQALEDRGGWRVRETAERFAEYTAVVAEHLGDRVPRWIT 164 Q9K440_STRCO LVDELLAAGIEPAATLYHWDLPQALEDRGGWRVRETAERFAEYTAVVAEHLSDRVPRWIT 164 A4X576_SALTO LVDQLLANGIEPWLTLYHWDLPQPLEDAGGWPARDTAARFADYAALVAGALGDRVRYWTT 178 A8LUQ2_SALAI LVDQLLANGIEPWLTLYHWDLPQPLEDAGGWPTRDTSARFAEYTSLVAGALGDRVRYWTT 178 A0R2K0_MYCS2 LVDELLAHDIQPWVTLYHWDLPQTLEDAGGWPARDTAQRFADYAAMTHGKLHDRIRHWTT 167 A8LZF3_SALAI LVDALLGRGIDPIVTLYHWDLPQTLQDRGGWVTRETAEHFAGYAAAVHGRIGDRVASWTT 163 Q1J2J3_DEIGD LTDGLLARGIEPHVTLYHWDLPQPLQDTGGWPNRDTAERFAEYAAAVAGRLGDRVRSYAT 173 A9AYR3_HERA2 LVDELLQHNIRPFVTLYHWDLPQILEDAGGWPERATAEAFVEYADAVSRALGDTVKDWIT 163 A6GCT8_9DELT LVDTLLEAGIKPFATLYHWDLPQVLEDEGGWSKRETAKAFVDYAEAVVRHLGDRVTDWIT 163 Q1CY46_MYXXD LVDGLLDAGIEPFVTLYHWDLPQALQDLGGWPSRDTASAFVEYADVMSRKLGDRVKRWIT 161 A9AYT4_HERA2 IIEGLHQRHLTPMATLYHWDLPQALQDKGGWMNRDTALRFAEYAEAMYRQLGESVPFWIT 165 A5KVQ8_9GAMM IIDECHARGMKVYVTLYHWDLPQYLEDKGGWLNRETSYKFAEYAEVVSNYFGDKIDVYTT 169 A3UQH3_VIBSP IIDECHARGMKVYVTLYHWDLPQYLEDKGGWLNRETSYKFAEYAEVVSKYFGDNIDVYTT 169 : : : ********* ::: *** * * * :: : : : * Q9KBK3_BACHD FNELWCVSFLSNYIGVHAPGNTDLQLATNVAHHLLVAHGKAVQSYRKMG-LDGQIGYAPN 222 BGLA_PAEPO FNEPWCIAFLSNMLGVHAPGLTNLQTAIDVGHHLLVAHGLSVRRFRELG-TSGQIGIAPN 222 BGLB_PAEPO INEPYCASILGYGTGEHAPGHENWREAFTAAHHILMCHGIASNLHKEKG-LTGKIGITLN 223 A3KK08_STRAM LNEPWCSSFLGYSIGRHAPGAKEGRGALAAAHHLLVGHGLAVGALRAAG--VREVGITLN 222 Q9K440_STRCO LNEPWCSSFLGYSIGRHAPGAKEGRGALAAAHHLLVGHGLAVKALRAAG--VREVGITLN 222 A4X576_SALTO LNEPWCSAFLGYGSGAHAPGRSDPAAAVRAGHHLLLGHGLAVPALRAAAQSEVEIGVTLN 238 A8LUQ2_SALAI LNEPWCSAFLGYGSGAHAPGRSDPADAVRAGHHLMLGHGLAVQALRSSARSDAEVGVTVN 238 A0R2K0_MYCS2 LNEPWCSAFLGYAAGAHAPGRTEPAAALAAAHHLMFGHGLAVAAMRAQD-GDSQLGITVN 226 A8LZF3_SALAI LNEPWCSAYLGYGNGVHAPGIQDPGAAFTAVHHLLLGHGLAARALRTAG--AGTVGITLN 221 Q1J2J3_DEIGD LNEPWCSSILSYEIGEHAPGLRDRRLALAAAHGLLLGHGLALPELRRQAP-RAAAGIVLN 232 A9AYR3_HERA2 HNEPWCAGLLGYQIGEHAPGRKNWNDGLKASHHLLLSHGWAVDVIRRNVP-QASVGITLN 222 A6GCT8_9DELT HNEPWCASMLGYEMGVHAPGVVDKARAIVASHHLLLSHGWAMPVIREHCP-GARAGITLN 222 Q1CY46_MYXXD HNEPWCISVLGYGNGEHAPGHKNWGEVLATAHHTLLSHGQAVPVIRANVK-NAEVGITLN 220 A9AYT4_HERA2 HNEPWVAAFVGHFQGRHAPGIKDLPSAVKASHHLLYSHGLATQLFRESK-LAGQIGITLN 224 A5KVQ8_9GAMM LNEPFVSAFLGYRWGEHAPGIKGEKEGFLASHHLMLGHGLAMPILRKNAP-HAKHGVVFN 228 A3UQH3_VIBSP LNEPFVSAFLGYRWGEHAPGIKGEKEGYLASHHLMLAHGLAMPILRNNAP-HAKHGVVFN 228 ** : . :. * **** . * : ** : : * . *

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Q9KBK3_BACHD VEWNEPFS-NQMEDAEACKRGNGWFIEWFMDPVFKGAYPSFLVEWFE----KKGITVP-I 276 BGLA_PAEPO VSWAVPYS-TSEEDKAACARTISLHSDWFLQPIYQGSYPQFLVDWFA----EQGATVP-I 276 BGLB_PAEPO MEHVDAAS-ERPEDVAAAIRRDGFINRWFAEPLFNGKYPEDMVEWYG----TYLNGLDFV 278 A3KK08_STRAM LDRNLPAT-DSPADLAAVVRADTQHNLVWTEPILAGRYPATEEETWG----ELITGADFR 277 Q9K440_STRCO LDRNLPAT-DSPADLAAVVRADTQHNLVWTEPILAGRYPATEEETWG----ELITGEDFR 277 A4X576_SALTO LYPVTPAT-DSPGDADAARRIDGLANRFFLDPLLRGSYPADLMSDL-----RQVSDFGHV 292 A8LUQ2_SALAI LYPVTPAT-DSPGDADAARRIDALANRFFLDPLLRGAYPVDLMLDL-----ERVADFGHV 292 A0R2K0_MYCS2 LTPVSPAT-EEPADVDAARRVDAVSNRLFLDALLRGRYPADLSADV-----AMISDFGFV 280 A8LZF3_SALAI PADVRPADPDSAADAAAVRLVDGLQNRIFLDPLFRAAYPVDVLEHI-----ARIVPPAFI 276 Q1J2J3_DEIGD LGPQMPAS-DRPEDVAAARLADGRFNRWFLEPLLRGEYPRDVWEAC-------SADVPEV 284 A9AYR3_HERA2 FTPAMPAS-RSTEDLNATRHFDGFFNRWFLDPVYGREYPADMVRDYTELGYLP-NGLDFV 280 A6GCT8_9DELT LQPMEPAS-DSAADHDAWRHSDGHFNRWFLDPVHGRGYPEDMVRDYIAGGFLPAEGMTMV 281 Q1CY46_MYXXD LSPAEPAS-PSPEDAEACRRHDGSFNRWFLDPLYGRGYPKDVVEDYVKDGRLASSALPFV 279 A9AYT4_HERA2 LTPAYPTH-DTPDDHAAAWRNDGYGNRWFLDPIFRGSYPADTVEWFQQ---HHQIEMDYV 280 A5KVQ8_9GAMM ATPAYPLT---PQDQGAADYCEAENYHWFIDPVLKGEYPQPVVDRQA-------MNMPMI 278 A3UQH3_VIBSP ATPAYPLT---PQDQAAADYCEAENYHWFIDPVLKGEYPQLVVERQA-------MNMPMI 278 . * * : :.: ** Q9KBK3_BACHD EAGDMETIQQPIDFLGINYYTGSVARYKENEGLFDL----------------EKVDAGYE 320 BGLA_PAEPO QDGDMDIIGEPIDMIGINYYSMSVNRFNPEAGFLQS----------------EEINMGLP 320 BGLB_PAEPO QPGDMELIQQPGDFLGINYYTRSIIRSTNDASLLQV----------------EQVHMEEP 322 A3KK08_STRAM LDGDLELISRPLDFLGVNYYRPIVVAGAPHRESDP------ARRVATDNRYEEVRLPGVR 331 Q9K440_STRCO RDGDLELISQPLDFLGVNYYRPIVVADAPHRESDP------ARRVATDNRYEEVRHPGVR 331 A4X576_SALTO RAGDLATIAAPLDLVGINYYSRHVVAAPTAAAPPEPYWRTPSCWPGSE-DVRFVAR-GMP 350 A8LUQ2_SALAI HEGDLDTIAAPLDLVGINYYSRHVVAAPAAQAPPQPYWRTPSCWPGSE-HVRFVTR-GVP 350 A0R2K0_MYCS2 QPGDEAVIAAPLDFLGVNYYFRETVRFGTGAPSDNPHAR---AWVGST-DVEPVRT-GLP 335 A8LZF3_SALAI RDGDEKLIATPIDLLGVNYYTPTYVAGRPDGAGGG------GAFPGTDGAVEFLPP-TGP 329 Q1J2J3_DEIGD REGDLALIAAPLDFLGVNYYSRGVLSASGGGVPAG-----------------------AP 321 A9AYR3_HERA2 HDGDFKAMAATTDFLGVNYYSRAVIHDPKTGTAP---------------------KLDSE 319 A6GCT8_9DELT QPGDLEAIAAPADFLGVNYYNRMIIRSEKIPEAQNDPVI-------------RSLAPKEE 328 Q1CY46_MYXXD RDGDMAAIAVPTDFLGINYYSRAIMRSDRIPESQNAP---------------RTVHPEPE 324 A9AYT4_HERA2 QTGDLAVIQQPIDFLGINYYFPNRISAADESKFLALVN----------------SPAIGE 324 A5KVQ8_9GAMM LEGDLDIISAPVDYIGINYYTRNVARFNENGDIES------------------VKQTDAE 320 A3UQH3_VIBSP LEGDLDIISAPVDYIGINYYTRNVARFNENGDIES------------------VKQTDAE 320 ** : . * :*:*** Q9KBK3_BACHD KTDIGWNIYPEGFYKVLYYITEQYGQ--IPIYITENGSCYNDE--PVNGQ---------- 366 BGLA_PAEPO VTDIGWPVESRGLYEVLHYL-QKYGN--IDIYITENGACINDE--VVNGK---------- 365 BGLB_PAEPO VTDMGWEIHPESFYKLLTRIEKDFSKG-LPILITENGAAMRDE--LVNGQ---------- 369 A3KK08_STRAM ETAMGWPVVPDSFTELLVRLKKQYGDALPPIHITENGSAEDDA-PAADGA---------- 380 Q9K440_STRCO HTAMNWPVVPDSFTDLLVALKRQYGDALPPVHITENGSAEDDA-AAADGT---------- 380 A4X576_SALTO VTDMDWEIDPSGLVETLQRVYEEYTD--LPLYVTENGSAFVD--AVVDGK---------- 396 A8LUQ2_SALAI VTDMDWEIDPPGLVETLQRVYEEYTD--LPLYVTENGSAFVD--TVVEGH---------- 396 A0R2K0_MYCS2 TTAMGWEIDPTGLYDVLSWVHREYGP--VPIYVTENGAAFDDD-AEADGS---------- 382 A8LZF3_SALAI LTDMGWMIEPAGLTRMLERLAADYPG--VPLLITENGAAFPDR-AGAEGVGADRTEAEGA 386 Q1J2J3_DEIGD VTAMGWEIYPQGLTDLLLRLQADYPS-LPPILITENGAAFTD--RLEDGR---------- 368 A9AYR3_HERA2 YTDIGWEVYPQGLGDLLKRLAFAYNP--GKIYVTENGASYNDG-PDAHGE---------- 366 A6GCT8_9DELT WTEMGWEVYPNGLYQTLMRVYLHYGP--RKMYVTENGCSYSTG-PDADGQ---------- 375 Q1CY46_MYXXD RTDMDWEVYAPALTRMLVHLHTDYQP--GPLYITENGCAYATG-PSEDGK---------- 371 A9AYT4_HERA2 TSFRGWEVVPAAFADLLKRVQRDYGN--TPIYITENGSAFADLKRAADGS---------- 372 A5KVQ8_9GAMM HTYIGWEINPQGLTDLLVRLDARYEN-MPPIYITENGAAGNDE--RVNGQ---------- 367 A3UQH3_VIBSP HTYIGWEINPQGLTDLLVRLDARYEN-MPPIYITENGAAGNDE--RVNGQ---------- 367 : .* : . .: * : : : :****.. .* Q9KBK3_BACHD --VKDEGRIRYLSQHLTALKRSMESGVNIKGYMAWSLLDNFEWAEGYSMRFGIVHVNYRT 424 BGLA_PAEPO --VQDDRRISYMQQHLVQVHRTIHDGLHVKGYMAWSLLDNFEWAEGYNMRFGMIHVDFRT 423 BGLB_PAEPO --IEDTGRHGYIEEHLKACHRFIEEGGQLKGYFVWSFLDNFEWAWGYSKRFGIVHINYET 427 A3KK08_STRAM --VHDADRVAYLRDHLRALRAAMDAGVDVRGYYVWSLLDNFEWAYGYDKRFGIVRVDYDT 438 Q9K440_STRCO --VHDTDRVAYLRDHLTALRAAIDAGVDVRGYYVWSLLDNFEWAYGYDKRFGIVRVDYDT 438 A4X576_SALTO --VDDPDRVAYFEAHLRAAHQAIAAGVPLRGYFAWSLMDNFEWAWGYTKRFGMIHVDYRS 454 A8LUQ2_SALAI --VDDPDRVAYFDAHLRAAHQAITAGVPLRGYFAWSLMDNFEWAWGYTKRFGMIHIDYRS 454 A0R2K0_MYCS2 --IRDDDRITFLDSHFRATLRAIDDGADIRGYFVWSLLDNFEWAYGYAKRFGLIHVDYAT 440 A8LZF3_SALAI GPVADTDRIAYLDAHLRAAHTAIARGVDLRGYLVWSLLDNFEWAEGYRKRFGIVHVDYLT 446 Q1J2J3_DEIGD --VHDPERVRYLQTHLAALRRALDAGVDVRGYFAWSLMDNFEWAYGYEKRFGLVYVDYPT 426 A9AYR3_HERA2 --VNDTRRTQYLHDHLSVCSDAIAAGVPLAGYFVWSLMDNFEWAKGYSQRFGVIWVDYET 424 A6GCT8_9DELT --VPDARRVAYFRDHLRAAHRAIADGAPLAGYFAWSLMDNYEWERGYGQRFGIVHVDYET 433 Q1CY46_MYXXD --VHDDKRVAYLRSHLEASLEAIRQGVPLAGYFAWSLMDNFEWAFGYQKRFGMVYVDYDS 429 A9AYT4_HERA2 --VNDGDRMSYLHTHLEAVADAIAAGVPVKGYYAWSMLDNYEWAEGYDERFGIIEVDFAT 430 A5KVQ8_9GAMM --VMDDQRVRYFQGHIEAVHNAVEAGVKVDGYFAWSLMDNFEWAFGYCQRFGIVHVDYTT 425 A3UQH3_VIBSP --VMDDQRVRYFQGHIEAVHNAVEAGVKVDGYFAWSLMDNFEWAFGYCQRFGIVHVDYTT 425 : * * :: *: : * : ** .**::**:** ** ***:: ::: : Q9KBK3_BACHD LERTKKDSFYWYKQMIANQFFEL--------------------- 447 BGLA_PAEPO QVRTPKESYYWYRNVVSNNWLETRR------------------- 448 BGLB_PAEPO QERTPKQSALWFKQMMAKNGF----------------------- 448 A3KK08_STRAM QERTPKDSYRWYREMIAANRG----------------------- 459 Q9K440_STRCO QRRTPKDSYRWYREMIAANRG----------------------- 459 A4X576_SALTO QARTLKSSGRWYAETIRRNGLAAQ-------------------- 478 A8LUQ2_SALAI QVRTLKSSGRWYAEVIRRNGLAAQ-------------------- 478 A0R2K0_MYCS2 QVRTPKASARWFAEVTRRNGVPHVFRQNDAPADIR--------- 475 A8LZF3_SALAI QRRTPKASARWYQEVISRNGL----------------------- 467 Q1J2J3_DEIGD QTRVLKDSGHWYRQFLR--------------------------- 443 A9AYR3_HERA2 QQRIPKASAHWYSRVVKANAVQPLEVLA---------------- 452 A6GCT8_9DELT QARTPKASAEFLAKVFADNAVPVDETPA---------------- 461

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18

Q1CY46_MYXXD QRRIPKDSAHLYKALVEKNGLDVELAA----------------- 456 A9AYT4_HERA2 QKRTPKRTARWYQQIVANNGLPSLPADVQALAERYRNCPIGPQD 474 A5KVQ8_9GAMM QERTLKQSAIAYRNMLQERAEENR-------------------- 449 A3UQH3_VIBSP QERTLKQSAIAYRNMLLERAEENR------------------- * * :

Figura 6- Alineamiento múltiple generado por CLUSTALW para el conjunto de proteínas estudiadas el asterisco indica la conservación del residuo en esa posición para todas las proteínas del grupo analizado. Los guiones indican las inserciones que debió realizar CLUSTALW para crear un alineamiento con alto puntaje en homologia, y en letras negritas se identifica el lugar de la secuencia donde se realizaron las mutaciones. 5.-Identificación de las diferencias entre termófilos y mesófilos mediante la salida del programa WEBLOGO El programa WEBLOGO (VI) requiere el ingreso del alineamiento generado por CLUSTALW , con esta información construye una gráfica los símbolos de cada residuo en colores con un tamaño proporcional a la conservación de cada residuo en una determinada posición en el alineamiento múltiple, donde cada una de las letras de los aminoácidos en un color diferente describe las propiedades fisicoquímicas en sus cadenas laterales esto la hace una herramienta de gran utilidad para poder identificar de forma rápida, y visual, las diferencias entre residuos presentes en las proteínas de organismos mesófilos y termófilos. Esta salida de CLUSTALW se empleó por separado para WEBLOGO por cada grupo de secuencias de proteínas homólogas de mesófilos y termófilos. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7.

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Figura 7.- Estos gráficos representan el resultado de WEBLOGO. El tamaño de las letras representa la conservación en cada aminoácido en cada posición de las secuencias alineadas en forma múltiple por CLUSTALW así como la posición de la secuencia del alineamiento múltiple y el color simboliza las mismas propiedades fisicoquímicas descritas previamente. 6.- Identificación de las posibles mutantes que confieran termoestabilidad a βglB de Paenibacillus polymyxa

La forma en que se decidió hacer las mutaciones fue observando las gráficas generadas por WEBLOGO para identificar en qué parte de las secuencia se encontraban los aminoácidos más conservados en las secuencias de termófilos, y que estuvieran simultáneamente ausentes en las proteínas de mesófilos (un ejemplo es Leucina se encuentra presente en termófilos y en secuencia de mesófilas no aparece). Una vez identificados los residuos, con estas características, se buscó en la salida de CLUSTALW la secuencia de βglB para conocer el cambio específico que debería llevarse a cabo en esta enzima, y así tener la posibilidad de que ella adquiera propiedades termorresistentes mediante diseño racional. De este análisis surgieron las tres mutaciones en la proteína bajo estudio, que se anotan en βglB de la tabla 1. Y que se localizan, en color rojo, en la secuencia de aminoácidos. Adicionalmente se presentan las fórmulas semicondensadas de los aminoácidos involucrados en cada mutación.

>gi|80133|pir||JW0038 beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) B - Bacillus polymyxa MSENTFIFPATFMWGTSTSSYQIEGGTDEGGRTPSIWDTFCQIPGKVIGGDCGDVACDHFHHFKEDVQLM KQLGFLHYRFSVAWPRIMPAAGIINEEGLLFYEHLLDEIELAGLIPMLTLYHWDLPQWIEDEGGWTQRET IQHFKTYASVIMDRFGERINWWNTINEPYCASILGYGTGEHAPGHENWREAFTAAHHILMCHGIASNLHK EKGLTGKIGITLNMEHVDAASERPEDVAAAIRRDGFINRWFAEPLFNGKYPEDMVEWYGTYLNGLDFVQP GDMELIQQPGDFLGINYYTRSIIRSTNDASLLQVEQVHMEEPVTDMGWEIHPESFYKLLTRIEKDFSKGL PILITENGAAMRDELVNGQIEDTGRHGYIEEHLKACHRFIEEGGQLKGYFVWSFLDNFEWAWGYSKRFGI

VHINYETQERTPKQSALWFKQMMAKNGF

Tabla 1.-

Aminoácido original Cambio propuesto

Alanina (A) 90 Ácido glutámico (E)

Leucina (L) 11 Ácido glutámico (E)

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Alanina (Ala,A) Ácido glutámico (Glu,E)

NH+3 NH+3

| | -OOC ─ C —CH3 ----------------->

- OOC—C─CH2 CH2 COO-

| | H H

Leucina (Leu,L) Ácido glutámico (Glu,E)

NH+3 NH+3

| | -OOC ─ C—CH2 CH CH3 ---------->

- OOC—C─CH2-CH2 COO -

Glicina (G) 281 Ácido aspártico (D)

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22

| | | H CH3 H

Glicina (Gly,G) Ácido aspártico (Asp,D)

NH+3 NH+

3

| | -OOC ─ C—H ----------- >

- OOC ─ C ─CH2 COO-

| | H H

Figura 8.- Los tres cambios propuestos de aminoácidos sobre la secuencia de βglB 7.-Construcción de mutantes, rotámeros y minimización de energía con el empleo de MOE El programa MOE contiene una amplia variedad de aplicaciones, entre ellas se encuentra el visualizar una enzima en su estructura tridimensional. Para ello se hace uso de la información generada por la estructura cristalográfica en su archivo pdb (Banco Mundial de datos de Proteínas) cuyo código para la βglB es 2O9T para crear cada una de las mutantes propuestas, se siguió el proceso que se describe a continuación. Dentro del programa MOE se encuentra una ventana llamada Sequence Editor en donde podemos visualizar la secuencia de nuestra proteína de estudio. Ésta se muestra en código de una sola letra, y ahí puede seleccionar el aminoácido que debe ser reemplazado por alguno de los 19 aminoácidos restantes, los cuales aparecen en una ventana vertical para su elección con el ratón. Después de realizar la mutación podemos identificar la ventana gráfica y en ella, observamos cómo los residuos se reacomodan con el nuevo aminoácido que mutamos en la misma posición estructural de la proteína de estudio. Para el modelado se usan los rotámeros, son aquellos que se obtienen por la rotación de enlaces sencillos que cambian a diferentes ángulos para ajustar lo mejor posible a la secuencia de βglB que se desea modelar, estos están depositados en la biblioteca del programa MOE . Una vez generados se realiza la minimización de energía que se describe a continuación. La minimización de energía de una molécula consiste en encontrar el conjunto de coordenadas atómicas que corresponde al mínimo local de la función de energía potencial empleada por el campo de fuerzas. De esta forma se garantiza que los nuevos residuos establezcan interacciones favorables con la finalidad de alcanzar el estado más relajado para todos los átomos presentes en cada una de las moléculas de βglB mutadas. Se diseñó la relajación por etapas partiendo del residuo mutado, permitiendo que éste se

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moviera libremente hasta encontrar una posición estructural adecuada con respecto al resto de la estructura, la cual permaneció fija; posteriormente se permitió la movilidad del residuo mutado junto con sus vecinos cercanos a 4.5 Ǻ, para permitir que el residuo mutado se acomodara lo mejor posible con sus vecinos inmediatos. Posteriormente, se permitió la movilidad de toda la molécula de βglB para encontrar el estado más relajado de todos los átomos que la conforman. A continuación se llevó a cabo el proceso de minimización de energía de cada uno de los rotámeros antes mencionados. Los cálculos de minimización de energía se realizaron empleando un campo de fuerzas optimizado para la representación de proteínas (CHARMM 27), y con átomos de hidrógeno y cargas parciales asignadas por el propio programa de simulación molecular. Una vez realizadas las mutaciones el programa de generación de rotámeros rindió una lista de 20 rotámeros que formó una lista de mayor a menor energía potencial y de ella elegimos el primero, el intermedio y último para tener una muestra representativa de rotámeros generados por el programa MOE los cuales etiquetamos con los siguientes nombres AXE1, AXE2, AXE3. Donde la X simboliza la sustitución de los aminoácidos que lo flanquean, por ejemplo en el primer caso se sustituyó alanina(A) por ácido glutámico (E) que le procede la notación para la segunda puntualizar de quien localizada en el residuo 111 y la tercera en el residuo 281 donde las variantes construidas fueron: LXE1, LXE2, LXE3 y GXD1, GXD2, GXD3 respectivamente. El arreglo tridimensional obtenido después de estos cálculos se muestra posteriormente para cada uno de los residuos sustituidos en la tabla 3 como análisis de resultados Las representaciones estructurales de tres rotámeros generados por MOE en esta etapa de cálculo se muestran en la figura 9. A) Rotámero LXE1 B) Rotámero LXE

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C) Rotámero GXD3

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Figura 9.- Tres rotámeros de βglB representados en forma de listones en los que se aprecian las estructuras secundarias y los residuos mutados a la cadena original. A) Rotámero LXE1, B) Rotámero LXE y C) Rotámero GXD3 Este proceso se realizó en etapas para evitar deformaciones de la molécula en estudio. Al inicio se permitió sólo la movilidad de los residuos mutados, en la siguiente etapa se admitió únicamente la movilidad de esta cadena y sus vecinos a una distancia de 4.5 Å, posteriormente se permitió la movilidad de toda la molécula. En este proceso de minimización de energía se usó el campo de fuerza CHARMM 27 el cual está parametrizado para simular biomoléculas como las proteínas. La secuencia de pasos de la minimización descrita se repitió para cada una, de las tres rotámeros de cada una de las tres mutantes de βglB realizadas en este trabajo. Como resultado de la minimización realizada por el programa MOE sobre cada una de las mutantes construidas se obtuvieron los valores de la energía potencial que se anotan en la tabla 2 Tabla 2.-

Tabla 2 .Valores en kcal/mol de la energía potencial total, y de cada contribución a ella obtenidos para la proteína silvestre y los 9 rotámeros de las tres mutaciones realizadas. Se resaltan color rojo los datos de los rotámeros de más baja energía. 8.- ANÁLISIS DE RESULTADOS

Epot

enlace

ángulo

inversión

torsion

vdw

ele

βglB -3015.07

890.597

1688.577

41.125

1982.919

798.532

-8416.82

AXE1

-3001.33

893.267

1725.809

40.285

2021.400

810.176

-8492.12

AXE2

-3055.99

893.093

1698.434

38.982

2011.156

755.467

-8453.1

AXE3

-3046.91

891.848

1710.274

41.923

2020.651

775.665

-8487.28

LXE1

-3077.40

897.450

1725.660

39.770

2012.880

775.381

-8528.54 LXE2

-3090.10

904.773

1700.791

44.185

2016.605

832.383

-8588.84 LXE3

-2952.85

900.493

1731.502

42.338

2023.158

756.704

-8407.05

GXD1

-2985.18

896.434

1725.702

41.994

2036.269

774.900

-8460.47

GXD2

-3040.03

903.064

1724.148

43.968

2024.541

784.374

-8520.12

GXD3

-3061.31

906.188

1731.871

42.768

2042.708

787.750

-8572.59

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Al comparar los valores de la energía potencial de βglB silvestre con la correspondiente a los rotámeros que aparecen en la tabla 2, resulta evidente la gran similitud existente

entre las magnitudes de estos parámetros. Sin embargo, los rotámeros poseen estructuras más estables, es decir de energía potencial más baja que la βglB silvestre (salvo en el caso del rotámero AXE1). Este hecho puede deberse a que los rotámeros establecieron un mayor número de interacciones intramoleculares, que la βglB natural, debidas a la mutación introducida en la molécula. Otro punto importante que puede resaltarse del análisis de la tabla 2 es que los contribuyentes de la energía potencial tienen valores positivas en todos sus valores. Pero dado que la energía potencial más baja implica valores negativos los casos son evidentes damos que el componente que aporta mayor estabilidad a la molécula es la energía electrostática. Para poder identificar cuantitativamente las mayores diferencias en energía potencial, y sus contribuyentes, entre la βglB y los tres rotámeros de menor energía, se calculó la diferencia de los valores que presenta la enzima silvestre y cada uno de los rotámeros mencionados. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 3. Tabla 3.- Datos obtenidos de las diferencias en los valores energéticos de βglB y los rotámeros marcados en rojo en la tabla 2. Como puede observarse en esta tabla, los valores que más divergen entre la βglB natural y los tres rotámeros analizados son los correspondientes a la energía electrostática, lo cual puede deberse a que en todos los casos se sustituyó un residuo hidrofóbico por otro con carga eléctrica. Esta carga eléctrica seguramente interactúa favorablemente con cargas de signo opuesto en la molécula de βglB mutada.

Epot

enlace

ángulo

inversión

torsión

vdw

ele

LXE2

75.03

-14.176

-12.214

-3.06

-33.686

-33.851

172.02

LXE1

62.33

-6.853

-37.083

1.355

-29.961

-23.151

111.72

GXD3

46.24

-15.591

-43.294

-1.643

-59.789

10.782

155.77

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CONCLUSIONES Los programas computacionales fueron de gran utilidad para el desarrollo este trabajo ya que pudimos manejar una vasta información en forma inmediata y gratuita, permitiendo así un ahorro tiempo y esfuerzo experimentales para cumplir con el objetivo establecido en este proyecto. La información sobre las proteínas homólogas a βglB reunida, nos permitió hacer comparaciones de secuencias y tomar decisiones para proponer las mutantes más prometedoras que desarrollen termorresistencia en la βglB. Basándose en los resultados de las tablas 2 y 3 de este trabajo puede afirmarse que las mutantes LXE2 en la posición 111 y GXD3 del residuo 281 de la secuencia de βglB son las más estables de todas las estructuras generadas por el programa MOE . Ello hace suponer que serán buenas candidatas para conferir termorresitencia a la molécula de βglB al ser sintetizadas en el laboratorio. Para poder identificar las secuencias de las proteínas homólogas generadas por la base de datos de los programas computacionales nos fue de gran ayuda el servidor Genome Proyect para realizar su clasificación en mesófilas y termófilas lo cual fue uno de los objetivos planteados en el presente trabajo. Por otro lado, pudimos haber considerado a un número mayor de homólogas del grupo de las mesófilas y termófilas de las cuales obtendríamos información más completa para poder seleccionar otras mutantes de βglB con propiedades termorresitentes. Ya que al analizar un gran número de secuencias se obtienen mayor cantidad de datos para poder proponer mutantes adicionales.

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