UNIVERSITAS INDONESIA Kajian Aktivitas Antioksidan ... · PDF filekhususnya teman-teman di...

UNIVERSITAS INDONESIA

Kajian Aktivitas Antioksidan, Modulasi Sitokin TNF- dan TGF-β1oleh Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) pada Pencegahan Fibrosis Hati

pada Tikus yang diinduksi Karbon Tetraklorida

TESIS

NANIK SUNDARINPM: 1206330495

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIAPROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

KEKHUSUSAN FARMAKOLOGIJAKARTAJUNI 2014

UNIVERSITAS INDONESIA

Kajian Aktivitas Antioksidan, Modulasi Sitokin TNF- dan TGF-β1oleh Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) pada Pencegahan Fibrosis Hati

pada Tikus yang diinduksi Karbon Tetraklorida

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelarMagister dalam Ilmu Biomedik

NANIK SUNDARINPM: 1206330495

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIAPROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

KEKHUSUSAN FARMAKOLOGIJAKARTAJUNI 2014

iiUniversitas Indonesia

iiiUniversitas Indonesia

ivUniversitas Indonesia

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahi Rabbil ‘Alamin, segala puji dan syukur penulis panjatkan

kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat, hidayah, karunia, dan

pertolongan-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul “Kajian

aktivitas antioksidan, modulasi sitokin TNF- dan TGF-β1 oleh mahkota dewa

(Phaleria macrocarpa) pada pencegahan fibrosis hati pada tikus yang diinduksi

karbon tetraklorida”. Tesis ini disusun dalam rangka memenuhi persyaratan untuk

memperoleh gelar Master Biomedik dari Program Magister Ilmu Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Indonesia.

Dalam kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan

yang sebesar-besarnya kepada dr. Vivian Soetikno, PhD., Sp.FK selaku pembimbing I

dan Dr. Melva Louisa, SSi., Apt., M.Biomed. selaku pembimbing II dan ketua

akademis yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, arahan,

kritik, saran, dukungan dan motivasi kepada penulis sehingga penelitian dan

penyusunan tesis ini dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan

kepada dr. Nafrialdy, PhD., Sp.PD., Sp.FK., Prof. Dr. dr. Sri Widia A. Jusman, MS.,

dan Prof. Dr. dr. Erni Hernawati Purwaningsih, MS. selaku penyanggah yang telah

berkenan memeriksa dan memberikan saran untuk penyempurnaan penulisan tesis ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Wawaimuli Arozal,

M.Biomed., Ph.D selaku ketua Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas

Kedokteran Universitas Indonesia, serta seluruh staf pengajar dan staf administrasi

dalam departemen tersebut, atas dukungannya selama penulis mengerjakan penelitian

ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Raymond R.

Tjandrawinata, Ph.D yang telah memberikan kesempatan dan mendanai penelitian ini.

Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada dr. H. Ahmad Aulia Jusuf, AHK,

PhD dan dr. Vetnizah Juniantito, PhD yang telah menyediakan waktu dan tenaga

untuk memberikan bantuan, bimbingan dan saran kepada penulis untuk menilai

sediaan histologi.

Dalam melaksanakan penelitian ini, peneliti dibantu oleh para laboran di

Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Oleh karena

itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Arif Supriyadi, Bapak Dede,

Bapak Rukmana, Bapak Kanto, Saudari Chiswita Chaliana, Saudari Tya dan Mas

vUniversitas Indonesia

Nasip atas bantuannya dan waktu yang diluangkan untuk membantu dalam

pelaksanaan penelitian ini.

Ucapan terima kasih, penulis sampaikan kepada Prof. Dra. Arini Setiawati,

PhD, Ibu Dra. Lucky S. Slamet, MSc., Ibu Dra. Endang Woro T., MSc, Ibu Dra.

Nurma Hidayati, MEpid, Ibu Dra. Ratna Irawati, MKes., Ibu Dra. Ega Febrina, Ibu

Dra. Lela Amelia, MEpid., Ibu Dra. Herawati, M.Biomed., Ibu Juliati SSi. Apt.

M.Biomed., Ibu Ade Irma Haryani, SSi., Apt., dan temana-teman di Kasubdit

Penilaian Obat Baru Badan POM atas kesempatan dan dukungan yang telah diberikan

kepada penulis untuk mengikuti Program Magister Ilmu Biomedik.

Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk kedua orangtuaku

tersayang yang telah mendoakan, mendidik, mendorong dan mendukung penulis

untuk selalu jujur, berdoa, belajar dan bekerja dengan sebaik-baiknya sehingga tesis

ini dapat diselesaikan. Terima kasih juga kepada adikku, Budi dan Puput, Lek

Hardiyo sekeluarga dan Lek Harni sekeluarga atas dukungan selama ini.

Terima kasih kepada teman mahasiswa di Program Studi Ilmu Biomedik,

khususnya teman-teman di kekhususan Farmakologi, Bantari dan Nurfitri atas

motivasi dan dukungan moral yang telah diberikan kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan pada tesis ini. Harapan

penulis, tesis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan pada

umumnya dan farmakologi pada khususnya.

Jakarta, Juni 2014

Nanik Sundari

viUniversitas Indonesia

viiUniversitas Indonesia

ABSTRAK

Nama : Nanik SundariProgram Studi : Ilmu BiomedikJudul : Kajian aktivitas antioksidan, modulasi sitokin TNF- dan

TGF-β1 oleh mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) padapencegahan fibrosis hati pada tikus yang diinduksi karbontetraklorida

Latar belakang: Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) merupakan salah satutanaman herbal di Indonesia dan ekstrak air buah mahkota dewa telah terbuktimemiliki efek hepatoprotektif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitasdan mekanisme kerja ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah terjadinyafibrosis hati.Metode: Penelitian dilakukan pada tikus Sprague-Dawley jantan yang diinduksikarbon tetraklorida (CCl4) secara intraperitoneal setiap 3 hari sekali selama 8 minggu.Hewan coba dibagi menjadi 6 kelompok: normal, CCl4, n-Acetyl cysteine (NAC)dosis 150 mg/kgBB, ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB.Penilaian dilakukan terhadap parameter aspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), alkali fosfatase (ALP), histopatologi hati, kadarmalondialdehid (MDA), rasio GSH/GSSG, kadar Tumor Necrosis Factor (TNF)-αdan kadar Transforming Growth Factor (TGF)-β1Hasil: Hasil studi menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dan NACsecara bermakna dapat melindungi hati dari cedera melalui penurunan aktivitas enzimALT, AST, ALP dan penurunan persentase jaringan ikat pada pemeriksaanhistopatologi. Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menghambat stressoksidatif melalui penurunan kadar MDA hati dan peningkatan rasio GSH/GSSG hati.Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menekan inflamasi melaluipenurunan kadar TNF-α dan menghambat aktivasi sel stelata hati (HSC) yangditandai dengan penurunan kadar TGF-β1.Kesimpulan: Ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah fibrosis hati pada tikusyang diinduksi CCl4. Pencegahan terhadap fibrosis tersebut terutama melalui aktivitasantioksidan dan kemampuan menekan sitokin inflamasi TNF-α, serta menghambataktivasi HSC melalui penurunan sitokin fibrogenik TGF-β1.

Kata kunci: CCl4, fibrosis, mahkota dewa, TNF-α, TGF-β1.

viiiUniversitas Indonesia

ABSTRACT

Name : Nanik SundariStudy Program : Biomedical ScienceTitle : Antioxidant, TNF- α and TGF-β1 modulating properties of

Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) on the prevention ofcarbon-tetrachloride induced liver fibrosis in rats

Introduction: Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) is one of the Indonesian herbalplants. Hepatoprotective effect of aqueous extract of mahkota dewa fruits have beenstudied previously. This study was conducted to evaluate the activity of water extractof mahkota dewa in the prevention of liver fibrosis and its mechanism of action.Method: Male Sprague-Dawley rats were induced by carbon tertrachloride (CCl4)given every 3 days by intraperitoneal injection for 8 weeks. Rats were randomlyallocated into 6 groups: control group, n-acetyl cysteine/NAC (150 mg/kgBB),aqueous extract of mahkota dewa (50, 100 and 150 mg/kgBB). Aspartateaminotransaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase(ALP), liver histopathology, malondialdehyde (MDA), ratio GSH/GSSG, TumorNecrosis Factor (TNF)-α and Transforming Growth Factor (TGF)-β1 wereexamined.Results: This study demonstrates that aqueous extract of mahkota dewa and NACsignificantly protects the liver from injury by reducing the activity of AST, ALT,ALP and by reducing fibrosis percentage in histopatological examination. Aqueousextract of mahkota dewa and NAC attenuates oxidative stress by reducing the levelsof MDA and increasing GSH/GSSG ratio. Aqueous extract of mahkota dewa andNAC suppresses inflammation by reducing the levels of TNF- α and inhibits hepaticstellate cells (HSC) activation by reducing the levels of TGF-β1.Conclusions: Aqueous extract of mahkota dewa prevents CCl4-induced fibrosis inrats. The prevention of liver fibrosis most possibly through its antioxidant activities,suppression of inflammatory cytokines TNF-α and inhibition of HSC activation byreducing fibrogenic cytokines TGF-β1.

Key words: CCl4, fibrosis, mahkota dewa, TNF-α, TGF-β1.

ixUniversitas Indonesia

DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ...........................................HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... ...KATA PENGANTAR .................................................................................. ...LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH .................................... ...ABSTRAK ........................................................................................................ABSTRACT .....................................................................................................DAFTAR ISI ...................................................................................................DAFTAR GAMBAR .......................................................................................DAFTAR TABEL ............................................................................................DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................

BAB 1. PENDAHULUAN ...........................................................................1.1. Latar Belakang……………………………………………………..1.2. Rumusan Masalah ............................................................................1.3. Tujuan Penelitian .............................................................................

1.3.1. Tujuan Umum ......................................................................1.3.2. Tujuan Khusus ..................................................................

1.4. Hipotesis Penelitian………………………………………………1.5. Manfaat Penelitian ...........................................................................

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................2.1. Hati ...................................................................................................

2.1.1. Fisiologi dan anatomi hati ....................................................2.1.2. Fungsi dan tipe sel hati..........................................................

2.2. Fibrosis Hati.....................................................................................2.2.1. Etiologi Fibrosis Hati...........................................................2.2.2. Patogenesis fibrosis hati........................................................2.2.3. Karbon tetraklorida sebagai model fibrosis hati in

vivo........................................................................................2.3. Strategi Antifibrosis..........................................................................

2.3.1. Reduksi inflamasi hati...........................................................2.3.2. Reduksi stress oksidatif.........................................................2.3.3. Modulasi produksi dan/atau aktivitas sitokin.......................

2.4. Mahkota Dewa...................................................................................2.4.1. Ekstrak air buah Mahkota dewa………………………...…2.4.2. Studi in vitro ekstrak air buah mahkota dewa…………….2.4.3. Studi in vivo ekstrak air buah mahkota dewa……………..2.4.4. Data toksisitas ekstrak air buah mahkota dewa…………..

2.5. Kerangka Teori……………………………………………………...2.6. Kerangka Konsep……………………………………………………

iiiiiivvi

viiviii

ixxii

xiiixivxv

11344444

557799

10

1314

15

15

1616171718182021

xUniversitas Indonesia

BAB 3. METODE PENELITIAN ..............................................................3.1. Disain Penelitian ……..................................................................3.2. Lokasi dan Waktu Penelitian………………………………………3.3. Hewan Coba… .................................................................................3.4. Etika Penelitian…………………………………………………….3.5. Obat Uji……………………...…………………………………….3.6. Bahan dan Alat..................................................................................3.7. Prosedur Penelitian ..........................................................................3.8. Pemeriksaan Kadar Protein Homogenat Hati................................

3.8.1. Prinsip…………………………………….......................3.8.2. Prosedur ..............................................................................

3.9. Penetapan Aktivitas ALT dan AST...................................................3.9.1. Prinsip…………………………………………………3.9.2. Prosedur ..............................................................................

3.10. Penetapan Aktivitas ALP…………………………………………3.10.1. Prinsip…………………………………………………….3.10.2. Prosedur…………………………………………………..

3.11. Pemeriksaan Histopatologi Hati…………………………………….3.12. Penetapan Kadar MDA……………………………………………

3.12.1. Prinsip…………………………………………………….3.12.2. Prosedur pembuatan homogenat hati……………………..3.12.3. Prosedur…………………………………………………..

3.13. Penetapan Rasio GSH/GSSG………………………………………3.13.1. Prinsip……………………………………………………3.13.2. Prosedur pembuatan homogenat hati……………………..3.13.3. Prosedur pemeriksaan rasio GSH/GSSG..………………..

3.14. Penetapan Kadar TNF-α…………………………………………..3.14.1. Prinsip…………………………………………………….3.14.2. Prosedur pembuatan homogenat hati pemeriksaan TNF-α…3.14.3. Prosedur pemeriksaan TNF-α ……………………………..

3.15. Penetapan Kadar TGF-β1…………………………………………..3.15.1. Prinsip…………………………………………………….3.15.2. Prosedur pembuatan homogenat hati pemeriksaan TGF-β1..3.15.3. Prosedur pemeriksaan TGF-β1……………………………..

3.16. Analisis Statistik…………………………………………………..

BAB 4. HASIL PENELITIAN ...................................................................4.1. Berat Badan Tikus…………………………………………………..4.2. Kadar Protein Homogenat Hati…………………………………….4.3. Aktivitas ALT, AST dan ALP……………………………………..4.4. Histopatologi Hati…………………………………………………..4.5. Kadar MDA Homogenat Hati……………………………….………4.6. Rasio GSH/GSSG Homogenat Hati………………………………

22

22

222222222225282828282829303030303333333334343535363637373838383940

41414242444748

xiUniversitas Indonesia

4.7. Kadar TNF-α Homogenat Hati……………………………………4.8. Kadar TGF-β1 Homogenat Hati…………………………………….

BAB 5. PEMBAHASAN .............................................................................

BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................6.1. Kesimpulan ........................................................................................6.2. Saran ...................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................LAMPIRAN .....................................................................................................DRAFT ARTIKEL ...........................................................................................BIODATA PENULIS .......................................................................................

4950

51

606060

616698

108

xiiUniversitas Indonesia

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Anatomi hati 5

Gambar 2.2. Gambaran mikroskopik hati 6

Gambar 2.3. Dua model anatomi mikroskopik, lobular dan asinus 6

Gambar 2.4. Asinus hati terbagi menjadi 3 zona 7

Gambar 2.5. Mikroanatomi sel hati 9

Gambar 2.6. Perubahan pada arsitektur hati 11

Gambar 2.7. Stres oksidatif dan kerusakan hepatosit 12

Gambar 2.8. Patogenesis molekuler fibrosis hati 13

Gambar 3.1. Kerangka kerja penelitian 27

Gambar 3.2. Cara pemilihan lapang pandang preparat hati 32

Gambar 3.3. Prinsip pemeriksaan total glutation 34

Gambar 4.1. Perubahan berat badan tikus selama 8 minggu perlakuan 41

Gambar 4.2. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALT plasma setelah 8 mingguperlakuan

43

Gambar 4.3. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim AST plasma setelah 8 mingguperlakuan

43

Gambar 4.4. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALP plasma setelah 8 mingguperlakuan

44

Gambar 4.5. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap persentase jaringan ikat hati setelah 8 mingguperlakuan

45

Gambar 4.6. Gambaran histopatologi fibrosis hati setelah 8 mingguperlakuan dengan pewarnaan Masson’s trichrome

46

Gambar 4.7. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar MDA hati setelah 8 minggu perlakuan

47

Gambar 4.8. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap rasio GSH/GSSG hati setelah 8 mingguperlakuan

48

Gambar 4.9. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TNF-α hati setelah 8 minggu perlakuan

49

Gambar 4.10. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TGF-β1 hati setelah 8 minggu perlakuan

50

xiiiUniversitas Indonesia

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Faktor genetik dan nongenetik yang berhubungan denganprogresi fibrosis pada berbagai jenis penyakit hati kronik

10

Tabel 2. Pembagian kelompok tikus dan perlakuan 26

Tabel 3. Perubahan berat badan dan persentase kematian hewan coba 42

xivUniversitas Indonesia

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Keterangan Lolos Kaji Etik 66

Lampiran 2. Sertifikat Analisis Ekstrak Air Buah Mahkota Dewa(Proliverenol)

67

Lampiran 3. Perhitungan Parameter Biokimia 68

Lampiran 4. Berat Badan Tikus 77

Lampiran 5. Data Kadar Protein Homogenat Hati 79

Lampiran 6. Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALT 81

Lampiran 7. Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas AST 83

Lampiran 8. Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALP 85

Lampiran 9. Data dan Hasil Analisis Statistik Persentase Jaringan Ikat 87

Lampiran 10. Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar MDA Hati 89

Lampiran 11. Data dan Hasil Analisis Statistik Rasio GSH/GSSG Hati 91

Lampiran 12. Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TNF-α Hati 94

Lampiran 13. Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TGF-β1 Hati 96

xvUniversitas Indonesia

DAFTAR SINGKATAN

1. ALT Alanine aminotransferase

2. AST Aspartate aminotransferase

3. ALP Alkaline phosphatase

4. CCl4 Carbon tetrachloride

5. ECM Extracellular matrix

6. GGT γ-globulin transferase

7. HSC Hepatic stellate cells

8. HGF Hepatic growth factor

9. IL Interleukine

10. IFN-γ Interferon-γ

11. MMP Matrix of metalloproteinase

12. NAC N-acetyl cysteine

13. NADPH Nicotinamude adenie dinucleotide phosphatase

14. NAFLD Non alcoholic fatty liver disease

15. NASH Non alcoholic steatohepatitis

16. PDGF Platelet-derived growth factor

17. ROS Reactive oxygen species

18. TIMP tissue inhibitor of metalloproteinase

19. TNF-α Tumor necrosis factor-α

20. TGF-β Transforming growth factor-β

1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Fibrosis hati dapat timbul pada berbagai penyakit hati kronis yang dapat

disebabkan oleh infeksi virus hepatitis, penyalahgunaan alkohol, penyakit perlemakan

hati non alkoholik, penyakit autoimun, stasis empedu kronis, gangguan metabolisme,

cacat genetik atau hipoksia.1,2,3 Fibrosis hati ditandai dengan akumulasi berlebih

protein matriks ekstraseluler termasuk kolagen atau jaringan parut yang terjadi setelah

berbagai penyakit hati yang kronis.1,2,4

Aktivasi sel stelata hati merupakan hal utama pada fibrosis hati. Pada hati

normal, sel tersebut terletak di space of disse dan berfungsi sebagai tempat utama

penyimpanan vitamin A dalam tubuh. Bila hati mengalami cedera kronis, sel stelata

hati teraktivasi dan berdiferensiasi menjadi sel seperti miofibroblas. Proses aktivasi

sel stelata hati adalah proses yang kompleks dan diperantarai oleh sitokin inflamasi

dan fibrogenik, diantaranya Tumor Necrosis Factor (TNF)-α dan Transforming

Growth Factor (TGF)-β.2,5 Fibrosis hati dapat berkembang lebih lanjut menjadi

sirosis yang ireversibel, gagal hati, hipertensi portal dan berkaitan dengan timbulnya

kanker hati. Sekitar 10-20% pasien mengalami progresivitas menjadi sirosis dan

kanker hati. Pada sebagian besar pasien, progresi fibrosis menjadi sirosis terjadi

dalam interval waktu 15 hingga 20 tahun.4

Karbon tetraklorida (CCl4) adalah hepatotoksin yang telah lazim digunakan

pada hewan coba sebagai penginduksi kerusakan hati termasuk fibrosis.6,7 CCl4

mengalami biotransformasi di hati menghasilkan radikal bebas sehingga

menyebabkan peroksidasi lipid membran. Radikal bebas dan peroksidasi lipid

memegang peran penting dalam patogenesis berbagai penyakit hati termasuk fibrosis.6

Obat yang digunakan sebagai standar terapi untuk fibrosis hati belum ada

sampai saat ini, meskipun telah dilakukan penelitian terhadap beberapa antioksidan

yang berpotensi sebagai antifibrosis. Antioksidan dapat mengurangi reactive oxygen

species (ROS) sehingga menghambat aktivasi sel stelata dan melindungi hepatosit

dari apoptosis. N-acetylcysteine (NAC) adalah satu satu obat yang memiliki aktivitas

antioksidan, dan beberapa penelitian telah membuktikan potensi antifibrosis NAC.

Narasimhanaidu dkk8 membuktikan bahwa potensi antioksidan NAC berperan dalam

memberikan efek hepatoprotektif pada tikus yang diinduksi CCl4 melalui peningkatan

2

Universitas Indonesia

kadar glutation dan aktivitas glutation peroksidase serta penurunan peroksidasi lipid.

Studi lain yang dilakukan oleh Demiroren dkk9 membuktikan bahwa NAC dapat

mencegah fibrosis hati pada tikus yang diinduksi CCl4 melalui peningkatan kadar

glutation dan penurunan level TNF-α serta interleukin (IL)-6. Studi klinik yang

dilakukan oleh Khoshbaten dkk10 menunjukkan bahwa NAC berperan dalam

memperbaiki fungsi hati pada pasien perlemakan hati non alkoholik.

Pengobatan dengan prinsip kembali ke alam berkembang dengan cukup pesat

di dunia termasuk Indonesia. Saat ini telah banyak dilakukan penelitian terkait terapi

antifibrosis dengan menggunakan bahan alam. Studi yang dilakukan di Cina oleh

Wang dkk4 menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan Saururus chinensis berkaitan

dengan aktivitas mencegah fibrosis hati pada tikus yang diinduksi CCl4. Studi lain

yang dilakukan Cháved E dkk5 menunjukkan bahwa resveratrol, senyawa phytoalexin

yang terdapat di anggur dan kacang, memiliki efek mencegah fibrosis hati melalui

penurunan aktivitas NF-κB dan sitokin profibrogenik TGF-β pada tikus yang

diinduksi CCl4.

Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) merupakan tanaman asli Indonesia

yang berasal dari Papua dan digunakan sebagai tanaman obat. Di Jawa Barat, tanaman

ini disebut buah simalakama, di Jawa disebut Makutodewo.11,12 Mahkota dewa

tergolong tanaman perdu yang tumbuh di dataran rendah hingga ketinggian 1200

meter di atas permukaan air laut. Buah mahkota dewa berwarna merah marun dan

berbentuk bulat dengan ukuran yang bervariasi dari sebesar bola pingpong sampai

sebesar apel dengan ketebalan kulit 0.1-0.5 mm.13

Secara empiris, sebagian masyarakat telah menggunakan mahkota dewa untuk

alergi, jerawat, penyakit hati dan jantung, kanker, diabetes melitus, tekanan darah

tinggi, stroke, migrain, wasir dan penyakit lainnya.13,14 Manfaat yang menguntungkan

tersebut disebabkan kandungan kimia dari tanaman mahkota dewa seperti alkaloid,

flavonoid, saponin, tanin dan sebagainya yang memberikan efek antiinflamasi,

antioksidan, antikanker, antihipoglikemik, antihipertensi, dan hepatoprotektif.15-21

Secara umum, proses isolasi senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman

termasuk mahkota dewa dilakukan menggunakan pelarut organik yang bersifat toksik

dan dapat membahayakan kesehatan manusia seperti metanol, etanol dan n-heksan.

Saat ini telah dikembangkan proses ekstraksi menggunakan subcritical water pada

suhu dan tekanan tertentu. Kim dkk14 telah berhasil melakukan proses ekstraksi buah

makhota dewa menggunakan pelarut air pada suhu 100°C dan tekanan 30 bar selama

3


5 jam. Ekstrak air buah mahkota dewa (Proliverenol) tersebut diketahui mengandung

mangiferin sebesar 21.7 mg/g, yang setara dengan ekstrak metanol (25.0 mg/g) dan

lebih besar dari ekstrak etanol (13.2 mg/g).14

Ekstrak air buah mahkota dewa tersebut telah diuji secara in vitro maupun in

vivo. Hasil studi pendahuluan secara in vitro yang dilakukan oleh Berlian dkk22

menunjukkan bahwa efek hepatoprotektif ekstrak air buah mahkota dewa terjadi

melalui down-regulation NFkB-TNF-α-lipid peroksidasi dengan hasil akhir

meningkatnya waktu hidup sel. Studi lain secara in vivo pada tikus yang diinduksi

etanol selama 4 minggu menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dengan

dosis 37,5; 50 dan 75 mg/kgBB dapat menurunkan level aspartat aminotransferase

(AST), alanin aminotransferase (ALT), total bilirubin dan γ-globulin transferase

(GGT).23

Berdasarkan hasil pendahuluan tersebut di atas, ekstrak air buah mahkota

dewa diketahui mempunyai aktivitas hepatoprotektif. Namun, untuk mengetahui

apakah ekstrak air buah mahkota dewa dapat digunakan untuk mencegah fibrosis hati

serta mekanisme kerja yang mendasari hal tersebut diperlukan studi lebih lanjut. Hal

ini didasarkan pada upaya untuk mencegah terjadinya fibrosis hati sedini mungkin.

1.2. Rumusan Masalah

Fibrosis hati dapat terjadi akibat berbagai penyakit hati kronis, dan jika tidak

ditangani sedini mungkin dapat berkembang lebih lanjut menjadi sirosis yang

ireversibel dan timbulnya kanker hati. Obat yang digunakan sebagai standar terapi

untuk fibrosis hati belum ada sampai saat ini. Mahkota dewa merupakan salah satu

tanaman herbal asli Indonesia dan ekstrak air buah mahkota dewa telah terbukti

memiliki efek hepatoprotektif melalui down-regulation NFkB-TNF-α-lipid

peroksidasi. Akan tetapi sampai saat ini belum ada penelitian yang membuktikan

apakah ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah terjadinya fibrosis hati yang

diinduksi CCl4, terutama melalui mekanisme antioksidan, penghambatan sitokin

inflamasi (TNF-α) dan penghambatan sitokin fibrogenik (TGF-ß).

4


1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan Umum

Menilai aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah fibrosis hati

pada tikus.

1.3.2. Tujuan Khusus

1. Menganalisis aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa sebagai pencegah

fibrosis hati melalui pemeriksaan penanda fungsi hati yaitu aktivitas enzim

ALT, AST dan alkali fosfatase (ALP) pada tikus jantan yang diinduksi CCl4.

2. Menganalisis aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa s ebagai pencegah

fibrosis hati melalui gambaran histopatologi hati pada tikus jantan yang

diinduksi CCl4.


fibrosis hati melalui pemeriksaan penanda stres oksidatif (malondialdehid

dan rasio GSH/GSSG) pada tikus jantan yang diinduksi CCl4.


fibrosis hati melalui pemeriksaan sitokin inflamasi (TNF-α) pada tikus jantan

yang diinduksi CCl4.


fibrosis hati melalui pemeriksaan sitokin fibrogenik (TGF-ß) pada tikus

jantan yang diinduksi CCl4.

1.4. Hipotesis Penelitian

Ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah fibrosis hati pada tikus yang

diinduksi CCl4 melalui mekanisme antioksidan, penghambatan sitokin inflamasi

(TNF-α) dan penghambatan sitokin fibrogenik (TGF-ß).

1.5. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa data non

klinik dalam hal penemuan kandidat obat pencegahan fibrosis hati yang berasal dari

ekstrak air buah mahkota dewa. Selain itu, mahkota dewa merupakan salah satu

tanaman asli Indonesia sehingga hasil positif penelitian ini diharapkan dapat

memperkaya khasanah tanaman obat tradisional Indonesia.

5

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Hati

2.1.1. Fisiologi dan anatomi hati

Hati adalah organ dalam terbesar manusia dengan berat hati orang dewasa

sekitar 1.5 kg.2 Hati terletak diantara sirkulasi portal dan umum, yaitu antara organ

saluran cerna dan jantung.24

Jaringan hati merupakan unit fungsional terdiri dari sel-sel yang terangkai

sekitar pembuluh portal (titik masuk) dan vena sentral (titik keluar) darah. Hati

menerima suplai darah dari dua tempat yang berbeda. Pertama dari sirkulasi portal

yang membawa sebagian darah kaya oksigen dari saluran cerna dan mengandung

berbagai senyawa hasil pencernaan. Kedua, sebanyak 30% darah hepatik masuk

melalui arteri hepatik (Gambar 2.1a). Darah dari kedua tempat tersebut akan

tercampur pada bagian akhir dari pembuluh portal yaitu tempat ditemukannya

sinusoid hati. Sinusoid adalah kapiler di hati yang tersusun dari sel endotel yang

berpori, berperan dalam mengontrol aliran berbagai senyawa ke- dan dari dalam ruang

diantara hepatosit dan space of Disse (Gambar 2.1b).2

Space of Disse mengandung protein matriks ekstraselular densitas rendah dan

sel stelata hati/sel Ito. Hepatosit adalah tipe sel epitelial utama di hati dan tersusun di

sepanjang sinusoid sampai daerah sentrilobular (lobule) atau zona 3 (acini) sebagai sel

epitel yang terpolarisasi. Makrofag hati (sel Kupffer) terletak diantara sinusoid.2

Gambar 2.1. Gambaran skematik anatomi hati 25

ba

6


Pada dasarnya terdapat 2 konsep berbeda terkait susunan 3 dimensi dan unit

fungsional hati. Konsep pertama yaitu lobul hati yang dikemukakan oleh Kiernan dan

konsep kedua yaitu asinus hati yang dikemukakan oleh Rappaport.26

Pertama, Kiernan atau lobul klasik yang tersusun sekitar vena sentral, terlihat

berbentuk heksagonal dan dibatasi oleh interlobular septa dari jaringan ikat pada

beberapa spesies (Gambar 2.2). Pada manusia, sublobulus digambarkan sebagai garis

imaginasi dengan saluran portal berada diantara sudut dari lobulus yang berdekatan.

Konsep lobular ini adalah dasar untuk menggambarkan sentrilobular, perilobular

(peripheral) serta perubahan struktur sekitar venula hati atau saluran portal

(Gambar 2.3).26

Gambar 2.2. Gambaran mikroskopik hati babi yang menunjukkan lobulusheksagonal (Kiernan) yang dipisahkan oleh lapisan tipis interlobular septa. CV,vena sentral; PT, saluran portal.26

Gambar 2.3. Dua model anatomi mikroskopik, lobular hati dan asinus.Pada model lobular, vena hepatik terminal terletak pada pusat lobul (CV),sementara pembuluh portal (PV) terletak di peripheral. Model asinus dibagimenjadi 3 zona, zona 1 paling dekat dengan pembuluh darah dan zona 3terletak paling jauh. BD, duktus biliaris; HA, arteri hepatika.27

7


Kedua, pada tahun 1973 Rappaport menggambarkan unit organisasi hati

manusia sebagai asinus (Gambar 2.4). Pada model ini, 3 zona konsentrik mengelilingi

portal triad. Sel pada zona 1 digambarkan paling dekat dengan pembuluh darah

aferen dan tempat pertama di sinusoid yang menerima darah. Darah tersebut

mengandung banyak oksigen dan nutrisi. Sel pada zona 2 dan 3 makin menjauh dari

pembuluh darah aferen dan sel pada zona tersebut mendapatkan darah yang

mengandung sedikit oksigen. Sel pada zona ini paling cepat mengalami cedera karena

iskemia. Sebagai tambahan, hepatosit pada zona 3 secara aktif berperan dalam

metabolisme obat sehingga jika obat bersifat hepatotoksik maka akan menginduksi

nekrosis pada zona tersebut.26

Gambar 2.4. Asinus hati terbagi menjadi 3 zona. Darah masuk ke sinusoid dizona 1 dan selanjutnya mengalir ke zona 2 dan zona 3. Darah akan semakin sedikitmengandung oksigen dan nutrisi yaitu dari zona 1 ke zona 3. TPV, terminal portalvein; HA, hepatic artery; BD, bile ductule; HV, hepatic vein.28

2.1.2. Fungsi dan tipe sel hati

Hati tersusun atas berbagai macam tipe sel, antara lain hepatosit, sel

endotelial, sel Kupffer, sel stelata hati dan sel pit, yang masing-masing berperan

penting untuk mempertahankan fungsi hati normal (Gambar 2.5).29

Hepatosit menempati 80-88% dari total volume hati pada manusia. Hepatosit

merupakan sel epitel yang terpolarisasi dan memiliki diameter 30-40 m.26 Pada

bagian basolateral dari hepatosit terdapat space of Disse dan memiliki banyak

mikrovili. Bagian tersebut berperan dalam aktivitas endositosis dan pinositosis, yaitu

mengambil berbagai nutrisi, protein dan molekul lain, baik secara aktif maupun pasif.

Bagian apikal hepatosit membentuk membran kanikular yaitu tempat disekresikannya

komponen empedu. Hepatosit memiliki berbagai fungsi penting yaitu sintesis protein

serum esensial (albumin, faktor pembekuan, hormon dan faktor pertumbuhan),

8


produksi asam empedu, kolesterol, lesitin dan fosfolipid. Selain itu, hepatosit juga

berperan dalam regulasi berbagai nutrisi (glukosa, glikogen, lipid, kolesterol, asam

amino), metabolisme dan konjugasi senyawa lipofilik (bilirubin, anion, kation, obat)

sehingga dapat diekskresikan melalui empedu atau urin.26,29

Sel endotelial berjumlah 20% dari total sel hati, tetapi hanya sekitar 3.3% dari

total protein hati. Sel endotelial berbentuk pipih memanjang dan memiliki pori-pori

(fenestrae) sehingga sering disebut sebagai pelat saringan (sieve plates). Pori-pori

tersebut hanya sekitar 6-8% pada permukaan sel endotelial dan berperan sebagai

barier antara darah dan parenkim. Berbeda dengan sel endotelial vaskular, sel

endotelial hati memiliki sedikit membran dasar sehingga solut dan partikel kecil

memiliki akses ke ruang perisinusoidal. Sel endotelial dapat mensekresikan berbagai

macam protein, seperti interleukin, interferon dan TNF-α. Bersama sel Kupffer, sel

endotelial berperan dalam mekanisme pertahanan di hati.26

Sel Kupffer adalah anggota dari sistem mononuclear-phagocytic dan

membentuk sekitar 80-90% total populasi makrofag di tubuh. Sel kupffer merupakan

komponen dinding sinusoid hati dan berperan penting dalam mekanisme pertahanan

serta membuang berbagai partikulat seperti toksin, zat infeksius dan senyawa asing

dari pembuluh darah portal. Sel kupffer melepaskan berbagai mediator sebagai respon

terhadap infeksi, termasuk IL-1 dan 6, TNF-α, interferon dan eicosanoids.26

Sel stelata hati (perisinusoidal, sel Ito atau sel penyimpan lemak) terletak

dalam space of Disse. Sel stelata hati berjumlah sekitar 5-8% dari total seluruh sel

hati. Bagian sitoplasma sel stelata hati kaya vitamin A. Selain berperan sebagai

tempat penyimpanan vitamin A, pada sel stelata hati juga terdapat fibroblast yang

merupakan sumber utama matriks ekstraselular baik pada hati normal maupun pada

hati yang mengalami cedera. Sel stelata hati merupakan sumber potensial hepatocyte

growth factor (HGF) dan kontraktilitas sel tersebut berperan dalam mengatur aliran

darah sinusoidal. Sel stelata hati memiliki dua fenotip berbeda yaitu diam (quiescent)

pada hati normal dan aktif pada hati yang mengalami cedera. Perubahan fenotip

menyebabkan perubahan fungsi sel stelata hati, ditandai dengan hilangnya retinoid

dan terjadinya proses sintesa matriks ekstraselular dalam jumlah besar termasuk

kolagen, proteoglikan dan glikoprotein. 3,26,30,31

10


Tabel 1. Faktor genetik dan nongenetik yang berhubungan dengan progresi fibrosis pada berbagai jenispenyakit hati kronik32

Jenis penyakit hati Kandidat gen Faktor nongenetik

Infeksi virus hepatitis C HFE (Hereditary hemochromatosisgene)AngiotensinogenTGF- β1TNF- αApoE (Apolipoprotein E)

Konsumsi alkoholKoinfeksi HIV dan/atau virushepatitis BTransplantasi hatiDiabetes melitus

Diinduksi alkohol IL-10IL-1βADH (Alcohol dehydrogenase)ALDH (Aldehyde dehydrogenase)CYP2E1 (Cytochrome P450 2E1)TNF- α

Konsumsi alkoholEpisode hepatitis alkoholik

NASH HFEAngiotensinogenTGF- β1

UsiaBeratnya obesitasDiabetes melitusHipertrigliserida

Sirosis bilier primer IL-1βTNF- αApoE

Hepatitis autoimun HLA-II (Human leukocyte antigentype II haplotype)

Hepatitis autoimunTidak berespon terhadap terapi

2.2.2. Patogenesis fibrosis hati

Fibrosis hati merupakan suatu proses dinamik yang kompleks dan diperantarai

oleh kematian hepatosit dan aktivasi sel stelata hati.2,3,33 Setelah terjadi cedera hati

akut, sel parenkimal akan beregenerasi dan menggantikan sel yang mengalami

apoptosis atau nekrosis. Jika cedera hati terjadi secara terus menerus, maka proses

regenerasi mengalami kegagalan dan hepatosit akan digantikan oleh matriks

ekstraseluler (ECM) dalam jumlah berlebih termasuk kolagen fibrilar (Gambar

2.6).2,32

11


Gambar 2.6. Perubahan pada arsitektur hati (A) terkait dengan fibrosis hati tahaplanjut (B). Pada cedera hati kronis, limfosit masuk ke sel parenkim hati, hepatositmengalami apoptosis dan sel Kupffer teraktivasi melepaskan mediator fibrogenik. HSCberproliferasi dan teraktivasi, mensekresikan protein ECM dalam jumlah besar.32

Fibrosis hati diawali oleh kematian sel hepatosit. Hal ini disebabkan karena

terjadinya peroksidasi lipid termasuk pembentukan ROS, TGF-β dan TNF-α.33 Pada

penyakit infeksi oleh virus hepatitis C (HCV) atau virus hepatitis B (HBV), konsumsi

alkohol dalam jumlah besar, dan penyakit perlemakan hati non alkoholik, hepatosit

akan memproduksi radikal bebas superoksida (O2-), radikal hidroksil (HO-) dan non

radikal seperti H2O2 sehingga menyebabkan peroksidasi lipid. Produksi ROS secara

persisten tersebut akan mencetuskan respon inflamasi dan cedera hati. Sumber utama

ROS pada hepatosit adalah NADH dan nicotinamide adenine dinucleotide

phosphatase (NADPH) oksidase yang terletak di mitokondria (Gambar 2.7).33,34

Sel stelata hati, sel Kupffer, makrofag dan neutrofil juga menghasilkan ROS

ketika terjadi cedera hati. Pada sel Kupffer, NADPH oksidase diaktivasi oleh

beberapa stimuli seperti metabolit alkohol dan TNF-α sehingga menghasilkan ROS.

Sel Kupffer tersebut akan memberikan efek proinflamasi dan mensensitisasi hepatosit

sehinggga mengalami apoptosis. Adanya ROS juga berperan dalam proses aktivasi

dan aksi fibrogenik sel stelata hati.33,34

12


Gambar 2.7. Stress oksidatif dan kerusakan hepatosit. Sumber utama ROSadalah NADPH/NADH oksidase mitokondria. Adanya logam Fe, H2O2 dikonversimenjadi radikal hidroksil yaitu radikal yang sangat reaktif. Radikal hidroksil akanmenginduksi kerusakan DNA dan peroksidasi lipid pada struktur membranfosfolipid sehingga menyebabkan kematian sel.33

Sel stelata hati (hepatic stellate cells, HSC) adalah sel utama penghasil ECM

pada hati yang cedera dan merupakan efektor dalam respon fibrogenik. Bila hati

mengalami cedera kronis, HSC bertransformasi dari diam (quiescent) menjadi aktif,

dimana aktivasi tersebut merupakan komponen sentral dalam proses penyembuhan

cedera di hati. Proses aktivasi HSC adalah proses yang kompleks dan menyebabkan

perubahan selular dan karakteristik sel termasuk hilangnya vitamin A. Perubahan

paling penting dalam proses aktivasi tersebut adalah terjadinya peningkatan produksi

dan sekresi protein ECM, termasuk kolagen I, III dan IV, fibronektin, laminin,

proteoglikan dan lainnya.30,32

Proses aktivasi HSC terdiri dari 2 tahap yaitu inisiasi dan perpetuasi. Tahap

inisiasi ditandai dengan perubahan awal pada ekspresi gen dan fenotip sehingga sel

menjadi responsif terhadap sitokin dan stimuli lain. Tahap perpetuasi merupakan

tahap mempertahankan bentuk fenotip yang aktif sehingga menyebabkan fibrosis.

Inisiasi disebabkan stimulasi parakrin sedangkan perpetuasi melibatkan stimulasi

autokrin dan parakrin.3,35

Tahap inisiasi diawali dengan terjadinya aktivasi HSC, terutama disebabkan

adanya stimuli inflamasi dan oksidatif akibat cedera hati. Pada cedera hati tahap awal,

sel endotelial berperan dalam proses konversi laten TGF-β1 menjadi bentuk aktif.3

TGF-β1 merupakan sitokin fibrogenik utama yang mengatur produksi, degradasi dan

akumulasi ECM pada fibrosis hati. TGF- β1 juga diproduksi melalui jalur parakrin

dari sel Kupffer dan sel inflamasi selama cedera hati.33 Selain memproduksi TGF-β1,

13


sel Kupffer dan sel inflamasi juga melepaskan sitokin inflamasi (TNF-α dan IL-6),

radikal bebas dan platelet-derived growth factor (PDGF).3

Pada tahap perpetuasi, HSC yang teraktivasi akan mengalami serangkaian

perubahan fenotip yang mengarah ke proses akumulasi ECM. Pada tahap ini, HSC

teraktivasi akan membentuk miofibroblast yang ditandai dengan hilangnya retinoid,

meningkatnya proliferasi, kontraktilitas dan disekresikannya berbagai mediator

fibrogenesis seperti TGF-β dan PDGF.3,27,31,35,36 Pada HSC yang teraktivasi tersebut

akan terjadi penurunan ekspresi matrix of metalloproteinase (MMP) dan peningkatan

ekspresi tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) yang pada akhirnya

menyebabkan akumulasi ECM dalam jumlah besar (Gambar 2.8).36

Gambar 2.8. Patogenesis molekuler fibrosis hati. Berbagai tipe hepatotoksik memproduksi mediatoryang menginduksi aktivitas inflamasi sel hepatik. Hepatosit rusak dan melepaskan sitokin inflamasidan ROS yang mengaktivasi sel Kupffer. Hal tersebut mengaktivasi HSC menjadi miofibroblasfibrogenik. HSC yang teraktivasi juga mensekresikan sitokin yang dapat mempertahankan bentukaktifnya. Jika kerusakan hati berlangsung terus menerus, maka terjadi akumulasi HSC teraktivasi danterjadi sintesa protein ECM dalam jumlah banyak sehingga menyebabkan terbentuknya jaringanfibrosis.37

2.2.3. Karbon tetraklorida sebagai model fibrosis hati in vivo

Beberapa senyawa kimia telah diidentifikasi dapat menginduksi inflamasi hati

dan fibrogenesis. CCl4 merupakan salah satu senyawa kimia yang lazim digunakan

untuk menginduksi fibrosis hati pada hewan coba. CCl4 memberi gambaran pola

fibrosis akibat hepatotoksik seperti yang terjadi pada manusia.38

Karakteristik CCl4 dalam menginduksi fibrosis hati yaitu dengan mengaktivasi

sel Kupffer dan mencetuskan respon inflamasi, sehingga melepaskan sitokin dan

faktor proinflamasi. Hal tersebut menyebabkan rekruitmen dan aktivasi monosit,

neutrofil dan limfosit yang berkontribusi terhadap terjadinya nekrosis hati.39

14


CCl4, seperti haloalkana lain, dimetabolisme oleh sitokrom P4502E1

(CYP2E1) dalam hepatosit hati menjadi radikal bebas triklorometil (CCl3*).38-40

Triklorometil dengan oksigen akan membentuk radikal triklorometilperoksi yang

kemudian menyerang lipid membran retikulum endoplasma dengan kecepatan yang

melebihi radikal bebas triklorometil. Triklorometil dan triklorometilperoksi tersebut

menyebabkan stress oksidatif, peroksidasi lipid, menginduksi kerusakan membran sel

dan struktur organel sel hati, menyebabkan cedera sel hati, degenerasi, nekrosis dan

fibrosis hati.41-43

Constandinou dkk38 melakukan penelitian terkait model fibrosis pada tikus

menggunakan CCl4 secara injeksi intraperitoneal. Berdasarkan hasil penelitian

tersebut diketahui bahwa injeksi intraperitoneal CCl4 secara berulang selama 4-6

minggu dapat menginduksi fibrosis hati, pemberian selama 8 minggu menyebabkan

sirosis reversibel tahap awal dan pemberian selama 12 minggu menyebabkan sirosis

tahap lanjut.38 CCl4 juga dapat diberikan secara oral. Berdasarkan hasil penelitian

yang dilakukan oleh Jang dkk39diketahui bahwa pemberian 50% larutan CCl4 pada

mencit dosis 2 mL/kgBB selama 10 minggu menyebabkan fibrosis dengan tingkat

kematian yang dapat diterima.

2.3. Strategi antifibrosis

Saat ini belum ada standar terapi untuk fibrosis hati. Walaupun uji non klinik

pada roden menunjukkan bahwa beberapa agen mempunyai potensi untuk mencegah

progresi fibrosis, namun efikasinya belum terbukti pada manusia. Hal ini disebabkan

oleh berbagai faktor seperti perlu dilakukannya beberapa kali biopsi hati untuk

menilai perubahan fibrosis hati secara akurat, perlu dilakukannya follow up studi

jangka panjang, dan fakta bahwa manusia mungkin kurang sensitif terhadap terapi

antifibrosis hati dibandingkan roden.

Antifibrosis yang ideal harus spesifik untuk hati, ditoleransi baik ketika

diberikan dalam jangka panjang dan efektif memperlambat deposisi kolagen yang

berlebihan tanpa mempengaruhi ECM normal.30 Strategi terapi yang saat ini

dikembangkan yaitu dengan menghambat inflamasi hati, mereduksi stress oksidatif

serta memodulasi produksi dan/atau aktivitas sitokin yang terlibat dalam proses

fibrogenesis.

15


2.3.1. Reduksi inflamasi hati

Inflamasi dapat menyebabkan progresi fibrosis hati, sehingga penggunaan

obat antiinflamasi merupakan hal yang rasional. Kortikosteroid adalah terapi pertama

pada autoimun hepatitis. Pemberian deksametason dapat mengurangi sinyal TGF-β

pada kultur sel HSC. Namun demikian, target deksametasone terhadap sel Kupffer

juga mempercepat fibrogenesis melalui peningkatan TIMP-1 pada tikus dengan bile

duct ligation. Kedua proses tersebut menggambarkan kompleksitas sinyal fibrosis dan

kesulitan ketika menggunakan obat seperti kortikosteroid yang memiliki banyak

target.35

Strategi antiinflamasi lain yaitu dengan meneutralisir sitokin inflamasi

menggunakan sitokin spesifik dan/atau reseptor antagonis. Pada hewan, anti TNF-α

efektif mengurangi kadar enzim hati dalam serum dan sitokin inflamasi termasuk IL-6

dan TGF-β1. Berkurangnya sitokin tersebut diikuti dengan hilangnya nekrosis dan

inflamasi jaringan. Pada penyakit hati alkoholik terjadi upregulation TNF-α, dan telah

dilakukan uji klinik menggunakan agen anti-TNF (contoh: pentoxifilline).34

Penggunaan anti TNF-α (Pentoxifilline) pada pasien hepatitis alkoholik diduga dapat

mengurangi inflamasi dan fibrosis, namun demikian data pendukung yang tersedia

saat ini masih belum cukup.30

IL-10, sitokin antiinflamasi dan imunomodulatori, menyebabkan down-

regulasi produksi sitokin proinflamasi seperti TNF-α, IL-1 dan IL-2 dari sel T. Ketika

diberikan pada pasien HCV, IL-10 dapat mengurangi inflamasi hati dan fibrosis,

namun level serum HCV-RNA meningkat selama terapi sehingga pendekatan terapi

dengan IL-10 tidak dilanjutkan.30

2.3.2. Reduksi stress oksidatif

Penggunaan agen yang memiliki target terhadap ROS juga dapat mengurangi

respon inflamasi yang berperan dalam aktivasi HSC dan fibrogenesis. Antioksidan

dapat menghambat efek ROS dan berpotensi sebagai antifibrosis. Antioksidan

terutama digunakan untuk memberikan efek preventif pada kerusakan hepatosit dan

diharapkan dapat berperan sebagai pencegah fibrosis hati. Salah satu antioksidan yang

telah diuji pada hewan coba dan manusia yaitu NAC.35

NAC adalah prekursor asetilasi asam amino L-cysteine dan glutation

tereduksi. NAC diindikasikan sebagai mukolitik, namun digunakan juga sebagai

antidot untuk kasus hepatotoksisitas karena asetaminofen.35,44

16


Studi non-klinik menunjukkan bahwa efek antifibrosis NAC terjadi dengan

cara pencegahan stres oksidatif dan downregulation sitokin profibrogenik TGF-β.44

Narasimhanaidu dkk45 melaporkan bahwa pemberian NAC (150 mg/kg/hari) secara

oral dapat memberikan efek protektif pada tikus yang diinduksi CCl4. NAC dapat

menurunkan aktivitas enzim penanda kerusakan hati (AST, γ-glutamyl transferase dan

ALP) dan peroksidasi lipid. Pemberian NAC (10 mg/kg/day secara ip) dapat

memberikan perlindungan terhadap fibrosis hati pada tikus, ditandai dengan

menurunnya peroksidasi lipid dan ekspresi iNOS, serta peningkatan level glutation.46

Studi klinik NAC menunjukkan bahwa kombinasi NAC dengan metformin

dapat memperbaiki NASH activity score, termasuk fibrosis pada pasien NASH.47

Studi lain menunjukkan bahwa NAC yang diberikan 600 mg tiap 12 jam dapat

memperbaiki fungsi hati pada pasien NAFLD.10

2.3.3. Modulasi produksi dan/atau aktivitas sitokin

Penghambatan terhadap produksi berlebihan sitokin fibrogenik yang terjadi

selama cedera hati sedang diteliti secara ekstensif. TGF-β diketahui memegang

peranan penting dalam kaskade fibrogenesis sehingga merupakan target terapeutik

yang penting.30 Berbagai strategi dikembangkan untuk menghambat efek TGF-β,

termasuk penggunaan antibodi yang meneutralisir TGF-β, small interfering RNA

(siRNA) dan menghambat oligonukleotida. Uji pra-klinik menunjukkan efek

antifibrosis, namun semua strategi itu tidak ada yang siap untuk diaplikasikan secara

klinik. Lebih lanjut, reseptor TGF-β diekspresikan pada banyak sel, sehingga

penghambatan terhadap TGF-β dikuatirkan dapat memicu penyakit autoimun atau

dediferensiasi sel, meskipun awalnya target yang diharapkan adalah HSC aktif.48

2.4. Mahkota dewa

Mahkota dewa atau Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl merupakan salah

satu tanaman asli Indonesia yang berasal dari Papua. Mahkota dewa adalah tanaman

perdu yang tumbuh dari dataran rendah hingga ketinggian 1200 meter di atas

permukaan laut.19-20

Secara empiris, bagian batang, daun dan buah mahkota dewa digunakan untuk

berbagai pengobatan seperti alergi, diabetes melitus, tekanan darah tinggi, penyakit

hati dan kanker.14,49-50 Manfaat bioaktivitas tersebut berasal dari kandungan kimia

mahkota dewa yang memiliki efek antiinflamasi, antioksidan dan antikanker.14,15

17


Hendra dkk15 melaporkan bahwa ekstrak metanol buah mahkota dewa

mengandung senyawa fenol dan flavonoid, yang memiliki aktivitas antioksidan dan

antiinflamasi. Aktivitas antioksidan dibuktikan melalui penurunan aktivitas 2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH) dan NO scavenging activity. Aktivitas

antiinflamasi dibuktikan dengan adanya hambatan sintesa nitrit oksida pada makrofag

RAW 264.7 cell lines yang diinduksi LPS/IFN-γ.

Faried dkk49 berhasil mengisolasi asam galat dari buah mahkota dewa dan

membuktikan bahwa komponen tersebut secara selektif menginduksi kematian

berbagai sel kanker seperti kanker esofagus (TE-2), kanker lambung (MKN-28),

kanker kolon (HT-29), kanker payudara (MCF-7) dan kanker serviks (CaSki).

2.4.1. Ekstrak air buah Mahkota dewa

Proses isolasi senyawa kimia yang terkandung dalam mahkota dewa, termasuk

mangiferin, dilakukan menggunakan pelarut organik yang bersifat toksik seperti

metanol, etanol dan n-heksan. Residu pelarut yang terkandung pada ekstrak yang

dihasilkan merupakan masalah utama karena dapat mempengaruhi kualitas ekstrak

dan menyebabkan gangguan kesehatan manusia. Berdasarkan hal tersebut, saat ini

telah dikembangkan metode ekstraksi menggunakan pelarut non organik, misalnya

air.

Ekstraksi menggunakan air pada suhu dan tekanan subkritis (subcritical water

extraction) merupakan alternatif metode ekstraksi yang dinilai efisien, tidak toksik

dan ramah lingkungan. Kim dkk14 telah berhasil melakukan proses ekstraksi buah

makhota dewa dengan mengunakan pelarut air pada suhu 100°C dan tekanan 30 bar

selama 5 jam. Salah satu komponen yang terdapat dalam ekstrak air buah mahkota

dewa tersebut yaitu mangiferin, yang kadarnya (21.7 mg/g) setara dengan ekstrak

metanol (25.0 mg/g) dan lebih besar dari ekstrak etanol (13.2 mg/g).

2.4.2. Studi in vitro ekstrak air buah mahkota dewa

Studi pendahuluan secara in vitro yang dilakukan oleh Berlian dkk22

menunjukkan adanya efek hepatoprotektif ekstrak air buah mahkota dewa. Pertama

dilakukan pengujian terhadap parameter penanda kerusakan hati yaitu ALT dan AST.

Ekstrak air buah mahkota dewa dapat menurunkan ekspresi ALT pada sel HepG2

yang diinduksi etanol 5%, namun ekspresi AST tidak menurun secara signifikan.

Kedua dilakukan pengujian terhadap protein yang diketahui terlibat dalam proses

18


hepatotoksisitas yaitu NF-κB dan TNF-α. Ekstrak air buah mahkota dewa dapat

menurunkan ekspresi NF-κB dan TNF-α pada sel HepG2 yang diinduksi etanol 5%.22

Efek ekstrak air buah mahkota dewa terhadap peroksidasi lipid pada sel

HepG2 juga dievaluasi. Hasil studi menunjukkan adanya penurunan peroksidasi lipid.

Berdasarkan hasil studi tersebut disimpulkan bahwa efek hepatoprotektif ekstrak air

buah mahkota dewa terjadi dengan meningkatkan waktu hidup sel melalui down-

regulation NFkB-TNF-α-lipid peroksidasi.22

2.4.3. Studi in vivo ekstrak air buah mahkota dewa

Studi in vivo dilakukan pada tikus yang diinduksi etanol 20% menggunakan

ekstrak air buah mahkota dewa dosis 37,5; 50 dan 75 mg/kgBB. Ekstrak curcuma

domestica digunakan sebagai pembanding dengan dosis yang sama. Perlakuan

dilakukan selama 4 minggu.23

Hasil studi menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dosis 37,5; 50

dan 75 mg/kgBB dapat menurunkan level AST, ALT, total bilirubin dan γ-globulin

transferase (GGT). Kondisi histopatologi kelompok yang diterapi ekstrak air buah

mahkota dewa dosis 50 dan 75 mg/kgBB sebanding dengan kelompok ekstrak

curcuma domestica dosis yang sama.23

2.4.4. Data toksisitas ekstrak air buah mahkota dewa

Penelitian toksisitas akut yang dilakukan pada mencit jantan dan betina,

menyimpulkan bahwa pemberian dosis tunggal ekstrak air buah mahkota dewa

(Proliverenol) sampai dosis 15 g/kgBB tidak mempengaruhi aktivitas dan perilaku

serta tidak menimbulkan kematian. Nilai LD50 ekstrak air buah mahkota dewa lebih

besar dari 15 g/kgBB yang termasuk kategori praktis non toksik.50

Pada pemeriksaan toksisitas subkronik pada tikus jantan dan betina

disimpulkan bahwa pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 134 mg/kgBB,

536 mg/kgBB dan 1000 mg/kgBB sekali sehari selama 90 hari tidak mempengaruhi

aktivitas motorik dan perilaku tikus. Parameter biokimia darah tidak dipengaruhi

kecuali adanya peningkatan kadar kolesterol yang bermakna pada tikus betina dengan

dosis 536 mg/kgBB dibandingkan kelompok kontrol. Hal tersebut bersifat reversibel

didasarkan hasil pengamatan pada kelompok satelit yang mengalami penurunan

kolesterol.51

19


Terjadi peningkatan eritrosit, angka hematrokit dan hematologi pada tikus

jantan dan betina dengan dosis 536 mg/kgBB. Bobot dan warna urin masih dalam

batas normal. Terdapat penurunan indeks organ hati yang bermakna pada tikus jantan

dengan dosis 536 mg/kgBB, sedangkan pada kelompok dosis 134 mg/kgBB dan 1000

mg/kgBB terjadi peningkatan indeks organ hati. Pada kelompok satelit dosis 1000

mg/kgBB indeks organ hati menurun kembali, yang menunjukkan sifat reversibel.

Peningkatan dosis tidak mempengaruhi aktivitas enzim ALT dan AST serta histologi

hati dibandingkan kelompok kontrol.51

20


2.5. Kerangka teori

Radikal bebas, TGF-β,TNF-α, Angiotensin II,

IL-8/IL-10

TGF-β, TIMP-1,TIMP-3,MCP-1 dan RANTES

FASE

INFLAMASI

FIBROGENESIS

Radikal bebas, TNF-αTGFβ, EGF, IGF

Radikal bebas, TGF-β,TNF-α, IL-6, IGF

Infeksi HBV& HCV

Kolestasis

Kerusakan hati berulang

Kerusakansel hati

Parasit

Alkohol

Obat & Racun

Obstruksivena

Obesitas,NAFLD

Penyakitmetabolik

Aktivasi sel T Aktivasi sel Kupffer

Aktivasi Sel StelataHati (HSC)

Miofibroblas

Sintesis matriks ekstraselular ↑

Fibrosis hati

PDGF

Proliferasi HSCteraktivasi

Inisiasi

perpetuasi

21


2.6. Kerangka konsep

Keterangan:: Parameter yang diperiksa

Karbon tetraklorida (CCl4)

Radikal bebas triklorometil (CCl3*)

CYP4502E1

Radikal bebas triklorometilperoksi

O2

Stres oksidatif ↓

Peroksidasi lipid ↓

Kerusakan sel hati ↓

Aktivasi sel Kupffer ↓

Aktivasi Sel Stelata Hati (HSC) ↓

Miofibroblas ↓

Sintesis matriks ekstraselular ↓

Fibrosis ↓

MDA, RasioGSH/GSSG

ALT, AST, ALP

TNF-α,TGF-β

TNF-α,TGF-β

histopatologi hati

Ekstrak air buahmahkota dewa

NAC(n-acetylcysteine)

22

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1. Disain penelitian

Desain penelitian ini berupa studi nonklinik eksperimental pada tikus dengan

rancangan berpembanding, acak dan paralel.

3.2. Lokasi dan waktu penelitian

Penelitian dilakukan di Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia selama bulan Oktober 2013 – Mei 2014.

3.3. Hewan Coba

Penelitian ini menggunakan tikus jantan galur Sprague-Dawley dengan berat badan

200-350 gram yang berasal dari Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPOMN),

Badan POM. Hewan uji ditempatkan pada ruangan yang suhu dan kelembaban ruangan yang

konstan, penerangan yang cukup, makanan pellet dan air minum ad libitum.

3.4. Etika Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan setelah mendapatkan persetujuan dari Komite Etik

Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

3.5. Obat Uji

Obat yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak air`buah mahkota dewa

(DLBSProliverenol) yang diproduksi oleh PT. Dexa Medica. Pembanding positif yang

digunakan yaitu n-acetyl cysteine (Fluimucil) dengan dosis 150 mg/kg berat badan/hari.

3.6. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan:

1. Ekstrak air buah mahkota dewa (PT. Dexa Medica) No. bets. RP130116

2. N-acetyl cysteine (Fluimucil oral solution 200 mg/Zambon S.p.A, Italia)

3. Karbon tetraklorida (Merck Cat. No. Em.222)

4. Minyak zaitun

23


5. CMC-Na

6. Akuabides (PT. Widarta Bakti)

7. NaCl 0.9% (PT. Widarta Bakti)

8. PBS pH 7.4 (Sigma Aldrich Cat. No. P4417)

9. Protease inhibitor cocktail (Boehringer Cat. No 1697498)

10. Penetapan kadar protein

a. Kit Coomassie PlusTM (Bradford) assay (Thermo Scientific, USA/Cat No. 23236)

11. Penetapan kadar ALT, AST dan ALP

a. Kit enzimatik Dyasis (International Holzheim, Jerman)

12. Penetapan kadar MDA

a. Asam tiobarbiturat, TBA (T5500-25G)

b. MDA standar: 1,1,3,3-tetrametoksipropan 99% (TMEP) (Aldrich 10838-3)

c. Asam trikloroasetat, TCA (Merck K40385207)

13. Penetapan rasio GSH/GSSG Sigma-Aldrich

a. OxyselectTM Total Glutathione (GSSG/GSH) (Cell biolabs Cat. No. STA-312)

b. GSH, standar (Sigma-Aldrich 66529)

14. Pembuatan homogenat jaringan hati

a. Pemeriksaan TNF-α

- PBS pH 7.4

- Protease inhibitor cocktail

b. Pemeriksaan TGF-β

- Tris(hidroksimetil)aminoten, pH 7.4 Trizma Base (Sigma-Aldrich T6791)

- NaCl (Sigma)

- Etilendiamnetetraasetat, EDTA (Sigma-Aldrich E6511)

- Natrium orthovanadate, Na3VO4 (Sigma-Aldrich S6508)

- Natrium fluorida, NaF (Merck)

- Natrium pirofosfat, Na4P2O7 (Sigma-Aldrich 221368)

15. Penetapan kadar TNF-α

a. ELISA kit (Sigma-Aldrich Cat. No RAB0480)

16. Penetapan kadar TGF-β

a. ELISA kit (Novateinbio Cat. No FM-E100129)

17. Pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan Masson’s trichrome

a. Xylol

24


b. Alkohol 100%, 90%, 95%, 70%

c. Larutan Boiun

d. Larutan wugertis iron hematoxylin

e. Larutan blenbrich-acid fuchsin

f. Larutan phosphomolibdic-phosphotungstic acid

g. Larutan aniline blue

h. Larutan asetat 1%

i. Entelan

Alat yang digunakan:

1. Spektrofotometer (Perkin-Elmer)

2. xMark microplate spectrophotometer (BioRad)

3. Homogenizer elektrik (Ultra Turrax)

4. Timbangan analitik (Precisa E220A)

5. Vortex mixer (Labinco)

6. Sentrifus berpendingin (Hitachi)

7. Freezer sampai -20°C dan -80°C (Panasonic)

8. Lemari es -2°C sampai -8°C (GEA laboratoires refrigerator)

9. pH meter (Inolab pH720)

10. Tabung heparin

11. Tabung Eppendrof

12. Tips dan mikropipet (Eppendrof, Finpippette)

13. Microplate 24 well (NuclonTM surface)

14. Microplate 96 well (TPP 92096)

15. Alat-alat gelas lain (Pyrex)

16. Mikroskop cahaya pembesaran 400x

17. Kamera digital (Optilab)

25


3.7. Prosedur Penelitian

Tikus terbagi dalam 6 kelompok dengan jumlah yang diharapkan hidup 5 ekor tiap kelompok.

I. Kelompok normal: tidak diberi perlakuan

II. Kelompok CCl4 (CMC Na 0.5% dan CCl4): diberikan CMC Na 0.5% per oral dan

diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada 2

minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100 gram berat badan sampai 8 minggu). CCl4

dilarutkan dalam minyak zaitun dengan perbandingan 1:1.

III. Kelompok CCl4+NAC (NAC dan CCl4): diberikan NAC per oral dosis 150 mg/kgBB

yang dilarutkan dalam CMC Na 0.5% dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari

sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada 2 minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100

gram berat badan sampai 8 minggu). CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun dengan

perbandingan 1:1.

IV. Kelompok CCl4+T50 (ekstrak air buah mahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrak air

buah mahkota dewa per oral dosis 50 mg/kgBB yang dilarutkan dalam CMC Na 0.5%

dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada

2 minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100 gram berat badan sampai 8 minggu).

CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun dengan perbandingan 1:1.

V. Kelompok CCl4+T100 (ekstrak air buah mahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrak air





VI. Kelompok CCl4+T150 (ekstrak air buah mahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrak air





26


Tabel 2. Pembagian kelompok tikus dan perlakuan

Kelompok TikusPerlakuan pada minggu ke-

1 2 3 4 5 6 7 8

Normal (N) Tidak diberi perlakuan

CCl4 CMC Na 0.5% per oral dan diinjeksi intraperitoneal CCl4

CCl4+NAC NAC per oral (dosis 150 mg/kgBB) dan diinjeksi intraperitoneal CCl4

CCl4+T50ekstrak air buah mahkota dewa per oral (dosis 50 mg/kgBB) dan

diinjeksi intraperitoneal CCl4





Aklimatisasi hewan coba dilakukan di kandang Departemen Farmakologi FKUI

selama 1 minggu. Kemudian, hewan coba dibagi menjadi 6 kelompok sesuai pembagian

tersebut secara acak. NAC dan ekstrak air buah mahkota diberikan bersamaan dengan

dilakukannya induksi fibrosis menggunakan CCl4 melalui injeksi intraperitonial.

Dosis CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa disesuaikan dengan

peningkatan berat badan setiap minggu. Selama periode penelitian, tikus diperlakukan sesuai

dengan standard perlakuan terhadap hewan coba yang berlaku dan dilakukan monitoring

tanda-tanda toksisitas umum seperti penurunan berat badan dan kematian.

Seluruh hewan coba diterminasi pada akhir masa studi dengan cara dekapitasi,

kemudian darah diambil dan dipisahkan plasmanya untuk dilakukan pemeriksaan ALT, AST

dan ALP. Seluruh jaringan hati segera dikeluarkan dan diambil untuk pemeriksaan

histopatologi dan biologi molekular yaitu malondialdehid (MDA), rasio GSH/GSSG, sitokin

inflamasi dan fibrogenik (TNF-α dan TGF-ß).

27


Gambar 3.1. Kerangka kerja penelitian

Pemberian NAC atau obat uji po+

injeksi ip CCl4 dosis 0.2 mL/100gBB

2 minggu

Timbang berat badan tikussetiap hari

6 minggu

Timbang berat badan tikussetiap hari

Tikus diterminasi dengan dekapitasi

Ambil plasma dan organ hatiTimbang organ hati

Organ hati

Pemeriksaanhistopatologi

Homogenat hati

PewarnaanMasson’sTrichrome

Pemeriksaan:1. Kadar Protein2. Kadar MDA3. Rasio GSH/GSSG4. Kadar TNF-α5. Kadar TGF-β

Plasma

Pemeriksaan:1. Aktivitas ALT2. Aktivitas AST3. Aktivitas ALP

Analisis statistikUji normalitas distribusi : Kolmogorov Smirnov

Uji homogenitas varias: Uji LeveneUji kemaknaan statistik: ANOVA satu arah

Perbandingan multipleTukey

Interpretasi hasil analisis statistik dan diskusi

Kesimpulan

Injeksi ip CCl4

dosis 0.2 mL/100gBB

Tidak diberiperlakuan

Pemberian NAC atau obat uji po+

injeksi ip CCl4 dosis 0.1 mL/100gBB

Injeksi ip CCl4

dosis 0.1 mL/100gBB

Tidak diberiperlakuan

28


3.8. Pemeriksaan kadar protein homogenat hati

3.8.1. Prinsip

Prosedur dilakukan untuk menentukan konsentrasi protein yaitu menggunakan reagen

Bradford. Prinsip reaksi berdasarkan pembentukan kompleks antara protein dalam sampel

dan Briliant Blue G. Kompleks yang terbentuk akan menghasilkan perubahan warna dari

coklat ke biru yang serapannya diukur pada panjang gelombang () 595 nm. Besar serapan

yang dihasilkan sebanding dengan konsentrasi protein.52

Perhitungan kadar protein jaringan hati dilakukan dengan tujuan sebagai faktor

pembagi dalam perhitungan kadar MDA, kadar total glutation, kadar GSH, TNF-α dan TGF-

β. Satuan kadar yang diperoleh untuk MDA, total glutation dan GSH menjadi nmol/mg

protein, sedangkan untuk TNF-α dan TGF-β menjadi pg/mg protein.

Reagan kit Coomassie PlusTM (Bradford) assay terdiri dari coomassie plus (Bradford)

assay reagent yang mengandung coomassie G-250 dye, metanol, phosphoric acid dan

pelarut, serta standar abumin 2 mg/mL.

3.8.2. Prosedur

a. Dibuat standar albumin menjadi 6 konsentrasi yang berbeda (blanko, 25-1000

g/mL)

b. Dipipet 10 L standar atau sampel ke dalam microplate 96 well.

c. Ditambahkan 300 L Coomassie Plus reagent ke dalam masing-masing well yang

berisi standar/sampel dan campur menggunakan plate shaker selama 30 detik.

d. Inkubasi plate selama 10 menit pada suhu kamar.

e. Ukur absorbansi pada =595 nm menggunakan plate reader.

f. Kadar protein didapatkan dari kurva standar dan dinyatakan dalam satuan g/mL

(dikonversi menjadi mg/mL).

3.9. Penetapan aktivitas ALT dan AST

3.9.1. Prinsip

ALT atau glutamat piruvat transaminase (GPT) dan AST atau glutamat oksaloasetat

transaminase (GOT) merupakan kelompok enzim aminotransferase atau transferase yang

paling representatif. Enzim ini bekerja mengkatalisis konversi asam keto menjadi asam amino

melalui transfer gugus amino.

29


Prinsip pemeriksaan ALT (GPT) berdasarkan International Federation of Clinical

Chemistry and Laboratory (IFCC ) adalah sebagai berikut:

ALATL-alanin + 2-oksoglutarat L-glutamat + Piruvat

LDHPiruvat + NADH + H+ D-laktat + NAD+

Reagen kit untuk pemeriksaan ALT ini terdiri atas reagen 1 (R1) dan reagen 2 (R2).

R1 mengandung dapar TRIS, L-alanin, dan LDH (laktat dehidrogenase). R2 mengandung 2-

oksoglutarat dan NADH.

Prinsip pemeriksaan AST (GOT) berdasarkan International Federation of Clinical

Chemistry and Laboratory (IFCC ) adalah sebagai berikut:

ASATL-aspartat + 2-oksoglutarat L-glutamat + Oksaloasetat

MDHOksaloasetat + NADH + H+ L-malat + NAD+

Reagen kit untuk pemeriksaan AST ini terdiri atas reagen 1 (R1) dan reagen 2 (R2).

R1 mengandung dapar TRIS, L-aspartat, MDH (malat dehidrogenase) dan LDH (laktat

dehidrogenase). R2 mengandung 2-oksoglutarat dan NADH.

3.9.2. Prosedur

a. Disiapkan campuran monoreagen yaitu 4 bagian R1 + 1 bagian R2 (misalnya

20 mL R1 + 5 mL R2). Monoreagen ini harus dilindungi dari cahaya.

b. Ke dalam tabung dimasukkan 100 L sampel aliquot ditambahkan dengan

1000 L monoreagen dan divorteks.

c. Campuran tersebut dipindahkan ke dalam microplate 24 well dan dibaca

serapannya pada =365 nm, suhu 37°C pada menit ke-1, 2, 3, dan 4.

d. Perhitungan aktivitas ALT dan AST digunakan rumus:

Aktivitas ALT/AST (IU/L) = ΔA sampel X faktor (3235)

A sampel =

30


3.10. Penetapan aktivitas ALP

3.10.1. Prinsip

ALP adalah enzim yang berperan dalam mempercepat hidrolisis fosfat organik

dengan melepaskan fosfat anorganik. Enzim ini terdapat dalam banyak jaringan, terutama di

hati, tulang, mukosa usus dan plasenta.7

Prinsip pemeriksaan ALP berdasarkan International Federation of Clinical Chemistry

and Laboratory (IFCC ) adalah sebagai berikut:

APp-nitrofenilfosfat + H20 fosfat + p-nitrofenol

Reagen kit untuk pemeriksaan ALP ini terdiri atas reagen 1 (R1) dan reagen 2 (R2).

R1 mengandung dapar diethanolamin, magnesium klorida. R2 mengandung p-

nitrofenilfosfat.

3.10.2. Prosedur

a. Disiapkan campuran monoreagen yaitu 4 bagian R1 + 1 bagian R2 (misalnya 20

mL R1 + 5 mL R2). Monoreagen ini harus dilindungi dari cahaya.

b. Ke dalam tabung dimasukkan 20 L sampel aliquot ditambahkan dengan 1000 L

monoreagen dan divorteks.

c. Campuran tersebut dipindahkan ke dalam microplate 24 well dan dibaca

serapannya pada =405 nm, suhu 37°C pada menit ke-1, 2, 3, dan 4.

d. Perhitungan aktivitas ALP digunakan rumus:

Aktivitas ALP (U/L) = ΔA sampel X faktor (2757)

A sampel =

3.11. Pemeriksaan histopatologi hati

Setelah dilakukan terminasi, sebagian lobus hati difiksasi dalam dapar formalin 10%

untuk dibuat sediaan histopatologi di Departemen Histologi FKUI. Proses pematangan

jaringan dilakukan sebelum pewarnaan jaringan. Tahapan yang dilakukan pada proses

pematangan jaringan yaitu dehidrasi, penjernihan, infiltrasi dan penanaman jaringan.

Dehidrasi dilakukan secara berurutan dengan alkohol 70% selama 30 menit kemudian

alkohol absolut selama 30 menit sebanyak tiga kali penggantian. Setelah dehidrasi, jaringan

dijernihkan dengan merendam dalam xylol selama 15 menit sebanyak dua kali pergantian.

31


Selanjutnya dilakukan proses infiltrasi dan penanaman jaringan yaitu dengan merendam

jaringan dalam parafin cair suhu 60°C selama 30 menit. Blok parafin yang terbentuk

kemudian dipotong dengan mikrotom setelan 5 μm. Potongan jaringan tersebut dimasukkan

dalam penangas air suhu 50°C agar mengembang dengan baik dan kemudian direkatkan pada

gelas obyek dan dikeringkan pada suhu 60°C selama 10 menit, dilanjutkan dengan pewarnaan

Masson’s trichrome.

Pewarnaan Masson’s trichrome dilakukan dengan urutan sebagai berikut:53

a. Dimasukkan ke dalam xylol I selama 5 menit, kemudian ke dalam xylol II selama 5

menit.

b. Dicelupkan masing-masing 10 kali secara berurutan ke dalam alkohol 100%, alkohol

95%, alohol 70% dan akuades.

c. Dibilas dengan akuades.

d. Direndam dalam larutan Bouin dan dioven selama 1 jam (56°C).

e. Dicuci dengan air mengalir selama 10 menit dan bilas dengan akuades.

f. Dimasukkan dalam larutan wugertis iron hematoxylin selama 10 menit.

g. Dicuci dengan air mengalir selama 10 menit dan bilas dengan akuades.

h. Dimasukkan dalam larutan blenbrich-acid fuchsin selama 15 menit.

i. Dibilas dengan akuades.

j. Dimasukkan dalam larutan phosphomolibdic-phosphotungstic acid selama 10 menit.

k. Dimasukkan dalam larutan aniline blue selama 5 menit.

l. Dibilas dengan akuades.

m. Dimasukkan dalam larutan acetic 1% selama 3 menit.

n. Dicelupkan masing-masing 10 kali secara berurutan ke dalam alkohol 95%, alkohol

100% ke-1 dan alkohol 100% ke-2.

o. Dimasukkan ke dalam xylol I dan xylol II, masing-masing selama 3 menit.

p. Ditutup dengan kaca penutup yang telah diberi entelan.

q. Preparat jaringan dibaca dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.

Pemeriksaan histopatologi dilakukan secara tersamar oleh patolog dari Fakultas

Kedokteran Hewan IPB, Bogor. Pengamatan area fibrosis hati dilakukan pada daerah

periportal yaitu pada cabang arteri hepatika, cabang vena porta dan cabang duktus biliaris.

Pengamatan area fibrosis dilakukan berdasarkan hasil mikrofotografi menggunakan

mikroskop yang dilengkapi dengan kamera digital (Optilab) pada 5 lapang pandang dengan

32


luas 0.045 mm2 dan perbesaran 400x. Pengambilan lapang pandang dilakukan berlawanan

arah jarum jam sesuai Gambar 3.2 dan selanjutnya dilakukan kuantifikasi menggunakan

imageJ.

Gambar 3.2. Cara pemilihan lapang padang preparathati. Pembacaan dilakukan berlawanan arah jarum jamdengan urutan kanan atas, kiri atas, tengah, kanan bawahdan kiri bawah.

Prosedur kuantifikasi menggunakan imageJ dilakukan dengan urutan sebagai berikut:

1. Skala imageJ diatur terlebih dahulu sebelum dilakukan pengamatan jaringan.

Pertama, klik file kemudian bagian open dan dilanjutkan dengan membuka

fotometer. Kedua, klik “straight line selections” pada toolbar kemudian dibuat garis

lurus pada mikrometer yang menceriminkan skala/jarak tertentu (misal 50 μm),

selanjutnya diikuti dengan klik analyze dan set scale. Pada menu “set scale” ketik

jarak mikrometer yang digunakan pada kolom “known distance”, ketik “μm” pada

kolom unit of length, kemudian klik “global” dan “OK”. Pada sisi kiri atas akan

terlihat ukuran panjang dan lebar foto sesuai jarak yang ditentukan dalam satuan

mikrometer (μm).

2. Penentuan area fibrosis hasil pewarnaan Masson’s trichrome

Pertama, klik file kemudian open dan dibuka foto yang ingin diproses. Kedua,

pada bagian menu klik “image” pada toolbar, kemudian klik bagian “type” dan

selanjutnya pilih “RGB stack”. Pada layar akan muncul foto dalam format “gray

scale” dengan 3 separasi yang berbeda yairu red, green dan blue, kemudian pilih

tipe separasi foto “blue”. Ketiga, klik “open” dan buka kembali foto asli yang akan

diolah untuk digunakan sebagai pembanding. Pada bagian menu klik “image” pada

toolbar kemudian klik “adjust” dan “threshold” sehingga muncul fokus-fokus

berwarna merah yang merupakan “threshold area” pada foto. Area yang menjadi

fokus pengukuran diatur menggunakan “threshold bar” dan pada proses pengaturan

12

3

45

33


tersebut dilakukan perbandingan dengan foto asli. Pada tahap ini, “threshold area”

merupakan area yang positif fibrosis.

3. Pengukuran luas area fibrosis hasil pewarnaan Masson’s trichrome

Sebelum dilakukan pengukuran “threshold area”, klik menu imageJ toolbar

klik bagian “analyze” kemudian dipilih “set measurement”. Pada bagian tersebut

dipilih kolom area, area fraction, limit to threshold, display label kemudian klik

“OK”. Pengukuran “threshold area” dilakukan dengan klik bagian “analyze” dan

“measure”. Pada layar akan terlihat hasil pengukuran luas area fibrosis dalam satuan

μm dan persen (%) area fibrosis.

3.12. Penetapan kadar MDA

3.12.1. Prinsip

Metode ini digunakan untuk menentukan senyawa aldehid, termasuk malondialdehid

(MDA) yang terbentuk dari hasil peroksidasi lemak oleh radikal bebas. MDA dapat bereaksi

dengan asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan senyawa berwarna yang mengabsorpsi

cahaya pada =530 nm. Standar MDA yang digunakan adalah 1,1,3,3-tetrametoksipropan

(TMEP). Pemeriksaan MDA dilakukan terhadap homogenat hati.

3.12.2. Prosedur pembuatan homogenat hati

a. Jaringan hati ditimbang ± 100 mg dan ditambahkan PBS ± 1 mL.

b. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan ultraturax selama 3 menit pada

suhu 4°C.

c. Homogenat dipindahkan ke dalam tabung Eppendrof dan disentrifugasi pada 4°C,

3000 rpm selama 10 menit.

d. Supernatan dipindahkan dalam tabung Eppendrof sebelum dilakukan pemeriksaan

MDA.

3.12.3. Prosedur

a. Larutan stok MDA standar dibuat dalam aquabides. Pengenceran larutan stok

MDA standar dibuat setiap hari pengukuran untuk memperoleh larutan standar

MDA dengan 7 konsentrasi berbeda (blanko standar, 0.075 – 2.4 nmol/mL).

34


b. Berbagai reagen yang perlu disiapkan sebagai berikut:

Larutan TCA 20% (b/v) dalam akuabides.

Larutan TBA 0.67% (b/v) dalam akuabides.

c. Ke dalam tabung sentrifus berisi 200 L sampel aliquot atau larutan MDA

standar, ditambahkan dengan akuabides 1800 L.

d. Ditambahkan 1 mL larutan TCA 20%, divorteks dan ditambahkan 2 mL larutan

TBA 0.67% kemudian dicampur sampai homogen dengan vorteks dan dipanaskan

pada suhu 100°C selama 10 menit.

e. Setelah larutan mencapai suhu ruang, tabung sampel ditutup dengan parafilm dan

disentrifus pada 3000 rpm selama 10 menit menggunakan sentrifus berpendingin.

f. Supernatan dipindahkan ke dalam kuvet 1 mL dan diukur absorbansinya pada

= 530 nm terhadap blanko.

g. Kadar MDA dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar MDA

dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga diperoleh

kadar dengan satuan nmol/mg protein.

3.13. Penetapan rasio GSH/GSSG

3.13.1. Prinsip

Penetapan rasio GSH/GSSG dilakukan dengan mengukur kadar total glutation dan

glutation tereduksi (GSH) yang terdapat dalam homogenat hati. OxiselectTM assay kit

digunakan untuk mengukur kadar total glutation dan GSH yang terdapat dalam sampel

(GSH/GSSG). Glutation teroksidasi (GSSG) akan direduksi menjadi GSH oleh reaksi yang

secara spesifik dikatalisis oleh enzim glutation reduktase dan NADPH. Kromogen akan

bereaksi dengan gugus tiol dari GSH menghasilkan kompleks warna yang dibaca pada

=405 nm. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kadar total glutation dalam

sampel (Gambar 10).54,55

Gambar 3.3. Prinsip pemeriksaan total glutation54

35


Pada pemeriksaan GSH tidak dilakukan penambahan glutation reduktase. Gugus tiol

dari GSH yang terdapat dalam sampel akan bereaksi dengan kromogen menghasilkan

kompleks warna yang dibaca pada =405 nm. Intensitas warna yang terbentuk sebanding

dengan kadar GSH dalam sampel.

Kadar GSSG dalam sampel diperoleh dengan melakukan pengurangan kadar total

glutation terhadap kadar GSH dalam sampel. Rasio GSH/GSSG diperoleh dengan membagi

kadar GSH dengan kadar GSSG dalam sampel.

3.13.2. Prosedur pembuatan homogenat hati

a. Jaringan hati ditimbang ± 40 mg dan ditambahkan 400 L MPA 5%.

b. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan pestel kaca selama 3 menit pada

suhu 4°C.


12000 rpm selama 15 menit.


total glutation.

3.13.3. Prosedur pemeriksaan rasio GSH/GSSG

Penetapan rasio GSH/GSSG ditentukan setelah dilakukan pengukuran kadar total

glutation dan kadar GSH terlebih dahulu.

Prosedur penetapan kadar total glutation adalah sebagai berikut:

a. Larutan stok GSSG (1 μM) dibuat dalam 0.5% MPA. Pengenceran larutan stok

GSSG dibuat setiap hari pengukuran untuk mendapatkan larutan standar GSSG

dengan 6 konsentrasi berbeda (blanko standar, 0.0156-0.5 M).

b. Secara berurutan, ditambahkan 25 L glutation reduktase, 25 L NADPH, 100 L

sampel/standar dan 50 L kromogen ke dalam masing-masing sumur, campur dan

serapan segera dibaca pada =405 nm setiap 1 menit selama 10 menit.

c. Kadar total glutation dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar

GSSG dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga

diperoleh kadar dengan satuan nmol/mg protein.

36


Prosedur penetapan kadar GSH adalah sebagai berikut:

a. Larutan stok GSH (1 μM) dibuat dalam akuabides. Pengenceran larutan stok GSH

dibuat setiap hari pengukuran untuk mendapatkan larutan standar GSH dengan 6

konsentrasi berbeda (blanko standar, (0.0156 - 0.5 M).

b. Secara berurutan, ditambahkan 25 L NADPH, 100 L sampel/standard dan 50 L

kromogen ke dalam masing-masing sumur, campur dan serapan segera dibaca pada

=405 nm.

c. Kadar GSH dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar GSH dan

hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga diperoleh kadar

dengan satuan nmol/mg protein.

.

3.14. Pemeriksaan TNF-α

3.14.1. Prinsip

Human TNF-α adalah protein nonglikosilasi dengan berat molekul 17.5 kDa dan

tersusun dari 157 asam amino. TNF-α disekresikan oleh makrofag, monosit, neutrofil, sel T

dan sel NK. TNF-α memegang peran penting dalam proses inflamasi, apoptosis dan

perkembangan sistem imun.56

Rat TNF-α ELISA kit digunakan untuk pemeriksaan kuantitatif TNF-α dalam cell

lysate atau jaringan. Pemeriksaan ini menggunakan antibodi spesifik untuk TNF-α tikus yang

di-coating pada 96 well plate. Antibodi tersebut akan berikatan dengan TNF-α yang terdapat

dalam sampel sehingga membentuk komplek antigen-antibodi. Kompleks tersebut akan

berikatan dengan antibodi sekunder (biotinylated anti-rat TNF-α). Selanjutnya, ke dalam

sumur ditambahkan enzim (HRP-conjugated streptavidin) yang akan berikatan dengan

biotinylated anti-rat TNF-α. Substrat HRP (TMB/3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) yang

ditambahkan berikutnya akan dihidrolisis oleh enzim sehingga terbentuk warna yang

intensitasnya sebanding dengan jumlah TNF-α yang terikat. Penambahan stop solution pada

akhir prosedur akan mengubah warna dari biru menjadi kuning dan intensitas warna yang

terbentuk dibaca pada =450 nm.

37


3.14.2. Prosedur pembuatan homogenat pemeriksaan TNF-αa. Jaringan hati ditimbang ± 10 mg dan ditambahkan PBS/protease inhibitor ± 500

L (1:50).

b. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan pestel kaca kemudian homogenat

dipindahkan ke dalam tabung.


10000 g selama 5 menit.


TNF-α.

3.14.3. Prosedur pemeriksaan TNF-αa. Semua reagen dan sampel diletakkan pada suhu ruang (18-25°C) sebelum

digunakan.

b. Persiapan standar:

i. Larutan standar Rat TNF-α dibuat dengan cara menambahkan 400 μl dapar

pelarut sampel ke dalam 1 vial rekombinan rat TNF-α sehingga diperoleh

larutan standar TNF-α dengan konsentrasi 100 ng/mL (100000 pg/mL).

ii. Dapar pelarut sampel sebanyak 400 μL ditambahkan ke dalam 7 tabung yang

berbeda.

iii. Standar TNF-α sebanyak 100 μL ditambahkan ke dalam tabung pertama

sehingga diperoleh larutan stok standar konsentrasi 20000 pg/mL.

iv. Serial dilusi dilakukan dengan menggunakan larutan stok standar sehingga

diperoleh larutan standar TNF-α dengan 6 konsentrasi berbeda. Dapar pelarut

sampel digunakan sebagai standar 0 (0 pg/ml).

c. Standar atau sampel sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-masing sumur.

Sumur ditutup dan inkubasi selama 2.5 jam pada suhu kamar.

d. Cairan kemudian dibuang dan dicuci sebanyak 4 kali dengan wash solution.

Pencucian dilakukan dengan mengisi tiap sumur dengan 300 μl wash solution

pada setiap tahapnya. Cairan dibuang dari sumur dengan cara membalikkan plate

dan diketuk di atas tisu.

e. Biotinylated anti-rat TNF-α sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-masing

sumur, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dan digoyang secara

perlahan.

38


f. Cairan dibuang dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap d.

g. Larutan HRP-conjugated streptavidin sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-

masing sumur, kemudian diinkubasi selama 45 menit pada suhu kamar dan

digoyang secara perlahan.

h. Cairan dibuang dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap d.

i. TMB one step substrate reagen sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-

masing sumur, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dan

digoyang secara perlahan.

j. Stop solution sebanyak 50 μL ditambahkan pada masing-masing sumur, kemudian

serapan dibaca pada =450 nm.

k. Kadar TNF-α dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar

TNF-α dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga

diperoleh kadar dengan satuan pg/mg protein.

3.15. Pemeriksaan TGF-β1

3.15.1. Prinsip

Rat TGF-β ELISA kit berdasarkan prinsip sandwich ELISA. Antibodi spesifik TGF-

β1 tikus di-coating pada 96 well plate. Antibodi tersebut akan berikatan dengan TGF-β1 yang

terdapat dalam sampel sehingga membentuk komplek antigen-antibodi. Kompleks tersebut

akan berikatan dengan antibodi sekunder (biotinylated anti-rat TGF-β1). Selanjutnya, ke

dalam sumur ditambahkan enzim (HRP-conjugated streptavidin) yang akan berikatan dengan

biotinylated anti-rat TGF-β1. Substrat HRP (TMB/3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) yang

ditambahkan berikutnya akan dihidrolisis oleh enzim sehingga terbentuk warna yang

intensitasnya sebanding dengan jumlah TGF-β1 yang terikat. Penambahan stop solution pada

akhir prosedur akan mengubah warna dari biru menjadi kuning dan intensitas warna yang

terbentuk dibaca pada =450 nm.

3.15.2. Prosedur pembuatan homogenat pemeriksaan TGF-β1a. Berbagai reagen yang perlu disiapkan untuk pembuatan dapar homogenat yaitu:

100 mM Tris, pH 7.4

150 mM NaCl

5 mM EDTA

2 mM natrium orthovanadate (Na3VO4)

39


1 mM natrium fluorida (NaF)

20 mM natrium pirofosfat (Na4P2O7)

b. Jaringan hati ditimbang ± 10 mg dan ditambahkan dapar homogenat/protease

inhibitor ± 600 L (1:60).

c. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan pestel kaca, kemudian

homogenat dipindahkan ke dalam tabung.

d. Pestel kaca dibilas dengan 200 L sebanyak 2 kali dan cairan hasil bilasan

tersebut dikumpulkan dalam 1 tabung yang sama dengan suspensi c.

e. Tabung digoyang menggunakan orbital shaker (120-150 rpm) pada suhu 4°C

selama 60 menit.

f. Homogenat disentrifugasi pada 4°C, 13000 rpm selama 20 menit

g. Supernatan dipindahkan dalam tabung Eppendrof sebelum dilakukan pemeriksaan

TGF-β1.

3.15.3. Prosedur pemeriksaan TGF-β1a. Persiapan standar:

i. Larutan standar Rat TGF-β1 dibuat dengan menambahkan 1 mL pelarut

sampel ke dalam 1 tabung 10 ng rat TGF-β1 sehingga diperoleh larutan

standar stok TGF-β1 dengan konsentrasi 10000 pg/mL.

ii. Disiapkan 7 tabung dan ke dalam tabung pertama ditambahkan 0.9 mL pelarut

sampel dan 0.1 mL larutan stok standar TGF-β1 (10000 pg/mL) sehingga

diperoleh larutan standar konsentrasi 1000 pg/mL.

iii. Tabung 2 sampai 6 ditambahkan dengan 0.25 mL pelarut sampel.

iv. Serial dilusi dilakukan dengan menggunakan larutan standar dari tabung

pertama (1000 pg/mL) sehingga diperoleh larutan standar TGF-β1 dengan 6

konsentrasi berbeda. Pelarut sampel digunakan sebagai standar 0 (0 pg/mL).

b. Standar dan sampel sebanyak 100 μL ditambahkan ke dalam masing-masing

sumur. Sumur ditutup dan inkubasi selama 1.5 jam pada suhu 37°C.

c. Setiap sumur diaspirasi dan dicuci 3 kali dengan wash solution. Pencucian

dilakukan dengan mengisi tiap sumur dengan 300 μL wash solution pada setiap

tahapnya. Cairan dihilangkan dari sumur dengan cara membalikkan plate dan

diketuk di atas tisu.

40


d. Biotinylated anti-rat TGF-β1 sebanyak 100 μL ditambahkan pada masing-masing

sumur, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C.

e. Setiap sumur diaspirasi dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap c.

f. Larutan HRP-conjugated streptavidin sebanyak 100 μL ditambahkan pada

masing-masing sumur, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C.

g. Setiap sumur diaspirasi dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap c sebanyak

5 kali.

h. TMB one step substrate reagen sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-

masing sumur, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.

i. Stop solution sebanyak 100 μL ditambahkan pada masing-masing sumur dan

dicampur. Serapan segera dibaca pada =450 nm.

j. Kadar TGF-β1 dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar

TGF-β1 dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga

diperoleh kadar dengan satuan pg/mg protein.

3.16. Analisis statistik

Seluruh nilai disajikan sebagai mean ± SD. Perbandingan antara enam kelompok

dianalisis menggunakan ANOVA satu arah dengan batas kemaknaan p < 0.05, bila hasil

bermakna maka akan dilanjutkan dengan analisis Post hoc (least significant difference).

Homogenisitas varians dan normalitas distribusi data dinilai terlebih dahulu menggunakan uji

Levene dan uji Kolmogorov Smirnov. Apabila data tidak homogen dan tidak menggambarkan

distribusi yang normal, selanjutnya dilakukan trasformasi data. Bila setelah ditransformasi

data tetap tidak terdistribusi normal dan tidak homogen, dilakukan uji non-parametrik

Kruskal-Wallis dengan batas kemaknaan yang sama. Bila bermakna maka akan dilanjutkan

dengan uji Mann-Whitney. Seluruh data dianalisis dengan menggunakan program SPSS 16.

41

BAB 4

HASIL PENELITIAN

Penelitian ini telah lulus uji etik dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia pada tanggal 23 Desember 2013 Nomor 785/H2.F1/ETIK/2013.

4.1. Berat badan tikus

Selama 8 minggu prosedur suplementasi dan pemberian injeksi intraperitoneal

CCl4, kelompok CCl4 mengalami kecenderungan penurunan berat badan dibandingkan

kelompok normal, kelompok NAC maupun kelompok ekstrak air buah mahkota dewa.

Namun secara keseluruhan, perubahan berat badan yang terjadi tersebut relatif tidak

berbeda. Selain pengamatan terhadap berat badan tikus, juga dilakukan pengamatan

terkait kematian hewan coba pada setiap kelompok perlakuan. Kelompok T150

memiliki persentase kematian yang sama dengan kelompok CCl4 sebesar 28%,

sedangkan untuk kelompok NAC, T50 dan 100 tingkat kematian yang terjadi lebih

rendah sebesar 14%. Perubahan berat badan tikus dan persentase kematian pada

masing-masing kelompok disajikan pada Gambar 4.1 dan Tabel 3.

Gambar 4.1. Perubahan berat badan tikus selama 8 minggu perlakuan. N: Normal,CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100,T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.

220

240

260

280

300

320

340

360

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Ber

at b

adan

(gr

am)

Minggu ke-

N

CCl4+T100

CCl4+T50CCl4+NACCCl4+T150

CCl4

42


Tabel 3. Perubahan berat badan tikus dan persentase kematian hewan coba

KelompokBerat badan (gram) Rasio berat

hati/beratbadan

Persentasekematian

Awal Akhir N (n=5) 278.80 354.20 75.40 (↑) 2.92 0

CCl4 (n=5) 279.60 275.53 -4.07 (↓) 3.60 28.57

CCl4+NAC (n=5) 284.00 293.88 9.88 (↑) 3.10 14.29

CCl4+T50 (n=5) 281.20 294.56 13.36 (↑) 3.11 14.29

CCl4+T100 (n=5) 278.80 320.93 42.13 (↑) 3.10 14.29

CCl4+T150 (n=5) 275.60 287.72 12.12 (↑) 3.14 28.57Keterangan :N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50,T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.

Perubahan berat badan setiap minggunya untuk masing-masing hewan coba

terdapat di Lampiran 4.

4.2. Kadar protein homogenat hati

Pemeriksaan kadar protein homogenat jaringan hati dilakukan untuk

menentukan kadar MDA, rasio GSH/GSSG, TNF-α dan TGF-β, sehingga kadar

MDA, GSH dan GSSG dalam satuan nmol/mg protein, sedangkan kadar TNF-α dan

TGF-β dalam pg/mg protein. Kadar protein homogenat untuk masing-masing hewan

coba disertakan dalam Lampiran 5.

4.3. Aktivitas ALT, AST dan ALP

Pemberian injeksi intraperitoneal CCl4 meningkatkan aktivitas ALT dan AST

sebesar 3 kali dan aktivitas ALP sebesar 6 kali dibandingkan kelompok N. Pemberian

NAC maupun ekstrak air buah mahkota dewa T50, T100 dan T150 menurunkan

aktivitas ALT dan AST secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05) dan

mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.2 dan 4.3). Pemberian NAC maupun

ekstrak air buah mahkota dewa T50, T100 dan T150 menurunkan aktivitas ALP

secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05), namun belum dapat

mendekati kelompok N (p<0.05) (Gambar 4.4)

43


N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00

5 0

1 0 0

1 5 0 a

b

bb

b

Akt

ivita

s A

LT (U

/L)

Rerata 36.68 123.87 42.10 44.99 46.98 56.44SD 9.722 13.241 5.692 7.577 11.293 14.036

Gambar 4.2. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALT plasma setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/ kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.


5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

a

b

bb

b

Akt

ivita

s A

ST (U

/L)

Rerata 54.28 173.54 55.21 55.77 65.09 69.12SD 6.202 18.799 14.774 12.193 9.556 12.513

Gambar 4.3. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim AST plasma setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

44



5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

b

b

b

b

a

Ak

tivi

tas

AL

P (

U/L

)

Rerata 180.12 1050.00 461.15 626.30 712.13 782.71SD 13.158 66.782 56.417 59.719 61.904 66.248

Gambar 4.4. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALP plasma setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

Aktivitas ALT, AST dan ALP hewan coba pada masing-masing kelompok dan

hasil analisis statistik disertakan dalam Lampiran 6, 7 dan 8.

4.4. Histopatologi hati

Hasil pewarnaan Masson’s trichrome menunjukkan bahwa pemberian injeksi

intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu menyebabkan terbentuknya jaringan ikat di

hati. Hal ini ditunjukkan oleh persentase jaringan ikat yang meningkat secara

bermakna dibandingkan kelompok N (12.83 ± 1.332 vs 2.03 ± 1.236, p<0.05).

Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150)

menurunkan persentase jaringan ikat secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4

(p<0.05), namun belum dapat mendekati kelompok N (p<0.05) (Gambar 4.5 dan 4.6).

Persentase jaringan ikat hati hewan coba pada masing-masing kelompok dan

hasil analisis statistik disertakan dalam Lampiran 9.

45



5

1 0

1 5 a

bb

b

bP

erse

ntas

e ja

ring

an ik

at (%

)

Rerata 2.03 12.83 6.67 8.28 8.55 9.46SD 1.236 1.332 1.626 2.517 1.139 2.021

Gambar 4.5. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap persentase jaringan ikat hati setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC:N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buahmahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.

46


Gambar 4.6. Gambaran histopatologi fibrosis hati setelah 8 minggu perlakuan denganpewarnaan Masson’s trichrome. Warna biru menunjukkan akumulasi jaringan ikat yangterjadi di sekitar cabang vena porta, cabang duktus biliaris dan cabang arteri hepatika.A. Kelompok Normal (2.03%). B. Kelompok CCl4 (12.83%). C. Kelompok CCl4+NAC(6.67%). D. Kelompok CCl4+T50 (8.28%). E. Kelompok CCl4+T100 (8.55%). F. KelompokCCl4+T150 (9.46%).N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50,T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.

A B

C D

E F

47


4.5. Kadar MDA homogenat hati

Pemberian injeksi intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu meningkatkan kadar

peroksidasi lipid di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadar MDA yang

meningkat secara bermakna dibandingkan kelompok N (0,119 ± 0,0254 vs 0,039 ±

0,0097, p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan

T150) menurunkan kadar MDA secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4

(p<0.05) dan mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.7).

Kadar MDA hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil analisis

statistik disertakan dalam Lampiran 10.

N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0 0

0 .0 5

0 .1 0

0 .1 5 a

bbbb

Kad

ar M

DA

(nm

ol/m

g pr

otei

n)

Rerata 0.039 0.119 0.049 0.050 0.051 0.054SD 0.0097 0.0254 0.0073 0.0074 0.0126 0.0145

Gambar 4.7. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadapkadar MDA hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ± SD(n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

48


4.6. Rasio GSH/GSSG homogenat hati

Pemberian injeksi intraperitoneal CCl4 secara bermakna menurunkan rasio

GSH/GSSG dibandingkan kelompok N. Rasio GSH/GSSG pada kedua kelompok

tersebut secara berurutan adalah 0.49 ± 0.064 dan 1.72 ± 0.370 (p<0.05). Pemberian

NAC maupun ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150) meningkatkan

rasio GSH/GSSG secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05) dan

hasilnya mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.8).

N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

a

bbb

b

Ras

io G

SH/G

SSG

Rerata 1.72 0.49 1.83 1.42 1.42 1.41SD 0.370 0.064 0.303 0.383 0.322 0.298

Gambar 4.8. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadaprasio GSH/GSSG hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ±SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50,100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

Rasio GSH/GSSG hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil

analisis statistik disertakan dalam Lampiran 11.

49


4.7. Kadar TNF-α homogenat hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu meningkatkan kadar

TNF-α di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadar TNF-α yang meningkat secara

bermakna dibandingkan kelompok N (2324.35 ± 376.090 vs 1412.96 ± 224.345,

p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150)

menurunkan kadar TNF-α secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05)

dan mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.9).


1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0 a

bbb

b

Kad

ar T

NF

(pg/

mg

prot

ein)

Rerata 1412.96 2324.35 1418.71 1440.95 1441.81 1475.56SD 224.345 376.090 135.235 281.052 379.674 187.178

Gambar 4.9. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TNF-α homogenat hati setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

Kadar TNF-α hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil analisis


50


4.8. Kadar TGF-β1 homogenat hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu meningkatkan kadar

TGF-β1 di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadar TGF-β1 yang meningkat

secara bermakna dibandingkan kelompok N (2515.68 ± 471.885 vs 492.45 ± 227.813,

p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150)

menurunkan kadar TGF-β1 secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05)

(Gambar 4.10).


1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

a

b b bb

Kad

ar T

GF

(pg/

mg

prot

ein)

Rerata 492.45 2515.68 1696.69 1749.25 1795.35 1821.75SD 227.813 471.885 189.939 365.714 232.980 297.028

Gambar 4.10. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TGF-β hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalamrata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buahmahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

Kadar TGF-β1 hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil analisis


51

BAB 5

PEMBAHASAN

Studi ini merupakan studi non klinik yang didesain untuk mengetahui

efektivitas ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah terjadinya fibrosis hati.

Penelitian ini dilatarbelakangi oleh tidak tersedianya obat standar untuk pencegahan

fibrosis hati dan pemanfaatan salah satu tanaman asli Indonesia, yaitu mahkota dewa

sebagai kandidat obat pencegah fibrosis hati.

Studi dilakukan dengan menggunakan CCl4 sebagai penginduksi fibrosis hati.

Pemilihan CCl4 didasarkan pada karakteristik CCl4 yang memberikan pola terjadinya

fibrosis seperti pada manusia, baik dari parameter biokimia, perubahan molekuler

maupun gambaran histopatologi.38 Pemberian CCl4 untuk induksi fibrosis hati dapat

dilakukan dengan injeksi intraperitoneal atau subkutan. Cháved E dkk5 menggunakan

tikus galur Wistar yang diinjeksi intraperitoneal CCl4 dosis 0.4 g/kgBB tiga kali per

minggu selama 8 minggu. Studi yang dilakukan oleh Wang dkk4 menggunakan galur

yang sama dan diinjeksi subkutan CCl4 dengan dosis awal 4 ml/kgBB kemudian

30 ml/kgBB, dan dilakukan dua kali per minggu selama 14 minggu. Fu dkk57

menggunakan galur Sprague-Dawley dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 (0.1 ml/100

gBB) setiap 2 hari sekali selama 8 minggu. Hal ini menunjukkan belum adanya

standar model fibrosis hewan coba menggunakan CCl4. Berdasarkan hal tersebut,

maka dilakukan studi pendahuluan untuk memperoleh metode induksi fibrosis hati

yang tepat.

Studi pendahuluan dilakukan sesuai prosedur yang dilakukan oleh

Constandinou dkk38 dengan sedikit modifikasi. Pemilihan metode tersebut didasarkan

pada pemilihan cara pemberian CCl4 dengan injeksi intraperitoneal dan kesamaan

galur tikus yang akan digunakan dalam penelitian saat ini yaitu tikus galur Sprague-

Dawley. CCl4 diberikan secara injeksi intraperitoneal dosis 0.2 mL/100 gBB pada 2

minggu pertama dan dilanjukan dosis 0.1 mL/100 gBB sampai 8 minggu.38 Pemberian

CCl4 dilakukan dengan interval waktu 3 hari. Pemeriksaan histopatologi Masson’s

trichrome menunjukkan terbentuknya jaringan ikat setelah 8 minggu perlakuan.

Selanjutnya dilakukan studi utama dengan menggunakan metode tersebut di

atas. Studi dilakukan dengan membagi hewan coba dalam 6 kelompok. Semua

kelompok tikus percobaan mendapat makanan, minuman dan lingkungan

pemeliharaan yang sama.

52


Penelitian ini menggunakan NAC dosis 150 mg/kgBB sebagai pembanding

positif. Pemilihan NAC didasarkan pada mekanisme antioksidan NAC yang

berpotensi dalam mencegah fibrosis hati dan telah terbukti secara non klinik melalui

studi in vivo menggunakan model hewan coba yang diinduksi CCl4.9,45,46 Pemilihan

dosis NAC didasarkan pada studi non klinik dan studi klinik. Studi non klinik yang

dilakukan oleh Narasimhanaidu dkk45 menggunakan NAC dosis 150 mg/kgBB. Studi

klinik yang dilakukan oleh Khosbaten dkk10 menggunakan NAC dosis 600 mg setiap

12 jam selama 3 bulan dan hasilnya menunjukkan adanya perbaikan fungsi hati pada

pasien non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).10 Dosis pada tikus tersebut

ekuivalen dengan dosis pada manusia.58 Berdasarkan hal tersebut maka digunakan

NAC dosis 150 mg/kgBB tikus.

Mahkota dewa mengandung berbagai senyawa seperti alkaloid dan flavonoid

yang memberikan efek antioksidan, antiinflamasi dan hepatoprotektif. Dengan adanya

efek tersebut diharapkan dapat berperan dalam proses pencegahan fibrosis hati.

Pemilihan dosis ekstrak air buah mahkota dewa didasarkan pada studi pendahuluan

secara in vivo. Hasil studi yang dilakukan oleh Nailufar dkk23 tersebut menunjukkan

bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50 mg/kgBB memberikan efek

hepatoprotektif pada tikus yang diinduksi etanol selama 4 minggu. Berawal dosis

tersebut di atas, pada penelitian ini juga digunakan dosis yang lebih besar yaitu 100

mg/kgBB dan 150 mg/kgBB. Hal ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak air

buah mahkota dewa sebagai pencegah fibrosis hati pada kisaran dosis 50 hingga 150

mg/kgBB.

Penilaian efektivitas obat uji maupun obat pembanding diperoleh melalui

pemeriksaan serum biomarker, aktivitas antioksidan dan histopatologi jaringan hati.

Secara umum, biomarker fibrosis diklasifikasikan menjadi 2 kelas yaitu kelas I

dan II.59,60

Kelas I merupakan biomarker serum langsung yang terkait proses fibrogenesis

dan terdapat di serum sebagai hasil peningkatan matriks ekstraselular. TGF-β dan

TNF-α adalah sitokin yang terkait langsung dengan fibrogenesis sehingga digunakan

sebagai biomarker fibrosis hati. Kelas II merupakan biomarker serum tidak langsung

dan umumnya berupa pemeriksaan laboratorium rutin fungsi hati. Serum ALT, AST,

ALP merupakan marker yang sensitif terkait cedera hati dan progresi penyakit

hati.59,60 Penilaian juga dilakukan terhadap aktivitas antioksidan ekstrak air buah

mahkota dewa yaitu melalui pemeriksaan penanda stres oksidatif (MDA dan rasio

53


GSH/GSSG). Pemeriksaan histopatologi merupakan gold standar untuk mengetahui

derajat fibrosis hati yang terjadi.59,60

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 selama 8 minggu

meningkatkan aktivitas ALT, AST dan ALP di plasma dibandingkan kelompok

normal. Peningkatan aktivitas ALT dan AST menunjukkan terjadinya pelepasan

enzim dari jaringan hati ke sirkulasi darah yang disebabkan oleh kerusakan sel hati.

Peningkatan aktivitas ALP terjadi akibat adanya kolestasis, dan pada obstruksi intra

maupun ekstrabiliar enzim ini akan meningkat 3-10 kali dari nilai normal. ALT

merupakan enzim yang terdapat di dalam sitosol sel hati, AST terdapat di dalam

sitosol serta mitokondria sel hati, sel otot rangka, jantung dan ginjal, sedangkan ALP

terdapat dalam banyak jaringan terutama di hati, tulang dan mukosa usus.7,58,61,62

Peningkatan aktivitas enzim ALT, AST dan ALP lebih dari 2 kali lipat pada

hewan coba dianggap menunjukkan adanya kelainan.63,64 Dari penelitian ini

didapatkan bahwa pemberian CCl4 selama 8 minggu meningkatkan aktivitas ALT dan

AST 3 kali dibandingkan kelompok normal, sedangkan aktivitas ALP meningkat 6

kali dibandingkan kelompok normal (p<0.05). Hasil ini menunjukkan bahwa

pemberian CCl4 menyebabkan terjadinya kerusakan sel hati. Hasil ini sejalan dengan

penelitian yang dilakukan oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,6 Demiroren dkk,9 dan Fu

dkk57 yang memberikan hasil berupa peningkatan aktivitas ALT, AST dan ALP antara

3 kali hingga 10 kali pada tikus yang menggunakan CCl4 sebagai penginduksi fibrosis

hati.

Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewa dosis

50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan aktivitas enzim ALT, AST dan ALP

secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4. Penurunan aktivitas enzim ALT dan

AST pada pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa tersebut dapat

mendekati kelompok normal dan sebanding dengan NAC. Penurunan aktivitas ALP

juga sebanding dengan NAC, walaupun belum dapat mendekati kelompok normal.

Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Demiroren dkk9 dan

Kamalakkannan dkk45 yang menunjukkan bahwa penurunan aktivitas ketiga enzim

tersebut mendekati kelompok normal pada pemberian NAC. Secara keseluruhan,

penurunan aktivitas ALT, AST dan ALP mengindikasikan bahwa ekstrak air buah

mahkota dewa dapat melindungi sel hati akibat paparan CCl4 secara kronis.

54


Pemeriksaan secara akurat tingkat keparahan fibrosis hati merupakan hal

penting untuk menentukan rencana pengobatan yang akan diberikan dan respon

pasien terhadap terapi tersebut. Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan

histopatologi jaringan hati tikus, yaitu menggunakan teknik pewarnaan masson’s

trichrome yang bertujuan untuk mengidentifikasi jaringan ikat. Penilaian dilakukan

secara kuantitatif menggunakan imageJ yaitu dengan menghitung persentase jaringan

ikat (warna biru) yang terbentuk pada daerah periportal. Perhitungan dilakukan pada 5

lapang pandang untuk setiap hewan coba dan dilakukan secara tersamar.


menyebabkan terbentuknya jaringan ikat dengan persentase yang lebih besar

dibandingkan kelompok normal. Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air

buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan persentase

jaringan ikat di hati walaupun belum dapat mendekati kelompok normal. Penurunan

persentase jaringan ikat pada pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa

sebanding dengan kelompok NAC. Hal ini mengindikasikan adanya proses

penghambatan terjadinya fibrosis hati pada pemberian ekstrak air buah mahkota

dewa.

Penilaian terhadap parameter penanda fungsi hati dan histopatologi

memberikan hasil positif sehingga dilakukan pemeriksaan lebih lanjut untuk

mengetahui mekanisme kerja ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah

terjadinya fibrosis hati. Hendra dkk15 melaporkan bahwa ekstrak etanol buah mahkota

dewa mengandung senyawa fenol dan flanovoid yang memiliki aktivitas antioksidan

dan antiinflamasi. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penilaian terhadap

aktivitas antioksidan dan antiinflamasi ekstrak air buah mahkota dewa.

Penilaian aktivitas antioksidan ekstrak air buah mahkota dewa dilakukan

melalui pemeriksaan peroksidasi lipid dan rasio GSH/GSSG pada jaringan hati.

Peroksidasi lipid adalah penanda yang penting terhadap kerusakan jaringan karena

stres oksidatif dan dapat diimplikasikan sebagai penyebab fibrosis hati.

Malondialdehid (MDA) merupakan produk akhir peroksidasi lipid dan dikeluarkan

dari hepatosit ke dalam space of Disse.33 Pemeriksaan peroksidasi lipid in vivo secara

tidak langsung dapat dilakukan dengan mengukur kadar MDA, yaitu dengan uji asam

tiobarbiturat (TBA).


dapat meningkatkan meningkatkan kadar MDA dalam jaringan hati hingga 3 kali

55


dibandingkan kelompok normal. Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan

oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,6 Kamalakkannan dkk45 dan Pereira-Filho dkk46 yang

menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati pada tikus. Peningkatan kadar

MDA terjadi karena hasil metabolisme CCl4 berupa radikal triklorometil dan

triklorometilperoksi yang dapat menyerang lipid membran retikulum endoplasma

sehingga menyebabkan peroksidasi lipid dan akhirnya menginduksi kerusakan

membran sel, kerusakan struktur organel sel hati, degenerasi, nekrosis serta fibrosis

hati.41-43


50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadar MDA dalam jaringan hati hingga

mendekati kelompok normal. Penurunan kadar MDA pada pemberian ketiga dosis

ekstrak air buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok NAC. Hasil ini sejalan

dengan penelitian yang dilakukan oleh Morsy dkk6 yang menunjukkan bahwa

penurunan kadar MDA tersebut mendekati kelompok normal pada pemberian NAC.

Kemampuan ekstrak air buah mahkota dewa dalam menurunkan kadar MDA dapat

disebabkan oleh aktivitas antioksidannya, yaitu kemampuan untuk melindungi

hepatosit terhadap radikal triklorometil dan triklorometilperoksi yang dihasilkan

akibat proses metabolisme CCl4.

Sel dalam tubuh memiliki serangkaian sistem penangkal (antioksidan) yang

berperan dalam meneutralisir efek negatif ROS, yaitu superoksida dismutase (SOD),

glutation peroksidase, glutation (GSH). GSH merupakan intraselular tripeptida yang

disintesa dari l-glutamate, l-sistein dan l-glisin, yaitu melalui 2 tahap reaksi yang

dikatalisis oleh enzim γ-glutamilsistein ligase dan glutation peroksidase. GSH

merupakan antioksidan non enzimatik yang dibutuhkan untuk menangkal terjadinya

stres oksidatif. 33,54,65

Dalam sel, glutation berada dalam bentuk tereduksi (GSH) dan teroksidasi

(GSSG). Pada sel dan jaringan sehat, lebih dari 90% glutation total berada dalam

bentuk GSH dan kurang dari 10% berada dalam bentuk GSSG. Dalam proses

oksidasi, GSH akan diubah menjadi glutation disulfida (GSSG). Mengukur rasio

GSH/GSSG pada model hewan coba dan membandingkannya dengan kelompok

kontrol merupakan cara terbaik untuk mengetahui potensi terapi suatu obat uji dalam

mempertahankan potensial redoks selular. Potensial redoks selular merupakan hal

yang kritikal pada fisiologi sel normal dan rasio GSH/GSSG merupakan indikator

terbaik untuk mengetahui potensial redoks tersebut.33,54,65

56



menurunkan rasio GSH/GSSG dalam jaringan hati hingga 3 kali dibandingkan

kelompok normal. Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Cháved E

dkk5 dan Fu dkk58 yang menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati pada

tikus. Hal ini disebabkan karena pemberian CCl4 secara kronis menyebabkan

terjadinya peningkatan ROS, terutama radikal triklorometilperoksi. Gugus tiol pada

GSH akan dioksidasi oleh radikal triklorometilperoksi membentuk GSSG. Pada

paparan CCl4 kronis, peristiwa tersebut terjadi secara terus menerus sehingga

menyebabkan deplesi kadar GSH. Penurunan kadar GSH akan diikuti dengan

penurunan nilai rasio GSH/GSSG. Penurunan rasio GSH/GSSG tersebut

mengindikasikan terjadinya perubahan potensial redoks selular dan stres oksidatif,

yang pada akhirnya menyebabkan kerusakan struktur dan fungsi sel tubuh.54


50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat meningkatkan rasio GSH/GSSG dalam jaringan hati

sehingga dapat mendekati kelompok normal. Peningkatan rasio GSH/GSSG pada

pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok

NAC. Peningkatan rasio GSH/GSSG pada penelitian ini mengindikasikan bahwa

ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas antioksidan yaitu sebagai

penangkap ROS hasil metabolisme CCl4 yang dapat mengganggu sistem pertahanan

antioksidan.

TNF-α merupakan kunci utama yang berkontribusi dalam memicu kaskade

inflamasi yang melibatkan induksi sitokin setelah cedera hati. Ketika terjadi cedera

hati, sel Kupffer, makrofag dan neutrofil akan melepaskan TNF-α. Selain berperan

dalam menginduksi proliferasi hepatosit dan regenerasi hati, TNF-α juga berperan

sebagai mediator kematian hepatosit serta aktivasi HSC.33

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 meningkatkan

secara bermakna kadar TNF-α dalam jaringan hati hingga 1,5 kali dibandingkan

kelompok normal. Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Demiroren

dkk9 yang menunjukkan peningkatan kadar TNF-α hingga 2 kali pada tikus yang

menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati. Peningkatan kadar TNF-α

mengindikasikan terjadinya proses inflamasi akibat cedera hati kronis. Peran utama

TNF-α dalam fibrosis hati yaitu menginisiasi proses aktivasi HSC. Aktivasi HSC

menggambarkan tahap penting terjadinya fibrosis karena sel HSC merupakan sumber

utama ECM selama terjadinya cedera hati.9

57



50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadar TNF-α sehingga mendekati

kelompok normal. Penurunan kadar TNF-α pada pemberian ketiga dosis ekstrak air

buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok NAC. Hasil ini sejalan dengan

penelitian yang dilakukan oleh Demoriren dkk9 yang menunjukkan bahwa penurunan

kadar TNF-α tersebut mendekati kelompok normal pada pemberian NAC. Hasil

penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas

antiinflamasi. Adanya penurunan kadar TNF-α tersebut akan diikuti dengan

penurunan aktivasi HSC sehingga dapat menghambat terjadinya fibrosis hati. Hasil ini

sejalan dengan studi pendahuluan oleh Berlian dkk22 yang menunjukkan efek

hepatoprotektif ekstrak air buah mahkota dewa (Proliverenol) terjadi melalui down-

regulation NFkB-TNF-α-lipid peroksidasi.

Selain TNF-α, aktivasi HSC juga dikarenakan adanya TGF-β yang dilepaskan

oleh sel hepatosit yang rusak, sel Kuppfer yang teraktivasi, infiltrasi makrofag dan

neutrofil pada hati yang mengalami cedera. Peningkatan TGF-β dapat meningkatkan

produksi ROS oleh HSC, sementara peningkatan ROS tersebut akan mengaktivasi

HSC untuk memproduksi dan mensekresikan ROS serta TGF-β. Hal ini dikenal

sebagai stimulasi autokrin ROS dan TGF-β pada HSC. Peningkatan aktivasi HSC

tersebut berperan dalam proses akumulasi ECM akibat cedera hati.33

TGF-β superfamily terdiri dari berbagai multifungsional sitokin termasuk

TGF-β 1, 2, 3, activin dan bone morphogenic proteins (BMPs). TGF-β1 adalah

sitokin fibrogenik utama dan induser yang paling berperan dalam fibrosis, yaitu

pengaturan produksi, degradasi dan akumulasi ECM pada fibrosis hati.65

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 meningkatkan kadar

TGF-β1 dalam jaringan hati hingga 5 kali dibandingkan kelompok normal. Hasil ini

sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Cháved E dkk5 dan Galicia-Moreno

dkk67 yang menunjukkan peningkatan kadar TGF-β1 hingga 4 kali pada tikus yang

menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati. Peningkatan kadar TGF-β1

mengindikasikan terjadinya aktivasi HSC yang berperan dalam proses fibrogenesis

pada cedera hati kronis.


50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadar TGF-β1 dalam jaringan hati

walaupun belum dapat mendekati kelompok normal. Penurunan kadar TGF-β1 pada

pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok

58


NAC. Penurunan kadar TGF-β1 akan menyebabkan penurunan HSC yang teraktivasi

sehingga dapat menghambat terjadinya fibrosis hati. Berdasarkan hal tersebut

diketahui bahwa ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas sebagai pencegah

fibrosis hati.

Berdasarkan pemeriksaan terhadap parameter biokimia diketahui bahwa

peningkatan dosis ekstrak air buah mahkota dewa tidak diikuti dengan penurunan

aktivitas enzim, penurunan kadar MDA, peningkatan rasio GSH/GSSG serta

penurunan kadar TNF-α dan TGF-β1. Hal ini ditunjukkan dari hasil penelitian,

dimana perbaikan parameter biokimia pada kelompok ekstrak air buah mahkota dewa

dosis 50 mg/kgBB relatif lebih baik dibandingkan dosis 100 dan 150 mg/kgBB,

walaupun secara statistik tidak berbeda bermakna. Hal ini dapat dikarenakan dosis

100 dan 150 mg/kgBB berada pada daerah plateu sehingga adanya peningkatan dosis

tidak diikuti dengan peningkatan aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa.

Selain itu, senyawa fenolik yang terkandung dalam buah mahkota dewa juga

dapat berperan sebagai prooksidan pada kondisi tertentu seperti penggunaan dosis

tinggi atau adanya ion logam.68 Senyawa fenolik dapat berperan sebagai prooksidan

pada sistem yang mengandung ion logam. Dengan adanya oksigen, transisi ion metal

seperti Cu dan Fe akan mengkatalisis siklus redoks senyawa fenolik sehingga

menyebabkan terbentuknya radikal fenolik yang dapat merusak DNA, lipid membran

dan molekul biologi lainnya.69 Sebagai contoh, resveratrol, suatu senyawa fenolik,

diketahui bersifat prooksidan yang dapat menyebabkan kerusakan DNA. Mekanisme

yang mendasari hal tersebut yaitu adanya oksigen dan ion Cu2+ yang akan

mengoksidasi resveratrol sehingga membentuk radikal fenoksil yang dapat

menyebabkan kerusakan DNA.70 Radikal peroksil tersebut juga dapat menginduksi

peroksidasi lipid yang akhirnya menyebabkan kerusakan sel.71 Namun demikian,

untuk mengetahui aktivitas prooksidan ekstrak air buah mahkota dewa perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut. Secara keseluruhan hasil yang diperoleh pada

pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa tersebut memberikan hasil

yang sebanding dan dapat mendekati kelompok normal.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dapat

melindungi hepatosit dari cedera kronis akibat paparan CCl4. Hal ini terlihat melalui

penurunan aktivitas enzim penanda fungsi hati yaitu ALT, AST dan ALP. Hasil

positif terhadap parameter penanda fungsi hati tersebut dikonfirmasi lebih lanjut

dengan pemeriksaan histopatologi jaringan hati yang menunjukkan adanya penurunan

59


persentase jaringan ikat pada pemberian ekstrak air buah mahkota dewa. Hasil

tersebut mengindikasikan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa berperan dalam

mencegah fibrosis hati.

Mekanisme kerja yang mendasari hal tersebut yaitu aktivitas antioksidan dan

antiinflamasi ekstrak air buah mahkota dewa. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa

ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas antioksidan sehingga dapat

melindungi hepatosit terhadap kerusakan oksidatif yang diinduksi oleh CCl4, yaitu

ditandai dengan penurunan kadar MDA dan peningkatan rasio GSH/GSSG. Ekstrak

air buah mahkota dewa juga memiliki aktivitas antiinflamasi yang ditandai dengan

penurunan kadar TNF-α. Hal tersebut akan menghambat proses aktivasi HSC yang

berperan dalam proses fibrogenesis. Hambatan aktivasi HSC juga terlihat melalui

penurunan kadar TGF-β1. Secara keseluruhan, pemberian ekstrak air buah mahkota

dewa dapat memberikan perlindungan terhadap hepatosit serta menghambat proses

aktivasi HSC, sehingga tidak terjadi akumulasi ECM dan pada akhirnya mencegah

terjadinya fibrosis hati.

60

BAB 6

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dari penelitian ini, maka disimpulkan hal-hal sebagai berikut:

1. Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB selama 8

minggu dapat melindungi sel hati tikus jantan yang diinduksi CCl4 yang ditandai

dengan penurunan aktivitas AST, ALT dan ALP.


minggu berperan dalam mencegah fibrosis hati pada tikus jantan yang diinduksi CCl4

yang ditandai dengan penurunan persentase jaringan ikat.


minggu dapat melindungi sel hati tikus jantan terhadap kerusakan oksidatif akibat

induksi CCl4 yang ditandai dengan penurunan kadar MDA dan peningkatan rasio

GSH/GSSG.


minggu dapat melindungi sel hati tikus terhadap kejadian inflamasi akibat induksi

CCl4 yang ditandai dengan penurunan kadar TNF-α.


minggu dapat menghambat proses fibrogenesis akibat induksi CCl4 yang ditandai

dengan penurunan kadar TGF-ß.

6.2. Saran

Mengingat adanya keterbatasan dan kekurangan dari penelitian ini, maka beberapa hal yang

perlu disarankan untuk penelitian selanjutnya adalah:

1. Penelitian untuk mengetahui potensi ekstrak air buah mahkota dewa dalam

menghambat aktivasi HSC melalui pemeriksaan sitokin IL-6, Angiotensin II, dan

alpha-smooth muscle actin (α-SMA).

2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas prooksidan ekstrak air buah

mahkota dewa menggunakan metode CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant

Capacity)

3. Salah satu senyawa yang terkandung dalam ekstrak air buah mahkota dewa adalah

mangiferin, oleh karenanya perlu dilakukan penelitian dengan menggunakan

pembanding mangiferin.

61

DAFTAR PUSTAKA

1. Ramachandran P, Iredale JP. Reversibility of liver fibrosis. Ann Hepatol.2009;8:283-91.

2. Wallace K, Burt AD, Wright C. Liver fibrosis. Biochem J. 2008; 411: 1-183. Rockey DC, Friedman SL. Hepatic fibrosis and cirrhosis. In: Boyer TD, Wright

TL, Manns MP, editors. Zakim and Boyer's Hepatology. 5th ed. Philadelphia:Saunders Elsevier;2006.p.87-109.

4. Wang L, Cheng D, Wang H, Di L, Zhou X, Xu T. The hepatoprotective andantifibrotic effects of Saururus chinensis against carbon tertrachloride inducedhepatic fibrosis in rats. J of Ethnopharmacol. 2009;126:487-91.

5. Cháved E, Reyes-Gordillo K, Segovia J, Shibayama M, Tsutsumi V, Vergara P,Moreno MG, Muriel P. Resveratrol prevents fibrosis, NF-κB activation andTGF-β increases induced by chronic CCl4 treatment in rats. J Appl Toxicol.2008;28:35-43.

6. Morsy MA, Abdalla AM, Mahmoud AM, Abdelwahab SA, Mahmoud ME .Protective effects of curcumin, α-lipoic acid, and N-acetylcysteine againstcarbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats. J PhysiolBiochem. 2012;68:29-35.

7. Panjaitan RGP, Handharyani E, Chairul, Masriani, Zakiah Z, Manalu W.Pengaruh pemberian karbon tertraklorida terhadap fungsi hati dan ginjal tikus.Makara Kesehatan. 2007;11:11-6.

8. Maksimchik YZ, Lapshina EA, Sudnikovich EY, Zabrodskaya SV, ZavodnikIB. Protective effects of N-acetyl-L-cysteine against acute carbontetrachloride hepatotoxicity in rats. Cell Biochem Funct. 2008;26:11-8.

9. Demiroren K, Dogan Y, Kocamaz H, Ozercan IH, Ilhan S, Ustundag B, et al.Protective effects of L-carnitine, N-acetylcysteine and genistein in anexperimental model of liver fibrosis. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2014;38:63-72.

10. Khoshbaten M, Aliasgarzadeh A, Masnadi K, Tarzamani MK, Farhang S,Babaei H, et al. N-acetylcysteine improves liver function in patients with non-alcoholic fatty liver disease. Hepat Mon. 2010;10:12-6.

11. Harmanto N. Mahkota Dewa, Obat Pusaka Para Dewa. Jakarta: AgromediaPustaka; 2003. hal.19.

12. Widowati L. Kajian hasil penelitian mahkota dewa. Jurnal Bahan AlamIndonesia. 2005;4:223-7.

13. Simanjuntak P. Identifikasi senyawa kimia dalam buah mahkota dewa (Phaleriamacrocarpa). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2008;6:23-8.

14. Kim WJ, Veriansyah B, Lee YW, Kim J, Kim JD. Extraction of mangiferinfrom mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) using subcritical water. J Ind EngChem. 2010;16:425-30.

15. Hendra R, Ahmad S, Oskoueian, Sukari A, Shukor MY. Antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxicity of Phaleria macrocarpa (Boerl.) Scheff fruit.BMC Complement Altern Med. 2011;11:2-10.

16. Dewoto HR, Mariyana Y, Arif A. Uji efek hipoglikemik ekstrak daging buahmahkota dewa [Phaleria marcocarpa (Scheff) Boerl.] pada kelinci,dibandingkan glibenklamid. Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2006;6:20-3.

62


17. Yanti AR, Widayanti, Ringoringo VS. Uji efek antihipertensi ekstrak etanoldaging buah mahkota dewa [Phaleria marcocarpa (Scheff) Boerl.] pada tikusputih jantan. Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2010;7:63-7.

18. Sulistianto DE, Harini M, Handajani NS. The effect of Phaleria macrocarpa(Scheff) Boerl fruits extract on the histological structure of white rat (Rattusnorvegicus L.) liver after orally carbon tetrachloride (CCl4) exposure. Biosmart.2004;6:91-8.

19. Gotama IBI, Sugiarto S, Nurhadi M, Widiyastuti Y, Wahyono S, Prapti IJ.Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jilid V. Jakarta: Departemen KesehatanBadan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan;1999.hal.147-8.

20. Simanjuntak P. Identifikasi senyawa kimia dalam buah mahkota dewa (Phaleriamacrocarpa). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2008;6:23-28.

21. Stoilova I, Jirovetz L, Stoyanova A, Krastanov A, Gargova S, Ho L.Antioxidant activity of the polyphenol mangiferin. J Environ Agr Food Chem.2008;7:2706-16.

22. Berlian G, Tandrasasmita M, Tjandrawinata R. Bioactive fractionDLBSProliverenol possess hepatoprotective activity via antiinflammation, DNArepair and antiapoptosis activities. Unpublished report. DLBS. 2013:1-10.

23. Nailufar F, Kristiana H, Hardadi P, Sinambela J, Tjandrawinata R.Hepatoprotective effect: Cell toxicity, pharmacodynamic and antioxidant ofbioactive fraction DLBS1433.Unpublished report. DLBS. 2013:1-10.

24. Ramadori G, Moriconi F, Malik I, Dudas J. Physiology and pathophysiologyof liver inflammation, damage and repair. J Physiol Pharmacol. 2008;59:107-17.

25. Fan GG, Steer CJ. Cellular Biology of the Normal Liver. In: Bacon BR,O’Grady JG Bisceglie, Adrian MDi, Lake JR, ed. Comprehensive ClinicalHepatology. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier Limited; 2006.p.17-41.

26. Portmann BC. Development and Anatomy of the Normal Liver. In: Bacon BR,O’Grady JG Bisceglie , Adrian MDi, Lake JR, editors. Comprehensive ClinicalHepatology. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier Limited; 2006.p.1-15.

27. Crawford JM, Liu C. Liver and Biliary Tract. In: Robbins SL, Kumar V, CotranRS, editors. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 8th ed.Philadelphia: Saunders Elsevier; 2010.p.833-90.

28. Luxon BA. Functions of the Liver. In: Bacon BR, O’Grady JG Bisceglie,Adrian MDi, Lake JR, editors. Comprehensive Clinical Hepatology. 2nd ed.Philadelphia: Elsevier Limited; 2006.p.43-59.

29. Ghany M, Hoofnagle JH. Approach to the patient with liver disease. In: LongoDL, Fauci AS, editors. Harrison’s Gastroenterology and Hepatology. 17th ed.New York: McGraw-Hill; 2010.p.322-31.

30. Rockey DC. Advances in translational science: Translating an understanding ofthe pathogenesis of hepatic fibrosis to novel therapies. Clin GastroenterolHepatol. 2013;11:224-31.

31. Ahmad A, Ahmad R. Understanding the mechanism of hepatic fibrosis andpotential therapeutic approaches. Saudi J Gastroenterol. 2012;18:155-67.

32. Bataller R, Brenner DA. Liver fibrosis. J Clin Invest. 2005;115:209–18.33. Shimizu I, Shimamoto N, Saiki K, Furujo M, Osawa K. Lipid peroxidation in

hepatic fibrosis. In: Catala A, editor. Lipid peroxidation. Rijeka. Intech; 2012.p.483-92.

34. De-Minicis S, Marzioni M, Saccomanno S, Rychlicki C, Agostinelli L, TrozziL, et al. Cellular and molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis leading toliver cancer. Transl Gastrointest Cancer. 2012;1:88-94.

63


35. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Current status of novel antifibrotic therapies inpatients with chronic liver disease. Therap Adv Gastroenterol. 2011;4:391-417.

36. Lotersztajn S, Julien B, Teixeira-Clerc F, Grenard P, Mallat A. Hepatic fibrosis:molecular mechanisms and drug targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol.2005;45:605–28.

37. Mormone E, George J, Nieto N. Molecular pathogenesis of hepatic fibrosis andcurrent therapeutic approaches. Chem Biol Interact. 2011;193:225–31.

38. Constandinou C, Henderson N, Iredale JP. Modeling liver fibrosis in rodents.Methods in Molecular Medicine. 2005;117:237-50.

39. Jang JH, Kang KJ, Kim YH, Kang YN, Lee IS. Reevaluation of experimentalmodel of hepatic fibrosis induced by hepatotoxic drugs: an easy, applicable, andreproducible model. Transplant Proc. 2008;40:2700-3.

40. Liedtke C, Luedde T, Sauerbruch T, Scholten D, Streetz K, Tacke F, et al.Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues andtranslational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 2013;6:19.

41. Hayashi H, Sakai T. Animal models for the study of liver fibrosis: new insightsfrom knockout mouse models. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011;300:G729-38.

42. Farber JL, Gerson RJ. Mechanisms of cell injury with hepatotoxic chemicals.Pharmacol Rev. 1984;36:71S-75S.

43. Li L, Hu Z, Li W, Hu M, Ran J, Chan P, et al. Establishment of a standardizedliver fibrosis model with different pathological stages in rats. Gastroenterol ResPract. 2012;2012:1-6.

44. Galicia-Moreno M, Rodríguez-Rivera A, Reyes-Gordillo K, Segovia J,Shibayama M, Tsutsumi V, Vergara P, et al. N-acetylcysteine prevents carbontetrachloride-induced liver cirrhosis: role of liver transforming growth factor-beta and oxidative stress. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009;21:908-14.

45. Kamalakkannan N, Rukkumani R, Aruna K, Varma PS, Viswanathan P, MenonVP. Protective effect of N-acetyl cysteine in carbon tetrachloride-inducedhepatotoxicity in rats. Iranian J Pharmacol Ther. 2005;4:118-23.

46. Pereira-Filho G, Ferreira C, Schwengber A, Marroni C, Zettler C, Marroni N.Role of N-acetylcysteine on fibrosis and oxidative stress in cirrhotic rats. ArqGastroenterol. 2008;45:156-62.

47. de Oliveira CP, Stefano JT, de Siqueira ER, Silva LS, de Campos Mazo DF,Lima VM, et al. Combination of N-acetylcysteine and metformin improveshistological steatosis and fibrosis in patients with non-alcoholic steatohepatitis.Hepatol Res. 2008;38:159-65.

48. Liu X, Hu H, Yin JQ. Therapeutic strategies against TGF-beta signalingpathway in hepatic fibrosis. Liver Int. 2006;26:8-22.

49. Faried A, Kurnia D, Faried L, Usman N, Miyazaki T, Kato H et.al. Anticancereffects of gallic acid isolated from Indonesian herbal medicine, Phaleriamacrocarpa (Scheff.) Boerl, on human cancer cell lines. Int J Oncol.2007;30:605.

50. Sukandar EY, Sigit JI, Adnyana IK. Uji Toksisitas Akut Sediaan DLBS 1433PT. Dexa Medica. Final report (unpublished). DLBS. 2012.

51. Sukandar EY, Sigit JI, Adnyana IK. Uji Toksisitas Subkronis Sediaan DLBS1433 PT. Dexa Medica. Final report (unpublished). DLBS. 2012.

64


52. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. AnalBiochem. 1976;72:248-54.

53. Gridley MF. Manual of Histologic and Special Staining Technics. 2nd ed. NewYork: McGraw-Hill;1960.p.63-4.

54. Owen JB, Butterfield DA. Measurement of oxidized/reduced glutathione ratio.Methods Mol Biol. 2010;648:269-77.

55. Rahman I1, Kode A, Biswas SK. Assay for quantitative determination ofglutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method(Abstract). Nat Protoc. 2006;1:3159-65

56. Brouckaert P, Libert C, Everaerdt B, Takahashi N, Cauwels A, Fiers W. Tumornecrosis factor, its receptors and the connection with interleukin 1 andinterleukin 6 (Abstract). Immunobiology. 1993;187:317-29.

57. Fu Y, Zheng S, Lin J, Ryerse J, Chen A. Curcumin protects the rat liver fromCCl4-caused injury and fibrogenesis by attenuating oxidative stress andsuppressing inflammation. Mol Pharmacol. 2008;73:399-409.

58. Reagen-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to humanstudies revisited. FASEB J. 2007;22:659-61.

59. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Current status of novel antifibrotic therapies inpatients with chronic liver disease. Therap Adv Gastroenterol. 2011;4:391-417.

60. Liu T, Wang X, Karsdal MA, Leeming DJ, Genovese F. Molecular serummarkers of liver fibrosis. Biomark Insights. 2012;7:105-17.

61. Boone L, Meyer D, Cusick P, Ennulat D, Bolliger AP, Everds N, et al.Selection and interpretation of clinical pathology indicators of hepatic injury inpreclinicalstudies. Vet Clin Pathol. 2005;34:182-8.

62. Ennulat D, Walker D, Clemo F, Magid-Slav M, Ledieu D, Graham M.Effects of hepatic drug-metabolizing enzyme induction on clinical pathologyparameters in animals and man. Toxicol Pathol. 2010;38:810-28.

63. Johnson-Delaney CA. Small rodents. In: Exotic Companion MedicineHandbook for Veterinarians. Florida: Zoological Education Network;2008.p.2-47.

64. Smith JB, Mangkoewidjojo S. Pemeliharaaan, Pembiakan dan PenggunaanHewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta: UI Press;1988.hal.39.

65. El-Beshbishy HA, Tork OM, El-Bab MF, Autifi MA. Antioxidant andantiapoptotic effect of green tea polyphenols against azathioprine-induced liverinjury in rats. Pathophysiology. 2011;18:125-35.

66. Cong M, Iwaisako K, Jiang C, Kisseleva T. Cell signals influencing hepaticfibros. Int J Hepatol. 2012;2012:1-18.

67. Galicia-Moreno M, Rodríguez-Rivera A, Reyes-Gordillo K, Segovia J,Shibayama M, Tsutsumi V, et al. N-acetylcysteine prevents carbon tetrachlorideinduced liver cirrhosis: role of liver transforming growth factor beta andoxidative stress. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009;21:908-14.

68. Yordi EG, Pérez EM, Matos MJ, Villares EU. Antioxidant and Pro-OxidantEffects of Polyphenolic Compounds and Structure-Activity RelationshipEvidence. In: Catala A, editor. Lipid Peroxidation. Rijeka: Intech; 2012.p.23-48.

69. Kyselova Z. Toxicological aspects of the use of phenolic compound in diseaseprevention. Interdiscip Toxicol. 2011;4:173-83.

65


70. de la Lastra CA, Villegas I. Resveratrol as an antioxidant and pro-oxidant agent: mechanisms and clinical implications. Biochem Soc Trans. 2007;35:1156-60.

71. Sakihama Y, Cohen MF, Grace SC, Yamasaki H. Plant phenolic antioxidant andprooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metalsin plants (abstract). Toxicology. 2002;177:67-80.

66


Lampiran 1

Keterangan Lolos Kaji Etik

67


Lampiran 2

Sertifikat Analisis

Ekstrak Air Buah Mahkota Dewa (DLBS Proliverenol)

68


Lampiran 3

Perhitungan Parameter Penilaian

1. Perhitungan kadar protein homogenat hati

Kadar protein dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap

kurva standar protein BSA. Persamaan linier kurva standar BSA yaitu:y = a + bxdi mana:

y = nilai absorbans standar BSA

x = kadar standar BSA (μg/mL)

a = intercept kurva standar BSA

b = slope kurva standar BSA

Perhitungan kadar protein dalam sampel yaitu:

di mana:

x = kadar protein sampel berdasarkan kurva standar (μg/mL)

df = faktor pengenceran sampel

Contoh perhitungan:

y = 0.0008x + 0.0153r = 0.9978

0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900

0 200 400 600 800 1000 1200

Abs

orba

nsi

Konsentrasi standar protein (μg/mL)

Kurva standar protein

( / ) = x. df1000

69


Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( − 0.0153)/0.0008Berdasarkan penelitian diketahui:

Absorbsi (A) blanko = 0.431

A sampel = 0.561

df = 1000x

maka:

y = A sampel – A blanko = 0.561 – 0.431 = 0.130

Nilai x = (0.130 - 0.0153) / 0.0008 =143.38 g/mLKadar protein dalam sampel = 143.38 x 10001000 = 143.38 mg/mL2. Perhitungan kadar MDA hati

Kadar MDA dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap

kurva standar MDA (1,1,3,3-TEMP). Persamaan linier kurva standar MDA yaitu:y = a + bxdi mana:

y = nilai absorbans standar MDA

x = kadar standar MDA (nmol/mL)

a = intercept kurva standar MDA

b = slope kurva standar MDA

Perhitungan kadar MDA dalam sampel yaitu:

di mana:

x = kadar MDA berdasarkan kurva standar (nmol/mL)


Cp = kadar protein sampel (mg/mL)

( / ) = x. dfCp

70


Contoh perhitungan:


Absorbsi (A) blanko = 0.0043

A sampel = 0.0179

df = 55x

Kadar protein sampel = 143.38 mg/mL

maka:


Nilai x = (0.0136 - 0.0057) / 0.1046 = 0.0755 nmol/mLKadar MDA sampel = 0.0755 x 55143.38 = 0.030 nmol/mg protein3. Perhitungan kadar total glutation, GSH dan rasio GSH/GSSG hati

3.1. Perhitungan kadar total glutation

Kadar total glutation dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel

terhadap kurva standar GSSG. Persamaan linier kurva standar GSSG yaitu:y = a + bxdi mana:

y = selisih nilai absorbansi standar GSSG/menit pengukuran

A/min =

y = 0.1046x + 0.0057r = 0.9998

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Abs

orba

nsi

Konsentrasi Standar MDA (nmol/mL)

Kurva Standar MDA

71


x = kadar standar GSSG (μM)

a = intercept kurva standar GSSG

b = slope kurva standar GSSG

Perhitungan kadar GSSG dalam sampel yaitu:

di mana:

x = kadar GSSG berdasarkan kurva standar (μM)


v = volume sampel (mL)


Contoh perhitungan:


A blanko = 0.022

A sampel = 0.272

y (A/min sampel) = 0.272-0.022 / 10 = 0.025

df = 1000x

v = 0.1 mL


y = 0.0303x + 0.0004r = 0.9935

00.0020.0040.0060.008

0.010.0120.0140.0160.018

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000

Abs

orba

nsi

Konsentrasi standar GSSG (μM)

Kurva Standar GSSG

( / ) = x. dfv. Cp

72


maka:

Nilai x = (0.025- 0.0004) / 0.0303 = 0.81188 μMKadar total glutation dalam sampel = 0.81188 x 10000.1 x 116.50 = 69.69 nmol/mg protein3.2. Perhitungan kadar GSH hati

Kadar GSH dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap kurva

standar GSH. Persamaan linier kurva standar GSH yaitu:

di mana:

y = nilai absorbans standar GSH

x = kadar standar GSH (μM)

a = intercept kurva standar GSH

b = slope kurva standar GSH

Perhitungan kadar GSH dalam sampel yaitu:

di mana:

x = kadar GSH berdasarkan kurva standar (μM)


v = volume sampel (mL)


Contoh perhitungan:

y = 4.0398x - 0.0125r = 0.9995

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Abs

orba

nsi

Konsentrasi standar GSH (μM)

Kurva Standar GSH

y = a + bx

( / ) = x. dfv. Cp

73


Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( + 0.0125)/4.0398Berdasarkan penelitian diketahui:

A blanko = 0.104

A sampel = 0.328

y = 0.328 - 0.104 = 0.224

df = 5000x

v = 0.1 mL


maka:

Nilai x = (0.224 + 0.0125) / 4.0398 = 0.0585 μMKadar GSH sampel = 0.0585 x 50000.1 x 116.50 = 25.11 nmol/mg protein3.3. Perhitungan rasio GSH/GSSG

Kadar GSSG (nmol/mg protein) = [kadar total glutation – kadar GSH] / 2

Contoh perhitungan:

Berdasarkan penelitian diketahui:

Kadar total glutation sampel = 69.69 nmol/mg protein

Kadar GSH sampel = 25.11 nmol/mg protein

Kadar GSSG = [69.69 – 25.11] / 2 = 22.29= 25.1122.29 = 1.13

/ = Kadar GSHKadar GSSG

74


4. Perhitungan kadar TNF-α hati

Kadar TNF-α dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap

kurva standar TNF-α. Persamaan linier kurva standar TNF-α yaitu:

di mana:

y = nilai absorbans standar TNF-α

x = kadar standar TNF-α (pg/mL)

a = intercept kurva standar TNF-α

b = slope kurva standar TNF-α

Perhitungan kadar TNF-α dalam sampel yaitu:

di mana:

x = kadar TNF-α berdasarkan kurva standar (pg/mL)



Contoh perhitungan:

Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( − 0.0685)/0.0007

y = 0.0007x + 0.0685r = 0.9942

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

0 500 1000 1500 2000 2500

Abs

orba

nsi

Konsentrasi standar TNF-α (pg/mL)

Kurva standar TNF-α

y = a + bx

TNF − α ( / ) = x. dfCp

75


Berdasarkan penelitian diketahui:

A blanko = 0.08

A sampel = 0.690

df = 250x


maka:


Nilai x = (0.61 - 0.0685) / 0.0007 = 773.57 pg/mLKadar TNF − α sampel = 773.57 x 250134.63 = 1436.47 pg/mg protein5. Perhitungan kadar TGF-β1 hati

Kadar TGF-β1dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap

kurva standar TGF-β1. Persamaan linier kurva standar TGF-β1 yaitu:

di mana:

y = nilai absorbans standar TGF-β1

x = kadar standar TGF-β1 (pg/mL)

a = intercept kurva standar TGF-β1

b = slope kurva standar TGF-β1

Perhitungan kadar TGF-β1 dalam sampel yaitu:

di mana:

x = kadar TGF-β1 berdasarkan kurva standar (pg/mL)



y = a + bx

TGF − β1 ( / ) = x. dfCp

76


Contoh perhitungan:


A blanko = 0.13

A sampel = 0.476

df = 750x


maka:


Nilai x = (0.346 - 0.0173) / 0.0013 = 252.85 pg/mLKadar TGF − β1 sampel = 252.85 x 75093.10 = 2036.92 pg/mg protein

y = 0.0013x + 0.0173r= 0.9975

0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700

0 100 200 300 400 500 600

Abs

orba

nsi

Konsentrasi standar TGF-β1 (pg/mL)

Kurva standar TGF-β1

77


Lampiran 4

Berat Badan Tikus

1. Perubahan berat badan tikus setiap minggu

Kelompok TikusMinggu ke-

1 2 3 4 5 6 7 8

N 1 299.33 309.00 306.33 309.00 315.67 326.33 332.00 330.00

2 311.33 320.00 323.00 330.00 345.33 358.00 372.00 381.33

3 258.67 266.33 272.33 281.00 279.33 293.67 297.67 305.67

4 272.67 297.00 317.00 331.67 343.67 360.33 374.33 387.67

5 279.33 301.67 319.67 336.33 288.33 362.00 367.33 366.33

Rerata 284.27 298.80 307.67 317.60 314.47 340.07 348.67 354.20

SD 21.06 20.12 20.71 23.00 30.51 29.81 33.28 35.16

CCl4 1 261.33 297.67 296.00 293.67 294.33 292.00 290.33 276.33

2 234.00 281.00 292.00 297.00 295.33 299.33 305.00 312.33

3 198.00 237.67 243.33 242.33 241.00 246.00 236.33 250.67

4 209.67 247.67 258.00 256.67 239.67 241.00 247.67 232.00

5 298.67 293.33 269.67 270.33 296.33 320.67 321.67 306.33

Rerata 240.33 271.47 271.80 272.00 273.33 279.80 280.20 275.53

SD 40.67 27.22 22.36 23.52 30.14 34.82 36.81 34.70

CCl4+NAC 1 321.67 322.67 338.67 348.33 347.00 356.33 361.33 373.33

2 276.67 264.33 262.00 263.67 268.00 274.33 273.67 271.67

3 232.33 282.67 289.33 306.67 297.67 292.67 285.00 283.20

4 201.33 223.00 211.67 216.33 220.33 228.67 223.00 211.20

5 273.00 271.00 281.00 293.00 302.00 320.00 327.00 330.00

Rerata 261.00 272.73 276.53 285.60 287.00 294.40 294.00 293.88

SD 45.97 35.84 46.00 49.28 46.76 48.00 52.82 61.36

78


Kelompok TikusMinggu ke-

1 2 3 4 5 6 7 8

CCl4+T50 1 280.00 273.00 276.67 287.00 289.67 292.00 295.00 299.33

2 264.00 262.00 269.00 272.33 267.33 255.33 270.00 258.00

3 254.67 308.67 309.00 309.67 312.00 311.33 321.00 330.80

4 225.33 267.33 269.33 281.00 275.00 270.00 259.33 256.67

5 248.00 247.00 272.00 291.00 310.00 319.00 328.00 328.00

Rerata 254.40 271.60 279.20 288.20 290.80 289.53 294.67 294.56

SD 20.21 22.87 16.94 13.91 20.12 26.93 30.26 36.15

CCl4+T100 1 296.00 295.33 303.00 315.67 328.50 332.33 335.00 334.67

2 250.67 295.00 322.67 346.33 361.00 367.00 368.67 394.00

3 227.67 266.33 265.00 270.00 273.33 281.33 276.00 264.00

4 256.33 257.33 272.33 284.33 248.67 319.00 327.00 323.00

5 242.00 236.00 245.00 259.00 248.00 251.00 274.00 289.00

Rerata 254.53 270.00 281.60 295.07 291.90 310.13 316.13 320.93

SD 25.58 25.48 31.01 35.70 50.63 45.09 40.68 49.48

CCl4+T150 1 274.00 252.00 258.00 261.00 267.67 269.67 266.00 247.67

2 275.33 271.00 267.33 269.00 286.00 297.67 297.67 328.67

3 230.00 277.67 275.00 263.00 262.33 274.33 278.67 261.60

4 199.00 234.67 239.33 243.00 246.67 230.67 228.00 238.67

5 274.00 275.00 291.00 308.00 326.00 346.00 354.00 362.00

Rerata 250.47 262.07 266.13 268.80 277.73 283.67 284.87 287.72

SD 34.62 18.32 19.25 23.96 30.42 42.35 46.29 54.51

79


Lampiran 5

Data Kadar Protein Homogenat Hati

1. Kadar protein untuk pemeriksaan MDA

No. Kelompok

N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 199.51 154.41 201.58 116.11 126.50 154.41

2 124.16 155.10 171.33 125.28 212.06 122.83

3 129.66 164.04 219.04 150.94 206.66 146.16

4 146.85 188.10 183.98 155.22 157.06 248.60

5 166.10 92.26 216.98 182.11 206.56 123.48

Mean 153.26 150.78 198.58 145.93 181.77 159.10

SD 30.614 35.443 20.748 26.155 38.134 51.923

2. Kadar protein untuk pemeriksaan rasio GSH/GSSG

No. Kelompok

N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 147.15 114.63 151.50 116.50 118.38 112.132 122.75 137.13 120.88 134.00 122.13 101.503 178.11 116.50 138.38 95.88 113.38 167.754 158.46 110.88 148.38 87.75 116.50 112.135 146.14 95.25 109.00 128.38 227.13 135.88

Mean 150.52 114.88 133.63 112.50 139.50 125.88SD 20.162 14.991 18.225 20.120 49.086 26.579

3. Kadar protein untuk pemeriksaan TNF-αNo. Kelompok


Mean 140.66 97.27 134.25 120.56 160.98 116.83SD 10.366 16.830 24.704 18.184 57.720 26.483

80


4. Kadar protein untuk pemeriksaan TGF-β1

No. Kelompok


Mean 98.79 62.16 71.55 74.19 75.20 52.61

SD 12.443 14.474 7.486 12.586 17.947 6.249

81


Lampiran 6

Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALT

1. Data aktivitas ALT

No. Kelompok


2 30.73 119.16 37.96 33.43 56.07 61.79

3 47.66 123.47 42.59 46.53 58.34 66.86

4 30.73 135.87 35.05 42.06 31.22 70.09

5 27.50 136.41 49.06 52.25 40.22 45.72

Mean 36.68 123.87 42.10 44.99 46.98 56.44

SD 9.722 13.241 5.692 7.577 11.293 14.036

2. Perhitungan statistik data aktivitas ALT

2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA

Tests of Normality

Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

ALT Normal .330 5 .080 .790 5 .067

CCl4 .218 5 .200* .912 5 .477

CCl4+NAC .167 5 .200* .971 5 .882

CCl4+T50 .181 5 .200* .927 5 .574

CCl4+T100 .190 5 .200* .936 5 .638

CCl4+T150 .248 5 .200* .898 5 .399

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Test of Homogeneity of VariancesALT

Levene Statistic df1 df2 Sig.

1.610 5 24 .196

ANOVAALT

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 26688.139 5 5337.628 46.813 .000

Within Groups 2736.492 24 114.021

Total 29424.631 29

82


2.2. Uji Tukey

Multiple ComparisonsALT

Tukey HSD

(I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

Normal CCl4 -87.18600* 6.75338 .000 -108.0670 -66.3050

CCl4+NAC -5.41400 6.75338 .964 -26.2950 15.4670

CCl4+T50 -8.30600 6.75338 .818 -29.1870 12.5750

CCl4+T100 -10.29800 6.75338 .652 -31.1790 10.5830

CCl4+T150 -19.75600 6.75338 .071 -40.6370 1.1250

CCl4 Normal 87.18600* 6.75338 .000 66.3050 108.0670

CCl4+NAC 81.77200* 6.75338 .000 60.8910 102.6530

CCl4+T50 78.88000* 6.75338 .000 57.9990 99.7610

CCl4+T100 76.88800* 6.75338 .000 56.0070 97.7690

CCl4+T150 67.43000* 6.75338 .000 46.5490 88.3110

CCl4+NAC Normal 5.41400 6.75338 .964 -15.4670 26.2950

CCl4 -81.77200* 6.75338 .000 -102.6530 -60.8910

CCl4+T50 -2.89200 6.75338 .998 -23.7730 17.9890

CCl4+T100 -4.88400 6.75338 .977 -25.7650 15.9970

CCl4+T150 -14.34200 6.75338 .309 -35.2230 6.5390

CCl4+T50 Normal 8.30600 6.75338 .818 -12.5750 29.1870

CCl4 -78.88000* 6.75338 .000 -99.7610 -57.9990

CCl4+NAC 2.89200 6.75338 .998 -17.9890 23.7730

CCl4+T100 -1.99200 6.75338 1.000 -22.8730 18.8890

CCl4+T150 -11.45000 6.75338 .548 -32.3310 9.4310

CCl4+T100 Normal 10.29800 6.75338 .652 -10.5830 31.1790

CCl4 -76.88800* 6.75338 .000 -97.7690 -56.0070

CCl4+NAC 4.88400 6.75338 .977 -15.9970 25.7650

CCl4+T50 1.99200 6.75338 1.000 -18.8890 22.8730

CCl4+T150 -9.45800 6.75338 .726 -30.3390 11.4230

CCl4+T150 Normal 19.75600 6.75338 .071 -1.1250 40.6370

CCl4 -67.43000* 6.75338 .000 -88.3110 -46.5490

CCl4+NAC 14.34200 6.75338 .309 -6.5390 35.2230

CCl4+T50 11.45000 6.75338 .548 -9.4310 32.3310

CCl4+T100 9.45800 6.75338 .726 -11.4230 30.3390

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

83


Lampiran 7

Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas AST

1. Data aktivitas AST

No. Kelompok


2 59.31 174.47 42.06 48.53 76.78 67.23

3 55.00 186.93 63.08 54.94 50.68 70.85

4 43.67 180.08 77.10 40.33 62.49 83.57

5 55.37 141.05 50.14 63.89 67.45 49.55

Mean 54.28 173.54 55.21 55.77 65.09 69.12

SD 6.202 18.799 14.774 12.193 9.556 12.513

2. Perhitungan statistik data aktivitas AST


Tests of Normality



AST Normal .346 5 .050 .806 5 .090

CCl4 .320 5 .105 .774 5 .049

CCl4+NAC .234 5 .200* .896 5 .391

CCl4+T50 .147 5 .200* .985 5 .961

CCl4+T100 .198 5 .200* .956 5 .779

CCl4+T150 .240 5 .200* .946 5 .710



Test of Homogeneity of VariancesAST


.933 5 24 .477

ANOVAAST


Between Groups 54721.980 5 10944.396 65.235 .000

Within Groups 4026.439 24 167.768

Total 58748.419 29

84


2.2. Uji Tukey

Multiple ComparisonsAST

Tukey HSD

(I) Kelompok (J)

KelompokMean Difference




d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

Normal CCl4 -119.25200* 8.19191 .000 -144.5808 -93.9232

CCl4+NAC -.92600 8.19191 1.000 -26.2548 24.4028

CCl4+T50 -1.48800 8.19191 1.000 -26.8168 23.8408

CCl4+T100 -10.80400 8.19191 .772 -36.1328 14.5248

CCl4+T150 -14.83800 8.19191 .478 -40.1668 10.4908

CCl4 Normal 119.25200* 8.19191 .000 93.9232 144.5808

CCl4+NAC 118.32600* 8.19191 .000 92.9972 143.6548

CCl4+T50 117.76400* 8.19191 .000 92.4352 143.0928

CCl4+T100 108.44800* 8.19191 .000 83.1192 133.7768

CCl4+T150 104.41400* 8.19191 .000 79.0852 129.7428

CCl4+NAC Normal .92600 8.19191 1.000 -24.4028 26.2548

CCl4 -118.32600* 8.19191 .000 -143.6548 -92.9972

CCl4+T50 -.56200 8.19191 1.000 -25.8908 24.7668

CCl4+T100 -9.87800 8.19191 .830 -35.2068 15.4508

CCl4+T150 -13.91200 8.19191 .546 -39.2408 11.4168

CCl4+T50 Normal 1.48800 8.19191 1.000 -23.8408 26.8168

CCl4 -117.76400* 8.19191 .000 -143.0928 -92.4352

CCl4+NAC .56200 8.19191 1.000 -24.7668 25.8908

CCl4+T100 -9.31600 8.19191 .861 -34.6448 16.0128

CCl4+T150 -13.35000 8.19191 .588 -38.6788 11.9788

CCl4+T100 Normal 10.80400 8.19191 .772 -14.5248 36.1328

CCl4 -108.44800* 8.19191 .000 -133.7768 -83.1192

CCl4+NAC 9.87800 8.19191 .830 -15.4508 35.2068

CCl4+T50 9.31600 8.19191 .861 -16.0128 34.6448

CCl4+T150 -4.03400 8.19191 .996 -29.3628 21.2948

CCl4+T150 Normal 14.83800 8.19191 .478 -10.4908 40.1668

CCl4 -104.41400* 8.19191 .000 -129.7428 -79.0852

CCl4+NAC 13.91200 8.19191 .546 -11.4168 39.2408

CCl4+T50 13.35000 8.19191 .588 -11.9788 38.6788

CCl4+T100 4.03400 8.19191 .996 -21.2948 29.3628


85


Lampiran 8Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALP

1. Data aktivitas ALP

No. Kelompok


Mean 180.12 1050.00 461.15 626.30 712.13 782.71SD 13.158 66.782 56.417 59.719 61.904 66.248

2. Perhitungan statistik data aktivitas ALP


Tests of Normality



ALP Normal .272 5 .200* .942 5 .680

CCl4 .219 5 .200* .895 5 .385

CCl4+NAC .245 5 .200* .897 5 .394

CCl4+T50 .343 5 .054 .760 5 .037

CCl4+T100 .242 5 .200* .946 5 .709

CCl4+T150 .250 5 .200* .926 5 .566



Test of Homogeneity of VariancesALP


1.623 5 24 .192

ANOVAALP


Between Groups 2186013.402 5 437202.680 133.815 .000

Within Groups 78413.423 24 3267.226

Total 2264426.825 29

86


2.2. Uji Tukey

Multiple ComparisonsALP

Tukey HSD

(I) Kelompok (J)





d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

Normal CCl4 -869.87600* 36.15094 .000 -981.6522 -758.0998

CCl4+NAC -281.02800* 36.15094 .000 -392.8042 -169.2518

CCl4+T50 -446.17200* 36.15094 .000 -557.9482 -334.3958

CCl4+T100 -532.00800* 36.15094 .000 -643.7842 -420.2318

CCl4+T150 -602.58600* 36.15094 .000 -714.3622 -490.8098

CCl4 Normal 869.87600* 36.15094 .000 758.0998 981.6522

CCl4+NAC 588.84800* 36.15094 .000 477.0718 700.6242

CCl4+T50 423.70400* 36.15094 .000 311.9278 535.4802

CCl4+T100 337.86800* 36.15094 .000 226.0918 449.6442

CCl4+T150 267.29000* 36.15094 .000 155.5138 379.0662

CCl4+NAC Normal 281.02800* 36.15094 .000 169.2518 392.8042

CCl4 -588.84800* 36.15094 .000 -700.6242 -477.0718

CCl4+T50 -165.14400* 36.15094 .002 -276.9202 -53.3678

CCl4+T100 -250.98000* 36.15094 .000 -362.7562 -139.2038

CCl4+T150 -321.55800* 36.15094 .000 -433.3342 -209.7818

CCl4+T50 Normal 446.17200* 36.15094 .000 334.3958 557.9482

CCl4 -423.70400* 36.15094 .000 -535.4802 -311.9278

CCl4+NAC 165.14400* 36.15094 .002 53.3678 276.9202

CCl4+T100 -85.83600 36.15094 .205 -197.6122 25.9402

CCl4+T150 -156.41400* 36.15094 .003 -268.1902 -44.6378

CCl4+T100 Normal 532.00800* 36.15094 .000 420.2318 643.7842

CCl4 -337.86800* 36.15094 .000 -449.6442 -226.0918

CCl4+NAC 250.98000* 36.15094 .000 139.2038 362.7562

CCl4+T50 85.83600 36.15094 .205 -25.9402 197.6122

CCl4+T150 -70.57800 36.15094 .397 -182.3542 41.1982

CCl4+T150 Normal 602.58600* 36.15094 .000 490.8098 714.3622

CCl4 -267.29000* 36.15094 .000 -379.0662 -155.5138

CCl4+NAC 321.55800* 36.15094 .000 209.7818 433.3342

CCl4+T50 156.41400* 36.15094 .003 44.6378 268.1902

CCl4+T100 70.57800 36.15094 .397 -41.1982 182.3542


87


Lampiran 9

Data dan Hasil Analisis Statistik Persentase Jaringan Ikat

1. Persentase jaringan ikat

No. Kelompok


Mean 2.03 12.83 6.67 8.28 8.55 9.46SD 1.236 1.332 1.626 2.517 1.139 2.021

2. Perhitungan statistik persentase jaringan ikat


Tests of Normality



Fibrosis N .195 5 .200* .887 5 .343

CCl4 .323 5 .097 .820 5 .117

CCl4+NAC .192 5 .200* .929 5 .592

CCl4+T50 .190 5 .200* .949 5 .729

CCl4+T100 .280 5 .200* .895 5 .382

CCl4+T150 .189 5 .200* .948 5 .725



Test of Homogeneity of VariancesFibrosis


.845 5 24 .532

ANOVAFibrosis


Between Groups 315.720 5 63.144 21.471 .000

Within Groups 70.581 24 2.941

Total 386.301 29

88


2.2. Uji Tukey

Multiple ComparisonsFibrosis

Tukey HSD

(I) Kelompok (J)





d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

N CCl4 -10.79200* 1.08460 .000 -14.1455 -7.4385

CCl4+NAC -4.63600* 1.08460 .003 -7.9895 -1.2825

CCl4+T50 -6.24400* 1.08460 .000 -9.5975 -2.8905

CCl4+T100 -6.51400* 1.08460 .000 -9.8675 -3.1605

CCl4+T150 -7.42200* 1.08460 .000 -10.7755 -4.0685

CCl4 N 10.79200* 1.08460 .000 7.4385 14.1455

CCl4+NAC 6.15600* 1.08460 .000 2.8025 9.5095

CCl4+T50 4.54800* 1.08460 .004 1.1945 7.9015

CCl4+T100 4.27800* 1.08460 .007 .9245 7.6315

CCl4+T150 3.37000* 1.08460 .048 .0165 6.7235

CCl4+NAC N 4.63600* 1.08460 .003 1.2825 7.9895

CCl4 -6.15600* 1.08460 .000 -9.5095 -2.8025

CCl4+T50 -1.60800 1.08460 .678 -4.9615 1.7455

CCl4+T100 -1.87800 1.08460 .526 -5.2315 1.4755

CCl4+T150 -2.78600 1.08460 .144 -6.1395 .5675

CCl4+T50 N 6.24400* 1.08460 .000 2.8905 9.5975

CCl4 -4.54800* 1.08460 .004 -7.9015 -1.1945

CCl4+NAC 1.60800 1.08460 .678 -1.7455 4.9615

CCl4+T100 -.27000 1.08460 1.000 -3.6235 3.0835

CCl4+T150 -1.17800 1.08460 .882 -4.5315 2.1755

CCl4+T100 N 6.51400* 1.08460 .000 3.1605 9.8675

CCl4 -4.27800* 1.08460 .007 -7.6315 -.9245

CCl4+NAC 1.87800 1.08460 .526 -1.4755 5.2315

CCl4+T50 .27000 1.08460 1.000 -3.0835 3.6235

CCl4+T150 -.90800 1.08460 .957 -4.2615 2.4455

CCl4+T150 N 7.42200* 1.08460 .000 4.0685 10.7755

CCl4 -3.37000* 1.08460 .048 -6.7235 -.0165

CCl4+NAC 2.78600 1.08460 .144 -.5675 6.1395

CCl4+T50 1.17800 1.08460 .882 -2.1755 4.5315

CCl4+T100 .90800 1.08460 .957 -2.4455 4.2615


89


Lampiran 10Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar MDA Hati

1. Data kadar MDA homogenat hati

No. Kelompok


Mean 0.039 0.119 0.049 0.050 0.051 0.054SD 0.0097 0.0254 0.0073 0.0074 0.0126 0.0145

2. Perhitungan statistik data kadar MDA homogenat hati


3.

Tests of Normality



log_MDA Normal .313 5 .122 .852 5 .202

CCl4 .203 5 .200* .942 5 .681

CCl4+NAC .251 5 .200* .954 5 .763

CCl4+T50 .180 5 .200* .952 5 .754

CCl4+T100 .284 5 .200* .830 5 .140

CCl4+T150 .187 5 .200* .971 5 .881



Test of Homogeneity of Varianceslog_MDA


.810 5 24 .554

ANOVAlog_MDA


Between Groups .704 5 .141 15.164 .000

Within Groups .223 24 .009

Total .927 29

90


3.1. Uji Tukey

Multiple Comparisonslog_MDA

Tukey HSD





d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

Normal CCl4 -.49000* .06095 .000 -.6785 -.3015

CCl4+NAC -.11000 .06095 .482 -.2985 .0785

CCl4+T50 -.12000 .06095 .388 -.3085 .0685

CCl4+T100 -.11400 .06095 .443 -.3025 .0745

CCl4+T150 -.14600 .06095 .198 -.3345 .0425

CCl4 Normal .49000* .06095 .000 .3015 .6785

CCl4+NAC .38000* .06095 .000 .1915 .5685

CCl4+T50 .37000* .06095 .000 .1815 .5585

CCl4+T100 .37600* .06095 .000 .1875 .5645

CCl4+T150 .34400* .06095 .000 .1555 .5325

CCl4+NAC Normal .11000 .06095 .482 -.0785 .2985

CCl4 -.38000* .06095 .000 -.5685 -.1915

CCl4+T50 -.01000 .06095 1.000 -.1985 .1785

CCl4+T100 -.00400 .06095 1.000 -.1925 .1845

CCl4+T150 -.03600 .06095 .991 -.2245 .1525

CCl4+T50 Normal .12000 .06095 .388 -.0685 .3085

CCl4 -.37000* .06095 .000 -.5585 -.1815

CCl4+NAC .01000 .06095 1.000 -.1785 .1985

CCl4+T100 .00600 .06095 1.000 -.1825 .1945

CCl4+T150 -.02600 .06095 .998 -.2145 .1625

CCl4+T100 Normal .11400 .06095 .443 -.0745 .3025

CCl4 -.37600* .06095 .000 -.5645 -.1875

CCl4+NAC .00400 .06095 1.000 -.1845 .1925

CCl4+T50 -.00600 .06095 1.000 -.1945 .1825

CCl4+T150 -.03200 .06095 .995 -.2205 .1565

CCl4+T150 Normal .14600 .06095 .198 -.0425 .3345

CCl4 -.34400* .06095 .000 -.5325 -.1555

CCl4+NAC .03600 .06095 .991 -.1525 .2245

CCl4+T50 .02600 .06095 .998 -.1625 .2145

CCl4+T100 .03200 .06095 .995 -.1565 .2205


91


Lampiran 11Data dan Hasil Analisis Statistik Rasio GSH/GSSH Hati

1. Data kadar total glutation homogenat hati

No. Kelompok


Mean 49.60 71.51 51.24 59.10 57.94 55.56SD 4.215 11.939 7.918 10.255 14.923 16.327

2. Data kadar GSH homogenat hati

No. Kelompok


Mean 22.57 13.93 24.22 23.85 23.54 22.28SD 1.859 1.638 3.053 2.497 5.601 4.952

3. Data Rasio GSH/GSSG

No. Kelompok


Mean 1.72 0.49 1.83 1.42 1.42 1.41

SD 0.370 0.064 0.303 0.383 0.322 0.298

92


4. Perhitungan statistik rasio GSH/GSSG


Tests of Normality



Rasio_ln N .242 5 .200* .876 5 .291

CCl4 .152 5 .200* .995 5 .994

CCl4+NAC .265 5 .200* .933 5 .620

CCl4+T50 .321 5 .102 .788 5 .065

CCl4+T100 .284 5 .200* .891 5 .364

CCl4+T150 .234 5 .200* .924 5 .559



Test of Homogeneity of VariancesRasio_ln


1.260 5 24 .313

ANOVARasio_ln


Between Groups 5.728 5 1.146 25.512 .000

Within Groups 1.078 24 .045

Total 6.806 29

93


4.1.1. Uji Tukey

Multiple ComparisonsRasio_ln

Tukey HSD





d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

N CCl4 1.24000* .13402 .000 .8256 1.6544

CCl4+NAC -.07400 .13402 .993 -.4884 .3404

CCl4+T50 .19800 .13402 .681 -.2164 .6124

CCl4+T100 .19200 .13402 .708 -.2224 .6064

CCl4+T150 .19800 .13402 .681 -.2164 .6124

CCl4 N -1.24000* .13402 .000 -1.6544 -.8256

CCl4+NAC -1.31400* .13402 .000 -1.7284 -.8996

CCl4+T50 -1.04200* .13402 .000 -1.4564 -.6276

CCl4+T100 -1.04800* .13402 .000 -1.4624 -.6336

CCl4+T150 -1.04200* .13402 .000 -1.4564 -.6276

CCl4+NAC N .07400 .13402 .993 -.3404 .4884

CCl4 1.31400* .13402 .000 .8996 1.7284

CCl4+T50 .27200 .13402 .356 -.1424 .6864

CCl4+T100 .26600 .13402 .379 -.1484 .6804

CCl4+T150 .27200 .13402 .356 -.1424 .6864

CCl4+T50 N -.19800 .13402 .681 -.6124 .2164

CCl4 1.04200* .13402 .000 .6276 1.4564

CCl4+NAC -.27200 .13402 .356 -.6864 .1424

CCl4+T100 -.00600 .13402 1.000 -.4204 .4084

CCl4+T150 .00000 .13402 1.000 -.4144 .4144

CCl4+T100 N -.19200 .13402 .708 -.6064 .2224

CCl4 1.04800* .13402 .000 .6336 1.4624

CCl4+NAC -.26600 .13402 .379 -.6804 .1484

CCl4+T50 .00600 .13402 1.000 -.4084 .4204

CCl4+T150 .00600 .13402 1.000 -.4084 .4204

CCl4+T150 N -.19800 .13402 .681 -.6124 .2164

CCl4 1.04200* .13402 .000 .6276 1.4564

CCl4+NAC -.27200 .13402 .356 -.6864 .1424

CCl4+T50 .00000 .13402 1.000 -.4144 .4144

CCl4+T100 -.00600 .13402 1.000 -.4204 .4084


94


Lampiran 12Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TNF-α Hati

1. Data kadar TNF-α homogenat hatiNo. Kelompok


Mean 1412.96 2324.35 1418.71 1440.95 1441.81 1475.56SD 224.345 376.090 135.235 281.052 379.674 187.178

2. Perhitungan statistik data TNF-α homogenat hati2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA

Tests of Normality



TNF Normal .276 5 .200* .928 5 .586

CCl4 .256 5 .200* .943 5 .684

CCl4+NAC .207 5 .200* .944 5 .695

CCl4+T50 .173 5 .200* .987 5 .967

CCl4+T100 .248 5 .200* .847 5 .185

CCl4+T150 .282 5 .200* .810 5 .098



Test of Homogeneity of VariancesTNF


.827 5 24 .543

ANOVATNF


Between Groups 3285551.152 5 657110.230 8.420 .000

Within Groups 1872961.647 24 78040.069

Total 5158512.799 29

95


2.2. Uji Tukey

Multiple ComparisonsTNF

Tukey HSD





d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

Normal CCl4 -911.38400* 176.68058 .000 -1457.6682 -365.0998

CCl4+NAC -5.75200 176.68058 1.000 -552.0362 540.5322

CCl4+T50 -27.98600 176.68058 1.000 -574.2702 518.2982

CCl4+T100 -28.84200 176.68058 1.000 -575.1262 517.4422

CCl4+T150 -62.60000 176.68058 .999 -608.8842 483.6842

CCl4 Normal 911.38400* 176.68058 .000 365.0998 1457.6682

CCl4+NAC 905.63200* 176.68058 .000 359.3478 1451.9162

CCl4+T50 883.39800* 176.68058 .001 337.1138 1429.6822

CCl4+T100 882.54200* 176.68058 .001 336.2578 1428.8262

CCl4+T150 848.78400* 176.68058 .001 302.4998 1395.0682

CCl4+NAC Normal 5.75200 176.68058 1.000 -540.5322 552.0362

CCl4 -905.63200* 176.68058 .000 -1451.9162 -359.3478

CCl4+T50 -22.23400 176.68058 1.000 -568.5182 524.0502

CCl4+T100 -23.09000 176.68058 1.000 -569.3742 523.1942

CCl4+T150 -56.84800 176.68058 .999 -603.1322 489.4362

CCl4+T50 Normal 27.98600 176.68058 1.000 -518.2982 574.2702

CCl4 -883.39800* 176.68058 .001 -1429.6822 -337.1138

CCl4+NAC 22.23400 176.68058 1.000 -524.0502 568.5182

CCl4+T100 -.85600 176.68058 1.000 -547.1402 545.4282

CCl4+T150 -34.61400 176.68058 1.000 -580.8982 511.6702

CCl4+T100 Normal 28.84200 176.68058 1.000 -517.4422 575.1262

CCl4 -882.54200* 176.68058 .001 -1428.8262 -336.2578

CCl4+NAC 23.09000 176.68058 1.000 -523.1942 569.3742

CCl4+T50 .85600 176.68058 1.000 -545.4282 547.1402

CCl4+T150 -33.75800 176.68058 1.000 -580.0422 512.5262

CCl4+T150 Normal 62.60000 176.68058 .999 -483.6842 608.8842

CCl4 -848.78400* 176.68058 .001 -1395.0682 -302.4998

CCl4+NAC 56.84800 176.68058 .999 -489.4362 603.1322

CCl4+T50 34.61400 176.68058 1.000 -511.6702 580.8982

CCl4+T100 33.75800 176.68058 1.000 -512.5262 580.0422


96


Lampiran 13

Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TGF-β1 Hati

1. Data kadar TGF-β1 homogenat hatiNo. Kelompok


Mean 492.45 2515.68 1696.69 1749.25 1795.35 1821.75SD 227.813 471.885 189.939 365.714 232.980 297.028

2. Perhitungan statistik data TGF-β1 homogenat hati


Tests of Normality



TGF Normal .330 5 .079 .845 5 .180

CCl4 .209 5 .200* .930 5 .599

CCl4+NAC .258 5 .200* .886 5 .337

CCl4+T50 .236 5 .200* .929 5 .587

CCl4+T100 .230 5 .200* .898 5 .398

CCl4+T150 .281 5 .200* .911 5 .474



Test of Homogeneity of VariancesTGF


1.941 5 24 .125

ANOVATGF


Between Groups 1.074E7 5 2147086.234 21.950 .000

Within Groups 2347606.336 24 97816.931

Total 1.308E7 29

97


2.2. Uji Tukey

Multiple ComparisonsTGF

Tukey HSD

(I) Kelompok (J)





d

i

m

e

n

s

i

o

n

2

Normal CCl4 -2023.22600* 197.80488 .000 -2634.8251 -1411.6269

CCl4+NAC -1204.23400* 197.80488 .000 -1815.8331 -592.6349

CCl4+T50 -1256.79800* 197.80488 .000 -1868.3971 -645.1989

CCl4+T100 -1302.89200* 197.80488 .000 -1914.4911 -691.2929

CCl4+T150 -1329.29800* 197.80488 .000 -1940.8971 -717.6989

CCl4 Normal 2023.22600* 197.80488 .000 1411.6269 2634.8251

CCl4+NAC 818.99200* 197.80488 .004 207.3929 1430.5911

CCl4+T50 766.42800* 197.80488 .008 154.8289 1378.0271

CCl4+T100 720.33400* 197.80488 .015 108.7349 1331.9331

CCl4+T150 693.92800* 197.80488 .020 82.3289 1305.5271

CCl4+NAC Normal 1204.23400* 197.80488 .000 592.6349 1815.8331

CCl4 -818.99200* 197.80488 .004 -1430.5911 -207.3929

CCl4+T50 -52.56400 197.80488 1.000 -664.1631 559.0351

CCl4+T100 -98.65800 197.80488 .996 -710.2571 512.9411

CCl4+T150 -125.06400 197.80488 .987 -736.6631 486.5351

CCl4+T50 Normal 1256.79800* 197.80488 .000 645.1989 1868.3971

CCl4 -766.42800* 197.80488 .008 -1378.0271 -154.8289

CCl4+NAC 52.56400 197.80488 1.000 -559.0351 664.1631

CCl4+T100 -46.09400 197.80488 1.000 -657.6931 565.5051

CCl4+T150 -72.50000 197.80488 .999 -684.0991 539.0991

CCl4+T100 Normal 1302.89200* 197.80488 .000 691.2929 1914.4911

CCl4 -720.33400* 197.80488 .015 -1331.9331 -108.7349

CCl4+NAC 98.65800 197.80488 .996 -512.9411 710.2571

CCl4+T50 46.09400 197.80488 1.000 -565.5051 657.6931

CCl4+T150 -26.40600 197.80488 1.000 -638.0051 585.1931

CCl4+T150 Normal 1329.29800* 197.80488 .000 717.6989 1940.8971

CCl4 -693.92800* 197.80488 .020 -1305.5271 -82.3289

CCl4+NAC 125.06400 197.80488 .987 -486.5351 736.6631

CCl4+T50 72.50000 197.80488 .999 -539.0991 684.0991

CCl4+T100 26.40600 197.80488 1.000 -585.1931 638.0051


98

Kajian aktivitas antioksidan, modulasi sitokin TNF- dan TGF-β1 oleh mahkotadewa (Phaleria macrocarpa) pada pencegahan fibrosis hati pada tikus yangdiinduksi karbon tetraklorida

Nanik Sundari,1 Vivian Soetikno,2 Melva Louisa,2 Raymond R. Tjandrawinata3

1 Magister Program Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia2 Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia3PT. Dexa Medica

AbstrakLatar belakang: Mahkota dewa (Phaleria marcocarpa) merupakan salah satutanaman herbal di Indonesia dan ekstrak air buah mahkota dewa telah terbuktimemiliki efek hepatoprotektif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitasdan mekanisme kerja ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah terjadinyafibrosis hati.Metode: Penelitian dilakukan pada tikus Sprague-Dawley jantan yang diinduksikarbon tetraklorida (CCl4) secara intraperitoneal setiap 3 hari sekali selama 8 minggu.Hewan coba dibagi menjadi 6 kelompok: normal, CCl4, n-Acetyl cysteine (NAC)dosis 150 mg/kgBB, ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB.Penilaian dilakukan terhadap parameter aspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), alkali fosfatase (ALP), histopatologi hati, kadarmalondialdehid (MDA), rasio GSH/GSSG, kadar Tumor Necrosis Factor (TNF)-αdan kadar Transforming Growth Factor (TGF)-β1Hasil: Hasil studi menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa and NACsecara bermakna dapat melindungi hati dari cedera melalui penurunan aktivitas enzimALT, AST, ALP dan penurunan persentase jaringan ikat pada pemeriksaanhistopatologi. Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menghambat stressoksidatif melalui penurunan kadar MDA hati dan peningkatan rasio GSH/GSSG hati.Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menekan inflamasi melaluipenurunan kadar TNF-α dan menghambat aktivasi sel stelata hati (HSC) yangditandai dengan penurunan kadar TGF-β1.Kesimpulan: Ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah fibrosis hati pada tikusyang diinduksi CCl4. Pencegahan terhadap fibrosis tersebut terutama melalui aktivitasantioksidan dan kemampuan menekan sitokin inflamasi TNF-α, serta menghambataktivasi HSC melalui penurunan sitokin fibrogenik TGF-β1.

Abstract:Introduction: Mahkota dewa (Phaleria marcocarpa) is one of the Indonesia herbalplant and hepatoprotective effect of aqueous extract of mahkota dewa fruits have beenstudied. This study was conducted to evaluate the protective effect of water extract ofmahkota dewa in liver fibrosis and its mechanism of action.Method: Male Sprague-Dawley rats were induced by carbon tertrachloride (CCl4) for8 weeks. Rats were randomly allocated into 6 group: control group, n-acetylcysteine/NAC (150 mg/kgBB), aqueous extract of mahkota dewa (50, 100 and 150mg/kgBB). Aspartate aminotransaminate (AST), alanine aminotransferase (ALT),alkaline phosphatase (ALP), liver histopathology, malondialdehide (MDA), ratioGSH/GSSG, Tumor Necrosis Factor (TNF)-α and Transforming Growth Factor(TGF)-β1 were studied.Results: This study demonstrates that aqueous extract of mahkota dewa and NACsignificantly protects the liver from injury by reducing the activity of AST, ALT,

99


ALP and by reducing fibrosis percentage in histopatological examination. Aqueousextract of mahkota dewa and NAC attenuates oxidative stress by reducing the levelsof MDA and increasing GSH/GSSG ratio. Aqueous extract of mahkota dewa andNAC suppresses inflammation by reducing the levels of TNF- α and inhibits hepaticstellate cells (HSC) activation by reducing the levels of TGF-β1.Conclusions: Aqueous extract of mahkota dewa prevents CCl4-induced fibrosis inrats. The prevention of liver fibrosis most possibly through their antioxidant activitiesand by suppressing inflammatory cytokines TNF-α and inhibits HSC activation byreducing fibrogenic cytokines TGF-β1.

Key words: CCl4, fibrosis, mahkota dewa, acetyl cysteine, TNF-α, TGF-β1.

LATAR BELAKANG

Fibrosis hati dapat timbul pada berbagaipenyakit hati kronis yang dapat disebabkan olehinfeksi virus hepatitis, penyalahgunaan alkohol,penyakit perlemakan hati non alkoholik,penyakit autoimun atau hipoksia.1,2,3 Fibrosishati ditandai dengan akumulasi berlebih proteinmatriks ekstraseluler termasuk kolagen ataujaringan parut yang terjadi setelah berbagaipenyakit hati yang kronis.1,2,4

Aktivasi sel stelata hati merupakan halutama pada fibrosis hati. Pada hati normal, seltersebut terletak di space of disse dan berfungsisebagai tempat utama penyimpanan vitamin Adalam tubuh. Bila hati mengalami cedera kronis,sel stelata hati teraktivasi dan berdiferensiasimenjadi sel seperti miofibroblas. Proses aktivasisel stelata hati adalah proses yang kompleks dandiperantarai oleh sitokin inflamasi danfibrogenik, diantaranya Tumor Necrosis Factor(TNF)-α dan Transforming Growth Factor(TGF)-β.2,5 Fibroris hati dapat berkembang lebihlanjut menjadi sirosis yang ireversibel, gagalhati, hipertensi portal dan berkaitan dengantimbulnya kanker hati. Sekitar 10-20% pasienmengalami progresivitas menjadi sirosis dankanker hati.4

Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa)merupakan tanaman asli Indonesia yang berasaldari Papua dan digunakan sebagai tanaman obat.Kandungan kimia dari tanaman mahkota dewaseperti alkaloid, flavonoid, saponin, tanin dansebagainya diketahui memberikan efekantiinflamasi, antioksidan, antikanker,antihipoglikemik, antihipertensi, danhepatoprotektif.6-9

Secara umum, proses isolasi senyawakimia yang terkandung dalam tanaman termasukmahkota dewa dilakukan menggunakan pelarutorganik yang bersifat toksik dan dapatmembahayakan kesehatan manusia sepertimetanol, etanol dan n-heksan. Saat ini telahdikembangkan proses ekstraksi menggunakansubcritical water pada suhu dan tekanan

tertentu. Kim dkk10 telah berhasil melakukanproses ekstraksi buah makhota dewamenggunakan pelarut air pada suhu 100°C dantekanan 30 bar selama 5 jam. Ekstrak air buahmahkota dewa (DLBSProliverenol) tersebutdiketahui mengandung mangiferin sebesar 21.7mg/g, yang setara dengan ekstrak metanol (25.0mg/g) dan lebih besar dari ekstrak etanol (13.2mg/g).

Ekstrak air buah mahkota dewa tersebuttelah diuji secara in vitro maupun in vivo. Hasilstudi pendahuluan secara in vitro menunjukkanbahwa efek hepatoprotektif ekstrak air buahmahkota dewa terjadi melalui down-regulationNFkB-TNF-α-lipid peroksidasi dengan hasilakhir meningkatnya waktu hidup sel.11 Studi lainsecara in vivo pada tikus yang diinduksi etanolselama 4 minggu menunjukkan bahwa ekstrakair buah mahkota dewa dengan dosis 37,5; 50dan 75 mg/kgbb dapat menurunkan levelaspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), total bilirubin dan γ-globulin transferase (GGT).12

Berdasarkan hasil pendahuluan tersebut diatas, ekstrak air buah mahkota dewa diketahuimempunyai aktivitas hepatoprotektif. Namun,untuk mengetahui apakah ekstrak air buahmahkota dewa dapat digunakan untuk mencegahfibrosis hati serta mekanisme kerja yangmendasari hal tersebut diperlukan studi lebihlanjut. Hal ini didasarkan pada upaya untukmencegah terjadinya fibrosis hati sedinimungkin.

METODE PENELITIAN

Hewan CobaPenelitian ini menggunakan tikus jantan

galur Sprague-Dawley dengan berat badan 200-350 gram yang berasal dari Pusat PengujianObat dan Makanan Nasional (PPOMN), BadanPOM. Penelitian ini dilaksanakan setelahmendapatkan persetujuan dari Komite EtikPenelitian Kesehatan Fakultas KedokteranUniversitas Indonesia

100


Bahan dan AlatEkstrak air buah mahkota dewa

(DLBSProliverenol) dari PT. Dexa Medica, N-acetyl cysteine (Fluimucil oral solution 200mg/Zambon SpA, Italia), Karbon tetraklorida(Merck), Kit Coomassie PlusTM (Bradford) assay(Thermo Scientific, USA Cat No. 23236), Kitenzimatik ALT, AST, ALP (Dyasis, Jerman).Asam tiobarbiturat, MDA standar (Aldrich10838-3), Asam trikloroasetat (MerckK40385207) OxyselectTM Total Glutathione(GSSG/GSH) (Cell biolabs Cat. No. STA-312),GSH standar (Sigma-Aldrich 66529), ELISA kitTNF-α (Sigma-Aldrich Cat. No RAB0480),ELISA kit TGF-β (Novateinbio Cat. No FM-E100129).

Prosedur PenelitianTikus terbagi dalam 6 kelompok dengan

rincian sebagai berikut:I. Kelompok normal: tidak diberi perlakuanII. Kelompok CCl4 (CMC Na 0.5% dan CCl4):

diberikan CMC Na 0.5% per oral dandiinjeksi intraperitoneal (ip) CCl4.

III. Kelompok CCl4+NAC (NAC dan CCl4):diberikan NAC per oral (dosis 150mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4

IV. Kelompok CCl4+T50 (ekstrak air buahmahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrakair buah mahkota dewa per oral dosis 50mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4

V. Kelompok CCl4+T100 (ekstrak air buahmahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrakair buah mahkota dewa per oral dosis 100mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4.

VI. Kelompok CCl4+T150 (ekstrak air buahmahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrakair buah mahkota dewa per oral dosis 150mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4

Pada kelompok II sampai VI, injeksi ipCCl4 dilakukan setiap 3 hari sekali yaitu dosis0.2 mL/100 gBB pada 2 minggu pertama dandilanjutkan 0.1 mL/100 gBB sampai 8 minggu).CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun denganperbandingan 1:1. Pada akhir studi, seluruhhewan coba diterminasi kemudian diambil darahdan jaringan hati.

Analisis BiokimiaPlasma dipisahkan dan dilakukan

pemeriksaan penanda fungsi hati ALT, AST danALP. Seluruh jaringan hati segera dikeluarkandan diambil untuk pemeriksaan biologimolekular yaitu malondialdehid (MDA), rasioGSH/GSSG, sitokin inflamasi dan fibrogenik(TNF-α dan TGF-ß).

Pemeriksaan HistopatologiSetelah terminasi, sebagian lobus hati

difiksasi dalam dapar formalin 10%, ditanam

dalam parafin, kemudian dilakukan pewarnaanmasson’s trichrome. Penilaian dilakukan secarakuantitatif menggunakan imageJ yaitu denganmenghitung persentase jaringan ikat (warnabiru) yang terbentuk pada daerah periportal.Perhitungan dilakukan pada 5 lapang pandanguntuk setiap hewan coba dan dilakukan secaratersamar.

Analisa statistikData disajikan sebagai rata-rata ± SD.

Analisis statistik dilakukan menggunakan SPSS16. Perbandingan antara enam kelompokdianalisis menggunakan ANOVA satu arahdengan batas kemaknaan p< 0.05, bila hasilbermakna maka akan dilanjutkan dengan analisisPost hoc (least significant difference).Homogenisitas varians dan normalitas distribusidata dinilai terlebih dahulu menggunakan ujiLevene dan uji Kolmogorov Smirnov.

HASIL

Aktivitas ALT, AST dan ALPPemberian injeksi intraperitoneal CCl4

meningkatkan aktivitas ALT, AST dan ALPsecara bermakna dibandingkan kelompok N(ALT 123.87 ± 13.241 vs 36.68 ± 9.722, p<0.05;AST 173.54 ± 18.799 vs 54.28 ± 6.202, p<0.05;dan ALP 1050.00 ± 66.782 vs 180.12 ± 13.158,p <0.05). Pemberian NAC maupun ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50 mg/kgbb (T50),100 mg/kgbb (T100) dan 150 mg/kgbb (T150)menurunkan aktivitas ALT, AST dan ALPsecara bermakna dibandingkan kelompok CCl4

(p<0.05) dan mendekati kelompok N (Gambar1-3).

Kadar MDA jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4

selama 8 minggu meningkatkan kadarperoksidasi lipid di jaringan hati. Hal iniditunjukkan oleh kadar MDA yang meningkatsecara bermakna dibandingkan kelompok N(0,119 ± 0,0254 vs 0,039 ± 0,0097, p<0.05).Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkotadewa (T50, T100 dan T150) menurunkan kadarMDA secara bermakna dibandingkan kelompokCCl4 (p<0.05) dan mendekati kelompokN(p>0.05) (Gambar 4).

Rasio GSH/GSSG jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4

secara bermakna menurunkan rasio GSH/GSSGdibandingkan kelompok N. Rasio GSH/GSSGpada kedua kelompok tersebut secara berurutanadalah 0.49 ± 0.064 dan 1.72 ± 0.370 (p<0.05).Pemberian NAC maupun ekstrak air buahmahkota dewa (T50, T100 dan T150)meningkatkan rasio GSH/GSSG secara

101


bermakna dibandingkan kelompok CCl4

(p<0.05) dan hasilnya mendekati kelompok N(p>0.05) (Gambar 5).

Kadar TNF-α jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4

selama 8 minggu meningkatkan kadar TNF-α dijaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadarTNF-α yang meningkat secara bermaknadibandingkan kelompok N (2324.35 ± 376.090vs 1412.96 ± 224.345, p<0.05). Pemberian NACdan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100dan T150) menurunkan kadar TNF-α secarabermakna dibandingkan kelompok CCl4

(p<0.05) dan mendekati kelompok N (p>0.05)(Gambar 6).

Kadar TGF-β1 jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4

selama 8 minggu meningkatkan kadar TGF-β1di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadarTGF-β1 yang meningkat secara bermakna

dibandingkan kelompok N (2515.68 ± 471.885vs 492.45 ± 227.813, p<0.05). Pemberian NACdan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100dan T150) menurunkan kadar TGF-β1 secarabermakna dibandingkan kelompok CCl4

(p<0.05) (Gambar 7).

Pemeriksaan histopatologiHasil pewarnaan masson’s trichrome

menunjukkan bahwa pemberian injeksiintraperitoneal CCl4 selama 8 minggumenyebabkan terbentuknya jaringan ikat di hati.Hal ini ditunjukkan oleh persentase jaringan ikatyang meningkat secara bermakna dibandingkankelompok N (12.83 ± 1.332 vs 2.03 ± 1.236,p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buahmahkota dewa (T50, T100 dan T150)menurunkan persentase jaringan ikat secarabermakna dibandingkan kelompok CCl4

(p<0.05), namun belum dapat mendekatikelompok N (Gambar 8 dan 9).


5 0

1 0 0

1 5 0 a

b

bb

b

Ak

tivi

tas

AL

T (

U/L

)

Rerata 36.68 123.87 42.10 44.99 46.98 56.44SD 9.722 13.241 5.692 7.577 11.293 14.036


5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

a

b

bb

b

Ak

tivi

tas

AS

T (

U/L

)

Rerata 54.28 173.54 55.21 55.77 65.09 69.12SD 6.202 18.799 14.774 12.193 9.556 12.513


5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

b

b

b

b

a

Akt

ivita

s A

LP (U

/L)

Rerata 180.12 1050.00 461.15 626.30 712.13 782.71SD 13.158 66.782 56.417 59.719 61.904 66.248

Gambar 1-3. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadap aktivitas enzimALT, AST dan ALP plasma setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ± SD (n=5).N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgbb/hari, T50, T100,T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgbb/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVA yang dilanjutkandengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

1

3

2

102


N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0 0

0 .0 5

0 .1 0

0 .1 5 a

bbbb

Ka

da

r M

DA

(n

mo

l/m

g p

rote

in)

Rerata 0.039 0.119 0.049 0.050 0.051 0.054SD 0.001 0.025 0.007 0.007 0.012 0.014

N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

a

bbb

b

Ras

io G

SH

/GS

SG

Rerata 1.72 0.49 1.83 1.42 1.42 1.41SD 0.370 0.064 0.303 0.383 0.322 0.298

Gambar 4-5. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadap kadar MDA danrasio GSH/GSSG hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N:Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgbb/hari, T50, T100, T150:ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgbb/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVA yang dilanjutkandengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.


1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0a

bbb

b

Kadar

TNF (

pg/m

g prot

ein)

Rerata 1412.96 2324.35 1418.71 1440.95 1441.81 1475.56SD 224.345 376.090 135.235 281.052 379.674 187.178


1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

a

b b bb

Kadar

TGF (

pg/m

g prot

ein)

Rerata 492.45 2515.68 1696.69 1749.25 1795.35 1821.75SD 227.813 471.885 189.939 365.714 232.980 297.028

Gambar 6-7. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadapkadar TNF-α dan TGF-β hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalamrata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis150 mg/kgbb/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan150 mg/kgbb/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVA yangdilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.

4 5

6

7

103



5

1 0

1 5 a

bb

b

b

Perse

ntase

jaring

an ika

t (%)

Rerata 2.03 12.83 6.67 8.28 8.55 9.46SD 1.236 1.332 1.626 2.517 1.139 2.021

Gambar 8. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap persentase jaringan ikat hati setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC:N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buahmahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.

Gambar 9. Gambaran histopatologi fibrosis hati setelah 8 minggu perlakuan denganpewarnaan Masson’s trichrome. Warna biru menunjukkan akumulasi jaringan ikat yangterjadi di sekitar cabang vena porta, cabang duktus biliaris dan cabang arteri hepatika.A. Kelompok Normal B. Kelompok CCl4. C. Kelompok CCl4+NAC. D. KelompokCCl4+T50. E. Kelompok CCl4+T100. F. Kelompok CCl4+T150.N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari,T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.

A B

C D

E F

104


PEMBAHASAN

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 selama 8 minggu meningkatkanaktivitas ALT, AST dan ALP di serumdibandingkan kelompok normal. Peningkatanaktivitas ALT dan AST menunjukkan terjadinyapelepasan enzim dari jaringan hati ke sirkulasidarah yang disebabkan oleh kerusakan sel hati.Peningkatan aktivitas ALP terjadi akibat adanyakolestasis, dan pada obstruksi intra maupunekstrabiliar enzim ini akan meningkat 3-10 kalidari nilai normal. ALT merupakan enzim yangterdapat di dalam sitosol sel hati, AST terdapatdi dalam sitosol serta mitokondria sel hati, selotot rangka, jantung dan ginjal, sedangkan ALPterdapat dalam banyak jaringan terutama di hati,tulang dan mukosa usus.13-15

Peningkatan aktivitas enzim ALT, ASTdan ALP sampai dua kali lipat masih dianggapnormal.16-17 Dari penelitian ini didapatkan bahwapemberian CCl4 selama 8 minggumeningkatkan aktivitas ALT dan AST 3 kalidibandingkan kelompok normal, sedangkanaktivitas ALP meningkat 6 kali dibandingkankelompok normal (p<0.05). Hasil inimenunjukkan bahwa pemberian CCl4

menyebabkan terjadinya kerusakan sel hati.Hasil ini sejalan dengan penelitian yangdilakukan oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,18

Demiroren dkk,19 dan Fu dkk20 yangmemberikan hasil berupa peningkatan yangsignifikan terhadap aktivitas ALT, AST danALP pada tikus yang menggunakan CCl4

sebagai penginduksi fibrosis hati.Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan

ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan aktivitasenzim ALT, AST dan ALP secara bermaknadibandingkan kelompok CCl4. Penurunanaktivitas enzim ALT dan AST pada pemberianketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewatersebut dapat mendekati kelompok normal.Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa jugamenurunkan aktivitas ALP secara bermakna,walaupun belum dapat mendekati kelompoknormal. Secara keseluruhan, adanya penurunanaktivitas ketiga enzim tersebut mengindikasikanbahwa ekstrak air buah mahkota dewa dapatmelindungi sel hati akibat paparan CCl4 secarakronis.

Penilaian aktivitas antioksidan ekstrak airbuah mahkota dewa dilakukan melaluipemeriksaan peroksidasi lipid dan rasioGSH/GSSG pada jaringan hati. Peroksidasi lipidadalah penanda yang penting terhadap kerusakanjaringan karena stres oksidatif dan dapatdiimplikasikan sebagai penyebab fibrosis hati.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 dapat meningkatkan secarasignifikan meningkatkan kadar MDA dalamjaringan hati dibandingkan kelompok normal.Hasil ini sejalan dengan penelitian yangdilakukan oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,18

Kamalakkannan dkk22 dan Pereira-Filho dkk23

yang menggunakan CCl4 untuk menginduksifibrosis hati pada tikus. Peningkatan kadar MDAterjadi karena hasil metabolisme CCl4 berupaROS (triklorometil dan triklorometilperoksi)yang dapat menyerang lipid membran retikulumendoplasma sehingga menyebabkan peroksidasilipid, menginduksi kerusakan membran sel danstruktur organel sel hati, degenerasi, nekrosisdan fibrosis hati.24-26

Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBBdan ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50,100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadarMDA dalam jaringan hati secara bermaknadibandingkan kelompok CCl4. Penurunan kadarMDA pada pemberian ketiga dosis ekstrak airbuah mahkota dewa dapat mendekati kelompoknormal. Kemampuan ekstrak air buah mahkotadewa dalam menurunkan kadar MDA dapatdisebabkan oleh aktivitas antioksidannya, yaitukemampuan untuk melindungi sel parenkim hatiterhadap radikal triklorometil dantriklorometilperoxi yang dihasilkan akibat prosesmetabolisme CCl4.

GSH merupakan antioksidan nonenzimatik yang dibutuhkan untuk menangkalterjadinya stres oksidatif. Dalam sel, glutationberada dalam bentuk tereduksi (GSH) danteroksidasi (GSSG). Mengukur rasioGSH/GSSG pada model hewan coba danmembandingkannya dengan kelompok kontrolmerupakan cara terbaik untuk mengetahuipotensi terapi suatu obat uji dalammempertahankan potensial redoks selular.Potensial redoks selular merupakan hal yangkritikal pada fisiologi sel normal dan rasioGSH/GSSG merupakan indikator terbaik untukmengetahui potensial redoks tersebut. 21,27,28

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 menurunkan rasio GSH/GSSGdalam jaringan hati secara bermaknadibandingkan kelompok normal. Hasil inisejalan dengan penelitian yang dilakukan olehCháved E dkk5 dan Fu dkk21 yang menggunakanCCl4 untuk menginduksi fibrosis hati pada tikus.Hal ini disebabkan karena pemberian CCl4secara kronis menyebabkan terjadinyapeningkatan ROS, terutama radikaltriklorometilperoksi. Gugus tiol pada GSH akandioksidasi oleh radikal triklorometilperoksimembentuk GSSG. Pada paparan CCl4 kronis,peristiwa tersebut terjadi secara terus menerussehingga menyebabkan deplesi kadar GSH.

105


Penurunan kadar GSH akan diikuti denganpenurunan nilai rasio GSH/GSSG. Penurunanrasio GSH/GSSG tersebut mengindikasikanterjadinya perubahan potensial redoks selulardan stres oksidatif, yang pada akhirnyamenyebabkan kerusakan struktur dan fungsi seltubuh.27

Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB danekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat meningkatkan rasioGSH/GSSG dalam jaringan hati sehingga dapatmendekati kelompok normal. Peningkatan rasioGSH/GSSG pada pemberian ketiga dosis ekstrakair buah mahkota dewa sebanding dengankelompok NAC. Peningkatan rasio GSH/GSSGpada penelitian ini mengindikasikan bahwaekstrak air buah mahkota dewa memilikiaktivitas antioksidan yaitu sebagai penangkapROS hasil metabolisme CCl4 yang dapatmengganggu sistem pertahanan antioksidan.

TNF-α merupakan kunci utama yangberkontribusi dalam memicu kaskade inflamasiyang melibatkan induksi sitokin setelah cederahati. Ketika terjadi cedera hati, sel Kupffer,makrofag dan neutrofil akan melepaskan TNF-α.Selain berperan dalam menginduksi proliferasihepatosit dan regenerasi hati, TNF-α jugaberperan sebagai mediator kematian hepatositserta aktivasi HSC.21

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 meningkatkan secara bermaknakadar TNF-α dalam jaringan hati hingga 1.5 kalidibandingkan kelompok normal. Hasil inisejalan dengan penelitian yang dilakukan olehDemiroren dkk19 yang menunjukkan peningkatankadar TNF-α hingga 2 kali pada tikus yangmenggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosishati.. Peningkatan kadar TNF-αmengindikasikan terjadinya proses inflamasiakibat cedera hati kronis. Peran utama TNF-αdalam fibrosis hati yaitu menginisiasi prosesaktivasi HSC. Aktivasi HSC menggambarkantahap penting terjadinya fibrosis karena sel HSCmerupakan sumber utama ECM selamaterjadinya cedera hati.

Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB danekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadarTNF-α sehingga mendekati kelompok normal.Penurunan kadar TNF-α pada pemberian ketigadosis ekstrak air buah mahkota dewa sebandingdengan kelompok NAC. Hasil penelitian inimenunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkotadewa memiliki aktivitas antiinflamasi. Adanyapenurunan kadar TNF-α tersebut akanmenyebabkan penurunan HSC yang teraktivasisehingga dapat menghambat terjadinya fibrosishati.

Selain TNF-α, aktivasi HSC jugadikarenakan adanya TGF-β yang dilepaskan oleh

sel hepatosit yang rusak, sel Kuppfer yangteraktivasi, infiltrasi makrofag dan neutrofil padahati yang mengalami cedera. TGF-β superfamilyterdiri dari berbagai multifungsional sitokintermasuk TGF-β 1, 2, 3, activin dan bonemorphogenic proteins (BMPs). TGF-β1 adalahsitokin fibrogenik utama dan induser yang palingberperan dalam fibrosis, yaitu pengaturanproduksi, degradasi dan akumulasi ECM padafibrosis hati.29

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 meningkatkan kadar TGF-β1dalam jaringan hati hingga 5 kali dibandingkankelompok normal. Hasil ini sejalan denganpenelitian yang dilakukan oleh Cháved E dkk5

dan Galicia-Moreno dkk30 yang menunjukkanpeningkatan kadar TGF-β1 pada tikus yangmenggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosishati. Peningkatan kadar TGF-β1mengindikasikan terjadinya aktivasi HSC yangberperan dalam proses fibrogenesis pada cederahati kronis.

Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB danekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadarTGF-β1 dalam jaringan hati walaupun belumdapat mendekati kelompok normal. Penurunankadar TGF-β1 pada pemberian ketiga dosisekstrak air buah mahkota dewa sebandingdengan kelompok NAC. Penurunan kadar TGF-β1 akan menyebabkan penurunan HSC yangteraktivasi sehingga dapat menghambatterjadinya fibrosis hati. Berdasarkan hal tersebutdiketahui bahwa ekstrak air buah mahkota dewamemiliki aktivitas sebagai pencegah fibrosishati.

Hasil pemeriksaan histopatologimenunjukkan bahwa pemberian CCl4

menyebabkan terbentuknya jaringan ikat denganpersentase yang lebih besar dibandingkankelompok normal. Pemberian NAC dosis 150mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewadosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB dapatmenurunkan persentase jaringan ikat yangterbentuk. Hal tersebut mengindikasikan adanyaproses penghambatan terjadinya fibrosis hatipada pemberian ekstrak air buah mahkota dewa.Hasil pemeriksaan histopatologi ini sejalandengan hasil pemeriksaan parameter biokimiayang secara keseluruhan menunjukkan perbaikanterhadap parameter yang telah dievaluasitersebut.

KESIMPULAN

Pemberian ekstrak air buah mahkota dewamemiliki aktivitas antioksidan dan antiinflamasi.Aktivitas tersebut berperan dalam memberikanperlindungan sel hati dan menghambat prosesaktivasi HSC, sehingga tidak terjadi akumulasi

106


ECM dan pada akhirnya mencegah terjadinyafibrosis hati.

SARAN

Mengingat adanya keterbatasan dankekurangan dari penelitian ini, maka beberapahal yang perlu disarankan untuk penelitianselanjutnya adalah dilakukannya penelitianuntuk mengetahui potensi ekstrak air buahmahkota dewa terhadap aktivasi HSC melaluipemeriksaan imunohistokimia HSC, alpha-smooth muscle actin (α-SMA).

DAFTAR PUSTAKA

1. Ramachandran P, Iredale JP. Reversibility ofliver fibrosis. Ann Hepatol. 2009;8:283-91.

2. Wallace K, Burt AD, Wright C. Liverfibrosis. Biochem J. 2008; 411: 1-18

3. Rockey DC, Friedman SL. Hepatic fibrosis andcirrhosis. In: Boyer TD, Wright TL, Manns MP,editors. Zakim and Boyer's Hepatology. 5th ed.Philadelphia: Saunders Elsevier;2006.p.87-109.

4. Wang L, Cheng D, Wang H, Di L, Zhou X,Xu T. The hepatoprotective and antifibroticeffects of Saururus chinensis against carbontertrachloride induced hepatic fibrosis in rats.J of Ethnopharmacol. 2009;126:487-91.

5. Cháved E, Reyes-Gordillo K, Segovia J,Shibayama M, Tsutsumi V, Vergara P,Moreno MG, Muriel P. Resveratrol preventsfibrosis, NF-κB activation and TGF-βincreases induced by chronic CCl4 treatmentin rats. J Appl Toxicol. 2008;28:35-43.

6. Hendra R, Ahmad S, Oskoueian, Sukari A,Shukor MY. Antioxidant, anti-inflammatoryand cytotoxicity of Phaleria macrocarpa(Boerl.) Scheff fruit. BMC ComplementAltern Med. 2011;11:2-10.

7. Dewoto HR, Mariyana Y, Arif A. Uji efekhipoglikemik ekstrak daging buah mahkotadewa [Phaleria marcocarpa (Scheff) Boerl.]pada kelinci, dibandingkan glibenklamid.Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2006;6:20-3.

8. Yanti AR, Widayanti, Ringoringo VS. Ujiefek antihipertensi ekstrak etanol dagingbuah mahkota dewa [Phaleria marcocarpa(Scheff) Boerl.] pada tikus putih jantan.Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2010;7:63-7.

9. Gotama IBI, Sugiarto S, Nurhadi M,Widiyastuti Y, Wahyono S, Prapti IJ.Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jilid V.Jakarta: Departemen Kesehatan BadanPenelitian dan PengembanganKesehatan;1999.hal.147-8.

10. Kim WJ, Veriansyah B, Lee YW, Kim J,Kim JD. Extraction of mangiferin from

mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) usingsubcritical water. J Ind Eng Chem.2010;16:425-30.

11. Berlian G, Tandrasasmita M, TjandrawinataR. Bioactive fraction DLBSProliverenolpossess hepatoprotective activity viaantiinflammation, DNA repair andantiapoptosis activities. Unpublished report.DLBS. 2013:1-10.

12. Nailufar F, Kristiana H, Hardadi P,Sinambela J, Tjandrawinata R.Hepatoprotective effect: Cell toxicity,pharmacodynamic and antioxidant ofbioactive fraction DLBS1433.Unpublishedreport. DLBS. 2013:1-10

13. Panjaitan RGP, Handharyani E, Chairul,Masriani, Zakiah Z, Manalu W. Pengaruhpemberian karbon tertraklorida terhadapfungsi hati dan ginjal tikus. MakaraKesehatan. 2007;11:11-6.

14. Boone L, Meyer D, Cusick P, EnnulatD, Bolliger AP, Everds N, et al.Selection and interpretation of clinical pathology indicators of hepatic injury in preclinicalstudies. Vet Clin Pathol. 2005;34:182-8.

15. Ennulat D, Walker D, Clemo F, Magid-SlavM, Ledieu D, Graham M.Effects of hepatic drug-metabolizing enzymeinduction on clinical pathologyparameters in animals and man. ToxicolPathol. 2010;38:810-28.

16. Johnson-Delaney CA. Small rodents. In:Exotic Companion Medicine Handbook forVeterinarians. Florida: Zoological EducationNetwork;2008.p.2-47.

17. Smith JB, Mangkoewidjojo S.Pemeliharaaan, Pembiakan dan PenggunaanHewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta:UI Press;1988.hal.39.

18. Morsy MA, Abdalla AM, Mahmoud AM,Abdelwahab SA, Mahmoud ME .Protective effects of curcumin, α-lipoic acid,and N-acetylcysteine against carbontetrachloride-induced liver fibrosis in rats. JPhysiol Biochem. 2012;68:29-35.

19. Demiroren K, Dogan Y, KocamazH, Ozercan IH, Ilhan S, Ustundag B, et al.Protective effects of L-carnitine, N-acetylcysteine and genistein in anexperimental model of liver fibrosis. ClinRes Hepatol Gastroenterol. 2014;38: 63-72.

20. Fu Y, Zheng S, Lin J, Ryerse J, Chen A.Curcumin protects the rat liver from CCl4-caused injury and fibrogenesis by attenuatingoxidative stress and suppressinginflammation. Mol Pharmacol. 2008;73:399-409.

21. Shimizu I, Shimamoto N, Saiki K, Furujo M,Osawa K. Lipid peroxidation in hepatic

107


fibrosis. In: Catala A, editor. Lipidperoxidation. Rijeka. Intech; 2012.p. 483-92.

22. Kamalakkannan N, Rukkumani R, Aruna K,Varma PS, Viswanathan P, Menon VP.Protective effect of N-acetyl cysteine incarbon tetrachloride-induced hepatotoxicityin rats. Iranian J Pharmacol Ther.2005;4:118-23.

23. Pereira-Filho G, Ferreira C, Schwengber A,Marroni C, Zettler C, Marroni N. Role of N-acetylcysteine on fibrosis and oxidativestress in cirrhotic rats. Arq Gastroenterol.2008;45:156-62.

24. Hayashi H, Sakai T. Animal models for thestudy of liver fibrosis: new insights fromknockout mouse models. Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol. 2011; 300:G729-38.

25. Farber JL, Gerson RJ. Mechanisms of cellinjury with hepatotoxic chemicals.Pharmacol Rev. 1984;36:71S-75S.

26. Li L, Hu Z, Li W, Hu M, Ran J, Chan P, etal. Establishment of a standardized liverfibrosis model with different pathologicalstages in rats. Gastroenterol Res Pract.2012;2012:1-6.

27. Owen JB, Butterfield DA. Measurement ofoxidized/reduced glutathione ratio. MethodsMol Biol. 2010;648:269-77.

28. El-Beshbishy HA, Tork OM, El-Bab MF,Autifi MA. Antioxidant and antiapoptoticeffect of green tea polyphenols againstazathioprine-induced liver injury in rats.Pathophysiology. 2011;18:125-35.

29. Cong M, Iwaisako K, Jiang C, Kisseleva T.Cell signals influencing hepatic fibros. Int JHepatol. 2012;2012:1-18.

30. Galicia-Moreno M, Rodríguez-Rivera A,Reyes-Gordillo K, Segovia J, Shibayama M,Tsutsumi V, et al. N-acetylcysteine preventscarbon tetrachloride induced livercirrhosis: role of liver transforming growthfactor beta and oxidative stress. Eur JGastroenterol Hepatol. 2009;21:908-14.

108

Biodata Penulis

Nama lengkap : Nanik Sundari

NPM : 1206330495

NIP : 19801004 200501 2 001

Tanggal Lahir : 4 Oktober 1980

Tempat Lahir : Jakarta

Jenis Kelamin : Perempuan

Agama : Islam

Status Pernikahan : Belum Menikah

Alamat Rumah : JL. Cempaka Putih Utara RT010/02. No. 18

Jakarta Pusat – DKI Jakarta

Kode Pos : 10640

No. Telepon : 021-4244677

No. HP : 08128167056

E-mail : [email protected]

Riwayat Pendidikan :

- 1987 – 1993, Sekolah Dasar Negeri 013 Pagi, Jakarta

- 1993 – 1996, Sekolah Menengah Pertama Negeri 77, Jakarta

- 1996 – 1999, Sekolah Menengah Atas Negeri 68, Jakarta

- 1999 – 2003, Sarjana di Bidang Farmasi, Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia

- 2003 – 2004, Program Apoteker, Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia

Pengalaman Penelitian :

- Peneliti dalam rangka Skripsi: Uji keamanan sediaan jadi ekstrak kering daun Jati

Blanda (Guazuma ulmifolia Lamk) terhadap fungsi hati ditinjau dari aktivitas

GPT plasma, alkali fosfatase dan jaringan hati tikus (2003).

UNIVERSITAS INDONESIA Kajian Aktivitas Antioksidan ... · PDF filekhususnya teman-teman di...

Documents

Transcript of UNIVERSITAS INDONESIA Kajian Aktivitas Antioksidan ... · PDF filekhususnya teman-teman di...