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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS TESE DE DOUTORADO KYVIA BEZERRA MOTA Análise energética in silico das interações: ERα-Tamoxifeno, ERα-Raloxifeno e Integrina α V β 3 -Cilengitide NATAL RN 2016

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS

TESE DE DOUTORADO

KYVIA BEZERRA MOTA

Análise energética in silico das interações:

ERα-Tamoxifeno, ERα-Raloxifeno e Integrina αVβ3-Cilengitide

NATAL – RN

2016

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KYVIA BEZERRA MOTA

Análise energética in silico das interações:

ERα-Tamoxifeno, ERα-Raloxifeno e Integrina αVβ3-Cilengitide.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (PpgDITM/UFRN) como requisito

para obtenção do título de Doutor em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em

Medicamentos.

Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco (UFRN)

Co-orientador: Prof. Dr. Eudenilson L. Albuquerque (UFRN)

NATAL – RN

2016

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte.UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Mota, Kyvia Bezerra.

Análise energética in silico das interações: ERα-Tamoxifeno, ERα- Raloxifeno e Integrina αVβ3-Cilengitide / Kyvia Bezerra Mota – Natal, 2016.

124f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco.

Coorientador: Prof. Dr. Eudenilson Lins de Albuquerque.

Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e

Inovação Tecnológica em Medicamentos. Centro de Ciências da Saúde.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

1. Modelagem molecular – Tese. 2. Teoria do funcional da densidade –

Tese. 3. Fracionamento molecular com capuzes conjugados – Tese. I. Fulco,

Umberto Laino. II. Albuquerque, Eudenilson Lins de. III. Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 577.2

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelo dom da vida

A você minha filha Mila, anjo que ilumina os meus passos, eternas saudades.

A minha mãe pelo incentivo, apoio, carinho e amor, que me são dados em todos os momentos

da minha vida.

Ao meu pai, professor Carlos Fernando Mota (in memorian) pelo cuidado na minha formação e

por ter despertado em mim o gosto pelas ciências exatas.

Aos meus filhos Marta Maria e Rui Cesar que transformam minha vida em alegria.

Ao meu marido Rui Veiga, que através de sua ajuda nas traduções dos artigos dessa tese, e que

graças à sua sensibilidade e suas palavras de sensatez tornaram tudo possível.

Ao Prof. Dr. Umberto Laino Fulco pela inestimável orientação, amizade, pela paciência e por ter

acreditado que este trabalho seria possível.

Ao professor Eudenilson Lins de Albuquerque, por sempre escutar atentamente todos os que o

procuram e pelo exemplo de dedicação e entusiasmo ao ensino e pesquisa na UFRN.

A Katy pela inestimável ajuda na revisão final dessa tese, sem a qual seria impossível esse

resultado.

Os jovens cientistas José Xavier, Jonas e Jefferson Caio pelas explicações técnicas, correções e

ajuda nesse trabalho.

Aos professores do PpgDITM pelos ensinamentos que me fizeram ver muito além do

“prescrever medicamentos”.

À diretoria da Maternidade Januário Cicco pela oportunidade e compreensão durante a minha

jornada do doutorado

Aos novos colegas da Escola Paulista de Medicina pela sensatez e dispensa da minha carga

horária para ser possível a conclusão dessa jornada.

Por fim, a todos os demais que colaboraram direta e indiretamente para a concretização deste

trabalho e que compartilharam comigo os seus conhecimentos.

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“É preciso ser valente pra entender um Deus Que nos leva de repente a mesma vida que deu.

Quem plantou esta semente, Com a própria mão colheu.

É preciso ser valente pra enxergar no escuro Ver a vida como é e acreditar no futuro.

Se pra nós o fruto é verde, Pra Deus deve estar maduro.”

(Trecho de VALENTE: Maria Célia Monteiro, Grace Gomes e Nizan Guanaes)

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RESUMO

Essa tese trata de duas pesquisas com diferentes naturezas conceituais

no campo da modelagem molecular, porém baseadas em semelhantes

princípios teóricos da física quântica e da química computacional. No primeiro

estudo, as estabilidades dos sistemas ERα-OHT (Receptor α de Estrógeno-

Hidroxitamoxifeno), ERα-RAL (Receptor α de Estrógeno-Raloxifeno) e Integrina

αvβ3-Cilengitide foram determinadas em termos energéticos a partir da técnica

de fracionamento molecular com capuzes conjugados (MFCC) e no escopo da

teoria do funcional da densidade (DFT) seguindo o esquema GGA-PBE-

Grimme para calcular a interação energias dos sistemas estudados. No

primeiro estudo, foi possível predizer a relevância individual dos aminoácidos

Glu, Asp, Arg, Lys no sistema com o Tamoxifeno e Glu, Asp e Lys com o

Raloxifeno. Para isso ser possível, as forças de atração e repulsão dos

resíduos que compõem os sistemas foram calculadas. Cada um desses

resíduos apresentou uma energia de interação que variou dependendo da

natureza química da sua cadeia lateral, do ambiente de microsolvatação que o

envolve e dos contatos intermoleculares que estabelece. O estudo pioneiro da

estabilidade conformacional em termos energéticos de uma região livre de

aminoácidos incitará pesquisas centradas no desenvolvimento e síntese de

novos antagonistas utilizados no tratamento de diversas patologias comuns na

população geral. No segundo estudo, foram determinadas as propriedades

energéticas do sistema Integrina αVβ3-Cilengitide, cuja estrutura cristalográfica

apresenta cátions Mn+2. Observou-se a importâncias dos aminoácidos Ser,

Asp, Leu, Arg, Lys, Ala e Pro na interaçao da integrina com o fragmento RGD

(R: arginina; G: glicina; D: ácido aspártico) do cilengitide. A importância da

integrina com o fragmento RGD no mecanismo de adesão de diversas células

envolvidas nas doenças cancerígenas e também na implantação embrionária

permitirá o desenvolvimento de novas terapias impactantes na sobrevida de

pacientes portadores de diversas neoplasias e na reprodução humana.

Palavras-chave: modelagem molecular, energias de interação, teoria do

funcional da densidade, fracionamento molecular com capuzes conjugados,

ERα-OHT, ERα-RAL, Integrina αVβ3-RGD, Cilengitide.

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ABSTRACT

This thesis deals with two researches with different conceptual nature in

the field of molecular modeling based on similar theoretical principles of

quantum physics and computational chemistry. In the first study the stabilities of

ERα-OHT (Receptor α Estrogen co-crystalyzed with Hydroxytamoxifen), ERα-

RAL (α-Estrogen Receptor co-crystalyzed with Raloxifene) and integrin αvβ3

co-crystalyzed with cilengitide systems were determined in terms of energy from

the Molecular Fractionation Technique Caps Conjugates (MFCC), and the

scope of the Density Functional Theory (DFT) following GGA-PBE-Grimme

scheme for calculating the interaction energy of the systems studied. In the first

study, it was possible to predict the relevance of individual amino acids Glu,

Asp, Arg, Lys in the system with Tamoxifen and Glu, Asp and Lys in Raloxifene

system. For this to be possible, the attraction and repulsion forces of the

residues that comprise the systems were calculated. Each of these residues

had an energy of interaction that varied depending on the chemical nature of

the side chain, the microsolvation environment that surrounds and

intermolecular contacts establishing. The pioneer study of conformational

stability in terms of energy of free amino acid region will encourage research

focusing on the development and synthesis of new antagonists used in the

treatment of several common diseases in the general population. In the second

study, we determined the energetic properties of Integrin αVβ3-cilengitide

system, whose crystallographic structure has Mn+2 cations. It was noted the

importance of amino acids Ser, Asp, Leu, Arg, Lys, Ala and Pro in integrin

interaction with the RGD fragment (R: arginine; G: glycine; D: aspartic acid) of

cilengitide. The importance of integrin with the RGD fragment in the adhesion

mechanism of various cells involved in cancers and in embryo implantation

allows the development of new therapies impacting on survival of patients with

various forms of neoplasms and in human reproduction.

Keywords: molecular modeling, interaction energies, the density

functional theory, molecular fractionation conjugated caps, ERα-OHT, ERα-

RAL, Integrin αVβ3-RGD, cilengitide.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação estrutural dos receptores de estrógeno-α no domínio

LDB (ERα-LBD) complexado com 4-hidroxitamoxifeno (PDB ID: 3ERT) (SHIAU,

1998). A esfera denota o bolsão de ligação de raio r. ........................................... 30

Figura 2: Representação do OHT e RAL em pH fisiológico e distribuição da

densidade eletrônica. (a) Estrutura química subdividida em quatro partes para

auxiliar a análise das suas interações com Erα; (b) densidade de eletrônica

projetada sobre um potencial eletrostático de isosuperfície mostrando regiões

negativa e positivamente carregadas destacadas com as cores vermelha e

azul, respectivamente. ................................................................................................ 42

Figura 3: Energia de interação total dos SERMs OHT e RAL considerando o

raio r = 4.0 Å, 6.0 Å, 11.5 Å, 13.0 Å e 15.0 Å, a partir do cálculo utilizando GGA-

PBE-Grimme como funcional de troca e correlação. O valor absoluto de E (r)

obedece a sequência OHT > RAL reproduzindo dados experimentais (CLEGG

et al.,2005; KUIPER et al.,1998). .............................................................................. 43

Figura 4: Painel gráfico BIRD que mostra os resíduos mais relevantes da Erα

que contribuem para a ligação de cada ligante: (a) OHT e (b) RAL. .................. 45

Figura 5: Disposição dos resíduos de aminoácidos mais envolvidos na ligação

ER-SERMs. Contatos entre droga-resíduo são representadas por linhas

tracejadas e as suas distâncias. (a) OHT e (b) RAL.............................................. 52

Figura 6: Isosuperfícies de potencial eletrostático com as densidades

eletrônicas para os SERMs interagindo com os resíduos mais atraentes: (a)

OHT e (b) RAL.............................................................................................................. 53

Figura 7: Classificação da família das integrinas e seus respectivos receptores.

Adaptado de KINASHI, 2005. .................................................................................... 58

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Figura 8: Arquitetura de domínio de um heterodímero de integrina. Adaptado de

Gahmberg et al., 2009. ............................................................................................... 60

Figura 9: Representação estrutural da integrina em complexo com o cilengitide,

são representadas as subunidades α e β montadas em uma cabeça ovoides e

duas caudas quase paralelas (PDB ID: 1L5G) (PROWSE et al., 2011). A bolsa

de ligação esférica de raio r também é apresentada nesta figura com um círculo

pontilhado em linha na cor preta em torno do ligante cilengitide. ........................ 66

Figura 10: A energia total de interação como uma função raio r no bolso de

ligação calculada utilizando-se o funcional B97D e GGA. Os resíduos de

aminoácidos responsáveis pelas regiões da variação negativa e positiva mais

acentuada são realçados............................................................................................ 72

Figura 11: Arranjo do sítio de adesão dependente de íons metálicos (MIDAS) e

o resíduos de aminoácidos encontrados na integrina αVβ3. ................................. 73

Figura 12: BIRD painel gráfico que mostra os mais relevantes resíduos que

contribuem para o complexo de integrina αVβ3 cilengitide, distâncias mínimas

entre cada resíduo e o ligante, bem como a região e os átomos dos ligantes

mais próximos de cada resíduo no sítio de ligação. .............................................. 77

Figura 13 - Os principais resíduos de aminoácidos e suas respectivas

interações intermoleculares com o complexo cilengitide- integrina αVβ3 (a)

Região I; (b) Região II; (c) as regiões II e III; (d) Região III. regiões IV e V não

são mostradas aqui porque apresentam poucos contatos com resíduos de

aminoácidos. Potenciais ligações de hidrogênio são indicadas por linhas

tracejadas. ..................................................................................................................... 81

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Lista de Tabelas

Tabela 1 - Energias de interação para OHT. ......................................................... 48

Tabela 2 - Energias de interação para RAL. .......................................................... 49

Tabela 3 - Principais integrinas encontradas em vertebrados, seus ligantes e

seus locais de distribuição. Adaptado de HYNES, 1992. .................................... 59

Tabela 4- Energias dos resíduos, grupo atômico, camada de interação,

distância mínima e ligação MFCC entre cada um dos 76 resíduos de

aminoácidos dos domínios β-hélice e βA. Os valores de energia foram

calculados uti lizando GGA com o funcional B97D + D3. ..................................... 75

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Lista de Símbolos e Abreviaturas

A Aminoácido Alanina

AMPc Monofosfato Cíclico de Adenosina

BIRD Binding site, Interaction energy and Residues Domain

BSSE Erro de sobreposição de base

C Aminoácido Cisteína

CRH Hormônio Liberador de Corticotrofina

D Aminoácido Aspartato

DBD Domínio de Ligação de DNA

DFT Teoria do Funcional de Densidade

DNA Ácido desoxirribonucleico

E Aminoácido Glutamina

EGF Fator de Cresciento Epidérmico

ER Receptor de Estrógeno

F Aminoácido Fenilalanina

FA Adesão Focal

FSH Hormônio Folículo Estimulante

G Aminoácido Glicina

GGA Aproximação do Gradiente Generalizado

GMPc Monofosfato Cíclico de Guanosina

GnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas

H Aminoácido Histidina

HF Método de Hartree Fock

HRE Hormone Response Element

I Aminoácido Isoleucina

ICAMs Moléculas de Adesão Intercelulares

IGF-1 Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1

INCA Instituto Nacional do Câncer

K Aminoácido Lisina

KS Método de Abordagem Kohn-Sham

L Aminoácido Leucina

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LBD Domínio de Ligação ao Ligante

LH Hormônio Luteinizante

LIMBS

M Aminoácido Metionina

MEC Matriz Extracelular

MFCC Fracionamento Molecular por Capas Conjugadas

MIDAS Sítio de Adesão Dependente de Íon Metálico

NR Receptores Nucleares

P Aminoácido Prolina

PDB Protein Data Bank

PSI Plexina-Semaforina-Integrina

PTH Paratormônio

QM/MM Quantum Mechanics/Molecular Mechanics

R Aminoácido Arginina

RCSB Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

RGD Arginina-Glicina-Aspartato

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RNAm Ácido Ribonucleico tipo mensageiro

S Aminoácido Serina

SERM Modulador Seletivo dos Receptores de Estrógeno

SyMBs Locais de Ligação Sinérgica ao Íon Metálico

T Aminoácido Tirosina

TGF-β Fator de Transformação do Crescimento tipo β

TRH Hormônio Liberador de tireotrofina

TSH Hormônio Tireoestimulante

V Aminoácido Valina

VCAM-1 Molécula de Adesão Vascular-1

vWF Fator de Von Willebrand

W Aminoácido Triptofano

Y Aminoácido Tirosina

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Sumário

INTRODUÇÃO.................................................................................................................15

INTERAÇÃO ENTRE O RECEPTOR DO ESTRÓGENO α E MODULADORES

SELETIVOS .....................................................................................................................20

2.1 Introdução ................................................................................................................21

2.1.1 Câncer de Mama................................................................................................21

2.1.2 Hormônios .........................................................................................................22

2.1.3 Hormônios Esteroides......................................................................................25

2.1.4 Receptor de Esteroide ......................................................................................27

2.1.5 Ligantes: Tamoxifeno e Raloxifeno (SERMs) ................................................30

2.2 Bioquímica Computacional ....................................................................................32

2.2.1 Métodos ab initio...............................................................................................33

2.2.2 Teoria do Funcional da Densidade .................................................................34

2.2.3 Energia de Troca-correlação ...........................................................................35

2.2.4 Fracionamento Molecular com Caps Conjugados (MFCC) .........................36

2.3 Objetivos...................................................................................................................37

2.3.1 Objetivos Gerais................................................................................................37

2.3.2 Objetivos Específicos.......................................................................................37

2.4 Materiais e Métodos ................................................................................................37

2.4.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica ..........................................................38

2.4.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização das Estruturas .....38

2.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional ....39

2.5 Resultados e Discussões .......................................................................................41

2.6 Conclusões ..............................................................................................................53

INTERAÇÃO ENTRE INTEGRINA αVβ3 E CILENGITIDE .............................................56

3.1 Introdução ................................................................................................................57

3.1.1 Estrutura das Integrinas ..................................................................................59

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3.1.2 Funções das Integrinas....................................................................................62

3.1.3 Sinalização Mediada por Integrinas................................................................62

3.1.4 Integrina αVβ3 .....................................................................................................64

3.1.5 Cilengitide ..........................................................................................................66

3.2 Objetivos...................................................................................................................67

3.2.1 Objetivos Gerais................................................................................................67

3.2.2 Objetivos Específicos.......................................................................................68

3.3 Materiais e Métodos ................................................................................................68

3.3.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica ..........................................................68

3.3.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização da Estrutura .........68

3.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional ....69

3.4 Resultados e Discussões .......................................................................................70

3.5 Conclusões ..............................................................................................................82

CONCLUSÃO GERAL E PESPECTIVAS ......................................................................84

REFERÊNCIAS ...............................................................................................................87

ANEXO 1 .......................................................................................................................109

ANEXO 2 .......................................................................................................................117

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INTRODUÇÃO

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1.1 Introdução

A saúde configura-se um tema complexo e multidisciplinar, influenciada

por uma variedade de fatores: fisiológicos, bioquímicos, psicológicos,

ambientais e sociais. Neste contexto, o aumento da população mundial, bem

como também da sua expectativa de vida, tem gerado um acréscimo nos casos

de doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, diabetes e câncer, entre

outras, elevando a sua importância entre os maiores desafios modernos na

busca por novas alternativas terapêuticas.

O câncer é caracterizado pela multiplicação descontrolada de células do

organismo (BAROT, 2013; ROSALES-HERNADEZ et al, 2009). Estas células

perdem os mecanismos que regulam o crescimento e a multiplicação, devido

normalmente a danos do material genético celular (DNA). Estes danos são

causados, dentre outros fatores, por agentes externos, como o fumo, radiação

solar, vírus ou alimentação. Esta doença caracteriza uma das principais causas

de morte no mundo e um dos principais problemas de saúde pública em países

desenvolvidos e em desenvolvimento.

Estima-se que no Brasil, biênio 2016-2017, haverá a ocorrência de cerca

de 600 mil novos casos de câncer. O perfil epidemiológico observado no país

demonstra que os tipos mais frequentes em homens serão próstata, pulmão,

intestino, estômago e cavidade oral. Já em mulheres, os cânceres de mama,

intestino, colo do útero, pulmão e estômago figurarão entre os principais tipos

(INCA, 2016).

É compreendido que a predisposição particular de cada indivíduo tem

uma atribuição determinante na resposta ao surgimento da doença, porém não

é possível precisar em que grau esse fator possa influenciar a relação entre a

dose e o tempo de exposição ao carcinógeno e a resposta individual à

exposição. Independentemente da exposição a carcinógenos, as células

sofrem processos de mutação espontânea, que não alteram o desenvolvimento

normal da população celular como um todo. Em síntese, a carcinogênese pode

iniciar-se de forma espontânea ou ser provocada pela ação de agentes

carcinogênicos (químicos, físicos ou biológicos) (DEVITA et al, 2005). Apesar

da grande quantidade de estudos associados ao câncer, a biologia, a etiologia

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e a fisiopatologia do câncer não estão totalmente estabelecidas, principalmente

devido a obstáculos ao estudo in vivo de uma variedade de fatores envolvidos

na sua gênese (RANG; DALE; RITTER, 2001).

Os tratamentos disponíveis para o câncer muitas vezes não demonstram

a eficácia pretendida, o que explica o grande interesse no desenvolvimento de

novos agentes anticâncer. Mesmo com diversas opções no mercado, a

complexidade da doença é o grande entrave para o seu tratamento (BEGLEY;

ELLIS, 2012). O arsenal terapêutico disponível atualmente, para o tratamento

do câncer, mostra-se muitas vezes ineficaz no controle dessa doença,

sobretudo nos tipos mais agressivos.

Os agentes quimioterápicos usualmente empregados agem no

maquinário genético da célula e não raramente tornam-se obsoletos devido à

resistência desenvolvida pelos tumores. Associa-se a isso alta incidência de

eventos adversos decorrentes da inespecificidade desses fármacos (ROCHE,

2008). Tendo em vista esses problemas e o crescente número de casos de

neoplasias no Brasil e no mundo, faz-se extremamente necessário o

conhecimento preciso da bioquímica estrutural dos compostos utilizados como

agentes anticâncer, bem como seus mecanismos de ligação, conduzindo para

um melhor entendimento de como estes agem sobre os tumores.

Neste sentido, a utilização de ferramentas computacionais baseadas em

química quântica pode prover um passo promissor, já que surgem como uma

alternativa simples e eficiente para o entendimento e desenvolvimento de

novos alvos terapêuticos. O uso destas ferramentas tende a promover o

desenvolvimento de pesquisas experimentais e de bioengenharia, visto que

permitem uma melhor compreensão dos mecanismos de ligação que envolvem

um fármaco ao seu alvo (BARREIRO; FRAGA, 2001; ROCHE, 2008; RUSSO,

2002).

A modelagem molecular constitui um capítulo das ciências naturais que

tem evoluído bastante nos últimos anos, de tal forma que hoje ela está

integrada em boa parte das pesquisas físicas, químicas e genéticas. A

expansão dessa área do conhecimento deve-se, entre outros fatores, aos

avanços conceituais na química teórica, especialmente no campo da mecânica

quântica; ao rápido desenvolvimento dos recursos computacionais; assim como

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à constante evolução das funcionalidades dos softwares modernos para

análise de estruturas moleculares, que permitem uma complexa caracterização

eletrônica e termodinâmica dos modelos estudados (BULTINCK;

TOLLENAERE; WINTER, 2003; ANDRICOPULO; MONTANARI, 2005; YAN et

al., 2011).

Assim, observa-se que o emprego de metodologias de modelagem

molecular permite gerar conhecimentos sobre fatores estruturais, parâmetros

geométricos e energéticos, propriedades eletrônicas fundamentais para o

estudo de moléculas isoladas ou mesmo sistemas macromoleculares

complexos. Diante disso, neste trabalho, foram utilizadas técnicas quânticas de

modelagem molecular no estudo das energias de interação de modelos

biológicos complexos envolvendo a interação entre o receptor α de estrógeno e

os moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs) 4-

hidroxitamoxifeno e raloxifeno. E também uma análise da interação entre a

integrina αVβ3 e o cilengitide.

Esta tese compreende a descrição de duas pesquisas distintas, mas

estritamente inseridas no campo da modelagem molecular. A tese está

organizada como segue:

Primeiramente, descreve-se o emprego de métodos da bioquímica

quântica baseada na Teoria do Funcional da Densidade modelo (DFT) e a

técnica MFCC (Fracionamento Molecular com Caps conjugado) para

desvendar as interações energéticas detalhadas entre os agentes SERMs 4-

hidroxitamoxifeno (OHT) e raloxifeno (RAL), amplamente utilizado no

tratamento do câncer de mama, co-cristalizados com o receptor α de estrógeno

(Erα). Os resultados computacionais demonstraram ser de grande importância

no entendimento das peculiaridades que envolvem as interações descritas (ver

Anexo 1).

A seguir, apresenta o estudo que explora a interação energética entre o

pentapeptídeo cilengitide e a integrina αVβ3. A metodologia utilizada para a

descrição energética baseia-se, também, na Teoria do Funcional da Densidade

modelo (DFT) e na técnica MFCC. Os resultados demonstrados denotam uma

compreensão a respeito das interações particulares que ocorrem no complexo

(ver Anexo 2).

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No último capítulo apresentamos nossas conclusões e algumas

possíveis pespectivas deste trabalho.

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INTERAÇÃO ENTRE O

RECEPTOR DO ESTRÓGENO α

E MODULADORES SELETIVOS

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2.1 Introdução

2.1.1 Câncer de Mama

É irrefutável que o câncer é um problema de saúde pública,

principalmente entre os países em desenvolvimento, onde espera-se que, nas

próximas décadas, o efeito do câncer na população chegue a 80% dos mais de

20 milhões de novos casos estimados para 2025. Em mulheres brasileiras, as

maiores frequências de casos de câncer encontradas são mama, intestino,

pulmão, colo do útero e estômago. Para o Brasil, em 2016, são esperados

57.960 casos novos de câncer de mama, com um risco estimado de 56,20

casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2016).

O câncer de mama é uma doença sistêmica de caráter biológico

variável, logo, apresenta conduta terapêutica complexa que, em diversos

casos, os bons resultados (de melhor prognóstico) dependem de um

diagnóstico precoce. Contudo, existe uma porcentagem de casos, cuja

detecção é rápida, mas a evolução não é favorável (mau prognóstico). É

provável que o perfil genético possa regular e diferenciar grupos específicos

que serão beneficiados com determinados tratamentos (PEROU et al., 2000;

QUACKENBUSH, 2006).

É um dos tipos de câncer mais temidos pelas mulheres, devido à sua

alta frequência e efeitos psicológicos (INCA, 2016), tais como: alterações da

sexualidade e da imagem corporal, medo de recidivas, ansiedade, dor e baixa

autoestima (CANTINELI et al., 2006). Os principais sinais e sintomas de câncer

de mama são nódulo na mama e/ou axila, dor mamária e alterações da pele

que recobre a mama, como abaulamentos ou retrações com aspecto

semelhante à casca de laranja (INCA, 2016). Os cânceres de mama localizam-

se, principalmente, no quadrante superior externo, e em geral, as lesões são

indolores, fixas e com bordas irregulares, acompanhadas de alterações da pele

quando em estádio avançado (SMELTZER et al., 2006).

Alguns fatores de risco influenciam o aumento da incidência do câncer

de mama (BERNSTEIN, 2002; FRIMAN et al., 2007), como as mudanças nos

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hábitos (maior consumo e ingesta de gorduras não saudáveis, sedentarismo e

consumo exagerado de álcool) (MICHELS et al., 2007), como também os

fatores reprodutivos que favorecem a maior exposição estrogênica (menarca

precoce, uso de anticoncepcionais, terapia hormonal, gestação tardia, menor

tempo de amamentação).

Muitos estudos demonstram que o estrógeno é um importante agente

promotor da carcinogênese mamária por aumentar o nível de proliferação das

células, acrescentando, deste modo, o risco de formação de atipias (YAGER;

LIEHR, 1996; ZHENG et al., 1998; RUSSO et al., 2007). Além disso, foi

verificado que alguns metabólitos estrogênicos, como o 4-hidroxiestradiol e o

16 α-hidroxiestradiol, possuem capacidade de induzir a carcinogênese, por

promover lesão genotóxica no DNA da célula mamária (FISHMAN et al., 1984;

MUTI et al., 2000).

2.1.2 Hormônios

As diversas funções do organismo devem ser aptas a responder, de

modo coordenado e apropriado, a distintas modificações físicas e químicas,

oriundas de dentro ou fora do organismo. Os sistemas nervoso e endócrino,

agem de forma integrada na regulação do metabolismo. No primeiro, a

comunicação ocorre por meio de neurotransmissores, tais como a

noradrenalina, acetilcolina ou serotonina, que cobrem uma curtíssima fenda

sináptica existente entre os neurônios. Já no segundo, há a ação de

mensageiros químicos denominados hormônios, que são sintetizados e

armazenados nas glândulas endócrinas, e, quando requeridos, estão prontos

para serem liberados no sistema circulatório pelo processo de exocitose.

Estando no sistema circulatório, os hormônios podem atingir células-alvo

distantes, e a retenção e absorção, são dependentes de receptores específicos

com alta afinidade, localizados na superfície da membrana plasmática da

célula, ou no núcleo celular. Logo, os hormônios são moduladores de reações

enzimáticas do metabolismo, participando de funções específicas, como

crescimento celular, tissular e metabolismo (HADLEY, 1988; NORMAN, A. W.,

LITWACK, 1987).

Os hormônios podem ser divididos em quatro classes, de acordo com

sua estrutura química, síntese e armazenamento, solubilidade, meia-vida,

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transporte, receptores celulares e mecanismo de ação (NORMAN; LITWACK,

1987), sendo eles:

Peptídeos: estes hormônios são compostos por aminoácidos, podendo

variar entre 3 ou até mais de 180 aminoácidos. É a classe mais

numerosa de hormônios. Os principais locais de produção são o

hipotálamo, hipófise, ilhotas pancreáticas, placenta, paratireoide e trato

gastrointestinal.

Esteroides: produzidos a partir do colesterol, nos tecidos

esteroidogênicos das adrenais, gônadas e placenta. Nas adrenais são

produzidos os glicocorticoides (cortisol, corticosterona e cortisona) e os

mineralocorticoides (aldosterona). As gônadas produzem os andrógenos

(testosterona), estrógeno e progesterona.

Aminas: sintetizados pela medula adrenal, em algumas células

nervosas, e na tireoide. Incluem as catecolaminas e as iodotironinas. Os

mecanismos de ação das catecolaminas são similares aos peptídeos e

as iodotironinas têm o seu mecanismo similar aos hormônios

esteroidais.

Eicosanóides: são produzidos exclusivamente na membrana plasmática

das células de quase todos os tecidos e podem ser considerados como

segundos mensageiros intracelulares. São derivados do ácido

araquidônico, liberado por fosfolipídios originados da ação das

fosfolipases, ativadas por estímulos hormonais. Os eicosanóides

incluem as prostaglandinas, os leucotrienos e os tromboxanos.

A secreção hormonal pode seguir estímulos, estabelecendo ciclos ou

ritmos de vários tipos, assim como ritmo circadiano (diário), ultradiano (horas) e

circalunar (mensal). Alguns hormônios, não entram na circulação sanguínea,

mas podem ir até a célula-alvo por difusão passiva, como algumas

prostaglandinas (GONZALEZ; CERONI, 2006). Os hormônios esteroides e

tireoidianos, são transportados pelo sangue, mediante proteínas específicas, e

isso limita sua difusão através dos tecidos, mas os protege da degradação

enzimática. Porém, devem estar na forma livre para a entrada nas células-alvo.

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Os mecanismos que controlam a secreção dos hormônios, estão

basicamente centralizados na regulação do tipo feedback. Um exemplo deste

tipo de regulação é a manutenção dos níveis plasmáticos de 𝐶𝑎2+ e glicose no

sangue, uma queda de 𝐶𝑎2+ plasmático, leva à produção de PTH pela

paratireóide (feedback negativo), e um aumento nos níveis de glicose

sanguínea, leva a um aumento da produção de insulina pelas ilhotas

pancreáticas (feedback positivo) (GONZALEZ; CERONI, 2006). Há um

mecanismo de feedback mais complexo, e estes podem ser de “alça longa”,

sendo predominantemente negativos, nos quais os hormônios secretados pelos

órgãos efetores (esteroides sexuais, glicocorticóides, hormônios tireoidianos),

têm efeito negativo sobre a secreção dos hormônios tróficos hipofisários (LH,

FSH, ACTH, TSH) e sobre os hormônios hipotalâmicos (GnRH, CRH, TRH).

Podem ser também de “alça curta” ou de “alça ultracurta”, que agem a nível do

eixo hipotálamo-hipófise, de forma mais rápida. Os hormônios hipotalâmicos

são liberados, obedecendo a uma regulação negativa, podendo exercer um

efeito positivo (liberador), ou negativo (inibidor) (GUYTON; HALL, 2006).

Quanto ao mecanismo de ação, os hormônios atuam através de

receptores específicos existentes nas células-alvo. Os receptores promovem o

meio pelo qual os hormônios interagem preliminarmente com as células,

podendo localizar-se na membrana plasmática, citosol e no núcleo celular. Os

receptores são proteínas nas quais, os hormônios correspondentes, com alta

especificidade e afinidade, provocam mudanças conformacionais que

desencadeiam reações modificadoras do metabolismo da célula-alvo,

constituindo a resposta celular. Estes receptores podem variar quanto ao

número para cada tipo de célula, com isso variam o grau de resposta. A

interação hormônio-receptor é forte, mas não covalente, sendo equivalente à

interação de um efetor alostérico com a enzima que o regula. O sítio de

reconhecimento é esteroespecífico, onde somente se une o hormônio

correspondente ou moléculas similares. (GONZALEZ; CERONI, 2006;

NORMAN; LITWACK, 1987). São descritos basicamente dois tipos de

mecanismos de ação hormonal. Os hormônios que possuem seus receptores

na superfície externa da membrana plasmática das células-alvo, que exercem

seus efeitos pela alteração da permeabilidade da membrana, ou pela ativação

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de enzimas. A adenilciclase e a guanilciclase, que produzem AMPc e GMPc

respectivamente, são conhecidos como “segundos mensageiros” e têm suas

concentrações aumentadas no interior da célula em resposta ao hormônio

primário, regulando e alterando a velocidade de transcrição de genes

específicos. Os hormônios deste grupo são transportados de forma livre pelo

sistema circulatório, sendo um mecanismo de ação rápido, o que promove

rápidas modificações metabólicas. Já os hormônios que atravessam a

membrana plasmática das células-alvo possuem receptores localizados no

núcleo celular. Estas substâncias devem atravessar a membrana plasmática e

o citosol até chegar ao núcleo. A interação hormônio-receptor altera

diretamente a transcrição de genes específicos, requerendo tempo para a

síntese de RNAm no núcleo e uma posterior síntese de proteínas nos

ribossomos. Os hormônios são transportados ligados a proteínas específicas, e

o tempo de ação é de horas, podendo chegar a vários dias (GUYTON; HALL,

2006; HADLEY, 1988).

2.1.3 Hormônios Esteroides

Esteroides são hormônios produzidos pelo córtex da supra-renal, ou

pelas gônadas, os quais são responsáveis por diversas funções no organismo,

tais como controle metabólico e características sexuais. Estes hormônios

derivam da molécula de colesterol. Dois grupos são sintetizados no córtex da

adrenal: os mineralocorticoides, controladores da reabsorção de íons

inorgânicos pelos rins, e os glicocorticoides, que ajudam a regular a

gliconeogênese e reduzem a resposta inflamatória. Os hormônios sexuais são

produzidos pelas gônadas e placenta. Esses últimos incluem progesterona,

regulador do ciclo reprodutivo feminino, andrógenos (como a testosterona) e

estrógenos (como o estradiol). Os hormônios esteroides são efetivos em baixas

concentrações e, portanto, produzidos em pequenas quantidades. A síntese

dos esteroides requer a remoção de alguns ou todos carbonos da cadeia lateral

no C-17 do anel D do colesterol. Essa remoção acontece na mitocôndria dos

tecidos específicos e envolve a hidroxilação de dois carbonos adjacentes (C-20

e C-22) na cadeia lateral, seguindo-se a clivagem da ligação entre eles. A

síntese de muitos hormônios envolve a adição de átomos de oxigênio (COX;

WISCONSIN, 2004).

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Estrógenos, como 17β-Estradiol, estão envolvidos no crescimento,

desenvolvimento e homeostase de muitos tecidos (CIOCCA; ROIG, 1995). Os

efeitos fisiológicos desses esteroides são mediados por um fator de transcrição

nuclear induzido por ligante, o receptor de estrógeno (ER) (TSAI; O’MALLEY,

1994). Dada a interação entre o ligante e o receptor, inicia-se uma série de

eventos moleculares que ativam ou suprimem genes alvo. A regulação da

transcrição se dá a partir da interação do ER com a maquinaria de transcrição

da célula.

A diminuição da produção de esteroides ovarianos no climatério está

associada a patologias no período pós-menopausa, principalmente

osteoporose e doenças coronarianas (MANOLAGAS; KOUSTENI; JILKA, 2002;

ROSS et al., 1990). A terapia de reposição hormonal é eficiente em reduzir os

riscos associados a essas patologias. No entanto, há um aumento no risco de

câncer de endométrio e de mama (COLDITZ et al., 1995).

Dados experimentais sugerem o papel dos estrógenos no

desenvolvimento do câncer de mama. Apesar dos mecanismos exatos não

serem completamente elucidados, associam-se a esses a alquilação de

moléculas celulares e formação de radicais livres que podem danificar o DNA

(NANDI; GUZMAN; YANG, 1995), ligadas à genotoxicidade do estrógeno e

alguns de seus metabólitos (YAGER; LIEHR, 1996). Os estrógenos, além de

promoverem câncer de glândulas mamárias em roedores, exerceram direta

(através da indução de proteínas envolvidas na síntese de ácido nucleicos e

ativação de oncogenes) e indiretamente (possivelmente através da estimulação

de secreção de prolactina e produção de fatores de crescimento) efeitos

proliferativos em culturas de células cancerígenas – de mama – de humanos

(LUPULESCU, 1993).

A formação do tumor de mama relaciona-se com a estimulação

hormonal excessiva do órgão, cujos crescimento e função encontram-se sob

controle endócrino. A resposta dos tecidos aos efeitos proliferativos do

hormônio pode progredir, passando o crescimento por estágios de

normalidade, hiperplasia e neoplasia. Outros fatores podem contribuir para a

variação de exposição ao estrógeno. Há relação entre peso e risco de câncer

de mama entre mulheres no período pós-menopausa. Mulheres obesas têm

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menores concentrações da globulina que transporta os hormônios sexuais

(SHBG) e, portanto, maiores concentrações de estrógeno biodisponível quando

comparadas a mulheres mais magras (POTISCHMAN et al., 1996). Além disso,

diferenças na dieta e quantidade de exercícios também podem influenciar a

exposição ao estrógeno. Estudos que relacionam risco de câncer de mama e

ingestão de álcool, gorduras, vitaminas antioxidantes e fibras apresentam

dados conflituosos (CADE; THOMAS; VAIL, 1998; HOLMES et al., 1999;

POTISCHMAN et al., 1999). A incidência de câncer de mama é mais baixa, por

exemplo, em regiões com dieta à base de soja, rica em fitoestrógenos, e

semente de linho, fonte de ligninas e ácido α-linoleico (BRZEZINSKI; DEBI,

1999). No entanto, não se pode determinar se esse efeito é resultado da

ingestão dos fitoestrógenos, das sementes de linho ou de outros fatores (WU et

al., 1998).

A terapia de reposição hormonal tem sido avaliada como fator de risco

para câncer de mama em mulheres no período pós-menopausa. O aumento do

risco encontra-se presente apenas durante a terapia ou por pouco tempo

depois de encerrada a mesma (CANCER, 1997; MAGNUSSON et al., 1999). E,

se a terapia for associação de estrógeno e progesterona, o risco aumenta, em

comparação à terapia baseada apenas na reposição de estrógeno. Apesar

disso, a mortalidade de forma geral entre essas mulheres é reduzida em virtude

da diminuição de mortes relacionadas a doenças cardiovasculares e

osteoporose (GRODSTEIN et al., 1997).

Uma variedade de compostos esteroidais e não-esteroidais que podem

interagir com o receptor de estrógeno foi desenvolvida a fim de ser utilizada

como tratamento para câncer de mama, disfunção uterina e outras desordens

do sistema reprodutor feminino (MIQUEL; GILBERT, 1988). Dentre essas

drogas, estão o tamoxifeno e raloxifeno, antagonistas do ER.

2.1.4 Receptor de Esteroide

Os receptores de hormônios esteroides são fatores de transcrição

intracelulares que existem na forma inativa de apoproteína no citoplasma ou no

núcleo. Após interação com ligante, os receptores passam por um processo de

ativação. O receptor ativado liga-se a um elemento de DNA (HRE, do inglês

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Hormone Response Element) e ativa a transcrição de um gene ligado a uma

região cis.

Os receptores de estrógeno fazem parte de uma superfamília capaz de

transformar sinais extracelulares, pequenas moléculas lipofílicas, em respostas

de transcrição (MOSSELMAN; POLMAN; DIJKEMA, 1996). Os efeitos

biológicos do 17β-estradiol são mediados por dois receptores distintos, ERα e

ERβ. Apesar de diferentes, esses receptores apresentam grande homologia em

algumas regiões: 97%, na região que se liga ao DNA; 60%, na região de

interação com o ligante (HALL; COUSE; KORACH, 2001). Enquanto o ERα é o

subtipo predominante expresso na mama, útero, cervix, vagina e outros órgãos;

o ERβ tem um padrão de expressão mais limitado e é detectado principalmente

em ovário, próstata, testículos, baço, pulmão, hipotálamo e timo (COUSE et al.,

1997).

O mecanismo clássico de ação do estrógeno é dependente de ligante.

Na ausência de hormônio, o receptor participa de um complexo multiproteico

inibitório dentro do núcleo das células. A interação com o ligante induz uma

mudança na conformação do ER, promovendo, assim, a homodimerização e

alta afinidade para ligar-se a elementos de resposta do DNA. Os receptores

ligados ao DNA recrutam a maquinaria de transcrição direta ou indiretamente,

através de proteínas cofatores (LANZ et al., 1999; MCKENNA; O’MALLEY,

2000; YANG et al., 1996). Outras rotas atualmente conhecidas influenciam o

funcionamento do ER como, por exemplo: diferentes conformações induzidas

por ligantes distintos, modificações do receptor por fosforilação e interações do

receptor com outros fatores de transcrição (MOSSELMAN; POLMAN;

DIJKEMA, 1996).

Ao longo dos anos, algumas alterações moleculares que refletem as

características biológicas dos carcinomas da mama invasivos foram

identificadas e consideradas marcadores moleculares, tais como os receptores

de estrogénio (ERs) (RIVENBARK; O'CONNOR; COLEMAN, 2013), expressos

em aproximadamente 75% dos tumores de mama invasivos (FLAGENG et al,

2015). Através de receptores nucleares (NR), há o controle da transcrição de

genes importantes para o desenvolvimento reprodutivo, neural, esquelético, de

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crescimento e de processos cardiovasculares (WALLACE et al, 2003; CLEGG

et al., 2005), transformando estes em importantes alvos de drogas.

Semelhante a outros receptores nucleares, os receptores de estrógeno

são caracterizados por apresentar um domínio variável trans N-terminal de

ativação, um domínio de ligação de DNA conservado (DBD), uma região de

dobradiça variável, um domínio de ligação ao ligante conservado (LBD), e um

domínio C-terminal variável (MANGELSDORF et al, 1995). A ligação ER-ligante

para o domínio de ligação (ER-LBD) é codificada dentro de uma região de

cerca de 300 aminoácidos e a sua arquitetura geral é constituída por hélices de

1 a 12 (H1-H12) e duas folhas-β (S1 e S2) (Figura 1). Ela possui a função de

reconhecimento de ligantes e a ativação da resposta fisiológica (FANG et al,

2003). Assim, após o acoplamento do ligante, há um rearranjo de LBD para o

estado ativo com uma mudança na posição da hélice 12. Logo depois, é

seguido por uma formação de dímeros (homo ou heterodímero) que

reconhecem sequências especificas de DNA com a ligação de diversos tipos

de co-ativadores ou co-repressores. Elas estão relacionadas com a ativação da

transcrição/repressão, a fim de mediar a transcrição de vários genes alvo

(AVIOR et al., 2013).

A família de receptores de estrógeno é composta pelo receptor de

estrógeno α (ERα) e o receptor de estrógeno β (ERβ), que são expressos por

uma ampla gama de tecidos e tipos celulares a partir de algum grau de

homologia em sequências (PAULMURUGAN et al., 2011). O ERα é codificado

pelo gene ESR1 no cromossomo 6 e foi encontrado predominantemente no

osso, testículos, epidídimo, próstata, útero, ovário, fígado, glândula mamária,

tecido adiposo, coração, cérebro e sistema vascular. O ERβ é codificado pelo

gene ESR2 no cromossomo 14 e está presente na bexiga, próstata, ovário,

cólon, tecido adiposo, sistema imunológico, coração, pulmão e cérebro

(NILSSON; KOEHLER; GUSTAFSSON, 2011). Em casos de neoplasias

mamárias, é comum ver uma diminuição da expressão de ERβ e um aumento

da resposta proliferativa associada à ativação do ERα (Rody et al, 2005).

Assim, muitos antagonistas/moduladores dos ERα têm sido desenvolvidos no

intuito de inverter a promoção do crescimento celular no câncer da mama,

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como, já bem estabelecido, o uso de moduladores seletivos do receptor de

estrógeno (SERMs).

Figura 1: Representação estrutural dos receptores de estrógeno-α no domínio LDB (ERα-LBD)

complexado com 4-hidroxitamoxifeno (PDB ID: 3ERT) (SHIAU, 1998). A esfera denota o bolsão de ligação de raio r.

2.1.5 Ligantes: Tamoxifeno e Raloxifeno (SERMs)

Como dito anteriormente, a ativação de transcrição dependente de

ligante por receptores nucleares é mediada por interações com co-fatores. O

grupo de agonistas do receptor promove a ligação desses co-fatores, enquanto

o dos antagonistas, bloqueiam tal ligação. Todos os ligantes interagem

exclusivamente com o domínio C-terminal (LDB, do inglês ligand-binding

domain) (TSAI; O’MALLEY, 1994). O LDB reconhece uma variedade de

compostos distintos em tamanho, forma e propriedades químicas.

Alguns ligantes funcionam como agonistas puros (17β-estradiol, por

exemplo); uns como antagonistas puros; e outros como antagonistas ou

agonistas a depender do tecido-alvo (SMIGEL, 1998). Nesse último grupo,

conhecido como moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs, do

inglês Selective Estrogen Receptor Modulators), estão o tamoxifeno e o

raloxifeno (GRESE et al., 1997). O tamoxifeno é um SERM não-esteroidal

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antineoplásico que inibe competitivamente a ligação do estradiol ao ER,

evitando, portanto, que o receptor interaja com o elemento de resposta ao

estrógeno no DNA. Isso resulta na diminuição da resposta ao estrógeno. Além

disso, essa droga regula positivamente a produção do fator de crescimento

TGF-β, um inibidor do crescimento de célula tumoral, e regula negativamente o

fator de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1), estimulante do

crescimento celular no câncer de mama. O raloxifeno faz parte da segunda

geração de SERMs. Assim como o tamoxifeno, esse composto tem atividade

estrogênica e antiestrogênica, dependendo do tecido no qual atua. Nos ossos,

por exemplo, seu efeito é similar ao do estrógeno, reduzindo a reabsorção

óssea e aumentando a densidade mineral. (BRYANT et al., 1999;

MANOLAGAS; KOUSTENI; JILKA, 2002). Por outro lado, no endométrio e nas

mamas, age como antagonista, exercendo papel importante na redução do

risco de câncer invasivo (BRZOZOWSKI et al., 1997; GRESE et al., 1997).

O tamoxifeno é usado no tratamento de câncer de mama desde a

década de 1970. Depois de ter sua eficácia comprovada para estágios mais

avançados, passou a ser adotado como adjuvante no tratamento de câncer de

mama primário operável, tornando-se o método mais utilizado nos casos desse

tipo de neoplasia. Apesar dessa droga demonstrar benefícios no tratamento de

todos os estágios de câncer de mama, vários efeitos adversos foram

reportados (CAULEY et al., 2001; MOURIDSEN et al., 1978; POWLES, 1992).

Dentre as vantagens do uso do tamoxifeno, também estão a alteração no

metabolismo de lipídios e lipoproteína, reduzindo o risco de doenças

coronarianas, e os efeitos benéficos na prevenção osteoporose. No entanto,

insere-se como desvantagem do seu uso, o aumento a incidência de câncer de

endométrio. O uso dessa medicação sinaliza um risco relativo 6,4 vezes maior

para mulheres que receberam 40mg/dia por, no mínimo, 2 anos quando

comparadas às que não fizeram uso da droga (FORNANDER et al., 1989).

Outros estudos sugerem riscos aumentados em 2 a 3 vezes, para dois anos de

uso, e em 3 vezes, para uso acima de cinco anos (VAN LEEUWEN et al.,

1994). Esse fato pode ser explicado pela natureza parcialmente agonista do

tamoxifeno no endométrio (COHEN, 2004; GOTTARDIS et al., 1988). Alguns

trabalhos sugerem que seu efeito estrogênico, especialmente o proliferativo no

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endométrio, parece estar relacionado à dose, enquanto outros não encontram

tal relação (VAN LEEUWEN et al., 1994).

Estudos sugerem que tanto o tamoxifeno quanto o raloxifeno são

equivalentes em eficácia na diminuição do risco de câncer de mama invasivo.

No caso de câncer endometrial, demonstrou-se que o raloxifeno não

aumentava os riscos quando comparado a placebos (CAULEY et al., 2001;

MARTINO et al., 2004). No entanto, existe diferença quando se compara os

riscos de câncer endometrial a partir do uso de tamoxifeno e raloxifeno, tendo

este último uma taxa de 38% mais baixa que o primeiro. Além disso, o

raloxifeno também foi associado a menores riscos de eventos tromboembólicos

e catarata (VOGEL et al., 2006). CYP

2.2 Bioquímica Computacional

A bioquímica computacional, consiste num conjunto de ferramentas que

utiliza várias ciências (física, química, biologia, matemática, estatística), com o

intuito de analisar, simular e interpretar dados de sistemas biológicos

complexos fundamentais para a resolução de problemas bioquímicos. Por meio

de softwares que realizam cálculos baseados nas equações da física clássica e

quântica, procura-se investigar a representação das estruturas moleculares,

assim como a simulação de seu perfil em um ambiente fisiológico, de modo a

fornecer informações sobre sua geometria (comprimentos de ligação, ângulos

de ligação, ângulos de torção), energia (calor de formação, energia de

ativação), propriedades eletrônicas (momento de dipolo, potencial de ionização,

afinidade eletrônica), e propriedades espectroscópicas (modo de vibração),

entre outras (volume, área de superfície, difusão, viscosidade) (VERLI;

BARREIRO, 2005; MATTA, 2010).

A análise de interações entre proteínas e seus ligantes é uma das

grandes abordagens da bioquímica computacional. Logo, detectar possíveis

sítios e quantificar a energia de interação entre fármacos e suas proteínas alvo,

são uma das abordagens nas quais o estudo bioquímico computacional pode

proporcionar relevante contribuição, visto que se pode através dele, por

exemplo, compreender fenômenos biológicos e discernir o planejamento de

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novas drogas farmacológicas (VERLI; BARREIRO, 2005). Neste sentido, a

análise estrutural dá agilidade ao processo de descobrimento de fármacos por

intermédio da utilização de estruturas tridimensionais obtidas por técnicas de

difração de raios-X, ressonância magnética nuclear ou geradas por modelagem

molecular (MATTA, 2010; ZHOU, 2010; HENNIG; SATTLER, 2014).

As técnicas de modelagem molecular podem ser classificadas em três

categorias principais: ab initio, métodos semi-empíricos e mecânica molecular.

Destaca-se neste trabalho a utilização de métodos ab initio.

2.2.1 Métodos ab initio

Os métodos ab initio são os mais precisos e consistentes, visto que

fornecem a melhor aproximação matemática do sistema a ser estudado. O

termo ab initio (do latim, a partir do início, ou seja, dos primeiros princípios)

sugere que os cálculos são baseados somente em leis da mecânica quântica,

massas e cargas dos elétrons e dos núcleos atômicos, e valores das

constantes da física fundamental, tais como velocidade da luz e constante de

Planck, e não contém aproximações. Esses métodos têm como objetivo

resolver a equação de Schrödinger para o sistema, gerando dados de energia

e função de onda. No entanto, a equação de Schrödinger não pode ser

resolvida de forma exata para moléculas com mais de um elétron. Portanto,

são utilizadas aproximações, na forma de funcional, no intuito de possibilitar e

facilitar os cálculos (LEWARS, 2011).

Hartree-Fock (HF) é o método mais comum, fornecendo uma boa

aproximação da equação de Schrodinger independente do tempo para um

sistema de muitos elétrons. Neste método não se considera a repulsão elétron-

elétron associada (correlação eletrônica), sendo seu efeito líquido incluído no

cálculo como uma interação média do sistema, isto é, como se os elétrons se

movimentassem independentemente uns dos outros. Portanto, a eficiência e a

simplicidade desse método conduzem a uma pobre performance para sistemas

de relevância para a química bioinorgânica. Então, o HF é atualmente utilizado

apenas como ponto de partida para métodos ab initio posteriores, mais

elaborados. Tais métodos fornecem formas diferentes de recuperar a

correlação perdida pelo HF e aproximam-se à função de onda exata (VREVEN

et al., 2003).

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Com o desenvolvimento de métodos baseados na densidade eletrônica,

como a Teoria do Funcional da Densidade (DFT) (HOHENBERG; KOHN,

1964), associado ao aumento do poder computacional das últimas décadas, a

análise de sistemas biológicos mais complexos tornou-se viável. Nesse

método, os cálculos podem ser quânticos ou pela combinação destes com

métodos de mecânica molecular, formando métodos híbridos, conhecidos

como quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) (SENN; THIEL,

2007; VREVEN et al., 2003).

2.2.2 Teoria do Funcional da Densidade

A Teoria do Funcional da Densidade (DFT) teve sua aplicação

aumentada para sistemas biológicos. Avanços na metodologia evoluíram ao

ponto no qual propriedades, desde razoáveis a de alta qualidade, podem ser

obtidas. A DFT emergiu como uma alternativa aos tradicionais métodos ab

initio padrões, já que demanda menor poder computacional e apresenta

resultados mais rapidamente (CUSTODIO; MORGON, 1995).

A DFT tenta solucionar a ineficiência do método HF e alto custo

computacional dos métodos posteriores ao HF a partir da substituição da

função de onda pela densidade eletrônica como base para descrição de

sistemas multieletrônicos (KOCH; HOLTHAUSEN, 2001). Enquanto a função

de onda para um sistema de N elétrons depende de 3N variáveis (três variáveis

espaciais para cada elétron), a densidade do mesmo sistema é dada por uma

função única com três variáveis e, portanto, mais simples tanto do ponto de

vista prático quanto conceitual. A DFT moderna sustenta-se em dois teoremas

propostos por HOHENBERG e KOHN (1964).

O primeiro teorema afirma que a densidade eletrônica do estado

fundamental determina a função de onda eletrônica de um sistema e,

consequentemente, todas as propriedades desse estado para tal sistema. O

segundo teorema estabelece que a energia de uma distribuição eletrônica pode

ser descrita em função da densidade eletrônica, sendo essa função mínima

para a densidade do estado fundamental (HOHENBERG; KOHN, 1964).

No entanto, apesar de estabelecerem teoricamente as relações entre

a densidade eletrônica e energia do sistema, esses teoremas não

materializaram a forma para calculá-las. Dessa forma, na prática, o uso da DFT

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deve-se à abordagem de Kohn e Sham (KS). O método KS é uma variante

operacional do HF baseado na construção de um sistema inerte, sem

interações, com a mesma densidade do original para o problema. Sistemas

inertes são relativamente mais fáceis de resolver, já que a função de onda

pode ser representada pelo determinante de Slater dos orbitais, nesse caso,

chamado de determinante de Kohn-Sham. Assim, o funcional da energia

cinética é conhecido fidedignamente, mas a energia de troca-correlação

permanece desconhecida (KOHN; SHAM, 1965).

2.2.3 Energia de Troca-correlação

A energia troca-correlação está associada a interações entre elétrons

(de spins iguais e opostos). O uso da DFT apresenta um importante problema:

os funcionais exatos para troca e correlação não são conhecidos, exceto para

gás de elétron livre. Entretanto, algumas aproximações permitem o cálculo de

propriedades moleculares com diversos níveis de acurácia. Os funcionais de

aproximações mais comuns são: densidade local (LDA, do inglês Local Density

Approximation) e gradiente generalizado (GGA, Generalized Gradient

Approximation) (PERDEW; BURKE; ERNZERHOF, 1996; BECKE, 1988; LEE

et al., 1988).

O funcional de aproximação mais fundamental e simples é o LDA, no qual

a energia depende apenas da densidade da região avaliada. O LDA considera

a energia de troca-correlação de um sistema como sendo a mesma de um gás

de elétrons uniformes de igual densidade, que é conhecida de forma precisa.

Seu sucesso na química é considerado, na melhor das hipóteses, moderado

em virtude da forte tendência a superestimar, de forma assistemática, os

valores de energia e o comprimento de ligações. Já o GGA representa um

avanço em relação ao LDA, uma vez que incorpora a dependência tanto da

densidade eletrônica quanto de seu gradiente, sendo, portanto, capaz de

melhor descrever a natureza não homogênea das densidades moleculares. Os

representantes dessa classe variam em acurácia para determinadas

propriedades. Os BP86 e PBE, por exemplo, apresentam bons resultados

particularmente para parâmetros estruturais, mas frequentemente menos

precisos para outras propriedades. Atualmente, o híbrido B3LYP, mistura de

GGA com troca Hartree-Fock, tornou-se escolha dominante quando se trata de

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moléculas que contêm metais de transição. Esse método tem demonstrado boa

performance para uma grande variedade de sistemas e propriedades químicas

apesar das limitações específicas e algumas falhas identificadas (PERDEW;

BURKE; ERNZERHOF, 1996).

O uso de funcionais GGA melhorou consideravelmente a descrição de

ligações, principalmente de ligações de hidrogênios, sem que essa melhora

significasse uma demanda computacional proibitiva. Entretanto, ainda falha na

descrição de ligações fracas como, por exemplo, interações de Van der Waals,

nesses casos são necessários métodos de correções (KLIMES et al., 2010).

2.2.4 Fracionamento Molecular com Caps Conjugados (MFCC)

Em virtude do grande número de átomos, cálculos completos baseados

em mecânica quântica tornavam-se inviáveis para analisar energias de

interação em sistemas proteicos. Então, métodos que facilitassem o estudo de

sistemas biológicos foram desenvolvidos. Inicialmente, métodos clássicos de

mecânica molecular eram usados para moléculas biológicas. Vias alternativas

surgiram com a abordagem de métodos híbridos (AMARA et al., 2000), nos

quais se combinam mecânica quântica (para pequenos subsistemas) e

molecular (campos de força para a maior parte do sistema). Outra forma é a

divisão de grandes sistemas em subsistemas menores (TITMUSS et al., 2000;

YANG, 1991).

O MFCC pode fornecer cálculos ab initio eficientes para energia de

interação entre uma proteína e uma dada estrutura ou molécula, como uma

droga por exemplo. A ideia central desse método consiste em dividir a energia

de interação (entre uma molécula relativamente pequena e uma proteína) em

pequenas somas de interação que possam ser facilmente calculadas via ab

initio. O sistema estudado é fracionado em subsistemas menores, mantendo-se

as propriedades eletrônicas e estruturais do sistema original. Assim, esses

fragmentos menores podem ser tratados com métodos quânticos de alta

acurácia (ZHANG; ZHANG, 2003).

No método MFCC, a proteína é decomposta em fragmentos menores

baseados em aminoácidos. A fim de conservar as propriedades eletrônicas dos

resíduos analisados, alguns vizinhos (chamados de caps) e suas respectivas

ligações peptídicas são mantidos no sistema, bem como pontes dissulfeto, se

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necessário. Dessa forma, a energia de interação entre a proteína e a molécula

pode ser inferida a partir de combinações sutis das energias de interação entre

os pequenos fragmentos a molécula em questão. Além disso, pode-se também

determinar o perfil de contribuição energética individual dos resíduos avaliados.

2.3 Objetivos

2.3.1 Objetivos Gerais

O objetivo geral deste trabalho é utilizar técnicas de bioquímica

computacional, dentro da teoria do funcional da densidade (DFT), com o intuito

de apresentar uma descrição adequada da interação entre 4-hidroxitamoxifeno

(OHT), um metabólito ativo do tamoxifeno com alta afinidade para ER, e

raloxifeno (RAL), um SERM amplamente utilizado no tratamento e prevenção

da osteoporose e câncer de mama, co-cristalizados com o receptor do

estrógeno (ERα).

2.3.2 Objetivos Específicos

Quantificar, através de cálculos computacionais, as energias individuais

de cada aminoácido em interação com os OHT e RAL e o ERα.

Avaliar as diferenças existentes entre os resultados energéticos obtidos

para cada ligante.

Identificar, a partir das diferenças energéticas entre os ligantes

analisados, as regiões mais importantes de cada um.

Realizar um comparativo entre os valores energéticos encontrados neste

trabalho e os dados experimentais de relevância para cada aminoácido

e para a resposta biológica de cada ligante.

2.4 Materiais e Métodos

Nesse capítulo abordaremos as diretrizes metodológicas e os aspectos

computacionais relacionados à descrição das interações entre 4-

hidroxitamoxifeno (OHT) e raloxifeno (RAL) com o receptor do estrógeno alfa

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(ERα). A estrutura utilizada como modelo foi ajustada e as energias de

interação entre os resíduos componentes do ERα e seus ligantes foram

determinadas com base na Teoria do funcional da Densidade (DFT) a partir da

técnica de Fracionamento Molecular com caps Conjugados (MFCC).

2.4.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica

A estrutura cristalográfica utilizada como input para a realização dos

cálculos do estudo in silico foi obtida a partir do banco de dados Research

Collaboratory for Structural Bioinformatics - Protein Data Bank (RCSB/PDB).

Este repositório contém informações sobre estruturas 3D de moléculas

biológicas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos. Com base nos modelos

tridimensionais de complexos ligante-receptor construídos por técnicas como a

difração por raio-X e Ressonância Magnética Nuclear, e depositados no banco

de dados PDB, é possível descrever qualitativamente e quantitativamente seus

respectivos sítios de interação a partir da modelagem molecular. Desta forma,

podemos investigar os aspectos energéticos e as características estruturais

que permitem uma ligação adequada do ligante ao seu receptor. (FERREIRA;

YAMANAKA, 2006).

Os modelos cristalográficos escolhidos estão identificados no PDB pelos

códigos 3ERT e 1ERR. O primeiro refere-se ao receptor humano de estrógeno

alfa (ERα) co-cristalizado ao 4-hidroxitamoxifeno apresentando resolução de

1.90 Å. Já a estrutura 1ERR denota o ERα co-cristalizado com raloxifeno com

resolução de 2.60 Å.

A determinação da estrutura do cristal envolve a descrição da disposição

no espaço de todas as entidades químicas existentes na amostra, assim para a

prescrição dos cristais 3ERT e 1ERR foi utilizada a técnica de difração por raio-

X. Esta técnica permite a exploração do efeito da interação radiação-matéria,

em um contexto de influência elástica entre elementos com dimensões

espaciais semelhantes, com a produção de inúmeros elementos de

interferência em determinadas posições do espaço (MASSA, 2004).

2.4.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização das Estruturas

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O estado de protonação de todos os ligantes em pH fisiológico foi obtido

utilizando o software de Marvin Sketch versão 5.3.2 (Marvin Beans Suite –

ChemAxon).

Estruturas obtidas por análises cristalográficas, frequentemente,

apresentam ausência dos átomos de hidrogênio, visto que, os mesmos

conferem densidade eletrônica mínima e apenas cristais com resolução

menores que 1.20 Å oferecem estrutura para a visualização dos átomos de

hidrogênio. Logo, fez-se necessário adicionar átomos de hidrogênio às

estruturas. Dessa forma, todos os átomos presentes nas estruturas

cristalográficas foram fixados, em seguida os átomos de hidrogênio foram

adicionados e os sistemas foram submetidos a uma otimização clássica para o

ajuste dos átomos livres. Esta otimização foi realizada no software Discovery

Studio sob os parâmetros de cálculo do campo de força CHARMm (Chemistry

at Harrvard Molecular Mechanics), sendo este parametrizado para todos os

átomos, porém com maior especialização para moléculas orgânicas em geral

(MOMANY; RONE, 1992).

2.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional

Os cálculos energéticos para determinação das energias de interação

entre os SERMs e os resíduos de aminoácidos da proteína ERα foram

realizados utilizando-se a técnica do MFCC. Este método permite cálculos

envolvendo proteínas, DNA e outras macromoléculas biológicas, visando

fornecer informações precisas a respeito das energias de interação

moleculares (ZHANG; ZHANG, 2003; ZHANG; ZHANG, 2005; GORDON et al.,

2011).

O estudo de convergência da energia total interação como uma função

do raio (r) no sítio de ligação ao ligante foi realizado usando-se um raio r a fim

de colocar um limite no número de resíduos de aminoácido a serem

analisados, porém sem perder interações importantes (COSTA et al, 2012). Ao

fazer isso, adicionou-se a energia de interação individual dos resíduos de

aminoácidos dentro de esferas imaginárias no sítio com o raio r centrado no

ligante. Considerando r = n/2 (em que n = 1, 2, 3, 4, ...), alcançaremos a

convergência do raio de ligação, quando a variação de energia no raio

subsequente for menor do que 10% (WU et al., 2007).

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Neste trabalho, determinou-se a molécula do ligante como L e o resíduo

de aminoácido que interage com o ligante como Ri. O cap Ci-1 (Ci+1) é formado

a partir dos resíduos vizinhos covalentemente delimitados pelo grupo amina

(carboxila) do resíduo Ri ao longo da cadeia de proteína. Para completar,

empregou-se a mesma linha de investigação realizada por LIMA NETO et al.

(2015), em que os cinco fragmentos de aminoácidos mais próximos de cada

lado do resíduo Ri foram usados para construir o cap Ci-1 e Ci+1, proporcionando

uma melhor descrição do ambiente eletrônico. Para estas estruturas

fragmentadas, a energia de interação entre o ligante e os fragmentos

individuais, EI (L - Ri), é calculado de acordo com a seguinte equação:

EI (L – Ri) = E (L + C1-i Ri Ci+1) – E (C1-i Ri Ci+1) – E (L + C1-i Ci+1) + E (C1-i Ci+1),

Eq.(1)

onde o primeiro termo da equação E (L + C1-i Ri Ci+1) é a energia total do

sistema formado pelo ligante e os resíduos com seus caps. O segundo termo

E (C1-i Ri Ci+1) refere-se a energia total do resíduo com seus caps. Já o terceiro

termo da equação E (L + C1-i Ci+1) denota o ligante e os caps do resíduo, por

fim, o último termo E (C1-i Ci+1) corresponde apenas aos caps. A energia total

de interação do RAL e OHT é obtida somando-se as energias de interação com

cada resíduo de aminoácido dentro de um determinado raio no sítio de ligação.

As moléculas de água existentes na estrutura cristalográfica foram levadas em

consideração durante os cálculos, desde que, apresentassem ligações de

hidrogênio formados com resíduos de interesse ou com algum cap. Neste caso,

foi definido um limite de comprimento para as ligações de hidrogênio de 2.5 Å.

Para o cálculo energético de cada resíduo no local de ligação, utilizou-se

o Dmol3 incluso no software Materials Studio, fazendo uso da Aproximação do

Gradiente Generalizado (GGA) através do funcional PBE como potencial de

troca e correlação (PERDEW, BURKE, ERNZERHOF, 1996). Para realizar os

nossos cálculos das energias de interação do OHT e RAL-ERα, utilizamos o

método DFT + D seguindo o esquema GGA-PBE-Grimme juntamente com uma

base de precisão numérica dupla mais polarização (DNP), para expansão das

funções de onda de Kohn-Sham. Levando todos os elétrons em consideração

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explicitamente com spin irrestrito. DELEY (1999), INADA e ORITA (2008)

apontam para uma elevada precisão e um erro de sobreposição de base

(BSSE) praticamente irrelevante desse conjunto de base. O DNP é comparável

ao conjunto de base gaussiano 6-311+G (3df,2pd), que tem um vasto conjunto

de funções de polarização e uma eficaz correlação eletrônica (INADA; ORITA,

2008; DELLEY, 1990). O raio de corte orbital foi ajustado em 3.7 Å e o limiar

de convergência do campo autoconsistente (SCF) ajustado para uma variação

de energia de até 10-6 Ha.

2.5 Resultados e Discussões

Embora os primeiros SERMs tenham sido identificados há mais de 60

anos, sua base molecular só começou a ser desvendada nos últimos 25 anos

(Wardell et al., 2004). Recentemente, estudos cristalográficos e computacionais

revelaram que a natureza do ligante é um determinante crítico para sua ação

nos receptores de estrógeno (KATZENELLENBOGEN et al., 2001; WARDELL

et al., 2004). Logo, um cenário de energia de ligação que perfaz os complexos

entre 4-hidroxitamoxifeno/raloxifeno e receptores de estrógeno ERα é um

passo crucial para o entendimento das bases moleculares e conformacionais

que regem essas estruturas. Ambos os ligantes são subdivididos em quatro

regiões, como representado na Figura 2a, a fim de facilitar análises posteriores.

A fim de esclarecer como os elétrons são distribuídos em torno das moléculas,

a figura 2b apresenta a isosuperfície de densidade de elétrons para o OHT e

RAL.

Todos os cálculos foram realizados a partir da estrutura cristalográfica

do receptor de estrógeno alfa (ERα) co-cristalizado com 4-hidroxitamoxifeno

(OHT) e raloxifeno (RAL), que estão depositados no Protein Data Bank (PDB

ID: 3ERT e 1ERR, respectivamente) (SHIAU et al., 1998, BRZOZOWSKI et al.,

1997). Como relatado anteriormente, as energias de ligação entre o ERα e dois

de seus antagonistas, 4-hidroxitamoxifeno (OHT) e raloxifeno (RAL), foram

calculadas empregando o método MFCC para obter a contribuição individual

dos resíduos de aminoácidos dentro de um sítio de ligação com um raio

selecionado, classificadas a partir das interações mais relevantes, uma vez que

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a determinação das características do ligante quanto à afinidade ao ERα é de

grande importância para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.

Figura 2: Representação do OHT e RAL em pH fisiológico e distribuição da densidade eletrônica. (a) Estrutura química subdividida em quatro partes para auxiliar a análise das suas interações com Erα; (b) densidade de eletrônica projetada sobre um potencial eletrostát ico de

isosuperfície mostrando regiões negativa e positivamente carregadas destacadas com as cores vermelha e azul, respectivamente.

A energia de ligação para cada raio do sítio de ligação total foi obtida

somando-se as respectivas contribuições individuais através do estudo de

convergência. Para levar em consideração a interação atrativa ou repulsiva de

cada resíduo de aminoácido significante, realizamos uma pesquisa para um

raio de sítio de ligação ideal para a qual nenhuma variação significante na

energia de ligação total pode ser observada depois de um aumento do raio. A

figura 3 apresenta uma comparação entre a energia total calculada das

interações E (r) para o OHT e RAL como uma função do raio r para o sítio de

ligação, indicando que a convergência é de cerca de 15.0 Å, compreendendo

um total de 138 e 145 aminoácidos, respectivamente. Nota-se que a energia de

interação segue a ordem OHT> RAL para cada um dos raios r = 4.0; 6.0; 11.5;

13.0 e 15.0 Å (-184,470 kcal/mol > -154,410 kcal/mol, -164,760 kcal/mol > -

121,360 kcal/mol, -282,170 kcal/mol > -250,220 kcal/mol, -360,420 kcal/mol > -

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333,640 kcal/mol, -346,230 kcal/mol > -327,750 kcal/mol, respectivamente).

Estes resultados estão de acordo com os dados experimentais obtidos por

CLEGG et al., (2005) e KUIPER et al., (1998), que indicaram uma maior

afinidade do OHT ao receptor.

Figura 3: Energia de interação total dos SERMs OHT e RAL considerando o raio r = 4.0 Å, 6.0 Å, 11.5 Å, 13.0 Å e 15.0 Å, a partir do cálculo utilizando GGA-PBE-Grimme como funcional de troca e correlação. O valor absoluto de E (r) obedece a sequência OHT > RAL reproduzindo

dados experimentais (CLEGG et al.,2005; KUIPER et al.,1998).

As Figuras 4a e 4b mostram um painel gráfico BIRD (Binding site,

Interaction energy and Residues Domain) com as energias de interação entre o

OHT e RAL e os resíduos de aminoácido mais importantes na região de

ligação. O painel descreve basicamente três itens: (1) a energia de interação

(em kcal/ mol) do resíduo com os ligantes ilustrado pelas barras horizontais,

atribuindo, quantitativamente, o papel de cada resíduo no local de ligação, bem

como sua efetividade; (2) no lado esquerdo do gráfico, os resíduos mais

importantes que contribuem para a ligação; (3) a região (identificadas na figura

4 por letras em negrito) e os átomos dos ligantes mais próximos de cada

resíduo no local de ligação.

Como pode-se verificar na figura 4, o padrão de interação parece ser

mais simples para OHT do que para RAL. No complexo OHT-ERα, as

interações atrativas são predominantes, mas também observamos algumas

repulsivas. Os resíduos que se ligam de forma significativa são D351, E542,

E353, D538, E423, C381, T347, M388, M543, M396, M427, M357, M343, L525,

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L346, I424, F404, H524, R394, R352 e K529, sendo os quatro últimos de uma

forma repulsiva. Para o complexo RAL-ERα, as interações repulsivas aparecem

com maior frequência quando comparadas com as interações de OHT. Seus

principais resíduos são D351, E542, D358, E423, E353, F404, T347, M343,

L346, L525, H524, I424, R394, R335, M543, M388, M396, M427, M357, C381 e

R352, sendo os nove últimos de forma repulsiva. A diferença de energias

atrativas e repulsivas quanto à proporção entre OHT e RAL pode sugerir que a

primeira droga se liga mais fortemente em seu sítio de ligação do que a

segunda, quando se considera a energia total dos sistemas.

Estruturas cristalográficas de raios-x obtidos por SHIAU et al. (1998) e

BRZOZOWSKI et al. (1997) fazem uma representação do complexo estrutural

em que os agonistas e antagonistas ocupam o mesmo local de ligação ER-

LBD. A partir destes, denotamos que a ligação de OHT e RAL é guiada pelo

seu anel fenólico (Figura 2a, região i), bem como pelo lado volumoso da

cadeia, o qual é envolvido pelo núcleo hidrofóbico do LBD. No entanto, apesar

de compartilhar o mesmo local de ligação, agonistas e antagonistas trazem

diferentes rearranjos com o receptor, estes rearranjos estão relacionados com

a ativação ou inibição da sua atividade de transcrição.

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Figura 4: Painel gráfico BIRD que mostra os resíduos mais relevantes da Erα que contribuem

para a ligação de cada ligante: (a) OHT e (b) RAL.

Ainda como demonstrado pelas estruturas cristalográficas, quando o

receptor de estrógeno está ligado a antagonistas, tal como OHT e RAL, existe

uma reorganização de algumas hélices seguida por um movimento da hélice 12

para a fenda de ligação ao co-ativador, formada pelos resíduos de hélices 3, 4,

e 5. Este, por sua vez, leva o receptor para um estado desativado mimetizando

a hélice de ligação ao co-ativador, criando, deste modo, uma deficiência para a

sua fixação (SHIAU et al., 1998). Desta forma, para compreender as diferenças

entre os complexos OHT/RAL-ERα é importante notar as características

distintas de ligação entre esses ligantes.

Cada uma das quatro regiões (i, ii, iii e iv) do OHT e RAL interage com

pelo menos um aminoácido no raio do sítio (15.0 Å). De acordo com a soma

dos valores na Tabela 1, as regiões (i) e (iv) do OHT são as principais regiões

em termos energéticos, respectivamente, enquanto as regiões (i) e (ii) são as

principais em número de interações com ERα. Além disso, como se pode notar

a partir da Tabela 2, as somas das energias nas regiões (i) e (iv) do RAL

ocupam a primeira e segunda posições, respectivamente, possuindo também

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maiores números de interações, reforçando a importância destas regiões no

reconhecimento das atividades desses SERMs, como apresentado por SHI et

al. (2001) e KOMM et al., (2014).

As regiões (iv) do OHT e do RAL são constituídas por um nitrogênio

carregado positivamente, que é estabilizado por D351 juntamente com alguns

contatos hidrofóbicos. No cálculo realizado neste trabalho, D351 é o resíduo

com a contribuição mais intensa de energia de ligação para ambos os ligantes,

com energias de interação de -62,92 kcal/mol (OHT) e -91,55 kcal/mol (RAL)

(ver Figura 4). Como observado nas figuras 5 e 6, o que provoca a atração dos

ligantes é uma ponte salina entre a sua cadeia lateral carboxilato e a região (iv)

N24 (N26)H do OHT (RAL), com uma distância de 3.40 Å (1.70 Å). Análises

cristalográficas e a análises computacionais de mutação mostraram que a sua

posição está correlacionada com a entrada da hélice 12 (H12) na forma ativa

ou inativa quando ERα está associado com agonistas ou antagonistas,

respectivamente (JORDAN et al., 1999; WATANABE et al., 2014).

A segunda maior energia de ligação para os OHT e RAL (-44,26 e -47,04

kcal/mol, respectivamente) pertence ao resíduo E542, o qual apresenta

diferentes posições em OHT e no RAL quanto à distribuição do raio (12.5 Å e

9.0 Å, respectivamente), mas está próximo da região (iv), como representado

na figura 4. Ele é seguido pelo resíduo D538 exibindo a terceira maior energia

de ligação, mostrando -39,05 e -42,72 kcal/mol para OHT e RAL,

respectivamente. Note-se que os E542 e D538 são resíduos altamente

conservados que ocupam a hélice 12 (H12) e criam uma área carregada

negativamente para co-ativadores sendo, portanto, resíduos importantes na

ativação ou inibição do ERα (SHIAU et al.,1998; WATANABE et al., 2014).

Um anel fenólico de estrógeno é compartilhado por muitos moduladores

seletivos do receptor de estrógeno (WALLACE, et al., 2003; FANG et al, 2001).

Observa-se a formação de ligações de hidrogênio deste com o grupo

carboxilato do E353 (H3), o grupo guanidina do R394 (H6) e uma molécula de

água conservada entre os resíduos E353 e R394 (FANG et al.,2003; SHIAU et

al,1998; BRZOZOWSKI et al., 1997; FUKUZAWA et al, 2006). Como se pode

ver a partir das figuras 5 e 6, E353 e R394 interagem de uma forma muito

semelhante com os dois SERMs através deste grupo hidroxilo fenólico (região

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47

i). É confirmado pelos cálculos de energias de ligações realizadas entre OHT e

RAL, respectivamente, que ambos estão próximos um do outro (ver figura 4),

com 17.25 (2.08 Å) e 21,54 (2.05 Å) kcal/mol para R394 e -38,06 (1.67 Å) e -

35,35 (1.67 Å) kcal/mol para E353 (quarta energia de interação mais atrativa).

Nos nossos cálculos, a molécula de água conservada foi ligada ao resíduo

mais próximo: R394 para o complexo OHT- ERα e para o resíduo E353 no

sistema RAL-Erα. Devido a diferença na quantidade de moléculas de água

cristalográficas, nomeou-se W2 no primeiro complexo e W3 no segundo. Em

ambos os casos, esta água é responsável pela formação de uma ligação de

hidrogênio mediada pela água, juntamente com a ligação de hidrogênio direta

formada pelos aminoácidos com os ligantes. Além da ligação de hidrogênio, os

resultados energéticos acima apresentam um efeito eletrostático na região

carregada (iv), sendo predominante em ambos os casos. Assim, mesmo

havendo ligações de hidrogênio com o mesmo grupo molecular, encontrou-se

energias de ligação opostas. O E423 (H8) é o quinto resíduo com energia de

ligação mais intensa, com valores de -31,98 e -39,25 kcal/mol, e raio em 7.5 Å

e 5.5 Å para os SERMs OHT e RAL, respectivamente.

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Tabela 1- Energias de interação para OHT.

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Tabela 2- Energias de interação para RAL.

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Uma das discussões biologicamente mais tradicionais e importantes da

bioquímica quântica, e que não é totalmente compreendida até agora, é a

natureza física de mutações pontuais espontâneas. Uma causa plausível

destas mutações é a chamada rara tautomeria decorrente da transferência de

prótons (PT) por reações entre a arquitetura de pares de bases da dupla hélice

do DNA, proposto por LÖWDIN em 1963. Mutações experimentais de H524

foram encontradas reduzindo a ligação ao estrógeno (HERYNK, M.H; FUQUA,

S.A., 2004), sendo este aminoácido correlacionado por FUKUZAWA et al. em

2006, como o ponto principal para a ligação de hidrogênio com os ligantes.

Desse modo, a figura 5a mostra H524 (H11) fazendo uma ligação de

hidrogênio com o grupo hidroxila da região (ii) do RAL, imitando (não imitando)

a ligação com estradiol (OHT) (BRZOZOWSKI et al., 1997). Assim, a perda

desta ligação aparece em nossos resultados energéticos através do aumento

(diminuição) da energia (distância) de 0,06 para -4,08 kcal/mol (de 2.5 Å para

2.0 Å), entre OHT e RAL. Além disso, os resíduos de L525 (-6,52 e -4,79

kcal/mol), W383 (-5,52 e -8,70 kcal/mol) e P404 (-2,83 e -8,52 kcal/mol) estão

envolvidos (não envolvidos) em uma interação π-sigma com RAL (OHT) nas

regiões (i), (iii) e (iv). Eles fazem parte da hélice 11 (H11), hélice 5 (H5) e a

folha-ß 1 (S1), sendo muito importantes na estabilização dos ligantes no sítio

de ligação, ao passo que mutações experimentais estão relacionadas com a

redução da ligação entre os ligantes (BRZOZOWSKI, 1997; SHIAU,1998;

HERYNK, 2004; FUKUZAWA, 2006). É importante notar também o papel

desempenhado pelos resíduos metionina (M343 (H3), M388 (H6), M357 (H3),

M427 (H8), M543 (H12), M396 (H6)) e cisteína (C381 (H5)) que estão entre os

resíduos mais relevantes em nossos cálculos. No entanto, como podemos ver

na figura 4, eles mostram um comportamento energético oposto, com uma

energia de ligação atraente (repulsiva) para OHT (RAL), exceto o M343.

No contexto geral, nota-se que entre os aminoácidos analisados neste

trabalho os resultados mostram que as energias mais fortemente atrativas para

ambas as drogas segue a sequência decrescente D351 > E542 > D538 > E353

> E423, sugerindo suas importâncias para a interação entre o ligante e o

receptor. Exceto para o E423, todos estes aminoácidos, por análises de

mutação e cristalográfica, são relevantes para o reconhecimento dos ligantes e

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para a ativação ou desativação da função da transcrição do ERα. Quando

consideramos estes resíduos específicos, observamos energias de ligação

semelhantes para os dois antagonistas. No entanto, nós encontramos

consideráveis diferenças em outros resíduos que podem estar relacionadas

com a distribuição de carga, distância ligante-resíduo e a presença de

moléculas de água. Os nossos resultados mostram que a perda de hidroxila na

região (ii) pelo OHT diminui a sua energia de interação com o H524, que é um

membro da rede de ligação de hidrogênio no sítio de ligação no ERα (R349,

E353, L387 e H524), e é considerado muito importante para o reconhecimento

de ligantes (FUKUZAWA et al., 2006). Também mostramos a importância de

alguns resíduos de metionina (M343, M388, M357, M427, M543, M396) e

cisteína (C381), que são atraídos pelo OHT, mas repelidos pelo RAL. A

existência de energias mais repulsivas para RAL pode sugerir uma razão pela

qual o mesmo permaneça como antagonista quando ligado ao ERβ (enquanto

OHT desempenha um papel agonista), sabendo que o LBD do ERβ humano

mantém 55% de homologia quando comparado com ERα (FANG et al., 2003;

PAULMURUGAN et al., 2011).

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Figura 5: Disposição dos resíduos de aminoácidos mais envolvidos na ligação ER-SERMs.

Contatos entre droga-resíduo são representadas por linhas tracejadas e as suas distâncias. (a) OHT e (b) RAL.

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Figura 6: Isosuperfícies de potencial eletrostático com as densidades eletrônicas para os

SERMs interagindo com os resíduos mais atraentes: (a) OHT e (b) RAL.

2.6 Conclusões

As técnicas computacionais possuem grande relevância para a pesquisa

bioquímica e farmacêutica. O presente trabalho vem reforçar o papel da

simulação computacional em um nível quântico para o entendimento da

interação de drogas antagonistas com o receptor de estrógeno alfa.

O receptor de estrógeno está relacionado com várias patologias como

câncer de mama, próstata e osteoporose. Assim, entender o comportamento

do seu sítio de ligação é um primeiro passo para a formulação de

medicamentos específicos para combater essas entidades patológicas.

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Os métodos de fragmentação têm-se mostrado bastante eficazes em

desenhar a estrutura do receptor e quantificar a importância de cada interação

formada dentro do sítio de ligação. Neste trabalho, utilizamos a técnica do

fracionamento molecular com caps conjugados para determinar quais são os

aminoácidos de maior importância na resposta dos receptores de estrógeno

após a entrada do antagonista no seu sítio de ligação. Tendo por base as

interações formadas com cada um destes aminoácidos, é possível modificar

estas moléculas (SERMs) e obter uma melhor resposta de antagonismo para o

receptor.

Investigamos as interações entre os bolsões de ligação dos SERMs

(OHT e RAL) co-cristalizados com os ERα usando cálculos de bioquímica

quântica. Depois de um estudo de convergência do tamanho da esfera do

bolsão de ligação, levamos em consideração todas as interações ligante-

resíduo dentro de um raio de 15.0 Å a partir do ligante. Aqui, demonstramos

também a necessidade de levar em conta um tamanho maior do bolsão de

ligação, incluindo mais resíduos de aminoácidos distantes a fim de se obter

uma boa correlação entre os dados experimentais e os dados colhidos a partir

de simulações computacionais.

Empregamos o método baseado na teoria do funcional de densidade

(DFT) para desvendar o detalhamento dos dados das energias de ligação dos

SERMs OHT e RAL com o receptor do estrógeno. Calculamos as energias de

ligação utilizando o método MFCC, incorporando a Aproximação do Gradiente

Generalizado (GGA) como funcional de troca e correlação, técnica que permite

que a descrição energética da estrutura completa, não fragmentada. Foi usado

o DFT + D para o cálculo das energias de ligação dos complexos analisados.

Podemos observar que o SERM OHT liga-se mais fortemente quando

comparado com SERM RAL, confirmando os dados experimentais. Além disso,

nós estabelecemos as principais regiões de ambos os ligantes (regiões I e IV) e

os resíduos que desempenham papel mais importante na afinidade de ligação

do ERα com os seus antagonistas.

Os nossos resultados sugerem que o estado de protonação dos

antagonistas carregados pode ter um efeito antagonista nos ERα dos SERMs

estudados. Para os complexos OHT-ERα (RAL-ERα), os resíduos mais

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importantes que afetam o mecanismo de ligação são: D351, E542, E353, D538,

E423, C381, T347, M388, M543, M396, M427, M357, M343, L525, L346, I424,

F404, H524, R394, R352 e K529 (D351, E542, D358, E423, E353, F404, T347,

M343, L346, L525, H524, I424, R394, R335, M543, M388, M396, M427, M357 ,

C381 e R352), com a contribuição principal para a energia total de ligação do

SERMs-ERα obedecendo a sequência decrescente D351 > E542 > D538 >

E353 > E423.

Os achados computacionais demonstraram que o total das energias de

ligação dos OHT e RAL com o ERα correlaciona-se com os dados da literatura.

Este modelo ajudou-nos a compreender os mecanismos energéticos e as

afinidades da ligação. Os dados aqui obtidos podem ser de grande auxílio no

entendimento dos sistemas ERα-OHT e ERα-RAL e, posteriormente, no

desenvolvimento de novos fármacos específicos para estes receptores,

estando de acordo com análises experimentais e acrescentando novos

conhecimentos até então não descritos na literatura. Esperamos que os

resultados aqui apresentados estimulem desenvolvimentos experimentais e de

bio-engenharia no tratamento do câncer de mama.

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INTERAÇÃO ENTRE INTEGRINA

αVβ3 E CILENGITIDE

_______________________________________________________________

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57

3.1 Introdução

O controle das interações celulares, em organismos multicelulares, é

crucial para grande parte dos processos biológicos. Estes processos vão desde

a embriogênese, as vias de manutenção das respostas imunes, a integridade

dos tecidos e a homeostase. Assim, a coesão intercelular é crítica para a

organização estrutural e comunicação intercelular dentro de organismos

multicelulares (HUMPHRIES, 2000; COLLER, 1986).

As integrinas são uma família de glicoproteínas transmembranares

heterodiméricas tipo I, que atuam como os principais receptores metazoários

para a adesão celular, desempenhando um papel fundamental em funções de

suporte físico para a transdução de sinais, montagem do citoesqueleto de

actina, expressão gênica e funções celulares, incluindo a adesão celular,

migração, proliferação, diferenciação e apoptose (HYNES, 2002; SCHWARTZ

et al., 1995).

Estas são heterodímeros compostos por duas subunidades, α e β, não

covalentemente associadas (CAMPBELL, HUMPHRIES, 2011). Até o

momento, são conhecidas 18 subunidades α e 8 subunidades β, que se

combinam para formar, pelo menos, 24 heterodímeros distintos com diferentes

propriedades de ligação e distribuição em diversos tecidos. Cada heterodímero

é formado por um grande domínio extracelular que se liga a proteínas em

ambiente extracelular, um domínio transmembranar e um domínio intracelular,

o qual forma ligações com elementos do citoesqueleto através de proteínas

adaptadoras citoplasmáticas (HYNES, 2002).

As integrinas podem se ligar a glicoproteínas da matriz extracelular

(MEC), tais como colágeno, fibronectinas e lamininas, e também a receptores

celulares como, por exemplo, a molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1) e a

família das moléculas de adesão intercelular (ICAMs) (HYNES 2002; PLOW et

al., 2000).

As integrinas e seus ligantes desempenham papéis fundamentais no

desenvolvimento da resposta imunológica, no tráfego de leucócitos, na

hemostasia, e no câncer, estando, portanto, no centro de muitas doenças

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genéticas humanas, autoimunes, entre outras. Elas são o alvo de fármacos

terapêuticos contra trombose e inflamação, além disso, são receptores para

muitos vírus e bactérias. Por apresentarem múltiplas funções, as integrinas têm

sido estudadas de forma intensiva. Nos últimos anos a elucidação de estruturas

3D da integrina tem permitido uma melhor compreensão da sua estrutura,

funções e interações moleculares que resultam na adesão celular (HYNES,

2002; XIONG et al., 2001).

A especificidade de ligação da integrina com os componentes da matriz

extracelular depende dos domínios extracelulares das subunidades α e β da

integrina. Estas proteínas são classificadas em várias subfamílias com base em

suas cadeias β. As integrinas α1β1, α2β1, α10β1, e α11β1 representam os

principais receptores do colágeno (CAMPER et al, 1998; VELLING et al., 1999;

HYNES, 2002), as integrinas α3β1, α6β1, α6β4 e α7β1 são conhecidas como os

principais receptores de laminina, já integrinas α5β1, α8β1, αIIbβ3 e αVβ são os

principais receptores de fibronectina que se ligam de uma forma dependente de

RGD (Arginina-Glicina-Ácido aspártico) (VAN DER FLIER, 2001; HYNES,

2002). A Tabela 3 resume a diversidade das integrinas em vertebrados.

Algumas integrinas se ligam aos mesmos ligantes extracelulares, porém, com

diferentes afinidades e, alguns ligantes são reconhecidos por diferentes

integrinas (HYNES, 1987; HYNES, 2002). A Figura 7 representa a classificação

da família das integrinas.

Figura 7: Classificação da família das integrinas e seus respectivos receptores. Adaptado de KINASHI, 2005.

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Tabela 3- Principais integrinas encontradas em vertebrados, seus ligantes e seus locais de

distribuição. Adaptado de HYNES, 1992.

3.1.1 Estrutura das Integrinas

Cada uma das subunidades α e β dos heterodímeros de integrina

possuem um grande domínio extracelular onde as subunidades dobram-se em

uma porção globular N-terminal (Figura 8), que se combinam para criar a

superfície de ligação ao ligante, também possuem um domínio transmembranar

do tipo I e uma região de curta cauda citoplasmática C-terminal (com exceção

das subunidades β4) (SHIMAOKA et al., 2002; HUMPHRIES, 2000). O tamanho

das subunidades varia, mas geralmente a subunidade α contém cerca de 750

aminoácidos, enquanto a subunidade β contém 1000 aminoácidos (XIONG et

al., 2001).

O domínio extracelular das integrinas é, em geral, formado por grandes

estruturas de aproximadamente 80-150 kDa. A maior parte das informações

Integrina Ligante Distribuição celular e tecidual

αvβ1 Laminina, fibronectina, osteopontina Fibroblastos, osteoclastos, células tumorais

αvβ3 Fibrinogênio, vitronectina, tenascina, osteopontina, fibronectina, Vwf* Células endoteliais, plaquetas, leucócitos

αvβ5 Vitronectina, osteopontina, fibronectina Células endoteliais,osteoclastos, células epiteliais

αvβ6 Fibrinogênio, vitronectina, tenascina, fibronectina Células epiteliais, células de carcinoma

αvβ8 Vitronectina Melanoma, cérebro, ovário, útero, placenta

α1β1 Colágeno VI, colágeno I, laminina Condrócitos, células endoteliais

α2β1 Colágeno I, colágeno IV, laminina, Queratinócitos, condrócitos, plaquetas, células endoteliais

α3β1 Laminina, trombospondina Queratinócitos

α4β1 Fibronectina, VCAM-1 Leucócitos, células endoteliais

α5β1 Fibronectina, trombospondina Condrócitos, células endoteliais

α6β1 Laminina, trombospondina Condrócitos, células endoteliais

α7β1 Laminina Células musculares diferenciadas

α8β1 Fibronectina Células do músculo liso

α9β1 Tenascina, VCAM-1 Queratinócitos, células endoteliais

α10β1 Colágeno Condrócitos

α11β1 Colágeno Células mesenquimais

α6β4 Laminina Células endoteliais

αIIIbβ3 Fibrinogênio, fibronectina, vWF* Plaquetas

αEβ7 Caderina Leucócitos

αXβ2 ICAM-1, fibrinogênio Leucócitos

αLβ2 ICAMs Leucócitos

αMβ2 ICAM-2, fibronectina Leucócitos

αDβ2 VCAM-1, vitronectina Leucócitos

* vWF Fator de von Willebrand

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estruturais dos domínios extracelulares é obtida a partir de dados

cristalográficos de alta resolução, como por exemplo, a cristalografia por raio-X.

A primeira estrutura cristalina completa da caracterização do domínio

extracelular de uma integrina foi publicada em 2001 e, demonstrava a integrina

αVβ3 (XIONG et al, 2001).

Figura 8: Arquitetura de domínio de um heterodímero de integrina. Adaptado de GAHMBERG

et al., 2009.

O domínio extracelular das subunidades α e β é composto por vários

subdomínios organizados em uma porção globular N-terminal de ligação ao

ligante, que se encontra sobre duas longas e estendidas pernas C-terminais

que conectam os domínios transmembranares e citoplasmáticos das

respectivas subunidades, o domínio extracelular encontra-se dobrado no

estado inativo (não ligado a um ligante) e estendido quando está ligado a

algum ligante (XIONG et al, 2001).

A análise estrutural das subunidades α revela a existência de sete

repetições homólogas na sua porção N-terminal que se dobram em sete pás

em uma β-hélice (XIONG ET AL, 2001; SPRINGER, 1997). Os resíduos que

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participam da ligação ao ligante estão agrupados na superfície superior da β-

hélice enquanto os motivos de ligação para regulação de cátions bivalentes

estão expostos na superfície inferior.

O domínio-I é exposto na superfície superior da β-hélice e está envolvido

diretamente no reconhecimento e ligação ao ligante (KERN; MARCANTONIO,

1998; SPRINGER, 1997). Dentro do domínio-I há a presença de um sítio de

adesão dependente de íon metálico (MIDAS), que se liga a um cátion metálico

bivalente desempenhando papel importante na ligação a uma proteína ligante.

Essa ligação ao ligante altera a coordenação do íon metálico deslocando o

domínio-I e alterando sua conformação, antes fechada, para uma conformação

aberta, resultando assim em um aumento da afinidade ao ligante e, por

consequência, promovendo a ativação de integrina (KANAZASHI et al., 1997;

LIDDINGTON; GINSBERG, 2002). O domínio-I é capaz de dobrar-se

corretamente sem estar associado a uma subunidade β (LU et al., 1998).

A região C-terminal da β-hélice compreende uma região de haste, que

se caracteriza por abranger grande parte do domínio extracelular e pode ser

dividido em três domínios denominados de “coxa”, calf-1 e calf-2. O domínio

“coxa” é semelhante a uma imunoglobulina que, em conjunto com a superfície

inferior da β-hélice, cria uma interface abrangendo dois sítios de ligação ao

cálcio na β-hélice. Já os domínios calf-1 e calf-2 são β-sandwich que juntos

formam contatos hidrofóbicos entre os domínios que fecham a estrutura

(BERTHET et al., 2000; LU et al., 1998).

A subunidade β é composta por um domínio-I-like, com um MIDAS, que

é estruturalmente semelhante ao domínio-I da subunidade α. Este é seguido

por um domínio híbrido, um domínio PSI (plexina, semaforina, integrina), quatro

repetições EGF (Fator de crescimento epidérmico) e um domínio cauda-β

(βTD). A subunidade β desempenha um papel importante na ligação ao ligante

em subunidades α que não possuem o domínio-I. Nos heterodímeros de

integrina, os ligantes se ligam a uma fenda na porção do domínio que está

localizada entre as interfaces das subunidades α e β. O ligante interage com o

domínio MIDAS que está localizado dentro da subunidade β e com o domínio

de β-hélice da subunidade α (SRICHAI; ZENT, 2010; MORGAN et al., 2007).

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Os domínios transmembranares das integrinas são estruturas que

possuem cerca de 25 a 29 resíduos de aminoácidos que formam α-hélices

espirais enroladas. Diferentemente dos domínios extracelulares, não há

estruturas cristalográficas de alta resolução para este domínio em qualquer

heterodímero da integrina, e grande parte dos dados estruturais são com base

na análise de RMN (Ressonância magnética nuclear) (LAU et al. 2009). Já os

domínios citoplasmáticos da integrina são geralmente curtos, em grande parte

não estruturados e compostos por 10 a 70 resíduos de aminoácidos e, assim

como o domínio transmembranar, também não possuem dados de estruturas

cristalográficas de alta resolução (LI et al., 2001). Entretanto, estudos recentes

demonstraram que a região da cauda do domínio citoplasmático medeia a

ligação entre a integrina e o citoesqueleto sendo, portanto, essencial para a

maioria das funções associadas a integrina.

3.1.2 Funções das Integrinas

As integrinas estão envolvidas em uma gama de atividades biológicas,

abrangendo patrulhamento imunológico, migração celular, forma e definição

celular, regulação do ciclo celular, crescimento, invasão, proliferação,

diferenciação, sobrevivência, apoptose e a ligação a determinados vírus

(DESGROSELLIER; CHERESH, 2010; ASSOIAN; KLEIN, 2008).

Elas atuam como receptores capazes de estabelecer uma comunicação

entre a MEC e a célula. Elas também transportam informação do interior da

célula para o compartimento extracelular. Isso permite a ação de respostas

rápidas e flexíveis em ambas as direções (MEC-célula e célula-MEC). Deste

modo, as integrina podem ter suas funções principais divididas em duas: a

ligação da célula para a MEC e a transdução de sinal da matriz para a célula.

Outra função importante é a de mediação de eventos de sinalização na célula

(STUPACK, 2007). As integrinas agem regulando processos complexos no de

câncer, como a angiogênese, crescimento do tumor e metástases (HYNES,

2002; STUPACK, 2007).

3.1.3 Sinalização Mediada por Integrinas

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63

As integrinas são capazes de promover a transdução de sinais

intracelularmente, após a ligação com o ligante (sinalização “outside-in”).

Todavia, ao contrário da maioria dos outros receptores celulares, as integrinas

podem alternar entre conformações de alta ou baixa afinidade para a ligação

com o ligante (sinalização “inside-out”). Dependendo do tipo de célula, as

integrinas podem ser ativadas basalmente, assim como a maioria das células

de adesão que estão ligadas a uma membrana basal, ou inativadas

basalmente, tal como as plaquetas e os leucócitos, que circulam livremente até

serem ativados para promover a agregação plaquetária e mediar uma resposta

inflamatória, respectivamente (HARBURGER; CALDERWOOD, 2009; HYNES,

1992). O heterodímero de integrina αIIbβ3, localizado na superfície celular das

plaquetas, denota a melhor caracterização de integrinas basalmente inativas.

Nestas células, as integrinas apresentam um estado de baixa afinidade, no que

se refere à ligação a um ligante extracelular, dessa forma, são dependentes de

uma sinalização intracelular para que se tornem ativadas (HARBURGER;

CALDERWOOD, 2009; LAU et al, 2009).

As integrinas não têm atividade de quinase, porém têm a capacidade de

fornecer uma conexão entre a matriz extracelular e o citoesqueleto de actina.

Esta conexão permite que as integrinas regulem a organização do

citoesqueleto celular e a motilidade, bem como, alterem fluxos de muitas vias

de sinalização intracelular, incluindo a sobrevivência celular, proliferação

celular, forma da célula e angiogênese (CALDERWOOD, 2004). Os domínios

extracelulares podem se ligar a diversos ligantes, considerando que os

domínios citoplasmáticos intracelulares são âncoras para as proteínas do

citoesqueleto. Esta ligação entre o exterior e o interior da célula acarreta em

uma sinalização bidirecional através da membrana plasmática (HYNES, 2002).

A sinalização inside-out, ou ativação da integrina, tem grande

importância em eventos fisiológicos, tal como nas células sanguíneas, onde as

mesmas estão em estreita proximidade com seus ligantes, porém, as

interações ocorrem apenas após a ativação da integrina em resposta

específica a estímulos externos, como por exemplo, um dano à vasculatura ou

um processo de indução da inflamação (MIRANTI; BRUGGE, 2002).

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64

As integrinas por si próprias não têm atividade catalítica intrínseca. A

ligação ao ligante no domínio extracelular das mesmas promove a transdução

do sinal para o citoplasma, na direção de fora para dentro. Estes sinais

intracelulares afetam o crescimento celular, diferenciação e apoptose. A

sinalização é complexa e consideravelmente influenciada pela interferência dos

receptores de fator de crescimento. Além disso, os fatores de adesão focal

(FAs) promovem um eixo para a transmissão de sinais intracelulares. Dentro

dos FAs, as proteínas estão em constante fluxo, agregando-se e dissociando-

se umas das outras incessantemente (HARBURGER; CALDERWOOD, 2009).

Neste contexto a sinalização outside-in interage com os fatores de crescimento

promovendo o controle das vias de sinalização intracelulares. Logo, as

integrinas podem produzir sinais a partir de estímulos localizados na MEC,

assim como também integram sinais mecânicos e químicos devido à sua

associação direta com o citoesqueleto.

3.1.4 Integrina αVβ3

A integrina αvβ3, objeto de estudo neste trabalho, ou receptor de

vitronectina, é uma das mais bem estudadas, principalmente pelo seu papel no

crescimento de tumores, angiogênese, crescimento celular e adesão do

embrião (BEER; SCHWAIGER, 2008). Seus genes estão localizados nos

cromossomos 2 (αV) e 17 (β3). BARCZYK et al. (2010) mostrou que este

receptor reconhece muitas moléculas da matriz, tais como: vitronectina,

fibronectina, fibrinogênio, a laminina, colágeno, fator de von Willebrand e

osteoponina, em uma sequência específica formada por arginina-glicina-ácido

aspártico (RGD) (ZHENG et al., 2014). Os receptores αVβ3 são expressos em

baixos níveis na maioria dos tecidos normais, incluindo intestino, vasos, e no

músculo liso, enquanto que níveis elevados de expressão são limitados aos

tecidos ósseo, o endométrio durante o ciclo menstrual, placenta, em sítios

inflamatórios, e tumores invasivos (glioblastomas, melanomas, ovário, mama e

próstata).

Os tipos de células que expressam elevados níveis desta integrina

incluem osteoclastos de reabsorção óssea, macrófagos ativados, uma pequena

fração de neutrófilos, células endoteliais angiogênicas e células lisas

(HORTON, 1997).

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65

Esta integrina modula o crescimento, sobrevivência, motilidade e

diferenciação de um grupo limitado de células. Cerca de 20% de ratos knockout

a integrina αV mostraram defeitos placentários (como a perda fetal),

anormalidades no sistema nervoso central e gastrointestinal, além de

deficiências na coagulação e fenda palatina, enquanto que camundongos

knockout para β3 são férteis, mas estes apresentam defeitos na capacidade de

agregação plaquetária e reabsorção de osteoclastos (osteoporose) (BARCZYK,

et al., 2010).

Neste contexto as integrinas αVβ3 são vistas como importantes

moléculas em abordagens biotecnológicas a nível celular, no que tange o

câncer e terapias anti-angiogênicas (PERLIN; MACNEIL; RIMMER, 2008). Com

base no exposto, drogas e peptídeos que contêm as sequências RGD são

utilizados em associação com fármacos (CORSO et al., 2016; AROSIO;

CASAGRANDE, 2016). Assim, muitos esforços estão sendo são aplicados com

o intuito de obter um bom entendimento do receptor αVβ3 e suas bases

moleculares. Estruturas cristalográficas do domínio extracelular de αVβ3 foram

obtidas por XIONG et al (2001) na presença de cátions de Ca2+ e Mn2+ (XIONG

et al, 2002). A Figura 9 representa a integrina em um complexo com a

sequência RGD na presença de Mn2+, a partir da qual é mostrado que α e β

são subunidades montadas em uma cabeça oval e duas caudas quase

paralelas. A cabeça é constituída de umas sete pás em uma β-hélice em αV e

um domínio βA seguido por um domínio híbrido em β3. A cauda αV consiste em

dois domínios calf, enquanto que a cauda β3 é formada por um domínio

plexina-semaforina-integrinas (PSI). Quando αVβ3 está em complexo com o

pentapeptídeo cíclico arginina-glicina-ácido aspártico (D) fenilalanina (N-metil)

Valina (RGDfV, também conhecido como cilengitide), a sequência RGD da

integrina liga-se através de contatos entre arginina e a β-hélice. Muitas

interações também ocorrem entre a glicina e ambas as subunidades α e β. Já o

ácido aspártico se liga a um sítio de adesão dependente de íon metálico

(MIDAS), através do metal Mn2+.

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66

Figura 9: Representação estrutural da integrina em complexo com o cilengitide, são

representadas as subunidades α e β montadas em uma cabeça ovoides e duas caudas quase paralelas (PDB ID: 1L5G) (PROWSE et al., 2011). A bolsa de ligação esférica de raio r também é apresentada nesta figura com um círculo pontilhado em linha na cor preta em torno do ligante

cilengitide.

3.1.5 Cilengitide

Devido a sua expressão primária em células endoteliais ativadas, as

integrinas αVβ3, aVβ5 e α5β1 são alvos atrativos para a terapia do câncer e para

o tratamento de doenças angiogênicas não malignas (KERR; SLEE.; MOUSA,

2002; KOCH, 2003). Especialmente em casos de tumores sólidos, as

moléculas anti-angiogênicas representam um novo conceito de terapia potente.

A inibição das interações integrina-ligante suprime o crescimento celular e

induz a morte celular por apoptose (MEREDITH; FAZELI; SCHWARTZ, 1993).

Atualmente, vários compostos com segmento para integrinas estão em

ensaios clínicos como potenciais fármacos para o tratamento de numerosas

doenças, incluindo o câncer. Entre eles, o cilengitide, que corresponde ao

primeiro antagonista de integrina em fase clínica III para tratamento de

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glioblastoma e em fase II para vários outros tumores. Esta droga é a única

pequena molécula anti-angiogênica que denota atividade antagonista

subnanomolar para αVβ3 e uma de afinidade nanomolar baixa para αVβ5 e α5β1

(AVRAAMIDES; GARMY-SUSINI; VARNER, 2008). Ele foi desenvolvido no

início dos anos 90 por um novo procedimento, a análise espacial. Esta

estratégia resultou em c(RGDfV), o primeiro inibidor superativo para αVβ3 que

em adição exibe uma elevada seletividade contra o receptor de plaquetas

αIIbβ3. Este peptídeo cíclico foi mais tarde modificado por N-metilação de uma

ligação peptídica para se obter uma ainda maior atividade antagonista em

c(RGDF (NMe) V). Atualmente, o cilengitide está sendo desenvolvido como

droga pela empresa Merck-Serono (Alemanha) (MAS-MORUNO;

RECHENMACHER; KESSLER, 2010).

Estudos demonstram que o cilengitide influencia a adesão celular a

ligantes αVβ3, induzindo um aumento da apoptose e também o bloqueio ao

crescimento de xenoenxertos humanos em ratos (TAGA et al, 2002; PAOLILLO

et al, 2009). Além disso, revelou atividade anti-angiogênica e anti-tumoral em

vários modelos animais. A inibição de integrinas αV resultou numa redução

significativa da densidade de vasos funcionais e atraso no crescimento de

tumores e metástases in vivo (MACDONALD et al., 2001; BUERKLE et al.,

2002).

Como mencionado, o cilengitide demonstra qualidades quanto a inibição

de metástases de tumores em muitos estudos pré-clínicos anti-angiogênicos e

anti-tumorais. Além disso, os antagonistas de integrina parecem conferir

sinergia com terapias já estabelecidas, tais como a radioterapia e a

quimioterapia (TABATABAI et al, 2010).

3.2 Objetivos

3.2.1 Objetivos Gerais

O objetivo deste trabalho é apresentar uma descrição da interação entre

o pentapeptídeo cíclico cilengitide com a integrina αVβ3 através de técnicas de

bioquímica quântica no âmbito da Teoria do Funcional da Densidade (DFT).

Pretendendo assim, identificar os resíduos de maior importância nesta ligação,

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68

bem como avaliar as peculiaridades que envolvem o complexo integrina-

cilengitide.

3.2.2 Objetivos Específicos

Quantificar as energias de interação entre os resíduos da integrina αVβ3

e o cilengitide.

Identificar os resíduos mais importantes que perfazem o complexo.

Descrever com base na Teoria da Densidade Funcional (DFT) as

interações mais pertinentes entre os resíduos da integrina e o cilengitide,

caracterizando os tipos de interação que acontecem e avaliá-los de

acordo com a sua importância.

Realizar uma comparação dos dados obtidos com os dados descritos na

literatura.

3.3 Materiais e Métodos

3.3.1 Obtenção da Estrutura Cristalográfica

Os dados cristalográficos utilizados para a realização deste trabalho e

que compreende ao cilengitide co-cristalizado com a integrina αVβ3 foi baixado

do banco de dados PDB (http://www.rcsb.org) sob o código 1L5G. Esta

estrutura foi determinada pela técnica de difração por raio-X e apresenta

resolução de 3.2 Å.

3.3.2 Determinação de Estado de Protonação e Otimização da Estrutura

O estado de protonação do peptídeo (ligante) em pH fisiológico foi obtido

usando o software de Marvin Sketch versão 5.3.2 (Marvin Beans Suite -

ChemAxon). Já quanto aos átomos de hidrogênio não resolvidos pela difração

de raios-x, portanto, ausentes na estrutura do cristal foram adicionados à

estrutura e submetidos a uma otimização de geometria clássica, assim como

os demais outros átomos. A otimização foi realizada utilizando o campo de

força clássico CHARMm (Chemistry at Harvard Molecular Mechanics), que é

especialmente parametrizada para moléculas orgânicas (MOMANY, F. A;

RONE).

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69

3.3.3 Determinação das Energias de Interação e Simulação Computacional

As energias de interação entre a molécula cilengitide e os resíduos de

aminoácidos da αVβ3 foram calculadas a partir do método MFCC (ZHANG;

ZHANG, 2003; ZHANG; ZHANG, 2005) dentro da abordagem do DFT,

conforme mostramos no capítulo anterior.

O método MFCC tem sido amplamente utilizado para calcular as

energias de ligação entre os complexos proteína-ligante (DANTAS et al., 2015;

MOTA et al., 2016), e entre as três cadeias de colágeno (RODRIGUES et al.,

2013), uma vez que torna possível a investigação de um grande número de

resíduos de aminoácidos numa proteína com pequeno custo computacional e

nenhuma perda de precisão (GORDON, et al., 2012). Este esquema de

fracionamento foi inicialmente destinado a fornecer uma eficiente linearidade de

escala para cálculos de energias de interação proteína-ligante ab initio,

dividindo uma molécula de proteína em fragmentos de aminoácidos

adequadamente cobertos (ZHANG; ZHANG, 2003; ZHANG; ZHANG, 2005). A

diferença significativa entre o método MFCC e outros métodos de

fragmentação, que empregam proteção às extremidades da ligação

fraccionada, é a natureza dos caps utilizados. Ao invés de simples caps de

hidrogênio, os caps do MFCC são partes das seções vizinhas da molécula,

proporcionando eficiente método para representação do ambiente local durante

os cálculos de fragmentos individuais (WU et al., 2007). Nós calculamos a

energia de interação entre o ligante, o pentapeptídeo, e os fragmentos

individuais utilizando a Eq.1.

Os cálculos energéticos para cada resíduo no local de ligação foram

realizados utilizando o módulo G09 (FRISCH et al., 2009), dentro do

formalismo da Teoria do Funcional da Densidade (DFT). Utilizou-se a

Aproximação do Gradiente Generalizado (GGA) aliado ao funcional B97D

(GRIMME, 2006). Este foi recentemente proposto por ANTONY E GRIMME

(2012), juntamente com a correção de dispersão D3, sob modelos no vácuo e

de solvatação COSMO contínuo para calcular a energia de ligação de alguns

complexos ligante-proteína dentro de um esquema de MFCC. Para expandir os

orbitais Khon-Sham para todos elétrons, foi escolhido o conjunto de bases 6-

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311+G (3df,2pd) para os cálculos. Para evitar perder interações importantes,

utilizamos um estudo de convergência igual ao realizado no capítulo anterior

(COSTA et al, 2012). Assim, alcança-se a convergência quando a variação de

energia no raio subsequente é menor do que 10%. Neste trabalho, o manganês

(Mn2+), íon MIDAS, foi levado em consideração nos cálculos ligado ao resíduo

mais próximo.

3.4 Resultados e Discussões

Os altos níveis dos receptores de integrina αVβ3 e αVβ5 em glioblastomas

e células de melanoma reforçam a proliferação do tumor, bem como a sua

propagação e adesão (VOGETSEDER et al, 2013; TAKAYAMA et al., 2005). A

inibição direta de αVβ3 por antagonistas seletivos em estudos pré-clínicos inibiu

a angiogênese e a adesão de células, levando a uma condição de regressão

do tumor em células cancerosas de mama e melanoma, experimentalmente

(VILORIA-PETIT et al., 2001). O cilengitide, cuja estrutura química está

representada na Figura 9, é um antagonista potente e seletivo de receptores de

integrina αVβ3 e αVβ5. Esta molécula promove a separação de células de

glioblastoma e mesotelioma a partir dos componentes de MEC e, como

consequência, a ativação de apoptose (DESGROSELLIER; CHERESH, 2010).

Além disso, ele apresenta níveis de toxicidades seguros e favoráveis, sem a

dose limitante em ensaios clínicos, aumentando a eficiência da radioterapia na

célula endotelial e em modelos celulares de câncer. Por outro lado, a

exploração de ligantes RGD, como veículos para compostos diferentes mostrou

ser uma estratégia útil para o desenvolvimento de sistemas de entrega para

fármacos ativos ou ferramentas de diagnóstico. A conformação assumida pela

sequência RGD no cilengitide é semelhante ao encontrado na equistatina e na

fibronectina (VAN AGTHOVEN et al., 2014), sugerindo que este pentapeptídeo

de estrutura cíclica possa servir como uma base para compreender as

interações proteína-ligante. Dessa forma, o desenvolvimento de dados

cristalográficos e computacionais tem sido fundamental para prover uma boa

perspectiva no que tange a base molecular que leva o cilengitide (e outras

pequenas moléculas que contem a sequência RGD) a ser reconhecido pela

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integrina αVβ3 (MARINELLI et al., 2003). O que deve contribuir para o design

racional de novos fármacos com base no RGD e compostos peptido-miméticos.

A fim de proporcionar uma base energética para a interação RGD-

integrina, usamos uma abordagem bioquímica quântica, combinando o

esquema MFCC com o funcional GGA B97D, para descrever a interação

energética entre o pentapeptídeo cíclico cilengitide e os resíduos de

aminoácidos da integrina αVβ3. O domínio extracelular obtido por XIONG et al.

(2001) é composto por 946 (666) aminoácidos da subunidade αV (β3), com 438

(243) formando um domínio β-hélice (βA). Portanto, o critério de convergência

para limitar o número de resíduos utilizados neste trabalho pode ser

contabilizado sem perder as interações importantes da integrina com o

complexo, tendo o motivo RGD. A convergência aqui significa a estabilização

da energia de ligação total por uma variação inferior a 10% do sequencial do

raio r no bolsão de ligação, no qual a energia de ligação total é determinada

somando-se todas as energias dos resíduos-ligante dentro de um raio no

bolsão.

A Figura 10 representa a energia de ligação total, calculada usando o

funcional B97D, como uma função do raio do bolso de ligação, com r variando

de 2.0 Å (-77,996 kcal/mol) e 10.0 Å (-364,533 kcal/mol), a fim de determinar o

melhor valor de r (7.5 Å corresponde a uma energia de -339,653 kcal/mol) a

partir do qual a convergência é alcançada.

O sítio de adesão dependente de íon metálico (MIDAS) é muito

importante para a adesão da integrina. Na integrina αVβ3, o MIDAS é composto

pelos aminoácidos D119, S121, S123, E220 e D25155, cujas distâncias a partir

do cátion manganês Mn2+ ligado ao resíduo S121 são, respectivamente, 3.88

Å, 2.51 Å, 2.68 Å, 2.65 Å e 3.81 Å, (Figura 11).

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Figura 10: A energia total de interação como uma função raio r no bolso de ligação calculada

utilizando-se o funcional B97D e GGA. Os resíduos de aminoácidos responsáveis pelas regiões da variação negativa e positiva mais acentuada são realçados.

De acordo com a Figura 10, há um aumento acentuado na energia de

ligação total entre r = 2.5 Å (-66,244 kcal/mol) e 3.0 Å (-295,179 kcal/mol),

devido a ocorrência de energias de ligação atrativas dos resíduos D150, S121

e R214 para o cilengitide. Em seguida, há um decréscimo da energia total de

ligação no bolsão de raio r = 3.5 Å (-279,962 kcal/mol) e 4.5 Å (-259,024

kcal/mol), isso acontece porque há a presença de energias repulsivas nos

resíduos D220 e M180, respectivamente. Nenhum resíduo foi encontrado para

r = 4.0 Å. As energias atrativas dos resíduos D219 e P219 aumentam, a

energia total em r = 5.0 Å (-294,253 kcal/mol). Uma pequena estabilidade é

encontrada entre os raios r = 5.0 Å e 5.5 Å (-299,165 kcal/mol) em

consequência de uma semelhante, entretanto oposta, energia de ligação nos

resíduos K125 (atrativa) e D251 (repulsiva), o que mantém a energia deste raio

estável. Contudo, interações com os resíduos A252, D119, L120 e D158 nas

posições 6.0 Å (-317,507 kcal/mol), 6.5 Å (-284,919 kcal/mol), e 7.0 Å (-340,947

kcal/mol), respectivamente, são responsáveis pela quebra da convergência.

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Depois disso, a partir de r = 7.5 Å para a frente, a energia de ligação total como

uma função de r tende a apresentar pequenas oscilações.

O conhecimento da estrutura do bolsão de ligação a um receptor é um

passo importante na concepção de medicamentos. Muitos trabalhos têm

sugerido um rearranjo dinâmico e dobramento de domínios sob a integrinas na

presença de diferentes ligantes e íons (MORUNO et al., 2010). No entanto, é

evidente que a sequência RGD desses ligantes insere-se na porção superior

da integrina entre entre os domínios β-hélice e βA, ver figura 9, com a ajuda de

um cátion bivalente (KIM; YE; GINSBERGR, 2011). Recentemente,

AGTHOVEN et al (2014) mostraram uma estrutura cristalográfica de um

domínio de fibronectina com alta afinidade (HFN10) indincando que esse

peptídeo se liga a αVβ3 com sua sequência RGD ligada entre os domínios β-

hélice e βA, em uma conformação semelhante ao cilengitide.

Figura 11: Arranjo do sítio de adesão dependente de íons metálicos (MIDAS) e o resíduos de

aminoácidos encontrados na integrina αVβ3.

Conforme resumido na Tabela 4, entre os 76 resíduos dentro do bolsão

no raio r = 10.0 Å, apenas aminoácidos dos domínios β-hélice e βA

(VOGETSEDER et al., 2013) foram selecionados. Além disso, verifica-se que

as regiões III (Asp), IV (D-Phe) e V ([N-Met] Val) do cilengitide interagem

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apenas com o domínio βA, enquanto que a região I (Arg) interage

principalmente com a β-hélice, apresentando apenas um contato com o

domínio βA. A região II (Gly) faz contato com ambos os domínios de integrina

de acordo com XIONG et al.,(2002). Após somar-se as energias de interação

de cada aminoácido com o cilengitide, as regiões foram classificadas em

termos de energias de ligação como se segue: Região I (E = -179,15 kcal/mol)

> Região III (E = -168,77 kcal/mol) > Região II (E = -47,16 kcal/mol) > Região V

(E = 6,16 kcal/mol) > Região IV (E = 27,69 kcal/mol). Entretanto, comparando-

se o número de contatos feitos com a integrina αVβ3, a classificação é a

seguinte: Região III (38) > Região I (34) > Região II (15) > Região IV (14) >

Região V (1). É importante destacar que as regiões IV e V estão na superfície

da integrina expostos ao solvente e contornado pelos resíduos polares Y122 e

S123 (região IV) e Y178 (região V). Assim, apesar de serem hidrofóbicas, as

regiões IV e V possuem cadeias laterais maiores, quando comparadas à região

II, embora com menos contatos (principalmente os aminoácidos polares).

Até aqui, foram descritas as características gerais do cilengitide no

cenário de ligação. Entretanto, é de grande importância para a concepção de

novos medicamentos e sistemas de distribuição também conhecer como ocorre

as interações entre a droga e os aminoácidos na cavidade de ligação. Assim,

para avaliar cada uma das interações energeticamente mais importantes entre

o cilengitide e a integrina αVβ3 usamos painel gráfico do BIRD (Binding site,

Interaction energy and Residues Domain), apresentado na Figura 12. Esta

figura descreve: (a) a energia de interação (em kcal/mol) do resíduo com os

ligantes, ilustrados pelas barras horizontais, a partir dos quais pode-se atribuir

quantitativamente o papel de cada resíduo na ligação, a sua eficácia, bem

como se eles atraem ou repelem o cilengitide; (b) os resíduos mais importantes

contribuindo para a ligação do lado esquerdo; (c) a região (letras em negrito) e

os átomos do ligante mais próximo de cada resíduo no local de ligação. De

acordo com a Figura 12 foram selecionados, 18 resíduos de aminoácidos como

os mais importantes para o complexo cilengitide-integrina.

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Tabela 4- Energias dos resíduos, grupo atômico, camada de interação, distância mínima e

ligação MFCC entre cada um dos 76 resíduos de aminoácidos dos domínios β-hélice e βA. Os

valores de energia foram calculados utilizando GGA com o funcional B97D + D3.

De acordo com a Figura 12 foram selecionados, 18 resíduos de

aminoácidos como as mais importantes para o complexo cilengitide-integrina.

Entre eles, 11 mostram energias de ligação atrativas (negativas), são: S121 (-

121,8 kcal/mol) > D218 (-80,44kcal/mol) > L120 (-62,70 kcal/mol) > D150 (-

42,96 kcal/mol) > R214 (-42,37 kcal/mol)> D219 (-23,75 kcal/mol) > K125 (-

14,85 kcal/mol) > D146 (-12,61 kcal/mol) > A252 (-11,89 kcal/mol) > P219 (-

11,21 kcal/mol) > R216 (-9,56 kcal/mol), enquanto 7 resíduos de aminoácido

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exibem energias de interação de repulsão (positivas): N215 (7,08 kcal/mol) >

Y122 (12,33 kcal/mol) > D158 (14,10 kcal/mol) > M180 (17,21 kcal/mol) > D251

(19,71 kcal/mol) > E220 (20,45 kcal/mol) > D119 (23,76 kcal/mol). Dentre estes

resíduos, apenas quatro (D218, D150, D219 e D146) compreendem o domínio

β-hélice.

As Figuras 13a - 13d apresentam alguns dos principais resíduos de

aminoácidos e suas respectivas interações intermoleculares com o cilengitide.

Tal como observado na Fig. 13a, a Região I esta envolvida por oxigênios

advindos do grupo carboxilato dos quatro ácidos aspárticos, D218, D150, D219

e D146 (β-hélice). Em nossos cálculos, D218 é o resíduo com a segunda

contribuição de energia de ligação mais atrativa. Ele atrai o ligante através de

pontes salinas entre a sua cadeia lateral carregada negativamente e dois

grupos amina pertencentes a cadeia lateral da Região I (arginina), I(N11)H e

I(N9)H, nas distâncias de 1.99 Å e 1.90 Å , respectivamente. O quarto

aminoácido com a energia de ligação mais atraente é o D150, que está

envolvido com uma ponte de salina na Região I[(N10) H] a uma distância de

2.89 Â. D219 e D146 são os sexto e oitavo resíduos mais atrativos,

respectivamente. A cadeia lateral desta última faz contato com I(N10)H a uma

distância de 8.80 Å, enquanto o D219 faz contatos com o cilengitide em

I(N11)H, I(N9)H e II H(C18) a uma distância de 4.51 Å, 6.64 Å e 5.17 Å

respectivamente.

Cálculos utilizando métodos de docking molecular de nove compostos

cíclicos e lineares determinaram um mapa das interações de cada composto

com a integrina αVβ3 (MARINELLI et al., 2003). O papel fundamental

desempenhado pelos resíduos D218 e D150 na ligação também foi observado

em outros compostos com sequência RGD (LIU; PAN; XU, 2010). Análises

realizadas a partir da síntese de 38 agentes anti-câncer sem a sequência RGD,

demonstraram que a interação do resíduo D150 com estes agentes é mantida

em todos os compostos (DAYAM et al., 2006). Além disso, outras análises de

docking molecular e ressonância nuclear magnética foram realizadas para

caracterizar peptídeos lineares baseados na sequência RGD ligada a integrina

αVβ3, mostrando que a variação do grupo fenil ao fenol faz com que estas

moléculas melhorem a sua afinidade de ligação (VASILE et al., 2016). A

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superposição de estruturas cristalográficas de αVβ3 e αIIbβ3, estruturas

heterodiméricas com a subunidade β3, mostra que a posição do resíduo D218

(αVβ3) é ocupado por uma fenilalanina (αIIbβ3), o que cria uma deficiência

hidrofóbica que impede a ligação ao cilengitide. Outros estudos de docking e

técnicas de dinâmica molecular em peptídeos cíclicos complexados com as

integrinas αVβ3 e αIIbβ3, demonstram que o resíduo Gly (aqui representado na

Região II) é um importante aminoácido de motivo RGD, uma vez que é

susceptível a fazer algumas interações fracas que estabilizam o peptídeo (CαH

· · · O = C) (BELLA; HUMPHRIES, 2005).

Figura 12: BIRD painel gráfico que mostra os mais relevantes resíduos que contribuem para o

complexo de integrina αVβ3 cilengitide, distâncias mínimas entre cada resíduo e o ligante, bem como a região e os átomos dos ligantes mais próximos de cada resíduo no sítio de ligação.

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Os principais resíduos de aminoácidos e suas respectivas interações

intermoleculares com o complexo cilengitide-integrina αVβ3 na Região II são

apresentados na Figura 13b. A Região II faz 15 contatos com resíduos da

integrina, a maioria deles provenientes de CαH[(C18)H]. Entre os 18

aminoácidos escolhidos como os mais energéticos, quatro fazem contatos com

esta região, cada um denotando interações atrativas com o cilengitide (E220,

S121, A252 e R216). O resíduo E220, juntamente com P219, N215 e D158,

constitui um sítio associado a ligação com o metal (ADMIDAS) ou, como

recentemente denominada, sítio de ligação sinérgica ao íon metálico (SyMBS)

(ZHU; et al., 2008). Este é um sítio regulador positivo que coordena E220 em

direção ao MIDAS, estabilizando a superfície de interação com o ligante

através dos efeitos sinérgicos de baixa concentração (LUO et al., 2007). Para

entender estes efeitos quanto a adesividade das integrinas, mutações

experimentais foram feitas em N215A, E220A e D217A da integrina α4β7

(CHEN; SALAS.; SPRINGER, 2003). Os resultados mostraram que estas

mutações levam a uma perda da função de aderência desta integrina.

S121, A252 e R216 são o primeiro, nono e décimo primeiro resídios

energeticamente mais atrativos, respectivamente, enquanto E220 revela a

segunda energia de ligação mais repulsiva. O resíduo R216 faz pontes de

hidrogênio fraca com as regiões II(C18)H e uma ligação de hidrogénio com

III(N8)H a uma distância de 2.70 Å. Apesar dos resíduos S121 e E220

interagirem com a Região III, eles apresentam energias de interação opostas.

Ademais, uma forma de modificar um ligante para torna-lo mais seletivo para

αVβ3 é a inserção de radicais volumosos devidamente orientados no ligante,

uma vez que a sobreposição de integrinas αVβ3 e integrinas α5β1 mostram que

a substituição de (β3)-Arg214 por (β1)-Gly217 e (β3)-Arg216 por (β1)-Leu219

abre um novo espaço adjacente ao local de ligação de RGD, que está ausente

no receptor αVβ3 mas presente na α5β1 (MARINELLI et al., 2003). O resíduo

S121 forma dois contatos com o carboxilato do cilengitide, uma ligação de

hidrogênio fraca com III(C22)O4 (2,8 Å) e uma ligação mediada com III(C22)O5

(5,1 Å). Já E220 apresenta uma repulsão eletrostática devido à carga negativa

do grupo carboxilato [III(C22) O4]. O A252 resíduo forma poucos contatos com

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as regiões II(C20)O2 e III(C17)H do cilengitide a distâncias de 5.56 Å e 5.66 Å,

respectivamente.

A Figura 13c mostra uma visão geral das interações entre cilengitide e

os resíduos R214, L125 e D119. R214 e L125 apresentam as quinta e sétima

energias atrativas mais intensas, respectivamente, enquanto D119 é o resíduo

mais repulsivo. Enquanto isso, o resíduo R214 forma dois contatos com o

ligante, uma fraca ligação de hidrogênio com III(C22)O5 (2.5 Å) e uma

interação entre o NH do grupo guanidina e o oxigénio do carbonila da cadeia

principal da região III(C21)O3 a uma distância de 3,8 Å. Carregadas

negativamente as porções carboxilato de D119 e de cilengitide estão face-a-

face [III(C22)O5] a uma distância de 6.14 Â, criando uma repulsão eletrostática

que representa a sua alta energia de repulsão encontrada pelo nosso

resultados.

Os grupos que interagem com os resíduos P219, N215 e D158 são

mostrados na Fig. 13d. Embora o resíduo P219 seja atraente (a sexta mais

atrativa energia), os outros dois possuem energias repulsivas. Como se pode

ver, N215 forma uma ligação de hidrogênio (1.85 Å) entre o seu grupo amino

da cadeia principal e do oxigênio do grupo carboxilato do cilengitide

[III(C22)O5]. Juntamente a isto, dois oxigênios provenientes de sua cadeia

lateral (3.23 Å) e de sua cadeia principal (3.09 Å) estão próximos do mesmo

átomo de oxigênio. Desta forma, apesar de fazer uma ligação de hidrogênio, a

força repulsiva prevalece. D158 interage com III(C22)O4 a uma distância de

6.90 Å, enquanto o resíduo P219 faz dois contatos principais com a glicina de

cilengitide [II(C18)H e II(C20)O2] a distâncias de 4.79 Å e 5.82 Å,

respectivamente.

Por fim, as subunidades αV e β3 são encontradas em diferentes

membros das integrinas, cujo cenário energético de ligação pode distinguir

cada um deles (COX; BRENNAN; MORAN, 2010). Apesar da relevância da

subunidade β3 com o ligante para o mecanismo de acoplamento do ligante,

evidenciado pela presença do sítio MIDAS e LIMBS, sua relevância energética

é de cerca de 25,00 kcal/mol menor do que a αV. Somando-se as energias de

ligação de cada aminoácido por subunidade, αV (β3), temos -194,79 kcal/mol (-

169,74 kcal/mol). Analisando os resíduos mais energéticos, podemos ver que

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as maiores repulsões são provenientes da subunidade β3, principalmente pelas

interações entre os grupos carboxilato carregados negativamente presentes na

Região III e resíduos de ácido glutâmico e ácido aspártico. Dos 76 aminoácidos

analisados neste trabalho, S121 e D218 são os com a maior contribuição para

a ligação ao cilengitide interagindo com os grupos III(C22)O4; III(C22)O5 e

I(N11)H; I(N9)H, respectivamente. L120, D150, D219 e R214, entre outros,

contribuiem para as interações atrativas, enquanto N215, Y122, D158, M180,

D251, E220 e D119 repeliem o cilengitide, sugerindo que a distribuição de

resíduos carregados negativamente em β3, circundando o ácido aspártico de

RGD pode diminuir a afinidade do complexo.

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Figura 13: Os principais resíduos de aminoácidos e suas respectivas interações

intermoleculares com o complexo cilengitide- integrina αVβ3 (a) Região I; (b) Região II; (c) as regiões II e III; (d) Região III. Regiões IV e V não são mostradas aqui porque apresentam poucos contatos com resíduos de aminoácidos. Potenciais ligações de hidrogênio são

indicadas por linhas tracejadas.

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3.5 Conclusões

As integrinas são moléculas de importância incomensurável na adesão

celular visto que são encontradas em praticamente todas as células do

organismo humano. Elas mediam as interações célula-célula e célula-substrato

sendo essenciais para a regulação celular, crescimento e diversas funções

celulares. Imtegrinas são receptoras poderosas para a geração de sinais

intracelulares e sua importância é refletida na gama diversificada de doenças

em que as integrinas desempenham papéis fundamentais incluindo câncer,

trombose e distúrbios autoimunes.

O papel das integrinas em controlar o comportamento celular, faz destas

moléculas alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas apesar das

grandes lacunas no conhecimento das suas propriedades bioquímicas. Embora

as estratégias terapêuticas para direcionar estas moléculas sejam abundantes,

poucas são usadas hoje em dia no tratamento clínico, com muitas delas não

passando das fases iniciais dos ensaios clínicos. A boa notícia é o

aparecimento do antagonista da integrina, um pentapéptido cíclico contendo o

segmento RGD e o primeiro inibidor da integrina em desenvolvimento clínico

para o tratamento do glioblastoma na fase III dos experimentos, e na fase II

para vários outros tumores. Esta droga é a primeira pequena molécula anti-

angiogênica visando as integrinas αVβ5, αVβ3 e αVβ1, cujo design e produção

requer um conhecimento preciso não só da sua estrutura bioquímica, mas

também do seu mecanismo de ligação com a integrina, levando a uma melhor

compreensão de como este complexo influencia os tumores e as suas terapias

anti-angiogênicas, bem como o seu microambiente.

Neste contexto, a modelagem molecular e a simulação, utilizando

biomoléculas surge como um método eficaz no estudo de eventos moleculares

difíceis de serem caracterizados por outros tipos de análises. Este fato tem

estimulado o interesse dos biocientistas em investigar os problemas biológicos,

este entusiasmo vem acompanhado do fortalecimento dos sistemas

computacionais, bem como da diminuição na proporção do preço do hardware.

Este desenvolvimento nos permite, hoje, realizar simulações com resultados

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significativos a respeito de sistemas biológicos e químicos complexos,

permitindo a compreensão de diversos eventos.

Face ao exposto, denota-se que os métodos computacionais possuem

grande relevância para a pesquisa bioquímica. Assim, este trabalho reforça o

papel da simulação computacional utilizando o nível quântico no entendimento

das interações do sistema aqui analisado. As metodologias empregadas nas

análises das interações proteína-droga, em particular os métodos de

fragmentação, têm-se mostrado bastante eficazes em delinear as interações,

bem como para qualificar a importância de cada uma delas.

Neste trabalho, realizou-se a técnica da fragmentação molecular com

capas conjugadas para determinar quais aminoácidos seriam de maior

importância nas interações entre o composto cilengitide com base no seu

fragmento RGD co-cristalizado à integrina αVβ3 usando cálculos de química

quântica. Depois de um estudo de convergência no tamanho da esfera do

bolsão de ligação, nós consideramos todas as interações ligante-resíduo num

raio de 10.0 Ȧ a partir do ligante. Observamos a necessidade de ter em conta

um cenário de ligação maior, incluindo resíduos de aminoácidos mais distantes

a fim de se obter uma boa correlação entre os dados da simulação e os

achados experimentais. Estabelecemos a ordem decrescente de ligação das

regiões de maior afinidade do Cilengitide, e encontramos região I> III> II> V>

IV. Determinamos também os resíduos da integrina que desempenham papel

mais importante na afinidade da ligação e vimos que as ligações

intermoleculares mais fortes são formadas entre o cilengitide e os aminoácidos

Ser121, Asp218, Leu120, Asp150, Arg214, Asp219, Lys125, Asp146, Ala252,

Pro219, Arg216, Asn215, Tyr122, Asp158, Met180, Asp251, Glu220 e Asp119.

Com base nas informações expostas, inferimos a importância dos

resultados para a análise proposta, visto que o conhecimento das

peculiaridades que envolvem a interação entre a integrina e o fragmento RGD

do Cilengitide podem auxiliar a compreensão de eventos ainda não totalmente

esclarecidos, bem como fornecer dados relevantes sobre os aspectos

particulares do sistema estudado.

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CONCLUSÃO GERAL E

PESPECTIVAS

_______________________________________________________________

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85

Os resultados desta tese mostraram-se bastante promissores,

confirmando dados computacionais, experimentais e clínicos. Vários sistemas

biológicos não possuem um detalhamento preciso pelo não conhecimento do

seu mecanismo de ação, o que dificulta a formulação de fármacos que trariam

a cura de diversas patologias.

Por muito tempo, a indústria farmacêutica baseou-se apenas em

análises experimentais para averiguar a viabilidade de novos fármacos, com

grandes custos e demanda de enorme quantidade de tempo. Hoje, há

computadores que auxiliam em vários passos da pesquisa farmacêutica, desde

a predição de novas moléculas até a simulação do seu comportamento no alvo.

Conhecer as interações específicas de cada ligante é primordial para o

estudo do comportamento do sítio ativo, tendo grande importância no

entendimento dos processos biológicos para o desenvolvimento de novos

medicamentos. Sabemos que uma metodologia que permita a caracterização

das interações que ocorrem no sítio de ligação é extremamente importante,

pois a distinção entre os grupos funcionais que são responsáveis por criar um

maior conjunto de ligações favoráveis pode propiciar ajustes na estrutura do

fármaco que levem a um melhor efeito do mesmo.

Esta dissertação constitui um passo a mais para o completo

entendimento da atuação das drogas nos receptores estrogênicos, podendo

auxiliar no desenvolvimento de novas perspectivas no tratamento do câncer de

mama e de outras patologias estrógeno-dependentes.

Os métodos computacionais de química quântica utilizados neste

trabalho surgiram como uma alternativa simples e eficiente para o

desenvolvimento de novas drogas. Com uma melhor compreensão dos

mecanismos de ligação entre a integrina αVβ3 e o Cilengitide, como também

entre as diversas outras integrinas e seus agonistas e antagonistas, poderemos

decifrar todos os processos que incluem as integrinas. O entendimento desses

mecanismos é de fundamental importância para o tratamento do câncer e

todas as outras patologias que têm na sua fisiopatologia os mecanismos de

adesão celular.

Nossas perspectivas para novos trabalhos em relação ao receptor de

Estrógeno α-Hidroxitamoxifeno podem ser continuadas estudando o

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tamoxifeno. Apesar de mostrar bons resultados clínicos durante o tratamento

de câncer de mama, o uso contínuo de tamoxifeno tem sido relacionado ao

surgimento do câncer de endométrio. Através de análises moleculares,

observou-se uma prevalência de receptores de estrógeno do tipo beta (ERβ) no

útero, sendo um indicativo de sua ação neste tipo de câncer. Ademais, sabe-se

que o tamoxifeno tem apresentado ação agonista neste receptor.

No caso das integrinas, podemos investigar outras integrinas em

complexo com cilengitide e diferenciar entre os subtipos de receptor,

propiciando assim a obtenção de fármacos com maior seletividade. Sua função

para o reconhecimento de moléculas vem sendo utilizada como base para o

desenvolvimento de terapias com maior precisão em relação ao alvo molecular,

levando a um menor número de efeitos indesejados. É sabido que se formam

vinte e quatro integrinas em humanos, sendo estas divididas por sua sequência

de aminoácidos e pelos ligantes aos quais estas se acoplam. Destas, oito

membros (α5β1, α8β1, αIIbβ3, α5β1, αVβ3, αVβ5, αVβ6 e αVβ8), reconhecem a

sequência RGD.

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REFERÊNCIAS

_______________________________________________________________

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WATANABE, C.; FUKUZAWA, K. ; TANAKA, S.; AIDA-HYUGAJI, S.; Charge

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109

ANEXO 1

_______________________________________________________________

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Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27

Contents lists available at ScienceDirect

Computational and Theoretical Chemistry

j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s ev i e r . c o m / l o c a t e / c o m p t c

A quantum biochemistry model of the interaction between the estrogen receptor

and the two antagonists used in breast cancer treatment

K.B. Mota a, J.X. Lima Neto

a, A.H. Lima Costa

a, J.I.N. Oliveira

a, K.S. Bezerra

a, E.L. Albuquerque

a,

E.W.S. Caetano b, V.N. Freire

c, U.L. Fulco

d,⇑

a Departamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970 Natal-RN, Brazil

b Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará, 60040-531 Fortaleza-CE, Brazil

c Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, 60455-760 Fortaleza-CE, Brazil

d Departamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970 Lagoa Nova, Natal-RN, Brazil

a r t i c l e i n f o Article history: Received 4 April 2016 Received in revised form 3 May 2016

Accepted 8 May 2016 Available online 9 May 2016

Keywords: Quantum biochemistry DFT (Density Function Theory) MFCC

(Molecular Fractionation with Conjugate

Caps) scheme Estrogen receptor

Raloxifene, Tamoxifen

a b s t r a c t In this work we employed quantum biochemistry methods based on the density functional theory (DFT) model and the MFCC

(Molecular Fractionation with Conjugate Caps) scheme to unveil the detailed binding energy features of the tissue-selective

synthetic agents SERMs (selective estrogen receptor modulators) 4-hydroxytamoxifen (OHT) and raloxifene (RAL), widely

used in the breast cancer treatment, co-crystallized with the estrogen receptor a (ERa). Our theoretical/computational results

demonstrated that the total binding energies of OHT and RAL to the ERa ligand-pocket correlate with the experimental

binding affinity. Besides, we found that SERMs-OHT binds stronger when compared to SERMs-RAL, confirming

experimental data, whose main contributions to the total SERMs-ERa binding energy are due to the amino acid residues in

decreasing sequence D351 > E542 > D538 > E353 > E423, an important information to understand their binding mechanisms.

2016 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction

Breast cancer is the second most common malignant neoplasms

worldwide and the fifth in cause of deaths [1]. Over the years, some molecular alterations which reflect the biological characteristics of invasive

breast carcinomas have been identified and considered as molecular markers,

such as the estrogen receptors (ERs) [2].

Expressed in approximately 75% of invasive breast tumors [3], ER belongs to the nuclear receptor (NR) superfamily of ligand-activated

transcription factors, like the glucocorticoid receptor (GR), androgen receptor

(AR), retinoic acid receptor (RAR) and orphan receptors [4,5]. Through these

receptors, NR controls the transcription of important genes for developmental, reproductive, neural,

skeletal, grow and cardiovascular processes [6,7], trans-forming them an

important drug target.

Similar to other nuclear receptors, estrogen receptors are char-acterized by

presenting a variable N-terminal transactivation domain, a conserved DNA

binding domain (DBD), a variable hinge region, a conserved ligand binding

domain (LBD), and a variable C-Terminal domain [8]. ER-ligand binding

domain (ER-LBD) is

⇑ Corresponding author.

E-mail address: [email protected] (U.L. Fulco).

http://dx.doi.org/10.1016/j.comptc.2016.05.006 2210-271X/

2016 Elsevier B.V. All rights reserved.

encoded within a region of about 300 amino acids, and its overall architecture

is comprised of helices 1–12 (H1–H12) and two b-sheet (S1 and S2; see Fig.

1). It possesses the function of ligands recognition and activation of

physiological response [5]. Thus, after ligand docking, there is an LBD rearrangement to active state with a shift at

the position of helix 12. It is followed by a formation of (homo or hetero)

dimers that recognize specific sequences of the genomic DNA with the

binding of many kinds of co-activators or co-repressors, which are related to

transcriptional activation/ repression, in order to mediate the transcription of

various target genes [9].

Estrogen receptor family is composed by estrogen receptor a (ERa) and

estrogen receptor b (ERb), that are expressed in a wide range of tissues and

cell types, sharing some level of sequence homology [10]. ERa is encoded by

ESR1 gene on chromosome 6 and has been found predominantly in bone, testes, epididymis, prostate,

uterus, ovary, liver, mammary gland, adipose tissue, heart, vascular system

and brain. ERb is encoded by ESR2 gene on chromosome 14 and is present in

the bladder, prostate, ovary, colon, adipose tissue, immune system, heart,

vascular system, lung and brain [11]. In breast cancers cases, it is common to

see a decrease of ERb expression and an increase in proliferative response

associated to the ERa activation [12]. Thus, many ERa

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22 K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27

Fig. 1. Structural representation of the Estrogen Receptors a Ligand-Binding Domain (ERa-

LBD) complexed with 4-hydroxytamoxifen (PDB ID: 3ERT) [19]. The binding pocket sphere

with radius r is also shown in this picture as a circle around the ligand.

antagonists/modulators have been developed to reverse the growth-promoting

effect of estrogen in breast cancer, as the selec-tive estrogen receptor

modulators (SERMs) [7]. SERMs, also called anti-estrogens, are tissue-selective synthetic agents

that modulate estrogen receptor transcriptional activity by acting, depending

on the cellular differences, as agonists or antag-onists such as cell-signalling

pathway, accessory co-factors and DNA response elements [13]. Tamoxifen

and raloxifene are SERMs with broadest utility for health maintenance in

woman [14]. Tamoxifen, a triphenylethylene derivative, is one of the oldest,

most well-known and most prescribed SERMs with remarkable tissue-specific

behavior [15]. It acts as an ER antagonist in breast and decreases the

incidence of invasive and non-invasive breast cancer [16]. However,

tamoxifen is associated with an increase incidence of venous thromboembolic

events, vasomotor symp-toms, stroke, hot flashes and abnormal endometrial

behavior [17]. Raloxifene, a benzothiophene derivative, is used for preven-

tion of osteoporosis [18] and to breast cancer cases [19]. It acts as an ER

agonist at bone and antagonist at breast and endome-trium. Resembling

tamoxifen, raloxifene use also shows increase of vasomotor symptoms and

hot flashes incidence [20].

Selective estrogen receptor modulators are very effective against breast

cancer. However, these drugs have unwanted side effects in non-target tissue,

and the cancer could become resistant to anti-estrogen therapy. Thus, a

number of experimental and the-oretical studies has been carried out to clarify

the mechanism of the ER-ligand binding, and a wide repertoire of structurally

distinct ligands that bind to ER with different degrees of affinity and potency

have been proposed [21–24].

It is the aim of this work to use computational biochemistry techniques,

within the density functional theory (DFT) framework (for a review of these

techniques see [25]), in order to present an adequate description of the

interaction between 4-hydroxytamoxifen (OHT), an active metabolite of

tamoxifen with high affinity to ER, and raloxifene (RAL), a SERMs widely

used in breast cancer treatment and prevention of osteoporosis, co-crystallized

with the estrogen receptor a (ERa). The individual con-tribution of each

amino acid residue was calculated applying the

MFCC (Molecular Fractionation with Conjugate Caps) scheme, con-sidering

residues at the binding site, but also including other rele-vant ones. The

simulations were performed using the X-ray structure of ERa co-crystallized

with OHT [19] and RAL [26] (PDB ID: 3ERT and 1ERR, respectively). A

comparison between our theo-retical binding energies and the experimental

one is also made and their features are discussed.

2. Materials and methods

Crystallographic data of the 4-hydroxytamoxifen (OHT) and raloxifene

(RAL) co-crystalized with ERa were downloaded from the PDB database

(http://www.rcsb.org) under the codes (resolu-tions) 3ERT (1.90 Å) and

1ERR (2.60 Å), respectively. The state of protonation of all ligands in

physiological pH was obtained using the Marvin Sketch code version 5.3.2

(Marvin Beans Suite – ChemAxon).

Hydrogen atoms, not resolved by the X-ray diffraction and therefore

absent in the crystallographic files, were added to the structures and submitted

to a classical geometry optimization fix-ing the other atoms. This optimization

was performed using the classical force field CHARMm (Chemistry at

Harvard Molecular Mechanics), which is especially parametrized for organic

molecules [27].

The interaction energy between each SERMs molecule and the ERa

amino-acid residues were calculated by using the MFCC method [28,29]. The

MFCC method has been widely used to calcu-late protein–ligand binding

energy once it turns possible the inves-tigation of a large number of amino

acid residues in a protein with small computational cost and no loss in

accuracy [30–34]. The convergence study of the total interaction energy as a func-tion of the

ligand binding pocket radius r was performed in order to put a limit in the

number of amino-acid residues to be analyzed without missing important

interactions [35]. In doing that, we have added the individual interaction

energy of the amino-acid residues within imaginary spheres with pocket

radius r centered at the ligand. Considering r ¼ n=2 (where n = 1, 2, 3, 4. . .),

we achieved the converged binding pocket radius when the energy variation

in the subsequent radius is smaller than 10% [36]. Here, we label the ligand

molecule as L and the i-th amino-acid residue interacting with the ligand as Ri

. The Ci 1 (C

iþ1) cap is formed from the neighbor residues covalently bounded

to the amine (carboxyl) group of the residue Ri along the protein chain. For

completeness, we employed the same line of investigation done in our

previous work related to the willardiine-iGluR2 [37], in which the nearest

five amino-acid fragments at each side of the Ri residue were used to build the

Ci

1 and C

iþ1 caps, providing a better description of its electronic

environment. For these fragmented structures, the inter-action energy between

the ligand and the individual fragments, EIðL RiÞ, is calculated according to:

EIðL RiÞ ¼ EðL þ C

1

iR

iC

iþ1Þ EðC

1

iR

iC

iþ1Þ EðL þ C

1

iC

iþ1Þ

þ EðC1

iC

iþ1Þ; ð1Þ

where the first term EðL þ Ci

1R

iC

iþ1Þ is the total energy of the sys-tem

formed by the ligand and the capped residue; the second term, EðCi 1R

iC

iþ1Þ,

is the total energy of the residue with the caps. Also the third term EðL þ Ci

1C

iþ1Þ is the total energy of the system formed by the caps and the ligand,

while the fourth and final term EðCi 1C

iþ1Þ is the energy of the caps with

dangling bonds hydro-genated. The total interaction energy for RAL and OHT

is obtained by adding up the interaction energies with each amino-acid residue

within a given binding pocket radius. Water molecules were taken into

account in the calculation procedures when hydrogen bonds

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112

K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27 23 are formed with the residues of interest or with the caps. A hydro-gen bond

length limit of 2.5 Å was adopted in this case. Energetic calculations for each residue at the binding site were performed

using the DMol3 code [38], within the density func-tional theory (DFT)

formalism. The Generalized Gradient Approxi-mation (GGA) Perdew–

Burke–Ernzerhof exchange–correlation functional (PBE) [39] was chosen. In

order to improve the descrip-tion of the non-covalent interactions, Ortmann et

al. [40] and Grimme [41] have developed semi-empirical approaches to pro-

vide a better compromise between the cost of first principles eval-uation of

the dispersion terms. We used the DFT + D method following the GGA–

PBE–Grimme scheme to calculate the interac-tion energies of the OHT and

RAL-ERa complexes. The DNP basis set, which is comparable to the 6 311 þ

G (3df, 2pd) basis set [38,42], was selected for the calculations to expand the

Khon– Sham orbitals for all electrons. The orbital cutoff radius was set to 3.7

Å, and the self-consistent field convergence threshold was adjusted to 10 6

Ha.

3. Results and discussions

Although the first SERMs were identified over 60 years ago, their

molecular basis only began to be unravelled in the last 25 years [43].

Nevertheless, recently computational and crystallo-graphic studies have

reported that the nature of the ligand is a crit-ical determinant of its action in

estrogen receptors [13,43]. Thus, a binding energy scenario, as discussed

here, of the complexes between 4-hydroxytamoxifen (OHT)/raloxifene (RAL)

and estrogen receptors a (ERa) is a crucial step in this process. As shown in

Fig. 2a, these ligands share some chemical features, but they show distinct

agonism/antagonism activity and affinity in different tis-sues and receptors

[44]. Both ligands are subdivided into four regions, as depicted in Fig. 2a, to

facilitate a further analysis. These

selected parts are used to describe the most important residues that interact

with each SERM region. Fig. 2b presents the electron density isosurface for

the OHT and RAL, in order to clarify how the electrons are distributed around

the molecules. All calculations were performed starting from the crystallo-graphic

estrogen receptor a (ERa) structure co-crystallized with 4-hydroxytamoxifen

(OHT) and raloxifene (RAL) that have been deposited in the protein data

bank (PDB ID: 3ERT and 1ERR, respec-tively) [19,26]. The binding energies

between of ERa-LDB and two of its antagonists, 4-hydroxytamoxifen (OHT)

and raloxifene (RAL), were calculated employing the MFCC scheme to

obtain the individ-ual contribution of the amino acid residues inside a binding

pocket with a selected radius, ranked from the most relevant interactions,

since the determination of ligand characteristics linking their affin-ity to ER is

quite important for the development of new therapeutic agents. Each residue

with their distance to OHT and RAL and indi-vidual binding energy are

shown in Tables I and II from the Supple-mental Material, respectively. It is

during the convergence study that the total binding energy for each binding

pocket radius was obtained by adding up the respective individual

contributions. To take into account each significant attractive and repulsive

amino acid residue, we perform a search for an optimal binding pocket radius

for which no significant variation in the total binding energy could be

observed after a radius increase. Fig. 3 presents a compar-ison between the

calculated total interaction energies E(r) for the OHT and RAL as a function

of the binding pocket radius r, which indicate that the converged binding

pocket radius is about 15.0 Å, comprising a total of 138 and 145 amino acids

respectively.

Note that the interaction energy follows the order OHT > RAL for each one of pocket radius r = 4:0; 6:0; 11:5; 13:0 and 15.0 Å ( 18 4.470 kcal/mol > 154.410 kcal/mol, 164.760 kcal/ mol > 121.3 60

kcal/mol, 282.170 kcal/mol > 250.220 kcal/mol, 360.420 k cal/mol > 333.640

kcal/mol, 346.230 kcal/mol >

Fig. 2. Representation of the OHT and RAL at physiological ph and electronic density

distribution. (a) Chemical structure subdivided into four parts to help the analysis of its

interactions with ERa; (b) electron density projected onto an electrostatic potential isosurface

showing negatively and positively charged regions in a red and blue color, respectively. (For

interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web

version of this article.)

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113

K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27

Fig. 3. Total SERMs interaction energy for OHT and RAL considering the pocket radius r = 4.0

Å, 6.0 Å, 11.5 Å, 13.0 Å, and 15.0 Å, calculated by using the GGA-PBEGrimme exchange–

correlation functional. The absolute value of EðrÞ obeys the sequence OHT > RAL,

reproducing experimental data [7,44].

327.750 kcal/mol, respectively). These results are in agreement with the

experimental data of Clegg et al. and Kuiper et al. [7,44]. Fig. 4a and b shows a BIRD graphic panel (BIRD being an acro-nym of

the keywords binding site, interaction energy and residues domain) with the

interaction energies between the OHT and RAL and the most important amino

acid residues at the binding region. The panel depicts:

(a) the interaction energy (in kcal/mol) of the residue with the ligands,

illustrated by the horizontal bars, from which one can assign

quantitatively the role of each residue in the binding site, i.e., their

effectiveness as well as if they attract or repel this SERMs;

(b) the most important residues contributing to the bonding in the left

side; (c) the region (boldface letters, identified in Fig. 4) and the atoms of the

ligands closer to each residue at the binding site.

As one can see from Fig. 4, the pattern of interaction seems to be simpler

for OHT than for RAL. For OHT, the attractive interactions are predominant,

but we also observe few repulsive one. The resi-dues that bind more

significantly are D351, E542, E353, D538, E423, C381, T347, M388, M543,

M396, M427, M357, M343, L525, L346, I424, F404, H524, R394, R352 and

K529, being the last four in a repulsive way. For RAL, repulsive interactions

appears more frequently when compare to OHT. Its main residues are D351,

E542, D358, E423, E353, F404, T347, M343, L346, L525, H524, I424, R394,

R335, M543, M388, M396, M427, M357, C381 and R352, being the last nine

repulsive. The difference of attractive and repulsive energies proportion

between OHT and RAL may sug-gest why the first binds tighter than the

latter when considering the overall energy.

Crystallographic X-ray structures obtained by Shiau et al. [19] and

Brzozowski et al. [26] do represent the complex structure in which agonists

and antagonists occupy the same ER-LBD binding pocket. From them, we

became aware that the binding of OHT and RAL is guided by their phenolic

ring (Fig. 2a, region i) as well as the bulky side chain, which is involved by

the hydrophobic core of LBD. However, even sharing the same binding site,

agonists and antagonists bring different rearrangements of receptor that are

related to the activation or deactivation of its transcriptional activity. As

shown by crystallographic structures, when estrogen

Fig. 4. BIRD graphic panel showing the most relevant residues of ERa that contribute to the

binding of each ligand: (a) OHT and (b) RAL. receptor a is bound to antagonists, as such OHT and RAL, there is a

reorganization of some helices followed by a motion of helix 12 toward

coactivator-binding groove formed by the residues from helices 3, 4, and 5.

This, in turn, leads the receptor to a deactivate state by mimic the coactivator

helix binding, creating an impair-ment to its attachment [19]. Thus, to

understand the differences between OHT/RAL-ERa complexes it is important

to notice the binding characteristics of these ligands. Each one of the four

regions (i, ii, iii and iv) of the OHT and RAL interacts, at least, with one

amino acid into our binding pocket radius (15 Å). According to the sum of the

values in Table I (see the Supplemental Material), OHT regions (i) and (iv)

are the first and second energetically most relevant regions, while regions (i)

and (ii) are the largest in number of interactions with ERa. Also, as one can

see from Table II in the Supplemental Material, the sum of the energies in

RAL regions (i) and (iv) occupy the first and second positions, respectively,

having also the largest number of interactions reinforcing the importance of

these regions in the recognition of the activities of these SERMs, as stressed

by Shi et al. [45] and Komm and Mirkin [46].

Region (iv) of OHT and RAL is comprised of a positively charged

nitrogen that is stabilized by D351 and other hydrophobic

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114

K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27 25 contacts. In our calculation, D351 is the residue with the most intense binding

energy contribution to both ligands, with interac-tion energies of 62.92 (OHT)

and 91.55 kcal/mol (RAL) (see Fig. 4). As observed in Figs. 5 and 6, it

attracts the ligands through a salt bridge between its carboxylate side chain

and region (iv) N24 (N26) H of OHT (RAL) with a distance of 3.40 (1.70) Å.

Crystallo-graphic, mutation and computational analysis have shown that its

position correlates with the entrance of the helix 12 (H12) into the active or

deactive form when the ERs (a and b) are attached with agonists or

antagonists, respectively [47,15]. The second high-est binding energy

contribution to OHT and RAL ( 44.26 and 47.04 kcal/mol, respectively)

belongs to the residue E542, which presents different positions in OHT and

RAL pocket radius distribu-tion (12.5 and 9 Å, respectively), but are closed to

the region (iv), as depicted in Fig. 4. It is followed by the residue D538,

exhibiting the thirst highest binding energy, showing 39.05 ( 42.72) kcal/mol

to OHT (RAL). Note that E542 and D538 are residues highly con-served

which occupy the helix 12 (H12) and create a negatively charged area to co-

activators being, therefore, important residues in ER activation or deactivation

[19,47].

A phenolic ring of estrogen is shared by many selective estrogen receptor

modulators [6,48]. It is seen by forming hydrogen bonds to the carboxylate

group of E353 (H3) and the guanidinium group of R394 (H6) and a water

molecule conserved between E353 and

Fig. 5. Arrangement of the most relevant amino-acid residues involved in the ERa-SERMs

binding. Drug-residue contacts are depicted by dashed lines and their distances. (a) OHT and (b)

RAL.

Fig. 6. Electrostatic potential isosurfaces with the projected electron densities for SERMs

interacting with the most attractive residues: (a) OHT and (b) RAL.

R394 amino acids [5,19,26,51]. As one can see from Figs. 5 and 6, E353 and

R394 interact in a very similar way with our two SERMs through this

hydroxyl phenolic group (region i). It is confirmed by our calculated binding

energies between OHT and RAL, respec-tively, that are closed to each other

(see Fig. 4), with 17.25 (2.08 Å) and 21.54 (2.05 Å) kcal/mol for R394, and

38.06 (1.67 Å) and 35.35 (1.67 Å) kcal/mol for E353 (the fourth most

attractive interaction energy). In our calculations, the conserved water

molecule was attached to the closer residue R394 (E353) for the complex

OHT-ERa (RAL-ERa). Due to the differences in quantity of the

crystallographic water molecules, it is named w2 in the first complex and w3

in the second one. In both cases this water is responsible by forming a water

mediated hydrogen bond, beyond the direct H-bond made by these amino

acids. Beyond the H-bond, the energetic results above are also an electrostatic

effect of the charged region (iv) that shows to be prevalent in both cases.

Thus, even making hydrogen bonds with the same molecular group, we find

opposites binding energies. E423 (H8) is the fifth residue with the most

intense binding energy, with interaction energy of 31.98 and 39.25 kcal/mol,

and radius position in 7.5 Å and 5.5 Å to OHT and RAL SERMs.

One of the traditional biologically important topics of quantum

biochemistry, which is not fully understood so far, is the physical nature of

spontaneous point mutations. A plausible cause of these mutation is the so-

called rare tautomers arising from the proton transfer (PT) reactions between

the base pairs double helix archi-tecture of DNA [49]. Experimental

mutations of H524, with no computer simulation counterpart, was found to

reduce estrogen

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115

K.B. Mota et al. / Computational and Theoretical Chemistry 1089 (2016) 21–27 binding [50] and it was correlated by Fukuzawa et al. with the key role of hydrogen bond to ligands [51]. Besides, as shown in Fig. 5a, H524 (H11) makes a H-bond with hydroxyl group of the region (ii) of RAL,

mimicking (not mimicking) the binding with oestradiol (OHT) [26]. Thus, the

lost of this binding appears in our results with the increase (decrease) of the

energy (distance) from 0.06 to 4.08 kcal/mol (from 2.5 to 2 Å), between OHT

and RAL. Further-more, the residues L525 ( 6.52 and 4.79 kcal/mol), w383 (

5.52 and 8.70 kcal/mol) and P404 ( 2.83 and 8.52 kcal/mol) are involved (not

involved) in p-sigma interactions with RAL (OHT) at regions (i), (iii), and

(iv). They are part of the helix 11 (H11), helix 5 (H5) and b-sheet 1 (S1),

being very important in the stabilization of the ligands into the binding

pocket, while experimental mutations are related with the decrease of ER

ligand binding [19,26,51,50]. It is important to notice the role played by the

methionine and cysteine residues, namely M343 (H3), M388 (H6), M357

(H3), M427 (H8), M543 (H12), C381 (H5) and M396 (H6), which are among

the most relevant residues in our calcula-tions. However, as we can see from

Fig. 4, they show an opposite energetic behavior, with an attractive

(repulsive) binding energy to OHT (RAL), except to M343.

Concluding, among the amino acids analyzed in this paper our results

show that the strongest attractive energies for both drugs follows the

decreasing sequence D351 > E542 > D538 > E353 > E423, suggesting their

importance to the interaction between ligand and receptor. Except for E423,

all these amino acids, by crys-tallographic and mutation analysis, are relevant

to the recognition of ligands and activation or deactivation of ERa

transcriptional function. When we consider these specific residues, we

observe similar binding energies for the two antagonists. However, we found

considerable differences in other residues that may be related to the charge

distribution, distance between ligand and residue, and the presence of water

molecules. Our results show that the loss of hydroxyl in region (ii) by OHT

decrease its interac-tion energy with H524, which is a member of the H-bond

network in ERa binding pocket (R349, E353, L387 and H524), and is consid-

ered to be very important to the ligands recognition [51]. We also show the

relevance of some methionine and cysteine residues (M343, M388, M357,

M427, M543, C381 and M396), that are attracted by OHT but repelled by

RAL. The existence of more repul-sive energies for RAL might suggest a

reason why it can remain as antagonist when bound to ERb (whereas OHT

plays an agonist role), knowing that the LBD of human’s ERb keeps 55%

homology when compared to ERa [5,10].

4. Conclusions

Summarizing, we have investigated the interactions among SERMs (OHT

and RAL) and ERa binding pocket using quantum bio-chemistry calculations.

We also demonstrated the necessity of tak-ing into account a larger binding

pocket size, including more distant amino acid residues in order to obtain a

good correlation between the experimental and the simulation data. After a convergence study on the size of the binding pocket sphere, we

have taken into account all ligand-residue interactions within a radius of 15 Å

from the ligand. We could notice that SERMs-OHT binds more strongly when

compared to SERMs-RAL, confirming experimental data [7,44]. In addition,

we have estab- lished the main regions of both ligands (regions i and iv) and the residues that

play important role on the binding affinity of ERa with their antagonists.

Through combining these computation techniques to ligand-based

approaches, more accurate models should be possible in order to study and

understand receptor-mediated effects.

Our results suggest that the protonation state of the charged

dimethylaminoethyl/piperazine can have an antagonist effect on ERa of the

studied SERMs. For OHT-ERa (RAL-ERa) complex, the most important

residues affecting the binding mechanism are: D351, E542, E353, D538,

E423, C381, T347, M388, M543, M396, M427, M357, M343, L525, L346,

I424, F404, H524, R394, R352 and K529 (D351, E542, D358, E423, E353,

F404, T347, M343, L346, L525, H524, I424, R394, R335, M543, M388,

M396, M427, M357, C381 and R352), with the main contribution to the total

SERMs-ERa binding energy obeying the decreasing sequence D351 > E542

> D538 > E353 > E423. We hope that the results pre-sented here should

stimulate experimental and bio-engineering developments in breast cancer

treatment, trough a better under-standing of the SERMs-ERa binding

mechanisms.

Acknowledgments

This work was partially financed by the Brazilian Research Agencies

CAPES (PNPD) and CNPq (INCT-Nano(Bio) Simes and Universal

454328/2014-1).

Appendix A. Supplementary material

Supplementary data associated with this article can be found, in the online

version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.comptc.2016.05. 006.

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orbital method, J. Phys. Chem. B 110 (2006) 16102–16110.

[52]

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117

ANEXO 2

_______________________________________________________________

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118

Quantum chemistry computational study of a cilengitide RGD-

based compound bound to integrin†

Kyvia B. Mota,a José X. Lima Neto,a Katyanna S. Bezerra,a Dalila N. Manso,a Jonas I. N.

Oliveira,a Eudenilson L. Albuquerquea and Umberto L. Fulco∗a

In this work we employ quantum biochemistry methods based on the Density Functional Theory (DFT)

within the Molecular Fractional with Conjugate Caps (MFCC) approach to investigate the binding energy

features of cyclic RGD (R: arginine; G: glycine; D: aspartic acid)-based pentapeptide cilengitide compounds

interacting with the vitronectin receptor αV β3, whose crystallographic structure presents cations Mn2+

symbolizing the integrin in complex RGD. Our computational results give a better understanding of the

cilengitide-integrin binding mechanisms, being also an efficient alternative towards the development of

RGD-based drugs, prodrugs, nanoparticles and carriers, leading to new bio-engineering devices for cancer

therapy.

Introduction Integrins are the major family of cell surface adhesion receptors

expressed in metazoans, which regulates a diverse array of cellular

functions, such as cell-cell, cell-matrix, and cell-pathogen interactions,

crucial to the initiation, progression and metastasis of cancerous

tumor, critical for cell migration and adhesion dynamics1. They are

heterodimeric transmembrane glycoproteins assembled in a large

extracellular domain (> 700 residues), a single-pass transmembrane

(TM) domain, and a short cytosolic tail (< 70 residues), which affects

the tumor progression by inducing programmed cell death of

angiogenic blood-vessels, making them an appealing target for cancer

therapy2,3. The heterodimer arises from non-covalent interactions

between eight β subunits and eighteen α subunits, forming 24

different receptors4, each one showing specificity to the extracellular

matrix (ECM) ligands, a cell survival factor5–7. Their functions are

associated with two directions of signalling pathway, namely the

inside-out and the outside-in pathways, presenting different biological

consequences. In the former, signals received by other receptors

activate intracellular signalling that impinge on integrin cytoplasmic

domains, making the extracellular domain competent for ligand

binding8. In the latter, signalling has beginning by integrin binding to

extracellular matrix molecules, followed by the transmission of signals

to the cell interior, organization of cytoskeleton, activation of kinase

signaling cascades, and modu-

aDepartamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, 59072-970, Natal-RN, Brazil. Fax: +-55-84-32153791; Tel: +-55-84-

32153793; E-mail: [email protected]

‡ This document is a collaborative effort of all authors † Electronic Supplementary Information (ESI) available: [details of any supplementary

information available should be included here]. See DOI: 10.1039/b000000x/

lation of cell cycles and gene expression9. Adhesion mediated by

integrins and signalling events are important in normal physiological

responses, embryonic implantation and development, wound healing,

hemostasis, morphogenesis, immune response, angiogenesis, cell

survival and differentiation (for a review see10), and impairments of its

normal functions have been pointed out in the pathogenesis of many

diseases, including cancer metastasis, auto-immune diseases,

thrombotic vascular diseases, infertility, endometriosis, luteal phase

defects, neoplasia, viral infections, osteoporosis and ischemia-

reperfusion injury11–13. For instance, during the tumor metastasis, a

fine tuned balance between the formation and loosening of adhesive

cell contacts has to occur, a process monitored by the integrins.

Among the 24 members of integrin family, the receptor αV β3, or

vitronectin receptor, is the most well studied, mainly for its role in

tumor growth, progression and angiogenesis, and embryo adhesion14–

16. It is a member of αA-lacking integrin class, with its genes located at

chromosomes 2 (αV ) and 17 (β3). As show by Barczyk et al.17, this

receptor recognizes many ECM molecules, such as vitronectin,

fibronectin, fibrinogen, laminin, collagen, Von Willebrand’s factor and

osteoponin, in a specific Arg-Gly-Asp (RGD) amino-acid sequence18.

Vitronectin receptor αV β3, which is mainly associated and correlates

with ovarian cancer progression, are expressed at low levels in most

normal tissues including intestinal, vascular, and smooth muscle cells,

while high levels of expression is limited to bone, the mid-menstrual

cy-

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119

cle endometrium, placenta, inflammatory sites, and invasive tumors

(glioblastomas, melanomas, ovarian, breast and prostate cancers).

The cell types that express high levels of this integrin include

mature, bone resorbing osteoclasts and activated macrophages, a

small fraction of neutrophils, angiogenic endothelial cells, and

migrating smooth cells19,20. It modulates the growth, survival,

motility and differentiation of a limited group of cells. It was found

that 20% of αV integrin knockout mice have showed placental

defects (with fetal loss), abnormalities in central nervous system and

gastrointestinal blood vessels (with hemorrhages), and cleft palate,

whereas β3 integrin knockout mice are fertile and survive, yet

showing defective platelet aggregation and osteoclast resorptive

capacity (increased bone mass), and osteosclerosis17,21.

Integrins αV β3 are nowadays being considered important

molecules in biotechnological approaches within cellular, cancer

and anti-angiogenesis therapies22,23. Many efforts are applied to

understand them, as well as their molecular basis to ligand binding

mechanism. Interaction with ligands triggers tertiary and quaternary

structural rearrangements in integrins that are needed for cell

signalling. Their crystallographic structures extracellular domain

were obtained by Xiong et al. in the presence of the cations Ca2+ and

Mn2+ 11,24. On the other hand, after RGD peptides have been found

to promote cell adhesion25 numerous materials have been RGD

functionalized for medical applications. Accordingly, RGD-based

drugs and peptides containing RGD sequences are used in

association with drugs, at prodrugs, nanoparticles and carriers in

therapies of cancer and anti-angiogenesis (see Refs.26,27 for recent

reviews). Fig. 1 represents integrin in complex with RGD motif in the

presence of the cation Mn2+, from which it is shown that the α and

β subunits are assembled into an ovoid head and two nearly parallel

tails. The head consists of

a seven-bladed β-propeller (βp) from αV and a βA domain followed

by a hybrid domain (H) from β3. The αV tail consists of a tight (T) and

two calf domains (C1 and C2), while the β3 one is formed by a

plexins-semaphorins-integrins (E) domain, four epidermal growth

factor domains (E), and a β-tail domain (βT). When the integrin αV β3

is in complex with cyclic pentapeptide Arg-Gly-Asp acid-

(D)Phenylalanine-(n-methyl)Valine (RGDfV for short, also known as

cilengitide), RGD motif binds the integrin through contacts between

the Arg amino-acid and the β-propeller, allowing many interactions

between Gly amino-acid and both α and β subunits. Besides, the

aspartic acid binds βA domain at a metal ion-dependent adhesion

site (MIDAS for short) through the cation Mn2+. Unfortunately,

despite all these qualitative description, a reliable quantitative

framework of this interaction remain incompletely characterized.

To fill this gap, it is the aim of this work to present an adequate

description of the interaction of cyclic pentapeptide cilengitide with

the integrin αV β3 through quantum biochemistry techniques within

the Density Function Theory (DFT) framework. The individual

contribution of each amino-acid residue was calculated applying the

Molecular Fractional with Conjugate Caps (MFCC) scheme28,29

considering residues at the binding site, but also including other

relevant residues. The simulations were performed using the X-ray

structure of the integrin co-crystallized with cilengitide (PDB ID:

1L5G)24. Our results allow us to provide a detailed energy profile of

the interactions between the residues in the binding site and the

peptide, being essential to identify the residues that contribute

more in the interactive process between the integrin and the

complex RGD, allowing adjustments that can

Fig. 1 (color online) Structural representation of the integrin in complex

with cilengitide, showing the α and β subunits assembled into an ovoid

head and two nearly parallel tails (PDB ID:1L5G)24. The binding pocket

sphere with radius r is also shown in this picture as a black dotted-line

circle around the cilengitide ligand.

be made to improve the effectiveness of new bio-engineering

devices for cancer therapy.

Materials and Methods

Crystallographic data of the cilengitide co-crystalized with integrin

αV β3 was downloaded from the PDB database

(http://www.rcsb.org) under the code (resolution) 1L5G (3.2 Å)24.

The state of protonation of the peptide (ligand) in physiological pH

was obtained using the Marvin Sketch code version 5.3.2 (Marvin

Beans Suite - ChemAxon). Hydrogen atoms, not resolved by the X-

ray diffraction and therefore absent in the crystallographic files,

were added to the structures and submitted to a classical geometry

optimization fixing the other atoms. This optimization was

performed using the classical force field CHARMm (Chemistry at

Harvard Molecular Mechanics), which is especially parametrized for

organic molecules30.

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120

The interaction energy between cilengitide molecule and the αV

β3 amino-acid residues were calculated by using the MFCC

scheme28,29 within a DFT framework (for a review see31. MFCC

method has been widely used to calculate binding energies of

protein-ligand complexes32–35, and between the three chains of

collagen36 once it turns possible the investigation of a large number

of amino-acid residues in a protein with small computational cost

and no loss in accuracy37,38. The fractionation scheme was initially

aimed to provide an efficient linear-scaling ab initio calculation of

protein-ligand interaction energies by dividing the protein molecule

into amino-acid fragments properly capped28,39. A significant

difference between the MFCC method and other fragmentation

methods that employ capping of fractionated bonds is the nature of

the caps used. Instead of simple hydrogen caps, the caps in the

MFCC approach are portions of the neighboring sections of the

molecule, providing an efficient method for representation of local

environment during individual fragment calculations40.

Here, we label the ligand pentapeptide as L, and the residue

interacting with the L as Ri (i denotes the index of the i-th aminoacid

residue). The Ci−1 (Ci+1) cap is formed from the neighbour residue

covalently bounded to the amine (carboxyl) group of the residue Ri

along the protein chain, providing a better description of its

electronic environment. For these fragmented structures, the

interaction energy between the ligand and the individual fragments,

EI(L−Ri), is calculated according to:

EI(L−Ri) = E(L+C1−iRiCi+1)−E(C1−iRiCi+1)

− E(L+C1−iCi+1)+E(C1−iCi+1), (1)

where the first term, E(L+Ci−1RiCi+1), is the total energy of the system

formed by the ligand and the capped residue; the second term,

E(Ci−1RiCi+1), is the total energy of the residue with the caps. Also the

third term E(L+Ci−1Ci+1) is the total energy of the system formed by

the caps and the ligand, while the fourth and final term, E(Ci−1Ci+1),

is the energy of the caps with dangling bonds hydrogenated.

Energetic calculations for each residue at binding site were

performed using the G09 code41, within the density functional

theory (DFT) formalism. The generalized gradient approximation

(GGA) functional B97D was chosen42. It was proposed by Grimme

and include dispersion terms in order to improve the description of

the non-covalent interactions, recently used by Antony and

Grimme43 together D3 dispersion correction under vacuum and

COSMO continuum solvation models to calculate the binding energy

of some protein ligand complexes within a MFCC scheme. To expand

the Khon-Sham orbitals for all electrons, we selected the

6−311+G(d,p) basis set for the calculations. To avoid missing

important interactions, a convergence study of the total binding

energy as a function of the ligand binding pocket radius was

performed, limiting the number of aminoacid residues to be

analyzed44. For this, we added the individual interaction energy of

those amino-acid residues within imaginary spheres with a pocket

radius r centered at the ligand, considering r = R/2 (R = 1, 2, 3, 4, ...

Nn, Nn being the next natural numbers in the sequence). Thus, we

achieved the converged binding pocket radius r when the energy

variation in subsequent radius is smaller than 10%. Here, the

manganese (Mn2+) ion of MIDAS was taken into account in the

calculation procedures attached to the nearest residue.

Results and Discussions

High levels of the integrin receptors αV β3 and αV β5 in glioblastoma

and melanoma cells reinforces tumor proliferation as well as its

spread and adhesion45–47. Targeting αV β3 by selective antagonists in

preclinical studies have inhibited angiogenesis and cell adhesion,

leading to tumor regression in experimental breast cancer cells and

melanoma48. Cilengitide, whose chemical structure is depicted in

Fig. 2, is a potent and selective antagonist of αV β3 and αV β5 integrin

receptors. It promotes the detachment of glioblastoma and

mesothelioma cells from the ECM components and, as a

consequence, the activation of apoptosis49. Besides, it shows

favorable safety and no-dose-limiting toxicities in clinical trials,

enhancing radiotherapy efficiency in endothelial cell and non-small-

cell lunger cancer models50. On the other hand, the exploration of

RGD ligands as vehicles for different compounds proved to be an

useful strategy towards the development of delivery systems for

active drugs or diagnostic tools. The conformation assumed by RGD

motif in cilengitide is similar to that found in echistatin and

fibronectin51, suggesting that this cyclic pentapeptide structure can

serve as a basis to understand integrin-ligand interactions. Hence,

development of crystallographic and computational studies have

been pivotal to yield a good insight into the molecular basis that

leads cilengitide (and other small RGDbased molecules) to be

recognized by αV β3 52–54, contributing to the rational design of new

RGD-based drugs and peptide-mimetic compounds with RGD motifs

specifically recognized.

Fig. 2 (color online) Cilengitide chemical structure subdivided into five

regions to help the analysis of its interactions with integrin αVβ3. Regions I-

V correspond to Arginine, Glycine, Aspartic acid, (D)Phenylalanine and (n-

methyl)Valine.

In order to provide an energetic basis for RGD-integrin interaction,

we use a quantum biochemistry approach, combining the MFCC

scheme with the GGA functional B97D to describe the

interaction

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121

energy between the cyclic pentapeptide cilengitide and the

amino-acid residues of the αV β3 integrin. Extracellular domain

obtained by Xiong et al.24 is composed by 946 (666) amino acids of

αV (β3) subunit, with 438 (243) of them forming βpropeller (βA)

domain. Therefore, the convergence criterion to limit the number of

residues used in this work can be accounted without loosing the

important interactions in the integrin-RGD motif complex.

Convergence here means the stabilization of the total binding

energy by a variation less than 10% of the sequential pocket radius

r, where the total binding energy is determined by adding up all

residue-ligand energies within a pocket radius. Figure 3 depicts the

total binding energy, calculated by using the GGA functional B97D,

as a function of the pocket radio r varying from from 2.0 Å (-77.996

kcal/mol) to 10.0 Å (-364.533 kcal/mol) in order to determine the

best value of r (7.5 Å corresponding to an energy of -339.653

kcal/mol) from which the convergence is achieved.

Fig. 3 The total interaction energy as a function of the binding pocket radius

r calculated using the GGA functional B97D. Amino-acid residues

responsible for the regions of steepest negative and positive variation are

highlighted.

Metal-ion-dependent adhesion site (MIDAS) is very important to

integrin adhesion, being found in both integrin classes, αA and αA-

lacking. In integrin αV β3, MIDAS is composed of amino acids D119,

S121, S123, E220 and D25155, whose distances from the manganese

cation Mn2+ attached to the residue S121 are, respectively, 3.88,

2.51, 2.68, 2.65, and 3.81, all units in Å (see Fig. 4). According to Fig.

3, there is a sharp increase in the total binding energy between r=

2.5 Å (-66.244 kcal/mol) and 3.0 Å (-295.179 kcal/mol) due to

attractive binding energies of the residues D150, S121 and R214 to

cilengitide. Afterwards, a slight decrease of the total binding energy

is seen at the pocket radius r= 3.5 Å (-279.962 kcal/mol) and 4.5 Å (-

259.024 kcal/mol), due to the repulsive energies of the residues

D220 and M180, respectively. No residue was found in r= 4.0 Å,

while attractive energies of residues D219 and P219 increase the

total energy in r= 5.0 Å (294.253 kcal/mol). A small stability is found

between r= 5.0 Å to 5.5 Å (-299.165 kcal/mol) as a consequence of

a similar, but opposite, binding energies of the residues K125

(attractive) and D251 (repulsive), keeping the energy of this radius

stable. However, interactions with the residues A252, D119, and

L120 and D158 at the positions 6.0 Å (-317.507 kcal/mol), 6.5 Å (-

284.919 kcal/mol), and 7.0 Å (-340.947 kcal/mol), respectively, are

responsible for the breakdown of the convergence. After that, from

r= 7.5 Å onward, the total binding energy as a function of r tends to

present small oscillations.

The knowledge of the structure of the receptor-binding pocket is

an important step in drug design. Many works have suggested a

dynamic rearrangement and bent of integrins domains under the

presence of different ligands and ions56,57. However, it is clear that

RGD motif of these ligands binds in integrin head between the β-

propeller and βA domains with the help of MIDAS bivalent

Fig. 4 (color online) Arrangement of the metal ion-dependent adhesion site

(MIDAS) amino-acid residues found in integrin αVβ3.

cations58. Recently, Agthoven and co-workers51 depicted a

crystallographic structure of a fibronectin domain with high-affinity

(hFN10) showing that this peptide binds to αV β3 with a RGD amino-

acid sequence attached between the β-propeller and βA domains,

in a conformation similar to cilengitide.

As summarized in Table 1 of the Supplemental Material, among the

76 residues within the pocket radius r=10.0 Å only amino acids

of the β-propeller (31) and βA (45) domains were selected. Also,

it is showed that regions III (Asp), IV (D-Phe) and V ([nMet]Val)

from cilengitide interact only with the βA domain, while region

I (Arg) interacts mainly with the β-propeller one, with just one

contact with the βA domain. Region II (Gly) is seen by making

contacts with both domains of integrin in agreement with

Ref.24. After adding up the energies of each amino-acid

interacting with cilengitide, we classified the regions in terms of

the binding energies as following: Region I (E =-179.15 kcal/mol)

> Region III (E =-168.77 kcal/mol) > Region II (E =-47.16

kcal/mol) > Region V (E =6.16 kcal/mol) > Region IV (E =27.69

kcal/mol). Meanwhile, comparing the number of contacts made

with the αV β3 integrin, the rank is as following: Region III (38) >

Region I (34) > Region II (15) > Region IV (14) > Region V (1). It

is important to notice that regions IV and V are in the surface of

the integrin exposed to solvent and surrounded by the polar

residues Y122 and S123 (region IV), and Y178 (region V). Thus,

despite hydrophobic, regions IV and V

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122

have larger side chains than region II, although with fewer

contacts (mainly the polar amino acids).

Up to now, we depicted the overall characteristics of the

cilengitide binding scenario. However, it is very important for

rational design of new drugs and delivery systems to be also

acquainted with the interactions between the drug and the amino

acids into the binding pocket. Thus, to evaluate each one of the

energetically most important interactions energies between

cilengitide and the αV β3 integrin we use the BIRD graphic panel

(BIRD being an acronym of the keywords binding site, interaction

energy and residues domain) showed in Fig. 5. The panel depicts: (i)

the interaction energy (in kcal/mol) of the residue with the ligands,

illustrated by the horizontal bars, from which one can assign

quantitatively the role of each residue in the binding site, i.e., their

effectiveness as well as if they attract or repel the cilengitide; (ii) the

most important residues contributing to the bonding in the left side;

(iii) the region (boldface letters) and the atoms of the ligands closer

to each residue at the binding site. According to Fig. 5, 18 amino-

acid residues were selected as the most important for cilengitide-αV

β3 integrin complex. Among them, 11 show attractive (negative)

binding energies, according to: S121 (-121.8 kcal/mol) > D218 (-

80.44 kcal/mol) > L120 (-62.70 kcal/mol) > D150 (-42.96 kcal/mol) >

R214 (-42.37 kcal/mol) > D219 (-23.75 kcal/mol) > K125 (-14.85

kcal/mol) > D146 (-12.61 kcal/mol) > A252 (-11.89 kcal/mol) > P219

(-11.21 kcal/mol) > R216 (-9.56 kcal/mol), while 7 amino-acid

residues display repulsion (positive) interaction energies: N215

(7.08 kcal/mol) > Y122 (12.33 kcal/mol) > D158 (14.10 kcal/mol) >

M180 (17.21 kcal/mol) > D251 (19.71 kcal/mol) > E220 (20.45

kcal/mol) > D119 (23.76 kcal/mol). Among them, only four residues

(D218, D150, D219 and D146) comprise the β-propeller domain.

Fig. 5 (color online) BIRD graphic panel showing the most relevant residues

that contribute to the cilengitide-αVβ3 integrin complex. The minimal

distances between each residue and the ligand, as well as the region and

the atoms of the ligands closer to each residue at the binding site are also

shown.

Figure 6a to 6d show some of the main amino-acid residues and

their respective intermolecular interactions with cilengitide. As

observed in Fig. 6a, charged Region I is surrounded by oxygens from

carboxylate moiety of four aspartic acids, D218, D150, D219, and

D146 (β-propeller). In our calculations, D218 is the residue with the

second most attractive binding energy contribution. It attracts the

ligand through salt bridges between its negatively charged side

chain and two amine groups belonging to the side chain of Region I

(arginine), I(N11)H and I(N9)H, at 1.99 Å and 1.90 Å distances,

respectively. The fourth amino-acid with the most attractive binding

energy is D150, which is involved in a salt bridge within Region I

[(N10)H] at a distance of 2.89 Å. D219 and D146 are the sixth and

eighth most attractive residues. The side chain of the latter makes

contact with I(N10)H at a distance of 8.80 Å, while the former (D219)

contacts cilengitide in I(N11)H, I(N9)H and II(C18)H at 4.51 Å, 6.64 Å

and 5.17 Å distances, respectively. Throughout molecular docking

calculations of nine cyclic and linear compounds, it is possible to

determine a map of interactions of each compound with the αV β3

integrin52. The key role played by the residues D218 and D150 in the

binding mechanism was also observed in other RGD-based

compounds59. Synthesizing 38 small anticancer agents without RGD

motif, the interaction of the residue D150 with them is retained in

all compounds used in the docking calculations53. Besides, using

NMR and molecular docking to characterize RGD-based linear

peptides bonded to αV β3 integrin, one can show that the change of

the phenyl group to phenol makes these molecules more

hydrophilic, improving their binding affinity60. Superposition of the

crystallographic structures of αV β3 and αIIbβ3, a heterodimeric

structures with a β3 subunit61, shows that the position of the residue

D218 is now occupied by a phenylalanine, creating a hydrophobic

impairment which hinder the binding to cilengitide. Applying

molecular docking and molecular dynamic techniques in cyclic

peptides into the αV β3 and αIIbβ3 integrins, it is possible to

demonstrate that Gly (here represented as Region II) is an important

amino-acid of RGD motif since it is liable to make some weak

interactions that stabilize the peptide (CαH···O=C)62.

The main amino-acid residues and their respective intermolecular

interactions with the cilengitide-αV β3 integrin complex in

Region II are shown in Fig. 6b. Region II forms 15 contacts with

residues from integrin, most of them coming from CαH [(C18)H].

Among the 18 amino acids chosen as the most energetics, four

make contacts with this region, each one showing attractive

interactions with cilengitide (E220, S121, A252 and R216). The

residue E220, along with P219, D158 and N215, constitutes a

ligand-associated metal binding site (LIMBS) or, as recently

named, synergistic metal ion binding site (SyMBS)63. It is a

positive regulatory site that is expected to coordinate its

orientation toward MIDAS, stabilizing the ligand-binding

surface through synergistic effects of low cation

concentrations5. To

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123

understand the effect of LIMBS under integrins adhesiveness,

experimental mutations in N215A, D217A and E220A were made in

α4β7 integrin64. The results showed that these mutations lead to loss

of adhesion function of this integrin, with 52% of the aminoacid

sequence identity being conserved between the β7 and β3 subunits.

S121, A252 and R216 are the first, ninth and eleventh most

energetically attractive residues, respectively, while E220 shows the

second most repulsive binding energy. The residue R216 makes one

weak hydrogen bonds with regions II(C18)H and a hydrogen bond

with III(N8)H at a distance of 2.70 Å. Although the residues S121 and

E220 interact with Region III, they show

Fig. 6 (color online) The main amino-acid residues and their respective

intermolecular interactions with the cilengitide-αVβ3 integrin complex. (a)

region I; (b) region II; (c) regions II and III; (d) region III. Regions IV and V are

not shown here because they present few amino-acid residues contacts

(mainly the polar amino acids). Potential hydrogen bonds are indicated by

dashed lines.

opposite binding energies. Furthermore, one way to become a

ligand selective to αV β1 integrin is the insertion of properly oriented

bulky moieties in the ligand since the superposition of the αV β3 and

α5β1 integrins shows that the replacement of (β3)-Arg214 by (β1)-

Gly217 and (β3)-Arg216 by (β1)-Leu219 opened up a new space

adjacent to the RGD binding site, which is absent in the αV β3

receptor but present in the α5β1 one65. The former residue (S121)

forms two contacts with carboxylate from cilengitide, one weak

hydrogen bond with III(C22)O4 (2.8 Å) and a cation-mediated with

III(C22)O5 (5.1 Å). The latter one (E220) presents an electrostatic

repulsion due to the negatively charged carboxylate group

[III(C22)O4]. The residue A252 forms some contacts with regions

II(C20)O2 and III(C17)H of cilengitide at 5.56 Å and 5.66 Å distances,

respectively.

Figure 6c depicts an overview of the interactions between

cilengitide and the residues R214, L125 and D119. R214 and L125

show the fifth and seventh most intense attraction energies,

respectively, while D119 is the most repulsive one. The residue R214

makes two contacts with the ligand, one weak hydrogen bond with

III(C22)O5 (2.5 Å) and an interaction between its NH from guanidine

group and the oxygen carbonyl from the main chain of III(C21)O3 at

the distance 3.8 Å. Negatively charged carboxylate moiety of D119

and cilengitide are face-toface [III(C22)O5] at a distance of 6.14 Å,

creating an electrostatic repulsion that represents its high repulsion

energy found by our calculations.

The interacting groups of the residues P219, N215 and D158 with

cilengitide are shown in Fig. 6d. Although the residue P219 is

attractive (the sixth most attractive energy), the other two show

repulsive energies (the less and the fifth most repulsive,

respectively). As one can see, N215 forms a hydrogen bond (1.85 Å)

between its amino group of the main chain and the oxygen from

carboxylate group of cilengitide [III(C22)O5]. Besides, two oxygens

from its carbonyl group of the main chain (3.09 Å) and side chain

(3.23 Å) are also in closer contact with the same atom of ligand.

Thus, even making a hydrogen bond, a repulsive binding energy

prevails. D158 interacts with III(C22)O4 at a distance of 6.90 Å, while

the residue P219 makes two main contacts with glicine from

cilengitide [II(C18)H and II(C20)O2] at 4.79 Å and 5.82 Å distances,

respectively.

Lastly, subunits αV and β3 are seen in a different number of integrin

members, whose binding energetic scenario may distinguish

each one of them66. Despite the relevance of the β3 subunit to

ligand binding mechanism (it has 14 more residues than the αV

one), evidenced by the presence of MIDAS and LIMBS sites, its

energetic relevance is approximately 25.00 kcal/mol smaller

than the αV one. Summing the binding energies of each

aminoacid by subunit, the subunit αV (β3) shows -194.79

kcal/mol (169.74 kcal/mol). Looking to the most

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124

energetic residues, we can see that the majors repulsions are

coming from the β3 subunit, mainly by interactions between

negatively charged carboxylate groups of Region III and aspartic

acid/glutamic acid residues. Out of the 76 amino-acid residues

analyzed in this work (see Table 1 of the Supplemental Material),

S121 and D218 are the residues with the larger contribution to the

binding of cilengitide interacting with the atom groups III(C22)O4;

III(C22)O5 and I(N11)H; I(N9)H of the ligand, respectively. The

residues L120, D150, R214 and D219, among others, contribute to

attractive interactions, while N215, Y122, D158, M180, D251, E220

and D119 repel cilengitide, suggesting that the distribution of

negatively charged residues in β3 surrounding the aspartic acid from

RGD may decrease the affinity between the cilengitide and αV β3

integrin.

Conclusions

The roles of integrins in controlling cellular behavior have made

these molecules highly attractive drug targets, despite the wide gaps

in the knowledge of their biochemical properties. Although

therapeutic strategies for targeting these molecules abound, only a

few are used in clinical treatment nowadays, with many of them not

going through the early stages of clinical trials. The good news is the

appearance of the integrin antagonist cilengitide, a cyclic RGD

pentapeptide and the first integrin inhibitor in clinical phase III

development for oncology, and in phase II for several other tumors.

This drug is the first anti-angiogenic small molecule targeting the

integrins αV β5, αV β3 and αV β1. Its design and production require a

precise knowledge not only of its biochemical structure, but also its

binding mechanism with the integrin, leading to a better

understanding of how this complex influences the cancer tumor and

its anti-angiogenesis therapies as well as its microenvironment.

Computational tools based on quantum chemistry may be a

promising step in this route, further increased by combination with

other anti-cancer therapies.

In this context, we have investigated the interactions between

the RGD-based compound cilengitide to the integrin αV β3 using

quantum chemistry calculations. We also demonstrated the

necessity of taking into account a larger binding scenario, including

more distant amino-acid residues in order to obtain a good

correlation between the experimental and the simulation data.

After a convergence study on the size of the binding pocket sphere,

we have considered all ligand-residue interactions within a pocket

radius of 10 Å from the ligand.

In addition, we have established the order of binding affinity

regions of the ligands (regions I > III > II > V > IV) and the residues

that play important role on the binding affinity. It is worth highlight

that strong intermolecular contacts are formed between the

cilengitide and the S121, D218, L120, D150, R214, D219, K125, D146,

A252, P219, R216, N215, Y122, D158, M180, D251, E220 and D119

residues.

The quantum chemistry computational methods used in this work

emerged as a simple and efficient alternative for the development

of RGD-based drugs, prodrugs, nanoparticles and carriers. We hope

that the results presented here should stimulate experimental and

bio-engineering developments through a better understanding of

the cilengitide-αV β3 binding mechanisms, of fundamental

importance for the cancer treat0.8ment.

Acknowledgements

This work was partially financed by the Brazilian Research Agencies

CAPES (PNPD) and CNPq (INCT-Nano(Bio)Simes and Universal

454328/2014-1).

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