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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Walter Ferreira da Silva Júnior DESENVOLVIMENTO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO E DISPERSÕES SÓLIDAS DA α, β AMIRINA ISOLADA A PARTIR DO Protium heptaphyllum Natal 2017
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Walter Ferreira da Silva Júnior
DESENVOLVIMENTO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO E DISPERSÕES
SÓLIDAS DA α, β AMIRINA ISOLADA A PARTIR DO Protium heptaphyllum
Natal
2017
Walter Ferreira da Silva Júnior
DESENVOLVIMENTO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO E DISPERSÕES
SÓLIDAS DA α, β AMIRINA ISOLADA A PARTIR DO Protium heptaphyllum
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Dr. Ádley Antonini Neves de
Lima
Natal
2017
Aos meus pais, Eliana Maria da Costa e Walter Ferreira da Silva,
pelo amor incondicional, apoio e carinho
As minhas avós, Antônia Costa de Melo e Antônia Fernandes (in memoriam),
pelo o amor, carinho e todo o incentivo para eu crescer.
A minha irmã Bruna Rafaella Ferreira da Silva,
por ser aquela explosão que não há em mim.
A Antônio Carlos Gomes Belchior Fontenelle Fernandes (Belchior ou, simplesmente,
Bel) (in memoriam), por mostrar que não sou à prova de amor e nem de som.
A Pedro Henrique Antunes de Azevedo (in memoriam),
pela inspiração ao grupo de pesquisa que participou.
AGRADECIMENTOS
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho, fica aqui expressa toda a minha gratidão.
Ao prof. Dr. Ádley Antonini Neves de Lima, pela orientação, pela amizade que
construímos, por estar sempre à disposição, pelas oportunidades oferecidas, pelo
apoio e por muitos outros motivos.
À aluna de iniciação científica Danielle Bezerra de Menezes Lima, por estar
sempre à disposição para ajudar, por participar do trabalho de quase do início até o
final, por apresentar trabalhos relacionados ao trabalho e pela amizade.
Ao aluno de iniciação cientíica Carlos Demócedes Luis de França Almeida
Moreira, por participar do trabalho e pela grande amizada construída.
À Dra Polyanne Nunes de Melo, por contribuir nas minhas dúvidas acerca dos
resultados e por toda a sua paciência para comigo.
Ao prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa, pela realização em conjunto dos
estudos teóricos computacionais e pela colaboração na escrita de trabalhos.
Ao prof. Dr. Valdir Florêncio da Veiga Júnior, pela doação da α, β amirina de
Protium heptaphyllum e por todo o auxílio na escrita dos trabalhos.
Ao prof Dr. Emerson Silva Lima, pela realização do experimento da atividade
anti-inflamatória.
Aos alunos do grupo Pedro Antunes, pela ajuda, pelo apoio e pela amizade.
Aos alunos do TecBioFar, pela ajuda, pelo apoio e pela amizade.
Ao prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão por sempre se dispor a me ajudar,
pelo o artigo que publicamos juntos e diversos experimentos realizados durante o
mestrado.
Ao doutorando Ednaldo Gomes do Nascimento, pela ajuda em experimento e
pelo apoio.
Ao doutorando Natan Emanuell de Sobral e Silva e ao mestre Jonas Gabriel de
Oliveira Pinheiro pelo apoio, ajuda no trabalho e pela amizade construída.
Ao meu amigo, farmacêutico Victor César Rodrigues de Almeida por todo
companheirismo e apoio nas horas difíceis.
A Júlia Maria da Trindade Nelson por todo apoio, amor e carinho nas horas
difíceis.
Amar e mudar as coisas me
interessa mais
Belchior
RESUMO
Α, β amirina (ABAM) é uma mistura natural de triterpenos pentacíclicos que possui
várias atividades biológicas, incluindo o efeito anti-inflamatório. É isolada das espécies
da família Burseraceae, nas quais a espécie Protium heptaphyllum é a espécie mais
comumente encontrada na Amazônia brasileira. A formação de complexo de inclusão
(CI) com a ciclodextrina (CD) e dispersões sólidas (DS) com polímeros hidrofílicos têm
sido aplicadas como alternativas para resolver algumas limitações que novas
entidades químicas (NEQ) têm em comum, principalmente a baixa solubilidade em
meios aquosos. Então, o objetivo deste trabalho foi desenvolver CI’s da ABAM
(ABAM) com a β-ciclodextrina (βCD) e com a hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) e
DS com a hidroximetilcelulose (HPMC), polietilenoglicol (PEG 6000) e a
polivinilpirrolidona (PVP k-30) a fim de melhoras suas propriedades físico-química
para torna-la viável numa futura formulação. Inicialmente, para os CI, foram realizados
estudos teóricos computacionais nos quais foram calculadas as energias de interação
entre a βCD e a ABAM e HPβCD e ABAM. Em seguida, foram desenvolvidos os CI’s
com βCD e HPβCD pelos métodos de mistura física (MF) e malaxagem (MAL). Foi
realizada a caracterização físico-química dos CI através de espectroscopia de
infravermelho com transformada Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura
(MEV), difração de raio-X de pó (DRX), análise termogravimétrica (ATG) e calorimetria
exploratória diferencial (DSC). As DS foram obtidas através da MF, MAL e RE com o
HPMC, PEG e o PVP. Foram utilizadas as mesmas técnicas de caracterização que
foram realizadas para os CI. Além da caracterização para as DS, realizou-se a
atividade anti-inflamatória in vitro e foram comparadas em relação à suas atividades
anti-inflamatórias com a ABAM. Os estudos de caracterização mostraram a formação
de CI entre a ABAM e as CD e a formação de dispersões sólidas entre a ABAM e os
polímeros hidrofílicos. No ensaio de atividade das DS, verificou-se que comparando o
efeito, mesma dose da ABAM e mesma dose da DS, tanto as DS quanto a ABAM
tiveram atividade anti-inflamatória sobre macrófagos ativados por LPS. Portanto, as
DS e CI com ABAM são alternativas eficazes para modificar suas características,
melhorando propriedades que possam interferir numa futura formulação terapêutica.
Palavras-chave: Amirina. Dispersão sólidas. Complexos de inclusão. Atividade Anti-
inflamatória. Caracterização.
α, β amyrin (ABAM) is a natural mixture of triterpenes pentacyclis which has various
biological activities, including the anti-inflammatory effect. Are isolated from the
species in the family Burseraceae, in which the species Protium heptaphyllum is more
commonly found in the brazilian Amazon. The inclusion complexes formation (IC) with
the cyclodextrin (CD) and solid dispersions (SD) with hydrophilic polymers have been
applied as alternatives to solve some limitations that new chemical entities (NCE) have
in common, mainly the low solubility in aqueous environments. So, the objective of this
work was to develop IC's the ABAM (ABAM) with β-cyclodextrin (βCD) and
hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) and SD with the hidroximetilcelulose (HPMC),
polyethylene glycol (PEG 6000) and polyvinylpyrrolidone (PVP-30 k). Initially, for the
IC, computational theoretical studies were carried out in which interaction energies
were calculated between the βCD and the ABAM and HPβCD and ABAM. Then, the
IC's have been developed with βCD and HPβCD by mixing physical methods (MF) and
kneading (KND). The physical and chemical characterization of IC's using Fourier
transform infrared spectroscopy (FTIR), scanning electron microscopy (SEM), x-ray
diffraction (DRX), thermogravimetric analysis (TG) and differential scanning
calorimetry (DSC). The DS were obtained through the MF, KND and RE with HPMC,
PEG and the PVP. Held the same characterization techniques that were held for the
IC. Beyond characterization to the DS, the anti-inflammatory activity in vitro and were
compared with respect to their anti-inflammatory activities with the ABAM. The
characterization studies showed the formation of CI between the ABAM and the CD
and the formation of solid dispersions between the ABAM and hydrophilic polymers. In
the activity of DS, it was found that comparing the effect, the same dose of ABAM and
same dose of the DS, the DS as the ABAM had anti-inflammatory activity on
macrophages activated by LPS. Therefore, the DS and CI with ABAM are effective
alternatives to modify their characteristics, improving properties that may interfere in a
future therapeutic formulation.
Keywords: Amyrin. Solid dispersions. Inclusion Complexes. Anti-inflammatory
activity. Physicochemical characterization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química da mistura triterpênica α, β amirina ................. 20
Figura 2 - Estrutura química das CD’s naturais: a αCD, a βCD e a γCD ........ 22
Figura 3 - Estrutura das CD’s em três perspectivas, sua cavidade
hidrofóbica e superfície hidrofílica ................................................. 23
Figura 4 - Representação esquemática da complexação de p-xileno
(molécula hóspede) na CD (molécula hospedeira) ........................ 24
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características das CD’s naturais, αCD, βCD e γCD ..................... 25
Tabela 2 - Solubilidade em água da βCD e seus derivados ........................... 25
Tabela 3 - Perda de massa da ABAM, da βCD e seus sistemas e HPβCD e
seus sistemas nas faixa de temperatura de 25 a 120 °C
.................................................................................................. 55
LISTA DE ABREVIATURAS
αCD α-ciclodextrina
ABAM α, β amirina
βCD β-ciclodextrina
CD Ciclodextrina
CD’s Ciclodextrinas
CI Complexo de inclusão
DRX Difração de raio-X de pó
DSC Differential scanning calorimetry (em português, calorimetria
exploratória diferencial)
FTIR Fourier transform infrared (em português, infravermelho com
transformada Fourier)
γCD γ-ciclodextrina
HPβCD
HPMC
Hidroxipropil-β-ciclodextrina
Hidroximetilcelulose
MAL Malaxagem
MEV icroscopia eletrônica de varredura
MF
mL µL
Mistura físicaginfe ecefie
Mililitro
Microlitro
PBS
PEG PVP
Solução-tampão fosfato salino (em inglês, phosphate buffered
saline)
Polietilenoglicol
Polivinilpirrolidona
TG Termogravimetria
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 14
2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 17
2.1 A espécie Protium heptaphyllum (Aubl.) March. ...................................... 17
2.2 Mistura triterpênica α, β amirina................................................................ 18
2.3 Ciclodextrinas (CD’s) ................................................................................ 19
2.3.1 CD’s quimicamente modificadas ........................................................... 23
2.4 Vantagens de complexação de fármacos em CD’s ................................. 25
2.5 Dispersão sólidas (DS) ............................................................................... 26
2.5.1 Método de obtenção de DS ..................................................................... 29
2.5.1.1 Método da fusão ................................................................................... 30
2.5.1.2 Método de evaporação do solvente .................................................... 30
2.5.1.3 Método da malaxagem ......................................................................... 30
2.5.1.4 Método de atomização por spray-dried ............................................. 31
2.5.1.5 Método de co-precipitação .................................................................. 31
2.5.1.6 Métodos do fluido super-crítico .......................................................... 31
3 OBJETIVOS .................................................................................................... 33
3.1 Objetivo geral ............................................................................................. 33
3.2 Objetivos específicos ................................................................................ 33
Capítulo I - DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VITRO DE DISPERSÕES SÓLIDAS DE α, β AMIRINA ISOLADA DE Protium heptaphyllum .................................. 34
Capítulo II - DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA NO ESTADO SÓLIDO COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE α, β AMIRINA COM CICLODEXTRINA NATURAL E SINTÉTICA .................................................... 66
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................ 98
5 PERSPECTIVAS FUTURAS .......................................................................... 99
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 100
ANEXO A – ARTIGO PUBLICADO NA REVISTA “JOURNAL OF THERMAL ANALYSIS AND CALORIMETRY”................................................................. 112
ANEXO B – PATENTE DEPOSITADA NO INPI, COM O TÍTULO “COMPLEXOS DE INCLUSÃO DA OLEORESINA DE COPAÍBA (GÊNERO COPAIFERA) COM CICLODEXTRINAS E SUA APLICAÇÃO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS” ......................................... 113
ANEXO C – CERTIFICADO DE MENÇÃO HONROSA NO X SIMPÓSIO BRASILEIRO DE FARMACOGNOSIA COM O TRABALHO INTITULADO “OBTENÇÃO DE DISPERSÕES SÓLIDAS POLIMÉRICAS DO TRITERPENO α, β AMIRINA E CARACTERIZAÇÃO ESPECTROSCÓPICA E MORFOLÓGICA” ........................................................................................... 114
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1 INTRODUÇÃO
A família Burseraceae possui cerca de 18 gêneros e, aproximadamente, 700
espécies, as quais são distribuídas em três tribos distintas: Canarieae, Protieae e
Bursereae. Esta família está diversificada em várias regiões de baixa latitude sem
intenso frio, incluindo florestas tropicais, florestas secas e desertos (WEEKS;
SIMPSON, 2005). Dentre as espécies compreendidas nesta família, tem-se o Protium
heptaphyllum que é uma árvore de ocorrência em todo o Brasil e, principalmente, na
Região Amazônica e é popularmente conhecida como almecegueira, breu-branco
verdadeiro (típico da Amazônia), almecegueira-cheirosa, almecegueira-de-cheiro,
almecegueiro-bravo (LORENZI, 2014).
Do tronco da espécie do Protium heptaphyllum, no momento em que o tronco
é lesionado, exsuda uma resina oleosa, a qual é bastante utilizada na medicina
popular como anti-inflamatório, analgésico, expectorante e cicatrizante de feridas
(SIANI et al, 1999). Muitos estudos demonstraram e isolaram metabólitos secundários
provenientes do Protium heptaphyllum e se verificou a presença majoritária de
substâncias de natureza terpênica, em específico, alfa e beta-amirina (LIMA et al,
2014).
Os terpenos são moléculas biologicamente versáteis que constituem de
subunidades de isopreno, que podem ser classificados como monoterpenos (C10),
sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40).
Essas moléculas apresentam esqueleto carbono acíclico ou contêm estruturas mono,
bi, tri, tetra e pentacíclicas (DZUBAK et al., 2006). Quimicamente, as misturas
isoméricas de alfa e beta amirina são dois triterpenos pentacíclicos pertencentes às
séries ursano (alfa-amirina) e oleano (beta-amirina). Estão presentes como
constituintes majoritários de resinas produzidas por um grande número de espécies
vegetais, entre as quais se destacam as espécies do gênero Protium (BANDEIRA et
al., 2007).
Estudos de atividades da mistura de α, β amirina demonstraram que essa
possui propriedades gastroprotetora (OLIVEIRA et al., 2004a), antipruriginosa
(OLIVEIRA et al., 2004b), antinociceptiva visceral (LIMA-JUNIOR et al., 2006),
hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2005), inibidora da expressão de receptor NK-1 em
modelo de cistite hemorrágica (LIMA-JUNIOR et al., 2007), antinociceptiva em dor
orofacial de ratos ( HOLANDA et al., 2008a) e anti-inflamatória em modelo de
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periodontite em ratos (HOLANDA et al., 2008). Além disso, recentes estudos têm
demonstrado que a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva da alfa e beta amirina
são devido a sua capacidade de interagir com o sistema canabinóide (CHICCA et al.,
2012; DA SILVA et al., 2011).
Metabólitos secundários apresentam alguns problemas para aplicações
terapêuticas, como volatilidade, estabilidade, sensibilidade dos compostos e sabor e
odor desagradáveis. Algumas alternativas que tem sido utilizada para a resolução
desses problemas é a inclusão desses metabólitos secundários em ciclodextrinas
(CD), formando complexos de inclusão (CI) e também a dispersão desses metabólitos
em polímeros hidrofílicos, resultando em dispersões sólidas (DS) (MARQUES, 2010;
HARWOOD et al., 1995).
As CD são oligossacarídeos cíclicos derivadas do amido com seis, sete, oito
ou mais unidades de D-glicopiranose unidas por ligação α-1,4, as quais são utilizadas
como excipientes farmacêuticos que podem solubilizar vários compostos pobremente
solúveis em água através da formação de complexos solúveis em meios aquosos.
Quando apresentam seis, sete e oito unidades, são conhecidas como α-ciclodextrina
(αCD), β-ciclodextrina (βCD) e γ-ciclodextrina (γCD), respectivamente. Seu uso como
excipiente farmacêutico é devido à baixa toxicidade, à baixa absorção no trato
gastrointestinal superior e a completa metabolização pela microbiota do cólon. As CD
são classificadas como naturais ou derivadas, sendo a αCD, a βCD e a γCD naturais.
As CD’s derivadas apresentam modificações nas hidroxilas da região superficial,
normalmente com substituição de caráter aleatório. Algumas alterações nas CD’s são
para modificar o seu perfil de liberação, e, em alguns casos, para diminuir a
solubilidade ou condicionar a solubilidade a diferentes valores de pH (SZENTE;
SZEJTLI, 2004; BREWSTER; LOFTSSON, 2007; LOFTSSON; BREWSTER, 2010,
2012).
As DS podem ser definidas como misturas de fármacos ou candidatos a
fármaco de baixa solubilidade aquosa em carreadores hidrofílicos, apresentando perfil
de dissolução do fármaco dirigido pelas propriedades do polímero (VASCONCELOS
SARMENTO; COSTA, 2007). Muitos estudos presentes na literatura têm demonstrado
o uso de dispersões sólidas como uma técnica eficaz para o controle de liberação de
fármacos a fim aumentar a taxa de dissolução através de fenômenos como: redução
do tamanho de partícula, alteração do estado cristalino do fármaco para o estado
amorfo e por aumentar a higroscopicidade (GANG et al., 2015; YANG et al., 2014;
16
DÉMUTH et al., 2015). Desta forma, é de suma importância a caracterização das
dispersões desenvolvidas para comprovar a formação do sistema, a fim de evitar
problemas associados a administração prolongada de fármacos como a acumulação
sistêmica do mesmo, instabilidade da molécula e toxicidade (GIRI et al., 2012), assim
como comprovar a melhoria na taxa de dissolução e biodisponibilidade.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
Nesta seção, são apresentados de forma detalhada alguns aspectos relativos
à espécie Protium heptaphyllum, α, β amirina, às CD’s e aos polímeros hidrofílicos.
2.1 A espécie Protium heptaphyllum (Aubl.) March
A família Burseraceae possui cerca de 17 gêneros e mais de 800 espécies
compreendidas, encontradas em diversas regiões, entre elas, região Amazônica,
Piauí, Bahia, Minas Gerais, Goiás em alguns países latino-americanos como
Suriname, Colômbia, Venezuela e Paraguai. Dentre as espécies, tem-se o Protium
heptaphyllum (Aubl.) March que é popularmente conhecido como almecegueira, breu-
branco verdadeiro, almecegueira cheirosa, almecegueira de cheiro, almecegueira
vermelha e almecegueiro bravo (CORRÊA, 1994; LORENZI, 2008).
O Protium heptaphyllum (Aubl.) March é uma árvore de grande porte, com
altura que varia de 10 a 20 metros, tronco de 40-60 cm de diâmetro, com ocorrência
em todo o Brasil, principalmente, na região Amazônica, vegetando em terrenos
arenosos, tanto úmidos quanto secos (CORRÊA, 1994). A árvore produz uma grande
quantidade de sementes viáveis, as quais é amplamente disseminas por pássaros.
Floresce durante os meses de agosto-setembro e os frutos amadurecem novembro-
dezembro. Esta espécie fornece madeira moderadamente pesada (densidade 0,77
g/cm3), compacta, de grande dureza, dócil ao cepilho, bastante elástica e de grande
durabilidade em ambientes secos, sendo de excelente utilidade para a construção civil
(LORENZI, 2008).
A partir do momento em que o tronco do Protium heptaphyllum (Aubl.) March é
lesionado, exsuda uma resina oleosa e ricas em compostos aromáticos, em que as
aplicações gerais são: fabricações de vernizes e tintas, na calafetagem de
embarcações, em rituais religiosos, na cosmetologia, repelente de insetos e
aromatizantes de ambientes. Em sua forma in natura, a resina é utilizada na medicina
popular como anti-inflamatório, gastroprotetor, expectorante, analgésico e cicatrizante
de feridas (SIANI et al., 1999).
A partir de estudos químicos da oléo-resina proveniente de P. heptaphyllum,
foram caracterizados e isolados muitos constituintes. A resina do P. heptaphyllum é
constituída de por compostos de natureza terpênicas, sendo o óleo essencial rico em
18
monoterpenóides e fenilpropanóides (BANDEIRA et al., 2002; SIANI et al., 1999;
ZOGHBI et al., 1995). Entre os constituintes fixos, a literatura registra a presença de
um monoterpeno trioxigenado e quatro misturas binárias de triterpenóides, onde se
destaca a α, β amirina.
2.2 Mistura triterpênica α, β amirina
As substâncias α, β amirina (figura 1) são triterpenos pentacíclicos que se
diferem pela posição de um grupo metila na posição C19 e C20, respectivamente
(BISKUP et al., 2012). É o constituinte majoritário da resina do P. heptaphyllum
(VIEIRA-JÚNIOR et al., 2005), além de serem encontradas comumente em outras
espécies arboríferas como Moldenhawera nutans (VALE et al., 2005), Achillea
alexandri-regis (KUNDAKOVIC et al., 2004), Sideritis candicans Ait (HERNANDEZ-
PEREZ et al., 2004), Carmona retusa (VILLASENOR et al., 2004), Anemone rivulgaris
(ZHAO et al., 2012) Manikara benditata (HERNANDEZ-VÁZQUEZ et al., 2013).
Várias atividades biológicas têm sito reportadas para essa mistura ao longo dos
anos. Oliveira et al. (2004a) demonstraram uma atividade gastroprotetora em úlceras
gástricas induzidas por etanol absoluto e os mesmos autores demonstraram atividade
hepatoprotetora (2005) em lesões hepáticas induzidas por acetoaminofeno. O pré-
tratamento com administração de 50 e 100mg/Kg (i.p.) desta mistura reduziu o stress
oxidativo e a formação de metabólitos tóxicos ao fígado, efeito provavelmente ligado
à ação anti-inflamatória. Lima-Júnior et al. (2007) demonstraram a inibição da
expressão do receptor NK-1 em modelo de cistite hemorrágica por esses triterpenos.
Há descrito na literatura atividade antinoceptiva em dor orofacial de ratos e anti-
inflamatória em modelo de periondontite em ratos (HOLANDA et al., 2008a;
HOLANDA et al., 2008b). Também há relatos na literatura descrevendo a redução da
hiperalgesia inflamatória e neuropática em camundongos por uma ativação direta dos
receptores canabinóides (CHICCA et al., 2012; DA SILVA et al., 2011).
O mecanismo da atividade anti-inflamatória tópica foi elucidado na literatura e
envolve a supressão da PGE2 por mecanismos envolvendo a supressão da expressão
da COX-2 e bloqueio da ativação de NFκB (MEDEIROS et al., 2007). Também há
descrito na literatura que a mistura tritepernênica α, β amirina tem a capacidade de
aumentar a atividade sexual e eréctil em ratos naїve (WATCHO et al., 2012). Aragão
19
et al. (2007) avaliaram uma atividade ansiolítica e antidepressiva e atividade
antiagregante plaquetário da mistura de α, β amirina, respectivamente.
Apesar da ampla gama de atividades farmacológicas atribuídas a α, β amirina,
o que pode limitar o seu uso, é a baixa solubilidade aquosa, que limita a
biodisponibilidade e consequentemente sua ação terapêutica. Algumas estratégias
farmacotécnicas também podem ser utilizadas visando ao aumento da solubilidade de
triterpernóides bem como a atividade terapêutica, como a complexação com
ciclodextrinas (LI et al., 2009) e dispersões sólidas (ELOY et al., 2015) em que
resultados satisfatórios foram obtidos.
Figura 1 – Estrutura química da mistura natural triterpênica α-amirina (A) e β-
amirina (B)
Fonte: Elaborada pelo autor, com estrutura desenhada no Marvin Sketch
2.3 Ciclodextrinas (CD)
As CD são insumos alimentícios e farmacêuticos que são capazes de modificar
características de fármacos, compostos e óleos pouco solúveis em água através da
formação de CI. Além disso, as CD despertaram o interesse das indústrias alimentícia
20
e farmacêutica por terem baixa toxicidade, baixa absorção no trato gastrointestinal
superior e serem completamente metabolizadas pela microbiota intestinal. Elas são
derivadas do amido e são produzidos em escala industrial (SZENTE; SZEJTLI, 2004;
MARQUES, 2010; LOFTSSON; BREWSTER, 2012).
As CD são um grupo de moléculas naturais e cíclicas e sua produção começa
com a conversão do amido pré-hidrolisado (mistura de dextrinas acíclicas) em
dextrinas cíclicas e acíclicas, promovida pela degradação enzimática da enzima
ciclodextrina-glicosil-transferase (CGTase, amilase do Bacillus macerans). Esta
enzima é obtida em cultura de micro-organismos. Quando as dextrinas cíclicas e
acíclicas são obtidas, elas passam por uma etapa de separação, purificação e, por
fim, cristalização (VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006).
Quimicamente, as CD são oligossacarídeos cíclicos que contém seis, sete, oito
ou mais unidades de D-glicopiranose unidas por ligação α-1,4. As CD de ocorrência
natural são a αCD, a βCD e a γCD, contendo seis, sete e oito unidades de D-
glicopiranose, respectivamente (VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006; LOFTSSON;
BREWSTER, 2010). As estruturas químicas das CD’s naturais são demostradas na
Figura 2.
Figura 2 – Estrutura química das CD’s naturais: a αCD, a βCD e a γCD
Fonte: Elaborada pelo autor
21
O anel que constitui as CD é tronco-cônico, apresentando uma cavidade, como
esquematizado na Figura 3. Os grupos hidroxila ligados aos átomos de carbono C-2
e C-3 são voltados para o lado amplo da cavidade, enquanto que os grupos hidroxila
ligados aos átomos de carbono C-6 são voltados para o lado mais estreito da
cavidade. Os átomos de hidrogênio dos grupos CH presentes na estrutura das
unidades D-glicopiranose H-1, H-2 e H-4 estão voltados para o interior da molécula,
enquanto que os átomos H-3 e H-5 são voltados para a cavidade da CD. O esqueleto
carbônico está voltado para a cavidade da CD. Desta forma, as CD apresentam a
superfície hidrofílica e a cavidade hidrofóbica. A estrutura das CD às permite formar
CI, onde moléculas com baixa solubilidade ou insolúvel em água podem ser inclusos
na cavidade das CD e a superfície interage com a água (BREWSTER; LOFTSSON,
2007; MARQUES, 2010).
Figura 3 – Estrutura das CD em três perspectivas, sua cavidade hidrofóbica e
superfície hidrofílica
Fonte: Elaborada pelo autor
Devido à estrutura das CD, elas são conhecidas como moléculas hospedeiras.
Este fato se deve à inclusão de moléculas na sua cavidade, estas conhecidas como
hóspedes. Então, as CD têm a capacidade de formar complexos hóspede-hospedeiro
(em inglês, guest-host), também conhecido como complexos fármaco-CD ou
simplesmente como CI’s. Em uma solução aquosa, as moléculas hidrofóbicas entram
na cavidade da CD, enquanto que moléculas de água que existem normalmente na
cavidade da CD são deslocadas (Figura 4). Isto se deve ao fato de que o sistema
22
sempre tende à um estado de menor energia livre (VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO,
2006).
As CD naturais apresentam características diferentes devido aos seus
tamanhos, pois quanto mais unidades de D-glicopiranose, maior o tamanho da sua
estrutura. As características relacionadas à cada CD natural são apresentadas no
Tabela 1. Como mostrado na Tabela 1, a βCD apresenta a solubilidade aquosa menor
em relação às outras, apesar de ser utilizada como insumo para aumentar a
solubilidade de compostos pouco solúveis em água. De acordo com a 5ª edição da
Farmacopeia Brasileira (2010), a βCD é classificada como ligeiramente solúvel.
Acredita-se que isso se deva à forte ligação das moléculas no estado cristalino, ou
seja, a energia da rede cristalina é relativamente elevada (LOFTSSON; BREWSTER,
2010).
Figura 4 – Representação esquemática da complexação de p-xileno (molécula
hóspede) na CD (molécula hospedeira).
As moléculas de água estão representadas em pequenos círculos.
Fonte: Adaptado de VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006
2.3.1 CD quimicamente modificadas
Tendo em vista a solubilidade limitada das CD naturais, especialmente a βCD,
as CD passaram a ser modificadas quimicamente para o aumento de sua solubilidade.
Então, a substituição de qualquer dos grupamentos hidroxila formadores de ligação
de hidrogênio, mesmo que por grupamentos lipofílicos, promove uma grande melhoria
na solubilidade aquosa da CD. A adição desses grupamentos feita de forma aleatória
origina uma mistura de isômeros de posição, o que transforma as CD naturais
23
cristalinas em compostos de característica amorfa. Os grupamentos mais utilizados
são hidroxipropil, metil, sulfobutil éter e maltosil. Na maioria dos casos, as inserções
dos grupamentos nas CD são de caráter aleatório (VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO,
2006; BREWSTER; LOFTSSON, 2007; LOFTSSON; BREWSTER, 2010). O efeito na
solubilidade pela inserção de alguns grupamentos na βCD são mostrados na Tabela
2.
Tabela 1 – Características das CD’s naturais, αCD, βCD e γCD
Característica αCD βCD γCD
Peso molecular do composto anidro (Da)
972,84 1134,98 1297,12
Solubilidade em água à 25 °C (mg/ml)
129,5 ± 0,7 18,4 ± 0,2 249,2 ± 0,2
Diâmetro interno (Å) 4,7 - 5,3 6,0 - 6,5 7,5 - 8,3
Volume aproximado da cavidade (Å3)
174 262 427
Número de moléculas de água na cavidade
6 11 17
Biodisponibilidade oral em ratos (%)
1 0,6 0,02
Fonte: Adaptado de: VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006; MARQUES, 2010; e LOFTSSON;
BREWSTER, 2010, 2012
Tabela 2 – Solubilidade em água da βCD e seus derivados
CD Solubilidade em água
à 25 °C (mg/ml)
βCD 18,5
2-hidroxipropil-β-CD > 600
Metil-β-CD > 500
Sulfobutil éter-β-CD sódica > 500
Fonte: Adaptado de BREWSTER; LOFTSSON, 2007
24
Além da solubilidade limitada das CD naturais, existe também outros fatores
que motivaram a derivatização química das CD, como a toxicidade via parenteral e a
capacidade de inclusão. As CD derivadas são classificadas em três classes:
hidrofílicas, hidrofóbicas e ionizáveis. Os derivados hidrofílicos podem ser metilados
(2,6-di-O-metil-β-CD, 2,3,6-tri-O-metil-β-CD e 2,3,6-metil-β-CD), hidroxialquilados (2-
hidroxietil-β-CD, 2-hidroxipropil-β-CD, 3-hidroxipropil-β-CD e 2,3-dihidroxipropil-β-CD)
e ramificados (glicosil-β-CD, maltosil-β-CD e dimaltosil-β-CD). Os derivados
hidrofóbicos são principalmente etilados (2,6-di-O-etil-β-CD e 2,3,6-tri-O-etil-β-CD).
Os derivados ionizáveis mais conhecidos são a carboximetiletil-β-CD e sulfobutil éter-
β-CD. Os derivados hidrofílicos são principalmente utilizados para aumentar a
solubilidade de moléculas e, na maioria dos casos, apresentam baixa toxicidade via
parenteral. Os derivados hidrofóbicos são utilizados para controlar a velocidade de
dissolução dos fármacos solúveis em água, agindo na liberação prolongada dos
fármacos. Já os derivados ionizáveis são utilizados para complexação e liberação de
fármacos dependente do pH do meio em que se encontram (VEIGA; PECORELLI;
RIBEIRO, 2006).
2.4 Vantagens de complexação de fármacos em CD’s
Os estudos relatam o desenvolvimento e expansão do uso de CD em diversas
áreas industriais, tais como aplicações nos campos farmacêutico, agroquímico,
alimentar e cosmético. Os seguintes fatores contribuem para este amplo uso: são
produtos naturais ou semi-naturais (MURA, 2014), são produzidos em grandes
quantidades a cada ano, com tecnologias que não são agressivas ao meio ambiente
(VEIGA et al., 2006; SZENTE; SZEJTLI, 2004). A
A inclusão de fármacos em CD é um processo termodinamicamente factível e
estável, pois o processo se dá ao deslocar a água, polar, originalmente existente na
cavidade apolar da CD para incluir uma molécula de caráter apolar. Este tipo de
reação envolve aumento da entropia do sistema e redução da energia total em função,
basicamente, de quatro motivos: deslocamento de moléculas de água da cavidade
apolar da CD; aumento na quantidade de interações de pontes de hidrogênio
formadas pelas moléculas de água que saíram da cavidade com as moléculas
presentes na solução; redução de interações de repulsão entre o hóspede hidrofóbico
(fármaco) e o ambiente aquoso e aumento da interações hidrofóbicas na medida em
25
que o hóspede é inserido na cavidade das CD (DEL VALLE, 2004). Além dessa
vantagem termodinâmica, é importante que seja avaliada a geometria do sistema e a
polaridade da molécula hóspede para que a complexação possa ocorrer (SZENTE;
SJZEJTLI, 2004; VEIGA; PECORELLI; RIBEIRO, 2006).
O tamanho favorável do diâmetro interno da cavidade das CD permite a
formação de CI com a maioria dos fármacos, em que irá afetar positivamente as
propriedades físico-químicas das moléculas hóspedes, proporcionando, assim, uma
série de benefícios possíveis. Dentro do campo farmacêutico, as CD possuem uma
grande aplicabilidade quando se trata de modificar as características físico-químicas
das moléculas hóspedes, em que se pode destacar: aumento da estabilidade física e
química do fármaco; aumento da velocidade de dissolução e, consequentemente, da
sua biodisponibilidade; melhoria da solubilidade de fármacos poucos solúveis;
redução dos efeitos secundários; eliminação de maus odores e sabores
(principalmente, em óleos) e redução da volatilidade de certos fármacos ou princípios
ativos (SZENTE; SJZEJTLI, 2004; FROMMING; SJZEJTLI, 1994; NAGAI; UEDA,
1994).
2.5 Dispersões sólidas (DS)
A terminologia dispersão sólida é descrita em vários trabalhos referindo-se as
formas farmacêuticas em que o fármaco é disperso em uma matriz biologicamente
inerte (carreador), geralmente com o objetivo de melhorar a biodisponibilidade oral,
atividade terapêutica ou alguma outra propriedade físico-química. Sua preparação se
dá pelo método de fusão, evaporação de solvente ou pela combinação de ambos
(SETHIA, SQUILLANTE, 2003; CHIOU et al., 1971). Apesar desta aparente
simplicidade, estes sistemas de dois componentes podem formar estruturas múltiplas
dependendo da sua composição e do histórico de processamento da amostra como é
demonstrado na Figura 5.
26
Figura 5 – As três estruturas possíveis de uma dispersão sólida, onde os
símbolos hexagonais representam moléculas de fármaco e linhas curvas
representam cadeias de polímero. (A) A estrutura ideal de uma dispersão
sólida em que o fármaco está molecularmente disperso na matriz polimérica;
(B) um sistema fármaco-polímero em que ocorreu formação de reítuclos
cristalinos de fármacos e (C) um sistema fármaco-polímero contendo
aglomerados de fármaco amorfos dispersos na matriz polimérica.
Fonte: Elaborada pelo autor
A melhora do perfil de dissolução de um fármaco e de suas propriedades físico-
químicas em função da utilização de dispersões sólidas, pode ser explicada através
dos seguintes fenômenos: redução do tamanho de partícula, o que tem o máximo
efeito no caso de dispersões sólidas do tipo moleculares; melhora da molhabilidade
do fármaco pelo polímero hidrofílico; aumento da porosidade, que depende das
características do polímero carreador; alteração do estado cristalino do fármaco, em
que o fármaco no estado amorfo irá apresentar uma solubilidade maior do que o
fármaco no estado cristalino e possui interações intermoleculares pela ligação de
hidrogênio entre o fármaco e o carreador (VASCONCELOS; SARMENTO; COSTA,
2007; CRAIG, 2002).
27
A primeira geração de dispersões sólidas foi descrita por SekiguchI e Obi em
1961. A primeira geração envolveu a formulação de misturas eutéticas entre fármacos
e carreadores cristalinos altamente hidrofílicos como a ureia, manitol (KANNING,
1964) e sorbitol (JACHOWICZ, 1987). Foi observada a melhora na taxa de dissolução
do fármaco e, consequentemente, o aumento da sua biodisponibilidade. Outras
abordagens mais vantajosas foram pesquisadas, como o preparo de soluções sólidas,
através de dispersões moleculares, em vez de misturas eutéticas (LEUNER;
DRESSMAN, 2000).
Observou-se, no final dos anos sessenta, que as dispersões sólidas em que o
fármaco se mantinha no seu estado cristalino, primeira geração, não podiam ser tão
eficazes como aquelas em que o fármaco estava em estado amorfo (SIMONELLI;
MEHTA; HIGUCHI, 1969). Para melhorar este parâmetro, as dispersões sólidas de
segunda geração contêm carreadores amorfos, que são principalmente polímeros,
onde partículas de fármaco são dispersas molecularmente em polímeros no estado
amorfo (VILHELMSEM et al., 2005). As dispersões sólidas amórficas podem ser
classificadas em soluções e suspensões sólidas, ou mistura de ambas, de acordo com
as interações moleculares entre o fármaco e o carreador hidrofílico. Em soluções
amórficas sólidas, o fármaco e o polímero carreador são completamente miscíveis e
solúveis, originando interação molecular homogênea entre eles. No caso das
suspensões sólidas amórficas, o fármaco tem limitada solubilidade no carreador.
Dessa maneira, do ponto de vista molecular, o sistema é composto por duas fases
(VAN DROOGE et al, 2006).
Os transportadores amorfos podem ser divididos em dois grupos, polímeros de
síntese completa e polímeros à base de produtos naturais. Os polímeros totalmente
sintéticos incluem polivinilpirrolidonas (PVP) (TAYLOR, 1997), polietilenoglicóis (PEG)
(BLEY, 2010) e polimetacrilados (HUANG et al., 2006). Polietilenoglicóis, polímeros
com massa molecular variando de 200 – 300000, são amplamente utilizados como
carreadores em dispersões sólidas devido ao seu baixo ponto de fusão, rápida
velocidade de solidificação, habilidade de formar soluções sólidas, baixa toxicidade e
baixo custo (BLEY; FUSSNEGGER; BODMEIER, 2010). Os polímeros à base de
produtos naturais são compostos derivados, principalmente, por celulose, tais como
hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) (LIM et al., 2010) etilcelulose, hidroxipropilcelulose,
ou derivados de amido (TANAKA et al., 2005). Entre eles, HPMC, PEG e PVP são
mais amplamente utilizados (BIALLECK; REIN, 2011). Todos estes polímeros são
28
solúveis em alguns solventes orgânicos, ou uma variedade deles, no caso de PEG,
PVP, HPMC, portanto, estes polímeros podem ser aplicados para preparar dispersões
sólidas pelo método do solvente. Todos estes polímeros têm uma solubilidade elevada
em água e, por conseguinte, podem melhorar a molhabilidade do fármaco quando as
dispersões sólidas são dispersas em água (VO; PARK; LEE, 2013).
A terceira geração de dispersões sólidas envolvem o emprego de tensoativos,
acarretando melhora pronunciada no perfil de dissolução de fármacos com
solubilidade aquosa limitada, o que aumenta sensivelmente a biodisponibilidade. Uma
estratégia recorrente em pesquisas com dispersões sólidas é o uso de polímeros
hidrofílicos juntamente com tensoativo, por exemplo, polissorbato 80
(DANNEFELSER et al., 2004). A introdução de tensoativos em dispersões sólidas
melhora não apenas o perfil de dissolução, mas também a estabilidade física e
química do fármaco. De fato, tensoativos com estrutura anfifílica podem aumentar a
miscibilidade de fármacos e carreadores e, assim, reduzir a taxa de recristalização de
fármacos. Além disso, tensoativos são capazes de melhorar a molhabilidade dos
fármacos e prevenir a precipitação do fármaco devido à supersaturação, absorvendo
a camada externa de partículas de fármaco ou formando micelas para encapsular
fármacos (VASCONCELOS; SARMENTO; COSTA, 2007).
A dispersão sólida de quarta geração é uma dispersão sólida de liberação
controlada (DSLC) contendo fármacos poucos solúveis em água e,
concomitantemente, com uma vida biológica meio curta. DSLC de fármacos pouco
solúveis em água, muitas vezes requer dois objetivos: maior solubilidade e liberação
sustentada de forma controlada. Na DSLC, a dispersão molecular de fármacos pouco
solúveis no carreador hidrofílico melhorará a solubilidade do fármaco enquanto que
os polímeros insolúveis em água ou os polímeros incháveis podem ser utilizados para
retardar a liberação do fármaco no meio de dissolução (HUANG et al., 2006). Os
polímeros convencionais utilizados para retardar a liberação dos fármacos poucos
solúveis em água incluem acetato de celulose, hidroxipropilcelulose (TANAKA et al.,
2006), Eudragit® (HUANG et al., 2006), óxido de polietileno a etileno e carboxivinil
(OZEKI et al., 2000), uma vez que são insolúveis em água ou dissolvem-se tão
lentamente. Este tipo de dispersão sólida tem dois mecanismos principais pelos quais
a droga é liberada: a difusão e a erosão (VO; PARK; LEE, 2013).
29
2.5.1 Métodos de obtenção de DS
Diversos estudos demonstram que as propriedades físico-químicas de DS
obtidas através de diferentes métodos de preparação estão diretamente relacionadas.
Dessa forma, esse fato se estabelece como pré-requisito no desenvolvimento de DS,
sendo necessária a avaliação da interferência do método utilizado, visando a escolha
daquele que seja mais eficiente com relação à dissolução, propriedades físico-
químicas e a estabilidade dos produtos obtidos nas condições de armazenamento
(BIKIARIS et al., 2005). Os métodos de obtenção de DS mais comumente utilizados
são o método da fusão e da evaporação do solvente (PATEL et al., 2008).
2.5.1.1 Método da fusão
O método de fusão foi proposto pela primeira vez por Sekiguchi e Obi e consiste
em fundir o fármaco junto com o carreador seguido de congelamento e pulverização
para obter o produto (CHIOU; RIEGELMAN, 1971). A mistura é fundida e rapidamente
resfriada, de modo a obter a supersaturação do fármaco, cujas moléculas ficam
aprisionadas entre as moléculas do carreador, devido ao rápido resfriamento que não
permite a nucleação do soluto (SERAJUDDIN, 1999). A obtenção de dispersões
sólidas pelo método da fusão pode ser limitada pela sensibilidade térmica dos
constituintes da formulação, podendo ocorrer dessa forma a degradação das drogas,
porém, apresenta vantagens sobre os métodos de solvente por não apresentar
toxicidade (SETTIA; SQUILLANTE, 2003).
2.5.1.2 Método de evaporação do solvente
Neste método, também conhecido como método de coevaporação, o fármaco
e o carreador são solubilizados em solvente orgânico comum, que é, em seguida,
evaporado sob agitação constante, obtendo-se um resíduo seco e sólido., e o solvente
é evaporado a uma temperatura fixa e a pressão reduzida. Com a remoção do
solvente ocorre uma supersaturação do meio seguido de precipitação simultânea dos
constituintes. A natureza do solvente e sua taxa e temperatura de evaporação são
particularmente críticos nesse método. Paralelamente, a principal desvantagem desse
método é a utilização de solventes orgânicos e a formação de resíduos, apesar de ser
um método simples, de baixo custo e muito utilizado em escala laboratorial, além da
30
dificuldade de selecionar um solvente comum que dissolva o fármaco com
características hidrofóbicas e o carreador hidrofílico (LIMA et al., 2011).
2.5.1.3 Método da malaxagem
Neste método, o polímero e o fármaco são homogeneizados por diluição
geométrica. A mistura é malaxada com adição de uma quantidade mínima de solvente
ou misturas de solventes (equivalente à 10-30 % do peso da mistura) visando a
obtenção de uma pasta. A secagem do material pode ser feita em estufa
acompanhada de pulverização para uniformização do tamanho de partícula. Devido à
simplicidade, ao elevado rendimento e à facilidade de transposição em escala, este
método é um dos mais utilizados na indústria farmacêutica para a obtenção de DS’s
(LIMA et al., 2011).
2.5.1.4 Método de atomização por spray drying
A técnica de spray-drying é um processo de energia de secagem intensiva,
contínua e gradual. Esta técnica envolve a atomização de um produto líquido em uma
corrente de ar quente para obter pós instantaneamente. O processo pode gerar
partículas de tamanho nanométricas ou micrométricas. A secagem por pulverização
pode ser descrita como as reações de estado sólido que ocorrem na conversão da
disposição cristalina da substância num produto amorfo. Historicamente, o processo
de secagem por pulverização tem sido mais amplamente utilizado na indústria
alimentar e química. No entanto, a sua utilização expandiu-se rapidamente para outros
setores, tais como cosméticos e na indústria farmacêutica (SINGH; VAN DEN
MOOTER 2016).
2.5.1.5 Método de co-precipitação
Esta técnica parte de uma solução de fármaco em condições muito próximas a
saturação e através de mudanças bruscas de temperatura ou adição de solventes
orgânicos se obtém a precipitação do material. Os cristais obtidos são coletados por
centrifugação ou filtração. Este método é bastante utilizado em escala laboratorial. No
entanto, o baixo rendimento conseguido em escalas maiores, o risco de formação de
31
complexos de inclusão com solventes orgânicos e o longo tempo do processamento
(um a três dias) torna-o pouco atrativo em escala industrial (NIKGHALB et al., 2012).
2.5.1.6 Método do fluido super-crítico
O processo de fluido supercrítico vem emergindo como um método alternativo
ao método de solvente, formando co-precipitados de pequeno tamanho de partícula e
com baixo teor de resíduo orgânico, apresentando também melhor escoamento. Neste
método, o fármaco e o polímero são dissolvidos em dióxido de carbono (CO2) super-
crítico e pulverizados através de um bocal na região de baixa pressão, causando
expansão adiabática do CO2 e rápido arrefecimento. Deste modo, esta técnica permite
a produção de partículas de fármaco com um tamanho bastante reduzidas. O CO2 é
atualmente o mais utilizado por essa técnica devido às vantagens associadas ao seu
uso, por ser um gás não tóxico, não inflamável, barato e de baixa temperatura crítica,
tornando-se atraente no processamento de fármacos sensíveis ao calor, sendo o
processo remoção do solvente extremamente controlado (AL-MARZOUQI et al., 2007;
BAGHEL et al., 2016).
32
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho foi o desenvolvimento, caracterização e ensaio
de atividade anti-inflamatória de CI e DS da α, β amirina com CD e polímeros
hidrofílicos, respectivamente.
3.2 Objetivos específicos (detalhar mais)
O trabalho teve como objetivos específicos:
• Realização de estudos teóricos computacionais da interação da βCD e
HPβCD com a α, β amirina;
• Obtenção dos CI da α, β amirina pelos métodos de mistura física (MF) e
malaxagem (MAL) e obtenção de DS pelos métodos da MF, MAL e da
rotaevaporação (RE);
• Caracterização espectroscópica da α, β amirina e dos CI e DS na região do
infravermelho por transformada Fourier, para verificação de interações
químicas entre os componentes dos sistemas;
• Caracterização estrutural dos CI e das DS por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) e difração de raio-X (DRX) para verificação de possíveis
alterações estruturais pela complexação da α, β amirina com as CD e com
os polímeros hidrofílicos;
• Avaliação térmica dos CI e das DS por análise termogravimétrica e análise
por calorimetria exploratória diferencial, para avaliação do comportamento
térmico;
• Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro da α, β amirina in natura e
nas DS em linhagens de macrófagos murinos J774.
33
CAPÍTULO I
Artigo I “DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VITRO DE DISPERSÕES SÓLIDAS DE Α, Β
AMIRINA ISOLADAS DE Protium heptaphyllum”
34
Desenvolvimento, caracterização físico-química e atividade anti-inflamatória in
vitro de dispersões sólidas de α, β amirina isoladas de Protium heptaphyllum
Walter Ferreira da Silva Júnior1, Jonas Gabriel de Oliveira Pinheiro, Danielle Lima
Bezerra de Menezes1, Emerson Silva Lima2, Valdir Florêncio da Veiga Júnior3,
Eduardo Pereira de Azevedo4, Ádley Antonini Neves de Lima1*.
1 Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59012-
570, Natal, RN, Brasil.
2 Departamento de Farmácia, Laboratório de Atividade Biológica, Universidade
Federal do Amazonas, 69077-000, Manaus, AM, Brasil.
3 Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal do
Amazonas, 69077-000, Manaus, AM, Brasil.
4 Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Laureate International Universities
– UnP, 59056-000, Natal, RN, Brasil
Autor correspondente: Ádley Antonini Neves de Lima; Universidade Federal do Rio
Grande do Norte – Departamento de Farmácia - Av. Coronel Gustavo Cordeiro de
Farias s/n, Petrópolis - CEP 59012-570 – Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Phone
número: +5584999288864. Fax: +558433429833. E-mail:
35
RESUMO
Α, β amirina (ABAM) é uma mistura natural de triterpenos pentacíclicos que possui
várias atividades biológicas, incluindo o efeito anti-inflamatório. São isoladas das
espécies da família Burseraceae, nas quais a espécie Protium heptaphyllum. Este
trabalho objetivou desenvolver e caracterizar dispersões sólidas (DS) de ABAM com
polímeros hidrofílicos: polivinilpirrolidona (PVP-K30), polietilenoglicol (PEG-6000) e
hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e também avaliação do efeito anti-inflamatório. As
DS foram preparados por métodos de mistura física (MF), malaxagem (MAL) e
rotaevaporação (RE). Para a verificação de qualquer interação entre ABAM e os
polímeros hidrofílicos, a caracterização físico-química foi realizada por meio de
infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura
(SEM), difração de raios-X em pó (XRD), termogravimetria (TG) e calorimetria de
varredura diferencial (DSC). Além disso, um ensaio anti-inflamatório in vitro foi
realizado com ABAM isolada bem como com as DS dos polímeros hidrofílicos
mencionados acima. A caracterização físico-química indicou que as DS foram
capazes de induzir alterações nas características físico-químicas da ABAM. O ensaio
anti-inflamatório in vitro mostrou que as DS foram capazes melhorar a atividade anti-
inflamatória de ABAM e não apresentaram citotoxicidade quando se utilizou a mesma
concentração. Em conclusão, este estudo mostrou o uso potencial das DS como uma
ferramenta eficiente para melhorar as propriedades e atividade anti-inflamatória da
ABAM sem causar citotoxicidade.
Palavras chaves: Amirina. Dispersão sólida. Caracterização. Anti-inflamatório.
36
ABSTRACT
α, β amyrin (ABAM) is a natural mixture of pentacyclic triterpenes that has shown a
variety of pharmacological properties, including anti-inflammatory effect. ABAM is
isolated from the Burseraceae family species, where Protium heptaphyllum is
commonly found in the Brazilian Amazon. This work aimed to develop solid dispersions
(SD) of ABAM with the following hydrophilic polymers: polyvinylpyrrolidone (PVP-K30),
polyethylene glycol (PEG-6000) and hydroxypropylmethylcellulose (HPMC). The SDs
were prepared by physical mixture (PM), kneading (KND) and rotary evaporation (RE)
methods. In order to verify any interaction between ABAM and the hydrophilic
polymers, physicochemical characterization was performed by Fourier transform
infrared (FTIR), scanning electron microscopy (SEM), powder X-ray diffraction (XRD),
thermogravimetry (TG) and differential scanning calorimetry (DSC) analysis.
Furthermore, in vitro anti-inflammatory assay was performed with ABAM alone and as
SDs with the hydrophilic polymers. The results from the characterization analysis show
that the SDs were able to induce changes in the physicochemical properties of ABAM,
which suggests interaction with the polymer matrix. In vitro anti-inflammatory assay
showed that the SDs obtained by RE improved the anti-inflammatory activity of ABAM
and decreased its cytotoxicity. In conclusion, this study showed the potential use of
SDs as an efficient tool for improving the stability and anti-inflammatory activity of
ABAM as well as for reducing its cytotoxicity.
Keywords: Amyrin. Solid dispersion. Characterization. Anti-inflammatory.
37
1 INTRODUÇÃO
A pesquisa de novas alternativas terapêuticas está se tornando forte e
crescente no campo da indústria farmacêutica. Quando se refere à busca de produtos
naturais com potencial bioativo, o Brasil tem um potencial promissor devido à sua
grande biodiversidade (YUNES, 2006). A descoberta de novos fármacos oriundos de
produtos naturais têm sido uma alternativa promissora, pois podem ter mecanismos
de ação inovadores e são fontes de novas entidades químicas com propriedades
biológicas muitas vezes inestimáveis (LI; VEDERAS, 2009; HARVEY et al., 2015).
A α, β amirina (ABAM) é uma mistura de triterpenos pentacíclicos e é
constituinte majoritário da óleo-resina da espécie Protium heptaphyllum
(Burseraceae). Esta mistura de triterpenos têm um esqueleto básico do tipo ursano e
oleano, respecvamente, cuja a principal diferença está na posição do grupamento
metil da posição C-20. Há diversos estudos descritos na literatura que demostraram
atividades para esta mistura triterpênicas, tais como anti-inflamatória (HOLANDA et
al., 2008), gastroprotetora (OLIVEIRA et al., 2004a), antitumoral (BARROS et al.,
2011), ansiolítica (ARAGÃO et al., 2006), hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2005),
dentre outras. No entanto, apesar da sua vasta atividade biológica, problemas como
solubilidade e velocidade de dissolução, que acarreta problemas com a
biodisponibilidade, dificultam seu uso na farmacoterapia.
A utilização de matrizes poliméricas hidrofílicas para o desenvolvimento de
dispersões sólidas (DS) com candidatos a novos fármacos se revela como uma
alternativa eficaz ao aumento das propriedades farmacocinéticas do fármaco. A DS é
um sistema bem estabelecido que tem sido amplamente utilizado devido à sua
abordagem simples e direta (LIMA et al., 2011; ALVES et al., 2014). A miscibilidade
entre fármaco e o polímero hidrofílico é um fator importante tanto para o aumento da
solubilidade como para a estabilidade física do DS obtida (LIMA et al., 2016; WANG
et al., 2017).
Os sistemas entre fármacos e polímeros demonstraram ser uma alternativa
promissora para melhorar a biodisponibilidade oral de fármacos pouco solúveis, onde
um fármaco hidrofóbico é disperso dentro de uma matriz polimérica inerte. Por
conseguinte, a compreensão do sistema fármaco-polímero é de extrema importância
para facilitar a optimização de tais formulações com base em variações estruturais,
estabilidade física e dissolução (MARSAC et al., 2009; LI et al., 2011).
38
Este estudo teve como objetivo desenvolver DS de ABAM com os polímeros
hidrofílicos PVP-K30, PEG-6000 e HPMC com o objetivo de melhorar as propriedades
físico-químicas da ABAM bem como melhorar sua atividade anti-inflamatória. Para
isso, foi avaliado a caracterização físico-química da ABAM in natura e os sistemas
obtidos, assim como a realização de um modelo de inflamação in vitro em linhagem
J774 de macrófagos ativados por lipopolissacarídeo.
39
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material
A ABAM foi obtida a partir das oleorresinas comerciais de Protium adquiridas
no estado da Amazônia, AM, Brasil. PVP K30 e HPMC foram adquiridos a Sigma
Aldrich e PEG 6000 foi obtido de Biotec Labmaster LTD. Foram utilizados reagente
com grau de pureza CLAE e água ultrapura (MilliQ) para as análises no cromatógrafo
líquido de alta eficiência (CLAE). Os demais experimentos, foram utilizados solventes
de grau analítico e água purificada (<1,3 μS) obtida por sistema de osmose reversa,
modelo OS50LX, Gehaka (Brasil).
2.2 Isolamento e identificação da ABAM por CLAE
As análises por CLAE foram efetuadas utilizando o cromatógrafo Shimadzu®
(Tóquio, Japão), modelo Prominence UFLC-XR, equipado com duas unidades de
fornecimento de solventes LC 20-ADRX, unidade de desgaseificação (DGU 20A3),
forno de colunas (CTO-20AC) e detector UV (SPD-M20A) ajustado a 200 nm. Foi
utilizada uma coluna Shim-Pack XR-ODS, com 30 mm de comprimento e 2,0 mm de
diâmetro interno, com tamanho de partícula de 2,2 µm, no desenvolvimento do método
analítico. A ABAM foi dissolvida em acetronitrila em uma concentração de 0,5 mg/mL
e o volume de injeção foi de 5 µL.
Para avaliação dos parâmetros iniciais, foi realizado um gradiente exploratório
amplo, em que se realizou a variação do modificador orgânico (acetronitrila) de 5 a
100 % por 30 minutos em um fluxo de 0,3 mL/min. A partir do gradiente exploratório,
decidiu-se fazer uma corrida isocrática em que a fase móvel consistiu de uma mistura
de acetonitrila e água (acidificada com 0,1% de ácido fórmico) na proporção 88:12 v/v
e fluxo 0,6 mL/min. As amostras foram filtradas em membrana de nylon de 0,45 μm e
diâmetro 13 mm.
2.3 Preparação das DS
40
As DS foram preparadas por três métodos diferentes: mistura física (MF),
malaxagem (MAL) e rota-evaporador (RE), utilizando a razão em peso de 1: 1
(ABAM: polímero hidrofílico).
2.3.1 DS obtidas por MF
A ABAM e os respectivos polímeros (PVP K-30, PEG 6000 ou HPMC) foram
pesados com precisão seguindo a relação (1: 1 (p/p)), obtendo uma mistura de 300
mg. Além disso, as misturas foram homogeneizadas com gral e pistilo e armazenados
em dessecadores de vidro a vácuo até à sua utilização.
2.3.2 DS obtidas por MAL
A ABAM e cada polímero foram pesados (1:1 (p/p)) e homogeneizados com
gral e pistilo, seguida de uma adição de uma mistura, cerca de 10% de volume do
peso total, de acetona: água (75:25 (v/v)) até a formação de uma pasta. Os solventes
foram evaporados em uma estufa durante 15 horas a uma temperatura de 60 °C e
depois o pó resultante foi armazenado em dessecador a vácuo até futuras análises.
2.3.3 DS obtidas por RE (FTIR e IV)
A ABAM e cada polímero foram pesados separadamente (1:1; p:p) e
dissolvidos numa solução de acetona: água (75:25; v:v) seguido por evaporação sob
vácuo a 75 °C utilizando um rotaevaporador GEHAKA IKA ® modelo RV 10 (Brasil),
operando a 150 rpm durante 20 minutos. A DS resultante foi mantida em dessecador
até análises futuras e para evaporação do solvente residual.
2.4 Caracterização físico-química
Para verificar qualquer interação entre a ABAM e o polímero correspondente
de cada DS, foram realizados ensaios de caracterização por espectroscopia no
infravermelho por transformada Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura
(MEV), difração de raios (DRX), análise termogravimétrica (TG) e calorimetria
exploratória diferencial (DSC).
41
2.4.1 Análise físico-química por FTIR
A análise espectroscópica por FTIR foi realizada no equipamento IR Prestige-
21 da Shimadzu ® (Tóquio, Japão), onde as amostras foram preparadas com pastilhas
de KBr utilizando uma prensa hidráulica a 10 toneladas de pressão. A análise foi
realizada na região 400-4000 cm-1 com 15 varreduras e resolução espectral de 4 cm-
1.
2.4.2 Análise morfológica por MEV
As amostras foram montadas em stubs de alumínio usando fita dupla-face de
carbono. A análise morfológica foi realizada num microscópio Hitachi TM-3000
Tabletop com uma ampliação de 500x. As fotomicrografias foram obtidas a um
potencial de aceleração de 15 kV sob pressão reduzida.
2.4.3 Análise cristalina por DRX
A análise por DRX em pó foi realizada utilizando um Bruker D2 Phaser
(Massachussets, EUA), com radiação CuKa (λ = 1,54 Å) a uma tensão de 30 kV e
uma corrente de 15 mA utilizando um detector Lynxeye. As amostras foram
examinadas à temperatura ambiente ao longo de um período de 2 horas numa gama
de 5-40° a 0,05 ° / s.
2.4.4 Análise térmica por TG/DTG
Os termogramas de TG foram obtidos utilizando um TGA-50 Shimadzu®
(Tóquio, Japão) na faixa de temperatura de 30-600 °C, utilizando cadinhos de alumina
com aproximadamente 2 mg de amostras sob atmosfera dinâmica de N2 (50 mL.min-
1) e aquecimento Taxa de 10 °C.min-1. O TG / DTG foi calibrado utilizando o padrão
CaC2O4 ∙ H2O em conformidade com a American Society for Testing and Materials
(ASTM).
2.4.5 Análise térmica por DSC
42
A análise térmica DSC foi realizada em um DSC-50 Shimadzu® (Tóquio, Japão)
utilizando aproximadamente 2 mg de amostra em cadinhos de alumínio sob atmosfera
dinâmica de N2 (50 mL.min-1) e taxa de aquecimento de 10 ° C.min-1 a uma faixa de
temperatura de 30-500 °C. A temperatura e o fluxo de calor do instrumento DSC foram
calibrados com índio (ponto de fusão = 157,5 ºC e ΔH = 26,7 J g-1).
2.5 Ensaio de atividade anti-inflamatória in vitro
Para avaliar a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos murinos J774
estimulados com LPS, os níveis de nitrito em meio de cultura foram medidos pela
reação de Griess. As células foram cultivadas em placas de cultura de 24 poços a
uma densidade de 1x106 células / mL e incubadas a 37 °C numa atmosfera de CO2 a
5% durante 2 horas para a adesão de macrófagos. As células foram estimuladas com
1 mL de LPS durante 60 minutos. Após estimulação, as células foram tratadas com
ABAM in natura e com as dispersões sólidas a uma concentração de 20 μg/mL. A
cultura foi de novo incubada a 37 °C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 24 horas,
onde o sobrenadante foi então recolhido para quantificação de NO.
2.5.1 Quantificação de óxido nítrico (NO)
A inibição da produção de NO foi determinada medindo os níveis de nitrito no
sobrenadante das células de macrófagos J774 estimuladas com LPS. O NO,
determinado como o acúmulo de nitrito (NO2-) no sobrenadante, foi medido
espectrofotometricamente utilizando o reagente de Griess (VERMA et al., 2010;
SHRESTHA et al., 2008).
Em placas de 96 poços, alíquotas de 50 mL de sobrenadantes de células foram
misturadas com 100 mL de reagente de Griess (mistura 1:1 de dicloridrato de
sulfanilamida a 1% e N-[1-naftil]-etilenodiamina 0,1%), seguido de incubação durante
10 minutos à temperatura ambiente e protegido da luz. A absorbância a 570 nm foi
determinada espectrofotometricamente num leitor de microplacas.
2.5.2 Ensaio de viabilidade celular
43
A viabilidade do crescimento celular foi determinada utilizando o ensaio de
brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). Resumidamente,
as linhas celulares foram crescidas em meio DMEM contendo FBS a 10% e
plaqueadas a uma densidade de 3,4x103 células/poço em placas de 96 poços. Após
24 h, adicionou-se a cada poço meio fresco contendo FBS a 10% e 20 μL de solução
MTT (Sigma, 5 mg / ml), seguido de incubação durante mais 4 h a 37 ° C. A quantidade
de MTT-formazan gerada foi medida a 540 nm utilizando um leitor de placas de
microcultura. Cada medição individual foi realizada em triplicata.
2.5.3 Análises estatísticas
Todos os resultados são apresentados como média ± desvio padrão. Realizou-
se o two way ANOVA com o post test de Bonferroni utilizando o GraphPad Prism
versão 5.0 (San Diego, CA, EUA). Valores de p inferiores a 0,05 foram considerados
estatisticamente significativos.
44
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Isolamento e identificação da ABAM por CLAE
O desenvolvimento do método analítico envolve a otimização de vários
estágios como a preparação da amostra, a separação cromatográfica e a
quantificação. Parâmetros como a fase móvel, a vazão, a coluna cromatográfica e o
comprimento de onda de detecção devem ser pré-estabelecidos com critério
(VELLOSO et al., 2009).
Inicialmente, foi realizado um screening inicial para avaliação e otimização da
melhor condição cromatográfica para resultar em alta qualidade de separação dos
isômeros α amirina e β amirina no menor tempo possível. O uso do gradiente
exploratório permitiu conhecer a complexidade da amostra fornecendo um importante
indicativo da proporção da fase móvel que podem resultar numa separação mais
adequada. A partir da corrida isocrática, foi possível separar os triterpenos α amirina
e β amirina em um tempo menor, porém, optou-se por acidificar a água para melhorar
a resolução entre os picos.
É mostrado, na Figura 1, o cromatograma obtido através da CLAE apresenta
dois picos bem característicos. De acordo com Dias e colaboradores que utilizaram
condições semelhantes, pode-se sugerir a α amirina eluindo com tempo de retenção
(TR) de 9,285 minutos e a β amirina com um TR de 8,255 minutos, numa proporção de
áreas de aproximadamente 1,5 para 1, respectivamente. A condição estabelecida
para a purificação dos triterpenos ainda pode ser otimizada para diminuir o tempo de
corrida, que foi de, aproximadamente, 12 minutos. Porém, vale ressaltar que esses
triterpenos foram obtidos com alto grau de pureza, a partir de oleorresinas comerciais
de Protium heptaphyllum.
45
Figura 1 – Cromatograma da mistura de triterpenos ABAM obtida da resina de
Protium.
Fonte: elaborada pelo autor a partir do software do equipamento
3.1 Caracterização físico-química
3.1.1 Estudos de IV
A espectroscopia de absorção na região do infravermelho é uma análise útil na
caracterização físico-química de compostos orgânicos, porque permite a identificação
de grupos funcionais que por outras técnicas seria de difícil detecção. A radiação
infravermelha se converte, quando absorvida por moléculas orgânicas, em energia de
vibração molecular. O espectro vibracional aparece como uma série de bandas, pois
cada variação de nível de energia vibracional corresponde a uma série de mudanças
de níveis de energia rotacional. A porção de maior utilidade, na área farmacêutica,
está compreendida entre 4000 e 400 cm-1 e se denomina região média do
infravermelho. Essa região é bastante utilizada para a identificação estrutural de
moléculas, uma vez que cada molécula orgânica apresenta um espectro na região do
infravermelho que é inerente a molécula e que não se repete (SILVERSTEIN, 2006).
β-amirina
α-amirina
46
A Figura 2 mostra os espectros de FTIR da ABAM, dos polímeros hidrofílicos e
das DS. De acordo com o espectro de FTIR para ABAM, a banda de alta intensidade
encontrada a aproximadamente 2800 cm-1 está associada à deformação axial das
ligações C-H em cadeias cíclicas. De fato, a maior parte da estrutura da ABAM
consiste em cadeias de cicloalcanos. Além disso, a banda na região 3250-3400 cm-1
é atribuída ao grupo hidroxilo (O-H) ligado a uma cadeia de cicloalcano e o da região
1031-1100 cm-1 é devido à vibração da ligação C-O. Finalmente, a banda na região
1400-1350 cm-1 é característica da deformação angular dos grupos dimetil e metil
germinativos de dupleto (SINGH et al., 2015, ABDEL-RAOUF et al., 2015).
O espectro de FTIR para o HPMC mostra uma banda de alta intensidade na
região de 3443 cm-1 relacionada com o alongamento da ligação OH, bem como a 2935
cm-1 correspondendo ao alongamento da ligação CH, em 1651 cm-1 correspondente
a ligação C = O de unidades de glucose e a 1069 cm-1, que está relacionada com C-
O-C. Por outro lado, o espectro de FTIR do PEG 6000 mostra bandas a 2980 cm-1,
que é devido ao alongamento da ligação CH, e outra a 1110 cm-1 relacionada com o
alongamento de uma ligação éster . O espectro do PVP K-30 revela bandas fortes em
torno de 2955 cm-1 correspondendo ao alongamento da ligação C-H, bem como a
1647 cm-1 correspondendo ao alongamento da ligação C-O. Observa-se uma banda
larga a aproximadamente 3425 cm-1, o que é atribuído à presença de moléculas de
água como confirmado por análise termogravimétrica.
Quando se compara o espectro das misturas físicas da ABAM com HPMC com
as de cada composto isolado, observa-se uma sobreposição espectral como resultado
da soma de cada composto isolado. Por outro lado, podem ser observadas alterações
significativas nos espectros das DS obtidas através de MAL e RE, especialmente na
região da impressão digital em torno de 1500 cm-1. Além disso, pode-se observar uma
ampliação da banda em torno de 3250-3400 cm-1 e uma diminuição da intensidade de
uma a 2800 cm-1 na DS obtida por RE.
47
Figura 2 – Espectros FITR da ABAM, polímeros hidrofílicos e suas respectivas
dispersões sólidas
Fonte: elaborada pelo autor
Os espectros de FTIR da MF da ABAM com o PEG 6000, bem como as suas
dispersões sólidas obtidas por MAL e RE, mostram uma diminuição na banda na
região 3250-3400 cm-1 em comparação com a da própria ABAM. No entanto, a
diminuição desta banda foi muito mais intensa na dispersão sólida preparada por MAL
e RE quando comparada com a MF. Além disso, a intensidade da banda em torno de
2800 cm-1 (característica das ligações C-H em cadeias alifáticas de ABAM) diminuiu
na DS preparada tanto pela MAL como pelo RE. No entanto, não foram observadas
alterações significativas entre o espectro FTIR da ABAM com o da sua MF. Observou-
se também uma diminuição significativa da intensidade das bandas na região de 1600-
750 cm-1 no DS da ABAM com PEG 6000 preparado por MAL e RE, enquanto que um
aumento nestas bandas foi observado com a MF de ABAM e PEG 6000. Portanto, as
48
alterações mais significativas na intensidade das bandas na região de impressão
digital de ABAM ocorreram com a DS preparado com PEG 6000 por RE, o que parece
indicar uma maior interação entre ABAM e PEG 6000.
Os espectros IV das misturas físicas de ABAM com o PVP K-30 bem como as
suas dispersões sólidas obtidas por MAL e RE foram também comparados com o de
ABAM isolado. Pode ser observada uma diminuição na intensidade e um alargamento
da banda na região em torno de 3250-3400 cm-1. Não foram observadas alterações
significativas em torno de 2800 cm-1 na MF e nas DS de ABAM e PVP K-30. Uma nova
banda de baixa intensidade aparece na região 1600-750 cm-1, tanto em MF como nas
DS, o que pode indicar uma interação entre ABAM e PVP K-30. No entanto, mudanças
significativas ocorreram nas bandas na região de impressão digital de ABAM quando
em dispersão sólida com PVP K-30 preparada por RE, o que indica maior interação
através deste método.
3.1.2 Análise morfológica por MEV
A MEV é uma técnica comumente empregada para caracterizar a morfologia e
forma de partículas de dispersões sólidas. Esta análise é de grande utilidade. Porque
as características morfológicas das partículas têm importante relevância industrial,
interferindo em processos como a compressibilidade do pó (FU et al., 2012)
As micrografias dos polímeros hidrofílicos, ABAM, MF e DS são mostradas na
Figura 3. As partículas ABAM apresentaram-se como estruturas aciculares bem
definidas com formas regulares e aspecto tridimensional, o que é características de
cristais (SILVA-JÚNIOR et al., 2017). O PVP K-30 (Figura 3D) apresentou partículas
esféricas e amorfas, enquanto as partículas de PEG-6000 (Figura 3C) e HPMC (Figura
3B) apresentaram formas irregulares e indefinidas.
As micrografias da MF da ABAM com HPMC (Figura 3E), PEG 6000 (Figura
3F) e PVP K-30 (Figura 3G) podem mostrar claramente uma heterogeneidade
morfológica, o que indica que a ABAM é simplesmente dispersa na superfície do
polímero. Por outro lado, as DS preparadas por MAL e RE mostram uma alteração
geral na morfologia, evidenciada pela ausência de cristais de ABAM (Figuras 3H a
3M). A morfologia de cada componente individual não pode ser distinguida nos DS, o
que parece indicar que o ABAM está molecularmente dispersa dentro da matriz
polimérica. Vale ressaltar que uma película polimérica foi formada na DS da ABAM
49
com HPMC (Figura 3H, MAL) e (Figura 3K, RE), o que parece ser devido à capacidade
de os derivados de celulose formarem películas após o solvente ser evaporado. Este
fenómeno não foi observado com os outros polímeros.
Figura 3 – Micrografias da ABAM (A), HPMC (B), PEG (C), PVP (D), MF-HPMC
(E), MF-PEG (F), MF-PVP (G), MAL-HPMC (H), MAL-PEG (I), MAL-PVP (J), RE-
HPMC (K), RE-PEG (L) e RE-PVP (M).
Fonte: elaborada pelo autor
50
3.1.3 Análise cristalina por DRX
Com o intuito de analisar uma possível alteração na estrutura cristalina da
ABAM em decorrência da obtenção de DS, conforme sugerido pelas análises de MEV,
e também avaliar o grau de cristalinidade das amostras (DONG; BOYD, 2011), os
experimentos de DRX foram realizados
Os difratogramas de raios X da ABAM e cada polímero, bem como as
respectivas MF e DS correspondentes são apresentados na Fig. 4. De acordo com o
conceito de pós cristalinos, estes sólidos são caracterizados por possuírem estruturas
tridimensionais bem definidas capazes de difratar os raios X e exibirem um ponto de
fusão bem definido (SHARMA; MAZUMDAR, 2013). O difratogramas de raios X do
PVP e HPMC exibiram um padrão halo, que é característico de pós amorfos
(PAPADIMITRIOU et al., 2012), enquanto PEG 6000 apresenta um padrão de difração
a 18,9 ° e 23 °, caracterizando um polímero semi-cristalino (LIMA et al., 2011). Por
outro lado, picos de difração cristalinos intensos podem ser observados em 13 ° no
difratograma da ABAM. Além disso, estão presentes no difratograma ABAM outras
reflexões cristalinas de intensidades inferiores a 6 °, 10 °, 11 °, 14 ° e 16 ° (SILVA-
JUNIOR et al., 2017).
A cristalinidade das partículas de ABAM explica a sua baixa solubilidade
aquosa, o que prejudica a sua dissolução quando utilizado em formas de dosagem
sólidas. Por conseguinte, a amorfização que ocorre com fármacos em dispersões
sólidas conduz habitualmente a um aumento significativo na dissolução do fármaco
(RIEKES et al., 2015; SHI et al., 2015). Embora as reflexões cristalinas de ABAM
tenham sido ligeiramente reduzidas na MF com HPMC, não se observou alteração
com as MF obtidas com PVP K-30 e PEG 6000, o que indica que as MF não foram
capazes de reduzir significativamente a cristalinidade de ABAM. As DS de ABAM
obtidos por MAL com PEG 6000 (Figura 4B) e PVP K-30 (Figura 4C) alteraram
ligeiramente a cristalinidade de ABAM, que é semelhante ao que ocorreu com as MF.
A DS de ABAM com HPMC preparado por KND (Fig. 4A) mostrou uma maior redução
nos reflexos cristalinos de ABAM. Os padrões de DRX dos DS obtidos por RE mostram
que este método é mais eficaz na redução da cristalinidade de ABAM. Por
conseguinte, DS de ABAM com ambos HPMC e PVP obtidos por RE, reduziu
significativamente a cristalinidade ABAM como a maioria de suas reflexões cristalinas
quase desapareceu. O DS de ABAM com PEG 6000 preparado por RE reduziu a
51
cristalinidade de ABAM em maior medida quando comparado com os métodos MF e
MAL, contudo, manteve-se grande parte das reflexões cristalinas de ABAM.
Figura 4 – Padrão de difração de raios-x da ABAM, os polímeros
hidrofílicos, as misturas físicas e as dispersões sólidas
Fonte: elaborada pelo autor
3.1.4 Análise térmica por TG
O comportamento térmico dos produtos farmacêuticos é crucial, pois pode
fornecer informações importantes sobre armazenamento e estabilidade. Além disso,
também pode revelar incompatibilidades entre fármaco e excipientes (RAMOS;
CAVALHEIRO, 2007). A curva de TG para ABAM mostra apenas um estágio bem
definido de perda de massa, como evidenciado na curva DTG (Figura 6), que está
relacionado à sua volatilização (Figura 5). A porcentagem de perda de massa (Δm%)
52
foi de cerca de 99,5%, onde as temperaturas inicial e final da perda de massa foram
232 e 347 ° C, respectivamente. Os resultados de TG para HPMC mostraram elevada
estabilidade térmica, cuja perda de massa ocorreu numa única etapa, começando a
335 ° C e terminando a 425 ° C com aproximadamente 93% de Δm% (Figura 5A). O
PEG 6000 também apresentou uma única etapa para perda de massa (93,5%) dentro
da faixa de temperatura de 338 a 448 ° C (Figura 5B). A curva de TG para o PVP K-
30 mostra uma perda de massa relacionada ao seu teor de água (Δm = 13%), que
ocorreu entre 42 e 102 ° C. Adicionalmente, observou-se um processo principal de
decomposição entre 400 e 488 ° C (68% De perda de massa), seguido de
carbonização (Figura 5C).
Todos os sistemas dispersos mostraram um aumento na estabilidade térmica
quando comparados com ABAM sozinha, sugerindo que os polímeros hidrofílicos
utilizados neste estudo foram capazes de proteger este fármaco. Para ABAM e HPMC,
não foi observada grandes diferenças entre as curvas TG de MF, MAL e RE. Por outro
lado, as DS da ABAM com PEG (Figura 5B) preparados pelos métodos MF e RE
apresentaram maior estabilidade térmica em comparação com o obtido pelo MAL. As
curvas TG da MF e DS preparadas com PVP K-30 (Fig.5C) mostraram uma perda de
massa inicial devido à água, o que está de acordo com a curva TG para PVP K-30
sozinha. Além disso, as amostras preparadas por MF e RE apresentaram melhores
resultados do que as preparadas pelo MAL, onde o DS preparado por RE apresentou
o melhor resultado com relação ao aumento da estabilidade térmica do ABAM.
53
Figura 5 – Curvas termogravimétricas da ABAM, polímeros hidrofílicos,
misturas físicas e dispersões sólidas
Fonte: elaborada pelo autor.
54
Figura 6 – Curvas derivadas termogravimétricas (DTG) da ABAM, polímeros
hidrofílicos, misturas físicas e dispersões sólidas
Fonte: elaborado pelo autor.
3.1.5 Análise térmica por DSC
As curvas DSC para ABAM (Figura 7) mostram dois eventos endotérmicos
entre 158 e 185 ° C, possivelmente relacionados com a fusão dos dois isómeros. Estes
dois eventos são seguidos por um terceiro evento endotérmico, que coincide com a
perda de peso por volatilização observada na análise TG da ABAM sozinha (SILVA-
JÚNIOR et al., 2017). Embora o PVP K-30 tenha vários eventos endotérmicos devido
à perda de água na faixa de 50-120 ° C (perda de peso de 12,26%), não é esperado
nenhum evento endotérmico devido à sua característica amorfa. Um comportamento
semelhante foi encontrado com HPMC, que é outro polímero amorfo, onde um evento
endotérmico inicial relacionado à perda de água é observado. Para o PEG, observa-
se um evento endotérmico de fusão em torno de 65 ° C, o que é provavelmente
MAL
PVP
55
relacionado com a fusão do polímero, uma vez que é caracterizado como uma
substância cristalina e apresenta ponto de fusão bem definido.
A curva DSC para MF de ABAM com HPMC mostra uma depressão do ponto
de fusão de ABAM, que parece estar relacionada com uma solubilização parcial deste
fármaco na matriz polimérica, embora o evento de fusão confirme a natureza cristalina
do ABAM na MF. Por outro lado, as DS obtidas com HPMC (MAL e RE) mostraram
uma supressão quase total do ponto de fusão do ABAM, sugerindo sua amorfização
do último. Em relação aos sistemas obtidos com PEG 6000, as curvas DSC para as
amostras obtidas por MF e MAL mostram que os picos endotérmicos relacionados à
fusão ABAM ainda persistem, confirmando seu caráter cristalino. No entanto, a curva
para a DS obtida por RE mostra o desaparecimento quase completo deste evento
endotérmico, que pode ser atribuído à solubilização de ABAM na matriz de PEG 6000
antes de atingir sua temperatura de fusão. Achado semelhante foi observado na figura
4C do DRX e por Kumar e Mishra (2006) em estudo de DS de meloxicam com PEG
6000. As amostras preparadas com PVP-K30 por MF e MAL mostram curvas DSC
com pontos de fusão diminuídos para ABAM, enquanto a DS preparada por RE não
apresenta nenhum evento endotérmico, indicando a formação de uma dispersão
sólida, em que o fármaco parece estar disperso no estado amorfo.
56
Figura 7 – Curvas de DSC da ABAM, polímeros hidrofílicos, misturas físicas e
dispersões sólidas
Fonte: elaborado pelo autor
3.2 Ensaios biológicos
3.2.1 Quantificação de NO em linhagem de macrófagos J774 estimulados por
lipopolissacarídeo chamar o drx
A inflamação é um dos processos mais importantes envolvidos no sistema de
defesa do organismo, mas muitas vezes progride para doenças crônicas que
requerem tratamento farmacológico. Os produtos naturais, incluindo os metabólitos
das plantas, representam um grande potencial para o desenvolvimento de fármacos
57
terapêuticos modernos com atividade anti-inflamatória (CALIXTO et al., 2013). O óxido
nítrico (NO-2) é um dos principais mediadores da inflamação e sua superprodução está
associada a doenças graves como choque séptico, artrite, acidente vascular cerebral,
doenças inflamatórias crônicas e doenças autoimunes. Assim, a determinação da taxa
de produção de NO-2 em modelos celulares estimulados com LPS tem sido
amplamente utilizada como um parâmetro importante na busca de fármacos anti-
inflamatórios (SHIH et al., 2010).
Neste estudo, investigou-se o efeito da ABAM e suas dispersões sobre a
produção de NO-2 em macrófagos de linhagem J774 estimulada por LPS. O potencial
anti-inflamatório de ABAM e suas DS é mostrado na Figura 8. A ABAM sozinha bem
como DS (concentração de 20 μg / mL) inibiram a produção de óxido nítrico quando
comparado ao grupo LPS. Observando a atividade inibitória contra a produção de NO-
2, é evidente que as DS apresentaram a mesma inibição do que a ABAM sozinha (p>
0,05). Deste modo, esta descoberta indica que as DS de ABAM preparadas com os
polímeros hidrofílicos utilizados neste estudo mantiveram a atividade anti-inflamatória
de ABAM.
58
Figura 8 – Efeito da ABAM isolada e suas DS na produção de NO-2 em
macrófagos da linhagem J774 estimulada por LPS. (A) Produção de NO-2 na da
ABAM isolada e as MF com os respectivos polímeros comparado com o do
grupo LPS. (B) produção de NO-2 na presença de ABAM isolada e suas DS
preparadas por MAL em comparação com o do grupo LPS. (C) produção de
NO-2 na presença de ABAM isolada e suas DS preparadas por RE comparado
com o do grupo LPS. Valores expressos como média ± DP com n = 5. * p
<0,0001 quando comparado com o grupo LPS por one-way ANOVA seguida
pelo teste de Bartlett.
3.2.2 Ensaio de viabilidade celular
Muitos compostos derivados de plantas podem modular a proliferação celular,
atuando como agentes citotóxicos, como é o caso de fármacos com atividade
59
antineoplásica. Por outro lado, podem atuar estimulando o crescimento celular com
potencial aplicação na cicatrização de feridas (BISKUP et al., 2012).
A capacidade da ABAM e das suas MF e DS na interferência da viabilidade
celular é mostrada na Figura 9. Os resultados mostram que não foi encontrada
diferença significativa (p <0,05) entre as dispersões de ABAM e a do grupo de
controle, apresentando viabilidade celular superior a 80 %, que classifica o ABAM e
as suas DS como não citotóxicos. Portanto, os resultados demonstraram que tanto a
ABAM como suas DS são seguros a uma concentração de 20 μg/mL no que se refere
a morte celular. O efeito citotóxico baixo ou ausente, além da atividade anti-
inflamatória confirmada, é crítico na investigação de novos compostos e novos
sistemas terapêuticos como potenciais agentes anti-inflamatórios.
Figura 9 – Efeito da ABAM isolada e suas DS na viabilidade celular. (A)
Viabilidade celular das MF e da ABAM comparadas com o grupo controle, (B)
Viabilidade celular das DS obtidas por MAL e da ABAM comparadas com o
grupo controle e (C) Viabilidade celular das DS obtidas por RE e da ABAM
comparadas com o grupo controle. O valor de p < 0,05 quando comparado com
o grupo controle por one-way ANOVA seguido pelo teste de Barlett
60
61
4 CONCLUSÃO
Neste estudo, a caracterização físico-química indicou que o ABAM foi
desenvolvida com sucesso em dispersões sólidas com HPMC, PEG 6000 e PVP-K30,
utilizadas como matrizes poliméricas hidrofílicas. A diminuição da cristalinidade de
ABAM, confirmada por análise XRD e DSC, indica a formação de dispersões sólidas
amorfas, onde o método por RE causou a amorfização mais significativa. A ABAM e
as suas SD mostraram-se seguras porque não mostraram uma redução significativa
na viabilidade de macrófagos murinos da linhagem J774 após 24 horas de tratamento.
Tanto o ABAM isolado quanto os DS inibiram a produção de NO quando comparado
ao grupo LPS, mostrando seu potencial anti-inflamatório. Estudos adicionais precisam
ser realizados para investigar a influência da redução da cristalinidade de ABAM na
sua solubilidade aquosa.
62
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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66
CAPÍTULO II
Artigo II “DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA NO
ESTADO SÓLIDO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE α,β AMIRINA ISOLADAS
DE Protium heptaphyllum”
67
Desenvolvimento e caracterização físico-química no estado sólido de
complexos de inclusão de α, β amirina isoladas de Protium heptaphyllum”
Walter Ferreira da Silva Júnior1, Danielle Lima Bezerra de Menezes1, Jonas Gabriel
de Oliveira Pinheiro1, Sofia Santos da Silva1, Euzébio Guimarães Barboosa1,
Emerson Silva Lima2, Valdir Florêncio da Veiga Júnior3, Ádley Antonini Neves de
Lima1*.
1 Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59012-
570, Natal, RN, Brasil.
2 Departamento de Farmácia, Laboratório de Atividade Biológica, Universidade
Federal do Amazonas, 69077-000, Manaus, AM, Brazil.
3 Departamento de Química, Institute de Ciências Exatas, Universidade Federal
Amazonas, 69077-000, Manaus, AM, Brazil.
Autor correspondente: Ádley Antonini Neves de Lima; Universidade Federal do Rio
Grande do Norte – Departamento de Farmácia - Av. Coronel Gustavo Cordeiro de
Farias s/n, Petrópolis - CEP 59012-570 – Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Phone
69
RESUMO
A α, β amirina (ABAM) é uma mistura natural de triterpenos pentacíclicos que possui
uma ampla variedade de atividades biológicas. São isoladas das espécies da família
Burseraceae, nas quais a espécie Protium heptaphyllum é a espécie mais comumente
encontrada na Amazônia brasileira, da qual foi isolada a mistura. Este trabalho
objetivou desenvolver complexos de inclusão (CI) da ABAM com as ciclodextrinas
(CD) betaciclodextrina (βCD) e a hidroxipropilbetaciclodextrina (HPβC). Os CI foram
preparados pelos métodos de mistura física (MF) e malaxagem (MAL). Para a
verificação de qualquer interação entre ABAM e as CD, bem como a formação de CI,
realizou-se a caracterização físico-química no estado sólido por meio de técnicas
como a espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR),
microscopia eletrônica de varredura (MEV), difração de raios-X (DRX),
termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC). Além disso,
realizou-se um estudo teórico-computacional para o entendimento da dinâmica
molecular de complexação. A análise teórica-computacional permitiu demonstrar a
formação de CI em proporção molecular de 1:1 e que a entrada da ABAM na cavidade
das CD’s são por ângulos diferentes. A caracterização físico-química indicou a
formação de CI com ambas as CD e que foram capazes de induzir alterações nas
características físico-químicas da ABAM como pode ser visto pelas alterações
cristalinas, espectroscópicas, térmicas e morfológicas das moléculas. Os CI obtidos
por MAL demonstraram ter a maior capacidade de complexar a ABAM na cavidade
das CD, o qual foi verificado nas técnicas realizadas para caracterizá-los. Em
conclusão, este estudo desenvolveu um novo insumo farmacêutico e mostrou o uso
potencial dos CI como uma ferramenta eficiente para melhorar as propriedades físico-
química da ABAM visando uma futura formulação.
Palavras chaves: Amirina. Ciclodextrinas. Complexos de inclusão. Caracterização.
70
ABSTRACT
α, β amyrin (ABAM) is a natural mixture of triterpenes pentacyclics that has a wide
variety of biological activities. Are isolated from the species in the family Burseraceae,
in which the species Protium is system more commonly found in the brazilian Amazon.
This work aimed to develop inclusion complexes (IC) of ABAM the cyclodextrins (CD)
betacyclodextrin (βCD) and hydroxypropylbetacyclodextrin (HPβC). The IC were
prepared by mixing physical methods (MF) and kneading (KND). For the verification of
any interaction between ABAM and the CD, as well as the formation of CI, the
physicochemical characterization in the solid state by means of techniques such as
infrared spectroscopy (FTIR) Fourier transform, scanning electron microscopy (SEM),
x-ray diffraction (DRX), Thermogravimetry (TG) and differential scanning calorimetry
(DSC). In addition, a theoretical-computational study to understand the molecular
dynamics of complexation. Physicochemical characterization indicated the formation
of CI with both CD and that the CI were able to induce changes in physicochemical
properties of the ABAM. The CI obtained by it demonstrated the greatest capacity for
complex the ABAM in the cavity of the CDs, which was verified in the techniques
performed to characterize them. In conclusion, this study has developed a new
pharmaceutical input and showed the potential use of IC as an efficient tool to improve
the physical and chemical properties of ABAM aiming at a future formulation.
Keywords: Amyrin. Cyclodextrin. Inclusion complexes. Characterization.
71
1 INTRODUÇÃO
Aproximadamente, 40% das novas entidades químicas com uma variedade de
atividade biológica descobertas possuem baixa solubilidade aquosa e,
consequentemente, baixa biodisponibilidade. Este fato torna necessária a utilização
de estratégias tecnológica farmacêutica para melhorar essas propriedades a fim de
que essas entidades sejam viáveis para a utilização de medicamentos. Preparar
complexos de inclusão tem sido uma estratégia viável para administrar substâncias
de baixa solubilidade com eficiência no organismo (KARAVAS et al., 2007; SALTÃO;
VEIGA, 2001).
α, β amirina (ABAM) é uma mistura de triterpenos pentacílicos que são
constituídos de seis unidades isoprênicas e sintetizados a partir da ciclização do
esqualeno (SHENG; SUN, 2011). Apresentam uma gama de atividades biológicas, por
isso, o interesse nestes triterpenos tem sido bastante crescente. Dentre as atividades
biológicas dos triterpenos ABAM destacam-se anti-inflamatória (HOLANDA et al.,
2008), gastroprotetora (OLIVEIRA et al., 2004a), antitumoral (BARROS et al., 2011),
ansiolítica (ARAGÃO et al., 2006), hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2005), dentre
outras. Considerando que a mistura ABAM possui uma lipofilicidade bastante
pronunciada, e que estudos de disposição cinética destes triterpenos em ratos
mostraram baixa biodisponibilidade para o composto puro e no extrato (0,86% vs
3,83%) (CHING et al., 2011), torna-se importante o desenvolvimento de um sistema
ou formulação que seja capaz de permitir a viabilização da α, β amirina como
medicamento, bem como promover melhoria nas suas características físico-químicas.
As ciclodextrinas (CD) são oligossacarídeos cíclicos, naturais ou sintéticos, de
formato tronco-cônico que possuem a superfície externa hidrofílica e a cavidade
interna hidrofóbica que permite complexar moléculas lipofílicas formando os
chamados complexos de inclusão (CI) (VEIGA et al., 2006, SORES-SOBRINHO et al.,
2012). A formação de CI com CD é uma das metodologias mais empregadas para
aumentar a solubilidade de fármacos na indústria farmacêutica. As CD têm a
capacidade de se ligar por interações não covalentes a moléculas orgânicas em
solução aquosa ou no estado sólido e são capazes de modificar as características
físico-químicas do fármaco, o que acarreta numa maior solubilidade, estabilidade e
72
biodisponibilidade para exercer a atividade biológica (LIMA et al., 2015; DAHAN et al.,
2010).
Este estudo teve como objetivo desenvolver e caracterizar os CI da ABAM com
as CD betaciclidextrina (βCD) e com a hidroxiproprilbetaciclodextrina (HPβCD) com o
objetivo de melhorar as propriedades físico-químicas da ABAM.
73
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material
A ABAM foi obtida a partir das resinas comerciais de Protium adquiridas no
estado da Amazônia, AM, Brasil. A βCD e a HPβCD foram adquiridas da Sigma-
Aldrich® (St. Louis, MO, Estados Unidos). Todos os experimentos foram realizados
utilizando água purificada (condutividade menor que 1,3 μS/cm) preparada por
osmose reversa. Foram utilizados reagentes de grau analítico.
2.2 Estudo teórico computacional
Inicialmente, foram construídos modelos moleculares da ABAM com uma
pesquisa conformacional, utilizando simulações de dinâmica molecular. A
conformação mais estável encontrada nessas simulações foi utilizada para a
simulação com a βCD e a HPβCD. A conformação escolhida foi passada pela
cavidade de duas formas: com a face que contém o grupamento OH e com a face
contrária ao grupamento. As energias foram calculadas pelo método semi-empírico
PM6-D3, usando tratamento com solvente COSMOS. As minimizações de energia
foram feitas em cada etapa.
2.3 Desenvolvimento dos CI
Os CI foram preparados pelos métodos de mistura física e malaxagem. Todos
os métodos foram desenvolvidos com razão molar 1:1 (ABAM:CD), considerando que
o peso molecular da ABAM como sendo de 426,72 g∙mol-1) e os pesos moleculares
da βCD e da HPβCD são 1134,98 e 1396 g∙mol-1, respectivamente.
2.3.1 Mistura física (MF)
A ABAM foi pesada com base na razão molar 1:1 com a βCD e a HPβCD. As
CD foram pesadas separadamente. ABAM e βCD foram adicionados a um gral de
porcelana e foram homogeneizados com pistilo. Então, as amostras foram mantidas
74
em dessecador até as análises posteriores. O mesmo procedimento foi realizado com
a HPβCD.
2.3.2 Método de malaxagem (MAL)
O processo MAL foi realizado como descrito por Galvão e colaboradores
(2015), com pequenas modificações. A ABAM e a βCD foram pesadas separadamente
e adicionados a um gral de porcelana e homogeneizados com pistilo, e, então, foi
adicionada água purificada mais acetona (25:75) no gral até a formação de um
aspecto pastoso (aproximadamente 10 mL de água purificada para cada 1 g de ABAM
e βCD juntos). O material com aspecto pastoso foi, então, homogeneizado com pistilo.
Logo após, as amostras foram adicionadas em uma estufa de secagem, a 60 °C, até
completa secagem. Por fim, as amostras foram mantidas em dessecador até as
análises serem realizadas. O mesmo procedimento foi realizado com a HPβCD.
2.4 Caracterização físico-química dos CI
Para verificar se ocorreu a formação dos CI entre a ABAM e as CD, βCD e
HPβCD, foi realizada a caracterização físico-química das amostras. Então, a
caracterização físico-química foi feito por: espectroscopia de infravermelho por
transformada Fourier, microscopia eletrônica de varredura, difração de raio-X, análise
termogravimétrica e calorimetria exploratória diferencial.
2.4.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada Fourier (FTIR)
A análise espectroscópica de FTIR foi realizada em um equipamento IR
Prestige-21. As amostras foram pastilhadas com KBr em uma prensa hidráulica com
pressão final de 10 toneladas. A análise foi feita na região do infravermelho médio de
4000-400 cm-1, com 16 varreduras e resolução espectral de 4 cm-1.
2.4.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As amostras foram distribuídas no suporte (stub) do microscópico eletrônico de
varredura com fitas adesivas. As análises foram realizadas em um microscópio da
75
marca Hitachi, modelo TM-3000 Tabletop, com aumento na magnitude de 1000 vezes.
As fotomicrografias foram obtidas com potencial de aceleração de 15 kV, sob pressão
reduzida.
2.4.3 Difração de raio-X (DRX)
Os perfis de DRX das amostras foram obtidas em um equipamento Bruker D2
Phaser, usando radiação CuKα (λ = 1,54 Å) com um filtro de Ni. A análise foi feita com
passo de 0,02 °, corrente de 10 mA, voltagem de 30 kV e usando o detector Lynxeye.
2.4.4 Análise termogravimétrica (TG)
Os perfis termogravimétricos das amostras foram obtidos por uma
termobalança da marca Shimadzu®, modelo TGA-50. As amostras foram submetidas
a uma variação de temperatura de 30-600 °C, com aproximadamente 2 mg de amostra
em cadinhos de alumina, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL∙min-1) e razão
de aquecimento de 10 °C∙min-1. A termobalança foi calibrada usando um padrão
CaC2O4∙H2O, em conformidade com a ASTM.
2.4.5 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
A análise térmica através de calorimetria exploratória diferencial foi realizada
em um equipamento da marca Shimadzu®, modelo DSC-50, usando
aproximadamente 2 mg de amostra em cadinhos de alumínio, sob atmosfera dinâmica
de nitrogênio (50 mL∙min-1), razão de aquecimento de 10 °C∙min-1 e uma faixa de
temperatura de 30-500 °C. A calibração do equipamento foi realizada com índio (ponto
de fusão: 156,6 °C; ΔHfus. = 28,54 J∙g-1) e zinco (ponto de fusão 419,6 °C).
76
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Estudo teórico computacional
A predição computacional em termos da afinidade de ligação entre hóspede-
hospedeiro (guest-host), do ponto de vista teórico, é de importância central, assim
como para muitas aplicações. Esses sistemas supramoleculares de baixo peso
molecular contêm, frequentemente, menos que algumas centenas de átomos. Assim,
seus espaços conformacionais são muito menores quando comparado aos sistemas
proteína-ligante, sendo uma utilização mais rápida, prática e mais barata (relativo ao
computador necessário para processar as informações) que a utilização com estes
sistemas (YE et al., 2016).
As energias foram minimizadas em cada etapa e para cada ângulo de entrada.
Os resultados do estudo teórico computacional são mostrados nas Figuras 1 e 2,
representando os isômeros α amirina e β amirina, respectivamente, com as
respectivas CD’s. Com a α amirina entrando na cavidade com a face que contém
grupamento hidroxila dentro da cavidade da βCD, a menor energia de interação entre
eles foi de -13,97 kcal∙mol-1, com disposição molecular mostrada na Figura 1A. Já com
a α amirina entrando na cavidade com a face que contém o grupamento hidroxila fora
da cavidade da βCD, a menor energia de interação entre eles foi de -16,48 kcal∙mol-
1, com disposição molecular mostrada na Figura 1B. Com a α amirina entrando na
cavidade da HPβCD com a face contendo o grupamento hidroxila dentro da cavidade
da HPβCD, tem-se a menor energia de interação entre eles de -12,77 kcal∙mol-1, com
disposição molecular demonstrado na Figura 1C. Já com a α amirina entrando na
cavidade com a face que contém o grupamento hidroxila fora da cavidade da HPβCD,
tem-se a menor energia entre eles de -8,57 kcal∙mol-1 e disposição molecular
demonstrado na Figura 1D.
Para a β amirina, tem-se suas disposições moleculares na Figura 2. Com a β
amirina entrando na cavidade com a face que contém grupamento hidroxila dentro da
cavidade da βCD (Figura 2A), a menor energia de interação entre eles foi de -12,73
kcal∙mol-1. Já com a β amirina entrando na cavidade com a face que contém
grupamento hidroxila fora da cavidade da βCD, a menor energia entre eles foi de 16,59
kcal∙mol-1, com disposição molecular mostrada na Figura 2B. Com a β amirina
entrando na cavidade com a face que contém grupamento hidroxila dentro da
77
cavidade da HPβCD, tem-se a menor energia de interação de 11,87 kcal∙mol-1, com
disposição molecular mostrado na Figura 2C. Com a β amirina entrando na cavidade
com a face que contém grupamento hidroxila fora da cavidade da HPβCD, tem-se a
menor energia de interação de 2,64 kcal∙mol-1 e disposição molecular mostrado na
Figura 2D.
De acordo com estudo teórico computacional, a molécula da α amirina e β
amirina entra preferivelmente na cavidade da βCD com sua face que contém o
grupamento hidroxila para fora da cavidade, com diferença energética de 2,51
kcal∙mol-1 e 3,86 kcal∙mol-1, respectivamente. Com relação a interação entre a
molécula da α amirina e β amirina com a HPβCD, tem-se que os dois triterpenos entra
preferivelmente na cavidade da HPβCD com sua face que contém o grupamento
hidroxila dentro da cavidade, com diferença energética de 4,15 kcal∙mol-1 e 9,23
kcal∙mol-1, respectivamente.
78
Figura 1 – Simulação energética da interação entre a α amirina e βCD e HPβCD.
(A) α amirina com a βCD com a face contendo a hidroxila dentro
da cavidade da βCD, (B) α amirina com a βCD com a face
contendo a hidroxila fora da cavidade da βCD, (C) α amirina com a
HPβCD com a face contendo a hidroxila dentro da cavidade da
βCD e (D) α amirina com a βCD com a face contendo a hidroxila
fora da cavidade da βCD.
Fonte: Elaborada pelo autor e colaboradores
79
Figura 2 – Simulação energética da interação entre a β amirina e βCD e HPβCD.
(A) β amirina com a βCD com a face contendo a hidroxila dentro da
cavidade da βCD, (B) β amirina com a βCD com a face contendo a
hidroxila fora da cavidade da βCD, (C) β amirina com a HPβCD com
a face contendo a hidroxila dentro da cavidade da βCD e (D) β
amirina com a βCD com a face contendo a hidroxila fora da
cavidade da βCD.
Fonte: Elaborada pelo autor e colaboradores
80
3.2 Caracterização físico-química dos CI’s
Os resultados e a discussão relacionada à caracterização físico-química dos
CI’s são mostrados a seguir.
3.2.1 Espectroscopia de FITR
A espectroscopia de FTIR é uma técnica muito utilizada nos trabalhos que
envolvem CD. Pela identificação do padrão vibracional da CD e do ligante, esta técnica
é muito útil para identificar, também, mudanças nas bandas características do padrão
vibracional do ligante, como desaparecimento, alargamento, mudança de intensidade
dos picos ou desvios em seu número de onda. Essas mudanças podem ser um forte
indicativo de interação entre o ligante e a CD (MURA, 2015).
Quando se forma um CI, pequenos deslocamentos das CD poderão mascarar
as bandas características do ligante, pois ocorre a encapsulação dos ligantes na
cavidade interna das CD via interações hidrofóbicas e forças de Van der Waals. No
entanto, se o ligante apresentar grupos funcionais característicos, como uma
carbolina, a banda será significativamente encoberta e algumas vezes pode ser
deslocada após a complexação (FROMMING; SZEJTLI, 1994; FROMMING, 1998).
Os espectros de infravermelho da ABAM, da βCD, HPβCD, das MF e dos
sistemas obtidos por MAL, são mostrados na Figura 3. Com base na literatura
(SILVERSTEIN, 1998), o espectro da ABAM apresenta uma banda de alta intensidade
encontrada em aproximadamente 2800 cm-1 e está associada à deformação axial das
ligações C-H em cadeias cíclicas. De fato, a maior parte da estrutura da ABAM
consiste em cadeias de cicloalcanos, que confere essa banda de alta intensidade.
Além disso, a banda na região 3250-3400 cm-1 é atribuída ao grupo hidroxilo (O-H)
ligado a uma cadeia de cicloalcano e o da região 1031-1100 cm-1 é devido à vibração
da ligação C-O. Por fim, outra banda característica é encontrada na região 1400-1350
cm-1 e é característica da deformação angular dos grupos dimetil e metil germinativos
de dupleto (SILVA-JUNIOR et al., 2017). O espectro da βCD apresenta bandas
características nas regiões de 3300 cm−1 (vibrações de estiramento de ligação O-H),
2925 cm−1 (vibrações de estiramento da ligação C-H), 1151 cm−1 e 1023 cm−1
(vibrações de estiramento simétrico e assimétrico da ligação C-O-C,
respectivamente), como apresentado nos trabalhos de Abarca e colaboradores (2016)
81
e Passos e colaboradores (2012). O espectro da HPβCD apresenta bandas
características nas regiões de 3355 cm−1 (vibrações de estiramento de ligação O-H),
2922 cm−1 (vibrações de estiramento da ligação C-H), 1151 cm−1 e 1080 cm−1
(vibrações de estiramento das ligações C-H e C-O, respectivamente), como
apresentado no trabalho de Medarević e colaboradores (2015).
82
Figura 3 – Espectros na região do infravermelho da ABAM, βCD, HPβCD, das
MF e dos complexos por MAL. Na figura 3A, tem-se os espectros relacionados
entre a ABAM e a βCD e na figura 3B, tem-se os espectros relacionados entre a
ABAM e HPβCD.
Fonte: elaborada pelo autor
83
Com base na observação dos espectros da Figura 1A e 1B, tem-se que as
bandas características das CD são predominantes (deformação axial da ligação OH)
em torno de 3355 a 3300 cm-1. A os espectros da MF e da MAL da ABAM com βCD
(Figura 1A), apresentaram semelhanças com o espectro da βCD, que indica o
mascaramento do espectro da ABAM, uma vez que uma pequena quantidade de
fármaco, aproximadamente 10% da quantidade total de fármaco, é incluso na
cavidade interna das CD, o que explica o mascaramento do espectro da ABAM pela
βCD tanto na MF quanto na complexação por MAL (MARQUES, 2010). O
mascaramento do espectro de um fármaco quando ocorre em uma simples MF, já é
um possível indício de que o fármaco se complexa com facilidade na cavidade interna
da CD (YANG et al., 2015). Os espectros em torno da região de 3300 cm-1 no
complexo por MAL entre a ABAM e βCD apresentou uma maior intensidade quando
comparado com os outros espectros, os isolados e a MF. Uma explicação razoável é
que o método da MAL proporcionou com maior facilidade a inclusão da ABAM na
cavidade da βCD, com isso, foi formada uma forte ligação de hidrogênio entre o
hóspede e o hospedeiro, o qual inclui a ABAM com mais firmeza na cavidade interna
da βCD.
Os espectros do complexo obtido por MAL e a MF entre HPβCD e ABAM são
representados na Figura 1B. As bandas da ABAM foram quase que completamente
obscurecidas por bandas da HPβCD, que são bem intensas e amplas. Em ambos os
espectros, MF e MAL, as principais bandas de identificação da ABAM (3400-3250 cm-
1, 2800 cm-1, 1100-1041 cm-1, 1450-1350 cm-1) deixaram de ser totalmente
identificáveis. Não foram identificados surgimentos de novas bandas na região do
infravermelho, o que exclui a possibilidade da criação novas ligações químicas
(ZHANG et al., 2016).
Os resultados apresentados pela análise espectroscópica de infravermelho por
transformada Fourier apontam que a βCD e a HPβCD interagem com a ABAM, tanto
na MF quanto na MAL, o que indica que até mesmo em estado sólidos, ambas as
CD’s possuem a capacidade de complexar a ABAM. Resultado semelhante foi
encontrado por Quitans e colaboradores (2017), onde uma sapogenina esteirodal foi
complexada com a βCD, onde ocorreu o mascaramento das principais bandas do
fármaco até mesmo numa simples MF.
3.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
84
A MEV é uma técnica bastante utilizada para definir morfologicamente a
formação dos complexos de inclusão. A análise é feita através da comparação
morfológica do fármaco e da CD. Quando ocorre o encapsulamento do fármaco no
interior da cavidade da CD, a morfologia dos complexos formados ficará distinta da
micrografia dos componentes isolados (PERIASAMY; KOTHAINAYAKI; SIVAKUMAR,
2015; ZHU et al., 2016).
As fotomicrografias da ABAM, βCD, HPβCD e os respectivos sistemas entre a
ABAM e as CD’s são demonstradas na Figura 4. A morfologia de superfície da ABAM
apresenta estruturas aciculares bem definidas com formas regulares e aspecto
tridimensional, que são características de um sólido cristalino (SILVA-JUNIOR et al.,
2017). A morfologia de superfície da βCD apresenta partículas com estrutura cristalina
em formato de paralelogramo, como observado por Bulani e colaboradores (2016). Na
fotomicrografia da MF-βCD e MAL-βCD, é possível observar a aparição de agregados
de diferentes tamanhos com superfície porosa e com aspecto diferente da partícula
da βCD inicial, o qual essas mudanças morfológicas podem ser empregadas como
evidências na interação fármaco-CD (DING et al., 2000). Apesar dos estudos de MEV
serem inadequados para confirmar a formação de CI, as alterações na superfície
morfológica das partículas, seu aspecto e tamanho são uma forte indicação de
complexação (FERNANDES; VIEIRA VEIGA, 2002)
A morfologia de superfície da HPβCD apresenta partículas esféricas amorfas,
como observado por Melo e colaboradores (2016). A morfologia da superfície das
partículas da MF não foi alterada. A observação microscópica evidenciou a presença
de cada um dos constituintes com manutenção da sua morfologia inicial, com cristais
da ABAM aderidos à superfície da HPβCD, não revelando, aparentemente, interações
entre a ABAM e a HPβCD por este método. No entanto, a fotomicrografia do produto
da MAL mostra mudanças no aspecto morfológico da superfície, com perda da forma
esférica típica da HPβCD e da forma cristalina evidenciada para a ABAM.
Figura 4 – Fotomicrografias da ABAM, βCD, HPβCD e seus respectivos
sistemas formados.
85
Fonte: Elaborada pelo autor
3.3.3 Difração de raio-X (DRX)
86
A difração de raios-X (DRX) determina a natureza cristalina de sólidos e é uma
técnica largamente utilizada para a caracterização de CI (VEIGA; PECORELLI;
RIBEIRO, 2006). O método de análise para a detecção dos complexos se baseia na
comparação dos difratogramas das substâncias pura e dos sistemas obtidos, devido
a evidente diferença entre os padrões de difração dos componentes individuais e os
padrões de difração dos complexos obtidos (SPAMER et al., 2002; TANG, 2016).
O conceito de pó cristalino é compreendido como o sólido que apresenta uma
estrutura tridimensional, possui a capacidade de difratar os raios-x e apresenta pico
de fusão bem característico (SHARMA; MAZUNDAR, 2013).
O padrão de difração da ABAM, βCD, HPβCD e os respectivos sistemas são
apresentados na Figura 5. O perfil cristalino da ABAM apresenta um pico de difração
intenso, que pode ser observados em 13 °. Além disso, estão presentes no
difratograma da ABAM outras reflexões cristalinas de intensidades inferiores a 6 °, 10
°, 11 °, 14 ° e 16 °, como observado também por Silva-Júnior e colaboradores (2017).
Os perfis de DRX da βCD e seus sistemas são mostrados na Figura 5. A βCD
apresenta como picos de difração cristalinas principais nos ângulos de 8,96 °, 10,62
°, 12,40 °, 19,52 °, 20,96 ° e 22,62 °. Além dos picos citados, a βCD apresenta outras
difrações cristalinas de menor intensidade. Tanto na MF quanto na MAL, observa-se
uma redução significativa da intensidade dos reflexos cristalinos das substâncias
isoladas, porém, observa-se que na MAL há uma maior supressão dos reflexos
cristalinos. A MF e MAL apresentaram um padrão de difração de raios-X diferentes
das substâncias isolada, indicando a provável formação de uma nova fase cristalina.
Esta nova fase indica a provável formação de um cristal diferente do fármaco e da
βCD, podendo ser um indício de complexação (CAPELLO et al., 2009)
O perfil de DRX da HPβCD e seus sistemas são mostrados na Figura 5B. A
HPβCD apresenta dois halos largos, característico de material com perfil amorfo.
Pode-se observar que tanto na MF quanto na MAL, o padrão de difração de raios-X
foi distinto daqueles das substâncias isoladas. Houve quase total supressão dos
reflexos cristalinos da ABAM, indicando uma tendência a amorfização do novo sólido
formado. No entanto, é possível verificar a presença de pequenos picos da ABAM, o
que pode sugerir a presença de ABAM não encapsulada na HPβCD.
87
Figura 5 – Padrão de difração de raios-x da ABAM, βCD, HPβCD e seus
respectivos sistemas formados.
Fonte: Elaborada pelo autor
Assim, pela análise de DRX de pó, é possível inferir que há interação entre o
ABAM, βCD e a HPβCD, uma vez que os sistemas obtidos com ambas as CD’s
apresentaram perfis de difração diferentes daqueles difratogramas das substâncias
individuais, que corroboram com os dados da morfologia de superfície sugerindo um
possível incremento na solubilidade aquosa da ABAM com os complexos formados.
88
3.3.4 Análise termogravimétrica (TG)
A TG é uma ferramenta útil na pesquisa de interação entre a CD e a molécula
hóspede. O seu uso é com base na comparação das perdas de massa em função do
tempo dos compostos isolados, da MF e dos CI’s. Mudanças evidentes no perfil de
perda de massa são indicativo de interação entre a CD e o ligante (MURA, 2015).
As curvas e os dados de perda de massa da ABAM, da βCD, da HPβCD e dos
respectivos sistemas são mostrados na Figura 6 e na Tabela 1. A curva de TG para
ABAM mostra apenas um estágio bem definido de perda de massa, que está
relacionado à sua volatilização. A porcentagem de perda de massa (Δm%) foi de cerca
de 99,5%, onde as temperaturas inicial e final da perda de massa foram 232 e 347 °
C. A βCD apresenta duas etapas de perda de massa, sendo a primeira com cerca de
13,60%, relativo à liberação de moléculas de água, como observado por Menezes e
colaboradores (2016), e a segunda começando após os 300 °C, relativo à sua
degradação. A partir da observação das curvas TG, pode-se observar que tanto a MF
quanto o MAL teve uma perda inicial de massa entre 25 e 120 °C que está relacionado
a perda de água da cavidade da CD. O percentual de perda de massa (Δm) para a
MF e o MAL foi de 10,45% e 9,65%, respectivamente, para essa faixa de temperatura,
portanto para ambos os sistemas, teve-se uma diminuição da perda inicial de massa
relativa à agua da βCD. Quando se verifica a diminuição da perda de massa
correspondente à agua nos sistemas quando se compara com a βCD, é possível
concluir que é devido à substituição das moléculas de água da cavidade da βCD por
ligantes de menor energia, sendo este um indicativo de interação de entre a ABAM e
a βCD. Em temperaturas mais altas, não foi possível verificar indícios de
complexação, porque a temperatura de degradação da ABAM foi muito próxima da
temperatura de degradação da βCD.
As curvas de TG da HPβCD e dos seus métodos são mostradas na Figura 6B
e na Tabela 1. Nas primeiras faixas de temperatura, em torno de 30 a 150 °C, a
HPβCD perde 3,9% da sua massa, também relativo à liberação de moléculas de água.
Após 300 °C, a HPβCD sofre degradação. Em relação à perda de massa dos métodos,
nessa faixa inicial, ocorre as perdas de massa da MF e MAL que são de 5,5% e 3,81%
respectivamente. Como observado anteriormente, a MF perde mais massa que a
HPβCD na faixa de temperatura de 25-120 °C, indicativo da ausência de interação por
esse método. O MAL, quando comparado ao MF, apresenta perda de massa menor
89
assim como também apresenta perda de massa menor quando comparada com a
HPβCD.
Figura 6 – Curva TG das amostras da ABAM e os CI.
Fonte: Elaborada pelo autor
90
Tabela 1 – Perda de massa da ABAM, da βCD e seus sistemas e da HPβCD e
seus sistemas, nas faixas de 25-120 °C.
∆m1 (%)
25-120 °C
ABAM 0,02
βCD 13,60
MF (βCD) 10,45
MAL (βCD) 9,65
HPβCD 3,93
MF (HPβCD) 5,5
MAL (HPβCD) 3,81 Fonte: Elaborada pelo autor
3.3.5 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
A DSC é uma ferramenta muito útil na identificação de interações de CD’s com
ligantes. A análise de formação de complexos pode ser realizada comparando as
curvas e DSC dos complexos formados com a curda da CD em questão. Geralmente,
a molécula hóspede ou o fármaco em questão se encontra no estado cristalino,
portanto, se tem um evento de fusão que será evidenciado pelo DSC por um pico
endotérmico. Quando ocorre a formação de complexos, espera-se que o pico
desapareça devido à perda da estrutura cristalina ocasionada pela encapsulação
(ARAUJO et al., 2008; MURA, 2015).
As curvas DSC da ABAM, da βCD HPβCD e os respectivos sistemas formados
são mostrados na Figura 7. A ABAM apresenta dois eventos endotérmico, que ocorre
entre 158 e 185 °C e com pico em 170 °C e entalpia (ΔH) de 46 J/g, o qual corresponde
ao processo de fusão da mistura triterpênica. No caso da βCD, é possível observar a
ocorrência de um evento endotérmico ocorrendo na faixa de 34-155 °C, corroborando
com o encontrado na análise termogravimétrica, o qual está relacionado à perda de
moléculas de água. Pode-se observar, que tanto na MF quanto na MAL, ocorre a
diminuição do evento da fusão da ABAM, que pode ser afirmado pela diminuição da
entalpia, onde os valores para a MF e o MAL foram de 4,54 J/g e 3,63 J/g
respectivamente, sugerindo uma mudança do estado cristalino através do
encapsulamento. Porém, o evento persiste, mesmo que bem menor comparado com
a ABAM individual, surgindo que parte da molécula hóspede pode ter ficado fora da
91
cavidade da βCD. Também é possível observar que o evento relacionado com a perda
de água da cavidade da CD diminuiu, corroborando com os dados da análise TG,
fortalecendo ainda mais os indícios de interação.
As curvas da HPβCD e dos seus sistemas são mostradas na Figura 7B. A curva
DSC da HPβCD apresenta a ocorrência de um evento endotérmico, ocorrendo na
faixa de 34-110 °C, o qual está relacionado à perda de moléculas de água. Pode-se
observar que, por esse método, a MF e a MAL tiveram um perfil semelhante em se
tratando de curva de DSC. Ambos os sistemas diminuíram o evento endotérmico
relacionado à fusão da ABAM, em que os valores de entalpia nesse evento para os
sistemas foram de 9,61 e 5,70 J/g, indicando a interação entre a molécula hóspede e
a hospedeira. O evento relacionado à perda de água da HPβCD também diminuiu,
sugerindo a complexação entre as moléculas pelo deslocamento desta da cavidade
interna da HPβCD.
92
Figura 7 – Curvas DSC das amostras da ABAM, CD’s e os CI.
Fonte: elaborada pelo autor
93
4 CONCLUSÃO
O estudo teórico-computacional demonstrou que a complexação entre a ABAM
e as CD ocorrem dentro da cavidade das CD com disposição molecular diferente para
cada CD. Os dados do DSC sugerem a formação de complexos com ambas as CD.
As TG corroboram com esta afirmativa devido à diminuição da perda inicial de massa
que está relacionada a moléculas de água no interior da cavidade das CD. A
espectroscopia no infravermelho mostrou que ambas a preparações binárias para as
CD, MF e MAL, confirmou-se o desaparecimento das bandas características da
ABAM, o que sugere a formação de complexos. A difração de raios-x revelou alteração
do perfil cristalino da ABAM, indicando uma interação entre a ABAM e as CD capaz
de modificar o perfil cristalino e a MEV corroboram com essa afirmativa pela alteração
morfológica dos complexos quando comparado com as fotomicrografias dos
compostos individuais.
Portanto, neste trabalho foram desenvolvidos novos insumos farmacêuticos, os
CI de ABAM com βCD e HPβCD. É de suma importância conduzir estudos destes
novos insumos em formas farmacêuticas, para verificar sua compatibilidade com
certos excipientes farmacêuticos aplicados à estas formas farmacêuticas.
94
5 AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPQ, CAPES e ao Laboratório de Peneiras
Moleculares.
95
6 REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO
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98
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
• As DS e os CI foram capazes de mofidicar as características físico-químicas da
ABAM, indicado que a metodologia proposta foi adequada para a formação de
ambos os sistemas a partir de três polímeros distintos para as DS ( HPMC,
PEG, PVP) e de dus CD distintas (βCD e HPβCD).
• Na avaliação das atividade anti-inflamatória das DS, verificou-se que as DS
apresentaram atividade anti-inflamatória mesmo com uma concentração da
ABAM menor que a ABAM in natura, porque foi realizada a comparação de
efeitos, sendo assim, utilizaram a mesma dose da ABAM e das DS,
considerando que a proporção das DS é de 1:1 do polímero e da ABAM. Então,
mesmo as DS contendo uma quantidade menor da ABAM, foi capaz de
melhorar a atividade anti-inflamatória.
• Novos insumos farmacêuticos, DS e CI, neste trabalho foram desenvolvidos e
constitui ferramentas para uma futura formulação com a ABAM.
99
4 PERSPECTIVAS FUTURAS
As perspectivas futuras em relação a este trabalho são:
• Finalização de experimentos em andamento - eficiência de encapsulação,
em parceria com o Prof. Dr. Fernando Nogueira; e a ressonância magnética
nuclear, em parceria com a Universidade Federal do Vale do São
Francisco;
• Redação de um segundo artigo com os experimentos à serem concluídos
e com os estudos teóricos computacionais já prontos;
• Desenvolvimento de estudos de compatibilidade com excipientes
farmacêuticos, tendo em vista o desenvolvimento de formas farmacêuticas
com os complexos de inclusão e dispersão sólidas da ABAM.
100
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112
ANEXO A – ARTIGO PUBLICADO NA REVISTA “JOURNAL OF THERMAL
ANALYSIS AND CALORIMETRY”.
113
ANEXO B – PATENTE DEPOSITADA NO INPI, COM O TÍTULO “SISTEMAS
SÓLIDOS DISPERSOS DOS TRITERPENOS α AMIRINA, β AMIRINA E A
MISTURA NATURAL α. Β AMIRINA E SUAS APLICAÇÕES”.
NÚMERO DE REGISTRO: BR1020160307139.
114
ANEXO B – CERTIFICADO DE MENÇÃO HONROSA NO X SIMPÓSIO
BRASILEIRO DE FARMACOGNOSIA COM O TRABALHO INTITULADO
“OBTENÇÃO DE DISPERSÕES SÓLIDAS POLIMÉRICAS DO TRITERPENO α, β
AMIRINA E CARACTERIZAÇÃO ESPECTROSCÓPICA E MORFOLÓGICA”
