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0 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL DENISE HÉLEN IMACULADA PEREIRA DE OLIVEIRA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS GLUT-1 E HIF-1α EM LESÕES VASCULARES DE MUCOSA ORAL. Natal / RN 2012

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0

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

DENISE HÉLEN IMACULADA PEREIRA DE OLIVEIRA

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS GLUT-1 E HIF-1α

EM LESÕES VASCULARES DE MUCOSA ORAL.

Natal / RN

2012

1

Denise Hélen Imaculada Pereira de Oliveira

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS GLUT-1 E HIF-1α

EM LESÕES VASCULARES DE MUCOSA ORAL.

Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa

de Pós-Graduação em Patologia Oral da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte -

UFRN, como parte dos requisitos para obtenção do

Título de Mestre em Patologia Oral

Orientadora: Profª. Lélia Maria Guedes Queiroz

Natal / RN

2012

2

Oliveira, Denise Hélen Imaculada Pereira de. Expressão Imuno-histoquímica das proteínas GLUT-1 e HIF-1α em lesões vasculares de mucosa oral / Denise Hélen Imaculada Pereira de Oliveira. – Natal, RN, 2011.

108 f. : il.

Orientadora: Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz. Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.

1. Neoplasias de Tecido Vascular – Dissertação. 2. Diagnóstico diferencial – Dissertação. 3. Biomarcadores Farmacológicos – Dissertação. I. Queiroz, Lélia Maria Guedes. II. Título.

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

3

4

“Para tudo há um tempo, para cada coisa há um momento

debaixo dos céus”

(Eclesiastes 3,1)

DEDICATÓRIA

5

A Deus, por me permitir esta VITÓRIA!

Tudo no tempo e na vontade de Deus, que é boa, perfeita e agradável.

A Maria Santíssima, que me ilumina e me conforta nessa caminhada rumo ao céu.

“Imaculada Maria do povo. Mãe dos aflitos que estão junto à cruz”

Aos meus pais, Francisco Nirton e Honorina Maria, os melhores pais, meu eterno amor

e agradecimento. Que mesmo com todas as dificuldades e a saudade nunca pouparam

esforços para a realização dos meus sonhos. Tudo que eu sou devo a vocês. Todo meu

amor eu dedico a vocês.

A minha irmã, Daniela, e ao meu irmão, Daniel, por me dar a certeza de um amor

verdadeiro e inquestionável.

6

“Todas as coisas que Deus fez são boas, a seu tempo.

Ele pôs, além disso, no seu coração a duração inteira,

sem que ninguém possa compreender a obra divina

de um extremo a outro.”

(Eclesiastes 3,11)

AGRADECIMENTOS

7

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À Professora Drª Lélia Maria Guedes Queiroz

Palavras não são o bastante para expressar toda minha gratidão por minha

querida orientadora. Admiração que trago desde a graduação, onde me foi dada a

primeira oportunidade para entrar no mundo da pesquisa e da docência.

Obrigada por ser minha orientadora, amiga, cúmplice, facilitar minha vida em alguns

momentos e, principalmente, por me apoiar sempre.

Que nos próximos anos essa cumplicidade possa sempre continuar aumentando.

“... e a doçura no falar aumenta o saber”

(Provérbios 16,21)

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AGRADECIMENTOS

Bem, essa parece ser a parte mais fácil de uma dissertação, mas digo a vocês,

não é! Ter que lembrar de cada pessoa que de alguma forma te deu forças, ânimo, te

empolgou pra fazer esse trabalho e fazê-lo direito é uma grande responsabilidade.

Aos demais familiares, principalmente aos meus avós maternos, a minha tia

Lucinete e minha prima (irmã) Aline.

Obrigada pelo apoio e compreensão por eu permanecer “longe” de casa.

“Recebei a instrução e não o dinheiro. Preferi a ciência ao

fino ouro, pois a Sabedoria vale mais que as pérolas e jóia

alguma a pode igualar”

(Provérbios 8,10-11)

Aos Professores

Profª Drª Ana Miryam da Costa Medeiros - minha querida “Tia Miryam”,

exemplo de simplicidade e sabedoria inata, muito obrigada pelo incentivo, acolhimento

e carinho de sempre.

Profª Drª Éricka Janine Dantas da Silveira - que eu tenho como minha “irmã”

(patológica) mais velha, meu respeito, minha admiração e meu exemplo de

determinação. Agradeço por contribuir, e muito, com meu conhecimento científico ao

longo do curso.

Profª Drª Lélia Batista de Souza - que no seu jeito singular de ser, mostra

verdadeira disposição de contribuir com o crescimento científico de todos os seus

“filhos”. Rígida em alguns momentos, mas, ao mesmo tempo compreensível e

adoradora do seu trabalho.

Profª Drª Hébel Cavalcanti Galvão - exemplo de beleza e leveza em conduzir

seus trabalhos. Obrigada pela simpatia, carinho e ternura.

9

Profº Drª Márcia Cristina da Costa Miguel - exemplo de inteligência e

profissionalismo. Inteligência como a sua, poucos têm.

Profº Drª Roseana de Almeida de Freitas – agradeço pela disponibilidade,

atenção e pelo aprendizado.

Profº Drº Manuel Antônio Gordón-Núñez - professor jovem, belo, simples e

sempre com um sorriso no rosto e disposto a dividir seus conhecimentos.

Profº Drº Antônio de Lisboa Lopes Costa - nosso tão querido “Costinha”,

sempre tão alto astral e atencioso.

Profº Drº Leão Pereira Pinto - professor culto, responsável pela fundação

desse Programa de Pós-Graduação que já formou muitos mestres e doutores.

Aos Funcionários da Patologia Oral - UFRN

Francisco Canindé de Macedo, Hévio Lucena, Ricardo Lima, Idelzuite de

Souza, Maria das Graças Galvão e Sandovânia Oliveira (Sandrinha), agradeço ao

apoio, a paciência, o auxílio e a disponibilidade.

Lourdes Souza (Lourdinha) – minha querida “Garotinha”, você merece um

obrigada especial. Agradeço imensamente pela alegria contagiante, por tornar os dias

mais leves no convívio diário. Com você sempre está “Tudo legal, Positivo”.

Patrícia – querida Patrícia, a clínica de estomatologia, sem dúvidas, é mais

prazerosa graças aos seus cuidados e atenção com todos nós.

Ao Programa de Pós Graduação em Patologia Oral /UFRN

Agradeço pela oportunidade de seguir a área de ensino que sempre me

identifiquei.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Agradeço pela oportunidade e pelo apoio financeiro essencial para minha

moradia e estudos em Natal.

10

Aos colegas da Patologia

Adriana Costa, Adriana Amorim, Águida Henriques (Sempre tão solícita),

Alessandra Barreto, Ana Rafaela (Sempre tão bela), Conceição Aparecida (Cida,

querida), Cinthya Helena (que talvez nem saiba, mas você me deu um conselho que

nunca esquecerei, quando ainda não era bolsista da patologia na graduação: “Procure o

professor que você mais gosta e diga que quer participar da base de pesquisa em

Patologia Oral”, meu obrigada especial), Emeline Lima (uma das pessoas mais pura de

coração que eu conheço “Emyline, Obrigadinha”), Emília Beatriz, Felipe Matos,

Fernando Nóbrega (meu irmão patológico, sempre sorrindo), Joabe Pereira (grande

personalidade), José Nazareno, Keila Martha, Maiara de Moraes, Marcelo

Gadelha, Pedro Paulo (PP, para sempre “mucocele”), Rodrigo Gadelha e Stefânia

Ferreira (Sté, empatia à 1ª vista e à 1ª saída), obrigada a todos pelo coleguismo e

amizade, pela troca de experiências.

A minha turma do mestrado

Ana Luiza, Bárbara Monteiro, Clarissa Demeda, Dmitry Sarmento, Edilmar

Santos, Lucileide Castro, Natália Guimarães, Pedro Carlos e Roseane Vasconcelos.

Para a realização desse trabalho foi essencial também o convívio com aqueles

que quase diariamente estavam ao meu redor; ajudando nas dúvidas que por vezes me

surgiam, apoiando nos momentos difíceis que todos nós passamos e, até mesmo,

presentes nos momentos mais descontraídos. Ter vocês como amigos de turma fez toda

a diferença nesses dois anos de mestrado. O meu Sincero Agradecimento acompanhado

de muito carinho e amizade.

As minhas “Xuxu’s ”

Ana Luiza – “Aninha”, minha Xuxuzinha, minha amiguinha, meu anjo. Você

foi um presente que a vida me deu e eu agradeço pela sua amizade todo santo dia. Deus

nos uniu no momento que fomos sorteadas para apresentar o 1º seminário de dupla no

mestrado, onde mesmo antes de nos conhecermos “oficialmente” já nos definimos como

dupla em tudo: nos momentos de alegria, de medo, de sofrimento, de risos, de planos,

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de cumplicidade eterna, e até na data de aniversário – Dia 15 de Julho é nosso dia, nosso

aniversário - “O que Deus une... ninguém separa”. Você é minha Xuxuzinha mais

“Perfeita” e eficiente.

Bárbara Monteiro – A Xuxu Flor, tenho em você um modelo (ou, “uma

modelo”, pra combinar com seu jeito de ser) de mulher forte que sabe o que quer, e

mais ainda o que não quer. Você não é somente “Brabara”, você é “Bárbara Esplêndida”

e eu tenho muito orgulho de te ter como companheira de doutorado e de amizade.

Clarissa Demeda – A Xuxu mais espelhada por todas as outras. Um exímio

exemplo de organização, determinação e por que não de “Nerd”? Sua presença na nossa

turma fez toda a diferença. Tenho muita alegria por continuarmos amigas de pós-

graduação.

Natália Guimarães - A Xuxu mais doce de todas. Natália você é única e por ti

tenho um carinho mais que especial. Você é a última a saber das coisas, mas tenho

certeza que é uma das primeiras a ser lembrada quando se trata de pessoas puras e

doces. O que teria sido esse mestrado sem seus seminários perfeitos? Você é muito

querida, viu!

Roseane Vasconcelos - A Xuxu Ímpar! E se existe “outras vidas” tenho certeza

que somos amigas desde a 1ª, pois só isso para explicar tanta amizade, tanta

cumplicidade e tanta afinidade entre nós. Você me deu uma prova de amizade mesmo

antes de nos considerarmos amigas: apresentou no mestrado o 1º seminário de

Imunologia (de Imuno!!) no meu lugar só para me ajudar. Vasconzinha, já vivemos

1001 histórias: “Encontramos o Fofinho, procuramos o Nemo, achamos Painho” e

estarei sempre pronta e à disposição para viver outros milhões de histórias.

Aos Amigos que a Patologia me deu

Dmitry Sarmento - obrigada pelos momentos de desabafo e angústias divididas,

e mais ainda por me aguentar sempre. Obrigada pelos conhecimentos, pela estatística e

por se fazer presente nesses dois anos. Sentiremos sua falta.

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Pedro Carlos – “Peter Charles”, pessoas como você estão em extinção.

Obrigada por ter nos proporcionados momentos memoráveis nesse mestrado. “Você é

um homem bom de um coração melhor ainda”.

Raniel Peixoto - meu Rani querido, meu companheiro de dança, meu

amigUSP.... que Ribeirão Preto te proporcione todo o sucesso que você merece e terá.

Rani, meu amigo. Que possamos dividir as alegrias e sofrimentos da vida de pós-

graduando.

As Minhas Amigas companheiras da graduação

“Amigos são anjos enviados por Deus para nos proteger e cuidar de nós aqui na terra”

Vocês, minhas amigas de anos, que mesmo sem saber, estavam sempre me

ajudando. Toda atenção dispensada comigo, as conversas que eram pra aliviar a cabeça.

Sempre que estou com vocês parece que tenho mais paz, calma, tranquilidade, que são

itens fundamentais para manter nosso eterno laço de amizade! Vocês são testemunhas

da minha descoberta pelo gosto da docência. Obrigada de coração a Aline (amow),

Amanda (Amandão coisa linda), Camyla (Cacau anjo), Carlinha (flor), Clara (minha

alma gêmea), Dani (minha solicitude), Débora (minha eterna dupla, minha futura

comadre), Éricka (meu bem), Nanda Amorim (minha sempre torcida), Janine (Jam,

meu amor), Luana (Lú), Pryscyla (Preki, meu bem, minha pequena grande mulher) e

Raíssa (Rá), vocês não são apenas parte de mim, mas da minha vida! Coloquei em

ordem pra não dizer que amo mais uma que a outra!

As minhas amigas “Dádivas de Deus”

Carla Monadeli, Júlia Serafim e Vanessa Limeira. Como poucas amizades,

vocês são daquelas que mesmo a gente se encontrando e se falando muito ou pouco, a

amizade permanece com a mesma grandeza de sempre, a grandeza de ser uma das

melhores da vida, das mais importantes. E em minhas orações, inegavelmente, vocês

estarão nelas com reiteradas menções de votos de agradecimentos e pedidos pra que

Deus continue abençoando vocês de uma maneira bem especial.

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“Porque um dia é preciso parar de sonhar, tirar os planos das

gavetas e de algum modo começar”

(Amyr Klink)

RESUMO

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RESUMO

O correto diagnóstico histológico de lesões vasculares em mucosa oral é

fundamental, sobretudo na hora de definir o tratamento e prognóstico, visto que

algumas dessas lesões apresentam involução. Este trabalho analisou a expressão imuno-

histoquímica da proteína humana transportadora de glicose (GLUT-1), em tumores

vasculares benignos orais e reclassificou tais lesões de acordo com sua imunoexpressão.

Além disso, avaliou a expressão imuno-histoquímica do fator 1 induzível por hipóxia

(HIF-1α), principal fator de transcrição envolvido na adaptação celular à hipóxia. Foram

analisados 60 casos de tumores vasculares benignos orais, sendo 30 casos com

diagnóstico histológico de HEM e 30 casos de granulomas piogênicos orais (GP). Os

resultados desta pesquisa demonstraram que das 30 lesões inicialmente classificadas

como HEM, apenas 7 apresentaram imuno-positividade para GLUT-1, permanecendo

com o diagnóstico inicial. As 23 restantes foram reclassificadas em malformação

vascular (MV) 13 casos e GP 10 casos . Todos os casos da amostra com diagnóstico

inicial de GP apresentaram-se negativos para GLUT-1. Quanto à imunoexpressão do

HIF-1α, o teste de Mann-Whitney revelou diferença estatisticamente significativa entre

os casos de GP e MV(p=0,002), onde a mediana do GP (m=78) foi superior a da MV

(m=53). Com base nesses resultados, este estudo mostrou que o diagnóstico histológico

por si só nem sempre é suficiente para o diagnóstico correto do HEM oral e que o HIF-

1α participa da patogênese das lesões vasculares.

Palavras chaves: Tumores de vasos sanguíneos, diagnóstico diferencial,

biomarcadores.

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ABSTRACT

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ABSTRACT

The correct histological diagnosis of vascular lesions in the oral mucosa is

critical, especially in defining the treatment and prognosis, as some vascular lesions

show spontaneous involution and others do not show such behavior. This study

analyzed the expression immunohistochemistry of human glucose transporter protein

(GLUT-1), in oral benign vascular tumors and to reclassify such lesions according to

with his immunoexpression. In addition, we evaluated the immunohistochemical

expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), the main transcription factor

involved in cellular adaptation to hypoxia. We analyzed 60 cases of benign oral vascular

tumors: 30 cases with histological diagnosis of HEM and 30 cases of oral pyogenic

granuloma (PG). The results of this research showed that of the 30 lesions initially

classified as HEM, only 7 showed immuno-positivity for GLUT-1, remaining with the

initial diagnosis. The remaining 23 were reclassified as vascular malformation (VM)

(13 cases) and PG (10 cases). All cases in the sample with an initial diagnosis of PG

were negative for GLUT-1, demonstrating the accuracy of histological diagnosis of

these lesions. Concerning to the immunoexpression of HIF-1α, the Mann-Whitney test

revealed a statistically significant difference between the cases of GP and MV (p =

0.002), where the median of GP (m=78) was higher than the MV (m=53). Based on

these results, this study showed that a histological diagnosis alone is not always

sufficient for the correct diagnosis of oral HEM and that HIF-1α participates in the

pathogenesis of vascular lesions.

Keywords: Blood vessel tumors, differential diagnosis, biomarkers.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Quadro 1. Classificação das lesões vasculares - Mulliken e Glowacki (1982).. 35

Quadro 2. Classificação das lesões vasculares – Sociedade Internacional

para o estudo de anomalias vasculares – ISSVA (1996).................

36

Quadro 3. Distinção das características entre hemangiomas e malformações

vasculares. Pedron et al. (2008).......................................................

40

Quadro 4. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica

e tempo de incubação dos anticorpos primários a serem utilizados

no estudo..........................................................................................

63

Quadro 5. Critérios histopatológicos para o diagnóstico das lesões

vasculares........................................................................................

65

Figura 1. Estrutura molecular bidimensional da GLUT. Fonte: Adaptado de

Machado; Schaan, Seraphim (2006).......................................................

42

Figura 2. Processos Fisiológicos e Patológicos nos quais o HIF tem função

regulador central. Fonte: Semenza (2000)..........................................

48

Figura 3. Representação esquemática da família do HIF. Fonte: Rankin; Giaccia

(2008)……………………………………………………………………

49

Figura 4. Genes ativados na presença do HIF. Fonte: Rankin; Giaccia

(2008)................................................................................................

52

Figura 5. Fotomicrografia do GP exibindo a superfície da lesão composta por área de ulceração e um tecido conjuntivo fibroso frouxo com intenso infiltrado misto permeado por numerosos vasos sanguíneos de calibres variados (H/E- 100x). Natal, RN-2012..................................................................................................

73

Figura 6. Detalhe em maior aumento do GP, mostrando vasos sanguíneos associados a uma inflamação mista difusa (H/E- 400x). Natal, RN-2012..........................................................................................

73

Figura 7. Fotomicrografia do HEM exibindo numerosos vasos associados a uma proliferação endotelial (H/E- 100x). Natal, RN-2012.................................................................................................

74

Figura 8. Detalhe em maior aumento do HEM, mostrando intensa proliferação de células endoteliais (H/E- 400x). Natal, RN-2012.................................................................................................

74

19

Figura 9. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da GLUT-1. Natal, RN-2012................................................................................

75

Figura 10. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão d HIF-1α. Natal, RN-2012................................................................................

76

20

LISTA DE TABELAS

LISTA DE TABELAS

21

Página

Tabela 1. Imunoexpressão do anticorpo anti-GLUT-1 em GP e HEM

orais. Natal, RN-2012....................................................................

69

Tabela 2. Percentuais médios do número de células positivas para a

proteína HIF-1α na amostra de GP oral. Natal, RN-2012.............

70

Tabela 3. Percentuais médios do número de células positivas para a

proteína HIF-1α na amostra de HEM oral. Natal, RN-2012.........

71

Tabela 4. Percentuais médios do número de células positivas para a

proteína HIF-1α na amostra de MV orais. Natal, RN-2012..........

71

Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75 e média dos

postos para os percentuais de expressão da proteína HIF-1α

entre as lesões categorizadas. Natal, RN-2012.............................

71

22

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

� bFGF Fator básico de crescimento de fibroblastos

� GLUT Facilitadores de transporte de glicose

� GLUT-1 Proteína humana transportadora de glicose

� GP Granuloma Piogênico

� HEM Hemangioma

� HEMCRI Hemangioma congênito rapidamente involutivo

� HEMCNI Hemangioma congênito não involutivo

� HIF Fator de transcrição induzível por hipóxia

� HIF-1α Fator 1-α induzível por hipóxia

� HIF-1β Translocador nuclear receptor aril hidrocarbono, ARNT

� HPH HIF prolil-hidroxilase

� HK Hemangioendotelioma kaposiforme

� HREs Elementos responsivos à hipóxia

� IFN-α Interferon alfa

� ISSVA Sociedade Internacional para o Estudo de Anomalias Vasculares

� MV Malformação vascular

� MAV Malformação arterio-venosa

� MCV Malformação capilar-venosa

� MCLV Malformação capilar-linfática-venosa

� MLV Malformação linfática-venosa

� MCAV Malformação capilar-arterio-venosa

� MCLAV Malformação capilar-linfática-arterio-venosa

� ODD Domínio de degradação oxigênio-dependente

� PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

� pVHL Proteína supressora de tumor

� SGLT Transportadores de glicose ligados ao íon sódio

� TIMP-1 Inibidores de metaloproteinase do tipo 1

� TGF-β Fator de crescimento transformador beta

� TNF-α Fator de necrose tumoral beta

24

� VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

� vWF Fator de von Willebrand

25

SUMÁRIO

26

SUMÁRIO

Página

1 INTRODUÇÃO........................................................................................ 28

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 31

2.1 GRANULOMA PIOGÊNICO................................................................... 31

2.2 HEMANGIOMA E MALFORMAÇÕES VASCULARES...................... 34

2.3 GLUT-1...................................................................................................... 40

2.4 HIF-1α........................................................................................................ 46

3 PROPOSIÇÃO......................................................................................... 57

4 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................... 59

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO....................................................... 59

4.2 POPULAÇÃO........................................................................................... 59

4.3 AMOSTRA................................................................................................ 59

4.3.1 Critérios de inclusão da amostra............................................................ 60

4.3.2 Critérios de exclusão da amostra............................................................ 60

4.4 ESTUDO MORFOLÓGICO.................................................................... 60

4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO...................................................... 60

4.5.1 Método imuno-histoquímico................................................................... 60

4.5.2 Análise imuno-histoquímica.................................................................... 63

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................................... 65

5 RESULTADOS......................................................................................... 68

5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS......................................................... 68

5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS.......................................... 68

5.2.1 Análise Qualitativa da marcação Imuno-histoquímica pelo

anticorpo Anti-GLUT-1...........................................................................

68

5.2.2 Análise Quantitativa da marcação Imuno-histoquímica pelo

anticorpo Anti-HIF-1α.............................................................................

69

6 DISCUSSÃO............................................................................................. 78

7 CONCLUSÃO.......................................................................................... 89

8 REFERÊNCIAS....................................................................................... 91

APÊNDICE 1............................................................................................ 102

APÊNDICE 2............................................................................................ 104

27

APÊNDICE 3........................................................................................... 105

APÊNDICE 4........................................................................................... 106

ANEXO A.......................................................................................................... 107

27

INTRODUÇÃO

28

1. INTRODUÇÃO

Conceitua-se anomalia vascular a lesão de etiologia congênita ou adquirida cujos

componentes predominantes são estruturas vasculares. São incluídas neste grupo todas

as malformações congênitas do sistema vascular, os tumores vasculares benignos, como

o hemangioma (HEM) e granuloma piogênico (GP) e também os tumores vasculares

malignos (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009).

Apesar da padronização dessa classificação, alguns autores continuaram

classificando, genericamente, essas lesões como HEM, dificultando o estudo e o

conhecimento das mesmas (HASSANEIN et al., 2011). O HEM pode apresentar

características histológicas e clínicas similares ao GP e à malformação vascular (MV), o

que também dificulta a classificação das lesões.

O GP é um crescimento tumoral reacional bastante comum na cavidade oral.

Representa cerca de 30 a 60% de todas as lesões que acometem a gengiva.

Histologicamente, caracteriza-se por uma exuberante reação de granulação rica em

vasos sanguíneos de calibres variados, por vezes ingurgitados por eritrócitos e dilatados,

sendo os mesmos revestidos por células endoteliais e pericitos mitoticamente ativos

(SILVEIRA et al., 2004; JAFARZADEH; SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006;

SHENOY; DINKAR, 2006).

O termo hemangioma foi restrito a lesões que exibiam proliferação celular, que

surgia após o nascimento (em 60% dos casos), crescia rapidamente e regredia em um

período variável. Microscopicamente, nessa lesão observam-se numerosas células

endoteliais proliferantes dilatadas e o lúmen vascular geralmente indistinto que durante

o estágio de progressão, originam abundantes espaços vasculares de diversos tamanhos

(RODRIGUES et al., 1998; FREITAS et al., 2005; GONTIJO et al., 2005). As MVs

estão presentes ao nascimento, têm um crescimento proporcional ao da criança, e

microscopicamente apresentam endotélio quiescente e são considerados defeitos na

morfogênese vascular, provavelmente devido a uma disfunção nas vias de regulação da

embriogênese e vasculogênese, compreendendo todas as malformações congênitas do

sistema vascular, tais como as malformações arteriais, venosas, linfáticas, capilares e

suas combinações. (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009).

Atualmente, pesquisas têm sido realizadas objetivando o entendimento das

apresentações clínicas, histológicas e patogenia das lesões vasculares com finalidade de

29

investigar fatores que possam contribuir no diagnóstico diferencial, haja visto que essas

lesões em muitas situações exibirem características clínicas e histológicas semelhantes

devido a presença do componente vascular.

A proteína humana transportadora de glicose (GLUT-1), identificada por North et

al. (2000) tem recebido especial atenção por ser atualmente considerada um marcador

imuno-histoquímico sensível e específico para HEM de pele. Merece destaque também

o marcador de hipóxia, representado pelo fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1α),

devido ao fato da hipóxia tumoral ser um evento importante no desenvolvimento e

progressão dos tumores, sendo considerado um fator prognóstico adverso em tumores

sólidos, particularmente nos localizados em cabeça e pescoço.

Assim, mesmo sendo lesões de comportamento benigno (HEM, GP e MV), se faz

necessário para que seja estabelecido o correto diagnóstico. Poucos trabalhos realizaram

este tipo de análise e comparação. Dessa forma, este trabalho propõe avaliar a expressão

de GLUT-1 e HIF-1α em uma série de casos de lesões vasculares, com a finalidade de

compreender os mecanismos de desenvolvimento destas lesões, bem como apurar se a

expressão destes marcadores poderia ser útil recurso e auxiliar o de diagnóstico

diferencial para estas dessas lesões orais.

30

2. REVISÃO DE LITERATURA

REVISÃO DE LITERATURA

31

2.1 GRANULOMA PIOGÊNICO

O granuloma piogênico (GP) consiste em uma lesão benigna de natureza não

neoplásica relativamente comum de tecido mole, que se desenvolve a partir do tecido

conjuntivo como uma reação inflamatória a uma irritação crônica, não específica e de

baixa intensidade. Esse tecido conjuntivo altamente vascularizado é sede de uma reação

de granulação (GOMES; DUARTE, 2008). Apresenta uma grande incidência na

cavidade oral, correspondendo a 3,81% a 7% de todas as lesões orais, embora possa

ocorrer em outras mucosas e pele (SILVEIRA et al, 2004; LAWOYIN et al., 1997;

AVELAR et at., 2008).

O GP foi descrito pela primeira vez por Porcet e Dor (1887), com o nome de

infecção botrimicótica. O termo Granuloma Piogênico é citado no texto “Doenças da

pele” por Croker (1903), passando a ser utilizado na literatura mundial em 1904, após

ter sido inserido por Hartzell, que sugere que essa lesão fosse causada por

microrganismos piogênicos capazes de desencadear uma inflamação granulomatosa

(FOWLER et al., 1996; NEVILLE et al., 2009).

Contudo, apesar desta denominação ser a mais utilizada, sabe-se que a lesão não

é um granuloma verdadeiro, isso, pelo fato de não se evidenciar uma formação

exuberante de material purulento (REGEZI; SCIUBBA; JORDAN, 2008). Outras

denominações são, também, citadas na literatura para esta lesão, como o termo

hemangioma capilar lobular, introduzido em 1980, por médicos dermatologistas, por

muitas vezes, ser caracterizado por uma intensa proliferação vascular organizada em

lóbulos, e granuloma gravídico, para configurar as lesões que acometem

frequentemente, as mulheres em gestação (SILLS et al., 1996; HARRIS et al., 2000).

Existem diversos fatores que podem estar associados à patogênese do GP. Para

muitos, a lesão representa, na maioria dos casos, uma resposta tecidual excessiva do

tecido conjuntivo a uma irritação local ou a um trauma (SHENOY; DINKAR, 2006).

Inicialmente se descrevia que o GP era uma infecção por Estafilococos e Estreptococos

e, que estes microrganismos produziam colônias com características parecidas entre si.

Por sua vez, Neville et al. (2009) postulam que a presença de bactérias é acidental e não

base do processo, não tendo, assim etiologia infecciosa.

32

Dentre os fatores que podem acarretar o aumento tecidual, podem-se destacar

principalmente as irritações crônicas locais e traumas de baixa intensidade, tais como

cálculos dentários, restaurações defeituosas, biofilme, raízes residuais, próteses

inadequadas, corpos estranhos, além de outros agentes traumáticos (JAFARZADEH et

al., 2006).

Destacam-se também como fatores etiológicos desta lesão, o uso de certas

drogas como a ciclosporina, além das influências hormonais e anomalias citogenéticas

(TOLENTINO; TOLENTINO, 2009). O papel dos hormônios na etiologia do GP ainda

não está totalmente esclarecido. Alterações hormonais que geralmente ocorrem na

puberdade, ou provocadas pelo uso de contraceptivos orais e na gravidez podem

modificar a resposta reparadora gengival a agentes irritantes. Nestes casos, podem-se

visualizar lesões gengivais múltiplas ou hiperplasia gengival generalizada (REGEZI;

SCIUBA; JORDAN, 2008).

Nichols et al. (1992) citaram em sua pesquisa que o estrogênio e a progesterona

não são fatores determinantes para o surgimento do GP em gestantes e em mulheres que

faziam uso de contraceptivos orais, visto que as lesões avaliadas não apresentavam

receptores específicos para esses hormônios. Outros autores afirmam que esses

hormônios não são fatores decisivos na patogênese da lesão, mas sim contribuitórios ou

secundários (WHITAKER et al, 1994).

Por sua vez, Yuan, Jin e Lin (2002) analisaram em ratas ovariectomizadas,

quando estas eram submetidas à injeção de β-estradiol, que a presença dos hormônios

femininos não apenas intensificam a quantidade de fatores angiogênicos produzidos por

monócitos e macrófagos, mas também os protegem da apoptose, prolongando os efeitos

da angiogênese. Os autores concluíram então que o GP trata-se de um crescimento

reacional, tanto angiogênico como hormônio-dependente.

Shenoy e Dinkar (2006) propuseram ser possível que as microulcerações

conseqüência desses irritantes em uma gengiva já inflamada favoreçam o ingresso de

uma microbiota oral de baixa patogenicidade dentro do tecido conjuntivo gengival. Esse

quadro pode acarretar uma resposta vascular hiperplásica exacerbada no tecido

conjuntivo e levar à formação do GP, podendo classificá-lo como uma desordem

angiogênica (GOMES; DUARTE, 2008). De acordo com Al-Khateeb e Ababneh (2003)

se esta hipótese fosse verdadeira, ela poderia explicar a predominância do GP em

localização gengival.

33

Com relação aos aspectos clínicos, o GP freqüentemente apresenta-se como um

nódulo ou tumor, pediculado ou séssil, com superfície lisa, lobulada que comumente

está ulcerada, recoberta por fibrina, exibindo tendência para hemorragia espontânea ao

mínimo traumatismo. Sua coloração vai do vermelho intenso ao vermelho violáceo,

dependendo da vascularização. Com consistência que pode ser mole ou firme, e apesar

de geralmente ser indolor, em alguns casos apresenta-se latejante ou com discreto ardor.

Pode atingir até 2,5 cm e geralmente alcança seu tamanho máximo em semanas ou

meses. Radiograficamente, geralmente não há evidências de envolvimento ósseo,

mas em alguns casos, ligeira erosão óssea superficial pode ser vista (MARTINS-FILHO

et al., 2011). Em 3% dos casos de GP podem ser visualizados extensa perda de osso

alveolar e mobilidade dos dentes (SILVERSTEIN; BURTON; SINGH, 1995).

No tocante à localização, o GP pode ser observado na mucosa oral, face e dedos.

Em mucosa oral, geralmente, o seu início é a partir de uma papila interdental,

correspondendo 30 a 60% de todas as lesões reacionais que acometem a gengiva, sua

localização predominante (DEZOTTI et al., 2000; BRUST; DOMINGUES, 2009). Pode

manifestar-se, também nos lábios, língua, bochechas e outras áreas da mucosa oral. A

região anterior de maxila apresenta-se mais afetada que a mandíbula (SARAVANA,

2009), mais na porção anterior, na faixa de 21 a 50 anos, devido aos efeitos vasculares

provocados pelos hormônios femininos (AGUILO, 2002).

O predomínio do sexo feminino foi observado em diversos estudos (SHAMIN et

al., 2008; AVELAR et al., 2008; SARAVANA, 2009).

Gordón-Núñez et al. (2010) em uma análise de 293 casos de GP constataram que

a essa lesão foi predominantemente na gengiva (83%), seguida por lábios e língua,

palato, mucosa jugal e assoalho de boca. Quanto à idade e o sexo, a maior incidência foi

na 2ª década de vida e o sexo feminino foi o mais afetado.

Histologicamente esta lesão apresenta uma proliferação de vasos de calibres

variados, semelhante ao tecido de granulação, onde os vasos são de calibres variados,

por vezes dilatados e obliterados por eritrócitos e, revestidos por células endoteliais e

pericitos mitoticamente ativos. Devido a este quadro, o GP, de acordo com alguns

autores, também pode ser considerado uma forma de hemangioma capilar (PATIL;

MAHIMA; LAHARI, 2006; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).

A lesão é revestida por epitélio pavimentoso estratificado ceratinizado, sendo

atrófico em algumas áreas e hiperplásico em outras. Em áreas ulceradas, observa-se a

presença de exsudato fibrinoso ou seropurulento. O tecido conjuntivo de permeio é do

34

tipo fibroso frouxo com proliferação de componentes inflamatórios e fibrosos. Na

região central, encontra-se tecido de granulação. Observa-se também a presença de

numerosos espaços vasculares revestidos por endotélio e a proliferação excessiva de

fibroblastos e brotamento de células endoteliais. O conteúdo de eritrócitos nos espaços

vasculares é responsável pela coloração vermelha da lesão. Com a cronificação, a lesão

torna-se mais fibrosa e há obliteração capilar, redução do componente inflamatório e

maior deposição de colágeno (SOLETTI et al., 2004; JAFARZADEH et al., 2006;

SHENOY; DINKAR, 2006; NEVILLE et al., 2009). O infiltrado inflamatório é

formado por linfócitos e plasmócitos localizados preferentemente na porção profunda da

lesão, além de neutrófilos, estando esses últimos localizados próximos da superfície

ulcerada (SHENOY; DINKAR, 2006; NEVILLE et al., 2009).

De acordo com Sanchez et al. (2000), o diagnóstico definitivo é confirmado por

biópsia. Para Harris et al. (2000), apesar do exame histopatológico determinar o

diagnóstico definitivo do GP, certas situações, tais como, ausência de ulceração

superficial, com conseqüente diminuição do infiltrado inflamatório misto, e proliferação

vascular irregular podem aparentar outra lesão vascular, dificultando o diagnóstico do

granuloma piogênico.

2.2 HEMANGIOMA E MALFORMAÇÕES VASCULARES

As lesões vasculares são as anomalias congênitas e neonatais mais comuns

(WERNER et al., 2001; WERNER et al., 2006). Até recentemente, não houve nenhuma

padronização para as lesões vasculares que fosse universalmente aceita (EIVAZI et al.,

2009).

Virchow (1863) foi o primeiro autor a classificar, com base na histologia, as

anomalias vasculares em: angioma simplex, angioma cavernosum e angioma

racemosum, onde qualquer um desses subtipos poderia transformar um no outro através

da proliferação celular ou da dilatação de vasos (MULLIKEN; GLOWACKI, 1982).

Em 1935, Geschickter e Keasbey denominaram de hemangioma (HEM) as

lesões benignas de vasos sanguíneos utilizando esse termo como sinônimo de angioma.

O HEM foi subdividido de acordo com as características clínicas e histopatológicas em:

HEM capilar, HEM cavernoso e fístula arterio-venosa congênita. O HEM capilar

35

clinicamente se apresenta como lesão elevada e avermelhada. Histologicamente, estas

lesões eram compostas por uma fina rede de capilares podendo organizar-se em lóbulos.

O HEM cavernoso clinicamente era identificado por marca de nascença na face ou

como um nódulo azulado na superfície mucosa da boca. Estas lesões eram compostas

histologicamente por vasos dilatados com paredes finas. A fístula arterio-venosa

congênita era uma persistência da rede vascular embriogênica, manisfestando-se após o

nascimento, sendo histologicamente caracterizada por regiões de hipertrofia vascular

com a presença de artérias e veias intercomunicantes.

Em 1982, Mulliken e Glowacki sugeriram uma nova classificação das lesões

vasculares de acordo com as manifestações clínicas, com o quadro histopatológico e

história natural, com o intuito de distinguir malformações vasculares e hemangiomas.

As malformações vasculares (MV) estão presentes ao nascimento, têm um crescimento

proporcional ao da criança, e microscopicamente apresentam células endoteliais

achatadas. O termo hemangioma foi restrito a lesões que exibiam proliferação celular,

que surgia após o nascimento (em 60% dos casos), crescia rapidamente e regredia em

um período variável (Quadro 1).

HEMANGIOMA

MALFORMAÇÕES

Fase Proliferativa e involutiva Sem Fase Proliferativa e Involutiva

Proliferação de células endoteliais Ciclo de células normais

40%-Presentes ao nascimento 90%-Presentes ao nascimento

Crescimento pós-natal rápido e

Involução lenta

Crescimento proporcional a criança

Razão Sexo (F:M) – 5:1 Razão Sexo (F:M) – 1:1

Quadro 1. Classificação das lesões vasculares – Mulliken e Glowacki (1982).

Em 1996, em virtude do surgimento de outras lesões, a classificação de Mulliken

e Glowacki foi revista, e uma classificação nova foi adotada (Sociedade Internacional

para o Estudo de Anomalias Vasculares – ISSVA), dividindo as lesões vasculares em

dois grupos: tumores e malformações vasculares. Os tumores vasculares são neoplasias

da vasculatura caracterizadas pela proliferação celular e incluem HEM da infância,

HEM congênito rapidamente involutivo, HEM congênito não involutivo, angioma em

36

tufos, hemangioendotelioma kaposiforme (HK) e granuloma piogênico. As MVs

consistem em erros da morfogênese e são classificadas de acordo com o vaso

predominante: capilar, venosa, arterial, linfática e combinada. (Quadro 2). Apesar desta

classificação não ser absoluta, ela possui uma relevância clínica porque possibilitou um

importante avanço na abordagem das anomalias vasculares.

TUMORES VASCULARES

MALFORMAÇÕES VASCULARES

Simples Combinadas

HEM Capilar Fístula AV

HEM Congênito Involutivo Linfática MAV, MCV

HEM Congênito Não-Involutivo Venosa MCLV, MLV

GP Arterial MCAV, MCLAV

HK

Angiomas em tufos

(Fístula AV – Fístula Arterio-venosa; MAV-Malformação arterio-venosa; MCV-

Malformação capilar-venosa; MCLV-Malformação capilar-linfática-venosa; MLV-

Malformação linfática-venosa; MCAV-Malformação capilar-arterio-venosa; MCLAV-

Malformação capilar-linfática-arterio-venosa.)

Quadro 2. Classificação das lesões vasculares – Sociedade Internacional para o Estudo de

Anomalias Vasculares – ISSVA (1996).

Mesmo após a classificação da ISSVA (1996), o termo HEM é usado para

diversas lesões, levando a uma confusão no entendimento das lesões vasculares (VERY

et al., 2002; JOHANN et al., 2007). Além disso, o HEM pode apresentar características

clínicas e histológicas similares ao GP e à MV, o que leva a erros no diagnóstico

(NORTH et al., 2000; LEON-VILLAPALOS et al., 2005).

O HEM infantil consiste em tumor benigno da infância que deve ser classificado

segundo o estágio, padrão de crescimento, a aparência e o órgão específico. A fase

prodrômica do HEM aparece dias ou semanas após o nascimento. Dependendo do tipo

de crescimento, pode ser difuso, podendo se infiltrar em torno dos tecidos, ou apresentar

37

um crescimento limitado (EIVAZI et al., 2009). Os HEMs sofrem crescimento pós-natal

por 8-12 meses (fase proliferativa), seguido de regressão para os próximos 1-5 anos

(fase de involução), com melhoria contínua até 6-12 anos (fase involuído).

Segundo Buckmiller et al. (2010), os HEMs são sub-divididos em duas

categorias com base no seu comportamento clínico e histológico. O mais comum o

HEM “infantil” surge logo após o nascimento, prolifera e em seguida, sofre uma

involução prolongada. Exibem aparência variável, podem apresentar isolados,

multifocais ou como lesões segmentares. Além, de evidenciarem imunopositividade ao

marcador GLUT-1 (proteína humana transportadora de glicose), considerado específico

para essa lesão. O 2º tipo, menos comum, é o HEM “congênito”. Este tipo raro está

presente ao nascimento, não possui uma fase de crescimento como sua contraparte

infantil. Por este tipo ser GLUT-1 negativo (NORTH et al., 2001) especulações sobre

sua verdadeira origem tem sido levantada. Os HEMs congênitos podem rapidamente

involuir (HEM congênito involutivo) ou nunca involuir (HEM congênito não

involutivo).

Ambos os tipos apresentam patogênese relacionada à proliferação de células

endoteliais. Entretanto, a causa da proliferação aberrante e focal das células endoteliais

permanece confusa. A origem dos HEMs, embora ainda discutida, tem sido associada à

angioblastos placentários endoteliais ou células progenitoras endoteliais intrínsecas com

a habilidade de duplicar clonalmente em um meio preciso de citocinas e estrógenos

(KLEINMAN et al., 2005; BARNES et al., 2007).

A origem das células endoteliais dos HEMs da infância tem sido discutida desde

que foi demonstrado em estudo imuno-histoquímico uma similaridade entre a

vasculatura dos HEMs e da placenta com a descoberta de marcadores tissulares

específicos coexpressos nos HEMs e em vasos placentários como GLUT-1, Ag Lewis Y

e antígeno endotelial placentário. Estas proteínas não são expressas nas células

endoteliais de MVs (NORTH et al., 2000). Com isso, há a hipótese de que as

células endoteliais do HEM na verdade, são provenientes da placenta ou se ambas as

células endoteliais do HEM e da placenta simplesmente compartilham uma mesma

forma de fenótipo imaturo.

Segundo Ribas, Laranjeira e Sousa (2004), a patogênese do HEM ainda é pouco

compreendida, acrescentando que estímulos endócrinos e inflamatórios poderiam ativar

esses distúrbios vasculares. Segundo Verkare et al. (1999), os tumores são compostos

por microvasos delimitado por células endoteliais mitoticamente ativas e pericitos,

38

caracterizados pela intensa proliferação do endotélio capilar com acúmulo de mastócitos

e fibroblastos. Em 1971, Folkman formulou o conceito de que as lesões são

angiogênese-dependentes e que moléculas angiogênicas atuariam sobre as células

endoteliais e pericitos induzindo a formação da rede capilar (TAKAHASHI et al.,

1994).

Avanços nos conhecimentos da angiogênese têm identificado algumas moléculas

chaves que controlam o desenvolvimento vascular, incluindo o fator de crescimento

celular endotelial vascular (VEGF), que é responsável pela indução de células

endoteliais, e o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), o qual atua em

sinergia com o VEGF, contribuindo, assim, com ativação de angioblastos. Os níveis de

VEGF e bFGF são altos no estágio proliferativo do tumor e baixos na fase evoluída ou

de resolução (SUN; ZHAO; ZHANG, 2007).

Sundine e Garrett (2007) descreveram os principais fatores angiogênicos

envolvidos na formação do HEM que seriam o VEGF, bFGF, fator de necrose tumoral

(TNFα), interleucina 8 e os fatores antiangiogênicos, que incluem os inibidores de

metaloproteinases tipo 1 (TIMP-1), fator de crescimento transformador beta (TGF-β) e

interferon alfa.

De acordo com Chiller et al. (2003) e Freitas et al. (2005), os HEMs infantis são

basicamente conseqüência do excesso de angiogênese, enquanto que as MVs poderiam

ser o resultado de erros na remodelação do vaso.

Freitas et al. (2005) em seu estudo reforçaram o papel dos fatores

angiogênicos na etiopatogênese dos HEMs e GPs, entretanto, através da avaliação da

expressão imuno-histoquímica do VEGF e da medição da atividade angiogênica pela

coloração de fator von Willebrand (vWF) e CD31 foi mostrado que a

quantificação microvascular não é útil no diagnóstico diferencial dessas lesões.

Vasconcelos et al. (2011) avaliaram a atividade angiogênica através da

expressão imuno-histoquímica dos anticorpos anti-CD105 e anti-CD34 em 20 casos de

MV e 20 casos de GP. Os resultados dessa pesquisa demonstraram que não houve

diferença estatisticamente significativa entre as médias de contagem microvascular. Este

ensaio reforçou a participação dos fatores angiogênicos na etiopatogênese dos HEMs e

dos GPs orais, porém a quantificação da angiogênese não pode ser utilizada como

parâmetro para diagnóstico diferencial entre as duas lesões.

Sem predileção por raça, o HEM apresenta-se clinicamente como mancha ou

nódulo arroxeado, cuja coloração varia de vermelho intenso ao roxo, de acordo com a

39

localização e a profundidade no tecido, além do grau de congestão dos vasos

(REGEZZI; SCIUBBA; JORDANN, 2008).

Corrêa et al. (2007) analisaram 154 casos de lesões vasculares categorizadas

como HEM, MV e varizes de boca. Destas, as varizes de boca (65,6%) foram as lesões

mais freqüentes. Os pacientes do sexo feminino foram os mais acometidos pelo HEM e

varizes de boca. As MV e varizes de boca foram mais prevalentes na 7ª e 6ª década de

vida, respectivamente. A localização prevalente dos HEM e varizes de boca foram a

superfície ventral de língua, e das MV, os lábios.

O tamanho do HEM é variável dependendo de diversos fatores que incluem,

entre outros, idade do paciente e local da lesão. Em geral, é relativamente flácido à

palpação, podendo ser circunscrito ou difuso apresentando-se plano ou elevado, com

superfície lisa ou nodular e, na maioria das vezes, assintomático (ROCHA et al., 2000).

Na maxila ou na mandíbula, ocorrem, ocasionalmente, HEMs centrais (intraósseos), que

se apresentam com aspecto radiolúcido, uni ou multilocular, semelhante a alguns cistos

(KHURANA et al., 2001). Nesses casos, pode-se ter dificuldade na realização do

diagnóstico diferencial por apresentarem aspecto radiográfico semelhante a outras

lesões.

Histopatologicamente, os HEMs em desenvolvimento inicial caracterizam-se por

apresentarem numerosas células endoteliais dilatadas e lúmem vascular freqüentemente

pequeno, comumente denominado de HEM juvenil; já as lesões maduras apresentam

células endoteliais achatadas e pequenas e espaços vasculares mais volumosos. O HEM

Capilar e HEM Cavernoso são definidos de acordo com o tamanho dos espaços

vasculares. O HEM capilar é composto de pequenos vasos de paredes finas do tamanho

de capilares, revestidos por uma camada única de células endoteliais achatadas e

circundados por uma camada descontínua de pericitos e fibras reticulares. O HEM

cavernoso consiste de vasos de paredes finas ou sinusóides cavernosos de permeio a um

estroma (NEVILLE et al., 2009; ZHENG et al., 2008). Ao passo que os HEMs sofrem

involução, os espaços vasculares tornam-se mais dilatados e amplamente espaçados

(NEVILLE et al., 2009).

As MVs devem ser classificadas de acordo com seu padrão de crescimento,

aparência e especificidade do órgão, e também de acordo com a desordem embriológica

e suas origens vasculares predominantes. Isto significa que uma característica comum

de todas as anomalias congênitas vasculares é que elas podem aparecer em todos os

órgãos e regiões do corpo. Outra característica comum é que podem ser únicas,

40

múltiplas, ou disseminadas e podem variar no padrão de crescimento, bem como podem

ser bem delimitadas ou ter infiltração difusa (BUCKMILLER et al., 2010).

Clinicamente, as MVs podem ainda ser subdivididas em lesões de baixo fluxo

(incluindo manchas de vinho do Porto, malformações venosas, malformações linfáticas,

e algumas lesões combinadas) e lesões de alto fluxo (incluindo malformações

arteriovenosas). Para se ter uma melhor correlação entre HEMs e as MVs congênitas,

Pedron et al. (2008) relataram um conjunto adicional de orientações para diagnóstico,

baseada em três características distintas, incluindo: 1) presença evidente da anomalia ao

nascimento, 2)crescimento, 3) evidência de involução da lesão (Quadro 3).

CARACTERÍSTICAS HEM MV

Presente ao nascimento Apenas 30% dos

hemangiomas estão presentes

ao nascimento.

Sempre presente ao

nascimento, mesmo que não

seja aparente.

Crescimento Crescimento rápido, brusco e

chamativo com duração

média entre 8 e 14 meses.

Crescimento lento que só se

faz evidente com o passar dos

anos.

Involução da lesão Salvo uma porcentagem

mínima os hemangiomas

sempre involuem em maior

ou menor proporção.

Não involuem. Alteração de

tamanho está relacionada a

infecções, alterações

hormonais ou traumas.

Quadro 3. Distinção das características entre hemangiomas e malformações vasculares

(PEDRON et al., 2008).

2.3 PROTEÍNA HUMANA TRANSPORTADORA DE GLICOSE (GLUT)

A GLUT-1 é uma proteína transmembrana que facilita o transporte da glicose e é

um alvo de transcrição da via de sensibilidade da hipóxia que promove a sobrevivência

da célula tumoral em um meio celular de hipóxia (BURSTEIN; NAGI; KOHTZ;

LUMERMAM; WANG, 2006).

41

Em mamíferos, a oxidação da glicose é responsável pela maior fonte de energia

metabólica celular. A membrana plasmática é impermeável a moléculas polares como a

glicose, necessitando assim de proteínas carreadoras para transportá-las para o meio

intracelular (BELL et al., 1990; OLSON; PESSIN, 1996; BROWN, 2000).

A glicose entra na célula através de dois tipos de proteínas carreadoras: os

transportadores de glicose ligados ao íon sódio (SGLT) e os facilitadores de transporte

de glicose (GLUT). Os SGLT transportam glicose acoplando sua captura com a do

sódio (BELL et al., 1990; SCHEEPERS et al., 2004). A GLUT funciona regulando o

movimento bilateral da glicose entre os espaços extra e intracelular, assegurando que

um suprimento constante de glicose circulante esteja disponível para o metabolismo

através de difusão facilitada (OLSON; PESSIN, 1996). A difusão facilitada é uma

forma de transporte passivo na qual a proteína carreadora facilita a passagem de

moléculas, se prendendo quimicamente a elas transportando-as assim através da

membrana (GUYTON; HALL, 1996).

Os facilitadores de transporte de glicose são uma família de 14 membros:

GLUT-1 ao GLUT-12, transportador HMIT–H+– ligado ao mio-inositol e GLUT-14.

Essas proteínas de 50-60 kDa, são expressas de forma tecido e célula-específicos,

apresentando propriedades cinéticas e reguladoras distintas que refletem seus papéis

definidos no metabolismo celular da glicose e homeostase glicêmica corporal total.

Todas as isoformas possuem 12 segmentos transmembrânicos, hidrofóbicos, inseridos

na porção lipídica da membrana plasmática. Os segmentos transmembrânicos estão

ligados por alças de conexão, e as terminações NH2 e o COOH localizam-se no

intracelular. Nas GLUTs, as sequências transmembrânicas são muito homólogas,

enquanto as alças de conexão e as terminações são altamente heterólogas, determinando

as especificidades de cada isoforma. (WU; FREEZE, 2002; MACHADO et al., 2006)

(Figura 1).

Embora 14 isoformas de GLUT já tenham sido caracterizadas, as 5 primeiras

variantes descritas parecem ser as principais, e têm sido foco de estudos que buscam

caracterizar os fluxos de glicose, tanto em situações fisiológicas como fisiopatológicas

(MACHADO et al., 2006).

As proteínas transportadoras de glicose exibem uma marcação padrão em um

tecido específico: GLUT-1 é expressa principalmente nos eritrócitos e tecidos

vasculares; GLUT-2 é expressa em células do fígado, pâncreas, rins e intestino; GLUT-

3 foi identificada nos tecidos do cérebro e em células inflamatórias (MANTYCH et al.,

42

1992); o transportador insulino-dependente, GLUT-4 é conhecido por ser expressa em

tecido muscular e gordura. GLUT-5 está presente nos enterócitos humanos e tem sido

encontrado para ser em grande parte um transportador de frutose (BURANT et al.,

1992).

Figura 1. Estrutura molecular bidimensional da GLUT. FONTE: Adaptado de Machado;

Schaan, Seraphim, 2006.

A GLUT-1 apresenta um modelo conformacional de doze segmentos

transmembrana α-hélice, um amino- e um carboxi-terminal intracelular, um grande

“loop” intracelular, e um sítio de N-glicolisação no primeiro “loop” extracelular. O gene

GLUT-1 localiza-se no cromossomo 1 (1p35.31.3) (KLEPPER; VOIT, 2002). A

expressão deste gene é supra-regulada por uma variedade de agentes e condições:

fatores séricos e de crescimento, transformação oncogênica, inoforos de cálcio,

hormônio da tireóide; e em resposta a redução na concentração externa de glicose,

hipóxia e inibição da fosforilação oxidativa (BEHROOZ; ISMAIL-BEIGI, 1999;

BURSTEIN et al., 2006). A estrutura molecular básica das GLUTs é apresentada na

Figura 1 (MACHADO et al., 2006).

A GLUT-1 é expressa particularmente no cérebro (incluindo a barreira

hematoencefálica), eritrócitos, placenta, centros germinativos dos tecidos linfóides e

túbulos renais (YOUNES et al., 1997). Níveis moderados de expressão também são

observados no tecido adiposo, músculo e no fígado (WOOD; TRAYHURN, 2003).

Todavia, a sua superexpressão tem sido observada em uma série de lesões tumorais

43

(mama, pulmão, fígado, estômago, ovário, pele, cabeça e pescoço) como passível de

utilização para informação diagnóstica e prognóstica (KUNKEL et al., 2003; MORI et

al., 2007).

Uma forte expressão da GLUT-1 em neoplasias ocorre quando as células, em

condições de hipóxia, necessitam da via glicolítica como fonte de energia durante a

isquemia ou hipóxia tecidual que ocorrem como conseqüência de um fornecimento

insuficiente de oxigênio pelo sangue resultante de uma rede vascular tumoral

desestruturada. Deste modo, a hipóxia tumoral induz uma superexpressão de genes

específicos associados ao crescimento e progressão tumoral, como a GLUT-1, anidrase

carbônica e o VEGF, os quais podem ser controlados pelo fator 1 induzível por hipóxia

(HIF-1) (KUNKEL et al., 2003; AHOBA et al., 2010 ).

A GLUT1 é indetectável imuno-histoquimicamente na vasculatura da pele

normal e tecido subcutâneo, mas é altamente expressa em endotélio em sítios de tecidos

sanguíneos, incluindo cérebro, olhos, nervos e placenta sugerindo possíveis associações

patogênicas entre hemangiomas juvenil e esses tecidos (HARIK et al., 1990; FARRELL

et., 1992).

North et al. (2000) avaliaram a GLUT-1 como um marcador imuno-histoquímico

para diferenciar o HEM do GP e da MV. A marcação de GLUT-1 foi positiva em todas

as fases do HEM e negativa nos casos de MV, de GP e hemangioendotelioma.

Observaram, também imuno-positividade focal para GLUT-1 em 3 dos 12

angiossarcomas. Esses autores alegaram que alguns patologistas confundem o HEM na

fase proliferativa com outras lesões proliferativas como o GP, afirmando que é

extremamente difícil distinguir, histologicamente, o HEM, nas fases em involução e

involuída, da MV venosa ou arterio-venosa. Concluíram, assim, que GLUT-1 é um

marcador imuno-histoquímico confiável e altamente específico para HEM.

North et al. (2001a), em seu estudo, investigaram as possíveis similaridades

entre os vasos sanguíneos do HEM e da placenta, através da expressão de antígenos

vasculares associados a placenta: GLUT-1, Lewis Y, merosina e Fcγ receptor ΙΙ

(receptor para imunoglobulina G-2). Foram avaliados 66 casos de HEM, 26 MV, 13 GP,

6 angiomas em tufo, 7 hemangioendoteliomas epitelióide, 1 HK (hemangioendotelioma

Kaposiforme infantil), 14 angiossarcomas e de placenta. Quanto à imunomarcação da

GLUT-1 foi observada imuno-positividade nos vasos de 100% dos casos de HEM e da

placenta. Os casos de angiossarcoma (35%) apresentaram marcação focal. Não foi

observada marcação para GLUT-1 nos casos de MV, GP, angioma em tufo,

44

hemangioendotelioma. Esses autores observaram que o perfil imuno-histoquímico do

HEM é similar ao da placenta, sugerindo uma relação entre a placenta e o HEM e novas

hipóteses sobre a origem desses tumores.

Dyduch et al. (2004) avaliaram a expressão de GLUT-1 em 26 casos de HEM,

15 casos de GP, 9 casos de HEM epitelióide de pele. Dezessete dos casos de HEM

(65%) apresentaram positividade para GLUT-1 nos vasos. Os casos de GP e HEM

epitelióide foram negativos.

Mo et al. (2004) analisando 19 casos de lesões vasculares hepáticos (HEM e

MV), observaram nos casos de HEM, imuno-reatividade para GLUT-1 no endotélio dos

vasos, mesmo na fase involutiva. Já nos casos de MV hepática não se observou imuno-

reatividade para GLUT-1. Esses autores concluíram que a imuno-positividade para

GLUT-1 em HEM hepático é uma ferramenta útil para distinguir essa lesão de MV

hepática.

Adicionalmente, Nguyen et al. (2004), asseguraram em seu estudo, uma intensa

marcação para GLUT-1, em células endoteliais de 100% de casos de HEMs localizados

em tronco, genitália e na cabeça incluindo a boca: 2 casos no lábio e 2 na mucosa jugal.

Leon-Villapalos et al. (2005) avaliaram em 19 casos de HEM, 2 de HEM

congênito não involutivo, 29 de MV e 4 de GP a expressão de GLUT-1. Foi observada

forte marcação da GLUT-1 nas células endoteliais em 95% dos casos de HEM, e

ausência de marcação em HEM congênito não involutivo, MV e GP. Os autores

concluíram que esse marcador é confiável e específico para HEM, útil na diferenciação

de anormalidades vasculares.

Hernández et al. (2005) classificaram 11 casos de lesões vasculares do fígado

com base na expressão de GLUT-1 independente de seu diagnóstico histológico. Em

seguida, os autores compararam os resultados da expressão de GLUT-1 com o

diagnóstico histológico e observaram que a histologia das lesões positivas para esta

proteína correspondia a do HEM. A maioria das lesões vasculares negativas para

GLUT-1 eram congênitas e provavelmente representavam HEM congênito rapidamente

involutivo e HEM congênito não involutivo. Verificou-se que as lesões positivas para

GLUT-1 apresentavam maior taxa de proliferação do que as negativas.

Johann et al. (2007), buscando o diagnóstico diferencial entre HEM, MV e GP

orais, investigaram a imunoexpressão da GLUT-1 em 14 casos de HEM, 48 GP e 17

MV. Observaram que nenhum dos casos de lesões vasculares benignas de boca foi

imuno-positivo para GLUT-1. Os 19 casos diagnosticados inicialmente como HEM de

45

boca mostraram negatividade para GLUT-1, sendo reclassificados como GP ou MV de

boca. A análise histológica não foi suficiente para concluir o diagnóstico de HEM de

boca pelo fato de nenhum desses ser HEM verdadeiro. Todos os casos com classificação

inicial de GP e MV foram imuno-negativos para esta proteína, o que demonstrou a

eficácia da análise histológica para estas lesões. Portanto, os autores asseguraram que a

GLUT-1 é um marcador efetivo para auxiliar no diagnóstico das lesões vasculares

benignas de boca.

O carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço também tem sido alvo de

estudo para avaliação do valor prognóstico da GLUT-1. Conforme Gillies e Gatenby

(2008), a GLUT-1, induzida por hipóxia, poderia provocar um ambiente ácido, devido o

estímulo à glicólise, contribuindo, portanto com a invasão celular, degradação da matriz

extracelular e angiogênese. Os tumores de baixo grau não experimentariam esse tipo de

“pressão ambiental”, pelo fato de que as células malignas ainda poderiam recorrer

predominantemente a fosforilação oxidativa para fornecimento de energia.

Kunkel et al. (2003), buscando associar o mecanismo do metabolismo da glicose

no crescimento e desenvolvimento tumoral, avaliaram em 118 espécimes de

carcinomas de cabeça e pescoço a expressão de GLUT-1. Os autores verificaram que a

imunoexpressão da GLUT-1 era mais fraca nos indivíduos com taxa de sobrevida

superior a 138 meses, quando comparado com os pacientes com taxa de 60 meses. Além

do mais, aqueles pacientes que apresentaram uma resposta negativa a radiação pós-

operatória obtiveram uma forte expressão, constatando, portanto, uma alta atividade

glicolítica nessas lesões.

Li et al. (2008), ressaltando a importância da expressão da GLUT-1 como

preditor de prognóstico em 25 lesões de cabeça e pescoço, constataram que a expressão

imuno-histoquímica dessa molécula era significantemente mais fraca nas lesões

primárias e bem diferenciadas, quando comparada com os tumores recorrentes (P=0,03)

e indiferenciados (P=0,02), respectivamente.

Choi et al. (2007), objetivando analisar a importância da GLUT-1 como

adjuvante no critério de diagnóstico e na estratégia de tratamento do carcinoma

epidermóide de língua, descreveram em uma pesquisa de 60 casos que a forte

imunoexpressão da GLUI-1 estava associada com a localização primária da lesão,

metástase para nódulos linfáticos e estágio tumoral (p < 0.05). Evidenciaram, ainda, que

o marcador de proliferação celular, Ki-67, estava correlacionado com a expressão da

46

GLUT-1 e que a taxa de sobrevida dos grupos com imunomarcação forte foi inferior

quando comparado com as lesões fracamente marcadas.

Ohba et al. (2010) investigaram a expressão imuno-histoquímica da GLUT-1 em

24 casos de carcinoma epidermóide oral e observaram que a marcação estava associada

a áreas de front de invasão, profundidade do tumor (p < 0.023) e a taxa de sobrevida,

sugerindo um pior prognóstico (p < 0.046), porém os autores não puderam inferir uma

relação dessa proteína com os parâmetros idade, gênero, tamanho do tumor e estágio

linfonodal.

2.4 FATOR 1 INDUZÍVEL POR HIPÓXIA (HIF-1)

Hipóxia significa deficiência de oxigênio, referindo-se assim a qualquer estado

em que existe uma redução do oxigênio disponível. É uma causa extremamente

importante e comum de lesão e morte celular, além de ser um dos mais fundamentais de

todos os estímulos ambientes (FERREIRA et al., 2006). Assim, como o crescimento

tumoral exige oxigênio, nutrientes e função metabólica adequada para se desenvolver,

torna-se necessário promover a angiogênese para inibir a apoptose das células tumorais

desencadeada pela hipóxia.

As células respondem a estímulos extra e intracelulares para manter a

homeostase, e a hipóxia é um dos mais fundamentais de todos os estímulos ambientais

(FERREIRA et al., 2006).

A progressão de uma célula normal para a malignidade envolve a capacidade de

esta estimular a angiogênese. Inicialmente, o desenvolvimento de um tumor é suprido

por vasos sanguíneos próximos. Entretanto, em certo momento de crescimento tumoral

estes vasos sanguíneos não são mais suficientes e novos vasos sangüíneos são

necessários para continuar o crescimento. A capacidade do tumor de induzir a formação

de novos vasos sanguíneos foi denominado “angiogenic switch” e pode ocorrer em

diferentes fases da progressão do tumor, sendo dependente do tipo de tumor e do meio

ambiente (BERGERS; BENJAMIN, 2003).

As células tumorais exigem uma vascularização para o fornecimento

de nutrientes e oxigênio, mas o oxigênio não é capaz de difundir além de cerca de 150

mM através dos tecidos. Com o crescimento do tumor, a demanda de oxigênio excede o

47

suprimento do mesmo oriundo da vascularização os seus vasos, assim as células ficam

sob condições de hipóxia (HORSMAN, 1998). Regiões hipóxicas se desenvolvem

dentro de tumores sólidos devido a formações aberrantes de vasos sangüíneos e também

em decorrência da expansão tumoral.

O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um fator de transcrição envolvido na

adaptação celular à hipóxia. Tem um importante papel em processos fisiológicos e

patológicos. O HIF facilita o fornecimento de oxigênio e adaptação à privação de

oxigênio através da regulação da expressão de genes que estão envolvidos em muitos

processos celulares, incluindo a absorção de glicose e do metabolismo, a angiogênese, a

eritropoiese, proliferação celular e apoptose (SEMENZA, 2000; SEMENZA, 2001;

RANKIN; GIACCIA, 2008; UEHARA, et al., 2009) (Figura 2).

O HIF-1 é um fator de transcrição nuclear que funciona na forma de

heterodímero, pertencente à família de fatores de trascrição basic-helix-loop-helix-PAS

(bHLH-PAS), sendo composto pelas subunidades HIF-1α e HIF-1β (conhecida como

translocador nuclear receptor aril hidrocarbono, ARNT) (WANG et al., 1995). A

subunidade HIF-1α contém quatro domínios distintos, incluindo um domínio bHLH

para a ligação do DNA e dimerização, um domínio de dimerização PAS e

especificidade do gene alvo, um domínio de degradação oxigênio-dependente (ODD),

necessário para a degradação pela via da ubiquitina-proteassoma e dois domínios de

transativação localizado na região C-terminal da proteína (PUGH et al., 1997; HUANG

et al., 1998; RANKIN; GIACCIA, 2008). Semelhante, a subunidade β (ARNT) contém

bHLH, PAS e domínios de transativação. No entanto, falta o domínio ODD, e por isso

é constitutivamente expressa em todos os tecidos em condições aeróbias (HUANG et

al., 1998; RANKIN; GIACCIA, 2008) (Figura 3).

48

Figura 2. Processos Fisiológicos (círculo interno) e patológicos (círculo externo) nos quais o

HIF-1 tem função como regulador central. FONTE: Semenza, 2000.

Existem 3 formas de HIF-α humana (HIF-1α, HIF-2α, e HIF-3α), cada uma das

quais é codificada por um locus genético distinto. HIF-1α e HIF-2α têm sido mais bem

caracterizadas, possuindo estruturas de domínio semelhante que são reguladas pelo

oxigênio, apesar de cada isoforma terem papéis distintos e separados. O papel do HIF-

3α ainda não está totalmente compreendido, entretanto uma forma truncada de HIF-3α

conhecida como inibitório Per/Arnt/Sim (PAS) domínio protéico (IPAS) tem sido

encontrado como um inibidor do HIF através de dimerização com HIF-β (KAELIN et

al., 2008; COOK; FIGG, 2010) (Figura 3).

49

Figura 3. Representação esquemática da família do gene HIF. FONTE: (RANKIN; GIACCIA,

2008).

O gene hif-a humano que codifica a proteína HIF-1α possui 2.478 pares de base

e a proteína consiste de 836 aminoácidos, com uma massa molecular que varia de 104 a

116 kDa (RICHARD et al., 1999). O hif-a encontra-se no cromossomo 14 e consiste de

15 exons interrompidos por 14 introns. O exon 2 codifica o domínio bHLH, essencial

para dimerização e ligação da proteína com DNA, enquanto a região que vai dos exons

3 ao 8 codifica o domínio PAS. A região carboxi-terminal, que compreende os domínios

responsáveis pela ativação e estabilidade da proteína, é codificada nos exons 9 a 15

(SEMENZA, 2006). O gene arnt humano localiza-se na região q21 do cromossomo 1 e

possui 22 exons. O gene processado que codifica para o ARNT possui 2.367 pares de

base e a proteína consiste de 789 aminoácidos com uma massa molecualr de 94 kDa

(FERREIRA et al., 2007).

O mecanismo de transativação pelo HIF-1 envolve a ligação do complexo HIF-

1α/ARNT aos motivos HREs (elementos responsivos à hipóxia), localizados nos

promotores e enhancers dos genes alvos. Para a ativação dos genes alvos vários

coativadores são recrutados se ligando ao complexo do HIF-1, tais como o complexo

CBP (CREB binding protein)/p300. Em adição ao CBP/p300, HIF-1 interage com o

coativador SRC-1 (coativador 1 do receptor de esteróide) e com o Tie-2 (fator

intermediário 2 da transcrição) (GIACCIA et al., 2003; FERREIRA et al., 2007). Essa

interação aumenta o potencial transcricional do HIF-1 de uma maneira dependente de

50

oxigênio e produz um efeito sinérgico com CBP. Esse efeito é fortemente

potencializado pela proteína regulatória do estado redox Ref-1 (fator redox 1), uma

proteína que tem atividade redutora de cisteína (CARRERO et al., 2000). Ref-1 interage

fisicamente com ambos os domínios TAD-C e TAD-N, levando a uma transativação

mais potente. Adicionalmente, a ligação do HIF-1 aos HREs não é suficiente para

indução de muitos genes pela hipóxia. Tem-se verificado cooperações sinérgicas entre

HIF-1α e outros fatores de transcrição, tais como Smad-3, fator 4 nuclear de hepatócito

(HNF4), ATF1/CREB1, proteína 1 ativadora (AP1) e Ets-1 (BRACKEN et al., 2003).

Embora a atividade de muitos fatores de transcrição seja afetada pela oxigenação

dos tecidos, portanto, influenciando a regulação gênica, tem se tornado mais evidente

que HIF-1 é o fator de transcrição dominante que regula a expressão gênica em resposta

aos níveis de oxigênio (PUGH et al., 1997).

A habilidade e a atividade do HIF-1α são reguladas por várias modificações pós-

traducionais, tais como hidroxilação, acetilação, nitrosilação e fosforilação (SEMENZA,

2003; FEREIRA et al., 2007). O óxido nítrico promove a estabilização do HIF-1α,

ligação ao DNA e a sua transativação sob condições de normóxia, o que favorece o

acúmulo HIF-1α; já sob condições de hipóxia o óxido nítrico inibe ou impede o

acúmulo de HIF-1α (FEREIRA et al., 2007).

Em relação à fosforilação, muitos genes/oncogenes supressores de tumor

influenciam ou são constituintes de cascatas de fosforilação e assim interferem os níveis

de expressão do HIF-1α independente do oxigênio. Essas cascatas podem ser iniciadas

após fatores de crescimento se ligarem aos receptores de tirosina quinase, que por sua

vez ativam os alvos posteriores da via. Existem duas vias principais de fosforilação

envolvidas na ativação do HIF-1, vias da proteína quinase ativada e da fosfatidilinositol-

3-quinase (FERREIRA et al., 2007).

Com relação à hidroxilação, o HIF-1α, sob condições de normóxia, é

constitutivamente expresso e subsequentemente hidroxilado por uma HIF prolil-

hidroxilase (HPH), levando-o a uma rápida degradação mediada pelo proteassoma. Essa

degradação envolve a ação de um complexo ubiquitina-ligase contendo o fator Von

Hippel Lindau, uma proteína supressora de tumor (pVHL) que faz parte de um

complexo de proteínas, constituído pela elonguina B e C e culina 2 (SMITH;

ROBBINS; RATCLIFFE et al., 2008). A pVHL reconhece os resíduos de prolina

hidroxilados (Pro402 and Pro564) presentes no domínio ODD do HIF-1α. A prolil-

hdroxilase é uma dioxigenase que usa O2 e 2-oxoglutarato como substratos. Essa

51

enzima transfere um átomo de O2 para os resíduos de prolina e o segundo átomo de O2

reage com o 2-oxoglutarato gerando o succinato. Ela também requer ferro como cofator,

o qual se liga ao O2 quando mantido no estado ferroso pelo ácido ascórbico. Sua

atividade é suprimida pelo decréscimo na tensão de O2. Quando HPH é inibida, a via de

degradação do HIF-1α é bloqueada, levando assim ao acúmulo dessa proteína e sua

migração para o núcleo, onde ela ativa genes responsivos à hipóxia (BRUICK;

MCKNIGHT, 2001).

Em condições de hipóxia, o mínimo de hidroxilação ocorre, há o recrutamento

do coativador p300/CPB, em seguida, HIF-1α transloca-se para o núcleo, formando o

heterodímero com o ARNT, onde se ligam ao motivo HRE dos genes alvos. Sob

condição de hipóxia, HIF-1α não é degradada e assim seus genes alvos são expressos e

uma resposta fisiológica à concentração de oxigênio é ativada (COOK; FIGG, 2010).

Chilov et al. (1999) mostraram que o acúmulo de HIF-1α no núcleo em células

submetidas à hipóxia é uma característica intrínsica desse fator de transcrição, já que ele

é independente da presença do ARNT.

No mecanismo da acetilação, foi verificado que o resíduo do aminoácido lisina

532 (K532), localizado no domínio ODD do HIF-1α é acetilado por uma

acetiltransferase chamada arrest-defective-1 (ARD1). A acetilação da K532 favorece a

interação do HIF-1α com o pVHL e assim desestabiliza o HIF-1α. Uma mutação na

K532, substituindo-a por um resíduo de arginina resulta em uma estabilidade aumentada

do HIF-1α (TANIMOTO et al., 2000). A atividade das acetiltransferases não é alterada

pelos níveis de oxigênio, mas os níveis do mRNA do ARD1 (e conseqüentemente da

proteína) diminuem sob condições de hipóxia, levando a um menor nível de acetilação

do HIF-1α do que sob normóxia (JEONG et al., 2002).

O HIF regula a expressão de mais de 100 genes que regulam aspectos chave da

tumorigênese, incluindo a angiogênese, o metabolismo, proliferação, invasão e

metástase (HICKEY; SIMON, 2006; RANKIN; GIACCIA, 2008) (Figura 3).

Sob condições severas de hipóxia, a geração de ATP a partir da fosforilação

oxidativa é substituída pela geração menos eficiente de ATP através da glicólise

anaeróbica. Dessa forma, o fornecimento de ATP para a síntese de proteínas pode cair

até 7% em relação às células expostas a condições de normóxia. Para compensar o

decréscimo de ATP normalmente fornecido pela fosforilação oxidativa, HIF-1 ativa

genes-chaves envolvidos no mecanismo da glicólise e no transporte da glicose, tais

52

como o GLUT-1 e 3, fosfofrutoquinase L (PFK), fosfoglicerato quinase 1 (PGK1) e

lactato desidrogenase-A (LDH) (SEMENZA, 2003).

Muitos fatores pró-angiogênicos como o VEGF, fator de crescimento tumoral β2

(TGF-β2), receptor do VEGF, bFGF e PDGF são induzidos por HIF-1 para promover a

angiogênese. Outros genes ativados pelo HIF-1 incluem fatores que regulam a

proliferação e sobrevivência celular, apoptose, motilidade e estrutura do citoesqueleto,

metabolismo da matriz extracelular, tônus vascular, adipogênese, desenvolvimento de

células B e resistência a drogas (SEMENZA, 2003; SEMENZA, 2006; RANKIN;

GIACCIA, 2008) (Figura 4).

Figura 4. Genes ativados na presença do HIF. FONTE: (RANKIN; GIACCIA, 2008).

O HIF-1 se liga aos genes alvos em sítios contendo o centro de reconhecimento

5'-RCGTG-3' (SEMENZA, 2006). A presença dos sítios de ligação do HIF-1 (HBS) é

necessária, mas não suficiente para a expressão dos genes em resposta à hipóxia,

indicando que o HIF-1 deve interagir com outros fatores de transcrição ligados a sítios

adjacentes (FERREIRA et al., 2007).

Embora o HIF-1 tenha sido inicialmente descrito como o fator de transcrição

regulado pela hipóxia, existe crescentes evidências de que o HIF-1 é também responsivo

a uma variedade de estímulos não hipóxicos. Entre esses estímulos podemos citar a

insulina, PDGF, fator de crescimento tumoral β3 (TGF-β3), fator 1 de crescimento de

53

insulina, trombina, peptideos vasoativos tais como angiotensina II, citocinas pró-

inflamatórias, carbacol que ativa os receptores de acetilcolina muscarínicos. Além disso,

o HIF-1 também é ativado por metais tais como, cobalto, cromo, níquel e arsênio, como

também por estresse mecânico. No entanto, os mecanismos pelos quais esses estímulos

não hipóxicos induzem o HIF-1 não são completamente conhecidos, embora algumas

evidências apontam para o papel dos EROs (espécies reativas de oxigênio) como

mensageiros, regulando a atividade do HIF-1 (FERREIRA et al., 2007).

Giaccia et al. (2003) resumiram o conhecimento discutido no Encontro de

Keystone sobre a biologia da hipóxia. Foi observado que as respostas induzidas pela

hipóxia são fortemente reguladas no desenvolvimento embrionário normal e podem ser

desreguladas em diferentes estados das doenças. A identificação das proteínas reguladas

pelo oxigênio como os fatores transcricionais da família HIF representa um paradigma

para a percepção do oxigênio a nível molecular. Todavia, considera-se que esta família

seja um dos exemplos envolvidos na regulação da expressão protéica em resposta a

hipóxia. Uma variedade de organelas intracelulares também pode estar relacionada com

a percepção do oxigênio como, por exemplo, os canais iônicos, mitocôndrias e retículos

endoplasmáticos. Finalmente, os pesquisadores concluíram que o conhecimento de

como as células percebem e respondem a hipóxia é fundamental para entender o papel

da hipóxia em doenças, bem como para aprimorar os diagnósticos e tratamentos.

Yamakawa et al. (2003) investigaram os eventos moleculares envolvidos na

regulação da resposta angiogênica pelo fator transcricional HIF-1α durante a hipóxia. E

observaram que baixo nível de expressão dos fatores angiogênicos foi observado nas

células endoteliais em normóxia. Em contraposição, em condição de hipóxia a

expressão dos fatores envolvidos na angiogênese estava aumentada. Através dos

resultados, pode-se sugerir que o HIF-1α medeia a resposta angiogênica à hipóxia, pela

regulação de múltiplos fatores angiogênicos, especialmente do VEGF e do sistema da

angiopoetinas.

Fang et al. (2001), com o objetivo de identificar as moléculas e os mecanismos

envolvidos com a troca do fenótipo angiogênico durante a progressão tumoral,

desenvolveram um modelo de condrosarcoma in vivo. O papel do VEGF e do bFGF e

do fator transcricional HIF-1α foi examinado nas fases de crescimento avascular e

vascular do tumor. Os autores observaram aumento significante dos níveis de expressão

protéica do VEGF em nódulos avasculares do tumor, quando comparado aos nódulos

vasculares. Quando os nódulos avasculares se vascularizaram, houve redução da

54

expressão do VEGF. Contrariamente, a concentração de bFGF não foi aumentada nos

nódulos avasculares, mas foi duas vezes maior nos nódulos vasculares. Como a

expressão do VEGF foi regulada transcripcionalmente pelo HIF-1α, análises da

imunohistoquímica dos nódulos do condrosarcoma revelaram que a translocação

nuclear do HIF-1α foi detectada exclusivamente em nódulos do tumor avascular. Estes

resultados indicaram que o aumento da expressão do VEGF foi mediada pelo fator de

transcrição HIF-1α, o que não ocorreu para o bFGF na troca do fenótipo angiogênico

durante o desenvolvimento tumoral.

Aranha (2008) ponderando o potencial angiogênico das células pulpares

humanas em hipóxia observou ausência da ativação do fator transcricional HIF-1α nas

células-tronco e de fibroblastos de polpas de dentes permanentes humanos em condição

de normóxia. Por outro lado, houve aumento da expressão do HIF-1α e do VEGF em

ambas linhagens celulares, quando as células foram colocadas em condição de hipóxia.

Demonstrando assim, que a hipóxia foi suficiente para induzir o potencial angiogênico

de células pulpares humanas.

Em amostras clínicas, elevada expressão de HIF-1 correlaciona com uma pobre

evolução do paciente com câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de nasofaringe,

colorretal, pâncreas, mama, cervical, osteosarcoma, ovário, endométrio, bexiga,

glioblastoma, e carcinomas gástricos (OSADA et al., 2007; WINTHER et al., 2006).

Ameri et al. (2010) realizaram um estudo com o objetivo de avaliar a associação

entre a hipóxia e as células tumorais circulantes, com a hipótese de que a hipóxia

poderia desempenhar um papel na seleção de células com fenótipos mais agressivos. E

observaram que as células tumorais circulantes mostraram uma resposta a hipóxia

alterada e um fenótipo agressivo mais forte in vivo e in vitro.

Tilakaratne et al. (2008) estudaram a expressão do HIF-1α em casos de fibrose

submucosa oral, com a hipótese de que a hipóxia poderia desempenhar um papel na

transformação e progressão desta condição potencialmente maligna. E observaram

correlação estatisticamente significante com o grau de displasia das fibroses

submucosas orais, podendo indicar a possível participação da hipóxia na transformação

maligna desta lesão.

Sasabe et al. (2005) analisando os mecanismos de sobrevivência de linhagens de

células de carcinoma epidermóide oral em condições de hipóxia, descreveram que a

superexpressão do HIF-1α inibia a apoptose das células neoplásicas. Além disso,

moléculas antiapoptóticas (Bcl2 e Bcl-X) e pró-apoptóticas (Bax e Bak) estariam em

55

níveis aumentados e diminuídos respectivamente pela superexpressão desse marcador

de hipóxia. Os autores ressaltam, ainda, que o HIF-1α estaria associado, em virtude

desse mecanismo, a um pior prognóstico, a uma menor taxa de sobrevida e a resistência

a quimioterapia.

Kyzas et al. (2005) investigando a correlação do VEGF e o HIF-1α com os

parâmetros clínico-patológicos e prognóstico em 81 casos de carcinoma epidermóide de

cabeça e pescoço, constataram uma associação significativa entre a expressão do VEGF

e do HIF-1α nos tumores localizados no lábio inferior e na laringe. Entretanto, a

expressão do HIF-1α não foi significativamente correlacionada com a taxa de sobrevida,

enquanto a expressão do VEGF caracterizou-se com um pior prognóstico. Os autores

suportam que a angiogênese tumoral poderia estar relacionada, mas não estritamente

dependente do ambiente hipóxico tumoral.

Uehara et al. (2009), demonstraram, em 57 casos de carcinoma epidermóide

oral, que a intensa imunoexpressão do HIF-1α estava associado com a metástase

linfonodal, quando comparado a pacientes sem metástase, contribuindo, assim com o

pior prognóstico.

Devido ao fato do HIF regular genes que permitam a sobrevivência das células

em um ambiente hipóxico, incluindo aqueles envolvidos na glicólise, na angiogênese e

na expressão de fatores de crescimento, tem sido observada sua importância na biologia

e na regulação do crescimento do tumor (COOK et al., 2010). O papel central do HIF na

ativação de genes relacionados a angiogênese tem se tornado um alvo promissor para o

tratamento de tumores.

56

PROPOSIÇÃO

57

3. PROPOSIÇÃO

Este trabalho se propõe a analisar a expressão imuno-histoquímica qualitativa e

quantitativa das proteínas GLUT-1 e HIF-1α, respectivamente, em lesões vasculares

orais. Além disto, procurou estabelecer uma análise comparativa desta expressão em

ambas as lesões objetivando verificar se estes marcadores podem ser utilizados como

ferramentas no diagnóstico diferencial e se o HIF-1α participa da patogênese de tais

lesões.

58

MATERIAIS E MÉTODOS

59

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

O presente estudo caracterizou-se como uma pesquisa descritiva constituída pela

observação, análise, registro e quantificação das expressões das células imunomarcadas

pelos anticorpos, anti-GLUT-1 e anti-HIF-1α em uma série de casos de lesões

vasculares orais diagnosticados histologicamente, previamente selecionados.

Constituiu-se, também, de uma investigação comparativa das variáveis independentes

(HEM e GP) como a imunomarcação por esses anticorpos. O mesmo foi aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN sob protocolo no. 286/2011 em reunião deste

comitê em Julho de 2011 (ANEXO A).

4.2 POPULAÇÃO

A população desta pesquisa foi constituída por casos de lesões vasculares orais

registrados e diagnosticados no período de 1995 a 2010 no Serviço de Anatomia

Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN.

4.3 AMOSTRA

A amostra foi intencional e dentre os casos diagnosticados no serviço

supracitado foram selecionados casos diagnosticados inicialmente como: hemangioma

oral (30) e casos de granulomas piogênicos orais (30). Foram coletados os dados

referentes às informações clínicas do paciente (sexo, idade e localização anatômica) e

anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 2).

60

4.3.1 Critérios de Inclusão da Amostra

Foram incluídos nessa pesquisa apenas os casos de hemangiomas e granulomas

piogênicos orais, cujos blocos parafinados oferecerem condições de corte em

micrótomo, que contiverem material biológico suficiente e significativo para realização

do estudo imuno-histoquímico.

4.3.2 Critérios de Exclusão da Amostra

Foram excluídos da amostra todos os casos de hemangiomas e granulomas

piogênicos orais, cujos blocos parafinados não possuírem material biológico suficiente e

significativo.

4.4 ESTUDO MORFOLÓGICO

A análise histomorfológica foi realizada em microscopia de luz (aumentos de

100× e 400×), com cortes de 5 µm de espessura e corados pela técnica da hematoxilina

e eosina. Em seguida, foi realizada uma análise descritiva das características anátomo-

patológica inerentes a cada lesão, onde foram selecionados apenas os casos que

apresentaram os aspectos morfológicos padrões de hemangiomas e granulomas

piogênicos orais.

4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

61

4.5.1 Método Imuno-Histoquímico

Todos os espécimes de hemangiomas e granulomas piogênicos orais fixados em

formol a 10% e incluídos em parafina, referentes aos casos previamente selecionados

para este estudo, foram submetidos a cortes com 3µm de espessura, os quais foram

estendidos em lâminas de vidro devidamente preparadas com adesivo à base de

organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).

Posteriormente, o material foi submetido ao método da imunoperoxidase pela técnica

baseada em polímeros de dextrano (ADVANCETM

HRP, Dako North America Inc.,

Carpinteria, CA, USA), utilizando anticorpos policlonais anti-HIF-1α e anti-GLUT 1

(Quadro 4).

A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito abaixo:

⇒ Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos cada);

⇒ Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:

• Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

• Álcool etílico 95°GL (5 minutos);

• Álcool etílico 80°GL (5 minutos);

⇒ Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°,

à temperatura ambiente (10 minutos);

⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos)

⇒ Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);

⇒ Recuperação antigênica (Quadro 4);

62

⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos);

⇒ Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);

⇒ Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes,

em proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (10 minutos

cada);

⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos);

⇒ Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);

⇒ Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl (Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO, USA) pH 7,4 (5 minutos cada);

⇒ Incubação dos cortes com anticorpos primários, em solução diluente (Antibody

diluent with background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria,

CA, USA);

⇒ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos

cada);

⇒ Incubação com anticorpo secundário (ADVANCETM

HRP Link, Dako North America

Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);

⇒ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos

cada);

⇒ Incubação com anticorpo polimerizado à peroxidase (ADVANCETM

HRP Enzyme,

Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30

minutos);

⇒ Duas passagens em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 (5 minutos cada);

⇒ Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid

DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (10 minutos);

⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos);

⇒ Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

63

⇒ Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (10 minutos);

⇒ Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

• Álcool etílico 80°GL (2 minutos);

• Álcool etílico 95°GL (2 minutos);

• Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

⇒ Duas passagens em xilol (2 minutos cada);

⇒ Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA).

Especificidade Clone Fabricante Diluição Recuperação

Antigênica Incubação

HIF-1α H1α67 Santa Cruz

Biotechnology 1:200

Tris/EDTA, pH 9,0

Pascal, 3 min

Overnight

(18 horas)

GLUT-1 SLC2A1 Gene Tex 1:400 Citrato, pH 6,0

Pascal, 3 min 60 min

Quadro 4. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários a serem utilizados no estudo.

4.5.2 Análise do Perfil Imuno-Histoquímico

Após o processamento dos cortes histológicos e tratamento imuno-histoquímico,

os mesmos foram analisados à microscopia de luz (Olympus CX41, Olympus Japan

Co., Tokyo, JPN).

64

• GLUT-1

A análise da imuno-marcação da proteína GLUT-1 foi qualitativa, realizada por

2 observadores em momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus

CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão), com aumento final de 400X, sendo os

achados anotados em ficha previamente elaborada para posterior análise dos resultados

obtidos (APÊNDICE 3). Em casos de discordância entre os avaliadores o caso foi

reavaliado até chegar a um consenso. Foi considerada marcação positiva para GLUT-1

quando as células endoteliais presentes na parede dos vasos sanguíneos constituintes das

lesões vasculares apresentaram coloração amarronzada e negativa quando

completamente ausentes a marcação, de acordo com a metodologia proposta por Johann

et al (2006).

Considerando que GLUT-1 é um marcador sensível e específico para o HEM,

aquelas lesões com ausência de marcação e que apresentaram diagnóstico inicial de

HEM oral foram reclassificadas (Quadro 5).

Como controle positivo interno para a GLUT-1, foram utilizados os eritrócitos

presentes nas lesões e como controle negativo o anticorpo foi substituído por albumina

de soro bovino a 1% (BSA - bovine serum albumin).

65

LESÃO

CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS

GERAIS

GRANULOMA PIOGÊNICO

-Células endoteliais organizadas em capilares

delimitados por fina camada de células endoteliais,

por um infiltrado de células inflamatórias agudas e

crônicas.

-Imuno-negativa para GLUT-1

HEMANGIOMA

-Proliferação de células endoteliais arredondadas

organizadas em lóbulos, formando vasos sangüíneos

dilatados, ou quando composta por poucos vasos

remanescentes delimitados por um endotélio

maduro achatado.

-Imuno-positividade para GLUT-1

MALFORMAÇÃO VASCULAR

-Vasos sangüíneos tortuosos delimitados por

endotélio maduro achatado

-Imuno-negativa para GLUT-1

QUADRO 5. Critérios histopatológicos para o diagnóstico das lesões vasculares (ENJOLRAS e

MULLIKEN, 1997; HERNÁNDEZ et al., 2005; LEON-VILLAPALOS et al., 2005; MO et al.,

2004; MULLIKEN e YOUNG, 1988; NORTH et al., 2000 e 2001a; EPIVATIANOS et al.,

2005; MULLIKEN e YOUNG, 1988; DRUT e DRUT, 2004; HERNÁNDEZ et al., 2005;

LEON-VILLAPALOS et al., 2005; MO et al., 2004; NGUYEN et al., 2004).

• HIF-1α

A análise da imuno-marcação da proteína HIF-1α foi quantitativa, realizada por

2 observadores através do microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus Japan Co.,

Tokyo, Japão), adaptando-se a metodologia utilizada no estudo de King-tung (2007).

Sob aumento de 200×, foram selecionados 5 campos de maior imunorreatividade ao

anticorpo anti-HIF-1α. Sob aumento de 400×, cada um destes campos foi

fotomicrografado com auxílio da câmera fotográfica (Infinity 1-3C, Lumenera Co.,

Ottawa, Canada), acoplada em microscópio de luz (Nikon Eclipse E200MV, Niko Co.,

Tokyo, Japão), sendo utilizado o programa Lumenera Infinity Analyze (version 5.0.3,

Lumenera Co., Ottawa, Canada). Com auxílio do programa Imaging Processing and

Analysis in Java (ImageJ®, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland,

66

USA), em cada um destes 5 campos, foi realizada a contagem das células endoteliais

exibindo imunomarcação bem como das células negativas.

Posteriormente, com os dados adquiridos da contagem das células, foi calculado

o percentual das células positivas para cada espécime. Os dados obtidos com essa

avaliação foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 4).

Como controle positivo externo para o HIF-1α, foram utilizados cortes de

adenocarcinoma de cólon. Como controle negativo o anticorpo foi substituído por

albumina de soro bovino a 1% (BSA - bovine serum albumin).

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Com o intuito de testar as hipóteses levantadas no presente estudo, os resultados

obtidos foram submetidos a testes estatísticos apropriados. Os dados digitados em

planilhas eletrônicas Excel (Microsoft®

Office XP Professional) foram exportados para

o formato DBF (Data Base Format), sendo, posteriormente, analisados e tratados

estatisticamente pelo programa SPSS (Statistical Package for Social Science version

18.0 for Windows®

XP, Chicago Illinois, USA).

Em relação à avaliação da marcação pelo GLUT-1 nas lesões analisadas, optou-

se pela utilização da análise descritiva, pois investigamos apenas a presença e ausência

de marcação.

Na comparação do percentual das células positivas da marcação imuno-

histoquímica do anticorpo anti-HIH-1α nas lesões analisadas, optou-se pela utilização

do teste estatístico não-paramétrico de Kruskal-Wallis e o teste estatístico não-

paramétrico de Mann-Whitney com o intuito de comparação entre pares de grupos

formulados.

Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de

significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).

67

RESULTADOS

68

5. RESULTADOS

5.1 Resultados Morfológicos

Nos casos de GPs orais analisados, observou-se a presença de uma massa

lembrando um tecido de granulação recoberta por epitélio pavimentoso estratificado

atrófico ou hiperplásico, com áreas ulceradas, cobertas por tecido necrótico, fibrina e

polimorfonucleares neutrófilos. No estroma de tecido conjuntivo fibroso frouxo

observaram-se uma intensa proliferação angioblástica com a formação de numerosos

espaços vasculares de calibres variados, normalmente ingurgitados por eritrócitos,

associados a um exsudato inflamatório difuso, rico em polimorfonucleares neutrófilos,

plasmócitos, macrófagos espumosos e linfócitos, cuja proporção variava com o grau de

ulceração superficial (Figuras 5 e 6).

Com relação aos espécimes de HEM, foi evidenciada a existência de múltiplas

células endoteliais proliferantes ora dilatadas, ora achatadas e pequenas em associação

com uma intensa proliferação e brotamentos de vasos capilares; com lúmen

frequentemente indistinto; e cavernosos, amplamente espaçados, sendo alguns deles

obliterados por hemácias (Figuras 7 e 8).

5.2 Resultados Imuno-Histoquímicos

5.2.1 Análise Qualitativa da marcação Imuno-histoquímica pelo anticorpo

Anti-GLUT-1.

Baseado em trabalhos anteriores (DRUT e DRUT, 2004; HERNÁNDEZ et al.,

2005; LEON-VILLAPALOS et al., 2005; MO et al., 2004; NGUYEN et al., 2004;

NORTH et al., 2000 e 2001; JOHANN et al., 2007) que consideraram GLUT-1 com um

marcador específico do HEM, as lesões que foram incluídas na nossa amostra com o

diagnóstico histológico inicial de HEM foram reclassificadas. Sendo assim, das 30

69

lesões inicialmente classificadas como HEM, apenas 7 apresentaram imuno-

positividade para GLUT-1 no endotélio dos vasos sangüíneos, permanecendo com o

diagnóstico inicial (Figura 9). As 23 restantes foram reclassificadas em MV (n=13) e

GP (n=10) de acordo com os critérios detalhados no Quadro 5 (Figuras 9) (Tabela 1).

Todos os casos da amostra com diagnóstico inicial de GP (n=30) apresentaram

imuno-negatividade para GLUT-1 no endotélio dos vasos sangüíneos (Figura 9)

(EPIVATIANOS et al., 2005; NORTH et al., 2001; JOHANN et al., 2007) (Tabela 1).

Tabela 1. Imunoexpressão do anticorpo anti-GLUT-1 em GP e HEM orais.

MARCAÇÃO

GP

n %

HEM

n %

GLUT-1 (+) 0 0% 7 23%

GLUT-1 (-) 30 100% 23 77%

TOTAL 30 100% 30 100%

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

5.2.2. Análise Quantitativa da marcação Imuno-histoquímica pelo anticorpo

Anti-HIF-1α

Todos os casos analisados demonstraram imunorreatividade ao anticorpo

utilizado. A expressão da proteína HIF-1α foi evidenciada através da marcação positiva

nuclear e/ou citoplasmática em células endoteliais (Figuras 10). Em cada grupo de lesão

estudado, calculou-se a porcentagem das células positivas através da contagem das

células que apresentaram positividade e negatividade para o HIF-1α (Tabelas 2, 3 e 4).

70

Tabela 2. Percentuais médios do número de células positivas para a proteína HIF-1α na

amostra de GP oral.

CASO % (HIF-1α) 1 49

2 87

3 96

4 86

5 77

6 85

7 33

8 88

9 85

10 97

11 93

12 91

13 99

14 86

15 87

16 91

17 78

18 42

19 66

20 85

21 98

22 96

23 89

24 89

25 89

26 90

27 11

28 98

29 98

30 99

31 94

32 86

33 58

34 93

35 97

36 95

37 84

38 8

39 77

40 71

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

71

Tabela 3. Percentuais médios do número de células positivas para a proteína HIF-1α na

amostra de HEM oral.

CASO % (HIF-1α)

1 77

2 57

3 95

4 73

5 95

6 83

7 78

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Tabela 4. Percentuais médios do número de células positivas para a proteína HIF-1α na

amostra de MV orais.

CASO % (HIF-1α) 1 96

2 85

3 85

4 82

5 28

6 40

7 31

8 46

9 76

10 44

11 82

12 8

13 53

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

A análise da imunoexpressão do HIF-1α em relação às lesões revelou, para a

lesão do GP maior mediana (87,5) para percentual das células positivas, seguido da

lesão HEM (78) e MV (53) (Tabela 5). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney

revelou presença de diferença estatisticamente significativa entre as lesões GP e MV

(p= 0,002) (Tabela 5).

72

Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75 e média dos postos para os percentuais

de expressão da proteína HIF-1α entre as lesões categorizadas. Natal, RN-2012.

LESÃO

N

Mediana

Q25-Q75

Média dos postos

p(1)

HEM 7 78 73-95 28,07 <0.05*

GP 40 87,5 77-95 35,15

MV 13 53 35,5-83,5 17,5

(*): Diferença significante a 5,0%.

(1): Teste Mann-Whitney.

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

73

Figura 5. Granuloma Piogênico. Fotomicrografia exibindo a superfície da lesão composta por área de ulceração e um tecido conjuntivo fibroso frouxo com intenso infiltrado misto permeado por numerosos vasos sanguíneos de calibres variados (H/E- 100x).

Figura 6. Granuloma Piogênico. Detalhe em maior aumento mostrando vasos sanguíneos associados a uma inflamação mista difusa (H/E- 400x).

Figura 7. Hemangioma. F a uma proliferação endote

Figura 8. Hemangioma. D de células endoteliais (H/E

. Fotomicrografia exibindo numerosos vasos associadosotelial (H/E- 100x).

. Detalhe em maior aumento mostrando intensa proliferaH/E- 400x).

74

s

feração

75

Figura 9. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da GLUT-1: A) Hemangioma; B) Malformação vascular e C) Granuloma Piogênico. (ADVANCE-400x).

A

B

C

76

Figura 10. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão d HIF-1α: A) Granuloma Piogênico; B) Hemangioma e C) Malformação vascular. (ADVANCE-400x).

C

B

A

77

DISCUSSÃO

78

6. DISCUSSÃO

Por longo período de tempo não houve consenso em relação à terminologia e a

classificação das lesões vasculares, dificultando a criação e a comparação de condutas

de diagnóstico e tratamento destas lesões. Na atualidade, a classificação baseada no

aspecto biológico é adotada internacionalmente, investigando a correlação entre

comportamento biológico celular e evolução clínica. Em 1996, a ISSVA dividiu as

lesões vasculares em duas categorias: tumores vasculares e malformações vasculares

(ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009; GOLDENBERG, 2002).

Tumores vasculares são caracterizados por proliferação de células endoteliais,

sendo incluídos neste grupo: os tumores vasculares benignos, como os HEMs,

hemangioendoteliomas, angiomas em tufos, glomangiomas, GP e também os tumores

vasculares malignos, como os hemangioendoteliossarcomas e os angiossarcomas. Já as

MVs apresentam endotélio quiescente e são considerados defeitos na morfogênese

vascular, provavelmente devido a uma disfunção nas vias de regulação da embriogênese

e vasculogênese, compreendendo todas as malformações congênitas do sistema

vascular, tais como as malformações arteriais, venosas, linfáticas, capilares e suas

combinações. (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009).

Com a aplicação da classificação da ISSVA tornou-se possível um melhor

diálogo entre os profissionais e uniformização na nomenclatura entre clínicos,

cirurgiões e patologistas (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009; GOLDENBERG,

2002). A diferenciação entre estes dois grupos é essencial, não apenas devido as suas

características clínicas, radiográficas e patológicas e sua morbidade, mas também

devido seus tratamentos serem bastante diferentes (HIRAKI; GOLDENBERG, 2010).

Entretanto, o termo “hemangioma” historicamente continua sendo usado

indiscriminadamente para se referir a qualquer anomalia vascular (HASSANEIN et al.,

2011).

Burrows et al. (1998) observaram que o tratamento adequado das anomalias

vasculares se inicia com o correto diagnóstico e que significativo número de pacientes

portadores de lesões vasculares recebe tratamento ineficaz e potencialmente lesivo em

função de diagnósticos errôneos. Hassanein et al. (2011) realizaram um estudo com

objetivo de determinar se a classificação proposta pela ISSVA (1996) está sendo usado

79

para categorizar corretamente as anomalias vasculares e se nomenclatura incorreta afeta

o atendimento ao paciente. Em seus resultados eles encontraram que o "Hemangioma"

foi usado incorretamente em 71,3% das publicações feitas no PubMed no ano de 2009.

Além disso, pacientes cujas lesões foram rotuladas de forma errada eram mais

propensos a receber tratamento inadequado (20,6%) em comparação com indivíduos

cujas lesões foram designadas usando o sistema da ISSVA.

Utilizamos neste trabalho, a classificação biológica atualmente aceita pela

ISSVA, assim sendo, foram analisados uma série de casos de GP e HEM e MVs,

consideradas lesões de comportamento biológico benigno. No entanto, apesar deste

comportamento biológico, se faz importante o estabelecimento do correto diagnóstico

das lesões vasculares, haja vista que estas entidades exibem características clínicas e

histológicas semelhantes em alguns casos.

No que concerne aos achados morfológicos verificados nas lesões analisadas

neste estudo, observou grande similaridade entre os casos, concordantes com as citações

de Vasconcelos et al. (2011), Buckmiller, Suen (2010), Seo et al. (2009), Johann et al.

(2007), Freitas et al. (2005), Leon-Villapalos et al. (2005), North et al., (2000), onde

enfatizam que o diagnóstico diferencial histológico entre HEM e MV ou GP pode ser

difícil, pois, por exemplo, o HEM na fase de involução pode apresentar semelhanças

histológicas com a MV, e o HEM com inflamação pode apresentar semelhanças

histológicas com o GP em si. Nesse contexto, além da informação clínica bem descrita e

anamnese detalhada, a utilização de biomarcadores com finalidade de contribuir no

diagnóstico diferencial, assim como, a reclassificação dessas lesões tem sido bastante

aconselhada.

Com relação aos biomarcadores, identificaram-se nos HEMs a presença de

imunoexpressão para a proteína GLUT-1, que é também expressa na placenta, tecidos

embrionários e fetais. Entretanto, esta proteína não apresenta relação com atividade

mitótica e não é expressa em outras patologias vasculares, como GP e MV. É

considerado um marcador específico para diagnóstico do HEM infantil e encontra-se

presente em todas as suas fases evolutivas (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009;

BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009). Assim, a expressão de GLUT-1 representa uma

característica intrínseca do fenótipo endotelial dessas lesões e permite a distinção

imuno-histoquímica de outros tumores vasculares benignos e outras anomalias

histologicamente semelhantes (NORTH et al., 2001).

80

De acordo com North et al. (2000), a proteína GLUT-1 poderia auxiliar o

crescimento celular por transportar glicose, vitamina C, galactose, água, glicopeptídeos

e outras moléculas para as células, podendo auxiliar desta forma na proliferação do

HEM. Além disso, na vida pós-natal, as células que deveriam ser negativas a GLUT-1

continuam a expressar esta proteína, estando este fato associado a um aumento da

atividade proliferativa e da necessidade energética, podendo exercer um papel

importante na fase proliferativa de HEM (YOUNES et al. 1997). Entretanto, a

persistência desse transportador na fase involuída do HEM sugere que essa expressão

não é uma adaptação temporária do aumento da demanda de glicose devido à alta taxa

de mitose, e sim caracteriza a especificidade dessa proteína como marcador específico

dessa lesão (NORTH et al., 2000).

Younes et al. (1997) propuseram que a ausência de detecção da GLUT-1 na

maioria dos tecidos humanos normais e nas neoplasias epiteliais benignas sugere duas

hipóteses: 1) essa proteína está sendo degradada rapidamente no tecido humano normal

e/ou 2) o anticorpo ou o método de detecção não é sensível o suficiente para identificar

a GLUT-1 na maioria dos tecidos normais, cuja expressão pode ser pequena.

Dentro dessa perspectiva, o presente trabalho investigou a presença da proteína

GLUT-1 em 30 casos com diagnóstico histológico prévio de HEM e 30 casos de GP

orais. Essas lesões foram submetidas à análise imuno-histoquímica e posteriormente

foram reclassificadas de acordo com os resultados obtidos.

Considerando que GLUT-1 é específico pra o HEM e de posse dos nossos

resultados imuno-histoquímicos e histológicos, foi necessária, uma reclassificação das

lesões inicialmente diagnosticadas como HEM oral que não foram imuno-positivas para

o marcador em questão. 10 dos 30 casos com diagnóstico inicial de HEM

correspondiam ao GP e 13 à MV. De acordo com os dados analisados, nossos resultados

sugerem que a análise histológica nem sempre é suficiente para a correta conclusão do

diagnóstico de HEM oral.

Al-Adnani et al. (2006) realizaram um estudo, onde foi aplicado a classificação

da ISSVA a todos os espécimes de anomalia vascular cutânea recebidos durante um

período de 2 anos, com o intuito de avaliar o valor dessa classificação para uso de

diagnóstico por patologistas. Semelhante ao nosso estudo, esses autores utilizaram um

protocolo padrão de imuno-histoquímica para GLUT-1 para confirmar os casos com

suspeitas de hemangioma. Em seus resultados, eles observaram que HEM representou

46% dos casos. No entanto, na coloração de hematoxilina e eosina, 18% dos casos

81

inicialmente pareciam representar MV, sendo seu diagnóstico de HEM confirmado pela

imunoexpressão da GLUT-1. Os casos de MV representaram 30%, entretanto nenhum

desses casos tinham sido subclassificados de acordo com seus vasos predominantes.

Assim, a classificação proposta pela ISSVA pode ser rotineiramente aplicada a amostras

de diagnóstico histopatológico. No entanto, concordando com a presente pesquisa, a

coloração imuno-histoquímica de rotina para GLUT-1 se faz necessária em algumas

situações de casos para a sua classificação correta.

Ainda nesse contexto, Bruder et al. (2009) em sua pesquisa realizaram uma

reavaliação clínico-patológica e aplicação da classificação ISSVA em lesões vasculares

ósseas em crianças, adolescentes e adultos jovens. Foi observado que certas lesões

ósseas muitas vezes consideradas como tumores devem ser classificados como MV. Por

fim, esses autores comentam que a padronização da nomenclatura é fundamental para a

comunicação científica e a gestão do paciente, recomendando que a classificação da

ISSVA deva ser aplicada a lesões tanto ósseas, como de tecido mole e vísceras.

Concordamos com os autores com relação á classificação da ISSVA para os tumores

vasculares ser fundamental para a comunicação científica e manejo do paciente. Em

nossa pesquisa apesar de termos utilizado lesões vasculares de tecido mole oral,

verificamos em uma pequena amostragem que lesões que previamente foram

classificadas como tumores vasculares, na realidade se tratavam de mal formações

vasculares.

Johann et al. (2007) realizaram um estudo quanto a imunoexpressão da GLUT-1

em lesões vasculares. Analisaram imuno-histoquimicamente 93 casos diagnosticados

histologicamente como lesões vasculares benignas de boca: 19 HEM, 48 GP, 17 MV e 9

varizes (VAR). Nenhum dos casos de lesões vasculares benignas de boca foi imuno-

positivo para GLUT-1. Os 19 casos diagnosticados inicialmente como HEM de boca

mostraram negatividade para GLUT-1 sendo reclassificados como GP ou MV oral.

Dados semelhantes aos obtidos pelos autores forma observados no presente trabalho.

Essa reclassificação é fundamental principalmente na hora de definir o

tratamento, prognóstico e na avaliação de respostas a novas terapias, principalmente

quando se considera que o HEM geralmente apresenta involução espontânea e que a

MV e o GP não apresentam (HASSANEIN et al., 2011; JOHANN et al., 2007; AL-

ADNANI et al., 2006).

82

No que se refere à expressão da GLUT-1 nos casos com diagnóstico inicial de

HEM, nossos resultados apontam que a presença da marcação foi identificada apenas

em 23% dos casos, sendo os remanescentes imuno-negativos para a GLUT-1. Esses

resultados discordam dos achados de North et al. (2001 a e 2001b), Li et al. (2003), Mo

et al. (2004), Lyons et al. (2004), Nguyen et al. (2004), Drut e Drut (2004), os quais

observaram imuno-positividade para GLUT-1 nas células endoteliais de 100% dos

casos de HEM.

North et al. (2001b) investigaram 43 lesões vasculares com base na análise

histológica e imuno-histoquímica para GLUT-1. No entanto, esses autores estudaram

lesões vasculares de cabeça, pescoço, tronco, extremidades superiores e inferiores,

diferentemente do nosso estudo, o qual todos os casos estudados se localizavam na

cavidade oral. Nos resultados, os autores observaram que 100% dos casos HEM foram

positivos, diferentemente do nosso, pois apenas 23% dos casos foram positivos. A

diferença desses achados pode ser justificada por diferenças técnicas relacionadas aos

anticorpos utilizados, sistemas de visualização empregados na técnica imuno-

histoquímica e métodos de recuperação antigênica.

Lyons et al. (2004) observaram intensa imuno-reatividade para GLUT-1, em

células endoteliais, em 100% casos de HEM não identificando a localização. NGUYEN

et al. (2004) verificaram intensa imuno-positividade para GLUT-1, em células

endoteliais, em 100% de casos de HEM localizados no tronco,na genitália e na cabeça,

incluindo a boca: 2 casos no lábio e 2 na mucosa jugal. Drut e Drut (2004) observaram

intensa imuno-reatividade para GLUT-1 em células endoteliais em 100% de casos de

HEM de placenta, pele, fígado, glândulas mamárias e submandibulares. No presente

estudo, 77% dos casos com diagnóstico inicial de HEM foi imuno-negativo para GLUT-

1, o que na realidade conduziu ao diagnóstico de GP e MVs. As diferenças na expressão

do GLUT-1, além das questões técnicas já abordadas, podem ser explicadas pelas

diferentes localizações das lesões bem como por métodos de análise diferentes.

Apenas dois tipos de HEM são negativos para GLUT-1: HEM congêntino

rapidamente involutivo (HEMCRI) e HEM congênito não involutivo (HEMCNI). O

HEMCRI apresenta-se completamente formado após o nascimento e rápida involução

no início da infância. Histologicamente caracteriza-se pela proliferação de células

endoteliais organizadas em lóbulos de diferentes tamanhos com áreas involuídas sem

lóbulos. Os vasos sangüíneos são formados por células endoteliais arredondadas e

membrana basal fina na fase inicial e espessada na fase de regressão rápida. O

83

HEMCNI apresenta-se completamente formado ao nascimento e não cresce na vida pós-

natal. Essa lesão é composta por pequenos vasos organizados em pequenos a grandes

lóbulos separados por feixes de tecido conjuntivo denso fibroso e microfístulas arterio-

venosas. As células endoteliais apresentam-se arredondadas e os vasos revelam finas

membranas basais (BERENGER et al., 2003; ENJOLRAS et al., 2001; MULLIKEN e

ENJOLRAS, 2004; NORT et al., 2001b). Nenhum dos casos avaliados no nosso estudo

era congênito, não correspondendo a nenhuma das lesões supracitadas.

North et al. (2000) observaram que quatro lesões classificadas histologicamente

como HEM foram imuno-negativas para GLUT-1. Entretanto, duas dessas lesões

apresentavam características que pudessem explicar a falta de marcação: eram

congênitas, não apresentavam crescimento pós-natal e histologicamente se

evidenciavam uma proliferação de capilares organizada em lóbulos celulares bem

desenvolvidos demarcados por espessos septos conjuntivos. Assim, considerando estes

aspectos os autores sugeriram que se tratavam, possivelmente, de granuloma piogênico.

As outras duas lesões também eram congênitas e foram removidas de crianças mais

velhas sendo classificadas como HEM involuído. Concordamos com Johann et al.

(2007), os quais comentam que torna-se extremamente difícil diferenciar HEM

involuído de MV, assim, provavelmente nos casos de HEM negativos observados no

trabalho de North et al. (2000) na verdade se tratavam de MV já que essas são imuno-

negativas a GLUT-1 semelhante ao detectado no presente estudo.

Dyduch et al. (2004) encontraram casos de HEM (35%) negativos para GLUT-1.

Esses autores classificaram uma dessas lesões como HEMCNI e afirmaram que, apesar

de GLUT-1 ser altamente específica para HEM, a ausência de marcação em lesões

vasculares não exclui o diagnóstico de uma variante do HEM verdadeiro.

Leon-Villapalos et al. (2005) observaram ausência de marcação para GLUT-1

nas células endoteliais em 5% dos 19 casos de HEM. Os autores acreditam que esse

único caso de HEM negativo para GLUT-1 possa ter perdido a expressão de GLUT-1

com a involução. Entretanto esta hipótese contradiz os achados de North et al. (2000 e

2001a) e Mo et al. (2004) que encontraram marcação positiva em todas as fases de

desenvolvimento do HEM.

Imuno-negatividade microvascular para GLUT-1 foi identificada em 100% de

casos de GP observados nos estudos de North et al. (2000, 2001a e 2001b), Dyduch et

al. (2004) e Leon-Villapalos et al. (2005). Apesar desses casos não serem localizados

em boca, os resultados foram semelhante aos nossos, onde também revelamos ausência

84

de marcação para GLUT-1 em GP oral. Assim, foi demonstrada a eficácia da análise

histológica para essas lesões. No nosso estudo 10 casos inicialmente diagnosticados

como HEM de boca eram, na realidade, GP. Isso demonstra que o HEM pode apresentar

similaridades histológicas com GP, principalmente na fase proliferativa onde o HEM

pode apresentar uma organização lobular assemelhando-se ao GP (FRIEDEN;

ESTERLY, 1992; NORTH et al., 2000, 2001a; FISHMAN e MULLIKEN, 1993).

Se tratando de lesões vasculares, a angiogênese é um evento crucial no seu

desenvolvimento e progressão, sendo um dos mais importantes estímulos para a

neovascularização o processo de hipóxia. A condição de hipóxia tecidual induz a

liberação de fatores de crescimento e desequilibra o processo normal de ajuste entre os

fatores pró e antiangiogênicos, formando novos capilares no tumor, a partir de células

endoteliais pré-existentes (FOLKMAN, 1971; FOX; GASPARINI; HARRIS, 2001).

A respeito desse contexto, o crescimento tumoral exige oxigênio, nutrientes e

função metabólica adequada para se desenvolver, tornando-se necessário promover a

angiogênese para inibir a apoptose das células tumorais desencadeada pela hipóxia

(HORSMAN, 1998).

Muitos estudos têm demonstrado a participação do HIF-1, regulador central das

respostas às mudanças na concentração de O2, em processos patológicos, através do

controle transcricional de um grande número de genes envolvidos na angiogênese,

transportadores de glicose (GLUT-1), reguladores de pH (CA-IX), enzimas glicolíticas

e fatores de sobrevivência celular (PUGH; RATCLIFFE, 2003; SEMENZA, 2006;

SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE et al., 2008).

A expressão e ativação do HIF-1α, entretanto, não são apenas estimuladas pela

hipóxia (HUANG E BUNN, 2003; RICHARD et al, 2000; WENGER, 2002). Citocinas

pró-inflamatórias, incluindo TNF-α e interleucina-1 (ALBINA et al. 2001; HADDAD;

LAND, 2001; SANDAU et al., 2001) e uma variedade de produtores microbianos, tais

como lipopolissacarídeos (BLOUIN et al., 2004), lipoproteínas e ácidos nucléicos

podem induzir a expressão HIF-1α. Em contraste com o estímulo de hipóxia, que

depende muito da estabilização da proteína HIF-1α, estímulos não hipóxicos para a

indução da expressão do HIF-1α envolve o caminho da fosfatidilinositol 3-quinase /

Akt, a proteína quinase ativada por mitógeno e caminhos diglicerídeos (FUKUDA et al,

2002;. LIU et al, 2002; TREINS et al, 2002).

Portanto, considerando a necessidade atual do descobrimento de novos

parâmetros patológicos e/ou ferramentas diagnósticas que possam agilizar o diagnóstico

85

diferencial entre determinadas lesões vasculares, na presente pesquisa também se

avaliou a expressão imuno-histoquímica do HIF-1α, para análise da atividade

angiogênica das células endoteliais, uma vez que existem poucos estudos que estudam a

expressão dessa proteína em lesões vasculares. Assim, através dessa análise, buscou-se

investigar se a condição de hipóxia e a expressão deste marcador poderiam fornecer

informações adicionais para o entendimento dos mecanismos biológicos destas lesões,

visto que as mesmas apresentam, na maioria das vezes, grande analogia clínica e

histopatológica.

No que concerne a análise da expressão da proteína HIF-1α, evidenciou-se

estatisticamente na presente pesquisa maior frequência de marcação nas células

endoteliais nos casos de GP, quando comparado às outras lesões, em especial a MV,

fato este comprovado pelas medianas (Tabela 5) que revelaram diferença

estatisticamente significativa (p < 0,05) entre essas duas lesões.

De acordo com Ameri et al. (2010), as células tumorais circulantes em uma lesão

mostraram uma resposta a hipóxia alterada e um fenótipo agressivo mais forte. Isso

pode sugerir que nas lesões tumorais, as células estariam mais em condições de hipóxia,

estando concordante com nossos resultados onde foi observado diferença

estatisticamente significativa entre lesão tumoral (GP) e lesão não tumoral (MV).

Há muitas maneiras em que a ativação do HIF-1α poderia levar a mudanças no

comportamento de células tumorais (CHANG et al., 2006). Os mecanismos já

reconhecidos nesse processo de mudanças causados pelo HIF-1α estão relacionados à

sua capacidade de promover a angiogênese e um aumento do fluxo glicolítico (DANG

et al., 1997). Entretanto, a contribuição da ativação do HIF nos aspectos da biologia do

tumor, como o crescimento e evolução para um fenótipo mais agressivo é muito menos

compreendida do que o seu papel na promoção da angiogênese e glicólise (CHANG et

al., 2006). De acordo com Tang et al. (2004), a exclusão condicional de HIF-1α em

células endoteliais prejudicaria a angiogênese tumoral e está associado com uma

diminuição na densidade de vasos do tumor.

Além disso, somando-se aos aspectos descritos anteriormente, a maior expressão

do HIF-1α no GP, pode ser associada ao fato de que nessas lesões se encontrou uma

forte presença de um infiltrado inflamatório, corroborando o estudo de Albina et al.

(2001), onde investigaram a expressão do HIF-1α durante a inflamação aguda em

feridas experimentais e observaram que a extensão da indução do HIF-1α coincidiu com

a quantidade de células inflamatórias.

86

Neste tocante, Hannah et al. (1995) e Walmsley et al. (2005) verificaram que

sítios inflamatórios são caracterizados por baixos níveis de oxigênio. Esses autores

mostraram que HIF-1α prolonga a longevidade das células polimorfonucleares (PMN),

evitando sua apoptose nos sítios inflamatórios.

Em consonância com a assertiva anterior, Cramer et al. (2003) acreditam que

HIF-1α foi crucial para manter a produção de energia glicolítica e o recrutamento de

células inflamatórias.

King-Tung et al. (2011) encontraram uma maior expressão do HIF-1α em

doença periodontal do que em amostras de tecido gengival saudável, associando tal

achado ao infiltrado inflamatório.Esses resultados podem ser comparados ao nosso

estudo, onde o grupo de lesão que mais expressou essa protéina foi aqueles onde havia

notável infiltrado inflamatório (GP) (Tabela 5).

Com relação a expressão do HIF-1α nos casos de HEM, Kleinman et al. (2007)

realizaram um estudo com o intuito de investigar o processo de progressão e involução

do HEM, uma vez que esses processos são importantes no diagnóstico. Eles verificaram

que a expressão imuno-histoquímica do HIF-1α foi mais forte em HEM durante a fase

proliferativa, quando comparado ao HEM involuído, o qual mostrou uma marcação

fraca da célula endotelial. No nosso estudo, não diferenciamos os casos de HEM quanto

a seu comportamento, isto é, se eles estavam em processo de proliferação ou de

involução. Entretanto, em alguns casos, obsevamos uma discreta marcação do HIF-1α

nas células endoteliais, possivelmente esses casos se tratavam de HEMs em involução

(Figura 10).

Apesar da ausência de trabalhos de HIF-1α em MV, os resultados dessa presente

investigação revelaram que o padrão de expressão nessa lesão, conforme o valor da

mediana (53) (Tabela 5) foi a que obteve o menor valor. Esta expressão pode ser devida

o fato de que, conforme Buckmiller, Richter e Suen (2010), a MV não demonstra

proliferação de células endoteliais, isto é, elas não são mitoticamente ativas.

Quanto a localização celular, verificamos que a expressão do HIF-1α foi

predominantemente no núcleo/citoplasma, independente da lesão (Figura 10). Diante

disso, pode-se inferir que a expressão nuclear de tal molécula está alicerçada pelo fato

de que o ambiente hipóxico tumoral acarreta, na maioria das vezes, o translocamento do

HIF-1α para o núcleo formando um heterodímero com o ARNT (WENGER et al., 2002;

SEMENZA, 2003; SEMENZA, 2006; FERREIRA et al., 2007).

87

Diante do que foi exposto, constata-se que a semelhança entre HEM, MV e GP é

inquestionável. Os resultados encontrados nesta pesquisa, portanto, sustentam a

relevância da imuno-histoquímica da GLUT-1 e do HIF-1α nos estudos de lesões

vasculares.

Ressalta-se ainda que conhecer o comportamento clínico, histopatológico e

biológico das lesões vasculares é essencial para adoção das medidas terapêuticas mais

indicadas para cada caso, evitando que o paciente receba um diagnóstico falso e um

tratamento inadequado ao seu caso.

Portanto, esse estudo sugere que uma educação continuada é necessária para

promover o uso da nosologia apropriada para anomalias vasculares. Além disso,

acredita-se que os dados obtidos nesta pesquisa possam contribuir para a construção de

um conhecimento mais profundo sobre os tumores vasculares benignos de mucosa oral.

Todavia, é fundamental que outros estudos sejam desenvolvidos com objetivo de avaliar

se estes marcadores podem ser um parâmetro seguro a ser utilizado como ferramenta no

diagnóstico preciso dessas lesões.

88

CONCLUSÕES

89

7. CONCLUSÕES

Com base nos resultados morfológicos e imuno-histoquímicos desta pesquisa, pode-

se concluir que:

� O anticorpo anti-GLUT-1 mostrou-se eficaz na identificação dos casos de

hemangiomas verdadeiros.

� Boa efetividade do anticorpo anti-GLUT-1 na determinação do diagnóstico

diferencial entre hemangioma, granuloma piogênico e malformação

vascular.

� A expressão imuno-histquímica do anti-corpo anti-HIF-1α participa da

patogênese dos GPs, devido a influência do infiltrado inflamatório em seu

crescimento.

90

REFERÊNCIAS

91

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UNIVERSIDAD

CEN

DEPA

PROGRAMA DE

TERMO DE CONSENTIM

Este é um convite p

HISTOQUÍMICA DAS

VASCULARES BENIGNA

Lélia Maria Guedes Queir

quiser), o que significa qu

consentimento (sua permiss

Essa pesquisa procura ava

(lesões com sangue interior

mecanismos biológicos des

decida aceitar o convite,

nenhuma cirurgia. Os risco

outro tipo por participar des

da melhor maneira possível

durante biópsia (cirurgia

participação é muito import

caso exista alguma mudanç

seu tratamento na Faculdad

APÊNDICE 1

ADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NO

ENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA O

TIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

e para você participar da pesquisa “EXPRES

S PROTEÍNAS HIF-1α E GLUT-1

NAS EM MUCOSA ORAL", sob a orientaçã

eiroz. Sua participação é voluntária (você s

que você poderá desistir a qualquer momento

issão), sem que isso lhe traga nenhum prejuízo

valiar proteínas (substâncias) presentes em le

ior) benignas em mucosa oral com a finalidade

estas lesões (forma como a doença se comport

e, não irá passar por nenhum tratamento cl

cos de você sofrer danos físicos, psicológicos

dessa pesquisa serão mínimos e caso ocorram s

vel. Iremos utilizar o material que já foi remov

ia para retirada da lesão que você tinha

ortante, pois assim podemos conhecer mais sob

ança no seu diagnóstico, você será comunicad

ade de Odontologia da UFRN. Todas as inform

102

ORTE

A ORAL

ESSÃO IMUNO-

EM LESÕES

ação da Profª. Drª.

ê só participa, se

nto, retirando seu

ízo ou penalidade.

lesões vasculares

ade de entender os

ortará). Caso você

clínico nem fará

os ou de qualquer

m serão resolvidos

ovido da sua boca

a na boca). Sua

obre essas lesões e

ado e será feito o

ormações colhidas

103

da sua ficha ficarão guardadas em local seguro e seu nome não será identificado em

nenhum momento.

Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa, você será

ressarcido. Se você sofrer algum dano, decorrente desta pesquisa, terá direito a

indenização que será providenciada pelos pesquisadores.

Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a

respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para, Profª. Drª. Lélia Maria

Guedes Queiroz no Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço Av. Sen.

Salgado Filho, nº 1787, Lagoa Nova, Natal – RN, ou pelo telefone (84)3215-4138.

Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética

em Pesquisa da UFRN, localizado no Campus Universitário da UFRN, ou pelo telefone

(84)3215-3135.

Consentimento Livre e Esclarecido

Eu,

_______________________________________________________________ , declaro

que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e

benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa

“EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS HIF-1α E GLUT-1

EM LESÕES VASCULARES BENIGNAS EM MUCOSA ORAL"

__________________________________________________________

Assinatura do Participante

__________________________________________________________

Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz

Pesquisadora Responsável

Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787. Lagoa Nova, Natal/RN. CEP – 59056-000

Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN (Tel: 84-32153135)

104

APÊNDICE 2

Ficha para coleta de dados clínicos dos Hemangiomas e Granulomas Piogênicos Orais.

Nº do Caso Tipo Histológico Gênero Sexo Idade Localização Anatômica

105

APÊNDICE 3

Ficha de avaliação da expressão imuno-histoquímica do anticorpo anti-GLUT-1 nos

casos de Hemangiomas e Granulomas Piogênicos Orais.

Nº do Caso Marcação (+) Marcação (-)

106

APÊNDICE 4

Ficha de avaliação da expressão imuno-histoquímica do anticorpo anti-HIF-1α nos

casos de Hemangiomas, Malformações Vasculares e Granulomas Piogênicos Orais.

Nº de células por campo

1

2

3

4

5

Total

%

Nº do Caso

Positivas

Negativas

Nº do Caso

Positivas

Negativas

Nº do Caso

Positivas

Negativas

Nº do Caso

Positivas

Negativas

Nº do Caso

Positivas

Negativas

Nº do Caso

Positivas

Negativas

Nº do Caso

Positivas

Negativas

Nº do Caso

Positivas

Negativas

ANEXO A

107

108

109