UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO … · 2019. 1. 30. · A Pe Nunes, por...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA ALMINO AFONSO DE OLIVEIRA PAIVA Prospecção de polissacarídeos bioativos da alga Lobophora variegata e elucidação estrutural de uma de suas β-glucanas NATAL/RN 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
ALMINO AFONSO DE OLIVEIRA PAIVA
Prospecção de polissacarídeos bioativos da alga Lobophora
variegata e elucidação estrutural de uma de suas β-glucanas
NATAL/RN
2016
ALMINO AFONSO DE OLIVEIRA PAIVA
Prospecção de polissacarídeos bioativos da alga Lobophora
variegata e elucidação estrutural de uma de suas β-glucanas
NATAL
2016
Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre O. Rocha
DEDICATÓRIA
Ao meu orientador, Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, os meus
agradecimentos pela orientação, paciência, apoio,
conhecimentos e pela oportunidade de concluir este trabalho.
Obrigado, Professor!
À Professora Edda Lisboa Leite, meus agradecimentos por abrir
as portas das ciências bioquímicas, dos conhecimentos em
ensino-aprendizagem e pela oportunidade de iniciar este trabalho.
Obrigado, Professora!
Ás minhas filhas (Maria Clara e Maria Cecília), aos meus pais
(Jeiza Dias e Carlos Magno), aos meus irmãos (Magno Filho e
Juliana Cardinali), ao meu sobrinho (Rafael).
Aos meus avós; Maternos: José Michico (homen de fibra e sabiedade) e Eloísa (in memoriam, mãe e avó de amor e carinho incomparáveis); Paternos: Francisco Nascimento (in memoriam), homem sábio e preciso e, em especial, a Francisca das Chagas (in memoriam, mãe e avó de amor, afeto e consciência apreciáveis); À Iaponira Leite Dantas (Dôdô) (in memoriam, tia-avó de ensinamentos únicos). Aos meus pais, que herdaram as qualidades dos seus.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, pela família e pelo que sou!
Aos meus pais, Jeiza e Magno, ao meu irmão, Magno Filho, e à minha irmã, Juliana,
por todo apoio e base familiar.
Às minhas filhas Maria Clara e Maria Cecília. Vocês são minhas razões.
À Rayane Holanda, por todo apoio e paciência.
A Pe Nunes, por viabilizar o término do ensino médio no CAdE.
Ao primo Edino e à sua esposa Kasserine, pelo acolhimento e ensino.
A tio Sébio e à sua esposa Fátima, por todo incentivo dado.
À Monique, Vinícius, Pablo e Raniere, pela amizade, conversas e reuniões
filosóficas e cafés.
Aos demais amigos do BIOPOL: Jailma, Marília, Larisse, Rony, Dayanne, Mônica,
Ivan, Talita, Gabriel, Moacir, Maxsuell, Cinthia, Ruth, Rafael, Jessyka, Joanna,
Mariana, Carol, Leandro, Cynthia, Cauê, Lucas, Daniele, Maíra, Polyana, Raynara,
Samanta, Éder, Yara, Letícia, Maria Lara, Karoline, Alexandre, Paulo Victor, Letícia,
Verônica, Ana Karina e Luciana por dividirem momentos e contribuírem para o meu
crescimento profissional e humano.
Aos professores do departamento de Bioquímica, por todo o conhecimento e
direcionamento transmitidos.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica, Freire, Eliene, Rogério, Ricardo
Ana Katarina, seu Márcio (in memoriam), Dona Margarita, Samara, Ângela e Jonas.
Á professora Renata Mendonça e à Mayara pelas colaborações junto ao
departamento de Química.
Aos professores da banca de qualificação, Diego Sabri, Leonardo Capistrano e
Luciana Guimarães por toda colaboração.
Aos professores da banca de defesa.
À existência do Programa de Doutorado em Bioquímica da UFRN.
À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro.
Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização desse
trabalho.
À Jimmy Page e Robert Plant pela passagem: ...um novo dia irá nascer para àqueles que suportarem...
RESUMO
Macroalgas marinhas são importantes fontes de polissacarídeos neutros e negativos com importante potencial industrial e farmacológico. A macroalga marrom Lobophora variegata é conhecida por apresentar polissacarídeos sulfatados (heterofucanas) e neutros (laminarinas). Neste trabalho, mostra-se a obtenção de 6 frações polissacarídicas (F0.3; F0.5; F0.8; F1; F1.5 e F2). A partir dos dados de caracterização físico-química das frações, escolheu-se a F1 para purificação de seus componentes polissacarídicos. Análises de cromatografia líquida de exclusão molecular levaram a observação que F1 apresenta polissacarídicos de baixa (~ 5 kDa) até alta (> 100 kDa) massa molecular. Estes componentes foram separados de acordo com sua massa molecular, utilizando-se dispositivos de separação por tamanho molecular. Com isso, obteve-se subfrações polissacarídicas com tamanhos médios de 5, 20, 40, 75 e acima 100 kDa, denominadas de F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 e F1>100 kDa, respectivamente. Estas subfrações foram analisadas físico-químicamente por eletroforese em gel de agarose, cromatografia líquida de alta eficiência, assim como, por análises de suas propriedades antioxidantes, imunoestimulantes e citotóxicas/antiproliferativas. Como resultados, detectou-se um teor de açúcares totais acima de 55% em todas as subfrações, já proteínas e compostos fenólicos não foram observados. As frações F1-5, F1-20 e F1-40 apresentaram somente glucose (glucanas), já F1-75 e F1>100 apresentam glucose, galactose e fucose (heterofucanas). Todas as subfrações apresentaram atividade quelante de metais, mas somente F1-75 e F1>100 foram mais efetivas em sequestrar radicais. A produção/liberação de óxido nítrico (NO) por células RAW 264.7 ficou aumentada apenas na presença F1-5 (10 µM, p<0,05), F1-75 (10 µM, p<0,001) e, com destaque, F1>100 (10 µM, p<0,001) cuja presença aumentou em cerca de 12 vezes a quantidade de NO. Entretanto, quando estas células foram ativadas com LPS, somente F1-20 e F1>100 (10 µM) (p<0,001) proporcionaram produção/liberação de ON. As demais frações não interferiram na ação do LPS. Somente F1-5 e F1>100 estimularam a produção/liberação de citocinas. Somente F1>100 (10 µM) foi citotóxica para a linhagem 3T3 (fibroblastos) (p<0,01). Nenhuma das subfrações apresentaram efeito citotóxico para linhagem de células RAW 264.7 (macrófagos) ou para linhagem de células tumorais Hep-G2 (carcinoma hepático). Já com a linhagen de células 786-0 (adenocarcinoma renal) somente a glucana F1-40 não apresentou atividade citotóxica (p>0,05). Os maiores valores de citotoxidade foram obtidos com a subfração F1-20, no caso contra células B16F10 (melanoma). Dados de citometria de fluxo indicaram que esta subfração promove uma parada das células na fase G1 do ciclo celular (10 µM, p<0,01). Análises de ressonância magnética nuclear levaram a proposta de que F1-20 é uma β-glucana formada por β-(13) glucoses com ramificações, compostas por um resíduo de glicose, na posição 6. A proporção é de nove resíduos de glucose 13 ligados para cada ponto de ramificação. Os dados apontam F1-20, por ser antioxidante, imunomoduladora e citotóxico, como um composto pluripotente cujo potencial deva ser melhor investigado.
Palavras-chave: β-glucana, quelação de metais, imunomodulador, antiprolifevativo.
ABSTRACT Seaweeds are important sources of neutral and negative polysaccharides with important industrial and pharmacological potential. The brown macroalgae Lobophora variegata is known for presenting sulfated polysaccharides (heterofucans) and neutral (laminarins). In this work, it is shown getting 6 polysaccharide fractions (F0.3, F0.5, F0.8, F1, F1.5 and F2). From the data of physicochemical characterization of fractions, F1 was chosen for next purification steps. Liquid chromatography of molecular exclusion analysis showed that F1 contain polysaccharide from low (~ 5 kDa) to high (> 100 kDa) molecular weight. These components were separated according to their molecular weight using separation by molecular size devices. Thus, it was obtained subfractions with an average polysaccharide size of 5, 20, 40, 75 and above 100 kDa, named F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 and F1>100 kDa, respectively. These subfractions were analyzed physico-chemically by agarose gel electrophoresis, high-performance liquid chromatography, as by analysis of their antioxidant, immunomodulatory and cytotoxic/antiproliferative properties. As result, total sugar content in all subfractions was above 55%, since proteins and phenolic compounds were not observed. The fractions F1-5, F1-20 and F1-40 showed only glucose (glucans), as F1-75 and F1> 100 exhibit glucose, galactose and fucose (heterofucans). All subfractions showed chelating activity of metals, but only F1-75 and F1>100 were more effective as radical scavenger. The production/release of nitric oxide (NO) by RAW cells was increased only in the presence F1-5 (10 µM, p <0.05), F1-75 (10 µM, p<0.001) and, especially, F1>100 (10 µM, p <0.001) whose its presence increased about 12 times the amount of NO. However, when these cells were activated with LPS only F1-20 and F1>100 (10 µM) (p<0.001) yielded production/release of NO. The other fractions did not interfere in the LPS action. Only F1-5 and F1>100 stimulated the production/release of cytokines. Only F1>100 (10 µM) was cytotoxic to line 3T3 (fibroblast) (p<0.01). None of subfractions showed cytotoxicity effect to cell line RAW 264.7 (macrophages) or tumor cell line Hep-G2 (hepatocellular carcinoma). On the other hand, only F1-40 did not showed cytotoxic activity (p>0.05) against 786-0 renal carcinoma cells. The highest cytotoxicity values were obtained with the subfraction F1-20, in the case against B16F10 cells (melanoma). Flow cytometry data indicate that this subfraction stopped of cells in the G1 phase of the cell cycle (10 µM, p<0.01). Nuclear magnetic resonance analysis led to the proposal that F1-20 is a β-glucan formed by β-(13) glucosides with branches, comprising a glucose residue at position 6. The ratio is nine glucose residues 1,3 connected to each branching point. The data point F1-20, being an antioxidant, immunomodulating and cytotoxic as a compound pluripotent whose potential should be further investigated. Key-words: β-glucan, chelation of metals, immunomodulator, antiproliferative.
LISTA DE FIGURAS / ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Enzimas envolvidas no sistema antioxidante celular e as reações químicas relacionadas.........................................................................
28
Figura 2 Mecanismo de ação de compostos antioxidantes não enzimáticos. Sistema Tocoferol-Ascorbato-GSH .....................................................
29
Figura 3 Vias de sinalização envolvidas na ativação do receptor Dectina 1 (receptor de β-glucanas) ....................................................................
33
Figura 4 Vias de Ativação da apoptose ............................................................. 38
Figura 5 Alga marinha Lobophora variegata (J.V.Lamouroux) .......................... 47
Figura 6 Foto da lâmina de eletroforese em gel agarose e tampão PDA (1,3-diaminopropano acetato, pH 9,0), das amostras obtidas da alga L. variegata..............................................................................................
59 Figura 7 Perfil de eluíção dos polissacarídeos presentes na fração F1 após
cromatografia de exclusão molecular ..................................................
60 Figura 8 Foto da lâmina de eletroforese em gel agarose e tampão PDA (1,3-
diaminopropano acetato, pH 9,0), do material obtido em cada grupo (G1 – G9) (5µL a 10 mg/mL) cromatográfico.......................................
61 Figura 9 Foto da lâmina de eletroforese em gel agarose e tampão PDA (1,3-
diaminopropano acetato, pH 9,0), das subfrações de F1 (5µL a 10 mg/mL) obtidas com os dispositivos de separação por tamanho molecular.............................................................................................
61
Figura 10 Resultados em percentual da redução de MTT por células 3T3 tratadas com glucanas ou heterofucanas ..........................................
68
Figura 11 Resultados em percentual da redução de MTT por células RAW tratadas com glucanas ou heterofucanas .........................................
69
Figura 12 Quantidade NO encontrado no meio de cultivo de células RAW tradadas com os polissacárideos na presença ou ausência de LPS ...
70
Figura 13 Resultados em percentual da redução de MTT por células de linhagens tumorais HEPG2 (A), 786-0 (B) e B16F10 (C) quando tratadas com as glucanas e heterofucanas .........................................
73 Figura 14 Atividade anticoagulante induzida por glucanas ou heterofucanas em
teste de TTPa .....................................................................................
74 Figura 15 Avaliação do efeito de tratamento com F1-20 (10 mM) sobre linhagem
celular B16F10 (melanoma) marcadas com Anexina-V-FITC e PI .......
77 Figura 16 Avaliação da distribuição das células nas fases do ciclo celular da
linhagem B16F10 (melanoma) tratadas com F1-20 (10 mM) ............ 77
Figura 17 Espectro de infravermelho com Transformada de Fourier da glucana F1-20 ...................................................................................................
79
Figura 18 Espectro unidimensional de RMN de 1H de F1-20 ............................... 80
Figura 19 Espectro unidimensional de RMN de 13C de F1-20 ............................. 82
Figura 20 Espectro de COSY de F1-20 ............................................................... 83
Figura 21 Espectro de RNM bidimensional 13C -1H com técnica de correlação heteronuclear (HSQC) de F1-20 .......................................................
84
Figura 22 Elucidação da estrutura molecular da β-glucanas (13)(16) F1-20 99
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Atividades farmacológicas apresentadas por compostos extraídos da
alga L. variegata ..................................................................................
21
Tabela 2 Origem, estrutura e atividades biológicas de β-glucanas..................... 24
Tabela 3 Compartimentos e reações de formação de radicais livres endógenos 26
Tabela 4 Reações não enzimáticas de formação de radicais livres endógenos 26
Tabela 5 Rendimento de extração e composição das frações polissacarídicas obtidas com a etapa de precipitação diferencial com acetona ............
58
Tabela 6 Rendimento e composição das frações polissacarídicas obtidas do
processo de separação com ultracentrifugação ..................................
62
Tabela 7 Percentual de sequestro de radicais determinado para as amostras .. 64
Tabela 8 Valores percentuais de quelação de cobre e de quelação de ferro determinados na presença dos polissacarídeos da alga L. variegata
66
Tabela 9 Quantidade de citocinas do meio de células RAW cultivadas na presença de glucanas ou heterofucanas ............................................
71
Tabela 10 Análise comparativa das atividades de glucanas e heterofucanas 75
Tabela 11 Sistemas de spins obtidos das análises de COSY e HSQC de F1-20 85
Tabela 12 Números de onda.cm-1 característicos de grupos funcionais............... 97
Tabela 13 Sistemas de spins de F1-20 e de outras β-glucanas ........................... 98
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTS
APAF1
AP-1
BAX
BCL2
BCL10
BIOPOL
B16F10
CARD-9
2,2´azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico
Fator de ativação de protease associada a apoptose 1
Fator ativador de proteína 1
Proteína reguladora de apoptose
Proteína 2 de linfoma de células B
Proteína 10 de linfoma de células B
Laboratório de biotecnologia de polímeros naturais
Linhagem celular de melanoma murino
Domínio de recrutamento de caspase
CAT
CDK
Catalase
Enzima kinase dependente de ciclina
CETAVLON
CKIs
COSY
CRB
CR3
cNOS
RLCs
Brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamônio
Inibidoras de ciclinas kinase
Espectroscopia de correlação homonuclear
Domínio de reconhecimento de carboidrato
Receptor 3 do complemento
Óxido nítrico sintase constitutiva
Receptores da família lectina tipo C
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DNA Ácido desoxiribonucléico
EAA Equivalente de ácido ascórbico
EDTA
FADD
FAO
FCDP
Ácido etilenodiamino tetra-acético
Domínio de morte com proteína associada a Fas
Food and Agriculture Organization of the United Nations
Fator de crescimento derivado de plaquetas
FCT-β1
FCEV- α
Fator de crescimento transformador β1
Fator de crescimento endotelial vascular α
FDA Food and Drugs Administration
FITC Isotiocianato de fluoresceína
GAL Galactose
GLU Glicose
GPx Glutationa peroxidase
GSH Glutationa reduzida
GSSG
H2O2
Glutationa oxidada
Peróxido de hidrogênio
HCl
HEPG2
Ácido clorídrico
Linhagem celular de carcinoma hepático murino
HPLC
HSQC
Cromatografia líquida de alta eficiência
Espectrocopia de correlação heteronuclear de quantum simples
ICAM1
IFNγ
IκB
Molécula de adesão intercelular 1
Interferon γ
Inibidor kappa B
IL-1β Interleucina 1β
IL-10 Interleucina10
IL-6
IL-17β
iNOS
ITAM
Interleucina 6
Interleucina 17β
Óxido nítrico sintase induzível
Immunoreceptor tyrosine-based activation motif
IV
LacCer
Infravermelho
Receptor lactosilceramida
LPS
MALT1
Lipopolissacarídeo
Proteína 1 de linfoma de tecido linfoide associado a mucosa
MAPK
MPAPs
MRB
Proteína kinase ativada por mitógeno
Moléculas padrão associadas a patógenos
Modificadores da resposta biológica
MTT Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
N.D Não detectado
NADP+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada
NADPH
NRLP3
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
Domínio ligante de nucleotídeos com repetições ricas em leucina
e contendo domínio pyrin
NBT
NK
NFAT
NFκB
NOS
O2-.
OH.
NO
ONOO.
Nitroblue tetrazolium
Natural Killer
Fator nuclear ativador de células T
Fator de nuclear kappa B
Óxido nítrico sintase
Radical superóxido
Radical hidroxila
Molécula de Óxido Nítrico
Peróxinitrito
PBS
PCK
Tampão salino-fosfato
Proteína kinase C
PDA
PiK3
PLCγ2
RAW 264.7
RMN
RNAm
1,3-Diaminopropano acetato
Fosfatidilinusitol 3 kinase
Fosfolipase tipo C γ2
Linhagem celular de macrófagos murinos
Ressonância Magnética Nuclear
Ácido ribonucleico mensageiro
RNS Espécies reativas de Nitrogênio
ROS
RRPs
rTNF
Espécies reativas de Oxigênio
Receptores de reconhecimento padrão
Receptores de fator de necrose tumoral
SFB
SRs
Soro fetal bovino
Receptores scavenger
SOD Superóxido desmutase
TCA Ácido tricloroacético
TNF-α
TLRs
Fator de necrose tumoral α
Receptores Toll-like
TTPa
3T3
Tempo de tromboplastina parcial ativada
Linhagem celular de fibroblastos murinos
VCAM1
SyK
mL
Molécula de adesão celular 1
Tirosina kinase esplênica
Mililitro
µL
786-0
δ
Microlitro
Linhagem celular de carcinoma renal murinos
Deslocamento químico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 16 1.1 MACROALGAS MARINHAS: BREVES COMENTÁRIOS SOBRE SUA
BIOLOGIA E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS.................................
16 1.2 POLISSACARÍDEOS DE ALGAS COM POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO.................................................................................
18 1.3 ALGAS MARRONS.................................................................................. 19 1.3.1 Alga Marrom L. variegata......................................................................... 20 1.3.2 Laminarinas (β-Glucanas de Algas).......................................................... 22 1.4 β-GLUCANAS DE OUTRAS FONTES..................................................... 23 1.4.1 Origem, Estrutura e Atividades Biológicas............................................... 23 1.4.2 Atividades Farmacológicas de β-Glucanas.............................................. 25 1.4.2.1 Atividade antioxidante.............................................................................. 25 1.4.2.1.1 Espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) ............... 25 1.4.2.1.2 β-Glucanas antioxidantes......................................................................... 30 1.4.2.2 Atividade imunomoduladora..................................................................... 31 1.4.2.2.1 Características das respostas imunológicas inata e adquirida................. 31 1.4.2.2.2 β-Glucanas imunomoduladoras................................................................ 34 1.4.2.3 Atividade antiproliferativa/antitumoral....................................................... 35 1.4.2.3.1 O ciclo celular e a morte celular programada (apoptose) ......................... 35 1.4.2.3.2 β-Glucanas antiproliferativas/antitumorais............................................... 38
1.5 OBJETIVOS............................................................................................. 42 1.5.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 42 1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................... 42 2 MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................... 43 2.1 MATERIAIS……………………………………............................................ 43 2.1.1 Reagentes e Aparelhos……………………………………………………… 43 2.1.2 Linhagens Celulares……………………..…………………………………... 45 2.2 MÉTODOS............................................................................................... 47 2.2.1 Obtenção da Macroalga Marinha............................................................. 47 2.2.2 Extração de Polissacarídeos.................................................................... 48 2.2.3 Eletroforese em Gel de Agarose ............................................................. 48 2.2.4 Composição Química............................................................................... 49 2.2.4.1 Determinação de açúcares totais............................................................. 49 2.2.4.2 Determinação de proteínas...................................................................... 49 2.2.4.3 Determinação de sulfato........................................................................... 49 2.2.4.4 Determinação de compostos fenólicos..................................................... 49 2.2.4.5 Determinação de ácidos urônicos............................................................ 49 2.2.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .................................... 50 2.2.6 Cromatografia de Exclusão Molecular em FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography) ......................................................................................
50 2.2.7 Dispositivo de Separação por Tamanho Molecular (Amicon® Ultra-15
centrifugal filter) ........................................................................................
51 2.2.8 Ensaios de Atividade Antioxidante. ........................................................... 51 2.2.8.1 Ensaio de sequestro de radicais ABTS+.................................................... 51 2.2.8.2 Ensaio de sequestro de radicais superóxido............................................. 52 2.2.8.3 Ensaio de sequestro de radicais hidroxila................................................. 52 2.2.8.4 Ensaio de quelação de ferro..................................................................... 52 2.2.8.5 Ensaio de quelação de cobre.................................................................... 53
2.2.9 Ensaio de Atividade Anticoagulante........................................................ 53 2.2.10 Ensaio para Determinação da Viabilidade de Linhagens de Células pelo
Ensaio de Redução do MTT.....................................................................
53 2.2.11 Ensaios para Determinação de Atividade Imunomoduladora................... 54 2.2.11.1 Ensaio para determinação de óxido nítrico (ON) em meio de cultura de
células RAW 264.7 ..................................................................................
54 2.2.11.2 Ensaio para determinação de citocinas em meio de cultura de células
RAW 264.7 ................................................................................................
55 2.2.12. Ensaios para Avaliação do Processo de Apoptose por Citometria de Fluxo 55 2.2.13. Ensaio para Avaliação de Ciclo Celular.................................................... 56 2.2.14. Análises Espectroscópicas....................................................................... 56 2.2.14.1 Espectroscopia de infravermelho............................................................. 56 2.2.14.2 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear – RMN..................... 57 2.2.15 Análises Estatísticas................................................................................. 57 3. RESULTADOS......................................................................................... 58 3.1 EXTRAÇÃO, FRACIONAMENTO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA............... 58 3.2 PURIFICAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA FRAÇÃO F1 GUIADA
POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE.....................................
59 3.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS GLUCANAS (F1-5,
F1-20 E F1-40) E DAS HETEROFUCANAS (F1-75 E F1>100) OBTIDAS DA ALGA L. variegata.............................................................
62
3.3.1 Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Atividade de Sequestro de Radicais ABTS+, Superóxido e Hidroxila..............................................
63
3.3.2 Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Atividade Quelante de Metais (cobre e ferro) ..............................................................................
64
3.4 AVALIAÇÃO DO EFEITO DE POLISSACARÍDEOS SOBRE A CAPACIDADE REDUTORA DE MTT EM CÉLULAS DE LINHAGENS NORMAIS...................................................................................................
67 3.4.1 Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Capacidade Redutora de
MTT de Fibroblastos 3T3...........................................................................
67 3.4.2 Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Capacidade Redutora de
MTT de Macrófagos RAW 246.7................................................................
68 3.5 AVALIAÇÂO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DOS
POLISSACARÍDEOS SOBRE CÉLULAS RAW......................................
69 3.5.1 Determinação da Quantidade de Óxido Nítrico Presentes no Meio de
Cultivo de Células RAW na Presença dos Polissacarídeos.....................
69 3.5.2 Determinação da Quantidade de Citocinas Presentes no Meio de Cultivo
de Células RAW na Presença dos Polissacarídeos...................................
71 3.6 AVALIAÇÃO DO EFEITO DOS POLISSACARÍDEOS SOBRE A
CAPACIDADE REDUTORA DE MTT DE CÉLULAS DE LINHAGENS TUMORAIS..............................................................................................
72 3.7 AVALIAÇÃO DO EFEITO DAS GLUCANAS E HETEROFUCANAS
SOBRE COAGULAÇÃO DO PLASMA HUMANO.......................................
73 3.8 RANQUEAMENTO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS..................... 74 3.9 AVALIAÇÃO DO EFEITO DE F1-20 NO PERCENTUAL DE MARCAÇÃO
DAS CÉLULAS B16F10 POR ANEXINA E IODETO DE PROPÍDEO (PI).
76 3.10 AVALIAÇÃO DO EFEITO DA PRESENÇA DA GLUCANA SOBRE O
CICLO CELULAR DAS CÉLULAS DE MELANOMA B16F10.................... 77
3.11 ANÁLISES ESPECTROSCÓPICAS........................................................... 78 3.11.1 Espectroscopia de Infravermelho…………………………………………….. 78
3.11.2 Análises de Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). 79 3.11.2.1 Análises dos espectros de RMN de 1H e 13C unidimensionais de F1-20.. 79 3.11.2.2 Espectroscopias de RMN bidimensionais................................................. 82 3.11.2.2.1 Analises dos espectros de correlação homonuclear de 1H-1H (COSY).... 82 3.11.2.2.2 Análises dos espectros de correlação bidimensional de 13C e 1H (HSQC). 83 4 DISCUSSÃO............................................................................................. 86 5 CONCLUSÕES........................................................................................... 101 REFERÊNCIAS......................................................................................... 102
16
1. INTRODUÇÃO
1.1 MACROALGAS MARINHAS: BREVES COMENTÁRIOS SOBRE SUA BIOLOGIA
E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
As algas são organismos reconhecidos por habilidades ímpares, não somente
devido serem a base da cadeia alimentar marinha e responsáveis por produzir boa
parte do oxigênio da atmosfera, mas por suas propriedades nas mais diferentes áreas
biotecnológicas, fazendo destes seres organismos intensamente pesquisados.
Podem ser divididas em dois grupos; as microalgas e as macroalgas (CHEN et al.,
2009). As microalgas compreendem organismos unicelulares fotossintetizantes,
apresentando diferenças morfológicas entre os diversos representantes, sendo
encontradas no solo, água doce e no meio marinho (CHISTI, 2004). Já as macroalgas
são pluricelulares, apresentando um talo, sem a existência de raízes, caule ou folha,
algumas apresentam vários metros de comprimento e são fixas no solo marinho,
principalmente em rochas.
Classicamente as macroalgas são agrupadas de acordo com seus pigmentos
constituintes e assim são classificadas como verdes (possuem as clorofilas “a” e “b”
como principais pigmentos), vermelhas (possuem as clorofilas “a” e “d” e como
principal pigmento, a fucoeritrina) e marrons (possuindo clorofilas “a” e “c”,
apresentam como principal pigmento, que confere a cor característica ao grupo de
algas, o carotenóide fucoxantina) (O ́SULLIVAN et al., 2010).
Na classificação taxonômica mais atual, os eucariotos estão divididos em cinco
grupos principais: Opisthokonta, Amoebozoa, Excavata, Archaeplastida e SAR (ADL
et al., 2012). Nesta divisão as macroalgas verdes e vermelhas estão classificadas no
grupo Archaeplastida, já as marrons aparecem no grupo SAR, filo Stramenopiles,
mostrando-se mais distantes das plantas do que as verdes e vermelhas. Cada grupo
de alga apresenta diferenciados tipos de polissacarídeos mais representativos.
As macroalgas apresentam como vantagens: o rápido crescimento, produção de
grande volume de biomassa e características inerentes a seus componentes que,
como os polissacarídeos (presentes em expressiva quantidade) (PERCIVAL;
McDOWELL, 1967), apresentam diversas propriedades físico-químicas e biológicas.
As macroalgas têm se destacado nas indústrias dos setores alimentício
(MAMATHA et al., 2007; PIRES et al., 2008), ambiental (REIS et al., 2011), do
agronegócio (BLUNDEN, 1991; KHAN et al., 2009) e farmacêutico (LIMA et al., 2004;
17
KADAM et al., 2015). Estima-se que mais de duzentas espécies de algas são
utilizadas em atividade humanas. Os 10 gêneros mais cultivados e explorados são: as
algas vermelhas dos gêneros Porphyra, Kappaphycus, Eucheuma e Gracilaria; as
marrons dos gêneros Saccharina, Undaria e Sargassum; e as verdes dos gêneros
Monostroma, Ulva e Caulerpa (BAST, 2014). Para se ter uma ideia da importância das
algas nas atividades humanas, a produção anual de algas em 2001 foi de 9,7 milhões
de toneladas, dez anos depois este valor chegou a 21 milhões de toneladas, o que
nesse ano equivaleu a um comércio de aproximadamente de 5,5 bilhões de dólares
(FAO, 2013). Boa parte desse comércio corresponde a subprodutos das algas, dentre
eles, polissacarídeos como alginatos e carragenanas (JIN et al., 2016).
Dentre as características que colocam as macroalgas como fontes promissoras na
indústria alimentícia, destacam-se propriedades espessantes, estabilizantes de
misturas e como fonte de fibras, vitaminas, minerais, proteínas, compostos fenólicos,
carotenóides, lipídeos, polissacarídeos e outros nutrientes (GLICKSMAN, 1983;
THENNARASAN; MURUGESAN, 2015; PIRES et al., 2008). Já no setor de
agronegócio, além de fertilizantes podem ser usadas para indução do crescimento e
de resistência em plantas a doenças e atividade antimicrobiana direta (DAPPER et al.,
2014). Já, como fontes de agentes farmacêuticos, são descritos na literatura diversas
atividades farmacológicas inerentes a componentes extraídos de algas marinhas,
dentre elas: atividade antioxidante (SOUZA et al., 2007), anticoagulante (ROCHA et
al., 2005; CAMARA et al., 2011), antiinflamatória (PAIVA et al., 2011), antiviral
(KREMB et al., 2014), antiparazitária (CANTILLO-CIAU et al., 2010) e antiproliferativa
(COSTA et al., 2010)
Além de serem responsáveis primárias pela biomassa marinha (HOLDT; KRAAN,
2011), as algas são fonte de compostos benéficos para a saúde (SOUZA et al., 2008)
e, para este fim, polissacarídeos têm se destacado devido a características intrínsecas
a suas estruturas, e assim, vêm sendo utilizados em diversas áreas do setor industrial
(DAPPER et al., 2014).
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1.2. POLISSACARÍDEOS DE ALGAS COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
As algas marinhas são fonte de vários tipos de polissacarídeos que
desempenham diversas funções nesses organismos, como: estrutural, proteção
contra as radiações (PATCHEN et. al., 1987), proteção contra desidratação (MICHEL
et al., 2010), reserva energética, regulação mecânica e iônica (KLOAREG;
QUATRANO, 1988). Estas funções estão relacionadas a características como
tamanho e composição desses biopolímeros. Estas características foram referidas por
serem influenciadas por alguns fatores, como: fases de desenvolvimento celular,
espécie, profundidade de imersão, habitat e sazonalidade (ZVYAGINTSEVA et al.,
2003).
As algas verdes apresentam predominantemente dois tipos de polissacarídeos
sulfatados: o primeiro é classificado como xilogalactoarabinana (os resíduos de
arabinose [do esqueleto central] e galactose são sulfatados) e o segundo tipo é
classificado como glucuronoxiloramnana (com sulfatações no resíduo de ramnose)
(FERNÁNDEZ et al., 2013; COSTA et al., 2012). É de se destacar que
homogalactanas sulfatadas também foram extraídas de algas verdes (FARIAS et al.,
2008). Esse grupo de algas apresentam o amido como carboidrato de reserva e
celulose na parede celular (JIN et al., 2016).
As algas vermelhas apresentam predominantemente polissacarídeos com
estrutura linear formada por duas unidades básicas de repetição (A e B), dentre esses
polissacarídeos destacam-se as carragenanas (unidade A formada por β-D-galactose
13 ligada a unidade B, uma α-D-galactose ligadas nas posições 14 [esta unidade,
em alguns polímeros, pode ser substituída por 3,6-anidro-galactose]), e as agaranas
(diferindo das carragenanas por possuírem a unidade B formada por α-L-galactose).
Xilogalactanas sulfatadas também foram extraídas desse grupo de algas (ALVES et
al., 2015). As algas vermelhas apresentam o polissacarídeo denominado de “amido
das florídeas” como polímero de reserva, também apresentando celulose na parede
celular. (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2007).
As algas marrons apresentam predominantemente como constituíntes os
polissacarídeos: alginatos (polissacarídeos lineares formados por unidade M [ácido
manurônico] e G [ácido gulurônico] unidas de formas variadas) (PAINTER, 1983; JIN
et al., 2016) e fucanas (polissacarídeos que apresentam o monossacarídeo L-fucose
na sua constituição [podem ser homo ou heterofucanas], obrigatoriamente parte
dessas fucoses devem ter grupos sulfato ligados covalentemente a sua estrutura
19
[ROCHA et al., 2006]), e como carboidrato de reserva destacam-se as laminarinas
(homopolissacarídeos de glucose unidos por ligações β-1,3, onde as ramificações
ocorrem na posição 6 e esses substituintes são unidos a estrutura central por ligações
do tipo β-1,6 e baixa massa molecular (aproximadamente 5 kDa) e a celulose na
parede celular (KADAN et al., 2014; AYOUB et al., 2015).
A quantidade de espécies e de biomassa que as macroalgas marrons
representam, assim como seus diferentes polissacarídeos, tornam esses organismos
foco de pesquisas e análises quanto a diversas propriedades em áreas da indústria
farmacêutica, cosmética, alimentícia e agrícola, sendo utilizadas em grande
quantidade neste último setor (DAPPER et al., 2014).
1.3. ALGAS MARRONS
Alguns autores afirmam que as algas marrons estão presentes principalmente
em áreas temperadas (Wells et al., 2007). No entanto, encontra-se textos que afirmam
que elas são abundantes em mares tropicais e subtropicais (PAULA; OLIVEIRA
FILHO, 1980; REIS et al., 2011). Estes dados foram corroborados por Thennarasan e
Murugesan (2015), que afirmaram que as algas marrons são encontradas em maior
quantidade que as algas verdes e vermelhas em países tropicais. Pereira e
colaboradores (2002) afirmaram que as algas marrons representam cerca de 50% da
biomassa de macroalgas do nordeste brasileiro.
As algas marrons apresentam paredes celulares formadas por uma matriz
mucilaginosa composta por celulose, ácidos algínicos e polissacarídeos sulfatado
(fucanas), proporcionando-as equilíbrio e flexibilidade. Apresentam pigmentos como
as clorofilas a e c e vários tipos de carotenóides, como a fucoxantina que confere a
cor característica desse grupo de algas. O material de reserva é a laminarina e o
manitol, presentes em vacúolos no citoplasma (SILVA, 2010).
Os principais carboidratos extraídos de algas marrons são os alginatos, porém,
estas algas sintetizam também as fucanas e laminarinas (CHATER et al., 2015). As
fucanas são os polissacarídeos com mais pesquisas referentes a atividades
farmacológicas. Estes polímeros são referidos como agentes antivirais (PONCE et al.,
2003; QUEIROZ et al., 2008), imunomoduladores (YIN et al., 2014), anticoagulantes,
antiinflamatórios, antiangiogênicos, antitumorais (ROCHA et al., 2005). Já as
laminarinas, por mais que não sejam intensamente pesquisadas, também são
conhecidas como agentes biologicamente ativos que apresentam propriedades
20
farmacológicas, como a imunomodulação (MENSHOVA et al., 2014; JI, JI; MEM,
2013). Contudo, não são todas as algas marrons que sintetizam laminarinas em
grande quantidade. Uma alga que produz grandes quantidades desses polímeros é a
Lobophora variegata.
1.3.1. Alga Marrom L. variegagta
L. variegata é uma alga amplamente distribuída pelo mundo, encontrada em
regiões do Caribe, Oceano Índico, Mar Vermelho (KREMB et al., 2014), Austrália,
Mediterrâneo, e litoral brasileiro (MEDEIROS et al., 2008). Essa alga pode crescer a
profundidades de até 25 metros (STEVENINCK; BREEMAN, 1987) e é encontrada
principalmente em ambientes tropicais (TAYLOR 1960; WOMERSLEY 1967). A L.
variegata apresenta elevada habilidade de adaptação e importância ecológica quando
analisada como indicadora de contaminação ambiental e de herbivorismo. Neste
sentido, essa alga apresenta características que a tornam importante como organismo
produtor de diversos compostos além de ser elementar na biota marinha para várias
espécies de peixes e crustáceos (COEN; TANNER, 1989).
Vários estudos demonstram o potencial uso de L. variegata como organismo
de alto valor ecológico, nutricional e farmacológico. Arnold, Tanner e Hatch (1995)
relataram que a alga L. variegata pode servir como indicadora de contaminação
ambiental ao analisarem a concentração endógena de polifenóis da alga quando
submetida a diferentes concentrações de nitrogênio no meio de cultivo. Já, referindo-
se ao poder nutricional, o grupo de Alencar e colaboradores (2011) afirmaram que a
quantidade de aminas biogênicas (Histamina e Tiramina) presentes nesta alga não é
capaz de provocar intoxicações alimentares.
A alga L. variegata tem sido elencada como organismo produtor de várias
moléculas bioativas (Tabela 1) que vêm apresentando propriedades farmacológicas
como: antiparasitária (ZULEMA; CANTILLO-CIAU et al., 2010), antifúngica
(KUBANEK et al., 2003), imunoestimulante (RODRIGUES et al., 2009), inibidoras da
replicação do vírus HIV 1 (KREMB et al., 2014), antioxidantes (ZUBIA; ROBLEDO;
FREILE-PELEGRIN, 2007), antiinflamatória (MEDEIROS et al., 2008; CARDOSO et
al., 2010), anticoagulante e antiangiogênica (CASTRO et al., 2015).
21
Tabela 1 – Atividades farmacológicas apresentadas por compostos extraídos da alga L. variegata
1, Kremb, et al., 2014; 2, Cantillo-Ciau et al., 2010; 3, Kubanek et al., 2003; 4, Almeida 2014; 5, Batista
et al., 2007; 6, Arnold, Tanner e Hatch, 1995; 7, Zubia, Robledo, Freile-Pelegrin, 2007; 8, Alencar et al.,
2011; 9, Medeiros et al., 2008; 10, Cardoso et al., 2010; 11, Paiva et al., 2011; 12, Castro et al., 2014;
13, Castro et al., 2015; 14, Rodrigues et al., 2009.
Fonte: Autoria própria
Dentre as atividades farmacológicas proporcionadas por compostos obtidos da
alga L. variegata destacam-se as atividades conferidas pelos polissacarídeos
sulfatados, apresentando ações imunoestimulantes (em alevinos de peixes Tilápias)
(RODRIGUES et al., 2009), antioxidante (em modelos de sequestro de radicais livres
(PAIVA et al., 2011), antiinflamatórias (em modelos inflamatórios com ratos Wistar e
camundongos Swiss Webster) (MEDEIROS et al., 2008; CARDOSO et al., 2010;
CASTRO et al., 2014), antiproliferativa (em modelo de redução de MTT em células
tumorais de carcinoma hepático humano da linhagem HepG2) e antiangiogênica (em
ensaio de inibição de angiogênese em membrana corioalantóide de ovos de galinha)
(CASTRO et al., 2015). Porém, as laminarinas dessa alga não foram avaliadas quanto
às suas estruturas, atividades biológicas e potencialidades biotecnológicas.
22
1.3.2. Laminarinas (β-glucanas de Algas)
São homopolissacarídeos ramificados (homoglucanas) com massa molecular
de aproximadamente 5 kDa, o que corresponde um grau de polimerização que varia
de 25 a 30 resíduos (RIOUX et al., 2007; PAINTER, 1983; FRECER et al.,2000). A
estrutura central das laminarinas é composta por resíduos de glicose unidos por
ligações do tipo β-(1→3). Os pontos de ramificações ocorrem sempre na posição 6
das glicoses (ZVYAGINTSEVA et al., 1999). O espaçamento entre essas
ramificações, assim como, o tamanho das cadeias laterais são os elementos
estruturais que dão a identidade de cada laminarina (CHIZHOV et al., 1998).
Originam-se como resultado da fotossíntese das algas e são encontradas
principalmente nas frondes (YIN et al., 2014). São produzidos sazonalmente por esses
organismos, podendo representar até aproximadamente 35% de peso seco das
frondes em períodos frios como outono e inverno (HANDA; NISIZAWA, 1961; YIN et
al., 2014).
As estruturas das laminarinas variam de acordo com as espécies de algas e
existem dois tipos de laminarinas: as que apresentam o manitol como elemento
redutor no final da cadeia, sendo chamadas de laminarinas de cadeia M e as que
apresentam a glicose no final da cadeia, chamadas de laminarinas de cadeia G
(CHIZHOV et al., 1998). Assim sendo, diferentes amostras desses polissacarídeos
podem demonstrar grande variabilidade estrutural (NELSON; LEWIS, 1974). Esta
variabilidade estrutural pode influenciar em propriedades desses polímeros, por
exemplo: a solubilidade (RIOUX et al., 2007). Pois, laminarinas com alto grau de
ramificação são solúveis em água fria e as laminarinas com baixo grau de ramificações
solubilizam-se somente em água quente (RUPÉREZ; AHRAZEM; LEAL, 2002).
As laminarinas destacam-se devido a promissoras funções nutricional
(AHMED, 2014; CHATER et al., 2015; JI, JI; MEN, 2013), agroindustrial
(KLARZYNSKI et al., 2000; JAULNEAU et al., 2010) e farmacêutica (MENSHOVA et
al., 2014; JI; JI, 2014; YIN et al., 2014; MORONEY et al., 2015).
As laminarinas da macroalga L. variegata foram relatadas por Medeiros e
colaboradores (2008), mas não foram analisadas quanto a propriedades
biotecnológicas, tornando-as alvo do presente trabalho. Ademais, laminarinas
23
apresentam estruturas e atividades semelhantes a outras β-glucanas encontradas em
diferentes organismos, como descrito a seguir.
1.4. β-GLUCANAS DE OUTRAS FONTES
1.4.1. Origem, Estrutura e Atividades Biológicas
Obtidas de diferentes fontes e isoladas através de técnicas e solventes
distintos, as β-glucanas demonstram ações promissoras devido suas propriedades
biotecnológicas. São polissacarídeos de ocorrência natural (ubíquos) encontrados na
parede de células de grãos (como aveia e cevada) (LAZARIDOU et al., 2011; ARENA
et al., 2014), bactérias (NOTARARIGO et al., 2014), fungos (BI et al., 2013;
SYNYTSYA et al., 2009; RIEDER et al., 2013), líquens (TOSH et al., 2004) e algas
marinhas (BOBADILLA et al., 2013; KADAM et al., 2015; MENSHOVA et al., 2014).
A utilização de métodos distintos de obtenção de β-glucanas associado a
variabilidade de origem proporciona grande heterogeneidade de lotes. A atividade
biológica desses polímeros tem sido elevada com o emprego de metodologias
modificadoras de suas estruturas, como modulação estrutural fina apenas na redução
de resíduos, as quais podem ser acompanhadas por diversas técnicas de análise
estrutural (VETVICKA et al., 2011).
As β-glucanas podem apresentar diferenças estruturais quanto ao tipo de
posição das ligações (12, 13, 14 e/ou 16), distribuição das ligações ao longo
da cadeia, tipo de cadeia (linear ou ramificada), presença de outros açúcares (sendo
divididos em homoglucanas ou heteroglucanas), tamanho da cadeia e a conformação
que adquirem quando em solução (SYNYTSYA; NOVÁK, 2013; PELOSI; BULONE;
HEUX, 2006).
A Tabela 2, a seguir, apresenta β-glucanas de diferentes origens obtidas por
métodos variados e que apresentam atividades em diversos ensaios.
24
Tabela 2 - Origem, estrutura e atividades biológicas de β-glucanas
1, Lazaridou et al., 2011; 2, Arena et al., 2014; 3, Sadovskaya et al., 2014; 4, Tosh et al., 2004; 5, Bi et al., 2013; 6, Synytsya et al., 2009; 7, Rieder et al., 2013; 8, Pacheco-Sanchez et al., 2006; 9, Giese et al., 2015; 10, Fang et al., 2012; 11, Notararigo et al., 2014; 12, Bobadilla et al., 2013; 13, Kadam et al., 2015; 14, Menshova et al., 2014. Fonte: Autoria própria
Atividades de indução de adesão e consequente sobrevivência de bactérias
entéricas em ensaio de ação probiótica (ARENA et al., 2014) ou atividade prebiótica,
por serem fermentadas por bactérias intestinais (SYNYTSYA et al., 2009) também
estão relacionadas a algumas das ações proporcionadas por β-glucanas. A atividade
imunoestimulante por indução da liberação de citocinas em células endoteliais de
aorta humana (HAEC) (LAZARIDOU et al., 2011), aumento da proliferação de
linfócitos (BI et al., 2013; BOBADILLA et al., 2013), atividade antiinflamatória,
antinociceptiva (RIEDER et al., 2013) ou estimulação de macrófagos (NOTARARIGO
et al., 2014) são ações relacionadas diretamente a estruturas de β-glucanas. Destaca-
se ainda atividades antioxidantes, antiproliferativa e antitumoral, sequestro de radicais
livres sintéticos (KADAM et al., 2015), inibição da proliferação de linhagem celular de
25
leucemia monocítica (MENSHOVA et al., 2014) e inibição do crescimento de linhagem
celular tumoral de Sarcoma 180 quando transfectada em camundongos (FANG et al.,
2012), respectivamente.
Assim, β-glucanas representam polímeros naturais com propriedades
importantes para o desenvolvimento da saúde como agentes terapêuticos, o que os
tornam foco de pesquisas quanto a suas propriedades farmacológicas, como descrito
a seguir.
1.4.2. Atividades Farmacológicas de β-glucanas
Os trabalhos que demonstram β-glucanas apresentando propriedades
farmacológicas, como: atividades antioxidante, imunoestimulante e
antiproliferativa/antitumoral (GIESE et al., 2015; MORENO et al., 2016; MENSHOVA
et al., 2014), apontam para características inerentes a estrutura desses biopolímeros
que os tornam biologicamente ativos quando analisados frente a ensaios in vitro e in
vivo. Assim, para melhor compreensão dessas atividades, são descritos a seguir seus
mecanismos e possibilidades de intervenção pelas β-glucanas.
1.4.2.1. Atividade antioxidante
1.4.2.1.1. Espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs)
As espécies reativas são um grupo heterogêneo de moléculas ou átomos
formados principalmente a partir do oxigênio ou do nitrogênio. As espécies reativas
que apresentem em sua camada de valência um elétron desemparelhado são
denominadas de radicais (SOMOGYI et al., 2007), que são reativos frente a ligações
e/ou grupamentos moleculares. Espécies reativas de oxigênio (EROs) e do nitrogênio
(ERNs), como radical superóxido (O2 •-), espécie não radicalar peróxido de hidrogênio
(H2O2), o radical hidroxila (OH•), radical óxido nítrico (NO) e o radical peroxinitrito
(ONOO-), são espécies reativas que estão diretamente relacionadas a danos celulares
causados por estresse oxidativo (HSU; CHAN; CHANG, 2007). O estresse oxidativo
é um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes em favor dos oxidantes, levando a
um desarranjo de sinalização celular e do controle redox e/ou a um dano molecular
(JONES, 2006). Assim, EROs têm sido reconhecidas ora como reguladoras ora como
aceleradoras de processos metabólicos (AVALOS; CHUNG; OESER, 2007).
26
O radical superóxido (O2•-) forma-se a partir de redução do oxigênio molecular
(O2) por um elétron e apresenta baixa capacidade de difusão (MYLONA;
POLIDOROS, 2010). EROs, como o superóxido, podem ser geradas em diversos
compartimentos celulares, como no retículo endoplasmático a partir de flavoproteína
NADPH-citocromo P450 redutase, na mitocôndria a partir da oxidação incompleta do
oxigênio ou no citosol pela enzima xantina oxidase (Tabela 3).
Tabela 3 - Compartimentos e reações de formação de radicais livres endógenos
Fonte: Autoria própria
Reduções do superóxido convertem esse radical ao peróxido de hidrogênio
(H2O2), esta espécie reativa pode atravessar membranas celulares e migrar entre
compartimentos apresentando ação deletéria por originar o radical hidroxila (OH•), o
mais oxidante dentre as EROs e por oxidar grupo tiol de enzimas, inativando-as
(KARUPPANAPANDIAN et al., 2011). Reações entre Fe2+ (ou Cu+) e o H2O2 ou entre
O2•- e o H2O2 (conhecidas como reações de Fenton e de Haber-Weiss,
respectivamente) reduzem o H2O2 ao radical hidroxila (OH•) e ao íon hidróxido (OH-)
(Tabela 4) (GIL; TUTEJA, 2010; BHATTACHARJEE, 2010).
Tabela 4 - Reações não enzimáticas de formação de radicais livres endógenos
Fonte: Autoria própria.
O radical hidroxila é o mais reativo dentre as EROs, sua alta reatividade resulta
em reações rápidas e inespecíficas com diversos substratos. Este radical pode reagir
com todos os tipos de moléculas biológicas (MYLONA; POLIDOROS, 2010) e, assim
27
como outros radicais, pode desnaturar proteínas pela oxidação de grupos sulfidrila (-
SH) e pontes dissulfeto (-S-S-) provocando perda da função biológica. Também
podem reagir com ácidos graxos poli-insaturados, inclusive os de membrana,
retirando átomos de hidrogênio de grupos metileno e induzindo a peroxidação lipídica
ou mesmo reagir com bases nitrogenadas do DNA causando oxidações que
comprometem a estrutura e a função dessas biomoléculas com consequente
distúrbios da membrana celular e de organelas ou a mutações, respectivamente
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1990; BLOKHINA et al., 2003; VALKO et al., 2007).
Além das reações de Fenton e de Haber-Weiss, o radical OH• também pode ser
gerado a partir da reação do O2•- com NO, com formação intermediária do radical
peroxinitrito (ONOO-).
Outro radical que também está envolvido em danos oxidativos e na defesa
celular contra agentes patogênicos é o NO, que é uma das menores e mais simples
moléculas biossintetizadas. Ele apresenta um elétron desemparelhado na camada de
valência, atuando como radical livre (MORRIS; BILLAR, 1994; BECKMAN;
KOPPENOL, 1996). Em sistemas biológicos, o NO tende a se concentrar em
ambientes lipofílicos, como membranas e domínios hidrofóbicos de proteínas
(KERWIN et al., 1995). A concentração de NO determina se esta substância é
benéfica ou tóxica, visto que pequenas quantidades desta molécula são necessárias
para hemostasia, enquanto grandes quantidades, como aquelas produzidas na
ativação da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), são citotóxicas (KIECHELE;
MALINSKI, 1993; BOGDAN, 2001). Entretanto, a produção de grande quantidade de
NO por células do sistema imune, pode ser importante na defesa contra
microrganismos invasores, tumores e ainda em lesões vasculares com perda
endotelial (SCHOROEDER, 1995; COSTA et al., 2003). O NO pode ainda formar o
radical peroxinitrito (ONOO•), que é altamente reativo e pode alterar o balanço redox
do sistema glutationa reduzida/glutationa oxidada no sentido do estresse oxidativo,
por depletar grupamentos –SH de componentes fundamentais de sistemas
antioxidantes naturais como a glutationa reduzida (BARRY, 2007). A existência de
componentes moleculares responsáveis pelo equilíbrio redox celular, como o sistema
da glutationa, representa importância central na sinalização de vias intracelulares de
defesa celular (OKTYABRSKY; SMINORVA, 2007).
Contra a excessiva produção de espécies reativas as células passaram a
desenvolver sistemas antioxidantes, mantendo um equilíbrio entre os componentes
28
oxidantes e os antioxidantes. Os sistemas antioxidantes podem atuar de duas formas:
via catálise enzimática ou não enzimática (BARTZ et al., 2010), os quais podem inibir
a cadeia de eventos de produção de espécies reativas em uma ou mais de suas três
fases: iniciação, propagação ou terminação (ZHANG; YANG; TANG, 2006). Os
antioxidantes enzimáticos como a catalase (CAT) presente em peroxissomos,
superóxido dismutase (SOD) e o sistema glutationa peroxidase (GPx) - glutationa
redutase (GR), ambos presentes no citoplasma e mitocôndrias, compõem sistemas
diferentes no combate ao dano oxidativo gerado por espécies reativas (VALKO et al.,
2007). A Figura 1 representa de forma resumida e condensada os diferentes
mecanismos antioxidantes relatados.
Figura 1 - Enzimas envolvidas no sistema antioxidante celular e as reações químicas relacionadas. SOD
(Superóxido dismutase), CAT (Catalase) e GPx (Glutationa peroxidase), GR (Glutationa redutase), GSH (Glutationa reduzida), GS-SG (Glutationa oxidada), NADPH (Nicotinamida adenina di-nucleotídeo reduzida), FADH2 (Flavina adenina dinucleotídeo reduzida).
Fonte: Autoria própria.
Por outro lado, reações não enzimáticas de atividade antioxidante promovidas
por elementos produzidos pelo próprio organismo, como a Glutationa (GSH),
coenzima Q10, proteínas ligadoras de ferro (transferrina e ferritina), proteína ligadoras
de cobre (ceruloplasmina) e elementos oriundos da dieta como o β-caroteno (pro-
vitaminas A), ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E) e os flavonóides
também atuam de forma decisiva contra danos oxidativos (HALLIWELL et al., 1995;
PIETTA, 2000; BARTZ et al., 2010).
Dentre os antioxidantes não enzimáticos citados a glutationa, que é o substrato
da enzima glutationa peroxidase (GPx), tem função de regenerar o α-tocoferol. Esta
vitamina, por sua vez, também pode ser regenerada pelo ácido ascórbico (Figura 2).
O α-tocoferol é o principal antioxidante atuante na inibição da peroxidação lipídica e,
29
portanto, na estabilização de membranas celulares devido seu caráter lipofílico (JU et
al., 2010).
Figura 2 - Mecanismo de ação de compostos antioxidantes não enzimáticos. Sistema Tocoferol-Ascorbato-GSH. Fonte: Autoria própria.
A oxidação descontrolada de biomoléculas compromete funções celulares de
vários tecidos gerando a formação de sinais intracelulares que culminam na ativação
e/ou desativação de enzimas e fatores de transcrição relacionados à defesa e
sobrevivência celular, o que induz exacerbação de doenças relacionadas aos tecidos
renal (ZHANG et al., 2016), ao tecido cardiovascular (doenças cardíacas,
aterosclerose, diabetes) (MEERAN et al., 2016; CHUN-HUI et al., 2007; CERIELLO;
TESTA; GENOVESE, 2016), encefálico (Parkinson e Alzheimer) (PISOSCHI; POP,
2015) ou de multiórgãos (inflamação, câncer e envelhecimento) (FERREIRA;
MATSUNARA, 1997; HALLIWELL, 2014; LÓPEZ-ALARCÓN; DENICOLA, 2013).
Compostos antioxidantes que possam evitar ou retardar a ação de radicais
livres estão associados a diversos mecanismos anti-patogênicos, em que a redução
de espécies reativas, o sequestro de radicais ou a quelação de metais contribuem
para minimizar a excessiva produção de espécies radicalares danosas aos tecidos.
Vale salientar que a quelação de metais é uma importante função desempenhada por
diferentes agentes apresentando propriedades de desintoxicação de organismos
vivos, seja em situação de doença crônica (Doença de Wilson ou β-talassemia) que
provoque a acúmulo do metal tóxico (intoxicação endógena) ou por intoxicação
exógena (ANDERSEN; AASETH, 2002). Neste contexto, o desenvolvimento de novos
agentes quelantes que possam ser administrados pela via oral e que apresentem
30
menos efeitos adversos e/ou colaterais é um processo atual e contínuo (ANDERSEN;
AASETH, 2002).
Assim, como moléculas promissoras para combater danos oxidativos
provocados por radicais, destaque é dado para os polissacarídeos (COSTA et al.,
2014). A atividade antioxidante dos polissacarídeos tem sido relacionada às
características físico-químicas inerentes a estrutura desses polímeros (NGO et al.,
2013).
1.4.2.1.2. β-glucanas antioxidantes
A capacidade de sequestro de radicais tem sido relacionada a habilidades de
transferir elétrons por doar átomos de hidrogênio devido a sua baixa energia de
dissociação das ligações de OH (JIN et al.,2011). Já as propriedades quelantes são
relacionadas ao posicionamento desses grupos –OH dentro da molécula, como
descrito por Gyurcsik e Nagy (2000), que relataram que hidroxilas posicionadas de
forma consecutivas axial-axial-axial ou axial-equatorial-axial apresentam melhor
configuração para estabilizar metais. Assim, a transferência de elétrons e/ou a
estabilização de metais atuam como fatores responsáveis pela atividade antioxidante
proporcionadas por polissacarídeos.
A atividade antioxidante de β-glucanas em ensaios de redução e sequestro de
radicais livres tem sido relatada, como o sequestro de radicais sintéticos como DPPH
e ABTS por β-glucanas de fungo (KAGIMURA et al., 2015). O sequestro de radicais
superóxido (GIESE et al., 2015) e hidroxila, a quelação de metais de transição como
o ferro (WANG et al., 2015) e a diminuição do estresse oxidativo devido a
lipoperoxidação (TOKLU et al., 2006) são importantes estratégias antioxidantes
proporcionadas por β-glucanas de fungos. Vale salientar que na forma complexada,
acredita-se que os carboidratos atuem como carreadores de metal, e têm sido
estudados como potenciais agentes antitumorais (YU et al., 2011).
31
1.4.2.2. Atividade imunomoduladora
1.4.2.2.1. Características das respostas imunológicas inata e adquirida
O processo de evolução do ser humano impôs a aquisição de diferentes
estratégias de defesa contra agentes danosos endógenos e/ou exógenos. O sistema
imunológico é uma dessas estratégias e pode atuar de forma diferenciada de acordo
com caraterísticas inerentes ao agente agressor. Os agentes agressores podem
apresentar em suas estruturas moléculas padrão associadas a patógenos (MPAPs,
do inglês PAMPs) e serem reconhecidos por receptores de reconhecimento padrão
(RRPs, do inglês PRRs) e ativar diferentes células do sistema imunológico (FRIC et
al., 2012). Esse sistema pode ser dividido em duas fases. A primeira fase, que compõe
a primeira linha de defesa, denomina-se de sistema imune inato e age principalmente
por intermédio de células fagocíticas como os macrófagos, neutrófilos e células
dendríticas e pela ação coordenada de proteínas que compõe o sistema complemento
(YAN et al., 2000). A segunda fase ou sistema imune adquirido, é constituída por
células como linfócitos T e B e por imunoglobulinas. Vale salientar que a segunda fase
entra em ação quando os mecanismos envolvidos na primeira fase não são suficientes
para eliminar os patógenos e que a primeira linha de defesa é inespecífica, atuando
de forma semelhante para todos os patógenos, já a segunda é específica, produzindo
uma resposta direcionada a cada patógeno.
Os macrófagos são células importantes para o processo anti e pró inflamatório,
assim como em processos de reparo e regeneração de tecidos, pois promovem
respostas que culminam no recrutamento, proliferação e ativação de vários tipos
células, como neutrófilos, células “NK” (do inglês Natural killer, matadoras naturais),
células B, células T, fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais e células
progenitoras (GORDON, 2016), o que as colocam como células com atividade
reguladora crítica durante estágios de inflamação e reparo (WYNN; BARRON, 2010;
GINHOUX; GUILLIAMS, 2016). Devido a essas características os macrófagos
tornam-se importantes alvos terapêuticos, uma vez que controlam os processos de
iniciação, manutenção e resolução de processos imunológicos, sendo críticos para a
homeostase (WYNN; VANNELLA, 2016).
Como são fontes de quimiocinas, enzimas (como as metaloproteinase) e outros
mediadores inflamatórios, os macrófagos participam ativamente nas fases iniciais da
inflamação, sendo responsáveis também pelas respostas secundárias ao evento
32
inflamatório, como é o caso da reparação do tecido lesado, assumindo o papel de
promover proliferação celular e desenvolvimento de novos vasos sanguíneos por
produzir vários fatores de crescimento, como: fator de crescimento derivado de
plaquetas (FCDP), fator de crescimento transformador β1 (FCT-β1), fator de
crescimento endotelial vascular α (FCEV- α), dentre outros (WILLENBORG et al.,
2012; WYNN; VANNELLA, 2016).
Como célula indutora de resposta a patógenos, o macrófago pode ser ativado
via RRPs como os receptores da família lectina tipo C (RLCs, do inglês CLRs), os
quais apresentam afinidades por moléculas antigênicas como β-glucanas (como por
exemplo e receptor Dectina-1) e desempenham função de ativação de fatores de
transcrição, como NFAT (fator nuclear ativador de células T), AP-1 (fator ativador de
proteína 1) e NF-κB (fator nuclear kappa B), relacionados a expressão de
componentes com função de ativação, proliferação, diferenciação, defesa e
sobrevivência do organismo (LEE et al., 2015; RIZZETO; WEIL; CAVALIERE, 2015).
O receptor Dectina-1 pertence à família dos RLCs que apresentam um domínio
extracelular de ligação a carboidratos e um domínio citoplasmático denominado de
imunorreceptor de ativação baseado em motivos de tirosina (ITAM, do inglês
immunoreceptor tyrosine-based activation motif). O domínio ITAM ativa a enzima
tirosina kinase esplênica (Syk) que por sua vez ativa o complexo proteico CARD-
9/Bcl10/Malt1, com consequente ativação do fator de transcrição NF-κB (SURAM et
al., 2010; GROSS et al., 2006; DENNEHY et al., 2007; DRUMMOND et al., 2011). A
ativação de Dectina-1 também proporciona elevação na produção de EROs e ativação
de fatores de transcrição AP-1 (via proteína kinase ativada por mitógeno [MAPK]),
elevando a produção e liberação de citocinas proinflamatórias e a ativação de vias de
mitose celular (Figura 3). EROs têm função microbicida e papel importante na ativação
de caspase-1 que promove ativação de IL-1β (SHIMADA et al., 2012; GOODRIDGE
et al., 2007).
33
Figura 3 - Vias de sinalização envolvidas na ativação do receptor Dectina 1 (receptor de β-glucanas). A ligação de β-glucanas ao receptor Dectina 1 ativa uma serie de sinais intracelulares envolvidos na ativação de fatores nucleares relacionados a expressão de fatores de sobrevivência celular, como citocinas envolvidas na estimulação, proliferação e diferenciação celular, assim como enzimas e receptores de membrana. A proteína Syk, após ser ativa pelo motivo ITAM, ativa vias de influxo de cálcio e ativação do complexo CARD9/MALT1/BCL10. O influxo de cálcio ativa o fator nuclear de transcrição relacionado à expressão de componentes ativadores de células T (via NFAT). O complexo CARD9/MALT1/BCL10 ativa fatores que estimulam a proliferação celular (via AP-1) e a reposta imunológica por citocinas e enzimas pró-inflamatórias (via NF-κB). Ativação de IL-1β, via ativação de caspase 1 por componente de inflamaossomo (via NRLP3), também pode ser gerada por ligante de receptor Dectina 1. CRB, domínio de reconhecimento de carboidrato. NRLP3, domínio ligante de nucleotídeos com repetições ricas em leucina contendo domínio pyrin 3. CARD-9, domínio de recrutamento de caspase. MALT1, proteína 1 de linfoma de tecido linfoide associado a mucosa. Bcl10, Proteína 10 de linfoma de células B. IκB, inibidor kappa B. PCK, proteína kinase C. PLCγ2, fosfolipase Cγ2. mtDNA, DNA mitocondrial Fonte: Autoria própria.
O fator de transcrição NF-κB ativa a expressão de diversas citocinas (como
interleucina (IL)-1β, IL-2. IL-6. IL-8, IL-10, IL17 β, TNFα e IFNγ), enzimas (como a
cicloxigenase [COX], fosfolipase A2 [PLA2] e iNOS) além de proporcionar o aumento
de radicais livres como superóxido, radical hidroxila e NO. Este último é sintetizado a
partir da oxidação do aminoácido L-arginina, catalisada pela enzima óxido nítrico
sintase (NOS). A NOS apresenta três isoformas agrupadas em duas categorias: a
NOS constitutiva (cNOS) – dependente de íons cálcio (Ca2+) e de calmodulina
34
(envolvida da sinalização celular) e a iNOS – produzida por macrófagos e outras
células ativadas por citocinas (BOGDAN, 2001).
O NO medeia ativação de células inflamatórias, como os macrófagos (NAGY et
al., 2007). Nestas células o NO também atua no processo de ativação de fatores de
transcrição relacionados a expressão de citocinas, que além de promovem aumento
da atividade microbicida, potencializam a ação de IL-1β e TNFα (RALTSON et al.,
1997) e aumentam a produção de prostaglandinas (substâncias proinflamatórias) por
aumento na expressão de COX (HEBEDA, 2008) o que promove a formação de um
ambiente de defesa imunológico.
1.4.2.2.2. β-glucanas imunomoduladoras
O primeiro passo para haver modulação da atividade celular por β-glucanas é
a ligação desses polímeros com receptores específicos presentes na membrana da
célula alvo (MUELLER et al., 1996). β-glucanas não são produzidas por animais
tornando sua presença um fator estimulante do sistema imunológico (FUENTES;
MILLIS; SIGOLA, 2011). As β-glucanas podem ativar cascatas intracelulares de
reações por ligação a receptores celulares de macrófagos, promovendo subsequente
ativação de vias e, assim, proporcionando amplificação das ações dos sistemas de
defesa celular relacionados ao aumento do metabolismo celular e expressão de
enzimas e fatores de transcrição genética que levam a produção de NO e produção
de citocinas (ADAMS et al., 1997). Dessa forma, as interações das β-glucanas com
receptores de membrana dos macrófagos estimulam a atividade destas células contra
agentes patogênicos.
Devido as atividades biológicas que proporcionam, como o estímulo de células
do sistema imunológico, as β-glucanas são denominadas de modificadoras da
resposta biológica (MRBs) (MUELLER et al., 1995). As diversas atividades
imunopotencializadoras são relacionadas a suas estruturas químicas, que promovem
afinidade desses polímeros com receptores de superfície das células (LEGENTIL et
al., 2015).
Os principais receptores de β-glucanas em membranas de macrófagos,
monócitos, neutrófilos, células ”NK”, alguns linfócitos T e células dendríticas são:
Dectina-1 (BROWN; GORDON, 2001), receptor 3 do complemento (CR3), receptores
scavenger (SRs) classe A e B, receptor lactosilceramida (LacCer) (SYLLA et al., 2011)
35
e receptores Toll-like (TLRs) 2 e 6 (SMIDERLE et al., 2013; QI et al., 2011;
AKRAMIENE et al., 2007).
O reconhecimento de β-glucanas por receptores Dectina-1 e TLRs 2/6 nos
macrófagos é sucedido de ativação de diferentes vias de sinalização que culminam
na ativação de fatores de transcrição relacionados a respostas imunológicas de
caráter inato e adaptativo. Dentre esses receptores destaque é dado para o Dectina-
1, que é um receptor específico para β-glucanas (BROWN et al., 2003).
A ativação de macrófagos por β-glucanas também é descrita por Lee e colegas
(2015), que relataram que β-glucanas de Cordyceps militaris ativaram macrófagos via
TLRs tipos 2 e 6 e por Dectina-1, culminando em sinalização via MAPK e NF-κB. Estes
autores ainda descrevem que na superfície externa dos macrófagos estão presentes
vários receptores que ativam diferentes vias de sinalização que incluem proteínas
tirosina kinases, proteína kinase C, fosfatidilinositol-3-kinase (Pi3K), MAPK e NF-κB
(BISWAS; SODHI, 2002; KUAN; HUANG; CHANG, 2012) e que essas cascatas de
sinalizações modulam a ligação entre as respostas imune inata e adaptativa.
Lee e colaboradores (2012) ao estudarem o efeito de laminarinas da alga
Laminaria digitata relataram que esses polímeros estimularam macrófagos da
linhagem RAW 264.7 a liberarem vários componentes relacionados a atividades de
defesa inata e adquirida como espécies reativas H2O2 e NO além de fatores de
crescimento de endotélio vascular, fator inibidor de leucemia e fator estimulador de
colônia de granulócitos. A atividade imunomoduladora das laminarinas da alga
Laminaria digitata também foram demonstradas através do aumento da expressão de
células T CD4 e CD8 (VETVICKA; YVIN, 2004).
1.4.2.3. Atividade antiproliferativa/antitumoral
1.4.2.3.1. O ciclo celular e a morte celular programada (apoptose)
As células somáticas sadias do corpo humano, com exceção das hemácias e
neurônios, apresentam propriedades de se dividirem oportunamente quando
necessário e quando há estímulos para que a proliferação ocorra. O processo de
divisão celular ocorre em fases (G1, fase de preparação para a síntese de DNA, há a
síntese de proteínas e aumento da célula; S, fase síntese de DNA, cromossomos são
duplicados; G2, fase de preparação para divisão, há síntese de proteínas; M, fase de
mitose, a célula se divide em duas) e é estritamente regulado a cada uma delas. A
36
proteína p53 por exemplo atua regulando a passagem da fase G1 para fase S
(LEMOINE, 1990). A sequência de eventos que compreendem essas fases é
denominada de ciclo celular e garante a transmissão de uma cópia completa do
material genético da célula “mãe” para as células “filhas”.
Ao longo das fases, proteínas-chave, como as enzimas quinases dependentes
de ciclinas (CDK, do inglês) – que quando ativadas levam à progressão do ciclo –, e
suas inibidoras, CKIs (inibidoras de ciclinas quinases), associam-se para conduzir e
regular várias etapas do processo de duplicação celular, permitindo que a célula
progrida no ciclo, cresça, multiplique-se, diferencie-se ou atinja o estado de latência
(G0, quiescência da célula). Falhas em algum dos processos regulatórios podem
redirecionar a célula no sentido da morte programada (apoptose) ou induzir a divisão
celular de forma ininterrupta, promovendo o desenvolvimento tumoral (REDDYA;
ODHAVA; BHOOLAB, 2003).
O processo de regulação do ciclo apresenta etapas que coordenam a
proliferação, quiescência, diferenciação e morte celular. Em todos esses eventos os
chamados pontos de checagem (checkpoints) são importantes para controlar a
qualidade da duplicação celular, que pode ser defeituosa e causar danos ao material
genético (ALBERTS et al., 2008). Caso o dano ocorra, cascatas de sinais são ativadas
no intuito de bloquear a progressão do ciclo e ativar os mecanismos de reparo do
material genético ou ativar vias de apoptose (REDDYA; ODHAVA; BHOOLAB, 2003).
Assim, os pontos de checagem proporcionam o correto desenvolvimento de cada fase
do ciclo, regulando a transição entre elas. Vale salientar que alterações nesses pontos
podem ocasionar acúmulos de mutações que podem alterar vias metabólicas a ponto
de levar ao desenvolvimento de doenças como o câncer (ALBERTS et al., 2008).
Células tumorais apresentam mecanismos de sobrevivência diferenciados de
células sadias. Por exemplo, a diminuição dos processos relacionados à fosforilação
oxidativa em detrimento de eventos da glicólise e intensa produção de lactato oriundo
de glicose, mesmo na presença de oxigênio (Efeito Warburg) (WOLF et al., 2011),
assim como a atividade respiratória diminuída durante utilização da glicose (Efeito
Crabtree) são características de células tumorais. Esses efeitos representam partes
de vias metabólicas relacionadas a fermentação como meio de obtenção de energia
em tumores (DIAZ-RUIZ et al., 2009 e 2011).
Outra mudança em rotas metabólicas presentes em células tumorais é o desvio
de vias de morte celular programada (vias apoptóticas) em detrimento de vias
37
relacionadas à proliferação por divisão celular (mitose). A apoptose pode ser iniciada
por duas vias clássicas, a via intrínseca (mediada por mitocôndria) e a via extrínseca
(mediada por receptores de morte) (JI; JI, 2014) (Figura 4). Em células tumorais há
diminuição ou anulamento dessas vias de apoptose.
Na via intrínseca da apoptose, alguns eventos, como: danos ao DNA, hipóxia,
ativação de oncogenes ou falta de fatores de crescimento, são reconhecidos por
sensores moleculares de estresse intra ou extracelulares que induzem sinais efetores
que têm a mitocôndria como alvo. Esses sinais induzem a permeabilização da
mitocôndria e posterior liberação de moléculas pró-apoptóticas (GRIVICICH;
REGNER; ROCHA, 2007). A atividade de proteínas reguladoras da família Bcl-2
(antiapoptótica) é balaceada pela atividade de proteínas como Bax (pró-apoptótica),
que tem função de formação de poros na membrana mitocondrial. Bcl2 e Bax podem
se unir e formar heterodímeros e, assim, uma pode regular a atividade da outra. Dessa
forma, o aumento na expressão de Bcl2 proporciona regulação de mecanismos para
o sentido anti-apoptótico, já o aumento na expressão de Bax promove a formação de
poros na membrana mitocondrial o que culmina na perda do potencial de membrana,
aumento do estresse oxidativo, eliminação de componentes intra-mitocondriais como
DNA oxidado e citocromo c para o citosol. Moléculas oxidadas de DNA mitocondrial
quando presentes no citosol são reconhecidas por induzirem a ativação de domínios
NLR (domínio de ligação de nucleotídeos a repetições ricas em leucina) que são
moléculas receptoras citosólicos relacionadas à ativação de caspase 1, esta protease
ativa a interleucina 1β, que é componente ativador de vias pró-inflamatórias
(SHIMADA et al., 2012). O complexo citocromo c atuará, juntamente com APAF1 (fator
de ativação de protease associada a apoptose 1), na ativação da caspase-9, esta
caspase ativará a caspase-3 que consequentemente induzirá o processo apoptótico
(BUDIHARDJO et al., 1999).
Na via extrínseca da apoptose há ativação de sinais induzidos por receptores
de membrana como os da superfamília dos receptores de fator de necrose tumoral
(rTNF) que proporcionam, via interação de seu domínio citoplasamático de morte com
o complexo molecular FADD, a ativação da caspase-8 que, consequentemente,
induzirá a ativação da caspase-3 e posterior indução de mecanismos apoptóticos
(GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007; GALLUZZI et al., 2012).
38
Figura 4 - Vias de Ativação da apoptose. Na via intrínseca há o desbalanço entre Bcl2 e Bax em favor do desiquilíbrio mitocondrial com consequente liberação de citocromo c e posterior ativação da caspase 3 via ativação da caspase 9. Na via extrínseca há ativação de caspase 8 por ativação de domínio de morte de receptores tipo rTNF, a caspase 8 promove ativação de caspase 3 que induz a mecanismos de fragmentação celular, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos. rTNF, receptor de TNF. FADD, domínio de morte com proteína associada a Fas. Bcl2, proteína 2 de linfoma de células B (proteína reguladora de apoptose [anti-apoptótica]). Bax, Proteína reguladora de apoptose (pró-apoptótica). APAF1, Fator de ativação de protease associada a apoptose 1. Fonte: Autoria própria.
O reconhecimento de β-glucanas por receptores de morte têm conduzido
diferentes grupos de pesquisa a proporem mecanismos prováveis de indução de
morte em várias linhagens de células tumorais, o que leva a novos saberes sobre a
ação desses biopolímeros e seus efeitos biológicos.
1.4.2.3.2. β-glucanas antiproliferativas/antitumorais
Com as novas metodologias voltadas à manutenção da saúde humana
envolvendo tratamentos para diversas doenças há, como consequência, o aumento
no número de pessoas que atingem a terceira idade, tornando-se mais comum o
aumento da incidência de doenças relacionadas ao processo de envelhecimento,
39
como o câncer. Diversas linhas de pesquisa têm relacionado essa doença a fatores
ambientais e genéticos, desde radiações ionizantes, poluentes químicos a
desregulação de processos de defesa do sistema imunológico, ocasionando a
proliferação descontrolada de células mutantes que não são eliminadas de forma
eficiente, podendo gerar como consequência o câncer (REDDYA; ODHAVA;
BHOOLAB, 2003).
Várias metodologias têm sido usadas para a inibição do crescimento de células
cancerígenas, dentre elas pode-se citar as que se utilizam de processos físicos,
químicos e imunológicos. Dentre os processos físicos há a utilização de radiações
ionizantes do tipo gama ou raio X que tendem a destruir as células neoplásicas. Já,
dentre os processos químicos há a utilização de substâncias que ao serem
administradas no paciente tendem a inibir a proliferação e/ou destruir as células
tumorais e, recentemente, a utilização de compostos que tenham a finalidade de
induzir o aumento das defesas do sistema imunológico tem sido usada com êxito,
principalmente quando associados aos outros métodos (KALOS; JUNE, 2013),
Neste contexto, os polissacarídeos têm sido relatados como inibidores do
crescimento de tumores (CHIHARA et al., 1969) por mecanismos que incluem:
prevenção de tumorigênese por imunoestimulação de células de defesa, atividade
anticancerígena direta por indução de apoptose de células tumorais, atividade
imunoestimulante em combinação com quimioterapia e inibição de metástases
(ZONG; CAO; WANG, 2012).
Polissacarídeos antitumorais, como β-glucanas, estão relacionados à ativação
de morte celular programada (JI; JI, 2014) e a ativação de vias que conduzem o
estímulo de células do sistema imunológico (EBERT et al., 2016), em que, por
exemplo, β-glucanas administradas por via oral, em ratos, podem ser capturadas por
macrófagos, via receptor Dectina-1, presentes no tecido intestinal proximal e, após
internalizadas, são fragmentadas e transportadas por estes macrófagos à medula
óssea e para células do sistema retículo endotelial (baço e nódulos linfático)
(CHEUNG et al., 2002). Os fragmentos de β-glucanas podem ser liberados e, assim,
ativar outras células do sistema imunológico, como granulócitos, monócitos ou outros
macrófagos via receptor de complemento (CR)-3, uma vez ativadas estas células
podem reconhecer e fagocitar células tumorais marcadas com anticorpo monoclonal
(CHAN et al., 2009). β-glucanas de diferentes tamanhos e graus de ramificação
podem apresentar diferenças quanto ao potencial de estímulo ao sistema imune. Rice
40
e colaboradores (2005) também avaliaram atividades de β-glucanas solúveis e
demostraram que laminarinas, podem ser internalizadas por células epiteliais
intestinais de tecido linfoide e, dessa forma estimularem a ativação do sistema
imunológico.
Qi e colaboradores (2011) relataram diferenças nas vias de regulação das
respostas antitumorais inata e adaptativa induzidas por β-glucanas. Estes autores
demonstraram que β-glucanas ativaram células dendríticas que por sua vez
estimularam, in vitro, resposta Th1 (citotóxica). Ainda relataram que estes
polissacarídeos, quando administrados oralmente, proporcionaram potente resposta
antitimoral em ratos transfectados com células de adenocarcinoma mamário de
linhagem EO771, relatando também aumento significante de macrófagos, células
dendríticas e linfócitos T CD8 ativados. As células T CD8 ativadas são conhecidas por
desenvolverem ações antitumorais (EBERT et al., 2016). β-glucanas também têm
sido referenciadas por induzirem a produção de anticorpos monoclonais antitumorais
por ativação da via do complemento, assim servindo como agentes adjuvantes para
estimular a resposta imune (AKRAMIENÈ et al., 2007).
Atividade apoptótica induzida por laminarinas foi relatada em células de
linhagem cancerígena de cólon humano (JI; JI, 2014). Neste estudo os autores
demonstraram a elevação da expressão dos níveis de receptores de morte DR4, DR5,
TRAIL (“TNF-related apoptosis-inducing ligante”- ligante de TNF indutor de apoptose)
e FADD (“Fas-associated protein with death domain” – domínio de morte com proteína
associada a Fas) e de complexos proteicos relacionados a destruição da membrana
mitocondrial, como Bid e Bax (via intrínseca de apoptose), ainda relatando a
diminuição do complexo Bcl-2 (regulador de Bid e Bax) e das pro-caspases 8 e 3 (via
extrínseca de apoptose). Deste modo, laminarinas provocaram, além da ativação de
receptores de morte, a formação de poros na membrana mitocondrial causando
subsequente liberação de citocromo ‘c’ e diminuição do potencial de membrana,
induzindo apoptose irreversível por via alternativa, envolvendo receptores de morte e
dano mitocondrial.
Park e colaboradores (2012) também demonstraram atividade antiproliferativa
de laminarinas, já que esses polissacarídeos inibiram a proliferação de células
cancerígenas de colón humano da linhagem HT-29 e induziram apoptose via receptor
de morte (DR) e via receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina.
41
As pesquisas envolvendo β-glucanas como agentes antitumorais também
relatam a importância de características intrínsecas a esses polissacarídeos para uma
efetiva ação. Dentre as características mais relevantes destacam-se a massa
molecular e a solubilidade, sendo esta, diretamente proporcional ao grau de
ramificação e substituições no polímero (BOHN; BEMILLER, 1995; SYNYTSYA;
NOVÁK, 2013).
As atividades bioativas que polissacarídeos, dentre eles as β-glucanas, vêm
apresentando em diferentes ensaios biológicos levam ao entendimento de que estes
biopolímeros são moléculas promissoras para serem usadas nas indústrias
alimentícia, agroindustrial e farmacêutica. Deste modo, devido a importância das β-
glucanas como modificadores da resposta biológica e que a alga Lobophora variegata
não foi estudada como fonte desses polissacarídeos, β-glucanas foram extraídas
desta alga e avaliadas quanto a atividades biológicas e apresentação estrutural.
42
1.5 OBJETIVOS
1.5.1 OBJETIVO GERAL
Extrair e caracterizar polissacarídeos da macroalga L. variegata e avaliá-los
frente a diferentes ensaios in vitro, bem como, propor a estrutura fina de uma β-
glucana obtida desta alga.
1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Obter frações ricas em polissacarídeos da macroalga Lobophora variegata;
- Caracterizar físico-quimicamente as frações ricas em polissacarídeos;
- Prospectar as seguintes atividades dessas frações polissacarídicas:
• Atividade antioxidante;
• Atividade imunomodulatória;
• Atividade anticoagulante;
• Atividade antiproliferativa;
- Caracterizar estruturalmente uma glucana presente em uma das frações
polissacarídicas.
43
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. MATERIAIS
2.1.1. Reagentes e Aparelhos
- Acetona, ácido acético, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, álcool etílico, azul de
toluidina, brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamônio P.A. (CETAVLON), citrato de sódio,
cloreto de bário, coomassie brilliant blue R 250, fosfato de sódio dibásico, fosfato de
sódio monobásico, sulfato de ferro II, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio foram
adquiridos da CRQ (Diadema, SP, Brasil);
- Ácido ascórbico, cloreto de sódio, 1,3-diaminopropano acetato (PDA), carbazol,
ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT), riboflavina, Reagente de Gries, L-fucose, D-
xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose, D-ramnose e ácido D-
glucurônico, ABTS (2,2´azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) e Reagente
MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) foram
comprados da empresa Sigma-Aldrich Chemicals (Saint Louis, MO, EUA);
- Filtros concentradores de centrifugação do tipo Millipore® Amicon® Ultra, com
membranas de celulose Ultracel® de tamanhos 3 KDa, 10 KDa, 30 KDa, 50 KDa e
100 KDa, cloreto de ferro e reagente de Folin-Ciocalteau adquirido da Merck KgaA©
(Darmstadt, Alemanha);
- Fenol, sulfato de cobre II, sulfato de sódio anidro adquiridos da Reagen Quimibrás
Indústrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
- Agarose (Standart Low-MR) proveniente da BioRad Laboratories (Richmond, CA,
EUA)
- Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) proveniente da VETEC (Duque de Caxias,
RJ, Brasil);
- Ácido gálico adquirido da CAQ Casa da Química Ind. e Com. (Diadema, SP, Brasil);
- Bacto-Gelatina adquirido da Difco Laboratories (Detroit, MI, USA);
- Metionina proveniente da Synth (Diadema, SP, Brasil);
- Prozima (preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750) adquirida
da Prozyn Biosolutions, São Paulo, SP, Brasil;
- Salicilato de sódio adquirido da FLUKA (Steinheim, Germany);
- Kit de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) adquirido da Labtest (Lagoa
Santa, MG, Brasil);
44
- Para determinação das concentrações de citocinas interleucina-2 (IL-2), interleucina-
4 (IL-4), interleucina-6 (IL-6), interferon- γ (INF-γ), fator de necrose tumoral (TNF),
interleucina-17A (IL-17A) e interleucina-10 (IL-10), kit comercial Cytometric Bead
Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
- Enoxaparina sódica da Aventis Intercontinental (Maisons, Alfort, França);
- Kit Annexin V Apoptosis Detection para realização da citometria de fluxo (Anenexin-
FITC, Iodeto de Propídeo-PercP), desenvolvido pela AffymetrixTM e Bioscience Inc.
(San Diego, CA, EUA)
- Agitador orbital modelo 255-B, banhos-maria e estufas de temperatura constante da
FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
- Agitador de tubos mod. AP 56 da Phoenix Ltda. (Araraquara, SP, Brasil);
- Balanças analítica e de precisão da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil), Mark S3102
(Bel engineering) e da Marte, modelo AY200 (MG, Brasil);
- Câmara para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e col.
(1968) (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP, Brasil);
- Centrífugas refrigeradas CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltd. (Tóquio, Japão), 5804R da
Eppendorf AG (Hamburg, Alemanha) e Sorvall Legand XTR da Thermo scientific (AM-
Kalberg, Alemanha);
- Centrífuga para tubos – QUIMIS C Lab. Comércio para laboratório LTDA. Natal – RN
– Brasil;
- Liofilizador, FreeZone Plus 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System, da
Labconco (Kansas City, MO, USA);
- Fontes de corrente contínua regulável Power Supply modelo LPS-400V da Loccus
Biotecnologia (Cotia, SP, Brasil) e Power Pac modelo HC-250V da Bio-Rad (Califórnia,
EUA);
- Espectrofotômetros Femto 700 plus, Femto Ind. Co. Instrumentos Ltda. (São Paulo,
SP, Brasil) e Leitor de microplacas Epoch-Biotek com software Gen5 versão 2.0
(Winooski, VT, EUA);
- Espectrôfotômetro de infravermelho Shimadzu FTIR-8400S e software IRSolution
1.60SU1 da Shimadzu (Japão);
- Espectrômetro de RMN Bruker Avance III 500 MHz (Brucker Biospin Corporation,
Billerica, MA, EUA);
- Medidor de pH Orion Research, modelo 701 A/digital lonalyzer (Cambridge, MA,
EUA);
45
- Coagulômetro automático Clot Quick Timer série 2480 adquirido da DRAKE
eletrônica e comércio LTDA (São José do Rio Preto, SP, Brasil);
- Bomba a vácuo da TECNAL modelo TE-058 (Piracicaba, SP, Brasil).
- Sistema HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) LaChrom Elite
System HPLC versão L-2490, da empresa Hitachi Ltd. Corporation (Chiyoda, TKY,
Japão) com coluna LiChroCART® 250-4 LiChrospher® 100 NH2 (10 μm) acoplada.
- Sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) ÄKTA Protein Purification
Systems com coluna Hiprep 16/60 Sephacryl-S300 da empresa GE Healthcare Life
Sciences (Little Chalfont, Bucks, Reino Unido);
- Bancadas de Fluxo Laminar Pachane Pa300 (Piracicaba, SP, Brasil) e VECO modelo
VLFS-12, série FL-8081 (Campinas, SP, Brasil);
- Destilador de água MA-270 da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
- Incubadora de CO2 LABOVEN L212 (Ribeira Preto, SP, Brasil);
- Microscópio invertido NIKON ECLIPSE TE300 da NIKON CORPORATION
(Shinagawa-ku, Tokyo, Japan);
- Placas para cultura da SR life sciences e da NEST Biotech Co. Ltd.(IONLab Equip.
Sup. Laborat. Hosp. LTDA) (PR, Brasil);
- Sistema de Ultrapurificação de água NanoPure 7148 da Thermo scientific (Waltham,
MA, EUA;
- Citômetro de fluxo FACSCANTO II da BD Biosciences (San Jose, CA, USA);
- Sonicador da série USC-1600 de 3,8 litros de capacidade da empresa Ciencor
Axygen® Brand Products (Union City, CA, EUA).
2.1.2. Linhagens Celulares
As linhagens celulares utilizadas nos ensaios envolvendo culturas de células
foram as seguintes:
- Macrófagos/monócitos murinos (RAW 264.7 – ATCC TIB-71), adquirida do banco de
células da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil;
- Fibroblastos murinos (3T3 – ATCC CCL-92), células de carcinoma hepatocelular
humano (Hep G2 – ATCC HB-8065) e células de adenocarcinoma renal humano (786-
0 – ATCC CRL-1932), estas últimas doadas por Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da UFRN, Brasil.
46
- Células de melanoma murino (B16F10 -- ATCC CRL-6475), doadas pelo Prof. Dr.
Edvaldo da Silva Trindade, do Departamento de Biologia Celular, da Universidade
Federal do Paraná.
As células das linhagens de fibroblastos, macrófagos/monócitos, carcinoma
hepatocelular e de melanoma foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco`s Modified
Eagle`s Medium) e as células da linhagem de adenocarcinoma renal em meio RPMI
(Roswell Park Memorial Institute), ambos os meios da Gibco Life Tecnologies do Brasil
(Itapevi, SP, Brasil), de acordo com a necessidade nutricional de cada linhagem. Os
meios foram suplementados com soro fetal bovino (SFB) a 10% (v/v), adquirido da
empresa Cultilab (Campinas, SP, Brasil), e com os antibióticos penicilina
(10.000U/mL) e estreptomicina (10 mg/mL), diluídos em solução de cloreto de sódio
(0,9%), da empresa Sigma Checal Co. St. Louis, MO, EUA).
47
2.2 MÉTODOS
2.2.1. Obtenção da Macroalga Marinha
As algas foram coletadas na praia de Búzios (6°.00’50.72” Sul / 35º.10’.83,52” Oeste)
/ Nísia Floresta, litoral do Rio Grande do Norte.
Figura 5 - Alga marinha Lobophora variegata (J.V.Lamouroux)
Fonte: Autoria própria.
A classificação taxonômica da alga L. variegata está descrita a seguir:
Domínio: Eukaryota;
Reino: Chromalveolata;
Filo / Divisão: Stramenopiles (ou Heterokontophyta);
Classe: Phaeophyceae;
Ordem: Dictyotales;
Família: Dictyotaceae;
Género: Lobophora;
Espécie: L. variegata;
48
2.2.2. Extração de Polissacarídeos
Após serem coletadas, as algas foram processadas como se segue: após
serem limpas com água para remoção de areia e epífitas, secas a 45 °C em estufa
aerada e posteriormente trituradas, o material algal foi tratado com 20 volumes (10 x
2 v) de etanol P.A. para despigmentação e delipidação do material. A mistura etanol-
alga foi decantada, e o resíduo colocado para secar sob aeração (25°C), após seco o
material algal (nesse momento chamado de pó etanólico) foi pesado para cálculos de
rendimento. Ao pó etanólico foram adicionados 2 volumes de NaCl 0,25 M, sendo o
pH ajustado para 8,0 com NaOH. A este material foi adicionado a enzima proteolítica
Prozima (15 mg de enzima por grama de pó etanólico), incubando-se a 60 °C por 16
horas. Em seguida a suspensão foi centrifugada a 8.000 x g por 20 minutos. O
precipitado foi desprezado e o sobrenadante foi denominado de Fração Total (FT). A
FT foi fracionada pela adição de volumes crescentes de acetona (0,3v, 0,5v, 0,8v,
1,0v, 1,5v e 2,0v) (como descrito por ROCHA et al., 2005), entre cada adição a
suspensão polissacarídica foi centrifugada (4 °C / 8.000 x g / 20 min) e o precipitado
coletado. Cada precipitado é descrito como uma fração polissacarídica e cada fração
foi denominada de acordo com o volume de acetona que provocou sua precipitação,
assim obteve-se seis frações ricas em polissacarídeos denominadas de F0,3; F0,5;
F0,8; F1; F1,5 e F2. As frações obtidas, depois de secas, foram pesadas para
realização do cálculo de rendimento.
2.2.3 Eletroforese em Gel de Agarose
Aliquotas (5 μL a 10 mg/mL) das amostras foram aplicadas no gel de agarose
0.6% preparado com 0.05 M do tampão 1.3 diaminopropano acetato, pH 9.0 e
submetidas a eletroforese a 100 V por 45 minutos (DIETRICH; DIETRICH, 1976) com
fonte BIO-RAD modelo PowerPac HC. Em seguida os compostos foram fixados ao gel
com 0,01% de brometo de N-cetyl-N-N-N-trimetilamonio por, no mínimo, 2 horas. Após
ser seco e corado com azul de toluidina 0,1%, o gel teve o excesso de corante
removido com a solução solvente de 1 % de ácido acético, 50 % de etanol e 49 % de
água e o gel foi seco à temperatura ambiente.
49
2.2.4 Composição Química
3.2.4.1. Determinação de açúcares totais
Açúcares totais foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico
(DUBOIS et al., 1956), empregando-se como padrão D-glicose ou D-galactose para
obtenção de equação da reta. As leituras foram realizadas a 490 nm (n=3).
2.2.4.2. Determinação de proteínas
O método de Bradford (1976) foi usado para avaliação da quantidade de
proteínas presentes nas amostras (n=3) utilizando o reagente Coomassie brilliant blue
R-250) (BRADFORD, 1976), com análise da absorbância a 595 nm. Curva padrão
com albumina sérica bovina foi realizada para obtenção da equação da reta para
análise quantitativa de proteínas nas frações polissacarídicas obtidas.
2.2.4.3. Determinação de sulfato
O teor de sulfato foi determinado após hidrólise ácida (HCl 6 N, 6 h, 100°C) por
turbidimetria pelo método da gelatina-bário (DODGSON & PRICE, 1962). Curva
padrão com sulfato de sódio (1 mg/mL) foi realizada para obtenção da equação da
reta para análise quantitativa de sulfato nas frações (n=3) polissacarídicas obtidas.
2.2.4.4. Determinação de compostos fenólicos
O reagente de Folin-Ciocalteau (100 µL) foi usado para identificação e
quantificação de compostos fenólicos (COSTA et al., 2010) na amostra (2 mg em 1600
µL, n=3). Após adição de Na2CO3 20% (p/v) aos tubos, estes foram submetidos a 40
°C, por 20 minutos, em banho-maria. A solução resultante da reação foi analisada por
espectrofotometria a 765 nm. Curva padrão com ácido gálico foi realizada para
obtenção da equação da reta, com o objetivo de usá-la para determinação da
quantidade de compostos fenólicos na amostra.
2.2.4.5. Determinação de ácidos urônicos
A quantidade de ácidos urônicos foi determinada pelo método de Dische
(1946). Após adição de 250 µg de amostra diluída 1 µg/µL em tubo de ensaio, foi
adicionado 1,5 mL de ácido sulfúrico. Esta etapa ocorre com os tubos de reação
estando em banho de gelo. Em seguida os tubos foram levados ao banho-maria por
50
15 minutos a 100 °C. Posteriormente os tubos foram colocados em banho de gelo
novamente e, após adição de 50 µL de carbazol aos tubos, estes foram incubados por
1 hora a temperatura ambiente. Em seguida foram agitados e as absorbâncias foram
lidas a 525 nm. Curva padrão com ácido glucurônico para obtenção da equação da
reta, com o objetivo de usá-la para determinação da quantidade de compostos
urônicos equivalentes na amostra (n=3).
2.2.5. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
O método descrito por Magalhães e colaboradores (2011) foi usado para
determinação da composição de açúcar, onde (i) polissacarídeos (1 mg) foram
hidrolisados com 2 M de HCl por 2 horas a 100 °C, seguido de (ii) etapas de
purificação e concentração (ressuspenção, neutralização e secagem sob pressão
reduzida [bomba a vácuo Tecnal modelo TE-O58]) e, em seguida, a amostra foi
submetida a cromatografia para (iii) cromatografia com uma coluna LichroCART®
250-4 (250 mm × 40 mm) acoplada a um HPLC da LaChrom Elite® com sistema VWR-
Hitachi e detector de índice de refração (modelo L-2490). Os açúcares, L-fucose, D-
xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose foram usados como padrões.
2.2.6. Cromatografia de Exclusão Molecular em FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography)
Para separação de polissacarídeos por tamanho molecular foi usada uma
coluna de gel filtração Hiprep 16/60 Sephacryl-S300 acoplada a um FPLC tipo
AKTApurifier com sistema CORNEON 5.11 acoplado a um coletor Frac-900 e fluxo de
0,5 mL/min. A amostra (50 mg/mL) diluída em tampão acetato de sódio (0,05 M pH
5,0) mais NaCl (0,15 M). A eluição foi realizada com o sistema de tamponamento
acetato de sódio 0,05 M pH 5 mais NaCl 0,15 M. Através do monitoramento do
conteúdo de açúcares totais presentes no eluato, pelo método do fenol/ácido sulfúrico
(DUBOIS, 1956), foi gerado um gráfico, onde os picos existentes foram divididos em
9 grupos e os conteúdos dos tubos referentes a cada grupo foram reunidos e
liofilizados. Soluções dessas amostras (5 µL a 10 mg/mL) foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose (DIETRICH; DIETRICH, 1976) afim de se identificar o
perfil eletroforético dos polissacarídeos presentes nas amostras. Dextranas com
diferentes massas moleculares (7, 40, 70, 100 e 500 kDa, 10 mg/mL cada) foram
utilizados como padrões para análise do perfil de eluição.
51
2.2.7. Dispositivo de Separação por Tamanho Molecular (Amicon® Ultra-15
Centrifugal Filter)
A fração 1 (100 mg) foi diluída em água e submetida a fracionamento utilizando-
se de dispositivos de separação por tamanho molecular (Amicon®Ultra-15 Centrifugal
filter) que apresentam membranas com poros de tamanhos específicos (100, 50, 30 e
10 kDa). O uso destes dispositivos foi associado à centrifugação (4500 g / 20 minutos).
As amostras obtidas foram liofilizadas e posteriormente acondicionadas em frascos
fechados e à temperatura ambiente até serem analisadas quanto ao perfil
eletroforético em gel de agarose (DIETRICH; DIETRICH, 1976) e a composição
química de açúcares (DUBOIS et al., 1956), proteínas (BRADFORD, 1976), sulfato
(DODGSON; PRICE, 1962) e compostos fenólicos (COSTA et al., 2010).
2.2.8. Ensaios de Atividade Antioxidante
A capacidade antioxidante dos polissacarídeos obtidos (F1-5, F1-20, F1-4-,
F175 e F1>100) foi analisada por ensaios que tiveram finalidades de avaliar atividades
de redução e sequestro de radicais livres gerados em sistemas in vitro (radicais ABTS,
superóxido [O2•-] e hidroxila [OH•]) e quelação de metais de transição (ferro e cobre).
2.2.8.1. Ensaio de sequestro de radicais ABTS+
A atividade antioxidante de captura dos radicais ABTS+ (2,2´azinobis-3-
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) foi realizado de acordo com Re e colaboradores
(1999), usando soluções estoques de ABTS (7 mM) e persulfato de potássio (140
mM). O radical ABTS+ foi gerado a partir da reação de 88 µL da solução de persulfato
de potássio com 5 mL da solução estoque de ABTS. A mistura foi mantida no escuro,
à temperatura ambiente, por 16 horas. Em seguida, 1 mL desta mistura foi diluída em
álcool etílico até obter-se uma absorbância de 0,70 ± 0,05 a 734 nm (reagente de uso).
Com o reagente de uso (150 µL) procedeu-se a análise de atividade redutora de
ABTS+ dos polissacarídeos (50 µL, 1 e 10 µM, n = 3). Controle interno com trolox foi
realizado para atestar a qualidade da reação. Controle (branco) foi usado para
obtenção de percentual de atividade. Para expressar os dados em valores percentuais
de sequestro de radicais ABTS+ (%S ABTS+) a seguinte fórmula foi usada:
%S ABTS+= (Ac – Aa / Ac) * 100
Onde, Ac é a absorbância do controle (branco) e Aa é a absorbância da
amostra.
52
2.2.8.2. Ensaio de sequestro de radicais superóxido
O sequestro de radicais superóxido (O2•-) foi analisado juntando-se 800 µL um
sistema formador deste radical (COSTA et al., 2010) e 200 µL da amostra (0,1; 1 e 10
µM, n=3). Controle interno com ácido gálico foi realizado para atestar a qualidade da
reação. Controle (sem antioxidantes) e branco (sem metionina) foram realizados para
obtenção de percentual de atividade. Para expressar os dados em valores percentuais
de sequestro de radicais superóxido (%S O2•-) a seguinte fórmula foi usada:
%S O2•-= (Ac – Aa / Ac - Ab) * 100
Onde, Ac é a absorbância do controle, Aa é a absorbância da amostra e Ab é
a absorbância do branco.
2.2.8.3. Ensaio de sequestro de radicais hidroxila
O sequestro de radicais hidroxila (OH•) foi analisado através de sistema
produtor desse radical (800 µL) (COSTA et al., 2010) mais 200 µL de amostra (0,1; 1
e 10 µM, n=3). Controle interno com ácido gálico foi realizado para atestar a qualidade
da reação. Controle (sem antioxidantes) e branco (sem H2O2) foram realizados para
obtenção de percentual de atividade. Para expressar os dados em valores percentuais
de sequestro de radicais hidroxila (%S OH-) a seguinte fórmula foi usada:
%S OH-= (Ac – Aa/Ac - Ab) * 100
Onde, Ac é a absorbância do controle, Aa é a absorbância da amostra e Ab é
a absorbância do branco.
2.2.8.4. Ensaio de quelação de ferro
Em tubos de hemólise foram adicionadas as amostras (0,01 – 0,4 µM, n=3)
diluídas em 910 μL de água ultrapura, 30 μL de cloreto de ferro (Cl2Fe, 2 mM) e 60 μL
de ferrozina (5 mM) (COSTA et al., 2010; MELO et al., 2013). Em seguida os tubos
foram agitados e incubados à 37 °C por 10 minutos, posteriormente suas
absorbâncias foram avaliadas a 562 nm. Controle interno com EDTA foi realizado para
atestar a qualidade da reação. Controle (sem antioxidantes) e branco (sem ferrozina)
foram realizadas para obtenção de percentual de atividade. Para expressar os dados
em valores percentuais de quelação de ferro (%Q Fe+2) a seguinte fórmula foi usada:
%Q Fe+2= (Ac – Aa / Ac - Ab) * 100
Onde, Ac é a absorbância do controle, Aa é a absorbância da amostra e Ab é
a absorbância do branco.
53
2.2.8.5. Ensaio de quelação de cobre
Em placa de 96 poços foram adicionadas as amostras (0,01 – 0,4 µM, n=3)
diluídas em 230 μL de tampão acetato (50 mM pH 6,0), 6 μL do reagente violeta de
pirocatecol (4mM) e 100 μL da solução de sulfato de cobre II (50 μg/mL), seguido por
homogeneização e leitura à 632 nm (QUEIROZ et al., 2015). Controle interno com
EDTA foi realizado para atestar a qualidade da reação. Controle (sem antioxidantes)
e branco (sem violeta de pirocatecol) foram realizadas para obtenção de percentual
de atividade. Para expressar os dados em valores percentuais de quelação de cobre
(%Q Cu+2) a seguinte fórmula foi usada:
%Q Cu+2= (Ac – Aa / Ac – Ab) * 100
Onde, Ac é a absorbância do controle, Aa é a absorbância da amostra e Ab é
a absorbância do branco.
2.2.9. Ensaio de Atividade Anticoagulante
Ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) foi realizado com Kit
APTT da Labteste utilizando o coagulômetro Draker modelo Clot Quick-Timer série
2480, como descrito por Albuquerque e colegas (2004), utilizando plasma humano
tratado com citrato (3,8%). A enoxieparina (Clexane®) (7 mM), um derivado da
heparina que apresenta baixa massa molecular (~6 kDa), foi o controle positivo. Os
polissacarídeos (1 e 10 µM, n = 3) foram analisados e os resultados foram expressos
em termos de razão de TTPa (R TTPa), como segue:
R TTPA= tempo de TTPaa / tempo de TTPac
Onde TTPaa é o tempo da amostra e TTPac é o tempo do controle (neste, foi
adicionado apenas água destilada).
2.2.10. Ensaio para Determinação da Viabilidade de Linhagens de Células pelo Ensaio
de Redução do MTT
Cinco linhagens celulares (RAW-264.7 [macrófagos], 3T3 [fibroblastos],
HEPG2 [carcinoma hepático], 786-0 [carcinoma renal] e B16F10 [melanoma]) foram
plaqueadas (5 x 103 célula/poço; 37 °C por 24 h, n = 3) em placas de 96 poços e, após
aderência (24 horas) e carenciamento (24 horas), foram incubadas por mais 24 horas
a 37 °C na presença dos polissacarídeos F1-5, F1-20, F1-40, F1-75 e F1>100 em
diferentes concentrações (0,1; 1 e 10 µM, n=3), diluídos em meio DMEM ou RPMI
acrescidos de 10% de soro fetal bovino. Após incubação o meio foi removido e 100
54
μL de uma solução 1 mg/mL de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl
tetrazolium bromide) diluído em meio DMEM, foram adicionados a cada poço e a placa
foi incubada a 37 °C por 4 h. Esse ensaio avalia a capacidade de enzimas
mitocondriais oxidorredutases em reduzir o MTT a cristais de formazan (MOSMANN,
1983). Após as 4 h de incubação o sobrenadante foi removido e foram adicionados
100 μL de etanol 96% (v/v), seguido da homogeneização da placa e mensuração da
absorbância a 570 nm para avaliação da solubilização dos cristais de formazan
formados. As células que foram utilizadas para análise do controle das reações foram
incubadas somente em meio de cultura (n = 3). O percentual de redução do MTT a
formazan (%R) foi calculado como segue
%R = (Aa /Ac) * 100
Onde Aa é a absorbância da amostra e Ac é a absorbância do controle
(considerada como 100% da redução do MTT a formazan) obtidas a 570 nm.
2.2.11. Ensaios para Determinação de Atividade Imunomoduladora
2.2.11.1. Ensaio para determinação de óxido nítrico (ON) em meio de cultura de
células RAW 264.7
Macrófagos RAW 264.7 foram mantidos em cultura a 37 °C, 5% de CO2, em
placas de cultura com 24 poços (3x105 macrófagos/poço; n=3), e volume total final de
0,4 mL de meio de cultura DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium) mais 10%
de soro fetal bovino. Após aderência das células por 24 horas prosseguiu-se o
carenciamento por mais 24 horas. Só então as células foram submetidas ao estresse
com lipopolissacarídeo (LPS, 2 μg/mL/poço, controle positivo), ou ao estresse com
LPS (2 μg de LPS/mL/poço) mais os polissacarídeos F1-5 ou F1-20 ou F1-40 ou F1-
75 ou F1>100 (0,1; 1 e 10 µM, n=3), ou somente aos polissacarídeos (0,1; 1 e 10 µM,
n=3) ou não submetidas a estresse ou fração polissacarídica alguma (controle). Após
24 horas, 100 μL de sobrenadantes das culturas celulares foram removidos e
adicionados aos poços de placa de 96 poços, 100 μL do reagente de Gries foram
adicionados a cada poço e, após 5-10 minutos de incubação a temperatura ambiente,
a leitura do resultado foi realizada a 540 nm (GREEN et al., 1982). O nitrato de sódio,
em diferentes concentrações, foi utilizado para gerar uma curva padrão utilizada como
controle interno. O percentual de produção de NO (%NO) foi obtido de acordo com a
seguinte fórmula:
55
%NO = (Aa /Ac) * 100
Onde, Aa é absorbância do teste com LPS, ou LPS mais polissacarídeos ou
polissacarídeos e Ac é a absorbância do controle.
2.2.11.2. Ensaio para determinação de citocinas em meio de cultura de células RAW
264.7
O ensaio para avaliação da quantidade de citocinas foi realizado como descrito
por Alves e colaboradores (2015). Para tanto, macrófagos da linhagem RAW 264.7
foram incubados por 24 horas a 37 °C, 5% de CO2, em placas de cultura com 24 poços
(3 x 105 células/poço; n=3) com volume total final de 0,4 mL. Decorrido esse tempo,
estando as células já aderidas a placa, elas foram carenciadas por mais 24 horas.
Transcorridas as 24 horas de carenciamento, o meio de cultura foi removido e foram
adicionados mais 0,4 mL de DMEM acrescido de 10% (v/v) de soro fetal bovino com
10 µM dos polissacarídeos F1-5, F1-20, F1-40, F1-75 e F1>100 (n=3) obtidos da alga
Lobophora variegata ou apenas 0,4 mL de DMEM acrescido de 10% (v/v) de soro fetal
bovino (controle negativo). Após 24 horas, os sobrenadantes das culturas celulares
foram removidos e submetidos a análises dos teores de citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-
10, IL-17A, IFNγ e TNFα usando o kit comercial Cytometric Bead Array (CBA) Mouse
Th1/Th2/Th17 Cytokine (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
2.2.12. Ensaios para Avaliação do Processo de Apoptose por Citometria de Fluxo
Este ensaio consiste na marcação quantitativa de células apoptóticas (que
externalizam os fosfolipídeos fosfatidilserina, normalmente expostos ao conteúdo
citoplasmático) e/ou células necróticas (membrana citoplasmática rompida tornando-
se permeáveis a grandes partículas) com os respectivos marcadores: Anexina V
conjugado ao fluoróforo FITC (apresenta grande afinidade pela fosfatidilserina
esternalizada) (Kit de detecção da apoptose (AffymetrixTM eBioscience) e o Iodeto de
propídeo (IP, que permeabiliza e se liga ao DNA). Neste ensaio as células da linhagem
B16F10 (2x105 células/poço) foram cultivadas em placas de 6 poços, utilizando-se
como meio de cultura o DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% (v/v), após
24 horas de aderência foram carenciadas por mais 24 horas. Após esse tempo as
células foram expostas a glucana F1-20 (10 µM, n=3) por 24 horas. Em seguida as
células foram removidas da placa com auxílio de tripsina, colocadas em tubos cônicos
e centrifugadas (4000g por 5 minutos a 4°C). Em seguida as células foram
56
ressuspendidas com tampão fosfato (PBS) seguidas de concentração por
centrifugação (4000 xg por 5 minutos a 4°C), seguido de ressupenção em tampão de
ligação (10 mM HEPES/NaOH, 140 m M NaCl, 2.5 mM CaCl2, pH 7.4) do kit, sendo
em seguida expostas aos marcadores Anexina-FITC (5 μL, 1 mg/mL) e PI (10 μL, 4
mg/mL) a temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, 300 μL do tampão
de ligação foi adicionado em cada tubo. As células foram imediatamente levadas para
análise em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems) e os
dados foram analisados com o software FlowJo versão 6.
2.2.13. Ensaio para Avaliação de Ciclo Celular
Este ensaio consiste na quantificação de DNA marcado por Iodeto de propídeo
em citômetro de fluxo. Esse ensaio apresenta as mesmas etapas de tratamento das
células do ensaio de morte celular, diferindo apenas nas etapas posteriores, em que
passado o tempo de tratamento de 24 horas, as células foram removidas da placa
(com tripsina) e colocadas em tubos cônicos, fixadas (com álcool 70% [v/v], 1 hora) e,
após serem rompidas (90 µL de triton-X 1% [v/v]) e terem seus RNAs clivados como
o usos de RNAase (10 µL, 4 mg/mL) foram incubadas por 1 hora a 37°C. Decorrido o
tempo de incubação foi adicionado 5 µL (4 mg/mL) de iodeto de propídeo em cada
tudo, menos em um tudo (controle não marcado). Em seguida 200 µL de tampão
fosfato (PBS) foi adicionado e as amostras foram levadas para leitura no citômetro de
fluxo. Os dados foram adquiridos em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD
Immunocytometry Systems) e analisado com o software FlowJo versão 6.
2.2.14. Análises Espectroscópicas
2.2.14.1. Espectroscopia de infravermelho
As amostras de polissacarídeos (5 mg) foram analisadas por espectroscopia
de infravermelho em espectrômetro Shimadzu FTIR-8400S, da série IRAffinity-1.
Foram realizadas 30 varreduras para cada amostra, na faixa: 4000 a 400 cm-1. Foi
usado brometo de potássio (KBr) misturado às amostras para formar pastilhas que só
então foram analisadas. As imagens dos espectros e as correções da linha de base
foram realizadas com o programa IRSolution versão 1.60SU1 (Shimadzu).
57
2.2.14.2. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear – RMN
A espectroscopia de RMN foi conduzida em um espectrômetro BRUKER
AVANCE III - 500 MHz (11,75 T) (Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA, USA), em
água deuterada (D2O) 99,9% e as análises foram realizadas a 70 ºC. O preparo da
amostra foi conduzido segundo protocolo do laboratório de análise, 20 mg da amostra
foi solubilizada em 0,5 mL de D2O e então centrifugada. Apenas o sobrenadante foi
transferido para tubos de RMN de 5 mm e então submetido às análises estruturais por
ressonância magnética nuclear uni (1H e 13C) e bidimensionais (COSY e HSQC). Os
deslocamentos químicos, expressos em δ (ppm), foram determinados utilizando
dimetil-sulfóxido (DMSO) com δ de 2,67 e 39,9 ppm para 1H e 13C, respectivamente,
de acordo com as recomendações da IUPAC. Os experimentos bidimensionais: 1H-1H
COSY e 1H-13C HSQC foram utilizados para os assinalamentos dos deslocamentos
químicos do composto isolado e, posteriormente, sua caracterização estrutural. Todos
os espectros, uni e bidimensionais, foram analisados utilizando o software TopSpin
versão 2.1.
2.2.15. Análises estatísticas
Todos os dados foram expressos como média ± desvio padrão (n=3). Análise
de variância para verificação do quão significante foram as diferenças entre os grupos
foi realizada com o teste de ANOVA. O teste de Tukey-Kramer (p < 0.05) foi utilizado
para resolver semelhanças encontradas pelo ANOVA. Todos os testes foram
realizados com software InStat versão 3.05 da GraphPad software (La Jolla, CA,
USA).
58
3. RESULTADOS
3.1. EXTRAÇÃO, FRACIONAMENTO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Através do procedimento de obtenção dos polissacarídeos realizado nesse
trabalho, como descrito em métodos, foi possível obter seis frações ricas em
polissacarídeos da alga Lobophora variegata. Na Tabela 5 é mostrado o rendimento
do processo de extração das amostras, onde pode-se observar que a maior parte do
material se concentrou nas frações F0,8; F1 e F1,5, com destaque para a fração F1,
que correspondeu a aproximadamente 52% do material obtido. Os teores de açúcares
totais das frações obtidas variaram entre 49,6 a 66,2 %, com destaque novamente
para essas três frações, e novamente a F1 ficou em evidência, pois foi a fração que
apresentou o maior teor de açúcares totais. Contudo, quando se verifica o teor de
sulfato, observa-se que a distribuição foi bem heterogênea e os valores variaram entre
13,2 a 36,6%.
Tabela 5 - Rendimento de extração e composição das frações polissacarídicas obtidas com a etapa de precipitação diferencial com acetona.
nd = não detectado, tr = traços. Fonte: Autoria própria.
As proteínas nas frações, que neste caso são consideradas contaminantes,
foram detectadas em baixas quantidades, e o destaque ficou com a F1, fração em que
se encontrou muito baixa quantidade de proteínas (0,03%).
Todas as frações apresentaram os monossacarídeos galactose, glucose,
fucose e ácido urônico. Contudo, as proporções entre eles se apresentaram diferentes
em cada fração. Na fração F0,3 observa-se que cerca de 75% de sua constituição é
formada por ácidos urônicos. Este monossacarídeo também foi encontrado em grande
quantidade na F0,5, perfazendo cerca de 27% do total, o destaque dessa fração é o
59
teor dos diferentes monossacarídeos, que no caso, são muito semelhantes, e
observa-se que fucose e glicose correspondem a cerca de 26% e galactose em 21%.
As frações F0,8 e F1 são as frações em que se encontrou o maior teor de glicose em
sua composição e a principal diferença entre elas é que o teor de ácido urônico na
fração F0,8 é de quase 4 vezes maior do que em F1. Os maiores teores de fucose e
galactose foram encontrados nas frações F1,5 e F2.
3.2. PURIFICAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA FRAÇÃO F1 GUIADA POR
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
A mobilidade dos componentes glicídicos encontrados nas frações extraídas
com acetona foi avaliada por eletroforese em gel de agarose como descrito em
métodos. Pode-se observar na Figura 6 que as frações F0,3; F0,5 e F0,8 apresentam
um ou mais componentes que se coloriram intensamente com o azul de toluidina, o
que indica que essas frações são ricas em polissacarídeos sulfatados, o que não
aconteceu com as outras três frações.
Figura 6 – Foto da lâmina de eletroforese em gel agarose e tampão PDA (1,3-diaminopropano
acetato, pH 9,0), das amostras obtidas da alga L. variegata. O extrato bruto e as frações (50 g de
cada) obtidas a partir desse utilizando-se acréscimo de diferentes volumes propanona, foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0,05M, pH 9,0. A visualização dos
polissacarídeos foi feita com azul de toluidina. Para maiores detalhes ver métodos.
Fonte: Autoria própria
A partir dos dados das análises químicas e da eletroforese observa-se que a
fração F1 é rica em polissacarídeos neutros, como também, apresenta
polissacarídeos sulfatados em menor quantidade. Além disso, essa fração foi obtida
em maior quantidade (rendimento, tabela 5). Como o intuito do trabalho é obter
glucanas da alga em questão, a fração F1 foi escolhida para os próximos passos de
purificação das glucanas.
60
A fração F1 foi então submetida a cromatografia de exclusão molecular, que foi
monitorada por dosagens de açúcares totais e presença de sulfato, o que resultou na
identificação de sete picos cromatográficos (Figura 7). Porém, um deles apresentou
uma base muito larga, e, portanto, foi dividido em três picos, o que fez com que se
obtivesse nove subfrações, denominadas G1 – G9. Estas subfrações foram
submetidas a eletroforese em gel de agarose, e na Figura 8 mostra-se o perfil
eletroforético obtido a partir desse procedimento. Pode-se observar que o material que
se corou com o azul de toluidina (polissacarídeos sulfatados) encontra-se
principalmente nas subfrações G3, G4 e G5. Nas demais frações não se observa
bandas coloridas intensamente com o azul de toluidina, indicando a presença de
polissacarídeos neutros. Além disso, pode-se afirmar que esses polissacarídeos
neutros têm massas moleculares bem diferentes. Há aqueles com massa molecular
acima de 100 kDa (G1 e G2), e que ocorrem em baixa quantidade, e aqueles com
massa molecular que compreende uma faixa de 70 a 5 kDa (G6 – G9).
Figura 7 - Perfil de eluição dos polissacarídeos presentes na fração F1 após cromatografia de exclusão molecular. A eluição do material foi acompanhada por dosagem de açúcares totais (como descrito em métodos). Setas indicam posições de padrões de dextranas (1 = 100 kDa; 2 = 70 kDa). Fonte: Autoria própria.
61
Figura 8 – Foto da lâmina de eletroforese em gel agarose e tampão PDA (1,3-diaminopropano acetato, pH 9,0), do material obtido em cada grupo (G1 – G9) (5µL a 10 mg/mL) cromatográfico. Para maiores detalhes ver métodos. Fonte: Autoria própria.
Diante deste fato utilizou-se dispositivos de separação por tamanho molecular
para separar os componentes da F1, como descrito em métodos, já que esses
dispositivos proporcionam rápida obtenção de uma maior quantidade de material após
o processo de purificação. Assim, foram obtidas cinco subfrações, que foram
denominadas de F1-5; F1-20; F1-40; F1-75; F1>100. O perfil eletroforético dessas
frações pode ser visualizado na Figura 9.
Figura 9 – Foto da lâmina de eletroforese em gel agarose e tampão PDA (1,3-diaminopropano acetato, pH 9,0), das subfrações (5µL a 10 mg/mL) de F1 (5µL a 100 mg/mL) obtidas com os dispositivos de separação por tamanho molecular. Para maiores detalhes ver métodos. Fonte: Autoria própria.
Verifica-se que a fração F1>100 corou-se intensamente com azul de toluidina,
além dela, a fração F1-75 também se corou com esse corante, mas, neste caso a
intensidade da coloração obtida foi muito mais baixa em comparação com aquela
observada com F1>100. As demais frações não se coraram com azul de toluidina.
Para confirmar a separação de moléculas de polissacarídeos neutros e
polissacarídeos sulfatados com esse procedimento, as frações foram analisadas com
62
relação ao teor de açúcares totais, sulfato, bem como, com relação a sua composição
monossacarídica. Os dados são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6 - Rendimento e composição das frações polissacarídicas obtidas do processo de separação
por tamanho molecular
nd = não detectado.
Fonte: Autoria própria.
Todas as frações são ricas em polissacarídeos e os teores de açúcares
observados entre as frações são semelhantes. Por outro lado, o teor de sulfato foi
bem diferente entre as frações. Na verdade, há dois grupos de frações, aquelas com
baixo teor de sulfato (F1-5; F1-20; F1-40) e aquelas ricas em sulfato, como F1-75 e,
principalmente, F1>100. Não foram detectadas proteínas e compostos fenólicos nas
frações. Quando se observa a composição monossacarídica, as frações de baixo teor
de sulfato são compostas exclusivamente de glucose, já as frações mais sulfatadas
(F1-75 e F1>100) apresentam, além da glucose, galactose e fucose.
Estes dados, em conjunto, mostram que as glucanas (F1-5, F1-20 e F1-40) são
encontradas principalmente nas frações de baixa massa molecular. Em contrapartida,
as heterofucanas (F1-75 2 F1>100) são encontradas nas frações de maior massa
molecular. Todas essas frações foram submetidas a análises de suas propriedades
biológicas em ensaios de atividades antioxidantes, citotóxicas e imunomoduladoras,
como descrito a seguir.
3.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS GLUCANAS (F1-5, F1-20 E
F1-40) E DAS HETEROFUCANAS (F1-75 E F1>100) OBTIDAS DA ALGA L. variegata
O processo de formação espécies reativas ocorre através de uma reação em
cadeia envolvendo três fases (iniciação, propagação e terminação), em que os
antioxidantes atuam através de vários mecanismos. Assim, utilizou-se métodos
diferentes para avaliar o efeito das frações de glucanas e de heterofucanas extraídas
63
de L. variegata nos diferentes estágios de iniciação (ensaio de redução do radical
ABTS+), de propagação (ensaio de quelação de cobre e de ferro) e de terminação
(ensaio de sequestro do radical superóxido e de hidroxila). Além disso, por questão
de comparação entre as frações polissacarídicas, estas foram avaliadas utilizando-se
a mesma concentração molar, e não se utilizando a mesma massa, como é comum
ser observado em outros trabalhos que avaliam atividade antioxidante de
polissacarídeos de algas. Dessa forma, garante-se que os polissacarídeos sejam
avaliados com o mesmo número de moléculas.
3.3.1. Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Atividade de Sequestro de
Radicais ABTS+, Superóxido e Hidroxila
Os resultados apresentados na Tabela 7 revelam que, independente da
concentração utilizada, as heterofucanas foram mais potentes agentes
sequestradores de radical ABTS+ do que a glucanas. No caso da concentração de 10
µM, as heterofucanas F1-75 e F1>100 apresentaram atividades de aproximadamente
26 e 27%, respectivamente. Atividades essas cerca de cinco vezes maiores do que
as atividades encontradas com as glucanas F1-20 e F1-40 e cerca de 13 vezes
maiores que a atividade obtida com a glucana F1-5.
64
Tabela 7 - Percentual de sequestro de radicais determinado para as amostras.
Os valores de sequestro dos radicais superóxido (O2
•-), hidroxila (HO•) e ABTS+ estão representados pelas médias ± desvio padrão (n=3) de cada concentração (0,1; 1 e 10 µM) dos polissacarídeos. Os controles não apresentam compostos antioxidante e são referidos como 0% de atividade (ver métodos). x, y, z representam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes concentrações da mesma amostra. a, b, c representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes polissacarídeos na mesma concentração. nd = não determinado. Fonte: Autoria própria.
As análises da atividade de sequestro de radicais superóxido e hidroxila
revelaram que as glucanas, nas concentrações testadas, não apresentaram boa ação
sequestrante desses radicais. Por outro lado, observa-se que as heterofucanas F1-75
e F1>100 apresentaram atividade dose dependente e, na concentração de 10 µM,
tiveram atividades em torno de 28 e 33% de sequestro do radical superóxido e 29 e
52% de sequestro do radical hidroxil, respectivamente.
3.3.2. Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Atividade Quelante de Metais
(Cobre e Ferro)
A Tabela 8 sumariza os resultados da avaliação da capacidade de quelação de
metais. Pode-se observar, com os dados de quelação de cobre, que a atividade
quelante encontrada para as glucanas são significantemente diferentes entre si
65
(p<0,001). A atividade determinada para a glucana F1-5 foi superior a todas as outras
frações (p<0,001), em todas as concentrações testadas. Os valores obtidos com as
heterofucanas para essa atividade foram semelhantes entre si, em todas as
concentrações testadas, bem como se assemelharam com aqueles encontrados com
as glucanas F1-20 e F1-40. Vale ressaltar que a partir da concentração de 0,3 µM,
não se identificou diferença significativa entre os valores obtidos com a presença
desses diferentes polissacarídeos (p>0,05). Também se observa que a atividade
quelante determinada para as glucanas e heterofucanas é dependente da
concentração e chegam a um platô com a concentração entre 0,2 e 0,3 µM, quando
foram alcançados valores máximos em torno de 70 e 60% de quelação para a glucana
F1-5 e para as heterofucanas F1-75 e F1>100, respectivamente.
66
Tabela 8 - Valores percentuais de quelação de cobre e de quelação de ferro determinados na presença dos polissacarídeos da alga L. variegata.
Quelação dos metais estão representadas pelas médias ± desvio padrão de replicatas (n=3) de cada concentração (0,01 – 0,4 µM) de polissacarídeos. Os controles não apresentam compostos antioxidante e são referidos como 0% de atividade (ver métodos). x, y, z , w, u representam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes concentrações da mesma amostra. a, b, c representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes polissacarídeos na mesma concentração. Fonte: Autoria própria.
Com relação a atividade quelante de ferro (Tabela 8), observa-se que também
se encontrou uma atividade dependente da concentração, cujo platô da atividade foi
em torno da concentração de 0,3 µM, neste caso com o uso de F1-5, F1-20 e F1-75.
Com a glucana F1-5 encontrou-se uma atividade significativamente diferente das
glucanas F1-20 e F1-40 (p<0,001). Contudo, quando se comparou a atividade destas
outras duas glucanas entre si, não se identificou diferença significativa entre os
67
valores obtidos. Pode-se também observar que a atividade identificada com F1-5 foi
significativamente semelhante àquelas obtidas pelas heterofucanas.
3.4. AVALIAÇÃO DO EFEITO DE POLISSACARÍDEOS SOBRE A CAPACIDADE
REDUTORA DE MTT EM CÉLULAS DE LINHAGENS NORMAIS
Este ensaio se baseia na capacidade oxido-redutora que enzimas
desidrogenases apresentam em reduzir o substrato MTT ao produto de cor roxa, o
cristal de Formazan, quanto menor for essa capacidade, maior é o indicativo das
células estarem na presença de um composto citotóxico. Assim, com intuito de avaliar
a atividade citotóxica dos polissacarídeos, verificou-se o efeito desses polímeros em
macrófagos e fibroblastos em condições de cultura. Para tal, células RAW 246.7 e 3T3
foram cultivadas por 24 horas na presença dos polissacarídeos e, em seguida,
avaliou-se a atividade das desidrogenases mitocôndrias das células.
3.4.1. Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Capacidade Redutora de MTT
de Fibroblastos 3T3
Na Figura 10 observa-se que a presença das glucanas alterou a atividade
redutora de MTT dos fibroblastos. Com o uso das glucanas na menor concentração
avaliada (0,1 µM) identificou-se uma menor capacidade redutora das células, porém,
estes resultados se modificaram com o aumento da concentração, e com o uso de 10
µM, a capacidade redutora das células, na presença das glucanas, se tornou
semelhante ao das células do grupo controle, exceto daquelas células tratadas com
F1-5, cuja capacidade redutora foi significativamente maior do que aquela observada
com o grupo controle, vale salientar que isso já foi observado com o uso da
concentração intermediária. Com o uso das heterofucanas observou-se resultados
diferentes; com o uso de F1-75, verificou-se que a presença desse composto, tanto
na menor como na maior concentração, não alterou a capacidade redutora das células
em relação ao controle. Contudo com o uso dessa fração na concentração
intermediária se observou uma redução de ~40% da atividade redutora das células.
Já na presença de F1>100 a capacidade redutora das células foi afetada, caindo em
~37%, quando ele foi usado na maior concentração.
68
Figura 10 - Resultados em percentual da redução de MTT por células 3T3 tratadas com glucanas ou heterofucanas. A redução do MTT pelas enzimas desidrogenases mitocondriais de células da linhagem 3T3 (fibroblastos) está representada pelo percentual das médias ± desvio padrão (n=3) de cada concentração (0,1; 1 e 10 µM) dos polissacarídeos. x, y, z representam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes concentrações dos polissacarídeos e o controle. a, b, c representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes polissacarídeos na mesma concentração. Fonte: Autoria própria.
3.4.2. Avaliação do Efeito de Polissacarídeos Sobre a Capacidade Redutora de MTT
de Macrófagos RAW 246.7
Na Figura 11 pode-se observar que a presença das glucanas, mesmo na menor
concentração utilizada, foi capaz de promover um aumento da capacidade redutora
de MTT das células. Observa-se também que a presença da glucana F1-40 foi mais
efetiva em induzir aumento da redução do MTT, nesse caso, o resultado mais
expressivo foi obtido com 10 µM, quando a capacidade redutora das células aumentou
em 57% (p<0,001) em comparação a capacidade das células do grupo controle.
Dentre as heterofucanas, o destaque é dado para F1>100, cuja presença aumentou
a capacidade redutora de MTT das células, chegando ao máximo em torno de 38%
em relação a capacidade das células do grupo controle (p<0,001), isso na
concentração de 10 µM.
69
Figura 11 - Resultados em percentual da redução de MTT por células RAW 264.7 tratadas com glucanas ou heterofucanas. A redução do MTT pelas enzimas desidrogenases mitocondriais de células da linhagem RAW está representada pelas médias ± desvio padrão de replicatas (n=3) de cada concentração (0,1; 1 e 10 µM) de polissacarídeos. x, y, z representam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes concentrações dos polissacarídeos e o controle. a, b, c representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes polissacarídeos na mesma concentração. Fonte: Autoria própria.
Estes dados são promissores, uma vez que indicam que, nas condições
testadas, os polissacarídeos não são citotóxicos para essa linhagem de células.
De posse desses dados, objetivou-se analisar a capacidade desses
polissacarídeos em ativar células da linhagem de macrófagos RAW 264.7 quanto a
atividade imunomoduladora, através da avaliação do estímulo da produção de óxido
nítrico (ON) e de citocinas por estas células.
3.5. AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DOS POLISSACARÍDEOS
SOBRE CÉLULAS RAW
3.5.1. Determinação da Quantidade de NO Presentes no Meio de Cultivo de Células
RAW na Presença dos Polissacarídeos.
A quantidade de NO produzida pelas células, induzida pela presença de
polissacarídeos e ausência de lipopolissacarídeo (LPS), é demonstrada na Figura 12.
Pode-se observar que quando se adicionou apenas os polissacarídeos ao meio de
cultivo, não se detectou um aumento da quantidade de NO neste meio em quase todas
as condições avaliadas. As exceções se deram com F1-5 e F-75, que quando usadas
70
na concentração de 10 µM, proporcionaram um aumento na quantidade de NO em
cerca de 2 e 3 vezes, respectivamente. E principalmente na presença da heterofucana
F1>100, quando, na presença desta, em todas as concentrações avaliadas, houve a
detecção de um aumento na quantidade de NO do meio, com destaque para a
concentração de 10 µM, quando se identificou uma quantidade de NO cerca de 12
vezes maior do que aquela encontrada com o grupo controle.
Quando o LPS, um conhecido imunoestimulador, foi adicionado ao meio junto
com os polissacarídeos, verificou-se que a presença de nenhum deles foi capaz de
diminuir o efeito de LPS sobre a quantidade de NO do meio. Por outro lado, observou-
se que na presença de F1-20 houve um efeito sinérgico deste com o LPS e a
quantidade de NO do meio aumentou em cerca de 0,44 vezes. Porém, foi com a
presença de F1>100 que esse efeito foi pronunciado, pois se notou um aumento de
cerca de duas vezes (p<0,001) na quantidade de NO do meio em comparação com
os dados obtidos com o grupo tratado somente com LPS.
Figura 12 - Quantidade NO encontrado no meio de cultivo de células RAW tradadas com os polissacarideos na presença ou ausência de LPS. OS dados estão representados pelas médias ± desvio padrão (n=3) de cada concentração (0,1; 1 e 10 µM) de polissacarídeos. x, y, z representam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes concentrações dos polissacarídeos e o controle negativo (CN, células e meio de cultura). X’, y’, z’ representam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes concentrações dos polissacarídeos e o controle positivo (CP, células, meio de cultura e LPS). a, b, c representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes polissacarídeos na mesma concentração. Fonte: Autoria própria.
71
3.5.2. Determinação da Quantidade de Citocinas Presentes no Meio de Cultivo de
Células RAW na Presença dos Polissacarídeos.
Os resultados das análises das citocinas são mostrados na Tabela 9. Como
pode ser observado, na maioria das condições avaliadas os polissacarídeos não
influenciaram a quantidade de citocinas avaliadas do meio de cultivo das células RAW.
Uma das exceções foi a glucanas F1-5, que com o uso da concentração de 10 µM
promoveu-se um aumento na quantidade das citocinas IL-6 (11,6 µg/mL), IL-10 (15,2
ng/mL) e TNFα (8,1 µg/mL). A outra exceção foi a heterofucana F1>100, que também,
quando usada na concentração de 10 µM proporcionou aumento da quantidade das
citocinas IL-2 (0,05 ng/mL) e IL-10 (2,2 ng/mL).
Assim, os dados obtidos até aqui demonstram que as glucanas ou
heterofucanas são capazes de alterar, em maior ou menor grau, atividades oxido-
redutoras e imunomoduladoras em ensaios in vitro, o que levam a crer em uma
possível ação de ativação do sistema imune contra diversos agentes patogênicos. Por
conseguinte, questionamentos acerca da capacidade citotóxica direta desses
polissacarídeos sobre células de linhagens tumorais foram levantados e analisados,
como segue.
Tabela 9 - Quantidade de citocinas do meio de células RAW cultivadas na presença de glucanas ou
heterofucanas.
A determinação da concentração de citocinas liberadas no meio de cultura de células da linhagem RAW
264.7 está representada pelas médias ± desvio padrão. Foi utilizada a concentração de 10 µM (n=3)
de cada subfração. x, y, z representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes
polissacarídeos na mesma concentração.
Fonte: Autoria própria.
72
3.6. AVALIAÇÃO DO EFEITO DOS POLISSACARÍDEOS SOBRE A CAPACIDADE
REDUTORA DE MTT DE CÉLULAS DE LINHAGENS TUMORAIS
Os testes de redução do MTT realizados com a linhagens de células tumorais
de carcinoma hepático (HepG2) levaram a observação de que em nenhuma das
condições avaliadas a capacidade dessas células foi reduzida (Figura 13A).
Já, para a linhagem de adenocarcinoma renal (786-0) (Figura 13B), os
resultados obtidos para cada amostra não foram semelhantes como aqueles
encontrados com as células HepG2. A exceção foi quando se usou a glucana F1-40,
pois não se observou alteração da capacidade redutora de MTT das células de
linhagem 786-0 na presença dessa amostra (p>0,05). Na presença da glucana F1-20
nas concentrações de 0,1 e 1 µM a capacidade redutora de MTT das células reduziu-
se em cerca de 20 e 24%, respectivamente. Porém, quando se usou a maior
concentração da amostra a capacidade redutora das células não foi afetada. Somente
na presença de F1-5 foi que se observou que as células perderam a sua capacidade
de reduzir o MTT em todas as condições avaliadas. Porém esse valor de redução, em
relação ao encontrado para o grupo controle, nunca ultrapassou os 25% (p<0,01). Na
presença da heterofucana F1-75 a capacidade redutora das células só foi afetada
significativamente na concentração de 1 µM. Entretanto, o valor encontrado não
ultrapassou a casa dos 40% de inibição. Com F1>100 verificou-se uma inibição da
capacidade redutora das células com 1 µM (~30%). Todavia, este valor não se alterou
com o uso de uma concentração maior de F1>100.
Para a linhagem de melanoma B16F10 pode-se dizer que o comportamento
destas células como agentes redutores de MTT variou muito conforme a presença de
cada polissacarídeo (Figura 13C). Na presença de F1>100, independente da
concentração avaliada, as células não perderam atividade redutora. Já na presença
de F1-5 a capacidade redutora das células só foi afetada com a maior concentração
utilizada. Algo bem parecido também foi observado nos experimentos com F1-75.
Porém, nesse caso, a capacidade redutora das células só foi diminuída (~ 30%)
quando se utilizou a concentração de 1 µM dessa amostra. Com o uso de F1-40
verificou-se que quanto maior a concentração utilizada dessa amostra menor era a
inibição que se observava da capacidade redutora das células e na maior
concentração utilizada o efeito se extinguiu. Um efeito dose dependente na
capacidade redutora das células de melanoma só foi observado com o uso de F1-20,
73
nesse caso, com o uso da maior concentração observou-se uma redução da
capacidade redutora das células em 53% (p<0,001).
Figura 13 - Resultados em percentual da redução de MTT por células de linhagens tumorais HEPG2 (A), 786-0 (B) e B16F10 (C) quando tratadas com as glucanas e heterofucanas. O percentual de redução do MTT, pelas enzimas desidrogenases mitocondriais das células está representado pelas médias ± desvio padrão (n=3) de cada concentração (0,1; 1 e 10 µM) de polissacarídeos. x, y, z representam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes concentrações dos polissacarídeos e o controle. a, b, c representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes polissacarídeos na mesma concentração.
Fonte: Autoria própria.
3.7. AVALIAÇÃO DO EFEITO DAS GLUCANAS E HETEROFUCANAS SOBRE
COAGULAÇÃO DO PLASMA HUMANO
Na Figura 14 mostra-se os dados referentes a atividade anticoagulante dos
polissacarídeos. Percebe-se que a presença das glucanas não afetou o tempo de
74
formação do coágulo, mesmo na concentração de 10 µM. Por outro lado, a presença
das heterofucanas afetou este tempo, principalmente a presença de F1>100, pois se
observa que o tempo de formação do coágulo foi cerca de 6 vezes maior do que
aquele observado com o controle negativo. Um forte dado positivo com relação a isso
é que a concentração de heparina utilizada para se obter a mesma potência de
atividade foi sete vezes maior.
Figura 14 - Atividade anticoagulante induzida por glucanas ou heterofucanas em teste de TTPa. A coagulação (razão entre a atividade proporcionada pelos polissacarídeos ou clexane, e a atividade do teste controle) está representada pelas médias ± desvio padrão de replicatas (n=3) de cada concentração (1 e 10 µM) de polissacarídeos. x, y, z representam diferenças significativas (p<0,05) entre as concentrações dos polissacarídeos ou clexane e o controle negativo. a, b, c representam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes polissacarídeos na mesma concentração. Fonte: Autoria própria.
3.8 RANQUEAMENTO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS
Tendo-se em mente os objetivos dessa tese, inclusive de que se objetiva obter
uma glucana, chegou-se ao momento da escolha de uma das amostras para com ela
realizar os demais experimentos, para tal gerou-se a Tabela 10. Nela fez-se um
ranqueamento utilizando os dados obtidos, que por sua vez receberam valores de
acordo com critérios pré-determinados e descritos abaixo. Deve-se observar também
que foram levados em consideração valores tidos como negativos, que também foram
utilizados na obtenção do escore final de cada amostra. Ter atividade coagulante foi
considerado o ponto negativo para a amostra, pois esta atividade é um efeito adverso
indesejado quando se pensa num agente imunomodulador, antioxidante e até como
antitumoral. Para maiores detalhes dos valores ver rodapé da Tabela 10.
Ao se analisar a tabela é possível observar que F1-75 foi a que apresentou
menor escore, quase a metade daquele observado com as outras amostras. Isso
75
ocorreu devido aos resultados ruins obtidos nos experimentos com as células. As
demais amostras apresentaram escores muito semelhantes. Contudo, F1>100 é
notadamente constituída de fucanas, o que fez com ela fosse descartada. As outras
amostras são ricas em glucanas e dentre elas, a fração F1-20 foi aquela em que se
obteve o maior escore. Portanto, esta foi escolhida para ser utilizada nos passos
posteriores.
Tabela 10 - Análise comparativa das atividades de glucanas e heterofucanas.
Critérios/
Pontuação das
Frações por
categoria
FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS
F1-5 F1-20 F1-40 F-75 F1>100
Quantificações
Polissacarídeos ++ +++ +++ +++ ++
Rendimento + + ++ ++ +++
Fenólicos/Proteínas +++ +++ +++ +++ +++
Atividades
Sequestro ABTS+ se se se + +
Sequestro O2.• se se se + +
Sequestro OH• se se se + ++
Quelacao Cu2+ ++ ++ ++ ++ ++
Quelação Fe2+ +++ ++ ++ +++ +++
MTT 3T3 +++ +++ +++ - -
MTT RAW ++ ++ +++ ++ +++
MTT 786-0 + se se se +
MTT B16F10 se +++ se --- ---
Óxido nitrico + se se + +++
Óxido nitrico (LPS) se + se se +++
Il-6, Il-10, TNF + se se se +
Anticoagulante +++ +++ +++ --- ---
76
“se” sem escore.
- Quantificações em %:
Para proteínas e fenólicos: 0 a <5 = “+++”; 5 a <7= “++”; 7 a <10 = “+”; 10 a 100 = “-”;
Para polissacarídeos: 0 a <10 = “-“; 10 a <30 = “+”; 30 a <65 = “++”; 65 a 100 = “+++”;
Para rendimento: 0 a <5= “-”; 5 a <10 = “+”; 10 a <20 = “++”; 20 a 40 = “+++”
- Atividade em %:
Sequestro de radicais ABTS+, superóxido e hidroxila (%): 0 a <15 = “se”; 15 a <40 = “+”; 40 a <70 = “++”; 70 a
100 = “+++”;
Quelações (cúprica e férrica), porcentagem de atividade (%): 0 a <10 = “se”; 10ª <30 = “+”; 30 a <70 = “++”; 70
a 100 = “+++”;
Redução do MTT em percentual (células normais): (%): 0 a <50= “---“; 50 a <75-= “--”;75 a <90= “-”; 90 a 120=
“++”; >120 = “+++”;
Redução do MTT em percentual (células tumorais): (%): < 0 = ---; 0 a <20 = “se”; 20 a <30 = “+”; 30 a 50 = “++”;
> 50 = “+++”;
Óxido Nítrico (As frações que aumentaram a produção de óxido nítrico): não interferiram na quantidade de ON =
“se”; dobraram a quantidade de NO = “+”; triplicaram = “++”; quadruplicaram = “+++”.
Produção de citocinas: positivo = “ + “;
Fonte: Autoria própria.
3.9. AVALIAÇÃO DO EFEITO DE F1-20 NO PERCENTUAL DE MARCAÇÃO DAS
CÉLULAS B16F10 POR ANEXINA E IODETO DE PROPÍDEO (PI)
Com intuito de se entender qual seria o mecanismo pelo qual a F1-20 estaria
afetando a capacidade das células B16F10 em reduzirem o MTT, as células de
melanoma foram cultivadas na presença de F1-20 (10 µM) por 24 h, e depois foram
submetidas a marcação com anexina e PI, como descrito em métodos. Na Figura 15
apresenta-se um dos gráficos que é representativo dos resultados obtidos. Verifica-se
nessa figura que a presença da glucana não afetou de forma significativa (p>0,05) a
marcação das células por anexina ou por PI.
Total de pontos
positivos 22 23 21 19 28
Total pontos
negativos 00 00 00 07 07
Escore final 22 23 21 12 21
77
Figura 15 - Avaliação do efeito de tratamento com F1-20 (10 µM) sobre linhagem celular B16F10 (melanoma) marcadas com Anexina-V-FITC e PI. A, representação de marcação de células controle (células e meio de cultura). B, representação de marcação de células tratadas com F1-20 (células, meio de cultura e F1-20 10 µM). Fonte: autoria própria.
3.10. AVALIAÇÃO DO EFEITO DA PRESENÇA DA GLUCANA SOBRE O CICLO
CELULAR DAS CÉLULAS DE MELANOMA B16F10
Como a presença de F1-20 não afetou a marcação das células com os
marcadores utilizados, avaliou-se então, como a presença da glucana afetaria a
distribuição das células nas diferentes fases do ciclo celular. Na Figura 16 tem-se o
resumo dos dados obtidos, em que se nota que após exposição das células à glucana
a distribuição dessas nas fases do ciclo celular não coincidiu mais com a distribuição
das células do grupo controle. Houve uma maior quantidade de células na fase G1
(parada em G1) e uma menor quantidade de células em G2/M.
Figura 16 - Avaliação da distribuição das células nas fases do ciclo celular da linhagem B16F10 (melanoma) tratadas com F1-20 (10 µM). Análise por citometria de fluxo usando o marcador PI. ** = p<0,01 Fonte: Autoria própria.
78
3.11. ANÁLISES ESPECTROSCÓPICAS
As análises por espectroscopia de infravermelho e ressonância magnética
nuclear de 13C e 1H foram realizadas visando a elucidação estrutural da glucana F1-
20.
3.11.1. Espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourier
Ao se observar o espectro de F1-20 (Figura 17) verifica-se que não há uma
grande quantidade de sinais o que indica que a estrutura da glucana não é tão
complexa como de outros polissacarídeos. Destacam-se aqui alguns sinais que são
bastante evidentes: um sinal largo e de grande intensidade em torno de 3390,5 cm-1.
Próximo a este, encontra-se um sinal menor, mas ainda bastante visível na região em
torno de 2921,3 cm-1. Entre 2500 e 1700 cm-1 não se observa sinais que se destacam,
o primeiro que vem a se destacar é visto em torno de 1560 cm-1. Posteriormente, na
região compreendida entre 1500 e 1250 cm-1 há quatro sinais que se sobressaem.
Todavia, há uma grande possibilidade de se ter sobreposição de sinais, e de que nesta
região haja mais de quatro sinais representativos dos grupos funcionais presentes em
F1-20. Entre 1110 e 1000 cm-1 há dois sinais de alta intensidade e terminam com uma
extremidade bem definida a ponto de se poder assinalar com certeza os seus valores:
1076 e 1037 cm-1, respectivamente. Logo em seguida, destaca-se um pequeno e fino
sinal em 891,7 cm-1. Após esta região tem-se um grande sinal muito largo que
compreende a região entre 700 e 500 cm-1.
79
Figura 17 - Espectro de infravermelho com Transformada de Fourier da glucana F1-20.
Fonte: Autoria própria.
3.11.2. Análises de Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
3.11.2.1. Análises dos espectros de RMN de 1H e 13C unidimensionais de F1-20
No espectro de RMN de 1H (Figura 18) observa-se que não há sinais na região
onde se deveria encontrar os sinais dos hidrogênios anoméricos de açúcares alfa (α),
indicando que não há açúcares na configuração “α” na glucana F1-20. Por outro lado,
na região dos hidrogênios anoméricos de açúcares beta (β) há a presença de dois
sinais proeminentes em 4,58 e 4,57 ppm, e dois pequenos sinais em 4,31 e 3,99 ppm.
Há um outro sinal em ~4,15 ppm (indicado pela seta) que está numa região não muito
comum para hidrogênios anoméricos, que se refere ao sinal de água residual da
saturação.do sinal. Na região compreendida entre 1,00 e 3,00 ppm só foram
detectados sinais da substância de referência (DMSO), por isso esta parte do espectro
foi suprimida na Figura 18. Por outro lado, na região que compreende os valores de
3,08 a 3,80 ppm observa-se uma concentração de sinais de baixa, média e grande
intensidade que correspondem aos sinais dos outros hidrogênios que constituem os
monossacarídeos de F1-20. Estes sinais podem ser divididos em quatro grupos
(indicados pelas linhas horizontais acima do espectro): o primeiro, compreendido
entre 3,62 e 3,80 ppm, onde se destacam dois sinais de intensidade média em 3,74 e
80
3,72 ppm, respectivamente; no segundo grupo, que se encontra 3,45 e 3,61 ppm,
observa-se vários sinais de intensidade média, sem nenhum se destacando em
relação ao outro, vale salientar que não se pode descartar a possibilidade de haver
sobreposições entres eles; o terceiro grupo abrange os sinais que aparecem entre
3,25 e 3,44 ppm, neste se observa um sinal de alta intensidade em torno de 3,32 ppm,
além de outros sinais de intensidade média, como no grupo anterior, sobreposições
entre sinais não podem ser descartadas; no quarto grupo encontram-se vários sinais
de intensidade pequena na região compreendida entre 3,24 e 3,05 ppm. A
possibilidade de se agrupar os sinais dos hidrogênios dos açúcares em diferentes
grupos mostra que a estrutura da glucana F1-20 não é tão complexa em comparação
com outros polissacarídeos.
Figura 18 - Espectro unidimensional de RMN de 1H de F1-20.
Fonte: Autoria própria.
No espectro de RMN de 13C da glucana F1-20 (Figura 19) verifica-se que não
há sinais proeminentes em torno de 170 ppm, indicando que não há presença de
grupos carboxila em F1-20. Observa-se ainda aproximadamente 6 sinais de grande
intensidade entre 105 e 38 ppm. Porém, vale salientar que os sinais abaixo de 60 ppm
são decorrentes da presença da substância de referência (DMSO). Já os sinais
compreendidos entre 105 e 60 ppm, em torno de 15 sinais, são referentes aos
carbonos dos monossacarídeos presentes em F1-20. Na região correspondente aos
81
carbonos anoméricos, observa-se a presença de dois picos muito próximos, um de
maior intensidade em 103,8 ppm e outro de menor intensidade em 104,1 ppm. Estes
dois sinais estão na região dos carbonos anoméricos de configurações beta. Não se
identificou sinais na região de sinais de carbonos alfa. Pode-se obeservar ainda
outros sinais que podem ser divididos em cindo grupos (indicados pelas barras acima
do espectro), que se apresentam com maior ou menor quantidade de sinais: o primeiro
grupo, entre 86,0 e 86,5, apresenta o sinal de média intensidade em 86,0 ppm; o
segundo grupo, que apresenta sinais de alta e baixa intensidade entre 75,5 e 80,0
ppm, apresenta como sinal mais representativo o de 76,2 ppm, também se destaca
um sinal mais isolado de baixa intensidade em 75,9 ppm; no terceiro grupo, entre 75,5
e 74 ppm, destaque é dado para o sinais de alta e intensidade em 74,4 ppm; em um
quarto grupo entre 71,5 e 69,0 ppm verifica-se um sinal que mais se destaca em 70,1
ppm, e, por fim, no quinto grupo entre 62,5 e 62 ppm os sinais em 62,3 e 62,2 ppm
são os mais representativos. É de se observar que em todos os grupos há múltiplos
sinais e que se deve considerar a existência de sobreposição dos mesmos.
82
Figura 19: Espectro unidimensional de RMN de 13C de F1-20.
Fonte: Autoria própria.
3.11.2.2. Espectroscopias de RMN bidimensionais
3.11.2.2.1. Análises dos espectros de correlação homonuclear de 1H-1H (COSY)
Na Figura 20 mostra-se o espectro de COSY obtido de F1-20. Pode-se
observar que na região de 3,1 e 3,8 ppm há muitas sobreposições de sinais. Por outro
lado, na região dos hidrogênios anoméricos isto não ocorre. É possível observar um
forte sinal de correlação entre o sinal em 4,58 ppm com um sinal em 3,38 ppm, como
assinalado na Figura 20, este sistema de spin foi denominado de “A”. Quase se
sobrepondo a este sistema observa-se outro sistema, denominado de “B”, cujo o
primeiro sinal de correlação é visto em δ 4,57/3,35. O terceiro sistema de spin
detectado, e denominado de “C”, é denunciado pelo sinal em δ 4,31/3,11.
83
Figura 20: Espectro de COSY de F1-20.
Fonte: Autoria própria.
3.11.2.2.2. Análises dos espectros de correlação bidimensional de 13C e 1H (HSQC)
Na Figura 21 pode-se verificar a presença no eixo horizontal do espectro de
prótons e no eixo vertical o espectro dos átomos de 13C. Picos transversais fornecem
a correlação entre carbonos e hidrogênios correspondente. Assim, observa-se os
sinais de correlações 13C/1H de 3 sinais de região anomérica, sendo elas: δ
103,8/4,58; δ 103,8/4,57 e δ 104,1/4,31. Verificam-se também outros sinais de
correlação 13C/1H com maior ou menor grau de sobreposição, como δ 86,4/3,51; δ
86,0/3,35; δ 76,2/3,32; δ 75,9/3,18; δ 77,4/3,30; δ 75,9/3,27; δ 74,4/3,38; δ 74,5/3,35;
δ 74,6/3,11; δ 70,1/3,27; δ 70,1/3,32; δ 71,1/3,19; δ 62,3/3,74; δ 62,3/3,48; δ 69,6/3,99
e 69,6/3,69; δ 62,2/3,72 e 62,2/3,48.
84
Figura 21: Espectro de RNM bidimensional 13C -1H com técnica de correlação heteronuclear (HSQC) de F1-20. Fonte: Autoria própria.
Baseado nestas análises dos espectros de COSY e HSQC foi possível
assinalar os três sistemas de spin detectados (Tabela 11). Vale salientar que quando
se fez a integração dos sinais anoméricos dos três sistemas se identificou um relação
entre eles de 8:1:1, respectivamente para os sistemas A:B:C.
85
Tabela 11: Sistemas de spins obtidos das análises de COSY e HSQC de F1-20.
Fonte: Autoria própria.
86
4. DISCUSSÃO
O fracionamento do extrato aquoso de L. variegata com o uso de propanona
permitiu a obtenção de seis frações ricas em polissacarídeos. Este resultado
corrobora com aquele descrito anteriormente pelo grupo em que está inserido esta
tese (PAIVA et al., 2011), quando também foram obtidas seis frações ricas em
polissacarídeos dessa mesma alga. A precipitação fracionada com propanona é
possível porque, segundo Câmara e colaboradores (2011), a proponona diminui a
constante dielétrica do meio aquoso onde se encontram os polissacarídeos, como
também, diminui a quantidade de moléculas de água que mantêm os polissacarídeos
em solução (camada de solvatação), e assim provoca a precipitação de
polissacarídeos solúveis em água. Dessa forma, quanto mais propanona é adicionada
mais polissacarídeos são precipitados. Vale salientar que os polissacarídeos que
interagem mais fortemente com a água só são precipitados com a adição dos maiores
percentuais de propanona na solução. A propanona foi usada devido apresentar
menor constante dielétrica (20,6) que outros solventes como metanol (32,7) ou etanol
(24,6) (LIDSTROM et al., 2001) e, assim, provoca maior efeito precipitante quando em
menores volumes.
Esse método também vem sendo utilizado para obtenção de outros
polissacarídeos, como por exemplo, Rocha e colaboradores (2005) que obtiveram
diferentes frações polissacarídicas da alga marrom Spatoglossum schröederi.
Polissacarídeos da alga Dictyopteris delicatula também foram obtidas através da
utilização do método de precipitação fracionada com propanona (MAGALHÃES et al.,
2011). Vale salientar que este método proporciona a obtenção de diferentes frações
de acordo com acréscimo da propanona, tendo em vista a existência de
polissacarídeos com tamanhos e cargas diferenciadas que interagem com a água
menos ou mais intensamente e, como dito antes, com o aumento gradual na
quantidade de propanona provoca-se a diminuição na quantidade de moléculas de
água que mantêm os polissacarídeos em suspensão. Vale salientar ainda que a
quantidade de propanona utilizada pode ser diferente para diferentes algas estudadas,
uma vez que cada alga apresenta repertório de polissacarídeos distintos de outras
algas.
É de se destacar que laminarinas ou outras glucanas normalmente não são
obtidas com métodos de precipitação seriadas com uso de solventes, mas por
87
solubilização em meios aquosos quentes e/ou frios e/ou modulações do pH da solução
aquosa. Assim, esse é o primeiro estudo que se utiliza dessa metodologia para
obtenção de glucanas.
A composição monossacarídica das frações obtidas dá ideia dos tipos de
polissacarídeos que foram extraídos. Nas frações precipitadas com menores volumes
de propanona (F0,3 e F0,5) encontrou-se uma grande quantidade de ácidos urônicos.
Vários autores já demonstraram que algas marrons sintetizam alginatos
(ZVYAGINTSEVA et al., 2005; THENNARASAN & MURUGESANM, 2015), que são
polissacarídeos constituídos de ácido manurônico e ácido gulurônico (PAINTER,
1983; JIN et al., 2016). Além disso, em um estudo feito com a alga marrom
Spatoglossum schröederi demonstrou-se que alginatos são precipitados, em maior
quantidade, com volumes pequenos de propanona (entre 0,5 a 0,7 volumes) (ROCHA
et al., 2005). Portanto, acredita-se que as frações F0,3 e F0,5 são ricas em alginatos.
Contudo, vale salientar, que nestas frações também se encontrou outros
monossacarídeos, inclusive fucose. Extratos de várias outras algas marrons ao serem
precipitados com pequenos volumes de propanona permitem a obtenção de frações
ricas em alginatos, como também, em heterofucanas, muitas delas ricas em ácidos
glucurônicos (MAGALHÃES et al., 2011; CAMARA et al., 2011; COSTA et al., 2011),
o que justificaria, junto com os alginatos, a grande quantidade de ácidos urônicos,
como também a presença dos monossacarídeos neutros nas frações F0,3 e F0,5. Nas
frações F0,8 e F1,0 encontrou-se grandes quantidade de glucose. Os principais
polissacarídeos sintetizados por algas marrons ricos em glicose, são as laminarinas
(RINAUDO, 2007). Portanto, estas seriam as frações ricas nestes polissacarídeos. E
como as frações F1,5 e F2,0 são ricas em fucose, então propõem-se que essas seriam
as frações ricas em fucanas.
Como o objetivo inicial do trabalho era obter frações ricas em glucanas da alga
em estudo, utilizou-se então alguns critérios, como maior quantidade de glicose e
baixa contaminação com proteínas e ácidos urônicos, para se escolher a fração F0,8
ou a F1,0 como fonte de purificação de glucanas. Uma análise do conjunto de dados
apresentados no item 3.1 levou a escolha da fração F1,0, pois é uma das frações que
foi obtida em grande quantidade e apresentou baixos teores de proteínas e ácidos
urônicos em comparação a F0,8.
O uso da cromatografia de exclusão molecular associada a eletroforese
permitiu a observação de que a fração F1,0 é constituída por populações de
88
polissacarídeos com diferentes massas moleculares e que essas populações são
constituídas de polissacarídeos neutros e por sulfatados. Assim, baseado nestes
dados, foi que se escolheu os dispositivos de separação por tamanho molecular, o
que permitiu separar os polissacarídeos com as diferentes massas moleculares
encontrados em F1, e, por conseguinte, obter as diferentes subfrações: F1-5; F1-20;
F1-40; F1-75 e F1>100.
Com relação aos polissacarídeos sulfatados e de acordo com os dados da
Tabela 6, pode-se afirmar que a subfração F1>100 é constituída principalmente de
uma heterofucana, mais especificamente de uma galactofucana. A presença de
galactofucana em L. variegata já tinha sido relatada anteriormente (MEDEIROS et al.,
2008) e os dados aqui desta tese confirmaram mais uma vez a presença dessa fucana
na alga. Galactofucanas não são as fucanas mais facilmente encontradas em algas
marrons, mas há relatos de purificação de galactofucanas de algumas algas, como:
Saccharina longicruris (RIOUX et al., 2009 e 2010), Saccharina japônica (VISHCHUK
et al., 2011) e Spatoglossum schrhöederi (ROCHA et al., 2005). Neste último exemplo,
a quantidade de galactose também foi maior do que a fucose, como observado com
F1>100. Com relação a outros monossacarídeos, foi descrito galactofucanas que
continham além de fucose e galactose, traços de xilose e manose nas algas Undaria
pinnatifida e Saccharina japônica (VISHCHUK et al., 2011). Contudo, nestes trabalhos
não se demonstrou a presença de glucose nessas heterofucanas, por isso, acredita-
se que a glicose encontrada em F1>100, assim como em F1-75, não deva ser um
monossacarídeo constituinte da heterofucana e, provavelmente essa glicose deve ser
proveniente de glucanas de alta massa molecular cuja presença foram identificadas
na cromatografia de exclusão molecular.
Glucanas não celulosídicas de alta massa molecular são muito raras em algas
marrons, na verdade, apenas um trabalho que demonstrou a presença dessas
glucanas em algas marrons foi identificado (MENSHOVA et al., 2014). Contudo, nesse
caso, a glucana apresentou uma massa molecular de aproximadamente 27 kDa.
Glucanas com massas moleculares acima de 100 kDa foram encontradas em fungos
(FANG et al., 2012; BI et al., 2013; SYNYTSYA et al., 2009; PACHECO-SANCHEZ,
2006), aveia e cevada (LARAZIDOU et al., 2011). Não foi identificado nenhum registro
de glucanas não celulosídica acima de 100 kDa em algas marrons. Portanto, este é o
primeiro relato dessas glucanas com massa molecular acima de 100 kDa encontradas
89
em algas marrons. Espera-se no futuro purificar esta glucana e analisá-la
estruturalmente e farmacologicamente.
Com relação a F1-5, F1-20 e F1-40, a análise de suas composições leva a
proposição de que essas subfrações são compostas unicamente por glucanas.
Glucanas não celulosídicas de algas marrons são denomidadas de laminarinas.
Contudo, laminarinas são definidas como β-glucanas de baixa massa molecular (5 –
10 kDa) (BOBADILLA et al., 2013; RIOUX et al., 2007; KADAN et al., 2015;
ZVYAGINTSEVA et al., 1999). Assim, pelo menos uma fração obtida, F1-5, poderia
ser denominada como uma laminarina propriamente dita, mas a presença de F1-20 e
F1-40 não corroboram com o que foi proposto por esses autores. Porém, se outros
autores demostrarem a presença de glucanas não-celulosídicas com massas
moleculares maiores que 10 kDa em algas marrons, acredita-se que com o surgimento
desses dados isso leve a uma revisão do conceito de laminarinas.
Polissacaricadeos bioativos podem ter suas atividades influenciadas por várias
das suas propriedades físico-químicas, inclusive a massa molecular. Tem sido
demonstrado que laminarinas de algas possuem ação imunomoduladora (YIN et al.,
2014), antitumoral (JI; JI, 2014), citotóxica (MENSHOVA et al., 2014) e antioxidante
(MORONEY et al., 2015). As glucanas de F1-20 e F1-40 possuem massas
moleculares maiores do que essas laminarinas citadas acima, mas seria possível que
elas também possuíssem estas atividades. Portanto, com intuito de responder este
questionamento e de avaliar o perfil das propriedades biológicas das glucanas estes
polissacarídeos foram avaliados quanto a atividades antioxidante, imunomoduladora
e citotóxica. E, uma vez que polissacarídeos sulfatados já vêm sendo avaliados
quanto a essas propriedades, as heterofucanas F1-75 e F1>100 também foram
avaliadas para comparação das atividades destes polímeros com as das glucanas.
Em relação às propriedades antioxidantes, os dados indicam que as glucanas
não foram hábeis em sequestrar osradicais ABTS+, superóxido e hidroxila. Apenas
um trabalho demonstra laminarinas sendo avaliadas quanto a propriedades
antioxidantes de sequestro de radicais ABTS+, e neste foi relatado sequestro de 10%
desse radical, quando na concentração de 1 mg/mL (GIESE et al., 2015). Já com
relação a outras β-glucanas há uma grande quantidade de artigos publicados.
Contudo, estas glucanas não apresentaram atividade sequestrante do radical ABTS+
alta, não ultrapassando o limite de 30% de sequestro, como observado por Wang e
colaboradores (2015) que trabalharam com β-glucanas e estas apresentaram
90
atividade máxima de 22,51% na concentração de 5 mg/mL, concentração esta 1000,
250 e 125 vezes superior às concentrações usadas das glucanas F1-5, F1-20 e F1-
40, respectivamente. O que demonstra que glucanas não são boas sequestradoras
de radical ABTS+.
Com relação ao sequestro do radical hidroxila foi identificado uma β-glucana de
fungo que apresentou uma atividade sequestradora em torno de 13%, na
concentração de 0,1 mg/mL. Porém, esse efeito não foi dose dependente (TELLES et
al., 2011). Já Giese e colegas (2015) ao analisarem a atividade de β-glucanas,
também de fungo, relataram uma atividade sequestradora em torno de 90%, mas essa
só foi alcançada em uma alta concentração (3 mg/mL). Não foi detectado outras
laminarinas que tenham sido avaliadas com relação a essa atividade. Com base nos
dados existentes pode-se dizer que β-glucanas não são bons sequestradores de
radicais hidroxila. Essa afirmação também pode ser feita para a atividade
sequestradora de superóxido, pois nos poucos trabalhos que avaliaram essa atividade
com β-glucanas não se observou valores de sequestro maiores que 40%, mesmo
quando altas concentrações foram utilizadas, como por exemplo 3 mg/mL (GIESE et
al., 2015).
As heterofucanas F1-75 e F1>100, diferentemente das glucanas F1-5, F1-20 e
F1-40, sequestraram os radicais ABTS+ num valor em torno de 26 a 27%. Outras
heterofucanas que tenham sido avaliadas quanto a atividade sequestrante de ABTS
não foram identificadas. Entretanto, há um grande número de trabalhos que mostram
heterofucanas como agente sequestradores de radical superóxido, inclusive com
atividade superior a observada para F1-75 e F1>100, como por exemplo uma
heterofucana da alga Canistrocarpus cervicornis, que apresentou uma atividade
sequestradora de cerca de 43%, na concentração de 0.1 mg/mL (CAMARA et
al.,2011). Um fato interessante é que Zubia, Robledo e Freile-Pelegrin (2007)
mostraram que um extrato rico em polissacarídieos da alga Lobophora variegata
apresentou uma atividade sequestradora de 70% desse radical. Este dado em
conjunto com o apresentado aqui nesta tese indica que quase 50% da atividade
sequestradora de radical superóxido dos polissacarídeos de L. variegata provem das
heterofucanas, já que heterofucanas sozinhas tiveram atividades sequestradoras em
torno de 30%.
As heterofucanas F1-75 e F1>100 também sequestraram o radical hidroxila (29
e 53%, respectivamente). Outros trabalhos relataram a ação sequestrante desse
91
radical por heterofucanas. Costa e colegas (2011) demostraram que uma
heterofucana extraída da alga Sargassum filipendula, denominada SF-1.0v,
apresentou atividade sequestrante de radicais hidroxil em até 26,7%, quando esses
polissacarídeos foram empregos na concentração de 0,5 mg/mL. Souza e colegas
(2007), ao analisarem a atividade sequestrante do radical hidroxila de heterofucanas
da alga Fucus vesiculosus, relataram atividade de 50% quando empregados 0,35
mg/mL. Nestes trabalhos os autores relataram alta atividade antioxidante por ambas
as heterofucanas. Assim, as heterofucanas estudadas por estes autores
apresentaram maior atividade que F1-75 (1,7 vezes maior) em uma concentração 2,1
vezes menor e apresentaram atividade semelhante a F1>100, porém em
concentração aproximada de 2,8 menor.
Quanto a atividade quelante de metais de transição as glucanas F1-5, F1-20 e
F1-40, na concentração de 0,3 µM, apresentaram forte atividade quelante de cobre e
ferro. F1-5 quelou mais de 70% dos íons de cobre e cerca de 80% de íons de ferro.
As glucanas F1-20 e F1-40 apresentaram cerca de 50% de atividade para ambos os
testes. Esses resultados estão de acordo com Melo e colaboradores (2013) que, ao
analisarem a atividade quelante de cobre por polissacarídeos da alga Dictyopteris
justii, relataram que glucanas, denominadas Dj-1.2, proporcionaram até 45% de
atividade quelante quando empregadas na concentração de 2 mg/mL. Dessa forma,
pode-se dizer que as glucanas F1-5, F1-20 e F1-40 proporcionaram maior atividade
quelante e em concentrações 40, 10 e 5 vezes menores, respectivamente, que as
glucanas Dj-1.2.
As heterofucanas F1-75 e F1>100, a 0,3 µM, também apresentaram forte
atividade quelante de cobre (53 e 55%, respectivamente) e ferro, (72 e 74%,
respectivamente). Melo e colaboradores (2013) também relataram atividade quelante
de cobre de 80% quando 2 mg/mL de uma heterofucana, extraída de D. Justii,
denominada Dj-0.4, foi usada. Atividade quelante de ferro de heterofucanas (1,5
mg/mL) extraídas de D. delicatula foi relatada por Magalhães e colaboradores (2011)
como apresentando 45,5% de atividade. Camara e colaboradores (2011) também
relataram atividade quelante de ferro (2 mg/mL) de 33,3% de uma heterofucana
denominadas de CC-1.2 extraída da alga marrom Canistrocarpus cervicornis. Assim,
pode-se dizer que as heterofucanas F1-75 e F1>100 induziram maior atividade
quelante de metais, e em concentrações que variaram de 2 a 2,6 vezes e de 1,5 a 2
92
vezes, respectivamente, menores que as concentrações usadas pelos autores
citados.
A quelação de metais pode ser indicativa de que, em sistemas biológicos, os
polissacarídeos possam atrasar ou inibir a ação de radicais livres (SIES, 1993)
provenientes de reações enzimáticas, pois tais enzimas necessitariam de cofatores
metálicos (ROCHA et al., 2007). Kumar e colaboradores (2008) relataram que a
capacidade quelante de metais está correlacionada a atividade antioxidante, pois o
processo de quelação previne a geração de espécies reativas do oxigênio (EROs) e,
consequentemente, o dano oxidativo. Sellimi e colaboradores (2014) relataram que
a estabilização de metais de transição como ferro e cobre por agentes quelantes
podem inibir a oxidação lipídica. O efeito pro-oxidante relacionado aos íons ferro deve-
se a reação desse metal de transição com H2O2, produzindo radical hidroxil, que
podem ocasionar danos a diversas moléculas intracelulares (VALKO et al., 2007;
QUEIROZ et al., 2015). Dessa forma, assume-se que polissacarídeos extraídos de
organismos como as algas podem mudar o estado metabólico de sistemas biológicos,
como as células, alterando processos no sentido de aumentar ou diminuir a
intensidade de reações químicas importantes para o equilíbrio homeostático celular.
Os dados levam à observação de que, dentre as glucanas, somente a
laminarina F1-5 apresentou atividade imunomoduladora, uma vez que, na maior
concentração estudada (10 µM) houve a duplicação na quantidade de NO e elevação
significativamente na concentração citocinas como TNFα e IL-6. Outros autores já
mostraram que laminarinas apresentam atividade imunomoduladora, como as
laminarinas estudadas pelo grupo de Yin e colegas (2014). Esses autores revelaram
que peixes da espécie Epinephelus coioides quando ingeriam laminarinas passavam
a ter uma maior quantidade de RNAm de interleucina 1-β (IL- 1β) e interleucina 8 (IL-
8). Outras glucanas também são capazes de aumentar a expressão de citocinas como
TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β (MENAGA et al., 2012). No entanto, as glucanas F1-20 e F1-
40, nas condições testadas, não apresentaram atividade imunomoduladora. Esses
dados indicam que glucanas não celulosídicas de algas com massa molecular em
torno de 20 e 40 kDa não são bons agentes imunomoduladores, entretanto é
necessário que outras laminarinas, que também apresentem essa massa molecular
sejam avaliadas para confirmar essa hipótese.
Similar a F1-5, as heterofucanas mostraram-se como agentes
imunomoduladores, principalmente no que se refere a produção de NO apresentada
93
por F1>100. Outros grupos também mostraram que fucanas são potentes
estimuladores da produção de NO, por exemplo, as fucanas obtidas das algas
Ascophyllum nodosum e Fucus vesiculosus aumentaram a quantidade de NO no meio
extracelular quando incubadas com células RAW 264.7. Contudo, a fucana de
Ascophyllum foi 6 vezes mais potente que a fucana de Fucus (JIANG et al., 2011), o
que mostra claramente que a potência de estímulo das células RAW depende de
propriedades intrínsecas a cada fucana. Esses dados levam a crê que a heterofucana
F1>100 tem potencial como agente imunomodulador e que estudos futuros devem ser
realizados para confirmarem esse potencial.
Um dado observado nesse trabalho que é a favor do potencial imunomodulador
das heterofucanas F1-75 e F1>100 foi aquele obtido com o ensaio de citotoxidade,
quando se mostrou que, nas condições testadas, o aumento da produção de NO não
foi provocado por nenhum efeito agressor da heterofucana às células RAW, já que as
heterofucanas não apresentaram citotoxidade para estas células.
As glucanas também não foram citotóxicas para linhagens de células RAW. Na
verdade, a presença das glucanas aumentaram a redução do MTT, o que é indicativo
de ação mitogênica. Outras glucanas também já foram descritas como agentes
mitogênicos, como o trabalho de Maity e colaboradores (2015) que demonstraram que
glucanas extraídas do fungo Entoloma lividoalbu estimularam a proliferação de
macrófagos em 2 vezes quando comparado ao controle. Na realidade muitos
trabalhos demonstram que β-glucanas são estimulantes de macrófagos, podendo
interagir com receptores Dectina-1 por intermédio de ligações hidrofóbicas (SYLLA et
al., 2011).
Com o emprego das glucanas F1-5, F1-20 e F1-40 houve aumento da redução
de MTT pelas células 3T3 (fibroblásticas), fato este não observado com emprego das
heterofucanas. O estímulo de fibroblastos por β-glucanas também foi relatado por
Methacanon e colaboradores (2011), que demonstraram que β-glucanas de 5 kDa
estimularam secreção de IL-8 por estas células. Ao estudarem novos componentes
com finalidade de produzir matriz extracelular Ayoub e colaboradores (2015) relataram
que laminarinas da alga Sacacharina longicruris são promissores polissacarídeos para
este fim, uma vez que estimularam fibroblastos a sintetizarem colágeno tipo 1,
importante componente da matriz extracelular. Não foram encontrados trabalhos que
demonstrassem ação de laminarinas como citotóxicas para linhagens de células 3T3,
94
o que induz a estudos futuros quanto ao melhor entendimento desses polissacarídeos
sobre essa linhagem celular.
Análise das atividades citotóxicas das glucanas e heterofucanas obtidas, frente
a linhagens tumorais sugerem que estes polímeros, nas condições testadas, não
apresentam propriedades citotóxicas para células HepG2 (carcinoma de células
hepáticas). Já para células 786-0 (carninoma de células renais), somente a glucana
F1-5, em todas as concentrações, e as heterofucanas F1>100 (1 e 10 µM)
proporcionaram diminuição da viabilidade desta linhagem celular. Quanto a
citotoxidade das células de melanoma (B16F10), somente a glucana F1-20 se
destacou por proporcionar redução de cerca de 50% da viabilidade desta linhagem
em ensaio de 24 horas. Menchova e colaboradores (2014) ao analisarem a atividade
antiproliferativa de laminarinas da alga marrom Eisenia bicyclis sobre linhagem de
melanoma SK-MEL-28 relataram que esses polissacarídeos inibiram a formação de
colônias dessas células. Estes autores ainda afirmaram que o grau de ramificação é
importante para a atividade antitumoral. Já Smiderle e colaboradores (2014) afirmam
que o grau de ramificação aumenta a solubilidade do polímero. Vale salientar que,
além das ramificações, a distribuição da massa molecular também é importante para
as atividades biológicas de β-glucanas (SADOVSKAYA et al., 2014). Mudanças
estruturais de laminarinas com objetivos de aumentar a atividade antitumoral têm sido
relatadas onde através de sulfatações do polímero, a atividade antitumoral pode ser
aumentada (JI; JI; MEN et al., 2013). Esses dados sugerem que características
intrínsecas aos polissacarídeos, possam atuar de forma decisiva no processo de
aumento ou diminuição na viabilidade/citotoxidade de linhagens celulares. Dessa
forma, é possível que a atividade induzida por F1-20 se deva a características
peculiares a sua estrutura.
É de se destacar que as glucanas não promoveram elevação do tempo de
coagulação por teste aPTT. Já as heterofucanas F1-75 e F1>100, quando na
concentração de 1 µM, apresentaram atividade anticoagulante em teste aPTT, com
aumento do tempo de coagulação em 5,6 e 6,4 vezes, respectivamente, em relação
ao controle negativo. Polissacarídeos sulfatados são extensivamente referidos como
moléculas anticoagulantes (ALBUQUERQUE et al., 2004). De acordo com Magalhães
e colaboradores (2011), a presença e posição do grupo sulfato nos resíduos de açúcar
é importante para atividade anticoagulante de uma fração de polissacarídeos
sulfatados (0,4 mg/mL) da alga D. delicatula, os quais prolongaram o tempo de
95
coagulação em 3,8 vezes. A presença de sulfato em polissacarídeos como fator
importante na atividade anticoagulante também é referida por Alves e colaboradores
(2015), que descreveram a importância da presença de sulfato na estrutura de
polissacarídeos como sendo de fundamental relevância para a promoção da elevação
do tempo de coagulação quando este é analisado por teste de aPTT. Wijesekara e
colaboradores (2011) afirmaram que compostos que prolongam aPTT estão
associados a inibição da via intrínseca de coagulação.
Com os dados das atividades antioxidantes, imunododuladoras e citotóxicas,
além da atividade anticoagulante, foi possível eleger a glucana F1-20 como
polissacarídeo que apresentou resultados mais promissores, uma vez que, dentre
outras atividades, proporcionou menor viabilidade de células de melanoma (linhagem
B16F10).
Esse dado sugeriu questionamentos acerca da baixa viabilidade proporcionada
por F1-20 sobre as células de melanoma. Análises da possível indução de morte ou
alteração do ciclo celular, devido à presença de F1-20, foram realizadas por técnica
de citometria de fluxo associada à marcação de células B16F10 com Anexina-FITC e
iodeto de propídeo e indicaram que F1-20 proporcionou diminuição da viabilidade
destas células não por indução de morte celular por apoptose ou necrose, mas devido
a alteração no ciclo celular, diminuindo a intensidade de proliferação das células.
Dados semelhantes ou que demonstrassem a ação de β-glucanas sobre células de
melanoma murino da linhagem B16F10 não foram encontrados. No entanto, a análise
de laminarinas como agentes antiproliferativos para linhagem de melanoma humano
SK-MEL-28 foi apresentada por Menchova e colaboradores (2014) que ao avaliarem
a atividade antiproliferativa de laminarinas da alga Eisenia bicyclis verificaram que
estes polissacarídeos promoveram inibição da formação de colônias destas células e
também de células de câncer de cólon da linhagem DLD-1. Porém, outros autores
relatam laminarinas como indutoras de apoptose em linhagens cancerígenas de cólon
humano (linhagens LoVo e HT-29) via interação com receptores de morte e ativação
de caspases (JI; Ji, 2014; PARK et al., 2012),
Outras β-glucanas também têm sido apontadas como moléculas antitumorais,
como demonstrado por Sadovskaya e colaboradores (2014), ao relatarem que β -
glucanas da microalga Isochrysis galbana alteram o ciclo celular no sentido de diminuir
a proliferação de células de leucemia humana da linhagem U937 (linfoma monocítico
96
humano). Neste caso a β-glucana apresentou ligação β-(16) no esqueleto central
com ramificações em β-(13).
O mecanismo exato de como F1-20 altera o ciclo celular das células B16F10
não está claro. No entanto, como já descrito, a atividade biológica de β-glucanas tem
sido intimamente relacionada à sua estrutura (BOHN; BEMILLER, 1995;
SADOVSKAYA et al., 2014), sendo a estrutura fina e o grau de ramificação
características importantes para atividade imunomoduladora (RUTHES et al., 2013;
MIKKELSEN et al., 2014) e antitumorais (MENCHOVA et al., 2014).
As características estruturais de F1-20 foram avaliadas através de métodos
espectroscópicos de infravermelho e RMN de 1H e 13C, associado a dados da literatura
(Tabelas 12 e 13). Assim, como o resultado da constituição monossacarídica já havia
revelado que F1-20 é composta por glicose e, associado aos resultados obtidos com
o espectro de infravermelho, que revela a existência de vibrações de ligações de
grupos químicos como OH, CH e CO (Tabela 12) típicas de sacarídeos (AHMAD et
al., 2010; KHAN et al., 2016; SEMEDO et al., 2015) e que há, nestes açúcares, a
presença de absorções entre 889 e 892 cm-1 condizentes com ligações em
configuração β (WANG et al., 2015; JIN et al., 2012), como o pico em 891.7 cm-1,
pode-se afirmar que F1-20 se trata de uma β-glucana. Para responder
questionamentos acerca de estrutura molecular fina, como linearidade e/ou grau de
ramificação, técnicas de ressonância magnética nuclear de carbono 13 (13C) e
hidrogênio 1 (1H), foram empregadas.
97
Tabela 12 – Números de onda.cm-1 característicos de grupos funcionais
1, Liu et al., 2015; 2, Ahmad et al., 2010; 3, Jin et al., 2012; 4, Khan et al., 2016; 5, Wang et al., 2015; 6, Semedo et al., 2015; Fonte: Autoria própria
A análise da estrutura fina de F1-20 foi realizada com os espectros de RMN
unidimensionais de 13C e 1H assim como bidimensionais por técnicas de COSY
(correlação homonuclear de 1H-1H) e HSQC (correlação heteronuclear de 13C-1H), dos
quais pôde-se determinar os sistemas de spins observados na Tabela 11. Na Tabela
13 (a seguir) pode-se observar os sistemas de spins de F1-20 e sistemas de spins de
outras β-glucanas descritas da literatura.
98
Tabela 13 - Sistemas de spins de F1-20 e de outras β-glucanas
1, Hu et al., 2016; 2, Lowman et al., 2011. Fonte: Autoria própria.
Na RMN unidimensional de 1H verificou-se a presença de 3 sinais na região
anomérica (4,58; 4,57 e 4,31 ppm), já na RMN de 13C verificou-se a presença de dois
sinais (103,8 e 104,1 ppm), estes sinais são característicos de ligações glicosídicas
do tipo β (BI et al., 2013), confirmando os achados da espectroscopia de
infravermelho. Ainda na RMN de 13C verificou-se os sinais em 86,4 e 86,0, que são
característicos de carbono 3 em ligação glicosídica. Resultado semelhante foi descrito
por Chen e colaboradores (2016) ao analizarem a estrutura fina de nanofibras de β-
glucanas com ligações (13). Dessa forma, pôde-se propor que F1-20 apresenta
ligações do tipo β-(13). Outros sinais observados, como 74,4; 74,5 e 74,6; 76,1;
70,1; 75,9 e 77,4; 62,3; 62,2 e 69,6 ppm, foram atribuídos a carbonos C2, C3, C4, C5
e C6, respectivamente. O último sinal (69.6 ppm.) foi atribuído ao C6 O-substituído.
Os resíduos de F1-20 são semelhantes aos referidos por HU e colaboradores (2016)
que analisaram uma glucana do fungo Cordyceps sinensis com ligações do tipo β-
(13) ramificada em β-(16). Os sinais de C1 e C3, e o deslocamento de C6 O-
substituído, suportaram a ideia da existência de um polímero ramificado, com ligações
do tipo β (13) e β (16).
Nos espectros de RMN bidimensionais de correlação heteronuclear (HSQC) e
homonuclear (COSY) verificou-se a existência de 3 sinais anoméricos e, associado
99
aos dados da literatura, foram atribuídos a presença de 3 resíduos distintos de glicose.
Utilizando-se a técnica HSQC foi possivel evidenciar correlações 13C/1H de 3 ligações
do tipo β-D-Glcp-(1: (δ 103,8/4,58; δ 103,8/4,57 e δ 104,1/4,31), que foram
atribuídas a resíduos de 3)-β-D-Glcp-(1 da estrutura central da molécula, ao
resíduo 3,6)-β-D-Glcp-(1, também da estrutura central, substituído em C6 e ao
resíduo β-D-Glcp-(1 substituinte e terminal não redutor, respectivamente.
Assim, baseado nos dados da Tabela 13 e nas análises discutidas, F1-20 foi
definida como uma β-glucana com ligações do tipo β-(13) no esqueleto central e
ramificações em β-(16). A análise da intensidade dos sinais anoméricos possibilitou
concluir que o polímero apresenta um ponto de ramificação a cada 9 resíduos do
esqueleto central (grau de ramificação de 0,10). Dessa forma a estrutura de F1-20 foi
proposta, como se vê na Figura 22.
Figura 22 - Estrutura molecular proposta da β-glucana (13)(16) F1-20. Fonte: Autoria própria.
Diferentes β-(13)(16)-glucanas com graus variados de ramificação têm
sido obtidas, por exemplo, glucanas com um ponto de ramificação a cada 7 resíduos
da estrutura central (grau de ramificação de 0,12) foi extraída das algas marrons
Ecklonia radiata e Cystophora sclaris, já uma β-(13)(16)-glucana de 6,9 kDa com
grau de ramificação de 0,21 foi isolada por Bobadilla e colaboradores (2013), e na
ocasião esses pesquisadores relataram efeito imunomodulatório desse polímero por
aumentar a atividade de linfócitos B (CD19+). Moreno e colaboradores (2016), ao
extraírem diferentes β-glucanas (13)(16) do fungo Cordyceps sinensis, afirmaram
que o grau de ramificação não influenciou na atividade antinocipectiva desses
polissacarídeos, no entanto esses polímeros apresentaram alta massa molecular (em
torno e 400 kDa).
100
A diversidade estrutural que as β-glucanas apresentam torna difícil uma análise
comparativa. No entanto, as atividades que F1-20 proporcionou sugerem que este
polissacarídeo possa ser aplicado como biomaterial em setores agroindustriais,
alimentícios ou farmacológicos. Devido às suas características estruturais,
apresentando relação estrutural com outras β-glucanas modificadoras de respostas
biológicas, a fácil obtenção e as promissoras atividades induzidas por esse
polissacarídeo, associado ao crescente desenvolvimento de novas pesquisas
relacionadas a compostos antioxidantes, imunomuduladores e antitumorais, acredita-
se que esse polímero possa ser usado para estas atividades. Mais estudos devem ser
realizados no sentido de melhor entendimento dos mecanismos de ação que esses
polissacarídeos possam apresentar, com vistas a seu uso na indústria como polímeros
naturais de uso biotecnológico. Ressalta-se que os estudos aqui realizados foram
todos in vitro e, assim, torna-se necessário novas análises que possam elucidar
efeitos de F1-20 em sistemas multicelulares, como in vivo.
101
5. CONCLUSÕES
- 06 Frações polissacarídicas físico-químicamente diferenciadas foram extraídas com uso de propanona;
- A fração F1 foi a que apresentou melhores características para posterior subfracionamento;
- A fração F1 é composta por polissacarídeos com diferentes massas moleculares, tanto neutros como sulfatados.
- As glucanas (F1-5, F1-20 e F1-40) nas condições testadas, e comparando-as com as heterofucanas (F1-75 e F1>100), não são boas sequestradoras de radicais livres;
- Dentre as amostras, a F1-5 e a F1>100 foram as que apresentaram maiores potenciais imunomodulatórios;
- A ação citotóxica das amostras variou conforme a linhagem celular utilizada. O destaque foi a glucana F1-20 quando foi utilizada com as células de melanoma (B16F10);
- A glucana F1-20 se trata de uma β-glucana formada por uma estrutura central, que é constituída de glicoses unidas por ligações do tipo β (13), e por ramificações a cada 9 resíduos da estrutura central. Estas são formadas por um resíduo de β-glicose ligado ao carbono 6 do açúcar da estrutura central.
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