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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Programa de Pós-Graduação de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

Escola de Química

Dissertação de Mestrado

Aplicação de Tecnologia Enzimática

na Obtenção de β-Caroteno a partir de

Óleo de Buriti (Mauritia vinifera)

Bernardo Dias Ribeiro

RIO DE JANEIRO

FEVEREIRO/2008

APLICAÇÃO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA NA OBTENÇÃO DE β-CAROTENO A PARTIR DE ÓLEO DE BURITI (MAURITIA VINIFERA)

Bernardo Dias Ribeiro

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE PÓS-

GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS DA ESCOLA

DE QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIIRO, COMO PARTE DOS

REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS (M.Sc.).

Orientadores:

Prof. Daniel Weingart Barreto, D. Sc. Profª. Maria Alice Zarur Coelho, D. Sc.

RIO DE JANEIRO

FEVEREIRO/2008

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T 18 R484a Ribeiro, Bernardo Dias

Aplicação de tecnologia enzimática na obtenção de β-caroteno a partir de óleo de buriti (Mauritia vinifera)/ Bernardo Dias Ribeiro. Rio de Janeiro, 2008.

xvi, 103 f.: il. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos

Químicos e Bioquímicos) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, 2008.

Orientadores: Daniel Weingart Barreto e Maria Alice

Zarur Coelho 1. Hidrólise enzimática. 2. Óleo de Buriti. 3. β-

Caroteno 4. Lipases I. Barreto, D. W. (Orient.) II. Coelho, M. A. Z. (Orient.) III. UFRJ. Escola de Química. IV. Título

CDD: 665.3
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AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus por ter me dado força e autoconfiança para conseguir superar todas as dificuldades que enfrentei durante esta dissertação;

À minha mãe Sonia, que sempre lutou muito para me dar estudo, comida, conforto, e tudo mais o que ela pode fazer, apesar de todas as dificuldades que a vida lhe proporcionou. Sempre darei o meu melhor para poder corresponder o seu esforço, mãe;

À minha avó Maria, meu avô Afranio e meu tio Afranio José por me apoiarem sempre quando precisei, apesar de não conseguir ser mais presente como era em alguns anos atrás, mas tenham certeza que amo muito todos vocês;

À minha noiva Aline, porque além de me fazer muito feliz, me deu algumas sugestões interessantes durante a condução desta dissertação;

A todos os meus amigos e familiares, por não terem me esquecido apesar de toda minha ausência neste período;

Ao meu orientador prof. Daniel Barreto, grande mestre e “pai científico”, por ter me ensinado como pensar mais concretamente sobre produtos naturais e também na minha vida, a ter mais foco nas pesquisas devido a minha avidez de querer saber sobre tudo e achar tudo interessante. Grandes conversas na hora do almoço que giravam em torno de praticamente qualquer assunto. Acima de tudo, mestre, obrigado por sua amizade e consideração;

À minha orientadora profª Maria Alice, por ter me acolhido carinhosamente no seu laboratório desde 2003, e que considero como minha “madrinha científica”. Quem conhece sabe que você tem um coração imenso, teacher, e só tenho a agradecer por mim e por todos do laboratório por tudo o que você faz pensando em nós;

À Roberta, Etel, Priscilla, Gizele, Ana Iraidy, Ariana, André, Mariana, Kelly, Tatiana e todos os outros que freqüentaram o laboratório de Enzimologia Industrial, pela amizade e pelo ambiente agradável de trabalho;

Á estagiária Lívia, por ter me ajudado em algumas análises em um ponto crítico da dissertação, e também ao pessoal do Departamento de Processos Orgânicos (Érika, Elizandra, Karine e Lourdes) pela convivência pacifica e divertida;

À profª Suely Freitas, por te me emprestado alguns solventes para realização de experimentos;

À profª Eliana Flávia, e ao técnico Paulinho, por terem permitido o uso do shaker no laboratório E-107;

A profª Magali Cammarota, por ter permitido o uso dos seus equipamentos, enquanto nosso laboratório estava em obras;

A profª Andréa Salgado e a pós-doutoranda Ninoska, por ter permitido o uso de seu shaker no Laboratório de Engenharia Química;

Ao prof Alexandre Torres (IQ-UFRJ), por ter me tirado várias dúvidas de HPLC, e de análise de insaponificáveis;

À profª Claudia Rezende (IQ-UFRJ), e as alunas Carolina, Silvia e Michelle, por terem feito e me explicado um pouco mais sobre análise da composição de ácidos graxos em cromatografia em fase gasosa;

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À prof Délia Rodriguez-Amaya (FEA-UNICAMP), por ter me enviado um artigo falando sobre carotenóides da polpa de buriti, e por ter feito o guia de análise e isolamento de carotenóides, que foram essenciais para a tese;

A todas as demais pessoas que contribuíram, direta e indiretamente, para que o presente texto pudesse ser desenvolvido;

Aos membros da banca examinadora, pelo aceite do convite;

A CAPES, pela bolsa de mestrado concedida;

A FAPERJ, pela bolsa ALUNO NOTA 10 concedida;

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Alguns homens vêem as coisas como são, e dizem: Por quê?

Eu sonho com as coisas que nunca foram e digo: Por que não?

George Bernard Shaw

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RESUMO RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicação de tecnologia enzimática para obtenção de β-caroteno a partir de óleo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.

O β-caroteno é utilizado como corante alimentício ou como complemento nutricional, por ser a principal fonte de pró-vitamina A. Estima-se que o mercado mundial de carotenóides, que em 2005 foi de 887 milhões de dólares, irá crescer 3% ao ano, quebrando a barreira de 1 bilhão de dólares em 2009, sendo o β-caroteno responsável por quase 30% deste mercado. A maior parte do β-caroteno vendido no mundo é obtida por síntese química a partir da β-ionona, mas uma pequena parte é produzida por processos biotecnológicos, utilizando diferentes microorganismos, tais como fungos filamentosos (Blaskelea trispora e Phycomyces blaskeleeanus), leveduras (Rhodotorula glutinis), bactérias (Flavobacterium multivorum) e microalgas (Dunaliella salina e D. bardawil). Alguns frutos oleaginosos como o dendê (Elaeis guineensis) e o buriti (Mauritia vinifera) apresentam um alto teor de carotenóides, principalmente de β-caroteno. O buriti é uma palmácea que cresce em diversas áreas do Brasil, e apresenta diversos usos tradicionais, como na preparação de refrescos e doces da região Amazônica. O recente interesse em novas fontes naturais de β-caroteno têm estimulado o desenvolvimento de processos para a extração do óleo rico em carotenóides do buriti. A maior parte desses processos, entretando, ainda é baseada em tecnologias convencionais que incluem a secagem e a prensagem do óleo da polpa. O presente trabalho trata da caracterização inicial do óleo bruto e refinado de buriti, incluindo a determinação dos insaponificáveis, e posteriormente a hidrólise enzimática de ambos os óleos, para a posterior extração e concentração de β-caroteno. Na etapa de hidrólise foi avaliado o desempenho de duas lipases comerciais, Lipozyme TL IM e CALB L, e também de uma lipase produzida em laboratório originada de Yarrowia lipolytica. Os parâmetros avaliados no processo de extração foram: temperatura, quantidade de enzima (atividade enzimática) e relação substrato (óleo de buriti) / água. As condições experimentais foram estabelecidas através de um planejamento estatístico de experimentos, de forma a se otimizar seus valores em função do maior rendimento de ácidos graxos livres e a perda mínima de carotenóides durante o processo. Os resultados foram analisados em relação ao teor de ácidos graxos livres por titulação; carotenóides totais por espectrofotômetro e composição de carotenóides totais por HPLC, utilizando coluna YMC ODS-A com fase móvel de acetonitrila/metanol/THF (50/45/5). Na caracterização do óleo bruto, os resultados foram similares aos já encontrados na literatura, mas o óleo refinado apresentou apocarotenóides, que são formados durante o processo de refino de óleos vegetais. As condições ótimas de hidrólise enzimática foram diferentes para cada óleo, onde a lipase Lipozyme TL IM apresentou uma atividade lipolítica superior às demais. Após a hidrólise do óleo, foram testados alguns métodos para separar os ácidos graxos formados dos carotenóides, e assim aumentar a concentração de β-caroteno no produto final.

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ABSTRACT RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicação de tecnologia enzimática para obtenção de β-caroteno a partir de óleo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.

β-carotene is the main source of provitamin A, and is widely used as a food colorant and nutritional supplier. The global market for carotenoids, which was of US$ 887 millions in 2005 and has been growing at an yearly rate of 3% , is estimated to surpass US$ 1 billion in 2009., β-carotene being responsible for almost 30% of this market. Most of the β-carotene sold in the world is produced by chemical synthesis from β-ionone, but a small amount is manufactured using biotechnological processes, based on different microorganisms, such as fungi (Blaskelea trispora and Phycomyces blaskeleeanus), yeasts (Rhodotorula glutinis), bacteria (Flavobacterium multivorum) e microalgae (Dunaliella salina and D. bardawil). Some oleaginous fruits such as palm (Elaeis guineensis) and buriti (Mauritia vinifera) present high concentrations of carotenoids, specially β-carotene. Buriti is a palm tree that grows wild in different areas of Brazil, and has been traditionally used for the preparation of beverages and candies in the Amazon area. The recent interest about other natural sources of β-carotene stimulated the development of processes to extract the carotenoid-rich oil of the buriti fruit. Most processes, however, are still based on the conventional technologies for pulps, including drying and pressing the oil off the pulp. The present work involves the initial characterization of crude and refined buriti oil. The characterization includes the determination of unsaponifiable matter, followed by enzymatic hydrolysis, for further extraction and concentration of β-carotene from the buriti oil. In the hydrolysis process, the performance of two commercial lipases Lipozyme TL IM and CALB L, and also a lipase originated from Yarrowia lipolytica produced in our laboratory was evaluated. The analysed parameters in the hydrolysis process were temperature, enzyme quantity (enzymatic activity) and ratio substrate buriti oil/ water. The experimental conditions were established based on an experimental design in order to set the more favourable conditions for the process. The results were analysed for the free fatty acids contents using titration; total carotenoids using spectrophotometry and its composition by HPLC, using a YMC ODS-A column with a mobile phase of acetonitrile/methanol/THF (50/45/5). In the characterization of crude oil, the results were similar with those described in the literature, but the refined oil presented apocarotenoids, which were formed during the refining of the oils. The optimized conditions of the enzymatic hydrolysis were different for each oil, where the Lipozyme TL IM had a higher lipolytic activity. After the hydrolysis of the oil, some methods were tested to separate the fatty acids formed from the carotenoids, increasing the β-carotene concentration in the final product.

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LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Exemplares de soja, canola e palma ..........................................................................1 Figura 2 - Traumatina .................................................................................................................1 Figura 3 - Principais carotenos ...................................................................................................5 Figura 4 - Principais xantofilas...................................................................................................6 Figura 5 - Biossíntese resumida dos insaponificáveis (Simões et al, 2003)...............................8 Figura 6 - Esquema geral de biossíntese de terpenóides (Dewick, 2002) ..................................8 Figura 7 - Biossíntese de licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005). ..................9 Figura 8 - Biossíntese de carotenóides a partir do licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005)................................................................................................................................10 Figura 9 - Principais isômeros cis do β-caroteno .....................................................................11 Figura 10 - Epoxicarotenóides derivados do β-caroteno..........................................................11 Figura 11 - Apocarotenóides derivados do β-caroteno ............................................................12 Figura 12 - Formulação de β-caroteno dispersável em água (http://www.corporate.basf.com/, 2007).........................................................................................................................................15 Figura 13 – Alimentos biofortificados. A) Tomate laranja e normal; B) Arroz dourado e branco .......................................................................................................................................16 Figura 14 - Vias sintéticas para obtenção de β-ionona.............................................................18 Figura 15 - Síntese de β-caroteno por condensação enol-éter..................................................19 Figura 16 – Síntese de β-caroteno por condensação de Wittig ................................................19 Figura 17 – Dunaliella salina e seu cultivo em tanques abertos ..............................................20 Figura 18 – Phycomyces blakesleeanus e um zigosporo de Blakeslea trispora .......................22 Figura 19 - Rhodotorula glutinis e Sporobolomyces roseus ....................................................22 Figura 20 - Halomonas elongata e Escherichia coli ................................................................23 Figura 21 – Palmeiras e frutos do buriti ...................................................................................25 Figura 22 – Algumas reações catalisadas por lipases...............................................................30 Figura 23 – Esquema geral do sítio ativo de uma lipase ..........................................................32 Figura 24 – Mecanismo de reação em lipases ..........................................................................33 Figura 25 – Perfil de carotenóides dos óleos de buriti .............................................................55 Figura 26 – Avaliação do tempo reacional de hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti .........................................................................................................................................56 Figura 27 – Avaliação da quantidade de ácidos graxos produzida pelo custo de lipase durante a hidrólise de óleo bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................56 Figura 28 – Avaliação da temperatura na redução da concentração de β-caroteno durante a hidrólise de óleo bruto (a) e refinado (b) de buriti ...................................................................57 Figura 29 – Avaliação da relação óleo/água na hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti .........................................................................................................................................58 Figura 30 – Avaliação da quantidade de enzima sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................58 Figura 31 – Avaliação da quantidade de enzima sobre a concentração de carotenóides .........58 Figura 32 – Avaliação de emulsificantes sobre a hidrólise enzimática dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................59 Figura 33 - Avaliação da adição de cálcio sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.....................................................................................................................................60 Figura 34 – Avaliação de adição de adsorventes sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................61 Figura 35 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................62

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Figura 36 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a concentração de carotenóides durante a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti .............................................................62 Figura 37 - Avaliação da substituição da água por tampão fosfato sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti ...............................................................................................62 Figura 38 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b).........................................64 Figura 39 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM..................................................................................................................................................65 Figura 40 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)........................................66 Figura 41 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L..................................................................................................................................................67 Figura 42 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b).................................68 Figura 43 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica ...................................................................................................................................69 Figura 44 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme TL IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b).........................................71 Figura 45 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme TL IM .............................................................................................................................................72 Figura 46 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)........................................73 Figura 47 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L................................................................................................................................................74 Figura 48 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b) ......................75 Figura 49 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica ...................................................................................................................76 Figura 50 – Otimização da quantidade de enzima na hidrólise enzimática dos óleos de buriti79 Figura 51 – Avaliação da velocidade de agitação sobre a hidrólise enzimática dos óleos de buriti .........................................................................................................................................79 Figura 52 – Otimização do tempo reacional na hidrólise enzimática dos óleos de buriti ........80 Figura 53 – Avaliação de ácidos graxos livres e carotenóides durante o pós-processamento do óleos bruto e refinado de buriti.................................................................................................82 Figura 54 – Perfil de carotenóides do óleo refinado após desacidificação com soda alcoólica82 Figura 55 – Fitoesteróis ..........................................................................................................101 Figura 56 – Retinal .................................................................................................................102 Figura 57 - Tococromanóis: (A) Tocoferóis, (B) Tocotrienóis ..............................................102 Figura 58 – Toruleno (R = CH3) e Torularodina (R = COOH) ..............................................102

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LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Insaponificáveis de alguns óleos vegetais ................................................................2 Tabela 2 – Potenciais fontes vegetais produtoras de β-caroteno..............................................24 Tabela 3 – Composição centesimal da polpa do fruto de buriti ...............................................26 Tabela 4 – Perfil de ácidos graxos de frutos oleaginosos.........................................................27 Tabela 5 – Perfil de carotenóides de alguns óleo vegetais .......................................................27 Tabela 6 – Faixas ótimas de atuação de algumas lipases .........................................................31 Tabela 7 - Comparação entre processos convencionais de hidrólise de óleos e gorduras........35 Tabela 8 – Faixa de valores utilizada para otimização dos parâmetros da hidrólise enzimática..................................................................................................................................................50 Tabela 9 – Planejamento Composto Central em 3 níveis com 3 pontos centrais.....................51 Tabela 10 – Comparação da composição de ácidos graxos dos óleos de buriti .......................52 Tabela 11 – Comparação dos índices físico-químicos dos óleos de buriti...............................53 Tabela 12 – Comparação da composição de carotenóides dos óleos de buriti.........................54 Tabela 13 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti utilizando planejamento composto central ........................63 Tabela 14 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti utilizando planejamento composto central ...................70 Tabela 15 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti .........................................................................................................................................77 Tabela 16 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti .........................................................................................................................................77

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AOT Sulfosuccinato de bis(2-etill hexil) sódio ATP Adenosina Trifosfato BHT Butiril hidroxitolueno CHB1 Carotenóide β-hidroxilase non-heme-di-ferro monooxigenase CHB2 Carotenóide β-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450 CHE Carotenóide ε-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450 CRTISO Carotenóide isomerase FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FPP Pirofosfato de farnesila GGPP Pirofosfato de geranilgeranila HPLC High Pressure Liquid Chromatography IPP Pirofosfato de isopentenila LCB Licopeno β-ciclase LCE Licopeno ε-ciclase PD Fitoeno desaturase PEP Fosfoenolpiruvato ppm Partes por milhão = mg/kg PUFA Poly unsaturated fatty acids Span 20 Monolaurato de sorbitana THF Tetrahidrofurano Tween 80 Polioxietileno monooleato de sorbitana UV-VIS Ultravioleta-visível ZD ζ-Caroteno desaturase

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SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO _____________________________________________ 1

CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA _________________________________ 5

2.1) CAROTENÓIDES ___________________________________________________ 5 2.1.1) Características Gerais ______________________________________________ 5 2.1.2) Biossíntese _______________________________________________________ 7 2.1.3) Propriedades e modificações ________________________________________ 10 2.1.4) Ações benéficas à saúde____________________________________________ 12 2.1.5) β-Caroteno ______________________________________________________ 14

2.1.5.1) Formas de comercialização ______________________________________ 14 2.1.5.1.1) Matrizes lipofílicas_________________________________________ 14 2.1.5.1.2) Matrizes hidrofílicas________________________________________ 15 2.1.5.1.3) Alimentos biofortificados____________________________________ 16

2.1.5.2) Mercado_____________________________________________________ 17 2.1.5.3) Fontes Comerciais_____________________________________________ 17

2.1.5.3.1) β-caroteno Sintético ________________________________________ 17 2.1.5.3.2) β-caroteno Natural _________________________________________ 20

A – Processos Biotecnológicos ___________________________________ 20 A.1 – Microalgas ______________________________________________ 20 A.2 – Fungos Filamentosos______________________________________ 21 A.3 – Leveduras _______________________________________________ 22 A.4 – Bactérias________________________________________________ 23

B – Extração de Fontes Vegetais _________________________________ 24

2.2) BURITI____________________________________________________________ 25 2.2.1) Características Gerais _____________________________________________ 25 2.2.2) Óleo de Buriti____________________________________________________ 26 2.2.3) Outras Tecnologias _______________________________________________ 27

2.3) LIPASES __________________________________________________________ 29 2.3.1) Fontes e Propriedades _____________________________________________ 30 2.3.2) Estrutura e Aspectos cinéticos _______________________________________ 31 2.3.3) Especificidade ___________________________________________________ 33 2.3.4) Hidrólise Enzimática de Óleos e Gorduras _____________________________ 35

CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS __________________________________ 39

3.1) MATERIAIS _______________________________________________________ 39

3.2) EQUIPAMENTOS __________________________________________________ 39

3.3) MÉTODOS ANALÍTICOS ___________________________________________ 40 3.3.1) Composição de ácidos graxos _______________________________________ 40 3.3.2) Índices _________________________________________________________ 40

3.3.2.1) Saponificação (IS)_____________________________________________ 40 3.3.2.2) Peróxido (IP) _________________________________________________ 41 3.3.2.3) Iodo (II) _____________________________________________________ 42 3.3.2.4) Ácidos graxos livres (AGL) _____________________________________ 42

3.3.3) Densidade_______________________________________________________ 42 3.3.4) Umidade ________________________________________________________ 42 3.3.5) Material Insaponificável ___________________________________________ 43

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3.3.5.1) Teor de Insaponificáveis ________________________________________ 43 3.3.5.2) Carotenóides _________________________________________________ 44

3.3.5.2.1) Carotenóides Totais ________________________________________ 44 3.3.5.2.2) Composição de carotenóides _________________________________ 44

3.3.5.3) Tocoferóis Totais _____________________________________________ 45 3.3.5.4) Esteróis Totais________________________________________________ 45

3.3.6) Atividade Lipolítica _______________________________________________ 45

3.4) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS _______________________________ 46 3.4.1) Caracterização dos Óleos de buriti ___________________________________ 46 3.4.2) Pré-Avaliação do Processo Enzimático________________________________ 47

3.4.2.1) Tempo reacional e Seleção de enzimas_____________________________ 47 3.4.2.2) Temperatura _________________________________________________ 48 3.4.2.3) Relação Óleo/Água ____________________________________________ 48 3.4.2.4) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimática) ______________________ 48 3.4.2.5) Aditivos _____________________________________________________ 48

3.4.3) Otimização da Hidrólise Enzimática __________________________________ 49 3.4.4) Desacidificação e Concentração de β-Caroteno_________________________ 51

CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO _______________________________ 52

4.1) CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS DE BURITI ________________________ 52 4.1.1) Composição em ácidos graxos_______________________________________ 52 4.1.2) Determinação dos Índices Físico-Químicos ____________________________ 52 4.1.3) Composição e Perfil de Carotenóides _________________________________ 53

4.2) PRÉ-AVALIAÇÃO DO PROCESSO ENZIMÁTICO _____________________ 55 4.2.1) Determinação do Tempo Reacional e Seleção das Enzimas ________________ 55 4.2.2) Pré-avaliação dos Parâmetros do Planejamento Experimental _____________ 57

4.2.2.1) Temperatura _________________________________________________ 57 4.2.2.2) Relação Óleo/Água ____________________________________________ 57 4.2.2.3) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimática) ______________________ 58

4.2.3) Pré-avaliação dos Aditivos _________________________________________ 59 4.2.3.1) Emulsificantes ________________________________________________ 59 4.2.3.2) Cálcio ______________________________________________________ 59 4.2.3.3) Adsorventes__________________________________________________ 60 4.2.3.4) Tampão Fosfato_______________________________________________ 62

4.3) OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA ________________________ 63 4.3.1) Planejamento Experimental do Óleo Bruto de Buriti _____________________ 63

4.3.1.1) Lipozyme TL IM______________________________________________ 63 4.3.1.2) Lipozyme CALB L ____________________________________________ 66 4.3.1.3) Lipase de Yarrowia lipolytica ____________________________________ 68

4.3.2) Planejamento Experimental do Óleo Refinado de Buriti___________________ 70 4.3.2.1) Lipozyme TL IM______________________________________________ 70 4.3.2.2) Lipozyme CALB L ____________________________________________ 73 4.3.2.3) Lipase de Yarrowia lipolytica ____________________________________ 75

4.3.3) Resumo das Condições Ótimas na Hidrólise dos Óleos de Buriti ____________ 77 4.3.4) Otimização ______________________________________________________ 78

4.3.4.1) Quantidade de Enzima _________________________________________ 78 4.3.4.2) Agitação ____________________________________________________ 79 4.3.4.3) Tempo Reacional _____________________________________________ 79

4.4) DESACIDIFICAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE β-CAROTENO ___________ 80

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4.4.1) Recuperação da Alumina ___________________________________________ 80 4.4.2) Métodos de Desacidificação ________________________________________ 81

4.4.2.1) Partição com Etanol ___________________________________________ 81 4.4.2.2) Saponificação ________________________________________________ 82 4.4.2.3) Winterização _________________________________________________ 83

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÃO _____________________________________________ 84

CAPÍTULO 6 – SUGESTÕES ______________________________________________ 86

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________________________________ 88

GLOSSÁRIO ___________________________________________________________ 101

APÊNDICE _____________________________________________________________ 103

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CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO

Os óleos vegetais são a maior fonte de lipídeos comestíveis, contabilizando mais de

75% do total de gorduras consumidas no mundo, com uma produção anual de cerca de 150

milhões de toneladas. Entre estes, quase 75% é extraída do endosperma de sementes de

oleaginosas, como a soja e a canola, enquanto os demais são extraídos do pericarpo de frutos,

como oliva e palma (Figura 1) (Salas et al, 2000; FAO, 2007).

Figura 1 - Exemplares de soja, canola e palma

A função do óleo na maioria dos vegetais superiores é de reserva energética primária

nas sementes, sendo metabolizado através de reações de β-oxidação para produção de acetato,

que aciona o ciclo do glioxilato, gerando os intermediários para a formação de

monossacarídeos via gliconeogênese, auxiliando a germinação e o crescimento durante o

desenvolvimento da planta (Eastmond & Graham, 2001).

A presença de óleo no pericarpo de frutos tem como funções principais a proteção

contra perda de água pela formação de ceras; e o auxílio na defesa contra injúrias à superfície

do fruto, onde pela degradação enzimática por lipoxigenase são gerados aldeídos precursores

de um hormônio vegetal chamado traumatina (Figura 2), que induz o reparo na planta e tem

atividade antimicrobiana. (Salas et al, 2000).

Figura 2 - Traumatina

1

Nos plastídeos, como cloroplastos e cromoplastos ocorre, além da produção de

triglicerídeos, a biossíntese de outras moléculas, como os intermediários destes

triacilgliceróis, que são os fosfatídeos, os diglicerídeos e os ácidos graxos livres, e também do

material insaponificável (Salas et al, 2000).

Os insaponificáveis são definidos como a soma dos componentes dissolvidos em óleos

e gorduras, que após saponificação alcalina, permanece como resíduo não reagido e não-

volátil, sendo solúveis em solventes apolares (por exemplo, éter dietílico e éter de petróleo)

(Matissek et al, 1998). Estes insaponificáveis contêm principalmente carotenóides,

fitoesteróis e tococromanóis e seus derivados (vitamina E), além de alguns componentes

menores como clorofila, polifenóis, hidrocarbonetos (esqualeno) e álcoois triterpênicos,

agindo como antioxidantes e fotoprotetores, que ajudam a evitar a oxidação dos ácidos graxos

insaturados. A Tabela 1 apresenta o teor e o perfil de insaponificáveis de alguns óleos

vegetais (Gunstone & Padley, 1997; Gunstone, 2002).

Tabela 1 – Insaponificáveis de alguns óleos vegetais Óleos Insaponificáveis

(%) Fitoesteróis

(ppm) α-Tocoferol

(ppm) Carotenóides

(ppm)

Coco 0,8 – 1,5 500 – 1100 5 -

Milho 1,3 – 2,8 7900 – 22100 112 – 134 1,2 – 3,6

Algodão 1,5 – 2,0 2700 – 5900 389 -

Amendoim 0,4 – 1,0 900 – 2900 130 -

Palma 1,2 400 – 500 130 – 260 500 – 700

Palmiste 0,1 – 0,8 800 – 1400 62 4,3 – 11,8

Oliva 0,5 – 1,5 1200 – 2700 119 1 – 20

Canola 1,2 – 2,0 4800 – 11300 210 130

Soja 0,5 – 1,6 1800 – 4100 75 - 117 -

Girassol 1,5 2400 – 4500 487 – 608 1,0 – 1,5

Arroz 3 – 5 1800 800 -

2

Os insaponificáveis têm sido objeto de grande atenção devido as descobertas recentes

sobre seus inúmeros benefícios à saúde, a partir das evidências publicadas sobre a ação

protetora dos antioxidantes, vitamina E e β-caroteno, contra radicais livres que mediam

diferentes tipos de dano celular, que têm implicação no desenvolvimento de várias doenças

degenerativas, como câncer, doenças cardiovasculares, catarata e degeneração macular

(Güçlü-Üstündag & Temelli, 2004). Como consequência dessas descobertas, o interesse na

incorporação de componentes das frações insaponificáveis em produtos de consumo, como

alimentos, cosméticos ou suplementos nutricionais também aumentou muito, como por

exemplo a incorporação de fitoesteróis derivatizados em margarinas aumentando seus

benefícios à saúde, como a redução do risco de doenças cardiovasculares (Moreau et al,

2002).

As principais formas de obtenção dos insaponificáveis são por síntese química, que

geralmente é simples e de baixo custo, ou por extração e isolamento a partir de óleos vegetais

ou de subprodutos do refino (destilado de óleo desodorizado) através de diversos processos

como extração líquido-líquido (Bhosle & Subramanian, 2005), extração com fluido

supercrítico (Lau et al, 2007), cristalização fracionada (Xu et al, 2005), destilação molecular

(Moraes et al, 2006), saponificação (Bhosle & Subramanian, 2005), adsorção (Rossi et al,

2001) ou separação por membranas (Subramanian et al, 2001). Além da extração e refino,

também são estudados processos de derivatização das frações para melhor estabilização de

seus componentes ativos frente a agentes oxidantes (oxigênio, luz e metais) (Abidi, 2000;

Rupérez et al, 2001, Güçlü-Üstündag & Temelli, 2004).

3

Devido à semelhança entre as propriedades físicas (solubilidade, polaridade, massa

molar) de carotenóides e triglicerídeos, além da baixa seletividade da maioria dos métodos de

separação física empregados atualmente para a extração dos carotenóides, bem como as

alterações estruturais irreversíveis induzidas pelos métodos químicos, a busca por métodos

mais brandos e específicos para a extração dos carotenóides contidos em óleos vegetais

constitui um grande desafio (Güçlü-Üstündag & Temelli, 2004).

Nesta dissertação, a abordagem utilizada emprega a tecnologia enzimática como

alternativa limpa para obtenção de carotenóides de óleos vegetais. As enzimas são proteínas

que participam de várias reações bioquímicas, aceleram reações termodinamicamente

favorecidas, e apresentam características estereoespecíficas. Normalmente os processos

enzimáticos têm ação rápida, ausência de toxidez e não geram problemas ambientais, além de

ocorrerem em temperaturas e pHs brandos, atuando sobre um substrato específico com uma

baixa concentração de preparado enzimático (Godfrey & West, 1996; Uhlig, 1998).

O objetivo desta dissertação consiste no desenvolvimento de um bioprocesso

utilizando a hidrólise enzimática do óleo bruto e refinado de buriti através de lipases, visando

a alteração de polaridade e solubilidade dos triglicerídeos com a geração de ácidos graxos e

glicerol, facilitando assim a extração e concentração de β-caroteno por diferentes métodos

com potencial de aplicação comercial.

4

CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1) CAROTENÓIDES

2.1.1) Características Gerais

Carotenóides são os pigmentos responsáveis pelas cores vermelho, amarelo e laranja,

largamente distribuídos em frutas, flores, raízes, algas, invertebrados, peixes, pássaros,

bactérias, fungos e leveduras e têm como principais funções o auxílio na fotossíntese e a

fotoproteção (Isler,1971; Ikan,1991; Britton et al, 1995).

Os carotenóides incluem 2 classes de compostos: carotenos propriamente ditos,

compostos por hidrocarbonetos poliinsaturados C40 (Figura 3), e xantofilas, seus derivados

oxigenados (Figura 4).

Figura 3 - Principais carotenos

5

Dos carotenos acíclicos, licopeno e ζ-caroteno são os mais comuns. O licopeno é o

principal pigmento de muitos frutos carnosos avermelhados, como tomate (Lycopersicon

esculentum), melancia (Citrullus lanatus), mamão (Carica papaya), goiaba (Psidium guajava)

e toranja (Citrus paradisi), enquanto o ζ-caroteno está presente em pequenas quantidades em

grande número de plantas, sendo que apenas na carambola (Averrhoa carambola) e no

maracujá (Passiflora alata) este adquire maior importância, aparecendo como seu principal

pigmento. Outros carotenos como o fitoflueno e fitoeno são incolores e provavelmente mais

largamente distribuídos do que o reportado (Isler,1971; Britton et al,1995).

Dentre os carotenos cíclicos, o que mais se destaca é o β-caroteno, presente em

cenoura (Daucus carota), manga (Mangifera indica), acerola (Malpighia glabra), damasco

(Prunus armeniaca), nêspera (Mespilus germanica) e frutos da família Palmae/Arecaceae. O

α-caroteno e o γ-caroteno estão geralmente em menor concentração que o β-caroteno, sendo

o primeiro encontrado em cenouras e abóboras (Cucurbita sp.), e o último em rosa silvestre

(Rosa canina) e pitanga (Eugenia uniflora). O δ-caroteno é menos freqüente, mas encontrado

em tomate e pupunha (Bactris gasipaes) (Goodwin, 1976; Rodriguez-Amaya, 2001).

Figura 4 - Principais xantofilas

6

Dentre as xantofilas hidroxiladas, as principais são derivadas do α- e β-caroteno, como

a β-criptoxantina, luteína e zeaxantina. β-criptoxantina é o principal pigmento de frutos

alaranjados, como pêssego (Prunus persica), caqui (Diospyros kaki) e cajá-mirim (Spondias

mombin). Luteína é o carotenóide predominante em folhas, vegetais verdes e flores amarelas,

e a zeaxantina é o principal no milho (Zea mays) e no piquiá (Cariocar villosum). As

xantofilas epoxidadas como a violaxantina e a anteraxantina são os produtos da degradação

de outros carotenóides, como a zeaxantina, e subestimadas nos alimentos, como a manga, por

exemplo (Goodwin, 1976; Rodriguez-Amaya, 2001).

Há algumas xantofilas incomuns como a capsantina, presente em pimenta malagueta

(Capsicum frutescens), bixina, principal pigmento do urucum (Bixa orellana) e a crocetina,

que é predominante no açafrão (Crocus sativus) (Isler,1971; Britton et al,1995).

Embora folhas verdes contenham hidroxicarotenóides não esterificados, quando o

fruto amadurece, estes são esterificados com ácidos graxos. Mas em alguns frutos como kiwi

(Actinidia chinensis), que permanecem verdes mesmo quando maduros, estes compostos não

são esterificados (Rodriguez-Amaya, 2001; Bouvier et al, 2005).

2.1.2) Biossíntese

Os precursores dos metabólitos especiais presentes nos óleos vegetais, e o próprio óleo

são intermediários no metabolismo primário, que se inicia a partir da fotossíntese, onde a

glicose é gerada para depois ser consumida na respiração e produzir água e CO2, sendo que

esta ocorre em 3 etapas: glicólise, ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa. De uma

forma resumida, a Figura 5 mostra a formação destes metabólitos visando principalmente nos

insaponificáveis (Berg et al, 2004).

7

Figura 5 - Biossíntese resumida dos insaponificáveis (Simões et al, 2003)

A biossíntese dos carotenóides segue o padrão usual da síntese de terpenóides, que

segue a via do ácido mevalônico, onde este é descarboxilado gerando o pirofosfato de

isopentenila (IPP) – principal bloco construtivo dos isoprenóides. O esquema geral da

biossíntese de terpenóides pode ser visto na Figura 6 (Bouvier et al, 2005).

FPP

IPP

IPP

GGPP

Figura 6 - Esquema geral de b

iossíntese de terpenóides (Dewick, 2002)

8

A passagem do intermediário fitoeno para o licopeno (Figura 7) ocorre através de

enzimas que promovem a desidrogenação, envolvendo a remoção de pares de átomos de

hidrogênio de forma alternada (Dey & Harborne, 1997; Fraser & Bramley, 2004; Bouvier et

al, 2005).

Após a formação do licopeno, ocorre a ciclização através da licopeno ciclase, podendo

gerar δ-caroteno (anel ε) ou γ-caroteno (anel β), que são os precursores do α-caroteno e do β-

caroteno, respectivamente. Estes carotenos formados podem ser modificados para geração de

outros carotenóides como luteína e zeaxantina (Figura 8) e outras xantofilas, através de

hidroxilases, epoxidases, cetolases e sintases.

PD

ZDCRTISO

ZD

PD

Figura 7 - Biossíntese de licopeno. PD: fitoeno desaturase; ZD, ζ-caroteno desaturase; CRTISO, carotenóide isomerase (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).

9

LCE LCB

LCB LCB

CHB1, CHB2 CHB1, CHB2

CHE CHB1, CHB2

Figura 8 - Biossíntese de carotenóides a partir do licopeno. LCE, licopeno ε-ciclase; LCB, licopeno β-ciclase; CHB1, carotenóide β-hidroxilase non-heme-di-ferro monooxigenase; CHB2, carotenóide β-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450; CHE, carotenóide ε-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450 (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).

2.1.3) Propriedades e modificações

A presença de ligações duplas conjugadas na estrutura dos carotenóides contribui para

sua pigmentação, absorção de radiação na faixa de UV-VIS e atividade antioxidante, mas

também são a principal razão da sua instabilidade química, pois as ligações duplas conjugadas

são muito suscetíveis à oxidação e à isomerização geométrica.

Alguns fatores como calor, luz, ácidos, refluxo em solvente orgânico, fusão de cristais

e tratamento com iodo, podem promover a isomerização cis-trans dos carotenóides (Figura 9).

A isomerização de trans-carotenóides, que é a configuração usual dos carotenóides na

natureza, para a forma cis aumenta a solubilidade e diminui a intensidade da cor, o ponto de

fusão e a atividade de pró-vitamina A (Goodwin, 1976; Britton et al, 1995; Rodriguez-

Amaya, 2001; Schiebe & Carle, 2005).

10

Figura 9 - Principais isômeros cis do β-caroteno

A oxidação, o principal mecanismo de degradação dos carotenóides, é acelerada pela

luz, calor, presença de ácidos graxos insaturados, peróxidos, metais como ferro, cobre e

manganês, e exposição a solventes orgânicos e enzimas (lipoxigenases, fenoloxidases e

peroxidases) (Goodwin, 1976; Britton et al, 1995; Rodriguez-Amaya, 2001).

Os principais derivados da degradação de carotenóides são os epoxicarotenóides

(Figura 10), apocarotenóides (Figura 11) e compostos voláteis, que apesar de terem sua

atividade pró-vitamímica A muito reduzida, ainda podem ser aproveitados como corantes

alimentícios, no caso de alguns apocarotenóides, ou como aromatizantes naturais, no caso dos

compostos voláteis (Rodriguez & Rodriguez-Amaya, 2007; Uenojo et al, 2007).

Figura 10 - Epoxicarotenóides derivados do β-caroteno

11

Estes derivados são formados em vários tipos de processamento de alimentos, como

cozimento, fritura, pasteurização, extrusão e desidratação, com perdas em torno de 25-35%

(Marty & Berset, 1990; Pinheiro-Sant’ana et al, 1998; Rodriguez & Rodriguez-Amaya,

2007), e também na etapa de refino de óleos vegetais, onde ocorrem processos de

desacidificação, branqueamento e desodorização (Ouyang et al, 1980).

Figura 11 - Apocarotenóides derivados do β-caroteno

2.1.4) Ações benéficas à saúde

A mais importante função nutricional dos carotenóides é como precursor da vitamina

A (pró-vitamina A). O envolvimento do retinal (vitamina A) como cromóforo de pigmentos

visuais no olho é central no processo da visão. Hipovitaminose A ainda é um grande problema

nutricional em áreas subdesenvolvidas do mundo onde suas conseqüências, como xeroftalmia,

cegueira e morte prematura, ainda são comuns, particularmente em crianças.

12

A vitamina A também tem funções sistêmicas importantes no crescimento e na

eficiência reprodutiva, além da manutenção dos tecidos epiteliais e prevenção da sua

queratinização. Por isso, os retinóides têm sido utilizados para tratamento dermatológicos,

como a acne (Britton et al, 1995; Rucker et al, 2001; Niizu, 2003).

Qualquer carotenóide cíclico que possua um anel β tem atividade pró-vitamínica A,

principalmente o β-caroteno, podendo ser clivado por uma β-caroteno-15,15’-dioxigenase

para gerar retinal (Della Penna & Pogson, 2006).

A propriedade antioxidante dos carotenóides é independente da atividade de pró-

vitamina A, e está associada com a capacidade de se ligar a oxigênio singlete através do

sistema de duplas ligações conjugadas, e a máxima proteção é dada pelos carotenóides com

mais de 9 duplas ligações, razão pela qual o licopeno tem demonstrado maior eficiência

antioxidante que o β-caroteno. Em altas pressões parciais de oxigênio ou altas concentrações

de carotenóides, entretanto, estes podem apresentar atividade pró-oxidante (Packer et al,

1999; Rodriguez-Amaya, 2001; Niizu, 2003; Palozza et al, 2003).

Devido à sua capacidade antioxidante, o β-caroteno é utilizado como protetor solar

oral para prevenir o fotoenvelhecimento da pele e as queimaduras de sol, devendo ser ingerido

por várias semanas para aumentar o seu teor no plasma e na pele (Packer et al, 1999).

Os carotenóides, principalmente o licopeno, vêm sendo utilizados na proteção de

doenças cardiovasculares e degenerativas, câncer de próstata, estômago e pulmão, agindo em

possíveis mecanismos de modulação do metabolismo de carcinógenos, inibição da

proliferação celular, aumento da diferenciação de células através dos retinóides, estimulação

da comunicação intercelular e aumento da resposta imunológica (Niizu, 2003; Fraser &

Bramley, 2004). A zeaxantina e a luteína têm uma maior ação na prevenção da degeneração

macular relacionadas a idade (Packer et al, 1999; Rodriguez-Amaya, 2001; Fraser & Bramley,

2004).

13

2.1.5) β-Caroteno

O caroteno foi isolado pela primeira vez por Wackenroder em 1831 na forma de

cristais de cor vermelho-rubi extraído a partir da cenoura. Mas somente em 1907, Willstäder

identificou a fórmula molecular correta para o caroteno, C40H56, apesar de ainda ser uma

mistura de α-caroteno e β-caroteno. Em 1930, Karrer e Kuhn, obtiveram a formulação correta

do licopeno, β-caroteno, α-caroteno, zeaxanatina e luteína (Isler,1971; Britton et al,1995).

2.1.5.1) Formas de comercialização

O β-caroteno é utilizado como corante alimentício, variando de amarelo a laranja, em

concentrações entre 2 a 50 ppm, ou como complemento nutricional, por ser a principal fonte

de pró-vitamina A, já que 100% pode ser convertido a vitamina A (Britton et al,1995).

Os carotenóides sintéticos são purificados por cristalização com o objetivo de formar

grandes cristais, os quais podem ser facilmente separados por filtração e lavados dos isômeros

cis e dos subprodutos remanescentes na solução. Para serem comercializados, os carotenóides

precisam ser formulados para aplicação em matrizes hidrofílicas (sucos e bebidas) ou

lipofílicas (manteigas, margarinas e queijos), e para isso é preciso também diminuir o

tamanho dos cristais.

2.1.5.1.1) Matrizes lipofílicas

A solubilidade dos carotenóides comercialmente disponíveis em óleos vegetais é em

torno de 1000 ppm, mas concentrações entre 10 e 100 ppm já são suficientes para coloração

intensa. Para assegurar uma rápida dissolução, os cristais são cominuídos em moinhos de

bolas, alcançando diâmetros de 1 a 4 µm. Dispersões pastosas preparadas dessa maneira têm

concentrações de carotenóides entre 20 e 30%, e são predominantemente utilizadas para

colorir e estabilizar gorduras vegetais, por exemplo, na produção de margarina (Britton et

al,1996).

14

2.1.5.1.2) Matrizes hidrofílicas

Os carotenóides produzidos industrialmente são praticamente insolúveis em meio

aquoso, sendo então um desafio desenvolver preparações dispersáveis em água para o setor de

alimentos e rações. Foi demonstrado que a intensidade de coloração suficiente e a

biodisponibilidade máxima podem ser conseguidas pela redução do diâmetro de partícula a

menos que 0,5 µm.

Os métodos de formulação individual diferem nas medidas utilizadas para

micronização de cristais de carotenóides sintéticos. Em um processo desenvolvido pela

Danochemo, os cristais são cominuídos em meio aquoso por meios mecânicos, gerando

partículas com diâmetro médio de 0,4 µm, as quais são misturadas a um hidrocolóide

(gelatina), que é adsorvido na superfície dos cristais, tornando-os hidrofílicos, podendo

formar dispersões estáveis e prevenir a reagregação. A biodisponibilidade é aumentada pelo

rápido aquecimento (20 s) da suspensão a 180°C, o que torna o composto ativo amorfo. A

matriz aquosa pode conter outros aditivos, como antioxidantes (α-tocoferol e ácido

ascórbico), emulsificantes (lecitina e palmitato de ascorbila), açúcar e amido para melhorar as

propriedades mecânicas do produto final (Britton et al,1996).

Figura 12 - Formulação de β-caroteno dispersável em água (http://www.corporate.basf.com/, 2007)

15

http://www.corporate.basf.com/

No processo de solução/precipitação desenvolvido pela Roche, uma dispersão de

carotenóide preparada para matriz lipofílica é tratada muito rapidamente (0,5 s) com vapor

superaquecido, onde em seguida a mistura óleo-água e carotenóide é estabilizada pela

emulsificação em uma matriz aquosa, e então os carotenóides precipitam da sua solução

inicial na fase oleosa em uma forma amorfa finamente dividida.

A BASF também produz preparações de carotenóides dispersáveis em água pelo

processo solução/precipitação (Figura 12). Os carotenóides sintéticos são transformados em

uma dispersão molecular em solventes hidrofílicos, de baixo ponto de ebulição e inócuos,

como álcool ou acetona e aquecidos a 170°C, por menos de 0,5 s, evitando assim a

isomerização. Em outro tanque, essa mistura é adicionada a uma matriz aquosa, e os núcleos

cristalinos são formados espontaneamente. O crescimento do núcleo pode ser controlado pela

escolha apropriada do colóide protetor e pode ser restrita a 0,1 µm. O solvente orgânico é

então removido em um evaporador em filme (Paust, 1994; Britton et al,1996).

Ao final, estas preparações comerciais de carotenóides dispersáveis em água são

desidratadas através de spray-drying e vendidas na forma de pó (Britton et al,1996).

2.1.5.1.3) Alimentos biofortificados

Um outro método de se obter um alimento com β-caroteno é adicionar suco de

cenoura, ou promover alterações genéticas na planta de forma a torná-la apta para a

biossíntese deste carotenóide, como é o caso do arroz dourado e tomate.

Figura 13 – Alimentos biofortificados. A) T

(b

omate laranja e normal; B) Arroz dourado e branco

)

16

O arroz dourado é gerado pela inserção de genes da bactéria Erwinia e de narciso

(Narcissus pseudonarcissus) e contém cerca de 2 mg de β-caroteno por g de arroz. No tomate,

as modificações genéticas geram uma diminuição no teor de carotenóides totais no fruto de 10

mg para 5 mg por 100 g de fruto, mas em compensação o licopeno, que correspondia 90% dos

carotenóides totais, agora foi substituído pelo β-caroteno que teve sua biossíntese aumentada

em 5 vezes, e representa mais de 50% dos carotenóides, conforme visto na Figura 13. Estes

alimentos biofortificados podem contribuir bastante para deficiência de vitamina A no mundo,

já que são amplamente consumidos (Giuliano et al, 2000; Fraser & Bramley, 2004; Al-Babili

& Beyer, 2005).

2.1.5.2) Mercado

Estima-se que o mercado mundial de carotenóides, que em 2005 gerou cerca de 887

milhões de dólares, irá crescer 3% ao ano quebrando a barreira de 1 bilhão de dólares em

2009, sendo o β-caroteno responsável por quase 30% deste mercado. No mercado brasileiro, o

produto em pó com 20% de β-caroteno é oferecido por R$ 215 a 240 por quilo, isso quer

dizer, de R$ 1075 a 1200 por quilo de β-caroteno puro. O mercado internacional é dominado

por empresas como Roche, BASF, Merck, Rhône-Poulenc e DSM (Fraser & Bramley, 2004;

http://www.sbaf.org.br/, 2006; http://aliceweb.desenvolvimento.gov.br/, 2007).

2.1.5.3) Fontes Comerciais

2.1.5.3.1) β-caroteno Sintético

O β-caroteno sintético têm sido produzido desde 1954 pela Roche e desde de 1960

pela BASF. A sua importância econômica aumentou nas décadas seguintes, sendo

particularmente acelerado a partir de 1990. Cada empresa utiliza um método diferente para

sua produção, mas ambas utilizam o mesmo precursor, que é a β-ionona.

17

http://www.sbaf.org.br/SBAF/_noticias/200503_Carotenoide.htm

http://aliceweb.desenvolvimento.gov.br/

Este intermediário era originalmente obtido de fontes naturais como o óleo de capim-

limão (Cymbopogon citratus) ou a terebentina do pinho (Pinus caribea), mas atualmente a β-

ionona é obtida a partir da acetona, ou através do butadieno, como é mostrado na Figura 14

(Isler,1971; Britton et al, 1996).

Figura 14 - Vias sintéticas para obtenção de β-ionona

A primeira síntese industrial de β-caroteno pela Roche seguiu os princípios C19 + C2 +

C19 de síntese. Como no processo de obtenção de vitamina A, a cadeia poliênica foi produzida

por acoplamento de Grignard, eliminação e hidrogenação parcial. Além disso, uma nova e

eficaz síntese para aldeídos poliênicos tem sido agora desenvolvida na forma da condensação

enol-éter e empregada industrialmente pela primeira vez na produção de C19 aldeído (8-

[2’,6’,6’-trimetil-ciclohex-1’-enil]-2,6-dimetil-octa-2,4,6-trien-1-al). A condensação enol-éter

permite um alongamento gradual específico de aldeídos conjugados por dois átomos de

carbono a cada vez, como visto na Figura 15 (Isler,1971; Britton et al,1996).

18

Figura 15 - Síntese de β-caroteno por condensação enol-éter

Já a BASF utiliza a condensação de Wittig para produzir β-caroteno, onde sais de

fosfônio, anteriormente derivatizados com a trifenilfosfina (PPh3), reagem com um aldeído,

formando uma dupla ligação e aumentando a cadeia poliênica. Na Figura 16, a reação ocorre

entre o retinal e o sal de retiniltrifenilfosfônio. O processo de síntese de β-caroteno da Roche

apresenta um rendimento de 60%, enquanto que o empregado pela BASF é de 85%, sendo

que este último necessita da reciclagem do óxido de trifenilfosfina, devido à sua baixa

biodegrabilidade. Este processo para recuperação da trifenilfosfina contém três fases:

purificação por destilação, cloração com fosgênio e desalogenação com alumínio (Isler,1971;

Britton et al,1996).

Figura 16 – Síntese de β-caroteno por condensação de Wittig

19

2.1.5.3.2) β-caroteno Natural Embora tanto o β-caroteno sintético quanto o natural possuam a mesma estrutura

molecular poliênica, o β-caroteno natural contém vários outros carotenóides em

concentrações menores, que apresentam benefícios à saúde adicionais podendo ser

consumidos em maiores quantidades. O β-caroteno natural pode ser produzido por processos

biotecnológicos utilizando fungos filamentosos, leveduras, bactérias ou microalgas, ou ainda

por extração de fontes vegetais. Apenas 2% do total de β-caroteno produzido é natural, sendo

principalmente utilizado como suplemento nutricional (Dufossé et al, 2005;

http://www.cotecportugal.pt/, 2006).

A – Processos Biotecnológicos

A.1 – Microalgas O gênero Dunaliella pertence ao grupo das microalgas unicelulares halotolerantes que

acumulam uma grande quantidade de β-caroteno em seu cloroplasto devido a alta intensidade

luminosa, obtendo em média, sob condições ideais em tanques abertos (Figura 17), 400 mg β-

caroteno por área (m²) de cultivo ao dia, i. e. 10 a 14 % em peso seco no caso de Dunaliella

salina e D. bardawil (Dufossé et al, 2005; Gobbi, 2006; Spolaore et al, 2006). García-

González et al (2005) também testaram a produção de β-caroteno por cultivo em

fotobiorreatores tubulares, gerando 100 mg/m² ao dia.

. Figura 17 – Dunaliella salina e seu cultivo em tanques abertos

20

http://www.cotecportugal.pt/

Para se promover a carotenogênese em D. salina, além dos nutrientes essenciais, uma

alta concentração de sal (1,5 M NaCl) e estresse luminoso, com intervalos de fotoperíodo de

12 h por 15 dias são condições requeridas (Dufossé et al, 2005; Gobbi, 2006; Spolaore et al,

2006). Outros métodos de estresse podem ser utilizados, tais como a supressão de fontes de

nitrogênio ou adição de solventes orgânicos com log P superiores a 5,6, como o decano e

hexadecano ou misturas destes solventes apolares biocompatíveis com pequenas

concentrações de outros solventes mais polares, como diclorometano e metil etil cetona, o que

possibilita o uso de biorreatores bifásicos, com o objetivo de produzir e extrair β-caroteno

simultaneamente (Hejazi & Wijffels, 2003; Léon et al, 2003; Mojaat et al, 2007)

O β-caroteno produzido, neste caso, é uma mistura de isômeros cis e trans, onde há

10% de 15-cis-β-caroteno, 41% de 9-cis-β-caroteno, 42% de trans-β-caroteno e 6% de outros

isômeros, e responde por cerca de 80% dos carotenóides totais produzidos sendo a luteína

responsável por 15%. As principais empresas produtoras de β-caroteno a partir de cultivo de

microalgas são as companhias Cognis Nutrition and Health (Austrália) e Nature Beta

Technologies (Israel) (Dufossé et al, 2005; García-González et al, 2005; Gobbi, 2006).

A.2 – Fungos Filamentosos

Os principais fungos filamentosos produtores de β-caroteno são Blakeslea trispora e

Phycomyces blakesleeanus (Figura 18), que também geram ubiquinona, ergosterol, ácidos

orgânicos e outros carotenóides como licopeno, γ-caroteno e fitoeno. Como nas microalgas, a

carotenogênese é induzida na forma de alguns estímulos como luz azul, interação sexual,

adição de retinol e ftalato de dimetila em Phycomyces sp., e ausência de luz, no caso da

Blakeslea sp..

21

Figura 18 – Phycomyces blakesleeanus e um zigosporo de Blakeslea trispora

Algumas linhagens modificadas geneticamente de Phycomyces sp. podem alcançar até

30 mg de β-caroteno por grama de micélio seco em 4 dias de cultivo, mais de 100 vezes a

quantidade da linhagem selvagem, correspondendo entre 90 a 95% do total de carotenóides; já

Blakeslea sp. pode gerar de 13 a 19 mg de β-caroteno em grama de micélio seco,

representando cerca de 73 a 85% do total de carotenóides. A DSM produz na Europa, desde

2000, β-caroteno a partir de cultivo de Blakeslea trispora para uso em alimentos (Dufossé et

al, 2005; Mehta et al, 1997; Kuzina e Cerdá-Olmedo, 2007; Choudhari & Singhal, 2008).

A.3 – Leveduras No gênero Rhodotorula, há algumas espécies produtoras de carotenóides como a R.

glutinis, R. minuta, R. mucilaginosa, R. graminis, e também em outro gênero como

Sporobolomyces roseus e S. patagonicus (Figura 19). Além do β-caroteno, estas leveduras

geram toruleno, torularodina e γ-caroteno, alcançando até 330 mg carotenóides/g célula seca

em 6-7 dias de fermentação (Tinoi et al, 2005; Buzzini et al, 2007; Maldonade et al, 2008).

Figura 19 - Rhodotorula glutinis e Sporobolomyces roseus

22

Dependendo das condições de cultivo, como fontes de carbono e nitrogênio, leveduras

como Rhodotorula glutinis podem gerar um perfil de carotenóides bastante variado, onde o β-

caroteno pode ser o principal produto (43%) e o toruleno, o secundário (30%), ou o inverso,

com 28% de toruleno e 25% de β-caroteno. Casos em que concentrado de uva foi utilizado

como a fonte de carbono do meio, a torularodina foi o principal carotenóide obtido (60 –

79%). Sporobolomyces roseus apresenta um perfil de carotenóides composto por 50% de β-

caroteno e 30% de toruleno, mas com rendimento bem menor que R. glutinis, sendo cerca de

72 µg/g célula seca (Maldonade et al, 2008).

A.4 – Bactérias

Entre as bactérias, há algumas espécies carotenogênicas, mas para produzir β-caroteno

como seu principal carotenóide, estas precisam ter seu metabolismo central inibido através de

sais inorgânicos e uréia, como no caso de Flavobacterium multivorum, ou então ser

modificadas geneticamente, como no caso de Halomonas elongata, Escherichia coli e

Sphingomonas paucimobilis (Figura 20).

Figura 20 - Halomonas elongata e Escherichia coli

A produção por F. multivorum foi de 2,9 mg/g de carotenóides totais, sendo 82% de β-

caroteno, 7% β-criptoxantina e 11% zeaxantina em 2 dias de fermentação (Bhosale &

Bernstein, 2004).

23

A bactéria halofílica H. elongata modificada com genes de Pantoea agglomerans e

Haematococcus pluvialis produz 0,56 mg/g célula seca, sendo 98% de β-caroteno, com 2%

NaCl no meio (Rodríguez-Saíz et al, 2007). E. coli recombinante com genes de Erwinia

uredovora e E. herbicola produz em um biorreator de 5 L em 2 dias de fermentação cerca de

270 mg/L de β-caroteno, representando 60% dos carotenóides totais (Kim et al, 2006). A

bactéria do solo S. paucimobilis tratada com metanosulfonato de etila gera 3,27 mg

caotenóides /g célula seca, sendo 70,7% β-caroteno (Silva et al, 2004).

B – Extração de Fontes Vegetais O β-caroteno de origem vegetal é geralmente obtido por extração com solventes de

cenoura e dendê, com conteúdos menores de α-caroteno, γ-caroteno e algumas xantofilas.

Mas outras fontes vegetais têm sido encontradas com grande potencial para produção de β-

caroteno, como visto na Tabela 2 (http://www.fao.org/, 2008).

Tabela 2 – Potenciais fontes vegetais produtoras de β-caroteno Fontes Vegetais Carotenóides

(µg/g) β-caroteno

(%) Referências

Cenoura (Daucus carota) 85 -174 49 - 65 Rodriguez-Amaya, 2001

Dendê (óleo) (Elaeis guineensis) 470-700 54,4 Rodriguez-Amaya, 2001

Batata doce (Ipomoea batatas) 160-226 92-95 Rodriguez-Amaya, 1996

Buriti (fruto) (Mauritia vinifera)

Buriti (óleo)

513,9

1150-3380

72,5 De Rosso & Mercadante, 2007

Rodriguez-Amaya, 2001

Acerola (Malpighia glabra) 8,8 - 18,8 69,8-90,6 De Rosso & Mercadante, 2005

Tucumã (Astrocaryum aculeatum)

62,6 - 96,6 75,6-89,3 Marinho & Castro, 2003; De Rosso & Mercadante, 2007

Marimari (Geoffrola striata) 38 61,1 De Rosso & Mercadante, 2007

Physalis (Physalis angulata) 80,9 76,9 De Rosso & Mercadante, 2007

Acuri (Scheelea phalerata) 22,7 76,2 Hiane et al, 2003

Pajurá (Couepia bracteosa) 17,8 92,1 Marinho & Castro, 2003

Piquiá (Caryocar villosum) 21 85,4 Marinho & Castro, 2003

Umari (Poraqueiba sericea) 102,9 78,9 Marinho & Castro, 2003

Bocaiúva (Acrocomia mokayaba) 59,6 92,3 Rodriguez-Amaya, 1996

24

http://www.fao.org/

2.2) BURITI

2.2.1) Características Gerais

Na Tabela 2, verifica-se que o buriti é uma das fontes vegetais de maior potencial para

extração de β-caroteno, com seu óleo podendo alcançar até 3380 µg de carotenóides totais por

g de óleo, sendo mais de 70% de β-caroteno.

O buriti é uma planta da família Arecaceae, antigamente conhecida como Palmae,

sendo nativa da América Latina, principalmente Brasil, Peru, Bolívia, Equador, Colômbia,

Venezuela e Guiana. Há duas espécies de buriti, sendo a Mauritia flexuosa nativa do Peru, e

conhecida como aguaje, e a Mauritia vinifera nativa do Brasil, conhecida também como

miriti. Podem chegar entre 35 a 40 m de altura, com ramos de 10 a 20 folhas, cada uma com 5

a 6 m de comprimento, gerando 3 a 4 cachos com 800 a 1000 frutos cada, sendo estes

variando entre 5 a 7 cm de diâmetro, e 40 a 85 g cada (Figura 21). A polpa destes frutos de

buriti é consumida pela população local em doces e sucos (Silveira, 2004; Santos, 2005;

http://www.fao.org/, 2008).

Figura 21 – Palmeiras e frutos do buriti

Em 1996, a produção brasileira chegou a quase 5000 toneladas de frutos, sendo o Piauí

responsável por cerca de 70% deste valor, alcançando próximo de 5 toneladas de óleo por

hectare (http://www.sidra.ibge.gov.br/, 2008).

25

http://www.fao.org/

http://www.sidra.ibge.gov.br/

A composição centesimal da polpa do fruto de buriti é descrita na Tabela 3, em termos

percentuais, comparando várias referências (g/100 g de polpa). É também verificado um teor

significativo de vitamina C (ácido ascórbico), entre 19,8 e 26 mg, e de cálcio, entre 113 e 156

mg por 100 g de polpa de buriti (Tavares et al, 2003; Santos, 2005), além do altíssimo teor de

vitamina A derivado das concentrações presentes de β-caroteno.

Tabela 3 – Composição centesimal da polpa do fruto de buriti Componentes Mariath et

al (1989) Tavares et al (2003)

Santos (2005)

Manhães (2007)

Água 64,2 67,2 49,77 62,93

Proteínas 1,8 1,5 2,82 2,1

Lipídios 8,1 3,8 19,8 13,85

Carboidratos 25,2 26,1 26,76 20,18

Cinzas 0,7 1,4 0,85 0,94

2.2.2) Óleo de Buriti

O óleo de buriti apresenta um alto teor de ácidos graxos insaturados, muito semelhante

ao azeite de oliva (Olea europaea) e óleo de abacate (Persea americana) (Tabela 4) (Silva,

2002). Além disso, contém uma alta concentração de carotenóides, principalmente β-

caroteno, superando o azeite de dendê (Tabela 5), conferindo uma alta estabilidade oxidativa

ao óleo também devido aos teores de tocoferóis (700 ppm) e fitoesteróis (800 – 1000 ppm)

presentes (Godoy & Rodriguez-Amaya, 1995; Rodriguez-Amaya, 2001; Silveira, 2004; De

Rosso & Mercadante, 2007). Outro uso ao óleo de buriti foi dado por Durães et al (2006) na

síntese de compósitos de poliestireno e de polimetacrilato para produção de plásticos mais

biodegradáveis.

26

Tabela 4 – Perfil de ácidos graxos de frutos oleaginosos % Ácidos graxos Buriti Tucumã Oliva Abacate Dendê

12:0 láurico ---------- ---------- ---------- ---------- 0,1 – 1,0

14:0 mirístico 0,1 ---------- 0,67 0,02 - 0,13 0,9 – 1,5

16:0 palmítico 17,3 - 19,3 13,86 10 - 11,7 19,8 – 22,7 41,8 – 46,8

18:0 esteárico 1,86 – 2,0 9,80 2,15 0,5 – 1,0 4,2 – 5,1

20:0 araquídico ---------- 0,82 0,48 ---------- 0,2 – 0,7

16:1 palmitoléico ---------- 0,17 1,45 3,9 – 5,6 0,1 – 0,3

18:1 oléico 73,3 – 78,7 46,81 73,8 -78 60 - 71 37,3 – 40,8

18:2 linolêico 2,4 – 3,9 26,13 7 - 9,8 7,1 – 15,3 9,1 – 11

18:3 linolênico 2,17 – 2,2 0,93 ---------- 0,37 – 1,03 0 – 0,6

Referências Santos, 2005

Bora et al, 2001

Gunstone & Padley, 1997

Danieli, 2006

Choo, 1994

Tabela 5 – Perfil de carotenóides de alguns óleo vegetais

% Tucumã Dendê Buriti

β-Caroteno 75,6-89,3 54,4 – 56,7 72,3 – 75,2

α-Caroteno 2,68 25,2 – 37,6 3,9 - 15,9

γ-Caroteno 3,29 1,16 - 3,3 5,3 - 7,2

ζ-Caroteno 0,22 0,7 – 2,3 0,9 – 2,5

δ-Caroteno 0,83 0,2 – 2,0 0 – 0,7

β-zeacaroteno 3,27 0,6 – 1,0 1,1 – 2,41

Outros carotenos

1,63 3,15 – 12,6 0,95

xantofilas 8,58 0 - 0,4 1,7 – 13,6

2.2.3) Outras Tecnologias

Várias outras tecnologias estão sendo estudadas, além da extração por solventes, para

recuperação de β-caroteno de matrizes, como óleo de dendê e do buriti. França & Meirelles

(1997) estudaram a extração com fluido supercrítico dos carotenóides de óleo de dendê retido

na torta de prensagem, enquanto França et al (1999) reportaram a utilização de CO2

supercrítico na extração de carotenóides do fruto de buriti. Porém, nestes trabalhos apesar de

extraírem até 10000 ppm de carotenóides, também são obtidos triglicerídeos e ácidos graxos.

27

Algumas modificações foram propostas por Chuang & Brunner (2006) neste processo

de extração com fluido supercrítico para contornar sua baixa seletividade. Os autores

utilizaram a transesterificação do óleo de palma e em seguida a extração em três etapas

obtendo um produto 200 vezes mais concentrado em carotenóides, praticamente ausente de

ésteres, ácidos graxos e triglicerídeos. Todavia, na temperatura utilizada (60°C) e dada a

presença de O2 no CO2 supercrítico, condições que auxiliam a degradação dos carotenóides, é

necessária a adição de antioxidantes (BHT) ao processo (Cocero et al, 2000).

A transesterificação também é utilizada como pré-etapa no processo de destilação

molecular, onde os carotenóides são o resíduo do processo, alcançando até 24000 ppm de

carotenóides, com perdas de até 14%, a 210°C em destilador centrífugo com tempo de

residência em torno de 50s (Batistella & Maciel, 1998), ou então em um destilador em filme

descendente em duas etapas, obtendo 80000 ppm de carotenóides, com perdas de 25%, mas

sem alteração significativa no seu perfil (Ooi et al, 1994).

O processo de separação por membranas, que inicialmente era realizado para

degomagem de óleos vegetais, foi testado também para recuperação de carotenóides

utilizando-se membranas densas poliméricas, mas na realidade este processo é bastante

efetivo na separação das xantofilas e clorofila, além dos fosfolípideos, com retenção entre 80

e 100%, produzindo um óleo rico em carotenos (Subramanian et al, 2001; Arora et al, 2006).

Este processo, apesar de positivo na concentração unicamente de carotenos, apresenta a

necessidade de uma etapa adicional de hidrólise ou transesterificação.

A hidrólise enzimática também foi testada como pré-tratamento para facilitar a

recuperação de carotenóide podendo substituir com êxito a hidrólise alcalina, sem perdas por

degradação e isomerização dos mesmos.

28

Lietz & Henry (1997) testaram a hidrólise do óleo de palma utilizando a lipase de

Candida rugosa em uma concentração de 10% p/v óleo solubilizado em tampão fosfato

0,08M, mantendo a relação de óleo e solução aquosa em 1/175, e agitação em atmosfera de

N2, a 35°C, durante 4 horas. Os autores obtiveram um rendimento de 96% em ácidos graxos,

mantendo inalterada a concentração de carotenóides. Resultado similar foi alcançado por

Fernandez et al (2000), que apenas modificaram a relação de óleo e solução aquosa para

1/350, mostrando que também nessas condições a quantidade de carotenóides se manteve

praticamente constante e igual a 330 ppm, enquanto que a saponficação alcalina promoveu a

redução em 15% no teor de carotenóides. Segundo os autores, a redução era ainda maior

quando o sabão formado era removido por filtração.

You et al (2002) utilizaram também óleo de palma e lipase de Candida rugosa, mas

em condições diferentes. Neste trabalho, a quantidade de enzima empregada foi de 1% p/v,

substituindo o tampão fosfato por água, alterando a relação óleo/água para 1/1, e aumentando

a temperatura para 50°C e o tempo reacional para 24 h. Os autores obtiveram um rendimento

de 94% em ácidos graxos e uma redução no teor de carotenóides da ordem de 15%,

provavelmente devido à temperatura empregada.

2.3) LIPASES

As lipases são enzimas classificadas como hidrolases (glicerol éster hidrolases, E.C.

3.1.1.3) e atuam sobre a ligação éster de vários compostos, tendo os acilgliceróis como os

melhores substratos, podendo catalisar reações de hidrólise, síntese, transesterificação e

interesterificação (Figura 22). As lipases são distintas de outras esterases, pois atuam de forma

única em substratos insolúveis em água, atuando na interface óleo-água de soluções

emulsionadas. Além disso, características como estabilidade na presença de solventes

orgânicos, ausência da necessidade de cofatores e alta enantiosseletividade, permitem que as

lipases tenham grande interesse tecnológico (Sharma et al, 2001; Castro et al, 2004).

29

Figura 22 – Algumas reações catalisadas por lipases

2.3.1) Fontes e Propriedades

As lipases podem ser obtidas a partir de várias fontes animais, vegetais e microbianas.

Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando entre 20 a 75 kDa,

atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e em temperaturas variando desde a ambiente até 70 °C.

Lipases são usualmente estáveis em soluções aquosas neutras à temperatura ambiente

apresentando, em sua maioria, uma atividade ótima na faixa de temperatura entre 30 e 40 °C.

Contudo, sua termoestabilidade varia consideravelmente em função da origem, sendo as

lipases microbianas as que possuem maior estabilidade térmica (Castro et al, 2004).

30

A maioria das preparações lipásicas comerciais são compostas pela mistura de várias

isoenzimas em diferentes proporções, como no caso daquelas obtidas a partir de culturas

Candida rugosa, C. antarctica, Rhizopus niveus, Chromobacterium viscosum, entre outras.

Cada isoforma tem propriedades diferentes, tais como massa molar, especificidade,

estereosseletividade, presença de glicosilações e preferência por substratos (Sharma et al,

2001; Saxena et al, 2003; María et al, 2006). As principais fontes de lipases e suas

propriedades estão descritas na Tabela 6.

Tabela 6 – Faixas ótimas de atuação de algumas lipases Fontes pH T (°C) Referência

Candida rugosa 5 - 8 35 - 50 López et al, 2004

Candida antarctica A 6 - 10 35 - 70 Pfeffer et al, 2006

Thermomyces lanuginosus 6 – 9 30 - 50 Fernandes et al, 2004

Aspergillus niger 6 – 8 40 - 55 Shu et al, 2007

Pseudomonas aeruginosa 5,5 – 7,5 35 - 45 Ogino et al, 2000

Bacillus subtilis 8 – 10 30 - 40 Lesuisse et al, 1993

Geotrichum candidum 6,5 - 8 32 - 42 Burkert et al, 2004; Maldonado, 2006

Streptomyces rimosus 8,5 - 10 45 - 60 Abrimic et al, 1999

Yarrowia lipolytica 4 - 7 30 - 45 Destain et al, 1997; Aloulou et al, 2007; Brígida et al, 2007

Rhizopus niveus 5 - 7 30 - 45 Uhlig, 1998

Rhizomucor miehei 6,5 – 7,5 30 - 40 Abbas et al, 2002

Pâncreas suíno 6 - 9 40 - 55 Godfrey & West, 1996

Mamona (Ricinus communis) 4 - 4,5 30 - 35 Eastmond, 2004; Cavalcante, 2006

2.3.2) Estrutura e Aspectos cinéticos

As lipases mostram uma característica padrão conhecida como o entrelaçado de α/β

hidrolase. O sítio ativo da lipase é formado por uma tríade catalítica constituída pelos

aminoácidos: serina, ácido aspártico (ou glutâmico) e histidina; o resíduo nucleofílico serina é

localizado no C-terminal da fita β5 de um pentapeptídeo GXSXG altamente conservado,

formando uma característica principal “β em torno de α”, designada como a cavidade

nucleofílica.

31

Como é visto na Figura 23, o sítio é composto de uma folha β central consistindo de 8

diferentes fitas β (β1-β8) conectadas com seis α-hélices (A-F) (Jaeger et al, 1999; Martins,

2001; Castro et al, 2004).

Figura 23 – Esquema geral do sítio ativo de uma lipase

A hidrólise do substrato inicia-se com o ataque nucleofílico pelo oxigênio da serina no

átomo de carbono carbonílico na ligação éster, levando à formação de um intermediário

tetraédrico estabilizado pelas ligações do hidrogênio a átomos de nitrogênio de resíduos da

cadeia principal pertencente à cavidade de oxiânion. Um álcool é liberado após a formação do

complexo acil-lipase, o qual é finalmente hidrolisado com a liberação dos ácidos graxos e

regeneração da enzima, conforme é demonstrado na Figura 24 (Jaeger et al, 1999, Martins,

2001; Amaral, 2007).

As reações lipolíticas ocorrem na interface água-lipídeo podendo, em alguns casos,

impedir que as cinéticas das reações enzimáticas sejam descritas pelo mecanismo de

Michaelis-Menten, que só são válidas se a reação ocorrer em fase homogênea. O mecanismo

cinético mais aceito para descrever a ação das lipases é o Ping-Pong Bi Bi (Cunha, 2007).

32

Figura 24 – Mecanismo de reação em lipases

O fenômeno conhecido como “ativação interfacial” foi originado de estudos cinéticos

recentes de reações lipolíticas e relaciona o aumento da atividade da lipase com a presença de

substratos insolúveis, que formam emulsão. Isso porque o sítio ativo de algumas lipases é

coberto por uma superfície entrelaçada, denominada de tampa (ou borda). Quando há ligação

do substrato na superfície da enzima, esta tampa move-se, alterando a forma fechada da

enzima para a forma aberta, com o centro ativo agora acessível ao substrato e, ao mesmo

tempo, expondo uma larga superfície hidrofóbica que facilita a ligação da lipase à interface.

Este modelo de ativação interfacial tem exceções tais como as cutinases, que não apresentam

tampa cobrindo o sítio ativo (Meirelles, 1997; Jaeger et al, 1999; Gama, 2000; Castro et al,

2004).

2.3.3) Especificidade Para aplicações industriais, a especificidade da lipase é um fator crucial. A enzima

pode ser específica com relação a estrutura ácida ou alcoólica do substrato, e também em

relação aos seus isômeros. As lipases podem ser subdivididas em 3 grupos baseados em sua

especificidade.

33

Lipases não específicas (como por exemplo as produzidas por Candida rugosa,

Staphylococcus aureus, Chromobacterium viscosum, Thermomyces lanuginosus e

Pseudomonas sp.) quebram as moléculas de acilglicerol randomicamente, produzindo ácidos

graxos livres, glicerol, monoacilgliceróis e diacilgliceróis como intermediários. Neste caso, os

produtos são similares àqueles produzidos por catálise química, porém com menor grau de

termodegradação, pois a temperatura do meio reacional é bem inferior às temperaturas

empregadas nos processos químicos (Uhlig, 1998; Castro et al, 2004; Amaral, 2007).

Lipases 1,3 específicas (ex: de Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus delemar,

Rhizopus oryzae, Yarrowia lipolytica, Rhizopus niveus e Penicillium roquefortii) liberam

ácidos graxos das posições 1 e 3 e formam, por esta razão, produtos com composições

diferentes daquelas obtidas pelas lipases não regiosseletivas, ou mesmo pelos catalisadores

químicos. Geralmente, a hidrólise de triglicerídeos em diglicerídeos é bem mais rápida do que

destes em monoglicerídeos (Meirelles, 1997; Uhlig, 1998; Castro et al, 2004).

Lipases ácido graxo específicas são lipases com ação específica na hidrólise de

ésteres, cujos ácidos graxos apresentam cadeia longa insaturada com duplas ligações, em cis

no carbono 9. Ésteres com ácidos graxos insaturados, ou sem insaturação no carbono 9, são

lentamente hidrolisados. Este tipo de especificidade não é comum entre as lipases e o exemplo

mais estudado até hoje é a lipase produzida por Geotrichum candidum (Meirelles, 1997;

Uhlig, 1998; Gama, 2000; Martins, 2001; Castro et al, 2004).

Lipases também podem ser estereoespecíficas, onde um dos isômeros de um racemato

pode ser hidrolisado preferencialmente em detrimento de outro, ou ainda, a formação de um

isômero pode ser catalisada seletivamente a partir de precursores pró-quirais, como os

compostos meso-diésteres ou meso-dióis. Como exemplos podemos citar as lipases originadas

de Burkholderia cepacia, Candida antarctica, Candida rugosa e Rhizopus delemar (Gama,

2000; Martins, 2001).

34

2.3.4) Hidrólise Enzimática de Óleos e Gorduras A hidrólise de óleos e gorduras pode ocorrer a partir de processos convencionais

(Tabela 7; Shreve & Brink Jr, 1997), onde se utilizam temperaturas e pressões elevadas na

presença de catalisadores inorgânicos, resultando em um alto consumo de energia e vários

subprodutos indesejáveis (polimerização e degradação de ácidos graxos insaturados, produção

de cetonas e hidrocarbonetos); ou então a partir de processos enzimáticos, onde as reações são

conduzidas a pressões e temperaturas menores na presença de um biocatalisador (lipase),

proporcionando menor consumo energético, minimização de degradação térmica e a

possibilidade de recuperar e concentrar moléculas de alto valor agregado, como os ácidos

poliinsaturados (PUFA) e os insaponificáveis (Queiroz, 1996; Castro et al, 2004; Hasan et al,

2006; Gunstone et al, 2007).

Tabela 7 - Comparação entre processos convencionais de hidrólise de óleos e gorduras Processos

Convencionais Autoclave

(média pressão) Twitchell Colgate -

Emery

Temperatura (°C) 149 – 177 100 - 104 252

Pressão (atm) 5,1 – 10,2 - 40,8 – 47,6

Tempo (h) 5 - 10 12 - 48 2 - 3

Rendimento (%) 85 -98 85 -98 97 - 99

Catalisador Óxidos de zinco, cálcio ou magnésio

Ácidos sulfônicos em H2SO4

-

A hidrólise enzimática de óleos e gorduras pode ser conduzida de várias formas. Neste

processo é necessária a formação de uma interface lipídeo/água e a absorção da lipase nesta

interface, e para isso podem-se empregar enzimas livres ou imobilizadas em sistemas

emulsionados, apenas agitados ou na presença de solventes orgânicos (Queiroz, 1996; Sharma

et al, 2001; Castro et al, 2004; Brigida, 2006).

Muitos trabalhos têm sido realizados utilizando sistemas emulsionados para hidrólise

enzimática. Yao et al (2005) mostraram que a condução de sistemas microemulsionados de

AOT (sulfosuccinato de bis(2-etill hexil) sódio) em isooctano para hidrólise de azeite de oliva

35

utilizando lipase de Candida rugosa em tampão fosfato 0,05M a 30°C e 150 rpm, apresentou

um rendimento em ácidos graxos de apenas 30% em 72 h de reação, sendo o baixo

rendimento atribuído a inativação que este sistema causa à lipase.

Padilha & Augusto-Ruiz (2007) apresentaram resultados um pouco melhores

utilizando um sistema com acetato de polivinila e detergente aniônico como emulsionantes

para hidrólise de óleo de pescado com uma solução tamponada de lipase pancreática, a 38°C

por 1 h resultando em 44% de ácidos graxos livres como resultado.

Noor et al (2003) testaram a hidrólise de óleo de palma utilizando a lipase SP398 em

tampão emulsionado com goma arábica agitado a 1000 rpm, a 40°C por 90 min, obtendo

hidrólise total do óleo. Outras alternativas para se produzir emulsões com maior área

interfacial vêm sendo testadas como a emulsificação por ultrassom, que aumenta em 67 vezes

a área de contato do que o sistema conduzido por agitação a 1000 rpm, apesar de manter a

emulsão estável apenas por 2 h (Ramachandran et al, 2006).

Mas a hidrólise enzimática não necessita exclusivamente de emulsionantes. Esta pode

ocorrer apenas com a agitação mecânica, apresentando taxas de hidrólise similares, conforme

verificado por Wang et al (1988).

Com o sistema apenas agitado, Gutierrez-Ayesta et al (2007) testaram várias lipases

com diferentes estruturas conformacionais em tampão para hidrólise de óleo de girassol

solubilizado em heptano, mantendo uma relação fase orgânica/fase aquosa de 1/1, e uma

quantidade de lipase de 5% em peso em relação ao óleo, durante 6 h, a 60°C. As lipases de

Thermomyces lanuginosus e Pseudomonas cepacia forneceram os melhores resultados,

correspondendo respectivamente a 85,3 e 69% de ácidos graxos livres. A lipase tipo B de

Candida antarctica, tanto livre como imobilizada, por outro lado, forneceu as piores taxas de

hidrólise, em torno de 5%.

36

Vacek et al (2000) compararam dois procedimentos experimentais para hidrólise de

óleo de semente de groselha. No primeiro método, sob agitação, foram misturados 100 mg de

óleo e 100 mL de água, a 40°C por 24 h. No outro, 300 mg de óleo foram solubilizados em 2

mL de isooctano e misturados com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M, a 30°C, durante 4 h, sendo

neste método utilizadas apenas enzimas imobilizadas. No primeiro método foi utilizada uma

quantidade de enzima 4 vezes maior em relação ao segundo. Os melhores resultados foram

obtidos no primeiro procedimento utilizando-se as lipases de Pseudomonas cepacia

imobilizada e de Mucor miehei imobilizada em resina macroporosa de troca iônica (Lipozyme

RM IM) com rendimentos superiores a 80% de ácido graxo livre.

A hidrólise de óleo de soja com diferentes tipos de lipase foi estudada por Park et al

(1988), tendo como principal objetivo a comparação das atividades dessas enzimas em

sistemas isolados e combinados. Após 10 h de reação, foi verificado que os sistemas

combinados de lipases microbianas, tais como Penicillium sp. e Rhizopus niveus ou

Penicillium sp. e Rhizopus delemar, forneceram rendimentos mais elevados (98,0 e 99,5% de

hidrólise) que os obtidos em sistemas contendo apenas uma lipase (7,2 e 44,4% de hidrólise).

A relação óleo/água na mistura reacional foi avaliada por Rooney & Weatherley

(2001) utilizando uma lipase de Candida rugosa para hidrólise de óleo de girassol em

diferentes quantidades. A reação conduzida com 0,8% peso de lipase em peso de mistura

reacional, a temperatura ambiente (20 – 25°C) durante 90 min e 500 rpm, variando a relação

óleo/água em 3/1, 4/1, 8/1 e 16/1 obteve como resultados 88, 68, 64 e 45% de ácidos graxos

livres, respectivamente.

Alguns aditivos podem ser usados para aumentar a hidrólise enzimática, como íons

Ca+2 que agem como ativadores de lipases; alumina e ciclodextrinas que retiram os ácidos

graxos da mistura reacional através de adsorção e de complexos de inclusão, respectivamente;

ou então remoção do glicerol com recirculação da lipase (Queiroz, 1996).

37

Considerando que inúmeras variáveis podem estar envolvidas nesse tipo de processo,

observa-se uma tendência pelo emprego da metodologia de planejamento estatístico, que

possibilita verificar a influência das variáveis e suas interações no rendimento de um

determinado processo com grande economia de tempo, material e recursos. Como exemplo,

cita-se o trabalho desenvolvido por Oliveira et al (1999) no qual foi analisada a influência da

concentração de lipase e do tempo de reação no desempenho da hidrólise da gordura de

babaçu por lipase comercial empregando a metodologia de superfície de resposta, sendo

obtidos rendimentos entre 6,52 e 41,44% de ácidos graxos livres. O ponto ótimo do processo

(maior porcentagem de hidrólise no menor tempo possível), entretanto, não foi alcançado,

pois o planejamento fatorial proposto não cobriu a faixa correspondente a maiores tempos de

reação.

38

CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1) MATERIAIS Os óleos de buriti bruto RF3800 e refinado RF3810 foram cedidos pela empresa

Beraca Sabará®.

As lipases utilizadas foram Lipozyme TL IM proveniente de Thermomyces

lanuginosus; Lipozyme CALB L e Novozym 435, que são produzidas por Candida

antarctica, onde a primeira está na forma livre, e a última, na forma imobilizada. Todas foram

doadas gentilmente pela Novozymes®. A lipase de Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 foi

produzida em biorreator multifásico de acordo com a metodologia desenvolvida por Amaral

(2007).

O padrão de α-tocoferol foi cedido pelo Laboratório de Bioquímica Nutricional e de

Alimentos do Instituto de Química da UFRJ. O kit enzimático para determinação de esteróis

totais foi doado pela Laborlab®.

3.2) EQUIPAMENTOS Os equipamentos utilizados no presente trabalho estão relacionados a seguir:

• Centrífuga Fanem modelo 204-NR;

• Transmissor de pH (pHmetro) Actron pH-2000;

• Espectrofotômetro Hach DR/4000 UV;

• Incubador com agitação e controle de temperatura (Shaker) Certomat BS-1;

• Cromatógrafo líquido de alta eficência (HPLC), equipado com uma bomba binária Waters

1525, de um detector UV-Visível Waters 2487, além de injetor e aquecedor de coluna.

Para processamento e análise de dados foi utilizado o software Breeze v. 3.30. A coluna

analítica empregada foi a YMC-Pack ODS-A (100 x 4,6 mm), com tamanho de poro de

120 Ǻ

39

• Cromatógrafo em fase gasosa HP 6890 acoplado a um detector de massas HP 5972 com

ionização por impacto de elétrons a 70 eV. A coluna utilizada foi DB-1 30 m x 0,25 mm x

0,25 µm pertencente ao Laboratório de Análise de Aromas do Instituto de Química da

UFRJ.

3.3) MÉTODOS ANALÍTICOS

3.3.1) Composição de ácidos graxos

Os óleos bruto e refinado de buriti foram inicialmente transesterificados através da

adição de metanol, na razão molar de 1/9, e de 3 mol % de carbonato de potássio, a 100°C por

2 h. A mistura reacional foi resfriada e neutralizada com solução aquosa de HCl 10%, sendo

os ésteres metílicos isolados por extração com acetato de etila. A fase orgânica resultante foi

submetida a lavagens sucessivas com água destilada (3 x), tratada com sulfato de sódio anidro

e evaporada.

Os ésteres metílicos formados foram analisados em um cromatógrafo em fase gasosa,

que operou sob as seguintes condições: temperatura do injetor e do auxiliar = 280°C;

temperatura inicial da coluna, 100°C (32 min.), com rampa de 5°C/min até 140°C, uma espera

(hold) de 5 min, mais uma rampa de 5°C/min até 200°C, e depois mais uma rampa de

15°C/min até a temperatura final da coluna, 280°C; “Splitter” (razão de divisão da amostra),

1:20; o gás de arraste utilizado foi hélio (0,9 mL/min); volume da amostra injetada, 0,5 µL. A

varredura foi efetuada na faixa de massa de 40 a 500 Daltons. O método utilizado para a

determinação quantitativa dos ésteres foi o da normalização interna (Rezende, 2006)

3.3.2) Índices 3.3.2.1) Saponificação (IS)

O índice de saponificação é uma medida dos ácidos graxos livres e combinados que

existem no óleo e é diretamente proporcional à massa molar média (MMM). Quanto menor

esta MMM, maior será o IS.

40

O método utilizado é o oficial Cd-3b-76 (Firestone, 1997), onde foram adicionados 2 g

de amostra a 25 mL de solução alcoólica 0,5M de KOH e pérolas de vidro, mantendo em

refluxo por 60 minutos, garantindo a solubilização total da amostra. Depois foram adicionadas

2 gotas de uma solução alcoólica 1% de fenolftaleína, e titulando-se com uma solução 0,5 M

HCl até desaparecimento da cor vermelha. O branco foi preparado com água ao invés da

amostra. Na fórmula abaixo, a representa o volume (mL) de HCl titulado quando se utiliza a

amostra, e b é o volume (mL) titulado quando a amostra é a água.

21,56*5,0*)( abIS −

= (mg KOH/g óleo)

3.3.2.2) Peróxido (IP)

O índice de peróxido é uma medida do oxigênio ligado aos óleos em forma de

peróxido. O método utilizado é o oficial Ja-8-87 (Firestone, 1997), também conhecido como

método de Wheeler. Inicialmente, o material de vidro deve estar totalmente limpo, por isso

incialmente foi lavado com água quente, em seguida imerso em solução sulfocrômica, e

depois lavado mais 5 vezes com água destilada.

A 1 g de amostra foi adicionado 30 mL de uma mistura 3/2 (v/v) de ácido acético

glacial/clorofórmio, e depois mais 0,5 mL de solução saturada de KI, agitando energicamente

por 1 minuto exato. Imediatamente depois, a solução foi diluída com 30 mL de água destilada,

e o iodo liberado foi titulado com solução 0,01M de tiossulfato de sódio. Pouco antes de

desaparecer a cor amarela, 0,5 mL de solução 1% de amido foi adicionada, mantendo a

titulação até desaparecer a cor azul ou turvação. O branco foi preparado com água ao invés da

amostra. Na fórmula abaixo, a representa o volume (mL) de Na2SO3 titulado quando se utiliza

a amostra, e b é o volume (mL) titulado quando a amostra é a água.

11000*1,0*)( baIPO −

= meq O2/kg

41

3.3.2.3) Iodo (II) O índice de iodo é uma medida do grau de insaturação dos componentes do óleo.

Quanto maior o número de duplas ligações por unidade de óleo, maior o II.

O índice de iodo foi calculado a partir da composição em ácidos graxos de acordo com

o método oficial Cd-1c-85 (Firestone, 1997), de acordo com a seguinte equação, sendo AOD,

ácido octadecenóico; AODD, ácido octadecadienóico e AODT, ácido octadecatrienóico.

61627321860 ,*%,*%,*% AODTAODDAODII ++= g I2 /100 g óleo

3.3.2.4) Ácidos graxos livres (AGL) O método utilizado foi de titulação potenciométrica, onde as amostras são adicionadas

a álcool quente neutralizado, completando 50 mL de solução, e os grupos ácidos são

neutralizados com solução 1M NaOH até detecção do ponto final a pH 10,2, já que o ácido

esteárico tem pKa neste valor (Kanicky & Shah, 2002; Osawa & Gonçalves, 2006). A %AGL

na maioria dos tipos de óleos é calculada tendo como base ácido oleico:

228,)g(Amostra

)mLNaOH(VolAGL% ×=

3.3.3) Densidade Um balão volumétrico vazio (m1) foi pesado, sendo depois preenchido com água

destilada, que tenha sido antes fervida e resfriada, e depois pesado novamente (m2). E

finalmente, o balão foi rinsado com amostra, e em seguida preenchido com esta e pesado

(m3), obtendo a densidade relativa, de acordo com fórmula abaixo (Matissek et al, 1998):

12

13

2020 mm

mmd−−

=

3.3.4) Umidade O método utilizado foi o oficial Bc-2-49 (Firestone, 1997), que consiste em se retirar

uma alíquota de 2 mL de amostra, adicionando-a ao cadinho (m2), previamente seco e pesado

(m1), e seca em uma estufa a 103ºC, durante 24 horas (m3). O teor de umidade na amostra foi

determinado pela fórmula:

42

100112

13 ×⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−−

−=mmmmUmidade%

3.3.5) Material Insaponificável 3.3.5.1) Teor de Insaponificáveis

O método utilizado é o oficial Tk-1a-64 (Firestone, 1997), sendo feito em três etapas:

saponificação, extração e concentração.

A 0,1 g de amostra foram adicionados 50 mL de solução hidroalcoólica (90% álcool)

2M de KOH, em banho-maria, em refluxo por 1 hora. A solução quente saponificada obtida

foi colocada em um funil de decantação, sendo a vidraria de refluxo rinsada 3 vezes com 17

mL de água destilada para evitar perdas de material.

Depois de esfriar, 100 mL de éter de petróleo foram adicionados ao funil, agitado

energicamente, e deixado em repouso até clara separação de fases, sendo então retirada a fase

inferior (fase B). Em seguida, a fase A (superior) foi lavada 2 vezes com 40 mL de água

destilada, e depois retirada a fase inferior, reunindo-a a fase B anterior.

A esta fase B foram adicionados mais 100 mL de éter de petróleo, repetindo-se o

procedimento acima. Com toda a fase A reunida, fez-se uma lavagem com 50 mL de etanol

50% até a água de lavagem estar em pH neutro. Depois, foram adicionados 1,5 g de sulfato de

sódio anidro, secando por 10 minutos, e agitando um pouco.

Finalmente, a fase A foi colocada em um balão previamente seco e pesado (m1), e

acoplado a um rotovaporador para eliminação do solvente. Depois foi seco na estufa por 30

minutos a 103°C (m2). Com isso, o teor de insaponficáveis foi calculado de acordo com a

equação abaixo:

10010

12 ×−

=,

%mm

cavelInsaponifi

43

3.3.5.2) Carotenóides

3.3.5.2.1) Carotenóides Totais

Neste ensaio, a amostra foi solubilizada e diluída em éter de petróleo, sendo detectada

a 450 nm no espectrofotômetro (Rodriguez-Amaya, 2001). A concentração de carotenóides

totais foi calculada de acordo com a equação abaixo:

)()( gAmostracaroteno ×−β××

= 1%cm 1

4

A10a(mL)Vol.Amostr(Amostra) Abs.(ppm) totais esCarotenóid

3.3.5.2.2) Composição de carotenóides

As amostras foram analisadas quanto a sua composição em carotenóides em HPLC,

utilizando uma fase móvel de acetonitrila/metanol/THF (50/45/5 v/v/v), com adição de 0,05%

trietilamina ao metanol, sendo submetida a ultrassom antes do uso. A vazão da fase móvel foi

de 1,0 ml/min. A temperatura da coluna era a ambiente (25 ± 2°C), e a absorbância foi

detectada a 450 nm. As amostras foram solubilizadas em acetona, e diluídas para depois

serem injetadas (5 µL) no HPLC (http://www.waters.com/, 2006).

Os padrões de carotenóides utilizados foram obtidos através de separação por

cromatografia em coluna 2,5 cm x 30 cm, usando como adsorvente uma mistura ativada 1/1

de óxido de magnésio e terra diatomácea (Celite®).

Inicialmente foi adicionada uma amostra da fração insaponificável do óleo bruto de

buriti à coluna, e em seguida eluída com éter de petróleo em concentrações variando de 4 a

20% de éter etílico. As frações obtidas foram α-caroteno, β-caroteno e γ-caroteno. O 10-apo-

β-carotenal foi obtido por partição em etanol do óleo refinado de buriti, e purificado pelo

HPLC, injetando 100 µL por 3 vezes nas condições já supra citadas. Estes carotenóides foram

confirmados pela varredura no espectro visível em espectrofotômetro (Godoy & Rodriguez-

Amaya, 1995; Rodriguez-Amaya, 2001).

44

http://www.waters.com/

3.3.5.3) Tocoferóis Totais

As amostras foram analisadas quanto aos tocoferóis totais em HPLC, utilizando uma

fase móvel de isopropanol (grau HPLC)/água ultra-pura milli-Q (65/35 v/v), sendo submetida

a ultrassom antes do uso. A vazão da fase móvel foi de 0,7 ml/min. A temperatura da coluna

foi ajustada para a temperatura ambiente (25 ± 2°C), e a absorbância foi detectada em 295

nm. As amostras foram solubilizadas em metanol, e diluídas para depois serem injetadas (7

µL) no HPLC. O padrão utilizado foi o α-tocoferol (Satomura et al, 1992).

3.3.5.4) Esteróis Totais

Para determinação de fitoesteróis totais, foi utilizado um método espectrofotométrico

através de um kit enzimático que contém lipase, colesterol oxidase e peroxidase, tendo como

padrão uma solução de colesterol de 200 mg/mL (Moreau et al, 2003).

Inicialmente, o reativo de trabalho (0,5 mL de 4-aminofenazona 0,025 M + 19 mL

água + 0,5 mL fenol 0,055 M + 0,2 mL reativo enzimático) é preparado, sendo utilizado:

Branco Padrão Amostra Reativo de Trabalho 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL Reativo Padrão - 20 µL - Amostra - - 20 µL

As soluções branco, padrão e amostra são incubadas a 37 ºC em um banho-maria por

60 minutos, e depois detectados em espectrofotômetro a 505 nm. A concentração de esteróis

totais é calculada de acordo com a fórmula abaixo.

200).().()/( ×=

PadrãoAbsAmostraAbsdLmgtaisEsteróisTo

3.3.6) Atividade Lipolítica

A atividade da lipase foi estimada mediante a variação de absorbância a 410 nm em

espectrofotômetro devido à oxidação do p-nitrofenil laurato (p-NFL) com uma concentração

de 0,162 mg.mL-1 em tampão fosfato de potássio (0,05 M), pH 7,0 (Meirelles, 1997).

45

O substrato (p-NFL) foi preparado solubilizando 0,018 g deste em 1 mL de

dimetilsulfóxido (DMSO). Em seguida, uma alíquota foi diluída 100 vezes em tampão fosfato

de potássio (0,05 M).

Um tubo de ensaio contendo 1,8 mL do substrato previamente preparado foi

aclimatado a 37ºC por, aproximadamente, 15 minutos. Após esse tempo, foram adicionados

0,2 mL de solução de enzima e a absorbância acompanhada em espectrofotômetro a 410 nm

contra o branco de reação (0,2 mL do tampão fosfato de potássio adicionados a 1,8 mL do

substrato).

O cálculo da atividade é realizado utilizando a equação abaixo:

( )VtfDAbsA

*)(1000***

∆∆

=

onde:

A = atividade da enzima (U.L-1), onde 1 Unidade enzimática (1U) é a quantidade de enzima

capaz de produzir 1µmol de p-nitrofenol por minuto nas condições de ensaio;

∆Abs = variação de absorbância no intervalo de tempo ∆t (em minutos) transcorrido durante a

fase de aumento linear da absorbância;

D = diluição da solução enzimática;

V = volume (mL) da solução enzimática utilizado no ensaio.

f = fator de conversão (0,1062 µmol/mL)

3.4) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

3.4.1) Caracterização dos Óleos de buriti Nesta etapa inicial, foi conduzida a caracterização dos óleos bruto e refinado de buriti,

permitindo avaliar alguns parâmetros-base, como a composição em termos de ácidos graxos;

suas propriedades físico-químicas (índices de peróxido, saponificação e iodo; ácidos graxos

livres; densidade e umidade) e o teor e a composição de material insaponificável, dentre os

quais estão tocoferóis, fitoesteróis e carotenóides.

46

3.4.2) Pré-Avaliação do Processo Enzimático A pré-avaliação do processo enzimático foi realizada para se determinar uma faixa de

valores mais restrita para as variáveis a serem testadas, como o tempo reacional mínimo para

cada enzima; a temperatura de atuação ótima das enzimas sem que haja degradação dos

carotenóides; a quantidade e a seleção de enzimas a serem adicionadas ao sistema reacional; e

a melhor proporção entre óleo e água. Além disso, foram testados alguns aditivos como

emulsificantes, cálcio, alumina básica ativada S, amberlita XAD-2 e substituição da água por

tampão fosfato. Estes parâmetros foram avaliados em relação à formação de ácidos graxos

livres por titulação, a quantidade de carotenóides totais por espectrofotometria e a variação no

perfil destes através de HPLC.

3.4.2.1) Tempo reacional e Seleção de enzimas Nesta etapa, foram avaliados o tempo reacional (1, 2, 4 e 24 h) a ser fixado para o

planejamento experimental e quais enzimas deveriam ser testadas. Para isso foram utilizados

alguns parâmetros fixos como agitação (200 rpm), quantidade de enzima (1 U de atividade em

8 mL de volume total), temperatura (30°C) e relação óleo/água (1/1).

Cada enzima apresenta uma atividade lipolítica diferente: Novozym 435 possui 1835,6

± 96,3 U por kg de enzima imobilizada, a Lipozyme CALB L apresenta 53106 ± 640 U/L, a

Lipozyme TL IM apresenta 690,24 ± 6 kU/kg de atividade e a lipase de Yarrowia lipolytica,

inicialmente tinha 2000 U/L quando produzida em frascos agitados (utilizada nesta pré-

avaliação). Posteriormente, quando a produção foi conduzida em biorreator, foi obtido 30184

± 500 U/L de atividade lipolítica (utilizada no planejamento experimental). Isso quer dizer

que para representar 1 U de atividade foram necessárias 0,545 g de Novozym 435; 18,83 µL

de Lipozyme CALB L; 1,5 mg de Lipozyme TL IM e 0,5 mL de lipase de Yarrowia lipolytica

para um total de 8 mL de mistura reacional.

47

O custo destas enzimas no mercado em 2007 está em US$ 1785,70 por kg de

Novozym 435; US$ 86,42 por kg de Lipozyme TL IM e US$ 138,36 por kg de Lipozyme

CALB L. Neste trabalho foi estimado que o valor de mercado da lipase de Yarrowia lipolytica

teria o mesmo custo da Lipozyme CALB L por esta também estar na forma livre.

3.4.2.2) Temperatura Para avaliar a cinética de degradação do β-caroteno, foram feitos ensaios que

consistiram da manutenção dos óleos bruto e refinado em tubos fechados em diferentes

temperaturas (25, 35, 45, 55 ,65 e 75°C) controladas durante 2 horas.

3.4.2.3) Relação Óleo/Água Para avaliar a relação óleo/água, foram empregadas como condições experimentais:

temperatura (30°C), agitação (200 rpm), lipase (Lipozyme TL IM, 10 U) e tempo reacional (2

h), variando esta relação de óleo para água em 7/1, 3/1, 1/1, 1/3 e 1/7.

3.4.2.4) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimática) Como na etapa anterior, alguns parâmetros operacionais foram adotados como

temperatura (30°C), agitação (200 rpm), lipase (Lipozyme TL IM), relação óleo/água (1/1) e

tempo reacional (2 h) para avaliação da quantidade de enzima (1, 10, 50, 100 e 250 U) sobre a

hidrólise enzimática dos óleos de buriti.

3.4.2.5) Aditivos Nesta etapa foram testados alguns aditivos (emulsificantes, cálcio, adsorventes,

tampão fosfato) que poderiam promover um aumento na hidrólise dos óleos de buriti.

O desempenho de todas as lipases selecionadas foi avaliado, uma vez que estes

aditivos podem ter atuação diferente sobre cada uma destas, já que possuem estruturas

distintas. Nesta avaliação foram empregadas as seguintes condições: temperatura (30°C),

agitação (200 rpm), lipase (10U), relação óleo/água (1/1) e tempo reacional (1,5 h).

48

3.4.3) Otimização da Hidrólise Enzimática Nesta etapa foi feito o planejamento experimental composto central para cada variável

selecionada na respectiva faixa de valores determinada na etapa anterior (item 3.4.2),

constituído de 17 experimentos para cada enzima e para cada óleo, gerando um total de 102

experimentos, como mostrado nas Tabelas 8 e 9.

Os parâmetros e suas interações foram avaliados de acordo com o diagrama de Pareto,

e as condições ótimas obtidas através de resposta por desirability, gerando os gráficos de

contorno de superfície, e um modelo com o qual se estimam os valores a serem obtidos das

variáveis-resposta: ácidos graxos livres e carotenóides. A correlação deste modelo com os

resultados obtidos foi avaliada pelo coeficiente de correlação, R², permitindo verificar o ajuste

do modelo.

O diagrama de Pareto é um histograma que apresenta os efeitos padronizados (valores

absolutos calculados através da distribuição t de Student) de cada parâmetro em termos

lineares, quadráticos e a interação do seu termo linear com o de outro parâmetro, sendo estes

considerados relevantes se forem estatisticamente significativos, isto é, quando o efeito

padronizado do parâmetro for inferior ao p-valor (probabilidade de significância) de 0,05,

para 95% de confiança (Rodrigues & Iemma, 2005).

A abordagem geral da função desirability consiste em converter primeiro cada

resposta yi em uma função individual desirability di , que varia de 0 a 1, onde quanto mais

próximo de 1, melhor o ajuste. Assim, as variáveis independentes são escolhidas de modo a

maximizar a desirability global, definida como a média geométrica de todas as funções

individuais di.

49

Através desta função podem-se obter superfícies de resposta, curvas de nível e

também as condições ótimas das variáveis independentes. As superfícies de resposta

apresentam o comportamento da desirability global perante a variação de 2 parâmetros, mas

neste trabalho optou-se pelas curvas de nível para uma melhor visualização da região de

maior desirability (Calado & Montgomery, 2003).

Tabela 8 – Faixa de valores utilizada para otimização dos parâmetros da hidrólise enzimática Fatores -1,68 -1 0 +1 +1,68

Temperatura (°C) 25 29 35 41 45 Atividade Enzimática (U) 1 10,7 25 39,9 50

Relação Óleo/água 1/1 (1) 7/5 (1,4) 2/1 (2) 13/5 (2,6) 3/1 (3)

Tabela 9 – Planejamento Composto Central em 3 níveis com 3 pontos centrais

Ensaios T(°C) Ativ(U) Oleo/agua 1 29,0 10,7 1,4 2 29,0 10,7 2,6 3 29,0 39,9 1,4 4 29,0 39,9 2,6 5 41,0 10,7 1,4 6 41,0 10,7 2,6 7 41,0 39,9 1,4 8 41,0 39,9 2,6 9 25,0 25,0 2,0 10 45,0 25,0 2,0 11 35,0 1,0 2,0 12 35,0 50,0 2,0 13 35,0 25,0 1,0 14 35,0 25,0 3,0

15 (C) 35,0 25,0 2,0 16 (C) 35,0 25,0 2,0 17 (C) 35,0 25,0 2,0

Os parâmetros fixados foram: volume reacional (8 mL), tempo reacional (4 h),

agitação (200 rpm), enzimas (Lipozyme TL IM, Lipozyme CALB L e lipase de Yarrowia

lipolytica), aditivo (alumina em concentração de 10% em peso em relação ao volume de óleo

adicionado). As condições a serem otimizadas foram: temperatura, quantidade de enzima

(atividade enzimática) e relação de quantidade de substrato (óleo de buriti) para uma

quantidade de água. Os resultados foram analisados através do software STATISTICA 6.0.

50

Com as condições ótimas obtidas neste planejamento, foram realizados testes variando

alguns parâmetros em intervalos menores, como a quantidade de enzima (5, 15, 25, 35, 45, 55

e 65 U), agitação (200, 300 e 400 rpm) e tempo reacional (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8 h) para se

alcançar maiores rendimentos em ácidos graxos livres.

3.4.4) Desacidificação e Concentração de β-Caroteno Inicialmente, a fase aquosa (água + glicerol), os ácidos graxos precipitados, a alumina

e lipase foram separadas da fase orgânica (carotenóides + ácidos graxos). Alguns testes foram

feitos para recuperação da alumina com vários solventes orgânicos para dessorção de ácidos

graxos e carotenóides.

A desacidificação da fase orgânica foi testada através de partição com álcool etílico,

adicionado com o mesmo volume da fase rica em carotenóides, agitado a 300 rpm por 15 min

a 45°C por 4 vezes (Gonçalves et al, 2007), sendo avaliada a concentração de carotenóides na

fase orgânica. Outros métodos também foram testados como saponificação utilizando soda

alcoólica e aquosa (NaOH 0,5 M) nas mesmas condições utilizadas na partição com etanol. A

winterização foi testada mantendo a fase orgânica em temperaturas de 4°C por 2 h seguida de

centrifugação.

51

CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1) CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS DE BURITI

4.1.1) Composição em ácidos graxos A Tabela 10 indica as composições em ácidos graxos dos óleos bruto e refinado de

buriti. Os dados obtidos referentes ao óleo bruto de buriti estão de acordo com trabalhos

reportados por García-Quiroz et al (2003) e Santos (2005). Já os dados referentes ao óleo

refinado de buriti não foram relatados na literatura. Os resultados aqui obtidos apresentaram

um alto teor de ácidos graxos insaturados (88,3%), podendo ser indicado como alimento

funcional e para aplicação em cosméticos.

Tabela 10 – Comparação da composição de ácidos graxos dos óleos de buriti Ácidos graxos % Bruto % Refinado

Miristico (14:0) - - Palmítico (16:0) 19,58 11,68 Esteárico (18:0) 2,62 -

Oleico (18:1) 74,74 73,16 Linolêico (18:2) 1,83 15,16

Linolênico (18:3) - - Araquidico (20:1) 1,23 -

4.1.2) Determinação dos Índices Físico-Químicos A Tabela 11 compara os principais índices físico-químicos dos óleos bruto e refinado

de buriti. Alguns índices foram comparados com valores referenciados pelo grupo empresarial

Beraca-Sabará, como o índice de iodo, o índice de saponificação, o índice de peróxido, os

ácidos graxos livres e a densidade. García-Quiroz et al (2003) também mediram alguns

índices do óleo de buriti, obtendo uma densidade de 0,86 g/cm³, índice de iodo de 77,2 g I2

/100g e índice de saponificação de 169,9 mg KOH/g. Todos os índices encontrados estão de

acordo com estas referências.

52

Tabela 11 – Comparação dos índices físico-químicos dos óleos de buriti Análises Óleo

Bruto Referências Óleo

Refinado Referências

Índice de Iodo (g I2/100g) 67,45 ± 1,0 115 - 150 89,17 ± 1,0 80 – 150 Índice de Saponificação (mg KOH/g) 186,53 ± 6,0 180 - 250 174,8 ± 6,0 150 – 210 Índice de Peróxido (meq O2/1000g) 3,79 ± 0,4 máx. 10 1,19 ± 0,2 máx. 7 Ácidos Graxos Livres (%) 10,0 ± 1,0 máx. 5 4,37 ± 0,4 máx. 1 Densidade, a 20°C (g/cm³) 0,844 ± 0,03 0,86 – 0,98 0,812 ± 0,02 0,8 – 0,98 Umidade (%) 0,73 ± 0,1 - 1,90 ± 0,2 - Teor de Insaponificáveis (%) 1,99 ± 0,2 - 1,23 ± 0,1 - Tocoferóis Totais (ppm) 777 ± 20 700 159 ± 20 - Esteróis Totais (ppm) 1600 ± 50 800 - 1000 1083 ± 50 - Carotenóides Totais (ppm) 1817 ± 30 1150 - 3380 864 ± 7 -

O teor de insaponificáveis foi comparado ao de óleo de palma (1,2%), pois também

apresenta teor representativo de carotenóides (500-700 ppm), sendo bastante similar ao óleo

de buriti, apesar de este ser ligeiramente maior devido ao alto teor de carotenóides (1150-3380

ppm) (Gunstone & Padley, 1997; Rodriguez-Amaya, 2001). Os tocoferóis totais no óleo bruto

encontrado foram um pouco inferior ao reportado por Silveira (2004), mas considerando os

esteróis totais esta concentração foi muito superior. Poucos trabalhos fornecem dados de

concentrações de carotenóides em relação ao óleo, como García-Quiroz et al (2003) que

encontraram 1706 ± 54 ppm. No óleo refinado, os insaponificáveis são parcialmente

removidos ou degradados durante as etapas de desacidificação, branqueamento e

desodorização (Ouyang et al, 1980), sendo por isso seus teores menores que no óleo bruto.

4.1.3) Composição e Perfil de Carotenóides Na Tabela 12, a composição de carotenóides de ambos os óleos de buriti estudados são

comparadas. O óleo bruto de buriti apresenta percentuais semelhantes aos descritos na

literatura (Godoy & Rodriguez-Amaya, 1995; Garcia-Quiroz et al, 2003; de Rosso &

Mercadante, 2007), sendo que neste trabalho não foi utilizada coluna cromatográfica

específica para detecção de cis-carotenóides, que geralmente representam de 2 a 18% de β-

caroteno presente no óleo de buriti.

53

Os outros carotenóides presentes, além dos já mencionados, são variados, como os

encontrados por Godoy & Rodriguez-Amaya (1995) utilizando uma coluna C18 Vydac 201-

TP54, 250 x 4,6 mm, com a seguinte composição: 3,9% zeaxantina, 1,1% β-zeacaroteno e

0,9% ζ-caroteno. Garcia-Quiroz et al (2003) detectaram fitoflueno (0,95%), β-zeacaroteno

(2,4%), ζ-caroteno (2,5%), δ-caroteno (0,7%), mutacromo (2,86%), β-10-apocarotenal (4,4%)

e zeaxantina (6,2%), mas sem mencionar qual coluna foi utilizada. De Rosso & Mercadante

(2007) utilizando uma coluna C30 YMC, 250 x 4,6 mm, com detector PDA e espectrômetro

de massas, analisaram o óleo de buriti e encontraram derivados epoxidados de β-caroteno

(1,6%), δ-caroteno (2,2%), α-criptoxantina (0,25%), ζ-caroteno (0,016%) e luteína (0,007%).

Tabela 12 – Comparação da composição de carotenóides dos óleos de buriti Carotenóides % Bruto % Refinado β-caroteno 76,8 ± 0,4 45,0 ± 0,3 α-caroteno 8,8 ± 0,1 2,5 ± 0,1 γ-caroteno 4,5 ± 0,1 1,9 ± 0,1 Apocarotenóides 0,45 ± 0,07 45,0 ± 1,2 Outros 9,4 ± 0,4 6,0 ± 0,2

No caso do óleo refinado de buriti, a composição de carotenóides demonstra como o

processo de refino promove a degradação dos carotenóides, sendo quase metade do β-

caroteno transformado em apocarotenóides, principalmente em 10-apo-β-carotenal. Este

problema inicial pode na verdade ser uma solução futura, pois além do aproveitamento do β-

caroteno natural, poder-se-ia separar este apocarotenóide para aplicação em margarinas como

substituto de corantes sintéticos, como cantaxantina e 8-apo-β-carotenal.

Na Figura 25 encontram-se os perfis de carotenóides dos óleos de buriti, diluídos 500

vezes em acetona, com identificação do tempo de retenção de cada carotenóide.

54

Óleo bruto

Beta-caroteno

Alfa-caroteno

Gama- caroteno

Apocarotenóides Óleo refinado

Beta-carotenoAlfa-caroteno Gama-

caroteno

Figura 25 – Perfil de carotenóides dos óleos de buriti

4.2) PRÉ-AVALIAÇÃO DO PROCESSO ENZIMÁTICO

4.2.1) Determinação do Tempo Reacional e Seleção das Enzimas Na Figura 26, observa-se que a enzima que apresentou melhor rendimento na hidrólise

dos óleos de buriti bruto e refinado foi a Novozym 435, alcançando 60% em ácidos graxos

livres em 24 h. Porém, na Figura 27 é aval

enzimas. Tal análise permite concluir que a

o óleo, com uma quantidade mínina de bi

sendo portanto selecionadas a Lipozyme

lipolytica para o planejamento experimenta

iada a produção de ácidos graxos pelo custo destas

Lipozyme TL é muito mais eficiente em hidrolisar

ocatalisador (0,01875% de peso por volume total),

TL IM, a Lipozyme CalB L e a lipase de Y.

l.

55

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25tempo (h)

% A

GL

CalB 435

TL Yarrowia

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 tempo (h)

% A

GL

CalB 435TL Yarrowia

Figura 26 – Avaliação do tempo reacional de hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

050

100150200250300350400

0 5 10 15 20 25tempo (h)

10³ x

% A

GL/

US

$ lip

ase CalB 435

TL Yarrowia

01

23

45

67

0 5 10 15 20 25tempo (h)

10³ x

% A

GL/

US$

lipa

se

050

100150200250300350400

0 5 10 15 20 25 tempo (h)

10³ x

% A

GL/

US

$ lip

ase CalB 435

TL Yarrowia

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

0 5 10 15 20 25 tempo (h)

10³ x

% A

GL/

US$

lipa

se

(a) (b)

(a)

Ampliando

(b)

Ampliando

Figura 27 – Avaliação da quantidade de ácidos graxos produzida pelo custo de lipase durante a hidrólise de óleo bruto (a) e refinado (b) de buriti

Quanto ao tempo reacional, apesar de em 24 horas haver maior hidrólise, foi escolhido

o tempo de 4 horas uma vez que a cinética já tende a estabilidade na formação de ácidos

graxos.

Os carotenóides também foram avaliados nesta etapa, mas não apresentaram

alterações muito significativas nos perfis, c

24 horas de hidrólise, provavelmente pel

pouco o volume total de fase orgânica.

oncentrando em mais de 10% do seu valor total em

a precipitação dos ácidos graxos, diminuindo um

56

4.2.2) Pré-avaliação dos Parâmetros do Planejamento Experimental 4.2.2.1) Temperatura

Na Figura 28 é apresentada a influência da temperatura sobre os carotenóides,

demonstrando que há uma ligeira diminuição no teor de β-caroteno presente no óleo bruto de

buriti entre 25 e 45°C, sendo esta queda ainda mais pronunciada entre 45 e 75°C. No óleo

refinado, a queda na concentração de β-caroteno e o aumento de apocarotenóides são

praticamente complementares, indicando também que a melhor faixa de operação está entre

25 e 45°C, a qual foi mantida para o planejamento experimental.

0200400600800

10001200140016001800

20 30 40 50 60 70 80T (°C)

ppm beta-caroteno

Apocarotenóides

0200400600800

10001200140016001800

20 30 40 50 60 70 80T (°C)

ppm

beta-carotenoApocarotenóides

(b)(a)

Figura 28 – Avaliação da temperatura na redução da concentração de β-caroteno durante a hidrólise de óleo bruto (a) e refinado (b) de buriti

4.2.2.2) Relação Óleo/Água Foram escolhidas relações óleo/água com maior proporção de água para comprovar

que estas condições promovem uma maior hidrólise do óleo, mas necessitam de um maior

tempo operacional para hidrolisar grandes quantidades de óleo, gerando custos operacionais

maiores e também um maior gasto no pós-processamento dos efluentes gerados. Portanto, a

relação óleo/água deve ser pelo menos com proporções iguais entre as fases, ou com

quantidade superior de óleo. Na Figura 29 é visualizado que a relação óleo/água 7/1 possui

baixo teor em ácidos graxos livres. Com i

1/1.

sso, a faixa operacional foi delimitada entre 3/1 e

57

01020304050607080

7\1 3\1 1\1 1\3 1\7

% A

GL

0

1020304050607080

7\1 3\1 1\1 1\3 1\7

% A

GL

(b)(a)

Figura 29 – Avaliação da relação óleo/água na hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

Os carotenóides também foram avaliados nesta etapa, não havendo alterações no seu

perfil, tendo sido concentrado em mais de 25% quando a relação 1/7 foi utilizada,

provavelmente devido ao seu maior rendimento na hidrólise.

4.2.2.3) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimática) Os resultados obtidos no que tange a quantidade de biocatalisador indicam que

concentrações muito altas de enzima, como 100 U e 250 U em 8 mL de mistura reacional,

produziram rendimentos maiores em ácidos graxos (Figura 30). Porém, o suporte em que a

lipase (Lipozyme TL IM) está imobilizada adsorve carotenóides (Figura 31), alterando

parcialmente o perfil dos mesmos nos óleos. Assim, a faixa operacional foi delimitada entre 1

e 50 U para o planejamento experimental, mantendo sempre o volume reacional de 8 mL.

01020304050607080

1U 10U 50U 100U 250U

%AG

L

0

1020304050607080

1U 10U 50U 100U 250U

%A

GL

(b)(a)

Figura 30 – Avaliação da quantidade de enzima sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

0

500

1000

1500

2000

2500

1 U 1

Caro

tenó

ides

(ppm

)

Figura 31 – Avaliação da quantidade d

0 U 50 U 100 U 250 U

Oleo BrutoOleo Refinado

e enzima sobre a concentração de carotenóides

58

4.2.3) Pré-avaliação dos Aditivos 4.2.3.1) Emulsificantes

A adição de emulsificantes a este sistema reacional poderia aumentar a área interfacial

entre a fase oleosa e a aquosa, facilitando a atuação lipásica na hidrólise. Na Figura 32 é

apresentado o rendimento em ácidos graxos encontrado quando alguns emulsificantes (goma

arábica, Tween 80 e Span 20) foram adicionados na concentração de 5% em peso pelo

volume de água presente. Para uma melhor comparação, foi realizado um experimento sem

adição de emulsificantes (branco). Nenhum dos emulsificantes promoveu um aumento em

ácidos graxos livres comparativamente ao branco, e também não alterou significativamente o

teor de carotenóides presentes com as três lipases testadas.

0

5

10

15

20

25

30

Branco Gomaarabica

Tween Span

% A

GL

Yarrowia TL CalB

0

5

10

15

20

25

30

Branco Gomaarabica

Tween Span

% A

GL

Yarrowia TL CalB

(b)(a)

Figura 32 – Avaliação de emulsificantes sobre a hidrólise enzimática dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

4.2.3.2) Cálcio A adição de íons cálcio a esse sistema reacional poderia: na forma solúvel, estabilizar

a lipase, dependendo da estrutura tridimensional da enzima, além de possibiltar a formação de

sabão (interação entre íons cálcio e os ácidos graxos gerados); ou ainda na forma insolúvel,

atuando como adsorvente dos ácidos graxos formados, deslocando o equilíbrio da reação no

sentido da hidrólise.

Na Figura 33 é apresentado o re

adicionado substituindo a água por uma so

de CaCO3 em concentrações de 5% em pes

ndimento em ácidos graxos quando o cálcio é

lução aquosa de CaCl2 a 0,01 e 0,05M ou na forma

o pelo volume de óleo presente.

59

Para uma melhor comparação, foi feito um experimento sem adição de cálcio (branco).

A adição de CaCO3 gerou um aumento (2 vezes) no rendimento em ácidos graxos com todas

as lipases avaliadas, mas ao mesmo tempo, este reduziu a concentração de carotenóides em

20%, além de necessitar de um maior número de centrifugações para sua separação da fase

orgânica.

A adição de solução de CaCl2 apresentou um pequeno aumento no rendimento em

ácidos graxos quando foram utilizadas enzimas livres, não sendo este aumento porém muito

siginificativo. No caso da Lipozyme TL, a adição de CaCl2 teve efeito negativo na hidrólise

dos óleos de buriti, principalmente no óleo refinado. Isso pode ter ocorrido pela formação de

sabão e possível oclusão dos poros do suporte.

0

10

20

30

40

50

60

Branco CaCl20,05M

CaCl20,01M

CaCO3 5%

% A

GL

Yarrowia TL CalB

0

10

20

30

40

50

60

Branco CaCl20,05M

CaCl20,01M

CaCO3 5%

% A

GL

Yarrowia TL CalB

(a) (b)

Figura 33 - Avaliação da adição de cálcio sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

4.2.3.3) Adsorventes Foram testados dois adsorventes nesta etapa, um inorgânico (alumina básica, pH entre

9-10, para cromatografia em coluna, com diâmetro de partícula de 0,05-0,15 mm e área

superficial de 155 m²/g) e um polimérico (amberlita XAD2, uma resina de poliestireno-

divinilbenzeno, com diâmetro de partícula de 0,25 – 0,80 mm e área superficial de 300 m²/g).

A alumina foi selecionada dada a sua gra

Hordern, 2004), inclusive com ácidos gra

tipos de compostos hidrofóbicos até massa

de ácidos graxos, deslocando o equilíbrio d

nde interação com ácidos carboxílicos (Kasprzyk-

xos (Queiroz 1996). Já a amberlita adsorve vários

molar de 20 kDa, o que possibilitaria a adsorção

a reação no sentido da reação de hidrólise.

60

Inicialmente ambos os adsorventes foram adicionados em concentrações de 5% em

peso por volume de óleo. Ambos os adsorventes apresentam rendimentos em ácidos graxos

similares (Figura 34), sendo facilmente removidos por centrifugação após a hidrólise. A

concentração de carotenóides se manteve inalterada no caso da amberlita e apresentou uma

redução de 9% quando a alumina é utilizada. Mas, entre estes dois adsorventes, há uma

grande diferença em relação aos seus custos. A alumina básica tem um custo de US$37 / kg, e

amberlita XAD2 apresenta um custo bem maior: US$116 / kg.

0

10

20

30

40

50

60

Branco Amberlita Alumina

% A

GL

Yarrow ia

TL

CalB

0

10

20

30

40

50

60

Branco Amberlita Alumina

%A

GL

Yarrow iaTLCalB

(b)(a)

Figura 34 – Avaliação de adição de adsorventes sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

Por isso, alumina foi escolhida para fazer os testes alterando sua concentração no meio

reacional, como é apresentado nas Figuras 35 e 36. O aumento da concentração de alumina na

hidrólise enzimática levou a uma maior adsorção dos carotenóides, como no caso da

utilização de 20% de alumina onde houve a redução de 15% no óleo bruto e de 35% no óleo

refinado, sendo esta adsorção preferencial por apocarotenóides. Até a concentração de 10% de

alumina, esta adsorção de carotenóides é menos evidenciada, e apresenta um alto rendimento

em ácidos graxos (superior a 60%), sendo por isso a quantidade de alumina escolhida para ser

usada no planejamento experimental.
61

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 5 10 20% Alumina no óleo

% A

GLYarrowiaTLCalB

0

10

20

30

40

50

60

70


% A

GL

YarrowiaTLCalB

(b)(a)

Figura 35 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100


Caro

tenó

ides

(ppm

)

Yarrowia TL CalB

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100


Caro

tenó

ides

(ppm

)

Yarrowia TL CalB

(b)(a)

Figura 36 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a concentração de carotenóides durante a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti

4.2.3.4) Tampão Fosfato A utilização de uma solução tampão neste sistema reacional poderia manter o pH de

melhor atuação lipásica durante a hidrólise, promovendo um aumento da produção de ácidos

graxos. A substituição da água por uma solução tampão fosfato de sódio 0,05 e 0,2M

promoveu um ligeiro aumento no rendimento em ácidos graxos, mas não muito

representativo, como visto na Figura 37, sem alterações na concentração de carotenóides. Por

isso, a água foi mantida para o planejamento experimental.

05

10152025303540

Branco 0,05M 0,2M

%A

GL

Yarrowia TL CalB

25303540

Yarrowia TL CalB

(b)(a)

Figura 37 - Avaliação da substituição da água prefina

05

101520

Branco 0,05M 0,2M

%A

GL

or tampão fosfato sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e

do (b) de buriti

62

4.3) OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

4.3.1) Planejamento Experimental do Óleo Bruto de Buriti Os resultados obtidos durante o planejamento experimental são apresentados na

Tabela 13 referente à hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti, sendo destacados em

negrito os melhores rendimentos em ácidos graxos livres para cada lipase utilizada.

Tabela 13 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti utilizando planejamento composto central

Lipozyme TL IM Lipozyme CALB L Lipase de Y. lipolytica Ensaios %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm)

1 62,89 1539 13,22 1879 15,36 1696 2 56,58 1810 13,86 1920 15,30 1799 3 73,61 1561 17,51 1903 34,30 1565 4 73,04 1732 14,72 1754 32,04 1648 5 62,53 1580 14,29 1725 15,72 1607 6 52,83 1692 15,30 1575 11,84 1693 7 76,46 1609 15,72 1857 34,30 1791 8 61,20 1609 15,59 1666 25,98 1773 9 60,11 1547 14,40 1749 32,56 1644 10 66,06 1570 18,16 1712 25,67 1754 11 18,78 1814 13,77 1758 9,08 1756 12 72,00 1602 18,78 1811 35,06 1754 13 64,24 1631 17,94 1665 31,29 1769 14 67,86 1596 16,41 1552 33,65 1868

15 (C) 66,06 1728 13,77 1700 28,80 1802 16 (C) 62,61 1746 14,08 1658 30,05 1792 17 (C) 68,87 1720 14,40 1730 31,43 1778

4.3.1.1) Lipozyme TL IM Na Figura 38 são apresentados os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos

livres e aos carotenóides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da

atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos e o termo quadrático da temperatura, no caso

dos carotenóides. O coeficiente de correlação, R², para os ácidos graxos livres foi igual a 0,75,

e para os carotenóides foi de 0,74, tendo baixo ajuste ao modelo.

63

(a)

(b)

Figura 38 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)

Na Figura 39, o intervalo ótimo (com maior desirability) foi determinado em 10 - 35U

de atividade enzimática, 1,9 - 2,9 de relação óleo/água e 27 - 36°C de temperatura. As

condições ótimas encontradas foram: temperatura de 31,2°C, atividade enzimática de 21,6U e

relação óleo/água de 2,33. Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta

(ácidos graxos livres e carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de

regressão resultando em 64,48% e 1749 pp

m, respectivamente.

64

Figura 39 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação

óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM

65

4.3.1.2) Lipozyme CALB L Na Figura 40 são apresentados os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos

livres e aos carotenóides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da

atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos; e o termo linear da temperatura, no caso dos

carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos graxos livres foi calculado como

0,70, e para os carotenóides 0,77, tendo baixo ajuste ao modelo.

(a)

(b)

Figura 40 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)

Na Figura 41, o intervalo ótimo (com maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade

enzimática, 1,0 - 1,6 de relação óleo/água

encontradas foram: temperatura de 45°C, a

1,6. Com estas condições foram calculada

carotenóides) através do modelo utilizan

18,80% e 2067 ppm, respectivamente.

e 25 - 45°C de temperatura. As condições ótimas

tividade enzimática de 50U e relação óleo/água de

s as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e

do os coeficientes de regressão resultando em

66


óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L

67

4.3.1.3) Lipase de Yarrowia lipolytica Na Figura 42 são apresentados os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos

livres e aos carotenóides, sendo estatisticamente significativo os termos linear e quadrático da

atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos; e o termo linear da relação óleo/água, o

termo quadrático da temperatura e a interação entre atividade enzimática e a temperatura, no

caso dos carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos graxos livres foi de 0,92,

e para os carotenóides foi de 0,88, tendo melhor ajuste ao modelo do que aquele obtido nos

ensaios empregando as demais lipases.

(a)

(b)

Figura 42 – Diagrama de Pareto para avaliação lipolytica sobre ácidos g

Na Figura 43, o intervalo ótimo (co

enzimática, 1,0 - 1,3 de relação óleo/água

encontradas foram: temperatura de 42,4°C,

da hidrólise do óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia raxos livres (a) e carotenóides (b)

m maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade

e 40 - 45°C de temperatura. As condições ótimas

atividade enzimática de 47,6U e relação óleo/água

68

de 1,0. Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e

carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de regressão resultando em



óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica

69

4.3.2) Planejamento Experimental do Óleo Refinado de Buriti Os resultados obtidos durante o planejamento experimental foram distribuídos na

Tabela 14 referente a hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti, sendo destacados em

negrito os melhores rendimentos em ácidos graxos livres para cada lipase utilizada.

Tabela 14 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti utilizando planejamento composto central

Lipozyme TL IM Lipozyme CALB L Lipase de Y. lipolytica Ensaios %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm)

1 68,42 760 8,55 788 8,92 820 2 51,07 844 8,11 632 7,81 755 3 66,56 863 28,63 686 30,49 864 4 68,80 804 8,71 789 27,04 939 5 61,35 812 11,15 690 8,18 867 6 39,66 690 8,71 675 6,91 773 7 74,37 878 16,36 780 7,44 814 8 71,20 641 12,92 762 6,01 864 9 62,88 829 11,73 759 22,15 834 10 63,20 849 7,82 761 5,21 708 11 14,66 697 6,84 686 4,56 806 12 68,74 673 14,99 807 9,77 865 13 59,04 693 14,76 654 12,15 898 14 46,02 642 8,68 592 8,68 919

15 (C) 65,81 813 11,08 720 9,42 889 16 (C) 67,07 778 11,73 709 9,12 876 17 (C) 63,85 796 11,08 706 8,67 873

4.3.2.1) Lipozyme TL IM Na Figura 44 são apresentados os diagramas de Pareto referentes às variáveis-resposta,

ácidos graxos livres e carotenóides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear

da atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos livres; e a interação entre a temperatura e a

relação óleo/água, no caso dos carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos

graxos livres foi de 0,80, e para os carotenóides foi de 0,81.

70

(a)

(b)

Figura 44 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme TL

IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)

Na Figura 45, o intervalo ótimo (com maior desirability) foi de 25 - 40U de atividade

enzimática, 1,0 - 1,8 de relação óleo/água e 25 ou 45°C de temperatura. As condições ótimas

encontradas foram: temperatura de 45°C, atividade enzimática de 31,2U e relação óleo/água

de 1,8. Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e


71


óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme TL IM

72

4.3.2.2) Lipozyme CALB L Os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos livres e aos carotenóides para a

enzima Lipozyme CalB L são apresentados na Figura 46, sendo estatisticamente significativo

o termo linear da atividade enzimática e da relação óleo/água, no caso dos ácidos graxos; e o

termo linear da atividade enzimática, o termo quadrático da relação óleo/água e a interação

entre a atividade enzimática e a relação óleo/água, no caso dos carotenóides. O coeficiente de

correlação R² para os ácidos graxos livres foi de 0,83, e para os carotenóides foi de 0,84.

(a)

(b)

Figura 46 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)

Na Figura 47, o intervalo ótimo

atividade enzimática, 1,2 - 2,0 de relação ó

ótimas encontradas foram: temperatura d

óleo/água de 1,667.

(com maior desirability) foi obtido em 50U de

leo/água e 25 - 30°C de temperatura. As condições

e 25°C, atividade enzimática de 50U e relação

73

Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e




óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L

74

4.3.2.3) Lipase de Yarrowia lipolytica Os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos livres e aos carotenóides para a

ação de hidrólise de Yarrowia lipolytica são apresentados na Figura 48. O termo linear da

atividade enzimática e da temperatura, o termo quadrático da temperatura e a interação entre

temperatura e atividade enzimática mostraram-se estatisticamente significativos, no caso dos

ácidos graxos; e o termo linear e quadrático da temperatura, o termo linear da atividade

enzimática e as interações entre a atividade enzimática e a relação óleo/água, e também com a

temperatura, no caso dos carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos graxos

livres foi de 0,94, e para os carotenóides foi de 0,92, tendo um bom ajuste ao modelo.

(a)

(b)

Figura 48 – Diagrama de Pareto para avaliaçYarrowia lipolytica sobre ácid

Na Figura 49, o intervalo ótimo (co

de 40 - 50U de atividade enzimática, 2

temperatura.

ão da hidrólise do óleo refinado de buriti por lipase de os graxos livres (a) e carotenóides (b)

m maior desirability) foi determinado no intervalo

,5 - 3,0 de relação óleo/água e 25 - 28°C de

75

As condições ótimas encontradas foram: temperatura de 29°C, atividade enzimática de

50U e relação óleo/água de 3,0. Com estas condições foram calculadas as variáveis de

resposta (ácidos graxos livres e carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de

regressão resultando em 30,80% e 708 ppm, respectivamente.


óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica

76

4.3.3) Resumo das Condições Ótimas na Hidrólise dos Óleos de Buriti Para uma melhor comparação dos resultados obtidos neste planejamento experimental,

foram dispostos nas Tabelas 15 e 16 os dados referentes às condições ótimas e os rendimentos

em ácidos graxos livres e carotenóides previstos pelos modelos da hidrólise enzimática dos

óleos bruto e refinado de buriti, respectivamente.

Tabela 15 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti Condição Ótima Rendimento Enzimas

T (°C) Ativ (U) Óleo/Agua % AGL Carotenóides (ppm) Lipozyme TL 31,2 21,6 2,33 64,48 1749 Lipozyme CalB L 45 50 1,6 18,80 2067 Lipase de Y. lipolytica 42,4 47,6 1,0 34,56 1861

Tabela 16 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti

Condição Ótima Rendimento Enzimas T (°C) Ativ (U) Óleo/Agua % AGL Carotenóides (ppm)

Lipozyme TL 45 31,2 1,8 75,86 878 Lipozyme CalB L 25 50 1,67 28,55 792 Lipase de Y. lipolytica 29 50 3,0 30,80 708

Os rendimentos em ácidos graxos tão distintos podem ser explicados pelas diferentes

estruturas tridimensionais dos sítios ativos das lipases utilizadas (Gutierrez-Ayesta et al,

2007) ou também pela possível hiperativação ocasionada pelo método de imobilização usado

na produção da Lipozyme TL IM, que deixaria o sítio ativo sempre exposto e ativado (Cunha,

2007). Devos et al (2006) fez uma comparação entre 12 lipases na hidrólise de fosfolipídeos

de biomassa algal, mostrando que a Lipozyme TL IM também gerou rendimentos em ácidos

graxos saturados e monoinsaturados de 75%, apesar de utilizar maior tempo reacional (24 h),

maior agitação (24 h), maior quantidade de enzima (1% p/v) e maior proporção entre fase

orgânica e aquosa (1/10). Já a lipase imobilizada de Candida antarctica apresentou resultados

abaixo dos 20% de ácidos graxos livres, valor próximo ao obtido na hidrólise do óleo bruto de

buriti.

77

As lipases de Candida antarctica e Yarrowia lipolytica não possuem um histórico em

reações de hidrólise de óleos vegetais na literatura, e sim na resolução de misturas racêmicas

(Guieysse et al, 2004; Ong et al¸ 2006), na síntese de novas moléculas (Fantin et al, 2001;

Yoshida et al, 2006) ou em outras modificações de óleos e gorduras (Hérnandez-Martín &

Otero, 2008). Por isso, a obtenção de baixos rendimentos em ácidos graxos não foi

surpreendente, mas o estudo foi necessário, justamente pela falta de dados na literatura.

4.3.4) Otimização Em ambas as hidrólises enzimáticas, tanto do óleo bruto como do óleo refinado de

buriti, o maior rendimento em ácidos graxos livres (até 75%) foi obtido quando utilizou-se a

Lipozyme TL IM com pequenas perdas de carotenóides.

Em todos os diagramas de Pareto analisados foi verificado que a atividade enzimática

foi estatisticamente significativa na hidrólise dos óleos no que se refere à produção de ácidos

graxos livres. Porém, como a correlação dos dados experimentais com o modelo teve um

baixo ajuste na maioria das avaliações, decidiu-se testar este parâmetro isoladamente,

mantendo as outras condições ótimas previstas pelo modelo.

Ainda objetivando uma maior hidrólise do óleo, foram testadas diferentes velocidades

de agitação do sistema, de forma a aumentar a área interfacial, facilitando a atuação lipásica.

Também foi avaliada a cinética reacional de hidrólise da Lipozyme TL IM em intervalos de

tempo menores que os utilizados no item 3.4.2.1.

4.3.4.1) Quantidade de Enzima Na Figura 50, pode-se determinar como condições ótimas de atividade enzimática 25

U (0,47% p/v) e 35 U (0,66% p/v) de Lipozyme TL IM para o óleo bruto e refinado,

respectivamente, sendo obtidos os maiores rendimentos em ácidos graxos livres (próximo de

70%), sem perdas significativas de carotenóides.

78

01020304050607080

0 10 20 30 40 50 60 70Ativ Enz (U)

%A

GL

Óleo BrutoÓleo Refinado

0200400600800

100012001400160018002000

0 10 20 30 40 50 60 70Ativ Enz (U)

Car

oten

óide

s (p

pm)


Figura 50 – Otimização da quantidade de enzima na hidrólise enzimática dos óleos de buriti

4.3.4.2) Agitação Mantendo as condições obtidas no item 4.3.3.1., a velocidade de agitação de 300 rpm

foi escolhida, pois gerou maiores incrementos nos rendimentos em ácidos graxos livres,

alcançando perto de 75%, com perdas de carotenóides ligeiramente inferiores aos obtidos a

400 rpm (Figura 51).

60

65

70

75

80

Óleo Bruto Óleo Refinado

% A

GL

200 rpm300 rpm400 rpm

0200400600800

10001200140016001800

Óleo Bruto Óleo Refinado

Car

oten

óide

s (p

pm) 200 rpm

300 rpm400 rpm

Figura 51 – Avaliação da velocidade de agitação sobre a hidrólise enzimática dos óleos de buriti

4.3.4.3) Tempo Reacional Tendo como condições iniciais para óleo bruto (25U de atividade enzimática, 2,33 de

relação óleo/água e 31,2°C de temperatura) e para o óleo refinado (35U de atividade

enzimática, 1,8 de relação óleo/água e 45°C de temperatura), além da velocidade de agitação

de 300 rpm, foi avaliada nesta última etapa a cinética reacional. Na Figura 52, observa-se que

a partir de 4 h de reação, a hidrólise tanto do óleo bruto como do refinado se estabiliza, sendo

então esta condição mantida como tempo reacional necessário ao processo.

79

Adicionalmente, o rendimento em ácidos graxos parece ter estabilizado em 75% fato

que pode ter ocorrido pela alteração do pH, que alcançou valores próximos a 5, pela formação

dos ácidos graxos livres, levando a uma possível inibição da lipase.

01020304050607080

0 1 2 3 4 5 6 7 8tempo (h)

% A

GL


0200400600800

100012001400160018002000

0 1 2 3 4 5 6 7 8

tempo (h)

Car

oten

óide

s (p

pm)


Figura 52 – Otimização do tempo reacional na hidrólise enzimática dos óleos de buriti

4.4) DESACIDIFICAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE β-CAROTENO 4.4.1) Recuperação da Alumina

A alumina nos experimentos de hidrólise do óleo de buriti adsorveu cerca de 15% dos

ácidos graxos liberados e ainda 5% dos carotenóides presentes no caso do óleo bruto, e

próximo de 10% no caso do óleo refinado. Esse aumento da adsorção de carotenóides pela

alumina no óleo de refinado deve estar relacionado com a grande presença de

apocarotenóides, que apresentam grupos aldeídos ou carboxílicos, os quais possuem afinidade

com a alumina (Kasprzyk-Hordern, 2004). Para a recuperação da alumina, e, por conseguinte

dessorção dos ácidos graxos e carotenóides, foram utilizados alguns solventes orgânicos como

etanol, acetona e éter de petróleo, puros ou em mistura.

A mistura 1/1 (v/v) de etanol e acetona promoveu a dessorção de 60% dos

carotenóides em apenas uma extração no caso da alumina usada durante a hidrólise do óleo

bruto de buriti, e utilizando o álcool etílico em 2 extrações obteve-se a remoção de 50% ds

carotenóides da alumina referente a hidrólise do óleo refinado. A utilização de 3 extrações,

sendo duas iniciais de etanol e uma última sendo uma mistura 1/1 de álcool etílico e acetona

removeu 85% dos ácidos graxos adsorvidos da alumina referente a hidrólise de ambos os

óleos de buriti.

80

4.4.2) Métodos de Desacidificação 4.4.2.1) Partição com Etanol

Inicialmente foi avaliado o tempo de agitação para a partição dos ácidos graxos ao

etanol, verificando que em 15 min a concentração de ácidos graxos já se estabilizava em 10%.

Resultado superior foi obtido por Gonçalves & Meirelles (2004) onde 53% dos ácidos graxos

presentes na fase oleosa distribuíram-se para fase alcoólica, mas neste trabalho foi incluída

uma etapa de repouso de 24 h para que as fases atingissem o equilíbrio e quantidade de ácidos

graxos livres presentes em sua amostra era pequena, cerca de 4%.

Em relação aos carotenóides apenas 2% se distribuem para a fase etanólica quando é

utilizado o óleo bruto de buriti, e cerca de 8%, no caso do óleo de refinado, onde 90% são

apocarotenóides. Gonçalves et al (2007) verificaram que os carotenóides de óleo de palma se

distribuem para a fase alcoólica entre 1,6 a 2,7%, podendo incrementar essa proporção se a

quantidade de água no sistema for menor, por exemplo com a utilização de etanol anidro

aumenta a partição dos carotenóides para 13%.

Na Figura 53 observa-se a variação dos ácidos graxos livres e dos carotenóides desde a

finalização do processo enzimático (1), a separação da fase orgânica (carotenóides + ácidos

graxos) da fase aquosa (água + glicerol + alumina + enzima + ácidos graxos precipitados) (2),

e após 4 extrações sucessivas da fase orgânica com álcool etílico (3).

Com as extrações por etanol, houve uma perda de 4,4% de carotenóides quando a fase

orgânica do óleo bruto de buriti foi utilizada, e 18,5% de carotenóides referentes ao óleo

refinado. Pela tendência descendente de ácidos graxos livres presentes na fase orgânica,

demonstrada na figura 53, para se alcançar 5% de ácidos graxos livres (tendo como referência

a quantidade inicial de ácidos graxos livres do óleo refinado de buriti), seriam necessárias

mais 4 extrações sucessivas com etanol.

81

01020304050607080

1 2 3

% A

GL


0

500100015002000250030003500

1 2 3

Car

oten

óide

s (p

pm)


Figura 53 – Avaliação de ácidos graxos livres e carotenóides durante o pós-processamento do óleos bruto e

refinado de buriti, onde (1) representa a finalização do processo enzimático; (2), a separação das fases orgânica e aquosa e (3), a desacidificação com etanol em 4 extrações sucessivas

4.4.2.2) Saponificação A saponificação foi realizada com soluções aquosas e alcoólicas 0,5 M de NaOH. A

saponificação aquosa não obteve separação de fases em nenhum dos dois óleos de buriti,

gerando apenas sabão. A saponificação alcoólica só obteve separação de fases com o óleo

refinado de buriti, já que o óleo bruto se tornou uma fase homogênea com a soda alcoólica.

A saponificação alcoólica foi realizada por 2 vezes sucessivas no óleo refinado,

removendo mais de 90% dos ácidos graxos livres, e também 35% dos carotenóides presentes,

além da diminuição de 63% do volume da fase rica em carotenóides. Apesar desses fatores,

esta fase ainda manteve 1085 ppm de carotenóides com uma grande alteração no seu perfil

(Figura 54), se aproximando muito do perfil de carotenóides encontrado no óleo bruto, com

69% de β-caroteno e 5% de apocarotenóides.

Figura 54 – Perfil de carotenóides do óleo refinado após desacidificação com soda alcoólica

82

4.4.2.3) Winterização A winterização foi realizada apenas no óleo bruto, pois no óleo refinado de buriti não

ocorreu a formação de nenhum precipitado ao se resfriar a fase orgânica.

Após a winterização do óleo bruto, foram obtidas 2 fases: a primeira sólida com 43%

de ácidos graxos livres e 3186 ppm de carotenóides, enquanto a outra líquida obtendo 26% de

ácidos graxos livres e 3910 ppm de carotenóides.

83

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÃO • A caracterização do óleo bruto e refinado de buriti se mostrou coerente com os dados

referenciados na literatura. A presença de apocarotenóides em quantidades elevadas no

óleo refinado de buriti confirma que o processo de refino promove a degradação de

carotenóides e a diminuição do seu valor nutricional.

• A pré-avaliação do processo enzimático determinou os intervalos de alguns parâmetros

para o planejamento experimental, como temperatura (25 a 45°C), relação óleo/água (1/1 a

3/1) e atividade enzimática (1 a 50U) em um volume de mistura reacional de 8 mL. Além

disso, determinaram-se o tempo reacional (4 h), as lipases a serem utilizadas (lipase de

Yarrowia lipolytica, Lipozyme TL IM e CALB L) e o uso da alumina em concentração de

10% p/v como aditivo para aumentar a hidrólise enzimática dos óleos bruto e refinado de

buriti.

• O planejamento experimental composto central determinou que tanto para hidrólise do

óleo bruto como do óleo refinado de buriti a Lipozyme TL IM foi a enzima que gerou

melhor rendimento em ácidos graxos livres, com pequenas perdas em carotenóides. Mas

como os modelos obtidos neste planejamento obtiveram baixo ajuste aos dados

experimentais, e também devido à atividade enzimática se demonstrar estatisticamente

significativa, foram realizadas etapas adicionais de otimização para avaliação da influência

de outras quantidades de Lipozyme TL IM, tempo reacional e agitação sobre a hidrólise.

Com isso, concluiu-se que as condições ótimas para a hidrólise enzimática dos óleo de

buriti são: bruto - 25U de atividade enzimática, 2,33 de relação óleo/água e 31,2°C de

temperatura e refinado - 35U de atividade enzimática, 1,8 de relação óleo/água e 45°C de

temperatura, mantendo o tempo reacional em 4 horas e alterando a velocidade de agitação

para 300 rpm.

84

• Dos métodos de desacidificação realizados, a utilização de solução etanólica 0,5M NaOH

sobre a fase orgânica do óleo refinado de buriti removeu 90% dos ácidos graxos livres

presentes, além dos apocarotenóides, permitindo um perfil de carotenóides próximo ao do

óleo bruto de buriti.

• Já para o óleo bruto de buriti, a combinação dos métodos de winterização e partição com

etanol parece ser a melhor alternativa para a desacidificação, pois a winterização promove

uma grande concentração de carotenóides e o etanol remove gradualmente os ácidos

graxos livres.

85

CAPÍTULO 6 – SUGESTÕES • No caso do óleo refinado de buriti, poder-se-ia testar a remoção dos apocarotenóides por

processos com membranas, antes mesmo de se realizar a hidrólise enzimática.

• O óleo de palma também poderia ser utilizado como matéria-prima para obtenção de β-

caroteno através de hidrólise enzimática.

• A adição de óleo vegetal em matrizes vegetais ricas em β-caroteno, como a cenoura e a

batata-doce; em licopeno, como o tomate e a melancia, ou ainda em xantofilas de interesse

comercial, caso de luteína e zeaxantina para a extração dos carotenóides, seguida de uma

posterior hidrólise enzimática do óleo vegetal poderia ser uma alternativa interessante, a

ser investigada.

• Novas opções de processo, como: a combinação de duas lipases distintas, sendo que uma

delas com maior atuação em faixa mais ácida de pH; outros emulsificantes; outros

adsorventes; maiores velocidades de agitação; e outras lipases, sendo estas originadas de

microrganismos diferentes deveriam ser testadas visando o aumento no rendimento da

hidrólise.

• Outros métodos de desacidificação poderiam ser testados como a extração supercrítica, a

extração por solventes utilizando outros álcoois de cadeia curta (metanol, propanol e

butanol) puros, ou com concentrações variadas de água.

• Diferentes concentrações de NaOH poderiam ser testadas para verificar a quantidade

mínima de base para a remoção de ácidos graxos livres e apocarotenóides.

• A possibilidade de integrar os métodos de winterização e extração com etanol para

aumentar a eficiência do processo na remoção dos ácidos graxos livres e na concentração

de β-caroteno do óleo bruto de buriti também poderia ser verificada.

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• Métodos mais focados na complexação ou na encapsulamento dos carotenóides, invés da

remoção dos ácidos graxos, poderiam ser testados como a utilização de ciclodextrinas e

uréia.

• A presença dos outros insaponificáveis (fitoesteróis e tocoferóis) durante o processamento

enzimático e desacidificação, para verificar seu aproveitamento futuro, deveria ser

analisada.

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100

GLOSSÁRIO Cloroplasto: é uma organela presente nas células das plantas e algas, rico em clorofila,

responsável pela sua cor verde, e onde a fotossíntese é realizada. Cromoplasto: é uma organela presente nas células das plantas e algas, onde ocorre a

biossíntese de pigmentos. Distribuição t de Student: é uma distribuição de probabilidades referente a inferências de

médias de populações normalmente distribuídas, sendo a base para o popular teste t de Student onde se avalia a significância estatística da diferença entre 2 médias amostrais, e também os intervalos de confiança da diferença entre 2 médias populacionais (Morettin & Bussab, 2002).

Endosperma: é um tecido vegetal, que se encontra nas sementes de muitas angiospermas e

acumula reservas nutritivas, como amido, proteínas e óleo, utilizadas pelo embrião durante seu desenvolvimento.

Fitoesteróis: alcoóis cristalinos, neutros e de alto ponto de fusão, sendo que os principais são

β-sitosterol, campesterol e estigmasterol (figura 55, Moreau et al, 2002).

Figura 55 – Fitoesteróis

Log P: logaritmo do coeficiente de partição da substância de um sistema padrão bifásico 1-

octanol/água. Quanto maior o log P, mais apolar é o solvente ou a mistura (Mojaat et al, 2007).

Mecanismo Ping-Pong Bi Bi: mecanismo cinético de reações com múltiplos produtos e

substratos catalisadas por lipases, onde E é enzima; Es, éster; Al, álcool; Ac, ácido; W, água; F, enzima em outro estado conformacional (Cunha, 2007)

Pericarpo: é o tecido do fruto que envolve e protege a semente nas angiospermas, incluindo

três camadas: epicarpo (mais externa), mesocarpo (intermediária) e endocarpo (mais interna).

Retinóides: derivados de síntese de vitamina A, dentre eles retinal (figura 56), retinol e

tretinoína (Rucker et al, 2001).

101

Figura 56 – Retinal

Significância estatística: é a probabilidade máxima de se rejeitar acidentalmente uma

hipótese nula (a ser testada) verdadeira. Spray-drying: é um método em que o material a ser seco passa por um tubo até um vaso

vertical e cilindrico, onde é pulverizado na forma de pequena gotas (diâmetro em torno de 2 mm), e geralmente na direção contrária é alimentado uma grande vazão de ar ou vapor quente com energia suficiente para completa vaporização do líquido, em menos de 30 s (Perry & Green, 1999).

Terebintina: é o destilado obtido de resina de pinheiros, sendo geralmente composto de

terpenos, principalmnete de α-pineno e β-pineno. Tococromanóis: consistem principalmente de tocoferóis (α, β, δ, γ) e tocotrienóis (α, β, δ,

γ), consistindo de um anel cromano e uma longa cadeia saturada fitil no caso de tocoferóis, enquanto os tocotrienóis têm uma cadeia com insaturações. Os quatro isômeros (α, β, δ, γ) diferem apenas no número e na posição dos grupos metila (figura 57, Güçlü-Üstündag & Temelli, 2004).

α- R1 = CH3, R2 = CH3

β- R1 = H, R2 = CH3

γ- R1 = CH3, R2 = H

δ- R1 = H, R2 = H

Figura 57 - Tococromanóis: (A) Tocoferóis, (B) Tocotrienóis Torularodina: um dos carotenóides produzidos pela levedura Rhodotorula glutinis, sendo

um derivado carboxilado do toruleno (Figura 58).

Figura 58 – Toruleno (R = CH3) e Torularodina (R = COOH)

Xeroftalmia: é uma doença caracterizada pela não produção de lágrimas e por dificuldades

de visão, principalmente durante a noite.

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APÊNDICE

Cinética de hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde os

tubos estão na seguinte seqüência temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h

Cinética de hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde

os tubos estão na seguinte seqüência temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h

(a) (b)

Antes (a) e depois (b) da winterização

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