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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA HELDER VERAS RIBEIRO FILHO EFEITOS CARDIORRESPIRATÓRIOS DO β-CITRONELOL: ENVOLVIMENTO DE FIBRAS AFERENTES VAGAIS E AÇÃO DIRETA EM MÚSCULOS LISO E CARDÍACO FORTALEZA 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
HELDER VERAS RIBEIRO FILHO
EFEITOS CARDIORRESPIRATÓRIOS DO β-CITRONELOL:
ENVOLVIMENTO DE FIBRAS AFERENTES VAGAIS E AÇÃO DIRETA EM
MÚSCULOS LISO E CARDÍACO
FORTALEZA
2015
1
HELDER VERAS RIBEIRO FILHO
EFEITOS CARDIORRESPIRATÓRIOS DO β-CITRONELOL:
ENVOLVIMENTO DE FIBRAS AFERENTES VAGAIS E AÇÃO DIRETA EM
MÚSCULOS LISO E CARDÍACO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de pós-graduação em
Farmacologia da Faculdade de Medicina
da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do Título
de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas
Magalhães
FORTALEZA
2015
1
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
R369e Ribeiro Filho, Helder Veras. Efeitos cardiorrespiratórios do β-citronelol: envolvimento de fibras aferentes vagais e
ação direta em músculos liso e cardíaco/ Helder Veras Ribeiro Filho. – 2015.
79 f.: il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina.
Programa de Pós-graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2015.
Área de concentração: Farmacologia.
Orientação: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães.
1. Citronellol. 2. Vagus Nerves. 3. Hipotensão. 4. Bradicardia. 5. Apneia. I. Título.
CDD 615.1
2
HELDER VERAS RIBEIRO FILHO
EFEITOS CARDIORRESPIRATÓRIOS DO β-CITRONELOL:
ENVOLVIMENTO DE FIBRAS AFERENTES VAGAIS E AÇÃO DIRETA EM
MÚSCULOS LISO E CARDÍACO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de pós-graduação em
Farmacologia da Faculdade de Medicina
da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do Título
de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas
Magalhães
Aprovada em ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
___________________________________________
Prof. Dr. Nilbeto Robson Falcão do Nascimento
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
___________________________________________
Prof. Dr. Mohammed Saad Lahlou
Universidade Federal do Ceará (UFC)
3
RESUMO
β-Citronelol é um monoterpeno encontrado no óleo essencial de diversas plantas
aromáticas utilizadas na medicina popular para tratar hipertensão, como a Cymbopogon
citratus. O β-citronelol possui propriedades hipotensoras e vasorrelaxantes, porém seu
mecanismo ainda não está claro. Portanto, o presente estudo foi realizado para abordar
essa questão em ratos normotensos. Para os experimentos in vivo, ratos Wistar macho
foram submetidos a cateterização da artéria e veia femoral esquerda para registro da
pressão arterial média e para administração de substâncias, respectivamente. Eletrodos
permitiram o registro da frequência cardíaca e certos grupos de animais foram
traqueostomizados para análise da frequência respiratória. Para os experimentos in vitro,
os átrios direito e esquerdo, e anéis de artéria mesentérica foram suspensos em cubas
para órgãos isolados sob condições fisiológicas. Em ratos anestesiados com uretana,
injeções intravenosas (i.v.) de β-citronelol (5 e 10 mg/kg) causaram hipotensão,
bradicardia e apneia em duas fases (fase 1 e fase 2), assim como em animais acordados
(5, 10 e 20 mg/kg). A fase 1 dessa tríade (1 – 2 s de latência), foi abolida pela
vagotomia bilateral (BV), pelo tratamento perineural com capsaicina (TP) ou pelo pré-
tratamento com metilatropina (MA, i.v.), assim como pela injeção do β-citronelol dentro
do ventrículo esquerdo, mas manteve-se inalterada pelo pré-tratamento i.v. com
capsazepina, ondansetrona, suramina ou HC-030031. A fase 2 tardia de bradicardia foi
também reduzida pela BV, TP ou MA, enquanto que a apneia de fase 2 foi abolida
apenas pela suramina. Em preparações atriais, o β-citronelol induziu efeito cronotrópico
e inotrópico negativos, os quais não parecem estar envolvidos com receptores
muscarínicos ou adrenérgicos, ou alterações no influxo de cálcio. Em anéis de artéria
mesentérica, com e sem endotélio, o β-citronelol relaxou totalmente pré-contrações de
fenilefrina com equiparável potência. Esses resultados revelam que a fase 1 de efeitos
do β-citronelol origina-se através de um reflexo vago-vagal resultante da estimulação de
aferências pulmonares vagais, que parecem não envolver receptores TRPV1, TRPA1, 5-
HT3 ou P2X. A fase 2 de hipotensão e bradicardia parece resultar de uma ação de
vasodilatação direta e de um efeito cardíaco depressor, respectivamente. Além disso,
receptores P2X parecem estar envolvidos na mediação da resposta de fase 2 de apneia
induzida por esse monoterpeno acíclico.
Palavras-chave: β-Citronelol. Reflexo vago-vagal. Fibras sensoriais pulmonares C.
4
ABSTRACT
Cardiorespiratory effects of β-citronellol: involvement of vagal afferent fibers and
direct actions on cardiac and smooth muscles.
β-Citronellol is a monoterpene found in the essential oil of various aromatic plants used
in folk medicine to treat hypertension such as Cymbopogon citratus. β-Citronellol
possesses hypotensive and vasorelaxant properties, but the mechanism of such effects
remains unclear. Therefore, the present study was undertaken to address this issue in
normotensive rats. For in vivo experiments, male Wistar rats were subjected to
catheterization of the left femoral artery and vein for mean arterial pressure monitoring
and drug injection, respectively. Electrodes allowed heart rate recordings and some
groups of rats were tracheostomized for respiratory rate analysis. For in
vitro experiments, right and left atria, and mesenteric artery rings were suspended in
organ baths at physiological conditions. In urethane-anesthetized rats, intravenous (i.v.)
injections of β-citronellol (5 and 10 mg/kg) caused biphasic (phase 1 and phase 2)
hypotension, bradycardia and apnea responses. Biphasic responses was observed also
following i.v. injection of β-citronellol (5, 10 and 20 mg/kg) in unanesthetized rats.
Phase 1 of this triad (onset time of 1-2 s) was abolished by bilateral vagotomy (BV),
perineural treatment with capsaicin (PNT) or pretreatment with methylatropine (MA,
i.v.), but remained unaltered by i.v. pretreatment with capsazepine, ondansetron,
suramin or HC-030031. Phase 1 responses was absent when β-citronellol was injected
into the left ventricle. The delayed phase 2 of bradycardia was also partially reduced by
BV, PNT or MA while the apnea component of this phase 2 was only abolished by
suramin. In atrial preparations, β-citronellol induced chronotropic and inotropic
negative responses, an effect that was related to neither muscarinic and adrenergic
receptor activation nor to altered calcium influx. In both endothelium-intact and
denuded mesenteric artery rings, β-citronellol fully relaxed phenylephrine-induced
contractions in a concentration-dependent manner and with equal potency. These
findings reveal that the effects evoked by β-citronellol induced vago-vagal reflex due to
stimulation of vagal pulmonary afferents, an effect that seems not involving TRPV1,
TRPA1, 5-HT3, or P2X receptors. Phase 2 hypotensive and bradycardiac responses to β-
citronellol appears resulting from a direct vasodilatory effect upon vascular smooth
muscle and cardiac depressor action, respectively. Furthermore, P2X receptors seem to
be involved in the mediation of phase 2 apneic response to this acyclic monoterpene.
Keywords: β-Citronellol. Vago-vagal reflex. Pulmonary sensory C-fibers.
5
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Fátima Maria Barros Veras e Helder Veras Ribeiro que me deram a
oportunidade da formação acadêmica. Agradeço ainda por todos os ensinamentos de
vida e pela confiança;
Ao Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães por me orientar cientificamente e
pessoalmente durante todos os anos de iniciação científica e de mestrado, agradeço
ainda pela grande paciência e confiança;
Aos Profs. Drs. Rodrigo Siqueira Bezerra de Siqueira e Mohammed Saad Lahlou, que
muito colaboraram para meu desenvolvimento acadêmico e, sempre solícitos,
colaboraram profundamente para o desenvolvimento e conclusão da presente
dissertação;
Ao Prof. Dr. Armênio Aguiar dos Santos, tecnicamente por permitir a realização de
grande parte dos experimentos em seu laboratório de pesquisa e por ter sido de
fundamental importância ao me fornecer a oportunidade de novos projetos;
Ao Prof. Dr. Diego Veras Wilke, membro da banca de qualificação, pelas sugestões de
melhoria da dissertação;
Ao Prof. Dr. Jairo Diniz Filho por pacientemente ter me apresentado ao universo das
metodologias in silico, com as quais prontamente me identifiquei e as quais escolhi para
trabalhar durante os próximos anos;
Ao Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso (LAFARMULI), que é minha
segunda casa há alguns anos, e aos seus membros, em especial Aclerton Pinheiro
Pereira, Alfredo Augusto Vasconcelos da Silva, Daniel Maia Nogueira de Oliveira,
Francisco José Batista, Kalinne Kelly Lima Gadelha, Larisse Tavares Lucetti, Patrícia
da Fonseca Magalhães, Teresinha da Silva Brito e Thiago Brasileiro Vasconcelos, com
os quais convivi a maior parte dos meus dias, pela ajuda técnica nos experimentos, pela
colaboração na minha formação acadêmica, pelos ensinamentos de vida, pela paciência
e por terem transformado o laboratório em um ambiente prazeroso de se trabalhar.
6
Aos membros do Laboratório Escola Prof. Luiz Capelo (LELC), onde realizei a maior
parte dos experimentos, em especial à Camila Meirelles Souza Silva pelos ensinamentos
técnicos e pela ajuda fundamental para realização dos experimentos;
Aos Profs. do Departamento de Fisiologia e Farmacologia e aos funcionários pela
dedicação e contribuição na minha formação acadêmica;
Aos colegas de pós-graduação em Farmacologia pelo companheirismo;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
apoio financeiro;
A todos meus amigos e familiares que muito me apoiaram e motivaram durante os anos
de mestrado.
Muito obrigado!
7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Estrutura química do β-citronelol...............................................................12
Figura 2 – Comparação estrutural do β-citronelol com outros compostos ativadores de
reflexos vago-vagais.....................................................................................................17
Figura 3 – Modelo esquemático de sistema para registro in vivo de parâmetros
cardiovasculares e respiratórios....................................................................................28
Figura 4 – Esquema dos protocolos experimentais realizados in vivo........................31
Figura 5 – Modelo esquemático do sistema de contratilidade para órgãos isolados..35
Figura 6 – Traçados típicos das variações PA e FC em animais acordados submetidos a
doses crescentes de β-citronelol...................................................................................39
Figura 7 – Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração
i.v. de β-citronelol em animais acordados ...................................................................40
Figura 8 - Traçados típicos das variações de PA, FC e VR em animais anestesiados
submetidos a doses crescentes de β-citronelol.............................................................42
Figura 9 – Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração
i.v. de β-citronelol em animais anestesiados................................................................43
Figura 10 – Curso temporal das alterações cardiorrespiratórias induzidas pela
administração i.v. de 10 mg/kg de β-citronelol em animais anestesiados...................45
Figura 11 – Traçados típicos dos efeitos do β-citronelol em animais bivagotomizados e
submetidos a tratamento perineural com capsaicina....................................................47
Figura 12 – Gráficos das reduções máximas da PAM e FC de fase 1 ou fase 2
produzida pelo β-citronelol em animais bigavotomizados, após tratamento perineural
com capsaicina ou após tratamento com metilatropina. ..............................................48
Figura 13 – Traçados típicos do efeito do β-citronelol no volume respiratório em
animais anestesiados.....................................................................................................50
Figura 14 – Traçados típicos comparativos da administração de β-citronelol pela via
intravenosa e pela via intraventricular..........................................................................53
Figura 15 – Gráficos comparativos dos efeitos do β-citronelol pela via intravenosa e
pela via intraventricular................................................................................................54
Figura 16 – Traçado típico do efeito do β-citronelol em átrio isolado........................56
Figura 17 – Efeito cronotrópico e inotrópico do β-citronelol na presença ou na ausência
de atropina....................................................................................................................57
8
Figura 18 – Efeito do pré-tratamento com β-citronelol na curva concentração-efeito ao
isoproterenol...................................................................................................................58
Figura 19 - Efeito do pré-tratamento com β-citronelol na curva concentração-efeito ao
CaCl2...............................................................................................................................59
Figura 20 – Curva concentração-efeito ao β-citronelol em preparações de arterial
mesentérica com ou sem endotélio pré-contraídas com fenilefrina ...............................60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Efeito do tratamento com antagonistas de receptores TRPV1, 5-HT3, P2X e
TRPA1 nas respostas cardiorespiratórias induzidas pelo β-citronelol............................51
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BV Bivagotomia
CEUA Cômite de Ético no Uso de Animais
CPZ Capsazepina
DMSO Dimetilsulfóxido
ECG Eletrocardiograma
EPM Erro padrão da média
F1 Fase 1
F2 Fase 2
FC Frequência cardíaca
FR Frequência respiratória
i.p. intraperitonial
i.v. intravenoso
i.v.t. intraventricular
MA Metilatropina
NA Núcleo Ambíguo
NTS Núcleo do trato solitário
OND Ondansetrona
PA Pressão arterial
PAM Pressão arterial média
SUR Suramina
TP Tratamento perineural com capsaicina
TRPA1 Receptor de potencial transiente anquirina do tipo 1
TRPV1 Receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1
VR Volume respiratório
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 12
1.1 Aspectos fitoquímicos do β-citronelol ................................................................. 12
1.2 A utilização dos óleos essenciais constituídos de β-citronelol e seu potencial
bioativo ...................................................................................................................... 13
1.3 Efeitos cardiovasculares de óleos essenciais e seus constituintes terpênicos ..... 14
1.4 Relação estrutural do β-citronelol com outros compostos ativadores de reflexos
vago-vagais ................................................................................................................ 16
1.5 A regulação reflexa da pressão arterial .............................................................. 17
2 JUSTIFICATIVA................................................................................................... 22
3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 23
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 24
4.1 Animais ................................................................................................................ 24
4.2 Soluções e drogas ................................................................................................. 24
4.3 Experimentos in vivo ........................................................................................... 25
4.3.1 Procedimento de cateterização ........................................................................ 25
4.3.2 Implantação de fios para registro de Eletrocardiograma ............................... 26
4.3.3 Registro de pressão arterial média, frequênca cardíaca e frequência
respiratória ................................................................................................................ 26
4.3.4 Protocolos experimentais in vivo ..................................................................... 29
4.4 Experimentos in vitro .......................................................................................... 33
4.4.1 Preparações de músculo liso e cardíaco ........................................................... 33
4.4.2 Protocolos experimentais ................................................................................. 34
4.5 Análise estatística dos dados ............................................................................... 36
5 RESULTADOS ...................................................................................................... 37
5.1 O β-citronelol induz resposta hipotensora e bradicardizante bifásicas em ratos
acordados .................................................................................................................. 37
5.2 O β-citronelol induz hipotensão, bradicardia e apneia de duas fases em ratos
anestesiados ............................................................................................................... 41
5.3 O β-citronelol induz efeitos temporalmente comparáveis a respostas reflexas . 44
11
5.4 Os efeitos imediatos de fase 1 induzidos pelo β-citronelol dependem das fibras
vagais e de mecanismo colinérgico ........................................................................... 46
5.5 O efeitos elicitados pelo β-citronelol não são originado pela ativação de
receptores classicamente conhecidos ........................................................................ 51
5.6 A administração intraventricular do β-citronelol indica que o reflexo vago-
vagal é originado nos pulmões .................................................................................. 52
5.7 No coração, o β-citronelol induz efeito cronotrópico e inotrópico negativo. ..... 55
5.8 Na artéria mesentérica, o β-citronelol produz relaxamento da musculatura lisa
................................................................................................................................... 60
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 61
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 67
REFERÊNCIAS.............................................................................................................68
APÊNDICE A – Comparação do efeito na PAM e FC induzido por duas doses
sequenciais (intervalo de 10 minutos) de β-citronelol (10 mg/kg) ........................... 76
APÊNDICE B – Efeito dos tratamentos na PAM e FC ........................................ 76
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos fitoquímicos do β-citronelol
O β-Citronelol (beta-Citronelol, 3,7-Dimetil-6-octen-1-ol, CAS no. 106-22-9), de
peso molecular 156,27 g/mol (C10H20O), é um monoterpeno, sendo estruturalmente
formado por duas unidades isoprênicas com cinco carbonos cada, com cadeia acíclica e
função álcool (Figura 1). O β-citronelol existe na forma de dois enantiômeros, o (+)-
citronelol característico da espécie Eucalyptus citriodora e o (-)-citronelol encontrado
em óleos essenciais de rosas. Porém, a forma racêmica, (±)-citronelol, é a forma mais
frequentemente encontrada (BAKKALI et al., 2008).
Figura 1 - Estrutura química do β-citronelol.
Fonte: SEBASTIÃO et al., 2011.
O β-citronelol é, portanto, uma substância de ocorrência natural, constituinte de
óleos essenciais produzidos por plantas aromáticas sob forma de um metabólito
secundário. Os óleos essenciais são misturas complexas que podem conter cerca de 20 a
60 componentes em diferentes concentrações, sendo os compostos da classe dos
monoterpenos, como por exemplo o β-citronelol, os mais representativos, constituindo
90% da composição desses óleos (BAKKALI et al., 2008).
13
1.2 A utilização dos óleos essenciais constituídos de β-citronelol e seu potencial
bioativo
Certas plantas que produzem o β-citronelol em seu óleo essencial são utilizadas
por seu aroma ou mesmo para fins ornamentais, como a Rosa damascena Mill. (BABU
et al., 2002), estando presente como ingrediente na formulação de diversas fragâncias na
indústria cosmética (BUCLEY, 2007; BELSITO et al., 2008). O β-citronelol faz parte
da composição de um extenso grupo de alimentos e produtos aromáticos, o que o torna
uma substância de potencial capacidade de exposição a população. O β-citronelol foi
detectado, por exemplo, na ordem de ppm (partes por milhão) em suco de laranja,
cerveja, chá preto, entre outros (De VINCENZI et al., 1987; FEMA, 1997). Na década
de 80, um estudo conduzido pelo National Institute for Occupational Safety estimou que
em um período de 2 anos 163.706 trabalhadores norte americanos em 62 industrias
foram expostos ao β-citronelol no ambiente de trabalho (NLM, 1997).
Adicionalmente a esse uso diverso dos óleos essenciais que contêm o β-
citronelol e do próprio como constituinte isolado, seu uso terapêutico também é
relatado. O capim citronela (Cymbopogon winterianus Jowitt) e a Erva-cidreira-de-
arbusto (Lippia Alba (Mill) N. E. Brown), por exemplo, são plantas medicinais cujas
folhas são utilizadas popularmente em municípios brasileiros no combate à febre, gripe,
tosse (GHEDINI et al., 2002) e asma (BARBOSA et al., 2007). As folhas de
Cymbopogon citratus, que também possui o β-citronelol como um de seus constituíntes,
são utilizadas popularmente por seu efeito anti-hipertensivo (CARBAJAL et al., 1989).
Ademais, seu constituinte majoritário e quimicamente relacionado ao β-citronelol, o
citral, já foi investigado experimentalmente por produzir efeitos vasorrelaxantes
(CHITRA et al., 2012).
Como composto isolado, em experimentos utilizando animais de laboratório, o
β-citronelol mostrou possuir atividade antinociceptiva e anti-inflamatória in vivo e in
vitro em roedores (SU et al., 2010; BRITO et al., 2012; 2013), atividade antifúngica in
vitro (PEREIRA et al., 2015) e efeitos antiespasmódicos em preparações de íleo
isoladas de ratos (SADRAEI et al., 2013), assim como atividade anticonvulsivante em
roedores (SOUSA et al., 2006).
14
1.3 Efeitos cardiovasculares de óleos essenciais e seus constituintes terpênicos
Diversos óleos essenciais constituídos de terpenos tiveram seus efeitos
cardiovasculares determinados experimentalmente através de sua administração por via
intravenosa (i.v.) em ratos normotensos.
Estudos prévios de nossa equipe mostraram que o óleo essencial do Croton
nepetaefolius (OECN) (LAHLOU et al., 1999), da Mentha x villosa (OEMV)
(LAHLOU et al., 2001), do Ocimum gratissimum (OEOG) (LAHLOU et al., 2004), da
Alpinia zerumbet (OEAZ) (LAHLOU et al., 2002) e da Aniba canelilla bark (OEAC)
(LAHLOU et al., 2005) induziram uma redução dose-dependente da pressão arterial
média (PAM) e da freqüência cardíaca (FC) em ratos normotensos. Efeitos similares
foram observados após injeção i.v. dos principais constituintes desses óleos, tais como
1,8-cineol (LAHLOU et al., 2002), metil-eugenol (LAHLOU et al., 2004a), eugenol
(LAHLOU et al., 2004b), óxido de piperitenona (LAHLOU et al., 2001) e terpinen-4-ol
(LAHLOU et al., 2002), sugerindo que os efeitos cardiovasculares dos óleos estudados
podem ser parcialmente atribuídos as ações do(s) seu(s) respectivo(s) principal(ais)
constituinte(s). Uma série de argumentos sugere que o efeito hipotensor desses óleos
essenciais, assim como de seus principais constituintes resulta, em grande parte, de uma
ação vasodilatadora direta na musculatura lisa vascular enquanto a bradicardia é
dependente da integridade do sistema nervoso autônomo (LAHLOU et al., 1999; 2001;
2005).
Entretanto, a administração i.v. do óleo essencial do Croton zehntneri Pax et
Hoffm (De SIQUEIRA et al., 2006), rico em anetol (42%) e estragol (46%), induz
efeitos hipotensores e bradicardizantes principalmente de origem reflexa (reflexo vago-
vagal) através da ativação de receptores TRPV1 localizados nas terminações nervosas
de fibras sensoriais vagais.
De Menezes e colaboradores (2010) estudaram os efeitos cardiovasculares do
óleo essencial de Cymbopogon winterianus, composto de monoterpenos tais como o
citronelal, geraniol e β-citronelol (RODRIGUES et al., 2013), em ratos normotensos
acordados. A administração por via i.v. do óleo provocou efeito hipotensor associado a
taquicardia, porém, na maior dose administrada (20 mg/kg), produziu uma imediata e
intensa bradicardia antes do efeito taquicardizante. O óleo essencial não induziu
bradicardia em animais submetidos a bivagotomia, sendo sugerido pelos autores que o
15
efeito é mediado por fibras vagais. Por outro lado, a hipotensão induzida pelo óleo em
doses menores que 20 mg/kg foi atribuída a um efeito vasorrelaxante direto
comprovado em preparações isoladas de artéria mesentérica de forma independente do
endotélio. Portanto, o óleo de Cymbopogon winterianus foi capaz de induzir respostas
cardiovasculares mediadas por fibras nervosas vagais e através de mecanismos diretos
na musculatura lisa de vasos.
O óleo essencial da Aniba rosaeodora Ducke var. amazônica (Lauraceae), rico
no monoterpeno linalol, também demonstrou ter efeitos cardiovasculares. De Siqueira e
colaboradores (2014) demostraram que, quando administrado por via i.v. em ratos
normotensos, o óleo induziu uma imediata hipotensão e bradicardia (denominada como
fase 1) seguida por uma mais tardia hipotensão e bradicardia (fase 2). A primeira fase de
eventos demonstrou ser dependente da estimulação de fibras aferentes vagais, de forma
semelhante a dose de 20 mg/kg do óleo comentado anteriormente. Em de preparações
de artéria mesentérica, o óleo foi capaz de produzir vasorrelaxamento, sendo portanto
esse efeito direto o provável indutor da fase 2 de resposta hipotensora.
Certos óleos essenciais, além de induzir efeitos diretos na musculatura lisa
vascular, produzem alterações diretas em músculo cardíaco. O Eucaliptol (SOARES et
al., 2005), por exemplo, mostrou ter efeito cardiodepressor direto em músculos
papilares ventriculares esquerdos através do bloqueio de canais para cálcio, impedindo
assim o influxo desse íon.
Os efeitos cardiovasculares agudos do β-citronelol, foram estudados por Bastos e
colaboradores (2010), que demonstraram que a administração i.v. de β-citronelol em
ratos normotensos acordados induziu respostas hipotensoras dose-dependentes
associadas a taquicardia. Além dos efeitos observados in vivo, foi mostrada também a
capacidade do β-citronelol em provocar relaxamento em preparações de artéria
mesentérica de ratos.
A administração por via i.v. do monoterpeno carvacrol em ratos acordados
(DANTAS et al., 2015), por sua vez, produziu hipotensão relacionada provavelmente a
seu efeito vasorrelaxante direto na musculatura lisa. Em preparações atriais isoladas, o
carvacrol induziu redução da frequência de contrações, sendo esse efeito relacionado a
bradicardia associada a hipotensão observada in vivo. Outro monoterpeno, o eugenol
(DAMIANI et al., 2004) também foi capaz de produzir efeitos diretos na musculatura
16
cardíaca. A adição desse monoterpeno em cubas para órgãos isolados contendo
músculos papilares ventriculares esquerdos induziu um inotrópico negativo através de
bloqueio do influxo de cálcio.
1.4 Relação estrutural do β-citronelol com compostos ativadores de reflexos vago-
vagais
O β-citronelol, como um representante da classe dos monoterpenos, apresenta
semelhança estrutural com outros monoterpenos como o linalol e o citral (Figura 2). O
linalol, conforme já mencionado, produz efeitos cardiovasculares de hipotensão e
bradicardia, sendo parte de seus efeitos mediados por respostas vagais. Esses efeitos
cardiovasculares são caracteristicamente semelhantes aos induzidos pela administração
i.v. de capsaicina, agonista do receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1
(TRPV1). A capsaicina, cuja cadeia alifática é semelhante a estrutura do β-citronelol
(Figura 2), é uma ferramenta bastante utilizada para explorar a função de neurônios
sensoriais uma vez que ativa neurônios aferentes vagais do tipo C, distribuídos
sistemicamente e encontrados no coração e na camada adventícia de muitos vasos
sanguíneos (BARJA et al., 1983; WHARTON et al., 1986). Segundo Rubino e
Burnstock (1996), várias evidências indicam que os nervos sensoriais contribuem para o
controle da função cardíaca e da regulação do tônus vascular. A administração i.v. de
capsaicina em ratos normotensos resulta em um efeito trifásico na PA e bifásico na FC
(DONNERER E LEMBECK, 1982). O primeiro desses efeitos é uma hipotensão
imediata associada com bradicardia (fase A) mediadas por reflexo vago-vagal, seguida
por um aumento levemente superior aos níveis basais da PA (efeito B) produzido por
vasoconstrição direta, concluindo com uma queda gradual na pressão sanguínea
associada a uma secundária e lenta bradicardia (efeito C) também mediadas por fibras
sensoriais vagais.
Stotz e colaboradores (2008) demonstraram que o citral, outro monoterpeno
estruturalmente relacionado ao β-citronelol, ativa receptores TRPV1. Além disso, o
próprio β-citronelol foi descrito por Ohkawara e colaboradores (2010) por ser capaz de
ativar esses receptores em celular humanas isoladas, alem de ser descrito também por
ativar receptores TRPA1 (receptor de potencial transiente anquirina do tipo 1), sendo
esse o mecanismo de seu efeito repelentes contra insetos (KWON et al., 2010).
17
Os receptores TRPV1 e TRPA1, assim como receptores serotoninérgicos 5-HT3
e purinérgicos P2X, estão presentes nas terminações nervosas de fibras aferentes vagais
e, uma vez ativados, induzem respostas cardiorrespiratórias depressoras mediadas pelo
reflexo vago-vagal (LUPINSKI et al., 2011).
Figura 2 – Comparação estrutural do β-citronelol com outros compostos
ativadores de reflexos vago-vagais
Fonte: National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database;
CIDs=8842, 638011, 6549 e 2548, respectivamente.
1.5 A regulação reflexa da pressão arterial
A pressão arterial é dependente do débito cardíaco e da resistência periférica
total, sendo o primeiro componente, por sua vez, definido como produto da FC pelo
volume de efejão sistólico. Assim, em certas situações em que se faz necessário uma
imediata elevação da pressão arterial, o aumento da frequência cardíaca, e ou o aumento
na resistência periférica total contribui para tal elevação. A pressão arterial é, dessa
forma, regulada ou comumente dita autorregulada, momento a momento por diversos
sistemas e componentes do corpo humano, como o sistema nervoso autônomo, com o
objetivo de proporcionar um aporte sanguíneo necessário à atividade dos tecidos e um
meio de remover metabólitos ou distribuir substâncias endógenas para outros territórios,
18
obedecendo a um limite pressórico que não cause danos aos vasos que distribuem o
sangue ou tecidos que o recebam (GUYTON, 1977).
Os sistemas de controle e regulação da pressão arterial atuam em tempos de ação
diferentes sendo, por exemplo, a regulação através da via renal de efeito mais lento uma
vez que atua principalmente por mecanismos de controle do volume sanguíneo. A
regulação através de vias neurais, por sua vez constitui-se como uma via mais rápida,
sendo ambas essenciais para a manutenção da pressão arterial em níveis adequados
frente às súbitas alterações que pode sofrer por imposição da demanda metabólica
tecidual, por exemplo, causadas pela atividade física (GUYTON, 1977). Diferentes
sistemas corporais estão envolvidos no controle da pressão arterial de forma
integralizada. O ritmo respiratório, por exemplo, influencia diretamente a frequência
cardíaca (ritmo sinusal). Vários reflexos neurais que comumente produzem redução na
frequência cardíaca, apenas são operados na fase de expiração na qual existe aumento
da atividade do nervo vago. Por outro lado, a inspiração, na qual a atividade vagal está
diminuída, pode contribuir para o aumento na frequência cardíaca (OPENSHAW,
1979).
Diversos mecanismos neuro-humorais trabalham momento a momento captando
informações sensoriais periféricas e gerando respostas reflexas rápidas e efetivas para a
manutenção da pressão arterial, como por exemplo, os baroreflexos, quimiorreflexos e
reflexos cardiopulmonares. Os baroreflexos são constituídos por baroreceptores
arteriais, cardiopulmonares e receptores localizados na adventícia do seio carotídeo e
arco aórtico sensíveis a estímulos mecânicos. A tensão desses sensores ativa potenciais
de ação que trafegam com destino a um centro integrador localizado no bulbo
denominado de núcleo do trato solitário (NTS), onde a partir daí neurônios de segunda
ordem podem fazer sinapses com neurônios simpáticos inibitórios e em paralelo através
de outros neurônios de segunda ordem manter influência excitatória sobre neurônios
parassimpáticos. A regulação da pressão arterial pelo baroreflexo é então feita através
da modulação das eferências autonômicas em nível de coração, rins e leitos vasculares
(ALBAGHDADI, 2007).
Outro reflexo de relevante importância na regulação da pressão arterial é o
quimiorreflexo. Variações na pressão parcial dos gases O2 e CO2 ou variações no pH
sanguíneo estimulam células sensíveis a esse tipo de estímulo químico localizadas nos
19
corpos aórticos e carotídeos que levam essas informações através de fibras aferentes até
o NTS. A partir daí, vias neurais provocam alterações na atividade eferente simpática e
vagal para o coração, vasos sanguíneos e pulmões (MARSHALL, 1987).
Além da pressão parcial de gases e do pH, agentes químicos podem estimular
componentes reflexos que regulam a pressão arterial, como os reflexos
cardiopulmonares vago-vagais. Os reflexos vago-vagais são caracterizados por
possuírem componentes aferentes e eferentes vagais. O nervo vago é o décimo nervo
craniano, caracterizado por uma trajetória que provê uma extensa inervação da região
do pescoço, peito e abdômen, e regula, além das funções cardiovasculares, a respiração,
resposta imune e o sistema digestório (CHANG et al., 2015). Esse nervo contém tanto
fibras aferentes sensíveis a estímulos mecânicos quanto populações de fibras sensíveis a
estímulos químicos e, quando estimuladas por esses últimos, as aferências podem dar
inicio ao quimiorreflexo (VERBERNE et al., 2002).
A função primária das fibras aferentes é captar informações sensoriais de regiões
periféricas do organismo e levá-las até centros integradores como o NTS.
Quimiorreflexos pulmonares, por exemplo, podem se originar através ativação de fibras
sensoriais vagais não mielinizadas do tipo C que proveem a captação sensorial de todos
os níveis do trato respiratório com suas terminações nervosas localizadas na
proximidade dos capilares pulmonares e no epitélio das vias aéreas de condução
(KWONG et al., 1998). Esse tipo de fibras corresponde a aproximadamente 75% das
fibras vagais (JAMMES et al., 1982), possuem pequeno diâmetro e baixa velocidade de
condução, e respondem a estímulos nocivos mecânicos, térmicos e químicos. (HOLZER
et al., 1991). Quando estimuladas por substâncias químicas inaladas ou injetadas na
circulação sanguínea, podem produzir como consequência fenômenos reflexos de
hipotensão e bradicardia (LEE e YU, 2014).
Assim como nos outros tipos de reflexos comentados, as informações sensoriais
que trafegam através das fibras vagais são integradas no NTS, sendo, portanto esse
núcleo o responsável por receber informações aferentes primárias de uma extensa
variedade de receptores localizados perifericamente e importantes para o controle do
sistema nervoso autônomo (KALIA et al., 1980). Posteriormente, neurônios de segunda
ou terceira ordem projetam-se para o núcleo ambíguo (NA) e núcleo dorsal motor do
nervo vago (CAMPAGNOLE-SANTOS et al., 2001). Assim, os neurônios pré-
20
ganglionares vagais localizam-se nesses dois grandes núcleos bulbares e suas fibras pós-
ganglionares, no coração, inervam principalmente o nodo sinusal, a musculatura atrial e
o nodo atrioventricular, estimulando a liberação de acetilcolina que ativa os receptores
muscarínicos M2. A estimulação de receptores muscarínicos M2 leva então a redução da
FC (GUYENET, 2006).
Um típico reflexo vago-vagal com efeitos cardiovasculares e respiratórios e que
tem por base a ativação de fibras aferentes vagais do tipo C é o reflexo de Bezold-
Jarisch, descrito primeiramente pelo fisiologista Albert Von Bezold em 1867, e
aprimorada a compreensão pelo farmacologista Adolf Jarisch na década de 40. O
reflexo de Bezold-Jarisch é um quimiorreflexo iniciado pela ativação de receptores
cardiopulmonares que se conectam com o sistema nervoso central através do nervo
vago, sendo esse, portanto seu componente aferente (DAWES e WIDDICOMBE,
1953). A saída cardíaca, conforme descrita por Frink e James (1971) é através de um
estreito funil envolvendo a artéria coronária principal esquerda. O componente eferente
desse reflexo é também o vago, sendo essa via colaboradora tanto no aumento da
atividade vagal cardíaca quanto na depressão da atividade simpática (DAWES e
COMROE, 1954). O reflexo de Bezold-Jarisch produz uma imediata hipotensão,
bradicardia e apneia, podendo ser ativado de forma experimental por agonistas de
receptores TRPV1 como a capsaicina (HOLZER, 1991), agonistas 5-HT3
serotoninérgicos como a fenilbiguanida (LUPINSKI et al., 2011), agonistas de
receptores purinérgicos P2X como o αβ-metileno ATP (MCQUEEN et al., 1998),
alcalóides do Veratrum (DAWES, 1947), nicotina e bradicinina (EVANS et al., 1991),
adenosina e íons H+ (SCHULTZ, 2001).
Apesar de serem relatados muitas vezes como fenômenos meramente curiosos,
como é o caso do reflexo de Bezold-Jarisch, estudos apontam a importância
fisiopatológica desses reflexos cardiopulmonares. Aviado e Aviado (2001) mostraram,
por exemplo, a importância desses reflexos como uma forma de defesa contra a inalação
de substâncias químicas nocivas, servindo como mecanismo de defesa para a proteção
de órgãos vitais. Clinicamente, o próprio reflexo de Bezold-Jarisch tem sido alvo de
estudos, mostrando ser importante para a patofisiologia de muitas desordens
cardiovasculares. Pacientes com infarto agudo do miocárdio apresentam evidências de
bradicardia e hipotensão durante o ataque (ALLYN, 1983), sendo sugerido por
Robertson e Robertson (1981) um possível efeito atenuante do reflexo de Bezold-
21
Jarisch contra os efeitos deletérios produzidos pela isquemia cardíaca. Além disso, as
interações entre esse e outros reflexos, como o baroreflexo, são descritos como
importantes mecanismos na regulação da pressão arterial sanguínea em condições
fisiológicas e patofisiológicas (MANCIA et al., 1976; DONALD et al., 1978;
VASQUEZ et al. 1997). Dessa forma, esses fatos demonstram a importância do estudo
dos reflexos cardiopulmonares e a modulação química desses fenômenos pode propiciar
uma nova abordagem dessas condições patofisiológicas.
22
2 JUSTIFICATIVA
O β-citronelol é um monoterpeno acíclico constituinte de óleos essenciais
utilizados na medicina popular para diversos fins. Além disso, por sua utilização como
fragrância está presente na forma de ingrediente em muitos produtos cosméticos e
aromatizantes. Apesar de ampla utilização do β-citronelol e de óleos essenciais que o
contêm, seus efeitos cardiovasculares e respiratórios agudos foram pouco investigados.
Estudos já mostraram efeitos vasorrelaxantes in vitro e efeitos hipotensores e
bradicardizantes in vivo produzidos pelo β-citronelol, demonstrando sua capacidade em
alterar de maneira aguda a pressão arterial e a frequência cardíaca, assim como provocar
alterações diretas na contratilidade da musculatura lisa vascular. Semelhanças
estruturais com outros compostos que induzem efeitos cardiorrespiratórios conhecidos e
mais amplamente estudados direcionaram nossos estudos para a hipótese do β-citronelol
de induzir reflexos vago-vagais com repercussões cardiovasculares e respiratórias.
Dessa forma, nos propusemos a estudar mais detalhadamente o efeitos do β-citronelol
sobre parâmetros cardiovasculares e respiratórios de ratos, especialmente os
mecanismos que envolvem a participação de reflexos vago-vagais.
23
3 OBJETIVOS
Objetivo geral
Estudar os efeitos cardiovasculares e respiratórios agudos do β-citronelol.
Objetivos específicos
Avaliar o efeito de doses crescentes de β-citronelol na pressão arterial média,
frequência cardíaca e respiratória, em animais normotensos anestesiados ou
acordados
Investigar o papel das fibras vagais nos efeitos induzidos pelo β-citronelol;
Localizar o sítio anatômico, pulmonar ou cardíaco, de origem dos efeitos
induzidos pelo β-citronelol;
Avaliar o envolvimento os receptores TRPV1, TRPA1, 5-HT3 ou P2X na
mediação dos efeitos do β-citronelol;
Determinar os efeitos do β-citronelol diretamente em preparações de átrio e de
artéria mesentérica.
24
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais
Ratos Wistar machos, pesando entre 280 e 320 g, provenientes do biotério
central da Universidade Federal do Ceará (UFC), foram mantidos sob condição padrão
de temperatura constante (22 ± 2°C) em gaiolas de polipropileno (410 x 320 x 160 mm)
em grupos de seis animais sob ciclo de doze horas de luz e doze horas de escuridão,
com livre acesso a comida e água. Durante o alojamento, a manipulação dos animais
consistiu apenas de procedimentos necessários para troca de ração, água, limpeza e
higienização das gaiolas. Os animais foram tratados com respeito às normas de cuidado
e bem estar animal preconizadas pela Lei 11.794 de 2008 e pela Diretriz Brasileira para
o Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos (DBCA) e todos
os procedimentos aprovados pelo comitê de ética no uso de animais (CEUA) da
Universidade Federal do Ceará (número 37/2014).
4.2 Soluções e drogas
Para os experimentos in vivo, o β-Citronelol ((±)-β-citronelol adquirido da
Sigma, St. Louis, Estados Unidos) foi dissolvido em Tween 80 na concentração de 2 %
em salina isotônica estéril, utilizando processo de sonicação para completa
homogeneização da preparação. Todas as drogas administradas pela via i.v. foram
injetadas em bolus em um volume de 0,1 mL, seguido de um flush de 0,2 mL com
salina fisiológica. Estudos prévios mostraram que as injeções i.v. desse veículo (100
μL) não tiveram efeitos significantes no estado basal da pressão arterial média (PAM)
ou frequência cardíaca (FC; LAHLOU et al., 2003, 2004 e 2005), sendo o procedimento
confirmado também experimentalmente no presente trabalho. Os anestésicos 2,2,2-
tribromoetanol e uretana foram adquiridos da Sigma (St. Louis, Estados Unidos) e o
pentobarbital de sódio adquirido da Cristalia (São Paulo, Brasil), sendo todos
administrados nos animais pela via intraperitonial (i.p.). A capsaicina, na concentração
de 250 μg/mL, usada no tratamento perineural (TP) dos vagos foi preparada em solução
de 1 % de Tween 80, 1 % de etanol e 98 % de salina fisiológica. A capsazepina foi
primeiro solubilizada em dimetilsulfóxido (DMSO, adquirido da Sigma, St. Louis,
25
Estados Unidos) a 0,1 mol/L (aproximadamente 37 mg/mL) e posteriormente diluída
com salina contendo 10 % de Tween 80 e 10 % de etanol até uma concentração final de
1 mg/mL, como previamente descrito por De Siqueira e colaboradores (2010). De forma
semelhante, o HC-030031 foi primeiramente solubilizado em DMSO e posteriormente
diluído com salina contendo 10 % de Tween 80 e 10 % de etanol. O cloridrato de
ondansetrona (OND), a suramina sódica (SUR) e o brometo de metilatropina (MA), por
sua vez, foram solubilizados diretamente em salina fisiológica. As doses dos agonistas e
antagonistas foram escolhidas de acordo com as recomendadas na literatura e os
antagonistas utilizados nos protocolos foram testados experimentalmente com seus
respectivos agonistas, conforme descrito na seção “Protocolos experimentais in vivo”,
para avaliação de sua eficácia na dose utilizada.
Para os experimentos in vitro, o β-citronelol foi dissolvido em uma solução de 2
% de Tween 80 em água destilada. O isoproterenol, a atropina e a fenilefrina foram
dissolvidos diretamente em água destilada e sonicados antes de seu uso. Todas as
substâncias utilizadas nos experimentos in vitro foram adquiridas da Sigma (St. Louis,
Estados Unidos) e foram preparadas imediatamente antes de cada experimento. O meio
fisiológico utilizado para manutenção da viabilidade dos tecidos nas cubas para órgãos
isolados foi a solução fisiológica modificada de Krebs-Henseleit, com a seguinte
composição de sais (em mM): 118,0 NaCl; 5 KCl; 1,18 NaH2PO4; 1,18 MgSO4•7H2O;
2,50 CaCl2; glicose e 11,1 NaHCO3). O sais, todos de grau analítico, foram adquiridos
da Sigma (St. Louis, Estados Unidos) ou Merck (Darmstadt, Alemanha).
4.3 Experimentos in vivo
4.3.1 Procedimento de cateterização
Para o procedimento de cateterização, foi confeccionado um cateter (figura 3A)
formado pela fusão de um cateter de polietileno PE-10 (Intramedic™, Becton
Dickinson, NJ, Estados Unidos) de tamanho aproximado de 3,5 cm, que é inserido
dentro do vaso sanguíneo, com um cateter de polietileno PE-50 (Intramedic™, Becton
Dickinson, NJ, Estados Unidos) de tamanho aproximado de 12 cm, que é exteriorizado
do animal. Antes da realização do procedimento cirúrgico de cateterização,
independente do grupo de animais a serem utilizados, os mesmos foram anestesiados
com injeção de tribromoetanol (250 mg/kg). Durante o procedimento cirúrgico, um
26
cateter foi implantado na aorta abdominal através da artéria femoral esquerda com o
objetivo de registrar a pressão arterial média (PAM) e outro cateter implantado na veia
cava inferior através da veia femoral esquerda para administração das drogas por via i.v.
(Figura 3B). Ambos os cateteres implantados foram previamente preenchidos com
solução de heparina em salina (3 %) para prevenir a coagulação sanguínea em seu
interior e, logo em seguida, percorreram o tecido subcutâneo até serem exteriorizados na
região dorsal do animal, a fim de evitar com que esse último deteriore-os no período de
recuperação. Um grupo separado de animais, utilizado para os procedimentos
experimentais nos quais foi administrado β-citronelol por via intraventricular (i.v.t.), foi
submetido a outro procedimento de cateterização no momento do experimento. Um
cateter de Teflon foi inserido na artéria carótida direita e avançado retrogradamente até
estar posicionado dentro do ventrículo esquerdo. A posição do cateter foi primeiramente
indicada pela característica do traçado de pressão pulsátil registrada dentro do
ventrículo e confirmada por exame post mortem.
4.3.2 Implantação de fios para registro de Eletrocardiograma
Três fios de aço inoxidável (D.E. 0,203 mm, Stainless Steel Teflon Coated, A.M.
System®) foram fixados no tecido subcutâneo dos animais, bilateralmente em nível de
músculo peitoral e em nível de músculo quadríceps esquerdo, para registro do
eletrocardiograma (ECG). Depois de fixados, todos os fios foram exteriorizados através
do mesmo orifício feito para exteriorização dos cateteres vasculares (Figura 3B).
Após implantação dos fios de ECG e após procedimento de cateterização, os
animais foram alojados individualmente em caixas de polipropileno com livre acesso a
água e comida para recuperação de 24 h antes de qualquer experimento.
4.3.3 Registro de pressão arterial média, frequênca cardíaca e frequência
respiratória
Após recuperação, no momento dos experimentos, os animais pertencentes ao
grupo experimental de animais anestesiados foram anestesiados com uretana (0,8 g/kg).
Um grupo separado de animais usados nos protocolos experimentais com o antagonista
de receptores purinérgicos, suramina, foi anestesiado com pentobarbital (50 mg/kg,
27
i.p.). O uso do pentobarbital nesse protocolo foi devido ao fato do agonista α,β-
metilenoATP não induzir por completo seus efeitos cardiorespiratórios em animais
anestesiados com uretana, conforme relatado por MCQUEEN e colaboradores (1998).
Para a análise da frequência respiratória (FR), uma pequena cânula (sonda uretral nº 4,
de aproximadamente 3 cm e com um orifício na região oposta a extremidade que foi
inserida na traqueia, orifício pelo qual o animal poderá respirar espontaneamente, na
posição supinada) foi inserida na traqueia e conectada a um módulo de espirometria (
ML-14, ADInstruments®). Os fios de aço inoxidável implantados nos animais foram
conectados a um módulo Bio Amp (ML-132, ADInstruments®) para registro de ECG, o
qual foi derivado para se obter FC. O cateter inserido na artéria femoral foi conectado a
um transdutor de pressão (ML-0699, ADInstruments®) previamente calibrado com a
ajuda de uma coluna de mercúrio. O transdutor, por sua vez, foi acoplado a um módulo
de pressão sanguínea (MLT-112, ADInstruments®). Todos os módulos foram
conectados a um sistema de aquisição de dados (Powerlab 8/5p, ADInstruments®)
(Figura 3B).
28
Figura 3 – Modelo esquemático de sistema para registro in vivo de parâmetros
cardiovasculares e respiratórios
A
B
Fonte: Autoria própria. Em A, imagem do cateter confeccionado pela fusão de um cateter PE-
10, segmento que vai de 0 a aproximadamente 4 cm, com um cateter PE-50, segmento que vai do centímetro 4 ao 16 da régua. A porção final do cateter é conectada a um segmento de aço de
calibre semelhante para evitar o escoamento da solução de salina do interior do cateter. Em B,
imagem do sistema para registro de alterações de pressão arterial, frequência cardíaca e frequência respiratória. A imagem mostra um animal anestesiado traqueostomizado com a
cânula respiratória, os fios de ECG e o cateter inserido na artéria femoral conectados ao sistema
de aquisição de dados. O cateter inserido na veia femoral está conectado a seringa para
administração das substâncias em estudo. A imagem ilustra também um animal acordado com os cateteres e fios de ECG exteriorizados por sua região dorsal.
29
4.3.4 Protocolos experimentais in vivo
Com o objetivo de investigar os efeitos cardiovasculares e respiratórios do β-
citronelol, foram realizados protocolos experimentais in vivo, com registro de PAM, FC
e FR, em animais acordados e em animais anestesiados.
Antes de se iniciar qualquer experimento cardiovascular in vivo, um período de
15 a 20 minutos foi concedido para se obter um traçado estável de PAM, FC e FR. Uma
vez atingida a estabilização dos parâmetros, os protocolos experimentais foram
iniciados, sendo os mesmos divididos nas seguintes 5 séries, esquematizadas na figura
4:
Série 1: Essa série de experimentos foi realizada para estabelecer a relação dose-efeito
do β-citronelol nos parâmetros de PAM, FC e FR (esse parâmetro foi registrado apenas
em animais anestesiados). Cada animal, anestesiado (n = 6) ou acordado (n = 5),
recebeu doses crescentes de β-citronelol (1, 5, 10 e 20 mg/kg, i.v.) e as alterações no
decorrer do tempo foram registradas. O intervalo entre as doses foi de 10 minutos para o
reestabelecimento dos parâmetros cardiorrespiratórios e para ser evitado o fenômeno de
taquifilaxia.
Série 2: Essa série de experimentos foi realizada para caracterizar o curso temporal dos
efeitos induzidos pelo β-citronelol. Doses isoladas de 10 mg/kg (n = 8) de β-citronelol,
dose submáxima, foram utilizadas e tanto o tempo de inicio para as alterações
cardiorrespiratórias quanto a duração dessas alterações foram mensuradas.
Série 3: Essa série de experimentos foi realizada para avaliar a participação do vago e
da via colinérgica eferente no efeito cardiorespiratório produzido pelo β-citronelol. Para
esse propósito foi realizada uma vagotomia bilateral cervical, ou seja, depois de
isolados, ambos os vagos foram cortados e 10 minutos após esse procedimento foi
administrada a dose de 10 mg/kg de β-citronelol (n = 5). Ainda para avaliar a
participação vagal, porém agora apenas a participação das fibras aferentes, foi utilizado
um método bem conhecido de tratamento perineural bilateral cervical do nervo vago
com capsaicina (Janscó & Such, 1983; Schelegle et al., 2000). O método consistiu no
isolamento de ambos os vagos cervicais e logo em seguida segmentos do nervo de 2 a 3
mm foram envoltos por um swab de algodão embebido com capsaicina (250 μg/mL),
sendo então os swabs removidos e a região irrigada com salina fisiológica. Esse
procedimento produz a dessensibilização apenas das fibras aferente vagais do tipo C,
30
impedindo o tráfego de informações por essas fibras. Após 20 minutos do tratamento
perineural com capsaicina, foi realizada a administração de 10 mg/kg de β-citronelol (n
= 4). A eficiência do tratamento foi comprovada pela administração por via i.v. de
capsaicina. Por fim, para avaliar a participação de receptores muscarínicos nos efeitos
induzidos pelo β-citronelol, animais acordados foram tratados com um antagonista
muscarínico que atua apenas perifericamente, não ultrapassando a barreira
hematoencefálica, a metilatropina na dose de 1 mg/kg. Após 5 minutos do tratamento,
foi realizada a administração de 10 mg/kg de β-citronelol (de SIQUEIRA et al., 2006; n
= 5).
Série 4: Essa série de experimentos foi realizada para determinar se os efeitos
produzidos pelo β-citronelol eram mediados pela ativação de receptores TRPV1
(receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1), 5-HT3 (receptor serotoninérgico),
P2X (receptor purinérgico) ou TRPA1 (receptor de potencial transiente anquirina do
tipo 1). Os animais foram tratados com administração intravenosa dos antagonistas
capsazepina (2 mg/kg, n = 4), ondansetrona (30 μg/kg, n = 5), suramina (2 mg/kg, n =
5) ou HC-030031 (2 mg/kg, n = 4) e após 40 segundos, 5 minutos, 40 segundos ou 2
minutos, respectivamente, foram submetidos a administração de 10 mg/kg de β-
citronelol. As doses e os intervalos de dose foram escolhidos baseados na literatura
(MALINOWSKA et al., 2001; BAGCHI & DESHPANDE, 1999; MCQUEEN et al.,
1988, De SIQUEIRA et al., 2014) e confirmados experimentalmente com seus
respectivos agonistas, capsaicina (1 μg/kg, n = 3), serotonina (10 μg/kg, n = 4) e α,β-
metilenoATP (100 μg/kg, n = 4).
Série 5: Essa série de experimentos foi realizada para determinar a localização dos
terminais das fibras aferentes do tipo C envolvidas na indução das respostas
cardiorespiratórias pelo β-citronelol, comparando para tal os efeitos da dose de 5 mg/kg
de β-citronelol injetada por via intravenosa e por via intraventricular (n = 5). O β-
citronelol injetado dentro do ventrículo esquerdo contorna a circulação pulmonar e
presumivelmente não tem acesso imediato as fibras pulmonares do tipo C.
31
Figura 4 – Esquema dos protocolos experimentais realizados in vivo
32
Fonte: Autoria própria. Os protocolos foram divididos didaticamente em 5 séries, sendo em cada série indicado se foram utilizados animais acordados ou anestesiados. As abreviações são
denominadas como: BCIT, β-citronelol; BV, bivagotomia; MA, metilatropina; CPZ,
capsazepina; OND, ondansentrona; SUR, suramina; IV, intravenoso; IVT, intraventricular;
PAM, pressão arterial média; FC, frequência cardíaca e FR, frequência respiratória. Todos os animais anestesiados foram anestesiados com uretana, com exceção dos animais utilizados para
os protocolos com suramina, que foram anestesiados com pentobarbital.
33
4.4 Experimentos in vitro
Para os experimentos in vitro foram utilizados dois tipos de tecidos
cardiovasculares que estão envolvidos diretamente com a regulação da pressão arterial e
que ao sofrerem ação direta de certas substâncias podem levar a alterações dos
parâmetros de PAM e FC. Para tal, foram utilizados segmentos de artéria mesentérica
superior, vaso de resistência responsável pela irrigação sanguínea de parte do pâncreas,
parte do intestino delgado e grosso, e foram utilizados também o átrio direito e
esquerdo, sendo no átrio direito onde se insere o nodo sinusal, responsável em primeira
instância pela frequência cardíaca.
4.4.1 Preparações de músculo liso e cardíaco
Os ratos Wistar foram anestesiados via i.p. com tribromoetanol (250 mg/kg) e,
sem seguida, sacrificados por exsanguinação. A artéria mesentérica superior e os átrios
direito e esquerdo foram rapidamente removidos do animal e imersos em placa de Petri
contendo solução de fisiológica modificada de Krebs-Henseleit sob oxigenação para
remoção de gordura e tecido conjuntivo aderido. Esse processo para ambos os átrios foi
realizado a temperatura de 4°C com o objetivo de reduzir a atividade metabólica do
tecido. A artéria mesentérica superior foi segmentada em pedaços de anéis de
aproximadamente 2 mm e por dentro do lúmen da cada anel foram passadas duas peças
triangulares de aço inoxidável (0,3 mm de diâmetro), ficando uma conectada a uma
haste fixa dentro da cuba para órgãos isolados e a outra peça conectada através de uma
linha ao transdutor de força (figura 5B). Diferentemente dos segmentos de artéria
mesentérica que foram posicionados de forma circular, as preparações atriais foram
posicionadas de forma longitudinal. Em cada extremidade atrial foram fixadas linhas,
sendo a linha de uma extremidade conectada a haste fixa dentro da cuba e a linha da
outra extremidade conectada ao transdutor de força. Para as preparações atriais
submetidas a estimulação elétrica, a haste que sustenta os tecidos tem características
especiais, sendo dotada de duas regiões circulares que criam um campo elétrico para
permitir a estimulação elétrica. Dessa forma, os tecidos submetidos a estimulação
ficaram posicionados entre as duas regiões circulares da haste.
Cada tecido foi então montado dentro de uma cuba de 5 mL contendo solução
fisiológica modificada de Krebs-Henseleit, a 37°C, constantemente aerada com mistura
de 5 % CO2 em O2 e com pH de 7,4. As preparações foram suspensas por um transdutor
34
de força (ML870B60/C-V, ADInstruments), o qual foi conectado a um sistema de
aquisição de dados ( Powerlab 8/30, ADInstruments), e alterações na tensão muscular
foram medidas isometricamente, sendo expressas em g (figura 5A). A tensão basal
aplicada as preparações, tanto artéria quanto átrio, foi de 0,5 g, sendo ao átrio direito
permitido seu batimento rítmico espontâneo e ao átrio esquerdo sua estimulação
artificial através de um estimulador LE 12406 (Panlab, Spain) com parâmetros de
estimulação de 5 Hz, 0,5 ms e 5 V.
Antes do inicio de qualquer experimento, os tecidos passaram por um período de
estabilização de 1 hora, com ajuste de tensão e troca de solução nutridora a cada 15
minutos. As preparações de artéria mesentérica, após o período de estabilização, foram
expostas a soluções despolarizantes de 60 mM de KCl até que fossem obtidas duas
contrações de mesma amplitude, configurando assim a viabilidade da preparação.
4.4.2 Protocolos experimentais
As preparações de artéria mesentérica, com ou sem endotélio, foram pré-
contraidas com fenilefrina (1μM) e concentrações cumulativas de β-citronelol (1 – 1000
μM, com intervalo de 10 minutos entre cada concentração, n = 6) foram aplicadas na
fase sustentada da pré-contração.
Em relação as preparações atriais, uma curva concentração-efeito ao β-citronelol
(0,1 – 1000 μM) foi construída para estabelecer seu efeito no comportamento cardíaco
inotrópico (átrio esquerdo, n = 6) e cronotrópico (átrio direito, n = 6). A mesma curva
foi produzida também na presença de atropina (1 ou 10 μM) para avaliar a participação
do componente muscarínico e curvas de concentração-efeito ao isoproterenol (0,01 nM
– 100 nM, n = 6) foram construídas na presença ou na ausência de 200 μM de β-
citronelol para caracterizar a participação do componente adrenérgico em seu efeito
cardíaco. Por fim, com o objetivo de estudar a dependência da concentração extracelular
de cálcio no efeito produzido pelo β-citronelol, curvas de concentração-efeito ao cálcio
(CaCl2; 3, 4 e 5 mM) (SOARES et al., 2005; WANG et al., 2004) foram produzidas na
ausência ou presença de 200 μM de β-citronelol (n = 6).
35
Figura 5 – Modelo esquemático do sistema de contratilidade para órgãos isolados
A
B
Fonte: Imagens cedidas e criadas no próprio laboratório no qual foram realizados os
experimentos pelo aluno de doutorado Francisco José Batista de Lima Júnior. Em A, figura
representativa do sistema de contratilidade. Os equipamentos que compõem o sistema foram numerados da seguinte forma: 1, transdutor de força; 2, cilindro de mistura carbogênica; 3,
sistema de aquisição de dados; 4, computador com software instalado; 5, visão da cuba para
órgãos isolados e sua interação com os outros equipamentos;.6, visão geral das cubas para
órgãos isolados em seus devidos suportes; 7, bomba de circulação térmica. Em B, imagem representativa e ampliada da cuba para órgãos isolados mostrando em 1, a recirculação de água
para manutenção da temperatura ideal, em 2 linha que conecta a peça de aço (6) com o
transdutor de força (3), em 4 o sistema para aeração da solução da cuba e em 5 o sistema para descarte da solução utilizada na cuba. Ao lado da cuba, demonstra-se a forma correta de acoplar
as peças de aço ao tecido circular.
36
4.5 Análise estatística dos dados
Para os dados in vivo, os resultados foram expressos como média ± EPM e n
representou o número de experimentos. Alterações máximas na PAM e na FC foram
expressas como o percentual de redução dos valores basais. Para os dados in vitro,
observaram-se as respostas de deflexão positiva ou negativa dos traçados basais antes da
adição de qualquer substância na preparação. Os valores de CI50 foram calculados pela
interpolação semi-logaritmica. A significância dos resultados (p < 0,05) foi realizada
pelo teste t de Student pareado ou não-pareado, teste U de Mann-Whitney e pela análise
de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguido pelo teste de múltipla comparação
de Holm-Sidak, quando apropriado. Todas as análises estatísticas foram feitas usando o
programa SigmaStat (Systat Software Inc., Estados Unidos).
37
5 RESULTADOS
5.1 O β-citronelol induz resposta hipotensora e bradicardizante bifásicas em ratos
acordados
Os efeitos cardiovasculares do β-citronelol foram primeiramente caracterizados
através de uma curva dose-resposta (1 – 20 mg/kg) avaliando-se os parâmetros de PAM
e FC em animais acordados e normotensos. Os valores médios basais de PAM e
frequência cardíaca foram 111,7 ± 6,9 mmHg e 450,98 ± 18,1 batimentos por minuto
(bpm), respectivamente ( dados agrupados de 10 ratos). Os traçados típicos de pressão
arterial e da frequência cardíaca derivada do ECG resultantes da administração
intravenosa das doses de 1, 5, 10 e 20 mg/kg de β-citronelol estão representados na
figura 6. A dose de 1 mg/kg de β-citronelol provocou uma resposta hipotensora
monofásica com redução de 20,2 ± 4,5 % da PAM basal (p < 0,05; teste t de Student
pareado) (Figura 6A), já as doses subsequentes produziram um comportamento
pressórico caracteristicamente diferente: observou-se uma queda imediata na PAM,
sendo denominada no presente trabalho como Fase 1 (F1), seguida por uma breve
tentativa de recuperação da pressão arterial para níveis basais com uma sequencial
hipotensão mais lenta e duradoura, denominada aqui como Fase 2 (F2).
A redução da PAM da F1 foi de 49,9 ± 3,8 %, 55,3 ± 5,4 % e 67,4 ± 3,2 %,
respectivamente, para as doses de 5, 10 e 20 mg/kg. Quando comparadas entre si a
diferença de efeito entre as doses foi estatisticamente significante apenas para a dose de
5 mg/kg em relação a de 20 mg/kg ( p < 0,05, ANOVA de uma via). Já a redução da
PAM da F2 foi de 20,2 ± 4,5 %, 42,9 ± 5,4 %, 59,8 ± 4,1 % e 72,6 ± 1,0 %,
respectivamente, para as doses de 1, 5, 10 e 20 mg/kg, demonstrando significativamente
a dependência de dose na F2 ( p < 0,05, ANOVA de uma via), conforme pode-se
observar na Figura 7A.
Em relação ao parâmetro de frequência cardíaca (Figura 6B), o β-citronelol
causou, de forma semelhante ao efeito na pressão arterial média, uma resposta de 2
fases: uma imediata bradicardia (F1), seguida de uma tentativa de resolução do efeito
com posterior bradicardia mais duradoura (F2), sendo essas duas fases observadas
apenas a partir da concentração de 5 mg/kg (Figura 6B). Assim como no efeito na PAM,
diferenças na magnitude dos efeitos bradicardizantes de F1 foram observadas apenas
entre a dose de 5 mg/kg (redução de 74,1 ± 4,5 %) e a dose de 20 mg/kg (redução de
38
89,3 ± 1,9) (p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak). A F2 da
bradicardia foi dependente da dose com reduções significativas da FC basal de 4,6 ± 2,6
%, 40,7 ± 8,6 %, 74,6 ± 5,3 % e 85,3 ± 4,7 %, respectivamente para as doses de 1, 5, 10
e 20 mg/kg (Figura 7B).
39 Figura 6 – Traçados típicos das variações de PA e FC em animais acordados submetidos a doses crescentes de β-citronelol
A
B
Traçados típicos das variações de pressão arterial (A) e de frequência cardíaca (B) mostrando o efeito hipotensor e bradicardizante do β-citronelol em animais
acordados. Cada traçado representa o efeito de uma dose de β-citronelol ( 1, 5, 10 ou 20 mg/kg) administrada por via intravenosa indicada pela seta
pontilhada, sendo construído em uma curva dose-resposta ao β-citronelol com intervalo de 10 minutos entre as doses administradas. A área cinza escuro do
traçado representa a F1 e a área cinza claro representa a F2. Percebe-se nos traçados que a F1 é gerada apenas a partir da dose de 5 mg/kg, sendo a dose de 1
mg/kg capaz de gerar apenas uma resposta monofásica de hipotensão sem bradicardia significativa.
40
Figura 7 – Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração
i.v. de β-citronelol em animais acordados
A
medias
medias
Col 49
medias
Col 60
medias
Col 71
0
20
40
60
80
100
*
#
Red
uçã
o n
a P
AM
(%
)
1 5 10
Dose (mg/kg)
20
F1 F2
B
0
20
40
60
80
100
*
#
Red
uçã
o n
a F
C (
%)
1 5 10
Dose (mg/kg)
20
F1 F2
Redução máxima da PAM (A, n = 5) e da FC (B, n = 5) resultante da administração
intravenosa de β-citronelol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) em ratos acordados. A F1 é
representada pelas colunas de cor preta, mostrando-se presente a partir da dose de 5
mg/kg ( #p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak), e a F2 é
representada pelas colunas de cor cinza, sendo a redução da PAM significante a partir
da dose de 1 mg/kg ( *p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-
Sidak) e a redução da FC significante a partir da dose de 5 mg/kg (*p < 0,05, ANOVA
de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak). Os dados são representados como média
± EPM e expressos como percentual de redução dos valores basais.
41
5.2. O β-citronelol induz hipotensão, bradicardia e apneia de duas fases em ratos
anestesiados
A administração de β-citronelol por via i.v. (1, 5 e 10 mg/kg) em ratos
anestesiados com uretana (0,8 g/kg) induziu os seguintes efeitos na PAM e FC: uma
resposta monofásica hipotensora e bradicardizante na dose de 1 mg/kg e a presença de 2
fases de hipotensão e de bradicardia , nas doses subsequentes de 5 e 10 mg/kg, como se
pode observar na figura 8. Os animais anestesiados com uretana apresentaram valores
médios basais de pressão arterial e frequência cardíaca de 93,5 ± 5,7 mmHg e 388,1 ±
12,6 batimentos por minuto (bpm), respectivamente (dados agrupados de 10 ratos).
Em relação a F1 da resposta hipotensora, o β-citronelol provocou reduções na
PAM de 39,2 ± 1,9 % e 47,0 ± 2,5 %, respectivamente para as doses de 5 e 10 mg/kg,
que foram significativamente diferentes entre si (p < 0,05, teste t de Student não-
pareado). Já em relação a F2 de resposta, o β-citronelol provocou reduções na PAM de
17,7 ± 4,7 %, 40,7 ± 2,8 % e 56,3 ± 5,4 %, significativamente diferentes entre si,
demonstrando caráter de resposta dependente de dose (Figura 9A).
A redução da FC (F1) foi de 80,4 ± 2,2 % e 75,4 ± 2,8 %, respectivamente, para
as de 5 e 10 mg/kg, não demonstrando efeito dependente de dose (p > 0,05,teste t de
Student não-pareado). Em relação a F2, o β-citronelol provocou reduções na FC de 18,3
± 8,1 %, 37,0 ± 5,6 % e 59,8 ± 4,4 %, nas doses de 1, 5 e 10 mg/kg, respectivamente
(Figura 9B).
Além dos efeitos cardiovasculares, as doses de 5 e 10 mg/kg de β-citronelol
provocaram alterações na FR. A dose de 5 mg/kg causou uma apneia que cursou com a
F1 de hipotensão e bradicardia, já a dose de 10 mg/kg levou a uma apneia em duas
fases, a primeira delas durante a F1 e a segunda durante a F2 de hipotensão e
bradicardia, como se pode observar na Figura 8C. O curso temporal dessas respostas
respiratórias foi avaliado através da dose de 10 mg/kg, como pode se observar na
próxima seção.
42
Figura 8 - Traçados típicos das variações de PA, FC e VR em animais anestesiados submetidos a doses crescentes de β-citronelol
A
B
C
Figura 8. Traçados típicos das variações de pressão arterial (A), frequência cardíaca (B) e volume respiratório (C) mostrando a hipotensão, bradicardia e apneia (doses de 5 e
10 mg/kg) produzida pelo Β-citronelol em animais anestesiados com uretana. Cada traçado representa o efeito de uma dose de β-citronelol (1, 5 e 10 mg/kg) administrada por
via intravenosa, sendo o intervalo de doses de 10 minutos. A área cinza escuro de cada traçado representa a fase 1 e a área cinza claro representa a fase 2. Pode-se observar
nos traçados (A) de pressão arterial que a fase 1 de resposta de hipotensora está presente apenas a partir da dose de 5 mg/kg, sendo o mesmo válido para os traçados de
frequência cardíaca (B). A apneia em duas fases é induzida apenas pela dose de 10 mg/kg. De forma diferente dos animais acordados, a dose de 1 mg/kg gera uma resposta
monofásica hipotensora de F2 estatisticamente significante.
43
Figura 9 – Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração
i.v. de β-citronelol em animais anestesiados
A
Red
uçã
o n
a P
AM
(%)
0
20
40
60
80
100
1 5 10
Dose (mg/kg)
*
#
F1 F2
B
Red
uçã
o n
a F
C (
%)
0
20
40
60
80
100
1 5 10
Dose (mg/kg)
*
#
F1 F2
Redução máxima da PAM (A, n = 6) e da FC (B, n = 6) resultante da administração intravenosa de β-citronelol (1, 5 e 10 mg/kg) em ratos anestesiados com uretana. A F1 é representada pelas
colunas de cor preta, mostrando-se presente a partir da dose de 5 mg/kg ( #p < 0,05, ANOVA de
uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak), e a F2 é representada pelas colunas de cor cinza, com redução significativa a partir da dose de 1 mg/kg ( *p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido
pelo teste de Holm-Sidak). Os dados são representados como média ± EPM e expressos como
percentual de redução dos valores basais.
44
5.3 O β-citronelol induz efeitos temporalmente comparáveis a respostas reflexas
O comportamento temporal do efeito hipotensor, bradicardizante e respiratório
induzido pelo β-citronelol foi caracterizado utilizando-se a dose de 10 mg/kg (n = 8,
Figura 10). É importante notar que quando duas doses sequenciais de 10 mg/kg de β-
citronelol foram injetadas em um mesmo animal, respeitando o intervalo de dose de 10
minutos, não houve diferença estatística na magnitude da hipotensão e da bradicardia
em ambas as fases (1 ou 2), como pode-se observar no Apêndice 1.
A imediata redução na FC produzida pelo β-citronelol ocorreu 1,6 ± 0,1 s após
sua administração intravenosa. Paralelamente a esse evento (1,9 ± 0,1 s ,p > 0,05, teste t
de Student não-pareado),ou seja, com o mesmo tempo de latência, o β-citronelol induziu
apneia. O evento seguinte observado foi a redução na PAM, 2,1 ± 0,1 s após a injeção
de β-citronelol. Esses eventos cardiovasculares e respiratórios de início imediato que
precederam uma resposta mais lenta e duradoura são os já denominados eventos de fase
1 (F1).
A segunda fase de eventos (F2) teve pico de efeito mais tardio, 7,5 ± 0,2 s e 5,2
± 0,5 s após administração de β-citronelol, respectivamente, para a resposta hipotensora
e bradicardizante e 4,7 ± 0,2 s para a resposta apnéica. O tempo de duração, ou seja, de
resolução dos efeitos cardiovasculares e respiratórios da F2 foi diferente para cada
parâmetro. A apneia foi o primeiro efeito induzido pelo β-citronelol a se resolver, em
7,5 ± 0,4 s após sua administração, seguida pela resolução da resposta bradicardizante
40,5 ± 2,9 s e por fim, pelo retorno da PAM aos seus níveis basais, com duração de 1,8
± 0,3 min (Figura 10).
45
Figura 10 – Curso temporal das alterações cardiorrespiratórias induzidas pela
administração i.v. de 10 mg/kg de β-citronelol em animais anestesiados
Traçados típicos das alterações de PAM, FC e FR induzidas pela administração intravenosa de
10 mg/kg de β-citronelol, mostrando temporalmente seus efeitos bifásicos. Os tempos são expressos como média ± EPM na unidade de tempo de segundos (s) ou minutos (min). O
primeiro intervalo de tempo foi calculado no momento da injeção de β-citronelol (indicado pela
seta) até o pico da alteração do parâmetro, o segundo foi calculado do momento da injeção de β-citronelol até o pico da alteração de F2 e o terceiro tempo calculado do momento da
administração até o completo retorno às condições basais. A pressão arterial (PA) foi expressa
em mmHg, a frequência cardíaca (FC) em bpm (batimentos por minuto) e o volume respiratório (VR) foi expresso em mL/s.
46
5.4 Os efeitos imediatos de fase 1 induzidos pelo β-citronelol dependem das fibras
vagais e de mecanismo colinérgico
A administração intravenosa de 10 mg/kg de β-citronelol em animais submetidos
a vagotomia bilateral em nível cervical foi incapaz de induzir a resposta hipotensora e
bradicardizante característica da F1, demonstrando apenas um comportamento
monofásico. De forma semelhante, o tratamento perineural do vago em nível cervical
com solução de capsaicina (250 μg/mL) e o tratamento i.v. com 1 mg/kg de
metilatropina aboliu a F1 de hipotensão e bradicardia evocada pelo β-citronelol (Figura
11).
Em relação a F2, como mostrado na figura 12D, a bivagotomia, o tratamento
perineural ou o tratamento com metilatropina reduziram de forma significante a
bradicardia provocada pelo β-citronelol para valores de 18,8 ± 3,2 % (*p < 0,05, test t
de Student pareado), 13,9 ± 2,0 % (#p < 0,05, test t de Student pareado) e 7,1 ± 1,5 %
(§p < 0,05, test t de Student pareado), respectivamente.
Ao contrário da interferência dos tratamentos mencionados acima na redução da
frequência cardíaca induzida pelo β-citronelol, os mesmos não tiveram a capacidade de
alterar a F2 da resposta hipotensora. Como se pode observar na Figura 12B, a
bivagotomia, o tratamento perineural ou o tratamento com metilatropina não foram
capazes de alterar significantemente a resposta hipotensora produzida pelo β-citronelol (
p > 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak). Convém notar que a
bivagotomia ou o tratamento perineural com capsaicina não alteraram de forma
significativa os níveis de PAM ou FC basais, já o tratamento com metilatropina elevou
os níveis basais da FC (Apêndice 2).
Em relação as alterações respiratórias causadas pelo β-citronelol, o
procedimento de bivagotomia aboliu a resposta apneica de F1, restando apenas a F2. Da
mesma forma, o tratamento perineural com capsaicina aboliu apenas a F1 de apneia
(Figura 13).
47
Figura 11 – Traçados típicos dos efeitos do β-citronelol em animais bivagotomizados ou submetidos a tratamento perineural com capsaicina
A
B
Traçados típicos mostrando o efeito da bivagotomia (BV) e do tratamento perineural com capsaicina (TP) no efeito hipotensor e bradicardizante induzido pela
dose de 10 mg/kg de β-citronelol. Todos os tratamentos foram capazes de abolir a resposta de F1, gerando uma queda monofásica da PAM e FC. O retângulo
mais escuro representa a F1 e o retângulo mais claro representa a F2.
48
Figura 12 – Gráficos das reduções máximas da PAM e FC de fase 1 ou fase 2
produzida pelo β-citronelol em animais bigavotomizados, após tratamento perineural
com capsaicina ou após tratamento com metilatropina.
A
Red
uçã
o d
a P
AM
(%
)
0
20
40
60
80
100
Antes do tratamento
Após o tratamento
FASE 1
BV MATP
B
Re
du
çã
o d
a M
AP
(%
)
0
20
40
60
80
100
FASE 2
Antes do tratamento
Após o tratamento
BV MATP
49
C
Re
du
çã
o d
a F
C (
%)
0
20
40
60
80
100
Antes do tratamento
Após o tratamento
BV MATP
FASE 1
D
Re
du
çã
o d
a F
C (
%)
0
20
40
60
80
100
* #§
FASE 2
Antes do tratamento
Após o tratamento
BV MATP
Reduções máximas da PAM (A e B) e FC (C e D) de Fase 1 ou 2 produzidas pela injeção
intravenosa de β-citronelol (10 mg/kg) na ausência (antes do tratamento; colunas brancas) ou
após os tratamentos (bivagotomia, BV; tratamento perineural com capsaicina, TP ou
metilatropina, MA). Os tratamentos aboliram a F1 de PAM e FC (A e C), porém não alteraram a
F2 de hipotensão (p > 0,05, teste t de Student pareado). Para a FC, os tratamentos reduziram
significativamente a bradicardia gerada pelo β-citronelol (*p < 0.05; #p < 0.05; § p < 0.05, teste
t de Student pareado).
50
Figura 13 – Traçados típicos do efeito do β-citronelol no volume respiratório de animais
anestesiados
Traçados típicos dos volumes respiratórios (em mL/s) em animais anestesiados, mostrando a
reposta bifásica de apneia (F1 e F2) provocada pelo β-citronelol. Controle representa o efeito do
β-citronelol na frequência respiratória sem qualquer tratamento ou procedimento cirúrgico em
duas diferentes doses (5 mg/kg, i.v. e 10 mg/kg, i.v.). Os outros traçados típicos representam o
efeito do β-citronelol após bivagotomia (BV), tratamento perineural com capsaicina (TP),
tratamento com suramina (SUR, animais anestesiados com pentobarbital), ou com a
administração de 5 mg/kg de β-citronelol diretamente no ventrículo esquerdo (IVT). As setas
pontilhadas indicam o momento da administração de β-citronelol.
51
5.5 Os efeitos elicitados pelo β-citronelol não são originados pela ativação de
receptores classicamente conhecidos
O tratamento prévio dos animais através da administração intravenosa de
capsazepina, ondansetrona, suramina ou HC-030031 não afetou nenhuma das fases (F1
ou F2) da resposta hipotensora ou bradicardizante induzidas pela dose de 10 mg/kg de
β-citronelol, como pode-se observar na tabela 1. A F1 de apneia, de forma semelhante,
também não foi alterada por nenhum dos tratamentos. Entretanto, o tratamento com
suramina foi capaz de abolir a segunda fase de apneia (Figura 13).
A capacidade das substâncias mencionadas acima em antagonizar os receptores
TRPV1, 5HT2, P2X , foi testada utilizando-se, respectivamente, os agonistas capsaicina
(1 μg/kg, n = 3), serotonina (10 μg/kg, n = 4) e α,β-metilenoadenosina 5´-trifosfato (100
μg/kg, n = 4). O tratamento prévio com capsazepina, ondansetrona, suramina foi capaz
de abolir a resposta de F1 induzida, respectivamente, pelos agonistas anteriormente
mencionados.
Tabela 1 – Efeito do tratamento com antagonistas de receptores TRPV1, 5-HT3, P2X e
TRPA1 nas respostas cardiorespiratórias induzidas pelo β-citronelol
ΔPAM (%) ΔFC (%)
β-Citronelol (10 mg/kg) F1 F2 F1 F2
Antes da Capsazepina
-47,7 ± 4,0
-50,1 ± 2,7
-76,4 ± 2,2
-43,4 ± 8,6
Após a Capsazepina -43,8 ± 5,8 -61,9 ± 3,2 -75,6 ± 3,5 -56,0 ± 3,4
Antes da Ondansetrona -50,3 ± 1,8 -65,3 ± 5,4 -64,7 ± 5,4 -58,3 ± 2,8
Após a Ondansetrona -43,9 ± 8,8 -70,1 ± 5,4 -73,3 ± 4,8 -60,9 ± 4,4
Antes da Suramina -45,2 ± 2,4 -55,1 ± 1,0 -77,5 ± 4,0 -55,6 ± 5,1
Após a Suramina -41,6 ± 0,7 -57,0 ± 1,7 -75,6 ± 2,1 -47,0 ± 2,3
Antes do HC-030031 -42,2 ± 4,5 -53,6 ± 1,6 -74,3 ± 1,7 -53,9 ± 2,3 Após o HC-030031 -35,4 ± 4,6 -52,2 ± 3,0 -78,7 ± 2,0 -58,5 ± 8,4
Reduções máximas na PAM e FC induzidas por injeções intravenosas de 10 mg/kg de β-
citronelol na ausência (antes) e na presença (após) de tratamentos com capsazepina (n = 4), ondansetrona (n = 5), suramina (n = 5) e HC-030031 (n = 5). As colunas F1 representam as
respostas de fase 1 e as colunas de F2, as de fase 2. Os quatro tratamentos realizados não
interferiram nas respostas de F1 ou F2 induzidas pelo β-citronelol ( p > 0,05, teste t de Student pareado).
52
5.6 A administração intraventricular do β-citronelol indica que o reflexo vago-
vagal é originado nos pulmões
A administração pela via intraventricular, diretamente no ventrículo esquerdo, da
dose de 5 mg/kg de β-citronelol produziu um efeito hipotensor e bradicardizante
monofásico, sendo a mesma incapaz de gerar uma resposta imediata de F1, como pode
se observar na Figura 14. Comparativamente, a mesma dose de 5 mg/kg de β-citronelol,
injetada por via intravenosa, foi capaz de induzir uma resposta bifásica de hipotensão e
bradicardia.
Em relação a F2, como apresentado na figura 15, o β-citronelol administrado por
via intraventricular induziu uma resposta hipotensora de magnitude semelhante
(redução de 47,3 ± 4,2% na PAM basal, p > 0,05, teste t de Student não-pareado) à
resposta hipotensora induzida pela administração pela via intravenosa. Por outro lado, a
redução na FC provocada pela injeção intraventricular de β-citronelol foi menor (14,8 ±
1,9%) em comparação com a administração por via intravenosa (36,9 ± 5,6%, p < 0,05,
teste t de Student não-pareado).
O tempo de latência para se alcançar o pico da hipotensão foi de 7,6 ± 1,0 s
quando o β-citronelol foi injetado por via intraventricular, valor não significativamente
diferente (p > 0,05, teste t de Student pareado) de 7,2 ± 1,1 s observado quando
administrado por via i.v. Por outro lado, a latência para o pico da resposta
bradicardizante foi 2,3 ± 0,2 s, latência menor (p < 0,05, teste t de Student pareado) do
que a observada pela administração i.v. do β-citronelol (5,6 ± 0,4 s).
Diferentemente do efeito induzido pela administração intravenosa, a injeção de
β-citronelol (5 mg/kg) dentro do ventrículo esquerdo não foi capaz de provocar nenhum
das fases da apneia, F1 ou F2, como pode-se observar na figura 13.
A dose de 10 mg/kg de β-citronelol também foi administrada diretamente no
ventrículo esquerdo (n = 3), porém todos os animais sofreram hipotensão severa e
morreram.
53
Figura 14 – Traçados típicos comparativos da administração de β-citronelol pela via
intravenosa e pela via intraventricular
A
B
Traçados típicos da pressão arterial (PA, em mmHg) e frequência cardíaca (FC, em bpm)
mostrando o efeito comparativo da administração da dose de 5 mg/kg de β-citronelol pela via intravenosa (traçados da coluna esquerda) e pela via intraventricular ( traçados da coluna
direita). A administração por via intravenosa produz um efeito bifásico,tanto na PA quanto na
FC, representado pelo plano de fundo cinza escuro (F1) e pelo plano de fundo cinza claro (F2). Já a administração da mesma dose de β-citronelol foi incapaz de produzir tal comportamento
bifásico.
54
Figura 15 – Gráficos comparativos dos efeitos do β-citronelol pela via intravenosa e
pela via intraventricular
A
Re
du
çã
o n
a P
AM
(%
)
0
20
40
60
80
100
Controle Intraventricular
-Citronelol (5 mg/kg)
B
Re
du
çã
o n
a F
C (
%)
0
20
40
60
80
100
*
Controle Intraventricular
-Citronelol (5 mg/kg)
Em A, reduções máximas na PAM (F2) induzidas pela dose de 5 mg/kg de β-citronelol por via
intravenosa (controle) ou pela via intraventricular, demonstrando que não há diferença estatística na F2 de hipotensão entre as duas vias de administração (p > 0,05, teste t de Student
pareado). Em B, reduções máximas na FC (F2) demonstrando que a bradicardia é reduzida
quando o β-citronelol é administrado pela via intravenosa (*p < 0,05, teste t de Student
pareado).
55
5.7 No coração, o β-citronelol induz efeito cronotrópico e inotrópico negativo.
Adições cumulativas de β-citronelol nas cubas de órgãos isolados (0,1 – 1000
μM) produziram redução na frequência de batimentos do átrio direito e redução na
amplitude de contração do átrio esquerdo, com efeitos reversíveis, como se pode
observar na Figura 16. O efeito cronotrópico negativo no átrio direito foi significante a
partir da concentração de 100 μM ( p < 0,05; ANOVA de uma via, seguido pelo teste de
Holm-Sidak) e a redução máxima na frequência dos batimentos foi de 45,3 ± 18,8% na
maior concentração utilizada (1000 μM). Em relação ao átrio esquerdo, o β-citronelol
reduziu significantemente a amplitude de contrações a partir da concentração de 1 μM
(10,7 ± 1,9 %; p < 0,05; ANOVA de uma via) e a redução máxima de amplitude foi de
44,6 ± 5,7 % na maior dose utilizada (1000 μM), como se pode observar no gráfico da
figura 17B. Esses efeitos cronotrópicos e inotrópicos negativos produzidos pelo β-
citronelol não foram modificados quando adicionou-se atropina previamente nas cubas,
na concentração de 1 ou 10 μM (p > 0,05; ANOVA de duas vias).
A estimulação β-adrenérgica através da adição cumulativa de isoproterenol nas
cubas (0,01 – 100 nM) produziu aumento na frequência de batimentos (Emax de 81,1 ±
12,9%) no átrio direito e aumento na amplitude de contração do átrio esquerdo (Emax
de 113,8 ± 16,5%). Como se pode observar nos gráficos A e B da figura 18, esses
efeitos induzidos pelo isoproterenol nos átrios não foram alterados em presença de 200
μM de β-citronelol (p > 0,05; ANOVA de duas vias).
A elevação na concentração extracelular de Ca2+
através de adições cumulativas
de CaCl2 (3, 4 e 5 mM) provocou um aumento na amplitude de contrações do átrio
esquerdo com efeito máximo de 49,3 ± 5,8%. A adição prévia de β-citronelol (200 μM
ou 600 μM) não foi capaz de alterar o efeito produzido por esse aumento de Ca2+
extracelular (p > 0,05; ANOVA de uma via, figura 19).
56
Figura 16 – Traçado típico do efeito do β-citronelol em átrio isolado
Traçado típico representando a curva concentração-efeito do β-citronelol (10 – 1000 μM) e seu
efeito sobre a contratilidade do átrio direito isolado. As setas verticais representam a adição de
cada concentração de β-citronelol e cada segmento de traçado foi colhido nos cinco segundos
anteriores a próxima concentração de β-citronelol. O intervalo de tempo entre as concentração
foi de cinco minutos, tempo suficiente para a completa estabilização da frequência e amplitude
de contrações.
57 Figura 17 – Efeito cronotrópico e inotrópico do β-citronelol na presença ou na ausência de
atropina
A
0,1 1 10 100 1000
0
20
40
60
80
100
120
140Em presença de 1 M de Atropina
Em presença de 10 M de Atropina
% F
req
uên
cia B
asa
l
-Citronelol ( em µM)
**
*
B
0,1 1 10 100 1000
0
20
40
60
80
100
120
140Em presença de 1 M de Atropina
Em presença de 10 M de Atropina
% A
mp
litu
de
Basa
l
-Citronelol ( em µM)
*
Concentrações cumulativa de β-citronelol (0,1 – 1000 μM) produziram redução significativa na frequência de batimentos ( efeito cronotrópico negativo) do átrio direito a partir da concentração
de 100 μM (*p < 0,05; ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak) com redução
máxima de 45,3 ± 18,8 % na concentração máxima utilizada de 1000 μM (n = 6). A adição prévia nas preparações atriais direitas de 1 μM de atropina ( quadrado branco) ou 10 μM
(triângulo cinza) não alterou a curva concentração-efeito ao β-citronelol (p > 0,05; ANOVA de
duas vias, seguido pelo teste de Holm-Sidak), assim como não alterou o efeito inotrópico
negativo produzido pelo β-citronelol em preparações atriais esquerdas (B, p > 0,05; ANOVA de duas vias, seguido pelo teste de Holm-Sidak).
58
Figura 18 – Efeito do pré-tratamento com β-citronelol na curva concentração-efeito ao
isoproterenol
A
Isoproterenol (em nM)
0,01 0,1 1 10 100
-20
0
20
40
60
80
100
120
Controle
Em presença de 200 M de -citronelol
% d
e au
men
to d
a f
req
uên
cia b
asa
l
B
Isoproterenol (em nM)
0,01 0,1 1 10 100
% d
e au
men
to d
a a
pli
tud
e b
asa
l
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Controle
Em presença de 200 M de -citronelol
Efeito de concentrações crescentes de isoproterenol ( 0,01 – 100 nM) na frequência (A) e
amplitude (B) basal na presença (círculos pretos) ou em ausência (círculos brancos) de 200 μM de β-citronelol (n = 6), mostrando que o aumento na frequência e amplitude de contrações
induzido pelo isoproterenol não foi alterado pelo β-citronelol (p > 0,05; ANOVA de duas vias,
seguido pelo teste de Holm-Sidak).
59
Figura 19 - Efeito do pré-tratamento com β-citronelol na curva concentração-efeito ao CaCl2
%
de a
um
ento
da a
mplitu
de b
asal
0
20
40
60
80
100
Controle
CaCl2 3 4 5 3 4 5 3 4 5( em mM)
-Citronelol (200 µM) -Citronelol (600 µM)
O aumento na amplitude basal de contrações atriais esquerdas produzido pelo CaCl2 (3, 4 e 5
mM) não foi alterado de maneira significativa pela adição prévia de β-citronelol (200 ou 600 μM, p > 0,05; ANOVA de uma via).
60
5.8 Na artéria mesentérica, o β-citronelol produz relaxamento da musculatura lisa
Adições cumulativas de β-citronelol (1 – 1000 μM) induziram efeito
vasorrelaxante em preparações de artéria mesentérica de ratos pré-contraídas com 1 μM
de fenilefrina. A concentração necessária de β-citronelol para produzir 50% de inibição
da resposta contrátil (CI50) foi de 131,4 [90,0 – 191,9] μM em preparações com
endotélio funcional e 108,7 [82,4 – 143,4] μM em preparações sem endotélio, como
pode-se observar no gráfico Figura 20. Quando comparadas as curvas de reversão em
preparações com ou sem endotélio, as mesmas mostraram-se significativamente
semelhantes (p > 0,05; teste de Mann-Whitney) e para ambas as preparações, o efeito
relaxante se tornou estatisticamente significante a partir da concentração de 30 μM (p <
0,05; ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak).
Figura 20 – Curva concentração-efeito ao β-citronelol em preparações de arterial
mesentérica com ou sem endotélio pré-contraídas com fenilefrina
-Citronelol ( em mM)
1 10 100 1000
% d
e co
ntr
açã
o d
a F
enil
efri
na
1
M
-20
0
20
40
60
80
100
120
E +
E -
Veiculo
*
Efeito de concentrações crescentes de β-citronelol (1 – 1000 μM) na contração induzida por 1
μM de fenilefrina em preparações de artéria mesentérica com (círculo branco) e sem (circulo
preto) endotélio funcional. Concentrações crescentes do veículo Tween a 2% (triângulo preto)
foram ineficazes em reduzir o estado contrátil induzido pela fenilefrina. As barras verticais
indicam EPM. *p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak.
61
6 DISCUSSÃO
A administração por via intravenosa de β-citronelol produziu, tanto em ratos
acordados quanto em anestesiados, uma resposta bifásica nos três parâmetros estudados:
pressão arterial, frequência cardíaca e padrão respiratório (estudado apenas em animais
anestesiados), sendo uma primeira fase (F1) imediata seguida de uma segunda mais
lenta e duradoura sequência de eventos cardiorespiratórios (F2). Doses crescentes de β-
citronelol mostram, no entanto, que o efeito bifásico só é produzido a partir de
determinadas doses, a dose de 1 mg/kg, por exemplo não é suficiente para elicitar tal
resposta, induzindo apenas uma queda monofásica na pressão arterial e frequência
cardíaca, sem qualquer alteração no padrão respiratório. É importante salientar que os
valores basais de pressão arterial média e frequência cardíaca em animais anestesiados
ou acordados, foram da mesma ordem de magnitude de valores obtidos em preparações
semelhantes (LAHLOU et al., 2005; 2006) e que os efeitos induzidos pela
administração do β-citronelol em animais anestesiados ou acordados não tiveram grande
diferença, o que sugere que o mecanismo a ser estudado do β-citronelol no sistema
cardiorespiratório não é, de forma geral, alterado pela anestesia. Além disso, convém
notar que a administração de doses sequenciais de β-citronelol não alterou a magnitude
de suas respostas, fato que exclui a possibilidade do fenômeno de taquifilaxia (Apêndice
1).
Padrões de resposta em mais de uma fase podem ser vistos na administração de
óleos essenciais ricos em terpenos, como a Aniba rosaeodora (Rosewood) var
amazonica Ducke (Lauraceae), rico no monoterpeno Linalol de estrutura semelhante ao
β-citronelol (de SIQUEIRA et al., 2014) e a Croton zehntneri Pax et Hoffm.
(Euphorbiaceae) (de SIQUEIRA et al., 2006). Além disso, esses padrões bifásicos são
também elicitados por substâncias utilizadas no presente trabalho, como a capsaicina, a
serotonina e o αβ-metilenoATP que são, respectivamente, agonistas dos receptores
TRPV1, 5-HT3 e P2X ,e que uma vez ativados, induzem um reflexo vago-vagal típico
Bezold-Jarisch com repercurssões cardiorespiratórias, produzindo assim uma imediata
hipotensão, bradicardia e apneia, de forma semelhante ao que encontramos com a
administração intravenosa de β-citronelol.
62
A resposta bifásica hipotensora e bradicardizante mostrada aqui, não foi descrita
por Bastos e colaboradores (2010), que observaram taquicardia associada com
hipotensão. Apesar dessa discordância entre os resultados, alguns fatos podem ser
sugeridos para explicá-la, como a sensibilidade do sistema de aquisição de dados
utilizado, o grau de compressão do traçado analisado e mesmo a forma de solubilização
utilizada (Bastos e colaboradores utilizaram o Cremophor enquanto nós utilizamos o
Tween 80). A despeito dessa discordância, os resultados de Menezes e colaboradores
(2010) que estudaram o efeito do óleo essencial de Cymbopogon winterianus, que
possui o β-citronelol como constituinte, mostraram que na maior dose administrada (20
mg/kg), o óleo induziu resposta bifásica de hipotensão e bradicardia, semelhante a
observada com o β-citronelol.
O intervalo de latência (1,65 ± 0,1 s para bradicardia, 1,86 ± 0,1 s para apneia e
2.09 ± 0,1 s para hipotensão) em que ocorrem esses eventos de F1 é condizente com
respostas cardiorespiratórias reflexas quimicamente produzidas pela administração i.v.
de agentes como a capsaicina (DONNERER & LEMBECK, 1982. YANG et al., 1993),
serotonina (OWEN et al., 2005) ou αβ-metileno ATP (MCQUEEN et al., 1998). Apesar
desses três imediatos eventos (hipotensão, bradicardia e apnea) serem referidos como
um grupo de eventos, ou uma tríade como ocorre tipicamente no reflexo de Bezold-
Jarisch, a bradicardia ocorre antes do efeito hipotensor, indicando que a hipotensão é
uma consequência da bradicardia. Diferentemente, a F2 de bradicardia se resolve em
uma janela de tempo bem menor do que a hipotensão, sendo essa aproximadamente 2,7
vezes mais duradoura, fato que sugere que na F2 esses eventos não são dependentes.
De forma semelhante a um outro composto também estudado por seus efeitos
cardiovasculares de origem vagal, o 1-nitro-2-feniletano (de SIQUEIRA et al. 2010) , os
eventos de F1 induzidos pelo β-citronelol, mostram originar-se perifericamente através
da ativação de fibras aferentes sensoriais vagais do tipo C, uma vez que
dessensibilizando essas fibras aferentes com capsaicina, o β-citronelol não foi capaz de
induzir a F1 de hipotensão, bradicardia e apneia. De forma semelhante, a bivagotomia,
que corta tanto aferências quanto eferências, aboliu esse evento. Além disso, a
dependência da via colinérgica para que seja gerada essa série de eventos imediatos é
comprovada através do bloqueio de receptores muscarinicos cardíacos pela
metilatropina, fato que também incapacita o β-citronelol de produzir a F1 de hipotensão
e bradicardia.
63
Dessa forma, o β-citronelol parece produzir um reflexo vago-vagal através da
ativação de fibras sensoriais vagais do tipo C e mediado por um mecanismo colinérgico
eferente, induzindo assim a uma resposta imediata de hipotensão, bradicardia e apneia.
Entretanto, esses efeitos não parecem se originar pela ativação periférica de receptores
classicamente conhecidos por sua capacidade em ativar reflexos vago-vagais típicos de
Bezold –Jarisch, como é o caso de receptores vanilóides TRPV1 (SZOLCSANY et al.,
1990), serotoninérgicos 5-HT3 (SAXENA; VILLALON, 1990), purinérgicos P2X
(MCQUEEN et al., 1988), ou mesmo de receptores TRPA1 (POSZGAI et al., 2010;
LIU et al., 2013), uma vez que o tratamento dos animais com antagonistas desses
receptores foi incapaz de impedir a indução do reflexo pelo β-citronelol. O fato do β-
citronelol, quando administrado por via i.v., parecer não estimular os receptores TRPV1
vai de encontro com o que pensávamos de início, pelas semelhanças estruturais com
ativadores desses receptores, como a capsaicina e o citral. Porém fato semelhante
também ocorreu com a investigação do óleo essencial da Aniba rosaeodora (Rosewood)
var amazonica Ducke (Lauraceae), rico em Linalol, em que estudos na literatura
(RIERA et al., 2009) o apontavam como ativador de receptores TRPA1, porém a
ativação do receptor não foi comprovada in vivo ( de SIQUEIRA et al., 2014).
Na tentativa de delimitar o sítio de origem do reflexo elicitado pelo β-citronelol,
foi comparado o efeito induzido por sua dose de 5 mg/kg quando administrado por via
intravenosa e a mesma dose quando injetado dentro do ventrículo esquerdo, não
passando em primeira instância pela circulação pulmonar. Quando injetado pela via
intraventricular, o β-citronelol foi incapaz de induzir a F1 de hipotensão, bradicardia e
apneia, de forma semelhante ao 1-nitro-2-feniletano estudado por de Siqueira et al.(
2010), fato que sugere que o sítio de origem do reflexo seja os pulmões, através da
ativação de fibras aferentes pulmonares do tipo C presumivelmente localizadas nas
estruturas pulmonares que recebem perfusão sanguínea da circulação pulmonar, como o
parênquima pulmonar, vias aéreas intrapulmonares e outros. (KWONG et al., 1998).
Esse grupo de efeitos provavelmente originados na circulação pulmonar não são
restritos ao β-citronelol ou mesmo ao 1-nitro-1-feniletano, estudados por nosso grupo de
pesquisa, existem vários outros compostos químicos estudados em décadas passadas
com a capacidade de elicitar quimiorreflexos de origem pulmonar e repercussão
cadiorespiratória, como é o caso do acetaldeído (BRUGERE et al., 1986). Dessa forma,
apesar da administração de β-citronelol gerar efeitos semelhantes aos induzidos por
64
substâncias conhecidamente ativadoras do reflexo de Bezold-Jarisch, o reflexo
produzido pelo β-citronelol não depende da ativação de fibras aferentes localizadas no
ventrículo esquerdo, sítio primário de origem dos reflexos típicos de Bezold-Jarisch.
Assim, não podemos caracterizar as respostas cardiorespiratórias do β-citronelol como
um reflexo típico de Bezold-Jarisch (LAUREN et al., 2007).
Em relação a fase 2, a hipotensão ou apneia parecem não serem mediadas por
vias vagais, uma vez que a bivagotomia, tratamento perineural com capsaicina ou
tratamento com metilatropina não foram capazes de alterar esses efeitos. Entretanto, a
fase 2 de bradicardia foi significantemente reduzida por esses tratamentos, indicando
que as fibras vagais e eferências colinérgicas possuem participação nesse efeito.
Ademais, esse fato indica mais uma vez, corroborando com o aspecto temporal já
comentado, que a bradicardia e a hipotensão na fase 2 provavelmente são
independentes, diferentemente da fase 1. Mesmo após o bloqueio da via colinérgica, o
β-citronelol ainda foi capaz de provocar uma bradicardia residual, e esse foi o fenômeno
que subsidiou a investigação dos efeitos diretos no coração, que serão comentados
posteriormente.
Os eventos de fase 2 não foram alterados pelos tratamentos com capsazepina,
ondansetrona ou HC-030031, porém a suramina foi capaz de abolir a segunda fase de
apneia. Dessa forma, a F2 de apneia induzida pelo β-citronelol pode envolver a ativação
de receptores purinérgicos através de um mecanismo que provavelmente não depende
do vago, uma vez que o procedimento de vagotomia não foi capaz de abolir essa fase. É
notório que não podemos afirmar ou mesmo supor em que sítio anatômico essa apneia
está se originando, já que a injeção intravenosa da dose de 5 mg/kg já não foi capaz de
induzir tal resposta em termos comparativos com a administração intraventricular.
A fase 2 de hipotensão não foi alterada por nenhum dos tratamentos utilizados, e
conforme indicado por Bastos e colaboradores (2010), a hipotensão pode ser devido a
um efeito direto do β-citronelol sobre a musculatura lisa de vasos de resistência, o que
também nós confirmamos experimentalmente através de preparações isoladas de artéria
mesentérica. Outro fato em nosso trabalho que suporta essa hipótese de redução da PA é
o fato do β-citronelol induzir um efeito hipotensor de F2 mais potente na pressão
arterial diastólica, quando comparada a sistólica, o que sugere que a queda pressórica é
devido a redução na resistência periférica vascular (de Simone e Pasanisi, 2001).
65
In vitro, o β-citronelol demonstrou efeito cronotrópico negativo no átrio direito e
efeito inotrópico negativo no átrio esquerdo, evidenciando dessa forma um efeito
cardiodepressor direito, assim como o carvacrol, outro monoterpeno de estrutura
semelhante estudado por Dantas e colaboradores (2015). Esse fato corrobora com a
redução residual da FC mesmo após o bloqueio in vivo da via colinérgica, indicando que
a bradicardia residual pode ser devido ao efeito cardíaco direto. A ativação de
receptores muscarínicos cardíacos do tipo M2 leva a hiperpolarização do nodo sinoatrial
e redução no ritmo de despolarização espontânea, reduzindo assim a frequência do nodo
sinoatrial. (DHEIN et al., 2001) Porém, a bradicardia residual parece não ter relação
com a ativação dos receptores muscarinico ou com o bloqueio de receptores beta-
adrenergicos, já que a atropina, antagonista muscarínico não-seletivo, não deslocou a
curva de concentração-efeito ao β-citronelol e o mesmo não inibiu o efeito inotrópico ou
cronotrópico produzido pelo isoproterenol.
O mecanismo de contração cardíaca depende da regulação do acoplamento
excitação-contração, que por sua vez depende da dinâmica do íon cálcio. A
despolarização da membrana da célula cardíaca é um evento inicial para o influxo de
cálcio através dos canais para cálcio do tipo L, o que por sua vez leva a eventos
subsequentes, como a liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático através da
liberação de cálcio induzida por cálcio. Dessa forma, os cardiomiócitos dependem do
cálcio extracelular para o processo fisiológico de contração (BERS, 2008). Um
ineficiente influxo de cálcio leva a uma contração ineficiente. Experimentalmente, o
aumento na concentração extracelular de Ca2+
nas cubas produziu um efeito inotrópico
de forma concentração dependente no átrio esquerdo, sendo esse efeito não alterado
pela pré-incubação de β-citronelol na preparação. Dessa forma, β-citronelol não foi
capaz de interferir na dinâmica de cálcio e o efeito inotrópico ou cronotrópico negativo
provavelmente não envolve o bloqueio do influxo de cálcio.
Como previamente descrito por Bastos e colaboradores (2010) e confirmado em
nosso estudo, o β-citronelol produz efeito vasorrelaxante em preparações de artéria
mesentérica pré-contraidas com fenilefrina de forma independente do endotélio. Porém,
em nossos protocolos experimentais o β-citronelol apresentou CI50 aproximadamente de
130 μM em preparações de artéria mesentérica com endotélio íntegro, apresentando
assim maior potência em relação aos resultados obtidos por Bastos e colaboradores, no
66
qual o β-citronelol apresentou CI50 (calculada a partir de dados de pD2) de
aproximadamente 195 mM. De fato, a diferença de potência do β-citronelol em
preparações isoladas nos dois trabalhos pode estar relacionada também as diferenças
nos efeitos cardiovasculares induzidos pelo β-citronelol, como a bradicardia observada
em nosso trabalho em contraste com a taquicardia observada por Bastos e
colaboradores.
Os efeitos depressores provocados pelo β-citronelol tanto in vivo quanto in vitro
apresentaram-se reversíveis, fato que exclui um possível efeito tóxico como produtor
dos efeitos demonstrados no presente trabalho. Alem disso, Batubara e colaboradores
(2015) mostraram que a inalação crônica de β-citronelol reduziu o apetite, ganho de
peso e colesterol em ratos submetidos a dieta de alto teor de gordura, mas não causou
qualquer alteração na concentração de enzimas hepáticas, demonstrando assim a
atividade farmacológica do β-citronelol, sem um possível efeito tóxico. Somado a essa
observação, dados mostram que o β-citronelol possui uma LD50 maior que 3500 mg/kg
(JENNER et al., 1964) em ratos quando administrado por via oral.
A presente descrição e análise dos efeitos cardiovasculares e respiratórios do β-
citronelol é, portanto, de relevância farmacológica já que contribui com estudos já
realizados objetivando entender os efeitos dessa substancia tão disseminada em plantas
de uso terapêutico e em produtos que usamos em nosso cotidiano. Apesar de
mostrarmos e caracterizarmos as alterações de pressão arterial, frequência cardíaca e
frequência respiratória produzida pela administração aguda por via i.v. de β-citronelol,
muitos aspectos acerca da origem e do mecanismo de transdução que envolvem esses
efeitos ainda não foram completamente elucidados, existindo assim a necessidade de
estudos complementares. Por fim, apesar de demonstrar efeitos hipotensores, nosso
estudo não almejou a investigação de um possível efeito anti-hipertensivo do β-
citronelol, efeito esse ainda não estudado e que é de extrema importância para indicar
uma potencial aplicação de plantas que contém o β-citronelol como forma de um
possível tratamento da hipertensão.
67
7 CONCLUSÃO
A administração intravenosa de β-citronelol produziu imediato reflexo vago-
vagal de hipotensão e bradicardia em ratos acordados, juntamente com apneia em ratos
anestesiados. O sitio de origem de tal reflexo é provavelmente os pulmões e, apesar do
mecanismo de ativação das fibras aferentes pulmonares vagais do tipo C pelo β-
citronelol não ser totalmente entendida, parece não envolver a ativação de receptores
TPRV1, 5-HT3, TRPA1 ou P2X classicamente envolvidos em quimiorreflexos vagais.
Uma segunda série mais tardia e duradoura de eventos foi elicitada pelo β-citronelol,
estando a hipotensão aparentemente relacionada com seus efeitos vasorrelaxantes
diretos, a bradicardia mediada por vias vagais somado a efeitos cardiodepressores
diretos e apneia, provavelmente dependente de receptores purinérgicos.
68
REFERÊNCIAS
ALBAGHDADI, M. Baroreflex controle of long-term arterial pressure. Rev Bras
Hipertens. v. 14, p. 212-225, 2007.
BABU G. D., SINGH B., JOSHI V. P., SINGH V. Essential oil composition of Damask
rose (Rosa damascena Mill.) distilled under different pressures and temperatures.
Flavour and Fragrance Journal, v. 17, p. 136-140, 2002.
BAGCHI, S.; DESHPANDE, S. B. Indian red scorpion (Buthus tamulus) venom-
induced augmentation of cardiac reflexes is mediated through the involvement of
peripheral 5-HT3 and central 5-HT1A receptor subtypes. Toxicon. v. 37, p. 1697-1709,
1999.
BAKKALI F., AVERBECK S., AVERBECK D., IDAOMAR M., Biological effects of
essential oils – A review. Food and Chemical Toxicology, v. 46, p.446-475, 2008.
BARBOSA, A. S.; SOUSA, E. G.; SILVA, M. A.; OLIVEIRA, H. S. M. C.;
MEDEIROS, M. B. Plantas medicinais: aspectos do uso de fitoterápicos na
melhoria da qualidade de vida humana. Anais do X Encontro de Iniciação à
Docência e IX Encontro de Extensão. Disponível em:
<http://www.prac.ufpb.br/anais/IXEnex/iniciacao/documentos/anais/6.SAUDE/6CFTD
APMT01.pdf>. Área da Saúde. Universidade Federal da Paraíba. João Pessoa, 2007.
BARJA, F.; MATHISON, R.; HUGGEL, H. Substance P-containing fibres in large
peripheral blood vessels of the rat. Cell Tissue Res v. 229, p.411-422, 1983.
BASTOS, J. F. A.; MOREIRA, I. J. A.; RIBEIRO,T. P.; MEDEIROS, I. A.;
ANTONIOLLI, A. R.; SOUSA, D. P.; SANTOS, M. R. V. Hypotensive and
vasorelaxant effects of Citronellol, a monoterpene alcohol, in rats. Basic & Clinical
Pharmacology & Toxicology, v. 106, p. 331–337, 2009.
BELSITO D, BICKERS D, BRUZE M. A toxicologic and dermatologic assessment of
cyclic and non-cyclic terpene alcohols when used as fragrance ingredients. Food Chem
Toxicol. v. 46, p. 71, 2008.
BERS, D. M. Calcium Cycling and Signaling in Cardiac Myocytes. Annu. Rev.
Physiol. v. 70, p. 23-49, 2008.
BEVAN S, GEPPETTI P. Protons: small stimulants of capsaicin-sensitive sensory
nerves. Trends Neurosci. p.509-12, 1994.
BONHAM AC, CHEN CY. Synaptic transmission in the nucleus tractus solitarius.
Advances in Vagal Afferent Neurobiology. v. 11., 2005.
BRITO R. G., GUIMARÃES A. G., QUINTANS J. S., SANTOS M.R., DE SOUSA
D.P., BADAUE-PASSOS D. Jr, DE LUCCA W. Jr, BRITO F. A., BARRETO E.
O., OLIVEIRA A.P., QUINTANS L. J. Jr. Citronellol, a monoterpene alcohol, reduces
nociceptive and inflammatory activities in rodents. J Nat Med. v.4, p. 637-44, 2012.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Quintans%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22350215
69
BRITO R.G., SANTOS P.L., PRADO D.S., SANTANA M.T., ARAÚJO
A.A., BONJARDIM L.R., SANTOS M.R., DE LUCCA Júnior W., OLIVEIRA
A.P., QUINTANS-JÚNIOR L.J.. Citronellol reduces orofacial nociceptive behaviour in
mice - evidence of involvement of retrosplenial cortex and periaqueductal grey areas.
Basic Clin Pharmacol Toxicol. v.112, p.215-21, 2013.
BRUGERE S.; SAAVEDRA A.; PENNA, M. Cardiorespiratory inhibitory reflex
induced by intravenous administration of acetaldehyde in rats. Alcohol v. 3, p. 317–322,
1986.
BUCKLEY D A. Fragrance ingredient labelling in products on sale in the UK. Br J
Dermatol. v. 157, p. 295-300, 2007.
CAMPAGNOLE-SANTOS, M. J., HAIBARA, A. S., Reflexos cardiovasculares e
hipertensão arterial. Rev Bras Hipertens. v.8, p. 30-40, 2001.
CARBAJAL, D.; CASACO, A.; ARRUZAZABALA, L.; GONZALEZ, R.; TOLON,
Z.; Pharmacological study of Cymbopogon citratus leaves. J ethnopharmacol. v. 25, p.
103-7, 1989.
CHANG, R. B.; STROCHLIC1, D. E.; WILLIAMS, E. K.; UMANS, B. D.; LIBERLES
S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. v. 161,
p.622-33, 2015.
CHITRA, R.; SIM, S. M.; ISMAIL, R. Effect of Cymbopogon citratus and Citral on
Vascular Smooth Muscle of the Isolated Thoracic Rat Aorta. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine. 2012.
DAMIANI, C. E. N.; MOREIRA, C. M.; ZHANG, H. T.; CREAZZO, T. L.;
VASSALLO, D. V. Effects of Eugenol, an Essential Oil, on the Mechanical and
Electrical Activities of Cardiac Muscle. Journal of Cardiovascular Pharmacology. v.
44, p. 688-695, 2004.
DANTAS, B. P. V., ALVES, Q. L., DE ASSIS, K. S., RIBEIRO, T. P., DE ALMEIDA,
M. M., DE VASCONCELOS, A. P., DE ARAÚJO, D. A. M., DE ANDRADE
BRAGA, V., DE MEDEIROS, I. A., ALENCAR, J. L. E SILVA, D. F. Participation of
the TRP channel in the cardiovascular effects induced by carvacrol in normotensive rat.
Vascular Pharmacology, v. 67-69, p. 48-58, 2015.
DAWES G. S., WIDDICOMBE J. G. The afferent pathway of the bezold reflex: the left
vagal branches in dogs. Br J Pharmacol Chemother.v. 8, p. 395-398, 1953.
DAWES, G. S. Studies on veratrum alkaloids. VII. Receptor areas of the coronary
arteries and elsewhere as revealed by the use of veratridine. J Pharmacol Exp Ther. v.
89, 1947.
DAWES, G.S.; COMROE, J.H., Chemoreflexes from the heart and lungs. Physiol. Rev.
v.34, p. 167-201, 1954.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oliveira%20AP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23035741
70
de MENEZES, I. A. C., MOREIRA, Í. J. A., DE PAULA, J. W. A., BLANK, A. F.,
ANTONIOLLI, A. R., QUINTANS-JÚNIOR, L. J. AND SANTOS, M. R. V. ,
Cardiovascular effects induced by Cymbopogon winterianus essential oil in rats:
involvement of calcium channels and vagal pathway. Journal of Pharmacy and
Pharmacology,v. 62, p. 215–221, 2010.
de SIMONE G.; PASANISI, F. Systolic, diastolic and pulse pressure: pathophysiology.
Ital Heart J Suppl. v. 2, p. 359-362, 2001.
de SIQUEIRA, R. J.; LEAL-CARDOSO J. H.; COUTURE, R.; LAHLOU S. Role of
capsaicin-sensitive sensory nerves in mediation of the cardiovascular effects of the
essential oil of croton zehntneri leaves in anaesthetized rats. Clinical and
Experimental Pharmacology and Physiology. v. 33, p. 238-247, 2006.
de SIQUEIRA, R. J.; MACEDO, F. I.; INTERAMINENSE, L F.; DUARTE, G. P.;
MAGALHÃES, P. J.; BRITO, T. S.; DA SILVA, J. K.; MAIA, J. G.; SOUSA, P. J.;
LEAL-CARDOSO, J. H.; LAHLOU, S. 1-Nitro-2-phenylethane, the main constituent of
the essential oil of Aniba canelilla, elicits a vago-vagal bradycardiac and depressor
reflex in normotensive rats. Eur J Pharmacol. v.638, p.90-98, 2010.
de SIQUEIRA, R. J.; RODRIGUES, K. M.; DA SILVA, M. T.; CORREIA JUNIOR, C.
A.; DUARTE, G. P.; MAGALHÃES, P.J.; DOS SANTOS, A. A.; MAIA, J. G.; DA
CUNHA, P. J.; LAHLOU S. Linalool-rich rosewood oil induces vago-vagal bradycardic
and depressor reflex in rats. Phytother Res. v. 28, p. 42-8, 2014.
de SIQUEIRA, R.; LEAL-CARDOSO, J.; COUTURE, R.; LAHLOU, S. Role of
capsaicin-sensitive sensory nerves in mediation of the cardiovascular effects of the
essential oil of croton zehntneri leaves in anaesthetized rats. Clin Exp Pharmacol
Physiol. v. 33, p.238-247, 2006.
de SOUSA, D. P., GONÇALVES, J. C. R., QUINTANS-JÚNIOR, L., CRUZ, J. S.,
ARAÚJO, D. A. M. E DE ALMEIDA, R. N. Study of anticonvulsant effect of
citronellol, a monoterpene alcohol, in rodents. Neuroscience Letters, v. 401, n. 3, p.
231-235, 2006.
de VINCENZI, M., CASTRIOTTA, F., DI FOLCO, S., DRACOS, A., MAGLIOLA,
M., MATTEI, R., PURIFICATO, I., STACCHINI, A., STACCHINI, P. & SILANO, B.
A basis for estimation of consumption: Literature values for selected food volatiles. Part
II. Food Addit. Contam., v. 4, 161-218, 1987.
DHEIN, S.; VAN, C. J.; BRODDE, O. E. Muscarinic receptors in the mammalian heart.
Pharmacol Res. v. 44, p. 161-82, 2001.
DONNERER, J.; LEMBECK F. Analysis of the effects of intravenously injected
capsaicin in the rat. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. v. 320, p
54-57, 1982.
EVANS, R. G.; LUDBROOK, J.; MICHALICEK, J. Use of nicotine, bradykinin and
veratridine to elicit cardiovascular chemoreflexes in unanaesthetized rabbits. Clin Exp
Pharmacol Physiol. v. 18, p. 245–254, 1991.
71
FEMA (1997) FEMA Database: dl-Citronellol (FEMA No. 2309), Washington, DC,
Flavor and Extract Manufacturers’ Association, 31 pp.
FRINK, R. J.; JAMES, T. N. Intracardiac route of the Bezold-Jarisch reflex. Am J
Physiol v. 221: 1464, 1971.
GHEDINI, P. C.; DORIGONI, P. A.; ALMEIDA, C. E.; FROES, L. F.; BAPTISTA, K.
C.; ETHUR, A. B. M.; BALDISSEOTTO, B.; BURGER, M. E.; LOPES, A. M. V.;
ZÁCHIA, R. A. Levantamento de dados sobre plantas medicinais de uso popular no
município de São João do Polêsine, RS. II - Emprego de preparações caseiras de uso
medicinal. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v. 5, n. 1, p. 46-55, 2002.
GUYTON, A. C. An Overall Analysis of Cardiovascular Regulation. Anesthesia &
Analgesia. v. 56, p. 761-768, 1977.
HOLZER, P., Capsaicin: Cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin
sensory neurons. Pharmacological reviews.v. 43, n.2, 1991.
JAMMES, Y., FORNARIS, E., MEI, N. E BARRAT, E. Afferent and efferent
components of the bronchial vagal branches in cats. Journal of the Autonomic
Nervous System, v. 5, n. 2, p. 165-176, 1982.
JANSCÓ, G., SUCH, G., Effects of capsaicin applied perineurally to the vagus nerve on
cardiovascular and respiratory functions in the cat. J. Physiol. v. 341,p. 359-370, 1983.
JENNER, P. M.; HAGAN, E. C.; TAYLOR, J. M.; COOK E. L.; Fitzhugh. food
flavourings and compounds of related structure I. Acute oral toxicity. Fd Cosmet.
Toxicol, v. 2, p. 327-343, 1964.
KALIA, M. E MESULAM, M. Brain stem projections of sensory and motor
components of the vagus complex in the cat: I. The cervical vagus and nodose ganglion.
J. Comp. Neurol., v. 193, n. 2, p. 435-465, 1980.
KWON Y, KIM SH, RONDEROS DS, LEE Y, AKITAKE B, WOODWARD OM, et
al. Drosophila TRPA1 channel is required to avoid the naturally occurring insect
repellent citronellal. Curr Biol. v. 20, p. 1672-1678, 2010.
KWONG K.; HONG, J.; MORTON R. F.; LEE, L Role of pulmonary C fibers in
adenosine-induced respiratory inhibition in anesthetized rats. J Appl Physiol. v. 84, p.
417-424, 1998.
LAHLOU S.; FIGUEIREDO A. F.; MAGALHÃES P. J.; LEAL-CARDOSO J. H.
Cardiovascular effects of 1,8-cineole, a terpenoid oxide present in many plant essential
oils, in normotensive rats. Can J Physiol Pharmacol. v. 80, p.1125-31,2002.
LAHLOU S.; FIGUEIREDO A. F.; MAGALHÃES P. J.; LEAL-CARDOSO J. H.;
GLORIA P. D. Cardiovascular effects of methyleugenol, a natural constituent of many
plant essential oils, in normotensive rats. Life Sci. v. 74, p.2401-12, 2004.
72
LAHLOU S.; INTERAMINENSE L. F.; MAGALHÃES P. J.; LEAL-CARDOSO J. H.;
DUARTE G. P. Cardiovascular effects of eugenol, a phenolic compound present in
many plant essential oils, in normotensive rats. J Cardiovasc Pharmacol. v. 43, p. 250-
7, 2004.
LAHLOU, S., FIGUEIREDO, A. F., MAGALHÃES, P. J. C. E LEAL-CARDOSO, J.
H. Cardiovascular effects of 1,8-cineole, a terpenoid oxide present in many plant
essential oils, in normotensive rats. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology,
v. 80, n. 12, p. 1125-1131, 2002.
LAHLOU, S., GALINDO, C. A., LEAL-CARDOSO, J. H., FONTELES, M. C. E
DUARTE, G. P. Cardiovascular Effects of the Essential Oil of Alpinia zerumbet Leaves
and its Main Constituent, Terpinen-4-ol, in Rats: Role of the Autonomic Nervous
System. Planta med. v. 68, p.1097-1102, 2002.
LAHLOU, S.; CARNEIRO-LEÃO, R. F. L.; LEAL-CARDOSO, J. H.; TOSCANO, C.
F. Cardiovascular Effects of the Essential Oil of Mentha x villosa and its Main
Constituent, Piperitenone Oxide, in Normotensive Anaesthetised Rats: Role of the
Autonomic Nervous System. Planta med. v. 67, p.638-643, 2001.
LAHLOU, S.; INTERAMINENSE, L. D. F. L.; LEAL-CARDOSO, J. H.; MORAIS, S.
M.; DUARTE, G. P. Cardiovascular effects of the essential oil of ocimum gratissimum
leaves in rats: role of the autonomic nervous system. Clin Exp Pharmacol Physiol. v.
31, p.219-225, 2004.
LAHLOU, S.; LEAL-CARDOSO, J. H.; MAGALHÃES, P. J. C., COELHO-DE-
SOUZA, A. N. E DUARTE, G. P. Cardiovascular Effects of the Essential Oil of Croton
nepetaefolius in Rats: Role of the Autonomic Nervous System. Planta med, v. 65, n. 6,
p. 553-557, 1999.
LAHLOU, S.; MAGALHÃES, P. J. C.; DE SIQUEIRA, R. J. B.; FIGUEIREDO, A. F.;
INTERAMINENSE, L. F. L.; MAIA, J. G. S.; SOUSA, P. J. D. C. Cardiovascular
Effects of the Essential Oil of Aniba canelilla Bark in Normotensive Rats. Journal of
Cardiovascular Pharmacology. v. 46, p. 412-421, 2005.
LAHLOU, S.; INTERAMINENSE, L. F.; LEAL-CARDOSO, J. H.; DUARTE, G. P.
Antihypertensive effects of the essential oil of Alpinia zerumbet and its main
constituent, terpinen-4-ol, in DOCA-salt hypertensive conscious rats. Fundam Clin
Pharmacol.v. 17, p. 323-330, 2003.
LAHLOU, S.; INTERAMINENSE, L. F.;, LEAL-CARDOSO, J. H.; MORAIS, S.
M.;, DUARTE, G. P. Cardiovascular effects of the essential oil of Ocimum gratissimum
leaves in rats: role of the autonomic nervous system.Clinical and Experimental
Pharmacology and Physiology. v.31, p. 219-225, 2004.
LAHLOU, S; MAGALHÃES, P. J.; DE SIQUEIRA, R. J.; FIGUEIREDO, A.
F.; INTERAMINENSE, L. F.; MAIA, J. G.; SOUSA, P. J. Cardiovascular effects of the
essential oil of Aniba canelilla bark in normotensive rats. J Cardiovasc Pharmacol.v.
46, p. 412-421, 2005.
73
LAUREN, M. S.; ROBYN, L. W.; COLIN, R. A.; MCALLEN, R. M. Nonuniformity in
the von Bezold-Jarisch reflex. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. V. 293 p.
714–720, 2007.
LEE, L. Y.; YU J.Sensory nerves in lung and airways. Compr Physiol v. 4, p. 287–324,
2014.
LIU, B.; TSAI, T.; HO, C.; , LU, S.; LAI, C. J.; KOUA, Y. R. Role of TRPA1 and
TRPV1 in the ROS-dependent sensory irritation of superior laryngeal capsaicin-
sensitive afferents by cigarette smoke in anesthetized rats. Pulmonary Pharmacology
& Therapeutics. v. 26, p. 364-372, 2013.
LUPINSKI, S.; SCHLICKER, E.; PÊDZIÑSKA-BETIUK A.; MALINOWSKA, B.
Acute myocardial ischemia enhances the vanilloid TRPV1 and serotonin 5-HT3
receptor mediated Bezold-Jarisch reflex in rats. Pharmacological Reports. v. 63, p.
1450 – 1459, 2011.
MALINOWSKA B.; KWOLEK G.; GOTHERT M. Anandamide and methanandamide
induce both vallinoid VR1- and cannanbinoid CB1 receptor mediated changes in heart
rate and blood pressure in anaesthetized rats. Naunyn Schmiedebergs Arch
Pharmacol v. 364, p. 562-569, 2011.
MANCIA,. G.; MARK, A. L.; Arterial Baroreflexes in Humans. Handbook of
physiology, The Cardiovascular System, Peripheral Circularion and Organ Blood
Flow. 1983.
MARSHALL, J. M. Analysis of cardiovascular responses evoked following changes in
peripheral chemoreceptor activity in the rat. Journal of Physiology. v. 394, p. 393-414,
1987.
MCQUEEN, D. S.; BOND, S. M.; MOORES, C.; CHESSELL, I.; HUMPHREY, P. P.;
DOWD, E. Activation of P2X receptors for adenosine triphosphate evokes
cardiorespiratory reflexes in anaesthetized rats. J Physiol. v.507, p. 843-55, 1998.
NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE, 1997 [Record No. 53763] NLM RTECS
(Registry of Toxic Effects of Chemical Substances), Bethesda, MD.
OHKAWARA, S.,TANAKA-KAGAWA, T.,FURUKAWA Y. Activation of the Human
Transient Receptor Potential Vanilloid Subtype 1 by Essential Oils. Biological and
Pharmaceutical Bulletin. v. 33, p. 1434-1437, 2009.
OPENSHAW, P. Breathing and control of heart rate. BMJ. v. 1, p. 199-199, 1979.
PEREIRA F.O., MENDES J.M., LIMA I.O., MOTA K.S., OLIVEIRA W.A., LIMA
E.O.. Antifungal activity of geraniol and citronellol, two monoterpenes alcohols, against
Trichophyton rubrum involves inhibition of ergosterol biosynthesis. Pharm Biol v. 53,
p. 228-234, 2015.
POZSGAI, G.; BODKIN, J. V.; GRAEPEL, R.; BEVAN, S.; ANDERSSON, D .A.;
BRAIN, S. D. Evidence for the pathophysiological relevance of TRPA1 receptors in the
cardiovascular system in vivo. Cardiovasc Res. v. 87, p.760–768., 2010.
74
RIERA, C.; MENOZZI-SMARRITO, C.; AFFOLTER, M.; MICHLIG, S.; MUNARI,
C.; ROBERT, F.; VOGEL, H.; SIMON, S. A.; LE COUTURE, J.Compounds from
Sichuan and Melegueta peppers activate, covalently and non-covalently, TRPA1 and
TRPV1 channels. Br J Pharmacol. v. 157, p.1398–1409., 2009.
RODRIGUES, K. A. D. F., DIAS, C. N., DO AMARAL, F. M. M., MORAES, D. F. C.,
MOUCHREK FILHO, V. E., ANDRADE, E. H. A. E MAIA, J. G. S. Molluscicidal and
larvicidal activities and essential oil composition of Cymbopogon winterianus.
Pharmaceutical Biology, v. 51, n. 10, p. 1293-1297, 2013.
RUBINO, A. BURNSTOCK, G. Capsaicin-sensitive sensory-motor neurotransmission
in the peripheral control of cardiovascular function. Cardiovascular Research.,p. 467-
479, 1996.
SADRAEI H, ASGHARI G, EMAMI S. Inhibitory effect of Rosa damascena Mill
flower essential oil, geraniol and citronellol on rat ileum contraction. Res Pharm Sci v.
8, p. 17-23, 2013.
SCHELEGLE, E.S., CHEN, A.T., LOH, C.Y. Effects of vagal perineural capsaicin
treatment on vagal efferent and airway neurogenic responses in anesthetized rats. J.
Basic Clin. Physiol. Pharmacol. v. 11, p. 1-16, 2000.
SCHULTZ, H. D. Cardiac Vagal Chemosensory Afferents. Annals of the New York
Academy of Sciences. v. 940, p. 59-73, 2001.
SEBASTIAO, R. C. O.; BRAGA, J. P.; VIRTUOSO, L. S.; BORGES, E. Retrieval of
kinetic rates in reactions with semi batch liquid phase using ill-posed inverse problem
theory. Quím. Nova., v. 34, n. 2, p. 213-217, 2011.
SOARES, M.; DAMIANI, C.; MOREIRA, C.; STEFANON, I.; VASSALLO, D.
Eucalyptol, an essential oil, reduces contractile activity in rat cardiac muscle. Braz J
Med Biol Res. v. 38, 2005.
SOARES, M.C.M.S.; DAMIANI, C.E.N.; MOREIRA, C.M.; STEFANON;
VASSALLO, D.V. Eucalyptol, an essential oil, reduces contractile activity in rat cardiac
muscle. Biological Research. v. 38, p. 453-461, 2005.
STOTZ, S. C.; VRIENS, J.; MARTYN, D.; CLARDY, J.; CLAPHAM, D. E., Citral
Sensing by TRANSient Receptor Potential Channels in Dorsal Root Ganglion Neurons,
PLoS ONE, v. 3, p 1, 2008.
SU, Y. W.; CHAO, S. H.; LEE, M. H.; OU TY; TSAI, Y. C. Inhibitory effects of
citronellol and geraniol on nitric oxide and prostaglandin E₂production in macrophages.
Planta Med., v. 76, n. 15, p. 1666-71, 2010.
VASQUEZ, E. C.;MEYRELLES S. S.; MAUAD, H.; CABRAL, A. M. Neural reflex
regulation of arterial pressure in pathophysiological conditions: interplay among the
75
baroreflex, the cardiopulmonary reflexes and the chemoreflex. Braz J Med Biol Res. v.
30, p. 521 – 532, 1997.
VERBERNE, A. Chemical stimulation of vagal afferent neurons and sympathetic
vasomotor tone. Brain Research Reviews, v. 41, n. 2-3, p. 288-305, 2003.
WANG, G.; LIAO, J.; HINTZ, K. K.; CHEN, W.; SU, M.; LIN, Y.; SHI, C.; CHEN, C.;
REN, J. Calcium-antagonizing activity of S-petasin, a hypotensive sesquiterpene from
Petasites formosanus, on inotropic and chronotropic responses in isolated rat atria and
cardiac myocytes. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. v. 369, p. 322-329,
2004.
WHARTON J., GULBENKIAN S., MULDERRY P.K., GHATEI M.A., MCGREGOR
G.P., BLOOM S.R., POLAK J.M. Capsaicin induces a depletion of calcitonin gene-
related peptide (CGRP)-immunoreactive nerves in the cardiovascular system of the
guinea-pig and rat. J. Auton. Nerv. Syst.v. 16, p. 289-309, 1986.
XU, H., BLAIR, N. T., CLAPHAM, D. E.. Camphor Activates and Strongly
Desensitizes the Transient Receptor Potential Vanilloid Subtype 1 Channel in a
Vanilloid-Independent Mechanism, J. Neurosci., v. 28, p. 8924-8937,2005.
76
APÊNDICE A – Comparação do efeito na PAM e FC induzido por duas doses
sequenciais (intervalo de 10 minutos) de β-citronelol (10 mg/kg)
Redução na PAM (%) Redução na FC (%)
F1 F2 F1 F2
1º injeção de β-citronelol 41,9 ± 4,1 53,0 ± 2.0 79,6 ± 3,0 58,1 ± 7,3
2º injeção de β-citronelol 42.9 ± 4.7 60,9 ± 3,2 76,8 ± 4,7 56,1 ± 4,5
APÊNDICE B – Efeito dos tratamentos na PAM e FC
*p < 0,05 quando comparado aos valores basais
PAM (mmHg)
FC (bpm)
Tratamentos
Antes
Depois
Antes
Depois
Bivagotomia 97,9 ± 7,3 97,3 ± 6,7 368,9 ± 8,5 375,4 ± 8,4
Tratamento Perineural com Capsaicina 125,3 ± 3,4 120,3 ± 3,8 455,2 ± 22,7 452,4 ± 19,5
Capsazepina 127,1 ± 3,1 126,9 ± 5,7 402,0 ± 6,1 395,9 ± 9,9
Ondansentrona 98,0 ± 10,8 100,2 ± 9,6 448,1 ± 17,4 449,5 ± 16,2
Suramina 141,8 ± 5,9 134,9 ± 7,4 396,3 ± 4,8 394,3 ± 4,6
Metilatropina 126,6 ± 3,7 130,5 ± 2,8 436,3 ± 18,3 509,6 ± 10,8 *
77
