UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC (UFABC)

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS (CCNH)

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

BIOTECNOCIÊNCIA

VIVIAM MOURA DA SILVA

ESTUDOS DA ESTABILIDADE, FLEXIBILIDADE E

ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA β-MANANASE DA

BACTÉRIA HIPERTERMOFÍLICA THERMOTOGA

PETROPHILA

Santo André,

Junho de 2014

3


BIOTECNOCIÊNCIA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO





PETROPHILA

Trabalho apresentado como requisito parcial para obtenção

do titulo de Mestre em Biotecnociência, sob orientação do

Professor Doutor Wanius José Garcia da Silva.

Santo André,

Junho de 2014

6





PETROPHILA

Santo André,

Junho de 2014

7

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC (UFABC)

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS (CCNH)


BIOTECNOCIÊNCIA




PETROPHILA

Santo André,

Junho de 2014

8




PETROPHILA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós graduação em

Biotecnociência da Universidade Federal do ABC, como

requisito parcial para obtenção do titulo de Mestre Ciências.

Área de concentração:

Biotecnociência

Oritentador:

Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva

Santo André,

Junho de 2014

9

SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................................... 15

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................ 17

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................................ 18

1. Introdução ............................................................................................................................... 22

1.2 Celulose ............................................................................................................................. 23

1.3 Lignina ............................................................................................................................... 24

1.2 Hemicelulose ..................................................................................................................... 24

2. Hidrólise Enzimática ................................................................................................................ 25

2.1 Polissacarídeos de manana ............................................................................................... 25

2.2 Enzimas hidrolíticas: hemicelulases .................................................................................. 28

2.2.1 Enzimas termoestáveis com potencial biotecnológico .................................................. 28

2.2 A enzima β-Mananase ....................................................................................................... 29

3. Objetivos ................................................................................................................................. 32

4. Materiais e métodos ............................................................................................................... 33

4.1 Materiais ........................................................................................................................... 33

4.2 Métodos ................................................................................................................................ 33

4.2.1 Expressão e purificação da proteína TpMan e TpManGH5............................................ 33

4.2.1.1 Expressão da proteína TpMan e TpManGH5 .............................................................. 33

4.2.1.2 Purificação da proteína TpMan e TpManGH5 ......................................................... 34

4.2.2 Medidas de atividade enzimática................................................................................... 36

4.2.3 Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ............................................................................. 36

4.2.4 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) ......................................................... 37

4.2.5 SAXS - Análise de dados ................................................................................................. 38

4.2.6 Modelos de baixa resolução obtidos dos dados de SAXS .............................................. 38

4.2.7 Modelo de corpo rígido e modelagem por EOM ........................................................... 38

10

4.2.8 Modelagem molecular (por homologia) ........................................................................ 39

4.2.9 Métodos computacionais para predição de estrutura secundária ................................ 39

4.2.10 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD) ................................................................. 40

5. Resultados e Discussão ........................................................................................................... 41

5.1.1 Perfil da atividade em função da temperatura .............................................................. 41

5.1.2 Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ............................................................................. 42

5.1.3 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) ......................................................... 45

5.1.4 Gráfico de Kratky e flexibilidade .................................................................................... 49

5.1.5 Modelagem molecular por homologia ........................................................................... 51

5.1.6 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD) ................................................................... 54

5.1.7 Métodos computacionais para predição da estrutura secundária ................................ 57

5.1.8 Método de otimização em conjunto (EOM) .................................................................. 57

5.1.9 Modelo de corpo rígido (RBM) ....................................................................................... 60

5.2. Discussão .............................................................................................................................. 62

5.2.1 Dimensão e forma da enzima TpMan da bactéria hipertermoestável Thermotoga

petrophila a 20 ºC .................................................................................................................... 62

5.2.2 Modelo molecular por homologia para o linker ............................................................ 63

5.2.3 Estrutura secundária dos domínios estruturais da enzima TpMan ............................... 64

5.2.4 Gráfico de Kratky sugere que a enzima TpMan apresenta algum nível de flexibilidade a

20 ºC ........................................................................................................................................ 65

5.2.5 Modelo tridimensional para a enzima TpMan intacta a 20 ºC ...................................... 66

5.2.6 SAXS revela que mudanças conformacionais na enzima TpMan é dependente da

temperatura ............................................................................................................................ 67

6. Conclusões ............................................................................................................................... 69

7. Perspectivas futuras ................................................................................................................ 71

8. Referências .............................................................................................................................. 72

ANEXO ......................................................................................................................................... 79

11

Dedicatória

À Deus, minha família, amigos, colegas de trabalho e

orientadoras pelo apoio, força, incentivo, companheirismo e

amizade. Sem eles

nada disso seria possível.

“Se vi mais longe que os outros é porque estava sobre os

ombros de gigantes”

Issac Newton

12

Agradecimentos

“Cada pessoa que passa em nossa vida, passa

sozinha, é porque cada pessoa é única e nenhuma

substitui a outra! Cada pessoa que passa em nossa

vida passa sozinha e não nos deixa só porque deixa

um pouco de si e leva um pouquinho de nós. Essa é

a mais bela responsabilidade da vida e a prova de

que as pessoas não se encontram por acaso.”

Charles Chaplin

13

À agência de fomento FAPESP,

Pelo apoio financeiro do processo nº 2012/03503-0.

Ao Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva, agradeço a orientação nestes dois anos de mestrado que

com certeza nunca falhou em seus conselhos e ensinamentos, que sempre buscou estar presente em

nossos trabalhos para que tudo sempre estivesse sendo realizado com cautela e inteligência, para que

no futuro eu consiga crescer profissionalmente sem nenhuma dificuldade, agradeço todas as dicas

sobre carreira profissional como orientador e colega de trabalho, por sempre estar disponível quando

precisei em momento de dificuldades no trabalho de mestrado, por me mostrar todo o mundo

científico que não havia conhecido antes, por estar sempre preocupado em fazer sempre o melhor,

que, no entanto, graças a você, nosso trabalho hoje já é um sucesso.

A Dra. Francieli Colussi, amiga, mãe, irmã, professora, toda minha gratidão por todo conhecimento e

experiências passados com toda “delicadeza” que só nós duas entendemos e todo carinho e respeito

durante nossos dias de trabalho. Pelo privilégio de tê-la ao meu lado e poder chegar todas segundas

feiras e compartilharmos nosso bom ou mau humor do final de semana, por estar sempre disponível

para sanar minhas dúvidas (que sempre são muitas), por fazer deste sonho um caminho mais florido

do que imaginei, você foi essencial para tudo ter dado tão certo em meu trabalho de mestrado,

obrigada Fran, por fazer parte de minha vida acadêmica e vida pessoal, que levo com certeza essa

amizade para a vida toda, afinal, você é do tipo de pessoa que passa em iluminada nossas vidas com

toda sua alegria e paz de espírito, sendo inevitável esquecer você, serei eternamente grata por tudo

que fez por mim.

A Professora Dra. Marcia Sperança, por todo companheirismo e amizade durante minha pesquisa, que

foi essencial para o ponta pé inicial dos primeiros dias de experimentos em nosso laboratório que

havia acabado de “nascer”, por ser a minha companheira de viagem e uma “roommate” muito especial,

obrigada Marcia por tudo que faz e fez para me ajudar, serei grata sempre a você, você é uma pessoa

muito especial para todos que a conhecem.

Ao Prof. Dr. Fabio Marcio Squina,

Por ceder os plasmídeos para o início de toda minha pesquisa de mestrado.

Ao Laboratório Nacional de Luz Síncontron (LNLS) e ao Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia

do Bioetanol (CTBE) e ao Laboratório de Física da Universidade de São Paulo (IFUSP), pela feliz

vivência, experiência e aprendizado.

14

As minhas amigas de republica, Amália Batista e Thais da Silva, que sem vocês tudo seria muito mais

difícil, morar com vocês foi a melhor experiência que consegui ter, mudar de uma cidade como

Campinas para Santo André, só nós três sabemos que não é fácil, mas com vocês ao meu lado consegui

me sentir em casa como uma família, vocês são muito especial para mim, adorei passar esses dois anos

conhecendo melhor cada uma, os stresses, os “siricuticos”, as manias. Obrigada meninas por me

deixarem fazer parte desse período de minha vida perto de vocês.

Aos meus amigos de pós-graduação, Daniele Ishihara, Samyr Machado e Mabel Uehara por todos os

momentos de desespero em busca dos novos aprendizados na UFABC.

A Juliana Sato, colega e amiga, agradeço a companhia dos longos dias no laboratório tomando zilhares

café para aguentar a jornada que às vezes era longa, mas também por ótimos momento de almoços

juntas, de preferência em um dia de “japonês”. Obrigada Ju por toda ajuda e por me ouvir nos

momentos de stress.

Ao Alex Sandro da Cruz Silva, por toda paciência no mundo comigo nos momentos de stress, nos finais

de semanas estudando e me ajudando a escrever e resolver listas de exercícios, por sempre me

incentivar para continuar em busca de meus sonhos, por sempre colocar para “cima” em momento de

tristeza, por estar ao meu lado em todos os melhores momento de minha vida e se deixar envolver

com todo o meu trabalho, minha rotina de vida sem em momento algum reclamar de qualquer coisa,

obrigada por ser essa pessoa companheira e muito paciente, você fez parte dessa minha caminhada,

você chegou comigo até aqui, você sempre será muito especial para mim.

Aos meus pais, Cleusa Regina B. Moura da Silva e Jaime Moura da Silva Filho, às minhas irmãs, Valéria

Moura da Silva, Valquiria Moura da Silva e Vanessa Moura da Silva, e grande amiga Maria Regina da

Cruz Silva, pela paciência, compreensão, apoio e incentivo na busca de um sonho.

15

RESUMO

A proteína endo-β-1,4-mananase da bactéria Thermotoga petrophila (TpMan) é

uma enzima hipertermoestável que catalisa a hidrólise de ligações β-1,4-manosídicas

em vários polissacarídeos contendo manana. Um recente estudo mostrou que a enzima

TpMan é composta de um domínio catalítico GH5 e um domínio de ligação ao

carboidrato CBM27 conectados através de um linker, entretanto, até o momento, a

estrutura tridimensional cristalográfica não foi determinada para a enzima completa.

Pouco se sabe sobre a conformação da enzima TpMan intacta como também o papel do

comprimento e flexibilidade do linker sobre o arranjo espacial dos domínio

constitutivos. Neste estudo, nós reportamos a primeira caracterização estrutural da

enzima TpMan completa utilizando a técnica de espalhamento de raios-X a baixos

ângulos (SAXS) combinada com a estrutura tridimensional dos domínios individuais

para elucidar o modelo de baixa resolução, as dimensões globais, e a flexibilidade desta

enzima modular em diferentes temperaturas. Nossos resultados são consistentes com um

linker que apresenta uma estrutura compacta e que ocupa um pequeno volume quando

comparado com seu grande número de resíduos de aminoácidos (102 resíduos de

aminoácidos). Além disso, a 20 ºC os resultados são consistentes com um modelo onde

a enzima TpMan é um monômero composto de três domínios e que apresenta nível de

flexibilidade molecular em solução. Mesmo a enzima intacta apresentando algum grau

de flexibilidade, existe uma conformação preferível, a qual pode ser descrita pelo

procedimento de modelagem de corpo rígido. Finalmente, os resultados indicam que a

enzima TpMan sofre uma transição dependente da temperatura entre estados

conformacionais de sua estrutura secundária regular. Nossos resultados sugerem que o

linker pode otimizar a geometria entre os outros dois domínios com respeito ao

substrato a altas temperaturas. Os estudos apresentados aqui devem proporcionar uma

base útil para futuros estudos biofísicos da enzima TpMan intacta.

Palavras chaves: β-mananase, manana, Thermotoga petrophila, hipertermoestável,

espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).

16

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABF – Tampão acetato, borato e fosfato

CbhA - celobiohidrolase A de Clostridium thermocellum

CD – Dicroísmo circular

cDNA - DNA complementar

DAM – Modelo atômico dummy

DLS – Espalhamento dinâmico de luz

Dmax – Dimensão máxima

EOM - método de otimização em conjunto

IPTG - isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo

LB - meio de cultura Luria Bertani

P(r) - Função de distribuição de distância

PDB – Banco de dados de proteínas

RBM – Modelo de corpo rígido

Rg – Raio de giro

RS – Raio hidrodinâmico

SAXS – Espalhamento de raios-X a baixo ângulo

SDS- PAGE - Gel de poliacrilamida contendo duodecil sulfato de sódio

T. petrophila - Thermotoga petrophila

TmMan - endo-β-1,4-mananase de Thermotoga marítima

TpMan - endo-β-1,4-mananase de T. petrophila

TpManCBM27 – Módulo de ligação ao carboidrato da TpMan

TpManGH5 – Domínio catalítico da TpMan

UV - Ultra-violeta

17

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Raio de giro (Rg) calculado por aproximação de Guinier em diferentes

concentrações roteicas.....................................................................................................47

Tabela 2. Resultados Gerais de SAXS para TpMan.......................................................49

Tabela 3. Modelos selecionados por HHPRED e PHYRE2 para os domínios central e

C-erminal.........................................................................................................................52

Tabela 4. Deconvolução do espectro de CD e predição da estrutura secundária...........56

18

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática da disposição das moléculas de celulose, lignina e

hemicelulose na parede celular das plantas e apresentação da estrutura da celulose

(fonte: www.genomics.energy.org). ............................................................................... 22

Figura 2. Estrutura da celulose formada pela união de moléculas de glicose através de

ligações β-1,4-glicosídicas. ............................................................................................ 23

Figura 3. Estrutura da hemicelulose. Fonte: biofueloutlook ......................................... 25

Figura 4. Estruturas de diferentes formas de mananas e as enzimas necessárias para a

sua hidrólise. A) Estrutura típica da manana linear, (C) galactomanana ramificada, (D)

glicomanana linear, e (F) galactoglicomanana ramificada. A cadeia de manana é

hidrolisada pela enzima β-mananase. Os produtos gerados pela ação da enzima β-

mananase: (B) manobiose, e (E) glicomanose, são em seguida hidrolisados pelas

enzimas: β-manosidase e β-glicosidase, respectivamente, para finalmente gerarem

monossacarídeos de manose, glicose e galactose 21

....................................................... 27

Figura 5. Enzima β-mananase de T. petrophila (TpMan). A) Sequência de aminoácidos

da enzima TpMan (Gene Bank: ABQ47550). Em laranja: peptídeo sinal (aminoácidos

de 1 a 20). Em vermelho: domínio catalítico (TpManGH5) (aminoácidos de 32-392).

Em verde: linker de 102 resíduos de aminoácidos. Em azul: domínio CBM27

(aminoácidos de 495 a 667). B) Estrutura cristalográfica do domínio catalítico da

enzima TpMan (TpManGH5) mostrando um enovelamento clássico tipo barril (β/)8

(PDB 3PZ9) 24

. ................................................................................................................ 31

19

Figura 6. Gel SDS-Page. TpMan e TpManGH5. Linha 1: Marcador de massa molecular

(KDa). Linha 2: Dominio catalítico (TpManGH5) 42 KDa. Linha 3: TpMan 73KDa. . 35

Figura 7. Atividade enzimática. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática da

enzima TpMan e de seu domínio catalítico (TpManGH5). ............................................ 41

Figura 8. Caracterização da enzima TpMan por espalhamento dinâmico de luz (DLS) a

pH6. (A) O raio hidrodinâmico (RS) da TpMan (em 20 ºC) em função da concentração

da proteína. (B) O raio hidrodinâmico (RS) da TpMan (8 mg/mL) em função da

temperatura. .................................................................................................................... 43

Figura 9. Caracterização da enzima TpMan e de seu domínio catalítico (TpManGH5)

por espalhamento dinâmico de luz (DLS) a pH 6. (A) O raio hidrodinâmico (RS) da

TpMan (a 0,5 mg/mL) em função da temperatura. (B) O raio hidrodinâmico (RS) do

TpManGH5 (a 0,5 mg/mL) em função da temperatura. ................................................. 44

Figura 10. Dados de SAXS coletados para TpMan a pH 6 em diferentes temperaturas.

Curvas experimentais de SAXS da enzima TpMan a 20 ºC (círculo aberto), 50 ºC

(triângulo aberto) e 65 ºC (quadrados aberto) sobreposta nas curvas de espalhamento

baseado no modelo de baixa resolução (DAMs, linhas sólidas). As curvas foram

deslocadas para melhor visualização. ............................................................................. 45

Figura 11. Gráfico de Guinier e curva experimental da função de distribuição de

distância. (A) Gráfico de Guinier (ln I versus q2) para o TpMan a 20 ºC (circulo aberto),

50 ºC (triângulo aberto) e 65 ºC (quadrados aberto). As curvas foram deslocadas para

melhor visualização. (B) P(r) experimental da TpMan a 20 ºC (linha vermelha), 50 ºC

(linha preta) e 65 ºC (linha azul). As curvas estão em escala para um máximo de 1,0

para uma pronta comparação. ......................................................................................... 46

20

Figura 12. Modelos de baixa resolução. (A) Envelope molecular da TpMan em solução

a 20 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos). As estruturas central e da

direita foram rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da

esquerda. (B) Envelope molecular da TpMan em solução a 50 ºC obtido pelo programa

DAMMIN (dammy átomos) As estruturas central e da direita foram rotacionadas 90º

no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda. (C) Envelope molecular da

TpMan em solução a 65 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos) As

estruturas central e da direita foram rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em

relação a estrutura da esquerda. ...................................................................................... 48

Figura 13. Gráfico de Kratky dos dados de SAXS para TpMan transformado como q2.I

vs q. (A) Medida a 20ºC (B) Medida a 50ºC (C) G Medida a 65ºC .............................. 50

Figura 14. Método de threading e modelagem molecular. Todos os modelos obtidos

pelo método de threading são de carboidrases de bactéria termofílica. O domínio central

(TpManIg-like) foi diretamente modelado pelo domínio X1 de CbhA. 27

TpManCBM27

foi diretamente modelado pelo CBM27 de TmMan. 26

.................................................. 53

Figura 15. Espectroscopia dicroísmo circular. (A) Espectro de CD coletado para

enzima TpMan a 20 ºC (linha preta), 50 ºC (linha tracejada) e 85 ºC (linha cinza). (B)

Espectro de CD para o TpManGH5 (linha preta) e TpMan (linha cinza) a pH 6 a 20 ºC.

........................................................................................................................................ 55

Figura 16. Modelagem por EOM. (A) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e

Dmax) produzidas pelo programa por dados experimentais de SAXS a 20ºC, enquanto as

linhas sólidas são as distribuições finais de parâmetros estruturais por modelos

selecionados pelo método de otimização em conjunto (EOM). 28

(B) As linhas

21

tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas pelo programa por dados

experimentais de SAXS a 50ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições finais de

parâmetros estruturais por modelos selecionados pelo método de otimização em

conjunto (EOM). 28

(C) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas

pelo programa por dados experimentais de SAXS a 65ºC, enquanto as linhas sólidas são

as distribuições finais de parâmetros estruturais por modelos selecionados pelo método

de otimização em conjunto (EOM). 28

............................................................................ 58

Figura 17. Ajuste para RBM e EOM. (A) Curvas experimentais de SAXS para TpMan

a 20 ºC (circulo aberto), 50 ºC (triângulos abertos) e 65 ºC (quadrados abertos)

sobreposto as curvas de espalhamento baseado no modelo de corpo rígido (RBMs, linha

sólida). (B) Ajuste (linha sólida) do melhor perfil determinado pela modelagem de

EOM dos dados de SAXS a pH 6 e 20 ºC (círculos abertos), 50 ºC (triângulos abertos) e

65 ºC (quadrados abertos). .............................................................................................. 59

Figura 18. Modelo de EOM. Modelo selecionado (cartoon) que obteve a mais alta

frequência na população otimizada sobreposta na nuvem de modelos. A estrutura

mostrada esta rotacionada 90º sobre o eixo longitudinal do modelo para produzir duas

orientações. ..................................................................................................................... 60

Figura 19. Modelo de mais alta frequência (EOM) e modelo de corpo rígido (RBM).

Sobreposição do modelo EOM (azul claro, verde claro e rosa) e RBM obtido utilizando

o programa CORAL (azul escuro, verde escuro e vermelho). ....................................... 61

22

1. Introdução

A biomassa lignocelulósica é a principal fonte de energia renovável disponível

na natureza, sendo composta de celulose, hemicelulose e lignina com uma proporção

aproximada de 2:1:1. 1-2

A figura 1 ilustra a disposição das moléculas de celulose,

hemicelulose e lignina na parede celular das plantas como também a estrutura da

celulose.

Figura 1. Representação esquemática da disposição das moléculas de celulose, lignina e hemicelulose na

parede celular das plantas e apresentação da estrutura da celulose (fonte: www.genomics.energy.org).

http://www.genomics.energy.org/

23

1.2 Celulose

A celulose (C6H10O5) é o biopolímero mais abundante na natureza com uma

produção estimada de 1014

toneladas por ano e de grande importância econômica, sendo

constituída por polissacarídeos lineares unidos por ligações glicosídicas β-1,4 entre

resíduos de D-glicose, conforme ilustrado na figura 2. 3 Todos os anos as plantas

produzem aproximadamente 180 bilhões de toneladas de celulose 4.

Figura 2. Estrutura da celulose formada pela união de moléculas de glicose através de ligações β-1,4-

glicosídicas.

Na parede celular, a celulose é produzida na forma de microfibrilas, onde cada

microfibrila corresponde em média a 36 cadeias lineares de glicose.5 Na estrutura

microfibrilar da celulose existem diferentes graus de ordenação, as regiões cristalinas,

muito ordenadas e as de menor ordenação, denominadas de regiões amorfas. A

cristalinidade é resultado da linearidade das moléculas de celulose, devido às ligações

de hidrogênio.6 As regiões de elevada cristalinidade são pouco acessíveis por solventes

e reagentes, e as regiões amorfas, no entanto, são mais acessíveis e mais susceptíveis a

reagentes químicos. Na estrutura da celulose, dois monômeros de glicose adjacentes são

ligados por ligações glicosídicas, onde a quebra da ligação química dá origem a uma

molécula de celobiose, a qual corresponde a duas unidades de glicose.

24

1.3 Lignina

A lignina é um dos principais componentes do tecido vegetal, fazendo parte da

lamela média e parede celular.7

É caracterizada por ser um polímero amorfo, de natureza

aromática e muito complexa. As ligninas possuem grande importância no transporte de

água, nutrientes e metabólitos, sendo responsável pela resistência mecânica dos

vegetais.7 A presença de ligninas em plantas superiores permite o crescimento vertical

acima do solo, pois ela proporciona o reforço estrutural necessário a isso, enquanto, por

exemplo, briófitas não conseguem atingir esse crescimento estrutural devido à falta de

lignina em sua parede celular.8 Além disso, as ligninas contribuem na defesa vegetal

contra diferentes tipos de estresses bióticos e abióticos, tais como o ataque de

microrganismos, deficiência mineral, déficit hídrico, radiação ultra-violeta (UV-B),

vento e baixas temperaturas.9 Por outro lado, as ligninas representam um problema no

aproveitamento agroindustrial de inúmeras espécies vegetais, por exemplo, com

impacto negativo na digestibilidade de gramíneas, produção de biocombustíveis de

segunda geração e na manufatura do papel.10

1.2 Hemicelulose

As hemiceluloses são heteropolissacarídeos lineares ou ramificados (Figura 3),

derivados de açúcares tais como D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, e L-

arabinose.11

As hemiceluloses são classificadas de acordo com sua unidade de açúcar

principal, e a maioria dos açúcares de suas cadeias principais no polímero de

hemicelulose estão conectados através de ligações glicosídicas β-1,4.

O teor de hemicelulose é variável para cada vegetal, tendo um valor médio de 25

a 30% do peso seco.12-13

A hemicelulose está localizada de forma intercalada nas

25

microfibrilas de celulose, em um estágio anterior à lignificação, o que promove a planta

elasticidade e flexibilidade impedindo que a microfibrilas de celulose se toquem, assim

as hemiceluloses fazem ligações fortes entre si, para manter ligações cruzadas através

de pontes de hidrogênio, em uma rede complexa.14

A distribuição de polissacarídeos na hemicelulose é variável para gimnospermas

e angiospermas. Em hardwoods, sua principal composição é de xilanas, no entanto

existe uma pequena porcentagem (3-5%) de glicomanana (glicose e manose), numa

proporção de 1:2. Em softwoods, a composição em sua maioria são de mananas, 15-16

principalmente galactoglicomanana, que contém resíduos de glicose, manose, galactose

numa proporção de 3:1:1 e glicomanana, com resíduos de manose e glicose na

proporção de 3:1.17

Figura 3. Estrutura da hemicelulose. Fonte: biofueloutlook

2. Hidrólise Enzimática

2.1 Polissacarídeos de manana

Comparado com xiloglicanos, pouco se conhece sobre o papel das mananas na

parede celular, assim, as mananas são raramente mencionadas ou são referidas como

26

"outros polissacarídeos". As mananas são estruturalmente mais diversas do que os

xiloglicanos, que são polissacarídeos relativamente homogêneos feitos de uma estrutura

de glicano substituídos com cadeias laterais que são ocasionalmente xilose estendidos

com resíduos de galactose. Polissacarídeos de mananas são classificados em quatro

categorias com base em sua estrutura de ligação e na presença de cadeias laterais de

galactose. 18

As mananas são estruturalmente importantes em paredes espessas e pode

desempenhar um papel na determinação da firmeza e flexibilidade do tecido vegetal, no

entanto, estão presentes apenas em quantidade mínimas em paredes de células de

parênquima de fruta. 18

A diversidade estrutural de mananas permite uma ampla gama de propriedades

físico-químicas, que por sua vez contribui para a funcionalidade da planta. A manana

pura é insolúvel em água fria e pH neutro. Quando alguns dos resíduos de manose são

substituídos por resíduos de glicose, como nas glicomananas, ou substituído por

galactose, como no galactomananas, a solubilidade em água aumenta.

Os padrões de resíduos de manose e glicose são geralmente aleatórios, e o grau

de substituição, bem como a distribuição dos substituintes galactosil varia

acentuadamente. 18

As mananas na parede celular da planta têm como função armazenagem de

polissacarídeos estruturais. Os polissacarídeos de armazenamento depositados no

interior da parede celular primária, mananas pura, galactomananas (em sementes) e

glicomananas (em bulbos ou tubérculos) são mais comuns. Eles são degradados e

metabolizados pelo embrião em crescimento. Em sementes, esse processo ocorre em um

período definido de embebição. 18

Dada à complexidade estrutural das hemiceluloses,

uma variedade de enzimas são necessárias para a sua hidrólise de uma forma eficiente

27

(Figura 4). 19

Neste contexto, o complexo enzimático que degrada manana desempenha

um papel-chave no fornecimento de energia para os organismos que os produzem, no

crescimento, maturação das plantas, na bioconversão de resíduos lignocelulósicos e

diversas aplicações, incluindo as indústrias de alimentos, celulose e papel. 20

Figura 4. Estruturas de diferentes formas de mananas e as enzimas necessárias para a sua hidrólise. A)

Estrutura típica da manana linear, (C) galactomanana ramificada, (D) glicomanana linear, e (F)

galactoglicomanana ramificada. A cadeia de manana é hidrolisada pela enzima β-mananase. Os produtos

gerados pela ação da enzima β-mananase: (B) manobiose, e (E) glicomanose, são em seguida hidrolisados

pelas enzimas: β-manosidase e β-glicosidase, respectivamente, para finalmente gerarem monossacarídeos

de manose, glicose e galactose [21].

28

2.2 Enzimas hidrolíticas: hemicelulases

A degradação da hemicelulose envolve a ação de enzimas frequentemente

classificadas de acordo com os distintos substratos. As xilanases rompem ligações entre

unidades monoméricas de xilose, enquanto as mananases atuam sobre ligações entre

moléculas de manose, respectivamente. As principais enzimas envolvidas na

biodegradação de polissacarídeos de manana são β-mananase (EC 3.2.178), β-

manosidase (EC 3.2.1.25) e β-glicosidase (EC 3.2.1.21). 16-21

A enzima β-mananse é

responsável por clivar ligações internas β-1,4 de polímeros de manana para produção de

novas cadeias terminais, enquanto que a β-manosidase cliva ligações β-1,4 manosideas

e libera a manobiose (dímero de manose) a partir da extremidade não redutora de

manose e monooligossacarídeos. 16-21

A enzima β-glicosidase hidrolisa ligações β-1,4-

D-glicopiranose de cadeias não redutoras de oligossacarídeos, tais como glicomanana e

galactomanana. Enzimas suplementares como acetil manana esterase (EC 3.1.1.6) e α-

galactosidase (EC 3.2.1.22) são necessárias para remover grupos laterais que podem

estar ligados sobre o polímero de manana, criando assim mais locais para subsequente

hidrólise enzimática. 16-21

A biodegradação da manana representa um passo chave para

várias aplicações industriais incluindo a deslignificação da polpa Kraft, processamento

de alimento e produção de biocombustíveis de segunda geração. 9-14

2.2.1 Enzimas termoestáveis com potencial biotecnológico

Enzimas termoestáveis, de modo geral, apresentam vantagens para a aplicação na

indústria, uma vez que processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas

sofrem menor risco de contaminação por microrganismos mesófilos, que são a maioria

em um ambiente industrial. 22

Por outro lado, temperaturas mais elevadas favorecem a

solubilidade dos substratos e de produtos, e aumentam as taxas de reação devido à

29

redução da viscosidade e por aumento do coeficiente de difusão dos substratos. 23

Outra

importante característica das enzimas termoestáveis é a sua maior resistência à ação de

proteases, uma vez que, quanto mais rígida for à molécula, menos sítios são expostos à

ação de proteólises. 24

A maior resistência à desnaturação por alguns solventes

orgânicos também é relatada como uma propriedade das enzimas termoestáveis. 25

A biodegradação de polímeros de celulose e hemicelulose envolve ação sinérgica de

uma variedade de enzimas hidrolíticas. Celulases e xilanases são enzimas que são

extensivamente estudadas devido a suas amplas aplicações industriais, principalmente

para o setor de biorrefinarias, contudo, enzimas que degradam manana tem recebido

menor atenção.

2.2 A enzima β-Mananase

Thermotoga petrophila RKU-1 (T. petrophila) é uma bactéria hipertermófila

isolada do reservatório de óleo Kubiki em Niigata (Japão). 23

O intervalo de temperatura

de crescimento é entre 47-88 ºC com um valor ótimo em 80 ºC. O intervalo de pH de

crescimento é entre 5-9 um valor ótimo em pH 7. Esta bactéria produz um repertório de

enzimas hipertermoestáveis de elevado potencial biotecnológico para aplicações

industriais, incluindo celulases, arabionofuranosidases, arabinases e mananases. 25-26

Para diversas aplicações industriais é necessário que as enzimas possuam alta atividade

e grande termoestabilidade. 22

A enzima hipertermoestável endo-β-1,4-mananase (EC 3.2.1.78), da bactéria

Thermotoga petrophila (TpMan) é composta por 667 resíduos de aminoácidos,

conforme figura 5A (Gene Bank: ABQ47550.1). Os primeiros 20 resíduos de

aminoácidos são um peptídeo sinal, o qual é removido depois da proteína ser exportada.

A enzima TpMan apresenta atividade ótima no intervalo de temperatura de 81-

30

93 ºC. 24

A enzima TpMan e seu domínio catalítico GH5, apresentam atividade máxima

em um intervalo de pH ácido entre 4,5-6,5. O domínio catalítico GH5 possui atividade

ótima em temperatura inferior quando comparado a TpMan. 24

Um recente estudo

reportou que a enzima TpMan consiste de um domínio catalítico GH5 (TpManGH5,

composto de 360 resíduos de aminoácidos) e um domínio de ligação ao carboidrato

(TpManCBM27, composto de 172 resíduos de aminoácidos) conectados através de um

linker (composto de 102 resíduos de aminoácidos). 24

Além disso, o mesmo estudo

apresenta a estrutura cristalográfica do domínio catalítico GH5 (Figura 5B).

Algumas estruturas de domínios catalíticos de β-mananases foram determinadas:

Thermobifida fusca KW3 (TfMan, PDB: 1BQC, 2MAN, 3MAN) 27

, Trichoderma reesei

(TrMAn, PDB: 1QNO, P, Q, R, S) 28

, Bacillus sp. JAMB-602 (PDB: 1WKY) 29

,

Lycopersicon esculentum (LeMan, PDB: 1RH9) 30

e Bacillus agaradhaerens (BaMan,

PDB: 2WHJ). 31

A enzima endo-β-1,4-mananase, geralmente denominada β-mananase,

catalisa a hidrólise de ligações β-1,4-manosideo em vários polissacarídeos contendo

manana, tais como glicomananas e galactomananas.32

A degradação deste

polissacarídeo representa um passo chave para várias aplicações industriais incluindo

deslignificação da polpa Kraft, processamento de alimento 33

e produção de

biocombustíveis de segunda geração.22

Em geral, esses processos biotecnológicos, como exemplo, o pré-tratamento da

biomassa, são realizados em condições extremas de pH, osmolaridade e temperatura.

Portanto, β-mananases que se mostram estáveis e funcionais a altas temperaturas

oferecem substancial vantagens tecnológicas e econômicas.

31

(A)

MRRFMFILSIVALSFVLFADEFVRVENGKFVLNGKEFRFIGSNNYYMHYKSNRMIDSVLESA

RDMGIKVLRIWGFLDGESYCRDKNTYMHPEPGVFGVPEGISNAQNGFERLDYTIAKAKEL

GIKLIIVLVNNWDDFGGMNQYVRWFGGTHHDDFYRDERIKEEYKKYVSFLINHVNVYTGV

PYREEPTIMAWELANELRCETDKSGNTLVEWVKEMSSYIKSLDPNHLVAVGDEGFFSNYEG

FKPYGGEAEWAYNGWSGVDWKKLLSIETVDFGTFHLYPSHWGVSPENYAQWGAKWIED

HIKIAKEIGKPVVLEEYGIPKSAPVNRTAIYRLWNDLVYDLGGDGAMFWMLAGIGEGSDRD

ERGYYPDYDGFRIVNDDSPEAELIREYAKLFNTGEDIREDTCSFILPKDGMEIKKTVEVRAG

VFDYSNTFEKLSVKVEDLVFENEIEHLGYGIYGFDLDTTRIPDGEHEMFLEGHFQGKTVKD

SIKAKVVNEARYVLAGKVDFSSPEEVKNWWNSGTWQAEFESPDIEWNSEVGNGALQLNVK

LPGKSDWEEVRAARKFEKLSECEILEYDIYIPDVEGLKGRLRPYAVLNPGWVKIGLDMNNT

SVESAEIVTFGGKEYRKFHVRIEFDKTAGVNELHIGIVGDHLKYNGPIFIDNVKLYTKEAE

(B)

Figura 5. Enzima β-mananase de T. petrophila (TpMan). A) Sequência de aminoácidos da enzima TpMan

(Gene Bank: ABQ47550). Em laranja: peptídeo sinal (aminoácidos de 1 a 20). Em vermelho: domínio

catalítico (TpManGH5) (aminoácidos de 32-392). Em verde: linker de 102 resíduos de aminoácidos. Em

azul: domínio CBM27 (aminoácidos de 495 a 667). B) Estrutura cristalográfica do domínio catalítico da

enzima TpMan (TpManGH5) mostrando um enovelamento clássico tipo barril (β/)8 (PDB 3PZ9) 24

.

32

3. Objetivos

Os objetivos do presente estudo são aumentar a compreensão da relação entre a

estabilidade, flexibilidade e atividade enzimática da proteína endo-β-1,4-mananase

(TpMan) da bactéria hipertermófila Thermotoga petrophila. A enzima TpMan será

analisada empregando-se técnicas biofísicas como também ferramentas de

bioinformática. Assim, pretende-se disponibilizar o primeiro modelo de baixa resolução

para a enzima TpMan empregando-se a técnica de espalhamento de raios-X a baixos

ângulos (SAXS).

33

4. Materiais e métodos

4.1 Materiais

No presente trabalho foi utilizado: coluna de resina de níquel ácido nitrilotriácetico

(Ni-NTA), imidazol, canamicina, meio de cultura Luria-Bertani (LB), indutor isopropil-

β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e galactomanana como substrato para teste de

atividade, todos adquiridos da empresa Sigma-Aldrich. Todos os reagentes químicos

usados neste estudo são de alto grau de pureza analítica.

4.2 Métodos

4.2.1 Expressão e purificação da proteína TpMan e TpManGH5

4.2.1.1 Expressão da proteína TpMan e TpManGH5

Plasmídeos pET28a(+) contendo o cDNA da enzima β-mananase de T. petrophila

(TpMan) e de seu domínio catalítico isolado (TpManGH5, resíduos de 32-393) foram

obtidos em colaboração com o Dr. Fabio Marcio Squina do Laboratório Nacional de

Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE, Campinas).26

Para a expressão das proteínas recombinantes, foi empregado à linhagem bacteriana

BL21(DE3), que possui a RNA polimerase do fago T7 sob controle do promotor lac,

induzido por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo). Nessa linhagem, a adição de

IPTG leva à síntese da RNA polimerase, que reconhece o promotor do fago T7 e

transcreve o cDNA de interesse em grandes quantidades. A linhagem BL21(DE3)

competente foi transformada através de choque-térmico, na presença de cloreto de

cálcio, com o vetor de expressão contendo o cDNA da TpMan ou TpManGH5, onde

para as duas proteínas, o gene que codifica são precedidos por uma sequência

codificadora que permite a expressão da proteína fusionada a uma cauda de histidina

(6xHis) na região N-terminal.

34

Em ambos os casos, as bactérias foram plaqueadas em meio LB (1% triptona, 1%

NaCl, 0,5% extrato de levedura) contendo canamicina (50 g/mL) e incubadas a 37 ºC

de 16-18 horas. Em seguida, as colônias isoladas da placa foram inoculadas em meio

LB líquido contendo canamicina (50 g/mL), e os pré-inóculos foram incubados de 16-

18 horas a 37 ºC e agitação de 200 rpm. Posteriormente, os pré-inóculos foram diluídos

a 2% em 500 mL de meio LB líquido contendo canamicina (50 g/mL). As culturas

foram mantidas a 37 ºC e 200 rpm até que a densidade óptica a 600 nm atingiu um valor

de 0,5, quando foi realizado a indução com IPTG em concentração final de 0,5 mM.

Após a indução, as culturas foram mantidas a 37 ºC durante 4 horas.

4.2.1.2 Purificação da proteína TpMan e TpManGH5

Após a etapa de indução, as células foram coletadas por centrifugação (5,000xg, 10

minutos, 4 ºC) e em seguida ressuspensas em 20 mM de tampão ABF (Acetato/Borato/

Fosfato) ajustado no pH 7,4. Após a ressuspensão, as células foram sonicadas em gelo

(8 vezes, cada uma com 30 segundos e com intervalo de 1 minuto) e subsequentemente

centrifugados a 10,000xg durante 30 minutos a 4 ºC. Em seguida, o sobrenadante foi

separado da parte insolúvel.

Na primeira etapa de purificação, o sobrenadante obtido foi incubado a 70 ºC por 30

minutos, para eliminar por aquecimento grande quantidade de proteínas mesófilas

indesejáveis. Em seguida os extratos foram centrifugados a 10,000xg durante 30

minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi novamente separado da parte insolúvel, a qual

contém a proteína de interesse. Esta etapa de purificação é de grande importância, pois

conseguimos eliminar grande quantidade de proteínas que não são de interesse para o

estudo, pois a temperatura favorece apenas a TpMan e o TpManGH5 que são enzimas

hipertermoestáveis.

35

Na segunda etapa da purificação, o sobrenadante foi submetido a uma cromatografia

por afinidade em coluna imobilizada de níquel (His Trap). Em ambos os casos, as

proteínas foram eluídas com imidazol em concentrações de 150 e 500 mM em 20mM de

tampão ABF ajustado no pH 7,4. A pureza das frações obtidas no processo de

purificação foram analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

desnaturante corado com azul de coomassie (Figura 6).

Finalmente, as proteínas obtidas (TpMan e TpManGH5) foram dialisadas em 20

mM de tampão ABF ajustado no pH 7,4 e concentradas a 4 mg/mL e armazenadas no

freezer -80ºC. As concentrações das proteínas foram determinadas por absorção a 280

nm e utilizando-se o coeficiente de extinção molar baseado na composição dos

aminoácidos. Os coeficientes utilizados foram ε280nm = 156,900 M-1

cm-1

para TpMan e

ε280nm = 108,875 M-1

cm-1

para TpManGH5.

Figura 6. Gel SDS-Page. TpMan e TpManGH5. Linha 1: Marcador de massa molecular (KDa). Linha 2:

Dominio catalítico (TpManGH5) 42 KDa. Linha 3: TpMan 73KDa.

36

4.2.2 Medidas de atividade enzimática

A atividade da enzima endo-β-1,4-mananase foi determinada usando como

substrato galactomanana 1% dissolvido em tampão ABF. Os ensaios de atividade da

TpMan e do TpManGH5 foram realizados no intervalo de temperatura de 20 ºC até 85

ºC em tampão ABF ajustado para o pH 6. A reação para cada experimento foi realizado

em uma placa de ELISA contendo uma mistura de 20 μL de enzima diluída (1,5 μM)

com 80 μL de substrato por 10 minutos. A reação foi parada pela a adição do reagente

DNS (ácido 3,5-dinitro-salicílico) e em seguida foi fervido a 100 ºC por 5 minutos e

então a atividade foi quantificada por método de espectroscopia de luz a 540 nm. 30

Uma unidade de atividade da enzima endo-β-1,4-mananase foi definida com uma

quantidade de enzima necessária para hidrolisar o equivalente a 1 μmol de manose por

minuto. Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e foi utilizado a média

dos valores obtido.

4.2.3 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)

O tamanho das enzimas purificadas TpMan e TpManGH5 foram caracterizados

através de técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) utilizando um equipamento

Nano-ZetaSizer (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK). Este sistema emprega um

laser com comprimento de onda de 633 nm a um ângulo fixo de 173°. As concentrações

de TpMan e TpManGH5 utilizadas estavam no intervalo de 0,5 e 8 mg/mL em 20mM

de tampão ABF ajustado em pH 6. As amostras foram filtradas com uma membrana de

poro 0,22 µm (Millipore, USA) e centrifugadas a 16,000xg por 10 minutos em

temperatura ambiente, e subsequentemente colocada na cubeta para medição. As medias

foram realizadas em um intervalo de temperatura de 20 ºC até 85 ºC e para cada

37

temperatura as amostras foram equilibradas por 2 minutos antes de cada medida. Foram

coletados para cada temperatura, múltiplos registros do perfil de DLS.

4.2.4 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS)

Para as medidas de SAXS, a proteína TpMan foi medida em várias concentrações

(2, 4 e 8 mg/mL em 20 mM tampão ABF ajustado em pH 6) e em três diferentes

temperaturas (T = 20, 50 e 65 ºC). As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a

16,000xg (em temperatura ambiente) e filtradas em filtro 0,22 μm (Milipore, USA)

antes de cada medida, para remover possíveis agregados ou partículas. Não foi

detectado efeito de concentração nas amostras.

As medidas foram realizadas em um equipamento Bruker-NanostarTM

localizado no

Instituto de Física da Universidade de São Paulo. Este equipamento é adaptado com

fonte de microfoco Genix3D acoplada com óptica multicamadas Fox3D e dois

conjuntos de fendas de espalhamento todos fornecidos pela XenocsTM

. As amostras

foram mantidas em um capilar de quartzo em uma caixa de ácido inoxidável, o qual

permite a limpeza adequada e reaproveitamento do porta amostra, permitindo que a

subtração do tampão seja precisa.

O espalhamento medido para a água foi utilizado para normalizar os dados para uma

escala absoluta. A temperatura da amostra foi controlada pelo sistema Peltier. Vários

frames de 900 s foram coletados para cada amostra controlando os danos de radiação. O

comprimento de onda do feixe monocromático de raios-X utilizado foi λ = 1,54 Å

(Cukα) e a distância da amostra para o detector foi 0,67 m, fornecendo um intervalo de q

(vetor de espalhamento) de 0,008 a 0,35 Å-1

, onde q = 4 π sin (θ)/λ e θ é metade do

ângulo de espalhamento.

38

O espalhamento 2D das amostras foi coletado por um detector Vantec2000TM

e a

integração do padrão de SAXS foi realizada usando o software Bruker SAXS. O

tratamento dos dados, a normalização para escala absoluta e procedimentos para média

foram realizados usando o programa SUPERSAXS (Oliveira e Pedersen, unpublished).

4.2.5 SAXS - Análise de dados

Os raios de giro (Rg) das moléculas foram determinadas por dois procedimentos

independentes: i) empregando a equação de Guinier I(q) = I(0).exp[(-q2.Rg

2)/3], q <

1,3/Rg, e ii) através de transformada indireta de Fourier utilizando o programa GNOM

(http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/) [35]. A função de distribuição de distância P(r)

também foi avaliada com o programa GNOM, obtendo-se o diâmetro máximo (Dmax).

4.2.6 Modelos de baixa resolução obtidos dos dados de SAXS

Modelos de átomos dummy (DAMs) foram calculados a partir das curvas

experimentais de SAXS pelos procedimentos ab initio implementados no programa

DAMMIN (http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/). 36

Os modelos de baixa resolução

obtidos, para cada caso, foram comparados utilizando-se o programa DAMAVER [37] e

o modelo mais representativo foi utilizado. A resolução (R) foi estimada pela equação R

= 2π/qmax. O programa CRYSOL (http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/) foi utilizado

para gerar curvas de espalhamento teóricas para o DAMs [34]. O Rg e a Dmax foram

determinados com o mesmo programa.

4.2.7 Modelo de corpo rígido e modelagem por EOM

Os modelos de corpo rígido da TpMan foram determinados com o programa

CORAL (http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/) [38]. O programa CRYSOL foi usado

http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/




39

para gerar as curvas de espalhamentos teóricas para os modelos de corpo rígido. Os

modelos de corpo rígido e os modelos ab initio (DAMs) foram sobrepostos utilizado-se

o programa SUPCOMB. 39

Adicionalmente, modelagem estrutural foi realizada

empregando o método de otimização em conjunto (EOM) descrito por Bernardo et al. 40

A sobreposição das figuras foram geradas pelo programa PyMOL (www.pymol.org).

4.2.8 Modelagem molecular (por homologia)

Os programas de detecção de homologia HHPRED 41

e PHYRE2 42

foram utilizados

para realizar a pesquisa de homólogos para os últimos 274 resíduos de aminoácidos da

TpMan no sítio do Protein Data Bank (PDB) com parâmetros padrão. Modelos

moleculares por homologia para TpManCBM27 e TpManIg-like foram construídos

usando-se modelos homólogos através da metodologia implementada no programa

Modeller. 43

O alinhamento do TpManCBM27 contra a sequência do CBM27 da enzima

endo-beta-1,4-mananase de Thermotoga marítima foi inicialmente usada como entrada

para o programa Modeller, junto com as coordenadas atômicas da estrutura

cristalográfica (PDB 1OH4). O alinhamento da TpManIg-like contra a sequência do

domínio X1 da celobiohidrolase A de Clostridium thermocellum foi inicialmente usado

como entrada para o programa Modeller, juntos com as coordenadas atômicas da

estrutura cristalográfica (PDB 3PZ9).

4.2.9 Métodos computacionais para predição de estrutura secundária

O coeficiente de extinção teórico, baseado na composição de aminoácidos (Gene

Bank: ABQ47550.1), para TpMan e TpManGH5 foram obtidos utilizando-se a

ferramenta ProtParam disponível no servidor ExPasy (www.expasy.org). Os programas

http://www.pymol.org/

http://www.expasy.org/

40

utilizados para gerar a predição da estrutura secundária foram: PHD 44

, PSIPRED 45

,

BALDIG 46

e PORTER. 47

4.2.10 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD)

Os espectros de dicroísmo circular foram coletados usando-se um

espectropolarímetro Jasco J-815 com um dispositivo de controle de temperatura Peltier.

As concentrações das proteínas TpMan e TpManGH5 foram 5 µM em tampão 20 mM

ABF ajustado em pH 6. Todos os dados foram coletados usando-se uma cubeta de

quartzo de 0,1 cm e os espectros foram obtidos no intervalo de comprimento de onda

entre 195 a 250 nm. Para a enzima TpMan, as medidas de CD foram coletadas em

diferentes temperaturas (T= 20, 65 e 85 ºC). Foi realizada uma média de oito

acumulações, utilizando um scanning de 100 nm min -1

, com uma linha espectral de 1

nm, e com um tempo de resposta de 0,5 s. A leitura foi realizada igualmente para o

tampão e os espectros coletados foram subtraídos para cada experimento. Espectros

foram transformados para elipticidade molar [] usando a massa molecular média dos

resíduos e a concentração. Para obter informação estrutural, o espectro de CD foi

deconvoluído usando-se os programas SELCON 48

, CONTIN 49

, CDS 50

, e K2D3 51

em

diferentes bases de dados.

41

5. Resultados e Discussão

5.1.1 Perfil da atividade em função da temperatura

A atividade de uma enzima é dependente do pH e da temperatura, condições que

envolve mudanças no enovelamento, conformação e protonação da enzima. Como

primeiro passo dos nossos estudos, a atividade da TpMan e do TpManGH5 foram

analisadas em função da temperatura utilizando-se como substrato galactomanana

(Figura 7). Nossos resultados mostram que, nas condições de nosso estudo (pH 6), a

atividade enzimática da TpMan aumenta com a elevação da temperatura. Um

comportamento similar foi também observado no caso do TpManGH5. Entretanto,

TpManGH5 mostrou uma redução significativa da atividade enzimática a 85 ºC quando

comparado com a TpMan (Figura 7). Assim, nossos resultados indicam que a TpMan é

mais termotolerante que o TpManGH5. Os resultados apresentados aqui são

consistentes com os resultados publicados recentemente para TpMan.24

Figura 7. Atividade enzimática. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática da enzima TpMan e

de seu domínio catalítico (TpManGH5).

42

5.1.2 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)

Espalhamento dinâmico de luz (DLS) fornece uma rápida e conveniente forma

para monitorar o tamanho de proteínas em solução como também para investigar

possíveis agregações em altas temperaturas ou em altas concentrações.52

Como pode ser

observado na figura 8, o raio hidrodinâmico (RS) obtido para TpMan foi praticamente

independente da concentração de proteína no intervalo de 0,5 a 8 mg/mL a 20 ºC e pH 6

(Figura 8 A). Após a incubação em 85 ºC (0,5 mg/mL) não foi evidenciado precipitação

da enzima e a solução permaneceu límpida. O valor médio determinado para o RS da

enzima TpMan pelo método de DLS foi 36 ± 2 Å, o qual corresponde a uma massa

molecular de 68 ± 6 kDa, consistente com a massa molecular esperada de 73kDa.

Contudo, quando a TpMan em pH 6 e 8 mg/mL foi incubada em valores de temperatura

acima de 65 ºC o RS aumentou significativamente sugerindo uma tendência a formação

de agregados (Figura 8 B). 52

Após a incubação a 85 ºC (8 mg/mL) a solução da enzima

TpMan ficou visivelmente túrbida concluindo-se que agregados foram formados.

43

Figura 8. Caracterização da enzima TpMan por espalhamento dinâmico de luz (DLS) a pH6. (A) O raio

hidrodinâmico (RS) da TpMan (em 20 ºC) em função da concentração da proteína. (B) O raio

hidrodinâmico (RS) da TpMan ( 8 mg/mL) em função da temperatura.

Os valores de RS obtidos para o TpManGH5, foram praticamente independentes

da temperatura no intervalo de temperatura de 20 a 75 ºC em pH 6 a 0,5 mg/mL (Figura

9 B). A média para o RS determinado para TpManGH5 pelo método de DLS foi 28 ± 2

44

Å, o qual corresponde a uma massa molecular de 38 ± 5 kDa, totalmente consistente

com a massa molecular esperada de 42kDa. Assim, quando o TpManGH5 em pH 6 e

0,5 mg/mL foi incubado em temperaturas acima de 75 ºC o RS aumentou

significativamente, sugerindo a tendência de formação de agregados (Figura 9 B).

Novamente, após a incubação a 85 ºC (0,5 mg/mL) a solução do TpManGH5 ficou

visivelmente túrbida e concluindo-se que precipitados foram formados.

Figura 9. Caracterização da enzima TpMan e de seu domínio catalítico (TpManGH5) por espalhamento

dinâmico de luz (DLS) a pH 6. (A) O raio hidrodinâmico (RS) da TpMan (a 0,5 mg/mL) em função da

temperatura. (B) O raio hidrodinâmico (RS) do TpManGH5 (a 0,5 mg/mL) em função da temperatura.

45

5.1.3 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS)

Para obter informações sobre a forma da estrutura terciária, a enzima TpMan foi

submetida à análises empregando-se SAXS. A figura 10 mostra as curvas de

espalhamento de raios-X para TpMan a pH 6 medidas a 8 mg/mL em três diferentes

temperaturas (T = 20, 50 e 65 ºC) . As curvas de espalhamento obtidas a 80 ºC e a alta

concentração mostraram efeitos de agregação e não foram utilizadas para as análises.

Figura 10. Dados de SAXS coletados para TpMan a pH 6 em diferentes temperaturas. Curvas

experimentais de SAXS da enzima TpMan a 20 ºC (círculo aberto), 50 ºC (triângulo aberto) e 65 ºC

(quadrados aberto) sobreposta nas curvas de espalhamento baseado no modelo de baixa resolução

(DAMs, linhas sólidas). As curvas foram deslocadas para melhor visualização.

O gráfico de Guinier exibiu um comportamento linear, indicando excelente

monodispersividade da TpMan e que as partículas estão livres de agregados (Figura 11

A). Além disso, a variação entre os valores de raios de giro para diferentes

concentrações proteicas em temperatura igual, são insignificantes (Tabela 1). Os raios

de giro (Rg) determinados por aproximação de Guinier em 20, 50 e 65 ºC foram 32 ± 1

46

Å, 34 ± 1 Å e 36 ± 1 Å, respectivamente. A função de distribuição de distancia, P(r), foi

avaliada por transformada indireta de Fourier com o programa GNOM 35

como

mostrado na figura 11 B. Os perfis obtidos para 20, 50 e 65 ºC possuem forma similar e

dimensão máxima (Dmax) de 105 ± 5 Å, 110 ± 5 Å e 115 ± 5 Å, respectivamente. Os

valores de Rg determinados para TpMan a 20, 50 e 65 ºC usando o programa GNOM

foram 32,5 ± 0,1 Å, 34,9 ± 0,2 Å e 36 ± 0,2 Å, respectivamente.

Figura 11. Gráfico de Guinier e curva experimental da função de distribuição de distância. (A) Gráfico de

Guinier (ln I versus q2) para o TpMan a 20 ºC (circulo aberto), 50 ºC (triângulo aberto) e 65 ºC

(quadrados aberto). As curvas foram deslocadas para melhor visualização. (B) P(r) experimental da

TpMan a 20 ºC (linha vermelha), 50 ºC (linha preta) e 65 ºC (linha azul). As curvas estão em escala para

um máximo de 1,0 para uma pronta comparação.

47

Tabela 1. Raio de giro (Rg) calculado por aproximação de Guinier em diferentes concentrações

proteicas.

Conc. (mg/mL) Rg (Å) a 20°C Rg (Å) a 50°C Rg (Å) a 65°C

2 32 ± 1 33 ± 1 36 ± 1

4 33 ± 1 34 ± 1 35 ± 1

8 32 ± 1 34 ± 1 36 ± 1

A forma molecular de baixa resolução da TpMan foi determinada através dos

dados de espalhamento de raios-X utilizando-se o programa DAMMIN 36

para

visualizar a forma da enzima em solução em diferentes temperaturas. Os resultados dos

envelopes de baixa resolução para as temperaturas estudadas são mostrados na Figura

12. Para cada caso, dez independentes simulações ab initio foram realizadas sem impor

restrições de simetria e os modelos obtidos foram capazes de reproduzir as curvas

experimentais. Os resultados, em cada caso, foram todos comparados utilizando o

programa DAMAVER 37

e o modelo mais representativo é mostrado na Figura 12.

48

Figura 12. Modelos de baixa resolução. (A) Envelope molecular da TpMan em solução a 20 ºC obtido

pelo programa DAMMIN (dammy átomos). As estruturas central e da direita foram rotacionadas 90º no

eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda. (B) Envelope molecular da TpMan em solução

a 50 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos) As estruturas central e da direita foram

rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda. (C) Envelope molecular da

TpMan em solução a 65 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos) As estruturas central e da

direita foram rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda.

A reconstrução do modelo de baixa resolução obtido para a TpMan a 20 ºC em pH

6, restaurado a 18 Å de resolução, mostra uma molécula alongada em forma de L, com

um Dmax de aproximadamente 105 Å. Contudo, o modelo de baixa resolução obtido para

TpMan a 65ºC e pH 6, restaurado a 18 Å de resolução, mostrou uma forma duas vezes

mais alongada que larga, com um Dmax de aproximadamente 115 Å. Um resumo de

todos os resultados de SAXS descritos neste trabalho estão mostrados na Tabela 2.

49

Tabela 2. Resultados Gerais de SAXS para TpMan

Parâmetros/amostra 20°C

Experimental DAM RBM EOM

Rg (Å)

32 ± 1 (Guinier)

32,50 ± 0,14 (GNOM) 32,97 32,30 31,14

Dmax(Å) 105 ± 5 103,90 104,70 102,70

Resolução (Å)

18

- - -

x/x2 - 1,6/2,6 1,8/3,2 1,9/3,36

50°C


Rg (Å)

34 ± 1 (Guinier)

34,87 ± 0,15 (GNOM)

35,26 33,99 33,22

Dmax(Å) 110 ± 5 110,60 111,20 105,17

Resolução (Å)

18

x/x2 - 1,1/1,2 1,3/1,7 2,4/5,8

65°C


Rg (Å)

36 ± 1 (Guinier)

35,98 ± 0,19 (GNOM)

36,41 34,95 34,31

Dmax(Å) 115 ± 5 116,20 118,20 108,63

Resolução (Å)

18

x/x2 - 1,3/1,7 1,5/2,3 2,1/4,4

5.1.4 Gráfico de Kratky e flexibilidade

Informações sobre a compactação global da enzima TpMan pode ser obtida

através de dados de SAXS utilizando-se o gráfico de Kratky (q2.I vs q.)

53-54 A figura 13

A mostra a curva para TpMan a 20 ºC (pH 6) que apresenta um máximo bem definido

(q < 0,15 Å-1

), entretanto, a curva não decai perto de zero em valores altos de q,

apresentando uma sutil linha de base elevada. Este resultado sugere que a TpMan deve

exibir algum grau de flexibilidade a 20 ºC e pH 6, provavelmente devido a flexibilidade

inerente entre os domínios. Os resultados para 50 ºC e pH 6, mostraram que a curva

apresenta também um máximo bem definido e uma diminuição sutil na linha de base

50

quando comparado com os resultados para a mesma enzima a 20 ºC (Figura 13 B).

Curiosamente, a 65 ºC e pH 6 (Figura 13 C) a curva para TpMan decai para zero para

elevados valores de q, sugerindo que a molécula é menos flexível em solução a 65 ºC

quando comparado com a mesma enzima a 20 ºC.

Figura 13. Figura 13. Gráfico de Kratky dos dados de SAXS para TpMan transformado como q2.I vs q. (A)

Medida a 20 °C (B) Medida a 50 °C (C) Medida a 65 °C.

51

5.1.5 Modelagem molecular por homologia

Um recente estudo reporta a estrutura cristalográfica do domínio catalítico 24

,

entretanto, até o momento, não existe uma estrutura tridimensional determinada por

métodos experimentais para TpMan intacta. Assim, para possibilitar a modelagem da

estrutura intacta, a estrutura tridimensional dos últimos 274 resíduos de aminoácidos da

enzima TpMan foi modelada a partir de ferramentas de bioinformática. Como ilustrado

na figura 14 e Tabela 3, ambos os métodos de threading utilizados (HHPRED e

PHYRE2) indicam dois domínios distintos. O domínio C-terminal (TpManCBM27)

possui alta identidade sequencial e confiabilidade, em ambos os programas utilizados,

quando comparados com CBM27 da enzima endo-β-1,4-mananase de Thermotoga

marítima (TmMan) (Tabela 3).

52

Modelos selecionados por HHPRED e PHYRE2 para os domino central e C-terminal

Domínio central

CATH 2.60.40 Topologia: imunoglobulina-like

SCOP b.1.2.1 Enovelamento: imunoglobulina-like beta-sanduíche

Super família: Fibronectin tipo III

PDBs 3TP4, 2X2Y, 2BVY, 2BVT HHPRED PHYRE2

Organismo Nome Score Ident % Prob E-value Conf Ident %

Celulomas fimi MAN26A 111.84 18 99,07 2,8 98,7 18

PDBs 3PE9, 3PDD, 3PDG

Organismo Nome HHPRED PHYRE2

Clostridium thermocelum Módulo X1 Score Ident % Prob E-value Conf Ident %

45,99 14 96,9 0,01 95,9 13

Domínio C-terminal

CATH 2.60.120.260 Topologia: imunoglobulina-like

SCOP b.18.1.18 Enovelamento: imunoglobulina-like beta-sanduíche

Super família: Fibronectin tipo III

PDBs 1OH4, 1OF3, 1OF4 HHPRED PHYRE2

Organismo Nome Score Ident % Prob E-value Conf Ident %

Thermotoga maritima MAN26A 111.84 18 99,07 2,8 98,7 18

PDBs

Organismo Nome HHPRED PHYRE2

Caldicelulosiruptor sacharoliticus Módulo X1 Score Ident % Prob E-value Conf Ident %

45,99 14 96,9 0,01 95,9 13

Tabela 3. Modelos selecionados pelos programas HHPRED e PHYRE2 para os dominios central e C-terminal

53

Portanto, TpManCBM27 foi diretamente modelado (figura 14) através da

estrutura cristalográfica resolvida 55

do CBM27 de TmMan que apresenta 88% de

identidade sequencial quando comparada com TpManCBM27. Entretanto, o domínio

central (linker) possui baixa identidade sequencial, em ambos os programas, quando

comparado com o domínio X1 da celobiohidrolase A de Clostridium thermocellum

(CbhA).56

Apesar dos resultados apresentarem baixos valores de identidade sequencial,

é evidente o alto nível de confiabilidade dos modelos selecionados (Tabela 3). Deste

modo, o domínio central foi modelado através da estrutura cristalográfica do domínio

X1 de CbhA (figura 14) que apresenta 14% de identidade sequencial e 97%

confiabilidade. O modelo molecular obtido para o domino central é estruturalmente

muito similar ao domínio immunoglobulin-like β-sandwich (Ig-like), portanto

adotaremos a nomenclatura TpManIg-like para este domínio.

Figura 14. Método de threading e modelagem molecular. Todos os modelos obtidos pelo método de

threading são de carboidrases de bactéria termofílica. O domínio central (TpManIg-like) foi diretamente

modelado pelo domínio X1 de CbhA. 27

TpManCBM27 foi diretamente modelado pelo CBM27 de

TmMan. 26

54

5.1.6 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD)

A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) foi usada para TpMan e TpManGH5

e avaliar seus enovelamentos em termos de estrutura secundária e realizar comparações

(figura 15). O espectro de CD para TpManGH5 coletado a 20 ºC (pH 6) é caracterizado

por ter uma banda positiva em 195 ± 1 nm e duas bandas negativas em 210 ± 1 nm e

220 ± 1 nm, e um cruzamento negativo para o positivo em 203 ± 1 nm (Figura 15 B).

Estas bandas são tipicamente encontradas em estruturas com grande quantidade de α-

hélice em sua estrutura secundária. Isto é diferente do observado para o espectro de CD

da TpMan, o qual não mostrou dois mínimos bem definidos. O espectro de CD para

TpMan coletado a pH 6 em três diferentes temperaturas são mostrados na figura 15 A.

Os dados indicam que a estrutura secundária da enzima não mudou significativamente

em resposta ao aumento de temperatura de 20 ºC para 85 ºC.

55

Figura 15. Espectroscopia dicroísmo circular. (A) Espectro de CD coletado para enzima TpMan a 20 ºC

(linha preta), 50 ºC (linha tracejada) e 85 ºC (linha cinza). (B) Espectro de CD para o TpManGH5 (linha

preta) e TpMan (linha cinza) a pH 6 a 20 ºC.

As porcentagens de α-hélice, folhas-β e coils (estruturas secundárias irregulares)

foram obtidas por deconvolução dos espetros experimentais usando quatro métodos

independentes e foi expresso como uma média e um desvio padrão. No caso do

TpManGH5, a deconvolução do espectro forneceu os seguintes valores médios para

56

estrutura secundária: 42 ± 4% α-hélice, 16 ± 2% folhas-β e 42 ± 5% coil (estruturas

irregulares) conforme tabela 4. Os resultados obtidos para TpMan foram: 21 ± 4% α-

hélice, 28 ± 3% folhas-β e 51 ± 5% coil (estruturas irregulares) (Tabela 4), indicando

um aumento do conteúdo de folhas-β e coil e uma redução na quantidade de α-hélice na

enzima completa.

Deconvolução do espectro de CD

Domínios α-hélice (%) Folhas-β (%) Coil (%)

TpManGH5 42 ± 4 16 ± 2 42 ± 5

TpMan 21 ± 4 28 ± 3 51 ± 5

Estrutura tridimensional**


TpManGH5 41 12 47

TpManIg-like 0 40 60

TpManCBM27 6 60 34

TpMan 25 29 46

Predição da estrutura secundária***


TpManGH5 31-40 11-17 45-57

TpManIg-like 0-9 42-51 43-57

TpManCBM27 0-11 36-60 34-65

TpMan 18-26 23-32 39-59

Tabela 4.Deconvolução do espectro de CD e predição da estrutura secundária

*As porcentagens de α-hélice, folhas-β e coils , foram obtidas por deconvolução do espectro

experimental usando quatro independentes métodos e expresso com um desvio médio

padrão.

**A estrutura secundária foi obtida da estrutura tridimensional do TpManGH5, TpManIg-like e

TpManCBM27.

***Os métodos computacionais comparados foram BALDIG, PHD, PSIPRED, e PORTER.

Os valores máximo e mínimo foram obtidos para cada tipo de estrutura secundária dada.

57

5.1.7 Métodos computacionais para predição da estrutura secundária

Os resultados de predição de estrutura secundária para a sequência completa da

TpMan (Gene Bank: ABQ47550.1) e seus domínios individuais são mostrados na

Tabela 4. Os resultados indicam que a TpMan é composta de porcentagens

aproximadamente iguais de estrutura secundária regular (α-hélice e folhas-β) e coil

(estruturas irregulares). A estrutura secundária regular do TpManGH5 é dominada por

α-hélice. Entretanto, a estrutura secundária regular para TpManCBM27 e TpManIg-like

são dominadas por folhas-β.

5.1.8 Método de otimização em conjunto (EOM)

Para entender melhor a flexibilidade sugerida pelo gráfico de Kratky, o método de

otimização em conjunto (EOM) foi empregado. 40

A distribuição dos valores de Rg e

Dmax das estruturas geradas pelo conjunto inicial e as distribuições das estruturas

selecionadas durante a otimização em conjunto são mostradas para 20, 50 e 65 ºC na

figura 16. As populações de estruturas selecionadas tornaram-se mais estreitas quando a

temperatura foi aumentada de 20 ºC para 65 ºC, sugerindo uma redução na flexibilidade

molecular com aumento da temperatura. A 20 ºC o Rg e o Dmax das estruturas

selecionadas durante o método de otimização estão centralizados o redor de 31 Å e 103

Å, respectivamente (Tabela 2). A 50 ºC o Rg e o Dmax das estruturas selecionadas são

centradas por volta de 33 Å e 105 Å, respectivamente. Finalmente, a 65 ºC o Rg e o Dmax

das estruturas selecionadas são centradas ao redor de 34 Å e 109 Å, respectivamente.

58

Figura 16. Modelagem por EOM. (A) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas

pelo programa por dados experimentais de SAXS a 20ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições

finais de parâmetros estruturais por modelos selecionados pelo método de otimização em conjunto

(EOM). 28

(B) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas pelo programa por dados

experimentais de SAXS a 50ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições finais de parâmetros

estruturais por modelos selecionados pelo método de otimização em conjunto (EOM). 28

(C) As linhas

tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas pelo programa por dados experimentais de SAXS a

65ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições finais de parâmetros estruturais por modelos

selecionados pelo método de otimização em conjunto (EOM). 28

59

Os resultados de EOM indicam que a TpMan torna-se mais alongadas e menos

flexível quando a temperatura aumenta de 20 para 65 ºC. Os ajustes dos perfis

determinados pelo processo de modelagem de otimização em conjunto (EOM) são

mostrados na figura 17. A figura 18 mostra a estrutura com mais alta frequência na

população otimizada a 20 ºC sobreposta a nuvem de modelos. Foram considerados os

modelos que cobriram 80% do intervalo de frequência.

Figura 17. Ajuste para RBM e EOM. (A) Curvas experimentais de SAXS para TpMan a 20 ºC (circulo

aberto), 50 ºC (triângulos abertos) e 65 ºC (quadrados abertos) sobreposto as curvas de espalhamento

baseado no modelo de corpo rígido (RBMs, linha sólida). (B) Ajuste (linha sólida) do melhor perfil

determinado pela modelagem de EOM dos dados de SAXS a pH 6 e 20 ºC (círculos abertos), 50 ºC

(triângulos abertos) e 65 ºC (quadrados abertos).

60

Figura 18. Modelo de EOM. Modelo selecionado (cartoon) que obteve a mais alta frequência na

população otimizada sobreposta na nuvem de modelos. A estrutura mostrada esta rotacionada 90º sobre o

eixo longitudinal do modelo para produzir duas orientações.

5.1.9 Modelo de corpo rígido (RBM)

O programa CORAL 38

foi usado para realizar a modelagem de corpo rígido das

estruturas tridimensionais baseada nas curvas experimentais de SAXS obtida em

diferentes temperaturas. As estruturas tridimensionais do TpManGH5, TpManIg-like e

TpManCBM27 foram organizadas e suas posições e orientações relativas foram

otimizadas utilizando o programa CORAL. Como resultado o arranjo tridimensional dos

domínios forneceu o melhor ajuste para os dados experimentais de SAXS. O ajuste dos

perfis determinados por modelagem de corpo rígido são mostrados na figura 17 para as

temperaturas 20, 50 e 65 ºC. O modelo de corpo rígido (RBM) obtido a 20 ºC mostra

61

uma partícula com um Dmax de 104,70 Å e Rg = 32,30 Å. O RBM obtido a 50ºC mostra

uma partícula com um Dmax de 111,20 Å e Rg = 33,99 Å. Finalmente, o RBM obtido a

65ºC mostra uma partícula com um Dmax de 118,20 Å e Rg = 34,95 Å. A sobreposição

dos modelos de baixa resolução (DAMs) obtidos em diferentes temperaturas e os

respectivos modelos de corpo rígido (RBM) mostraram concordância (Figura 12). Além

disso, a sobreposição do modelo de mais alta frequência obtido por EOM e o RBM,

ambos obtidos a 20ºC e pH 6, estão também em concordância (Figura 19).

Figura 19. Modelo de mais alta frequência (EOM) e modelo de corpo rígido (RBM). Sobreposição do

modelo EOM (azul claro, verde claro e rosa) e RBM obtido utilizando o programa CORAL (azul escuro,

verde escuro e vermelho).

62

5.2. Discussão

Proteínas modulares em que os domínios globulares são conectados por linkers

são comumente encontradas na natureza. 57

É reconhecido que um grande número de

carboidrases bacterianas e fúngicas são compostas de um domínio catalítico e um

módulo de ligação ao carboidrato conectados por um linker. 58

Um recente estudo

relatou que a enzima TpMan tem uma estrutura modular, com um domínio catalítico e

um domínio de ligação ao carboidrato conectados por um longo linker (considerando-se

o grande número de aminoácidos). 24

Ainda, neste mesmo estudo foi apresentada a

estrutura cristalográfica do domínio catalítico a 1,5 Å de resolução, no entanto, não foi

possível a cristalização da enzima TpMan intacta, provavelmente devido à flexibilidade

inerente entre os domínios. 16

No presente estudo, a enzima TpMan intacta e seu

domínio catalítico isolado (TpManGH5), foram analisados por meio de técnicas

biofísicas e ferramentas de bioinformática. Os resultados apresentados neste trabalho

forneceram a caracterização da estrutura global da enzima TpMan e também a

influência do linker e da temperatura sobre a conformação estrutural e flexibilidade

desta enzima hipertermoestável.

5.2.1 Dimensão e forma da enzima TpMan da bactéria hipertermoestável

Thermotoga petrophila a 20 ºC

O valor calculado para o raio de giro da TpMan através da região de Guinier

(Rg=32 ± 1 Å) é muito próximo do valor obtido pela análise integral da curva de

espalhamento (Rg = 32,50 ± 0,14 Å) utilizando a metodologia implementada no

programa GNOM (Figura 11). Além disso, a reconstrução do envelope da TpMan

restaurado a 18 Å de resolução mostra uma partícula alongada com um Dmax de 103,9 Å

e Rg = 32,97 Å (figura 12). O raio hidrodinâmico obtido por DLS (RS = 36 ± 2 Å) é

63

consistente com o RS determinado para o modelo de baixa resolução da enzima TpMan

(RS = 38,3 Å) calculado a partir do programa HYDROPRO. 59

O modelo de baixa

resolução obtido através da técnica de SAXS indica uma estrutura monomérica

alongada em forma de L. Os valores para os raios de giro e dimensão máxima obtidos

para TpMan indicam que a dimensão do linker não é muito grande quando comparado

com sua massa. Portanto, nossos resultados sugerem a presença de um linker com uma

estrutura compacta e capaz de ocupar um pequeno volume mesmo considerando seu

grande número de resíduos de aminoácidos. Embora o envelope molecular apresentado

tenha uma resolução limitada, esta é a primeira visualização da estrutura intacta da

TpMan já reportada até o momento.

5.2.2 Modelo molecular por homologia para o linker

O modelo de baixa resolução obtido através das análises de SAXS para TpMan

indica que o linker tem uma estrutura compacta. Para investigar esta hipótese, foram

realizado estudos adicionais empregando-se a metodologia de threading e modelagem

molecular. Todos os modelos identificados pelos programas HHPRED e PHYRE2 são

de enzimas carboidrases de bactérias termofílicas. O domínio central (linker) apresenta

baixa identidade sequencial quando comparado com os modelos selecionados (Tabela

3). Entretanto, existe alto nível de confiabilidade dos modelos selecionados.

TpManCBM27 foi diretamente modelado usando como molde o domínio de ligação ao

carboidrato (CBM27) de TmMan 55

, o qual apresenta alta identidade sequencial e

confiabilidade (Tabela 3). Contudo, um modelo molecular consistente para o

TpManCBM27 pode ser também diretamente modelado usando-se um molde de baixa

identidade sequencial mas alta confiabilidade, como o domínio de ligação ao

carboidrato (CBM27) da bactéria Caldicellulosiruptor saccharolyticus. Assim,

64

similarmente foi possível obter um modelo molecular consistente para o domínio central

da enzima TpMan utilizando como molde o domínio X1 de CbhA 56

(Figura 14).

A região central (linker) da enzima TpMan é um domínio de função biológica

desconhecida. 55

O modelo molecular obtido para o domínio central é estruturalmente

muito similar ao domínio immunoglobulin-like-β-sandwich (Ig-like). Há evidências que

estas estruturas são apenas uma “forma de armazenamento” ou que tenha função de

conectar os domínios das enzimas que podem se estender quando necessário. 56

Alternativamente, eles podem simplesmente funcionar como espaçadores entre os

domínios. No caso do módulo X1 de CbhA foi proposto que um possível papel é a

termoestabilidade estrutural do complexo enzimático da CbhA. 56

No caso da enzima

TpMan, a deleção do linker mais o módulo de ligação ao carboidrato (TpManCBM27)

reduz a estabilidade térmica do TpManGH5 (Figura 9), e dados enzimáticos revelam

que o TpManGH5 sozinha perde significativamente mais a atividade catalítica a altas

temperaturas quando comparando com a TpMan intacta (Figura 7). Portanto, um

possível papel do domínio central é o aumento da estabilidade térmica da proteína

completa como proposto para o complexo CbhA. 56

5.2.3 Estrutura secundária dos domínios estruturais da enzima TpMan

A inspeção visual do espectro de CD do TpManGH5 indicou a presença de

estrutura secundária do tipo α-hélice que é evidenciado por elipticidades negativas ao

redor de 210 e 220 nm (Figura 15 B). A deconvolução dos espectros empregrando-se

quatro diferentes algoritmos resultou nos seguintes valores médios para a estrutura

secundária: 42 ± 4% α-hélice, 16 ± 2% folhas-β, e 42 ± 5% de coil (estrutura secundária

irregular). Por comparação, os resultados de deconvolução apresentam boa

65

correspondência com a estrutura cristalográfica do TpManGH5 (41% α-hélice, 12%

folhas-β, e 47% coil). 24

Como pode ser visto na figura 19, o espetro de CD para TpMan não mostra dois

mínimos bem definidos, mostrando um aumento nas elipticidades negativas entre 210 e

220 nm. Estas diferenças são sugestivas de um considerável aumento no conteúdo de

folhas-β para TpMan quando comparado com o TpManGH5, e esta diferença pode ser

apenas atribuída ao complexo TpManCBM27 e TpManIg-like. Isto é refletido por um

aumento do conteúdo de folhas-β de 16 a 28% na deconvolução (Tabela 4). Isto foi

prontamente confirmado através da análise dos modelos moleculares gerados para os

domínios TpManCBM27 e TpManIg (figura 14). O modelo molecular gerado para

TpManIg-like contém 40% folhas-β e 34% coil, e o modelo molecular para

TpManCBM27 contém 6% α-hélice, 60% folhas-β, e 34% coil, consistente com os

resultados de predição de estrutura secundária (Tabela 4). Quando considerados em

conjunto, TpManGH5, TpManIg-like e TpManCBM27 apresentam as seguintes

porcentagens de estruturas secundárias: 25% α-hélice, 29% folhas-β, e 46% coil, as

quais são totalmente consistentes com os resultados de deconvolução do espectro

experimental (Tabela 4).

5.2.4 Gráfico de Kratky sugere que a enzima TpMan apresenta algum nível de

flexibilidade a 20 ºC

Para um sistema com forma compacta, o gráfico de Kratky mostra uma curva

com forma de sino, onde uma porção inicial com valores crescentes é seguida por uma

descida acentuada formando um máximo bem definido. 53

No entanto, para um

polímero com uma conformação alongada ou conformações random coil (aleatória) a

curva esperada aumenta para grandes valores de q não apresentado um máximo bem

66

definido. 23

Moléculas com regiões compactas conectadas por linkers flexíveis podem

apresentar as duas características, um máximo bem definido seguido por regiões de

platô. A alta da região do platô é uma indicação do grau de flexibilidade molecular.

Assim, podemos utilizar o comportamento do gráfico de Kratky para avaliar

qualitativamente o grau de flexibilidade. 23

O gráfico de Kratky, na figura 13 A, mostra que a curva para a TpMan, em pH 6

a 20ºC, tem um máximo bem definido (q < 0,15 Å-1

), contudo apresenta uma leve

elevação da linha de base para valores grandes de q (q > 0,15 Å-1

). Este comportamento

para q > 0,15 Å-1

sugere que TpMan apresenta algum nível de flexibilidade molecular

intrínseca. Devido à sua arquitetura, as proteínas modulares podem muitas vezes adotar

diversas conformações em solução. O método de otimização em conjunto (EOM)

representa uma excelente estratégia para identificar movimentos entre os domínios

inequivocamente. 40

Assim, para investigar a hipótese de que a enzima TpMan apresenta

algum nível de flexibilidade em solução a 20ºC, foram realizados estudos adicionais

empregando modelagem por EOM. O Rg e Dmáx das estruturas selecionadas durante a

otimização em conjunto estão centradas em torno de 31 Å e 103 Å, respectivamente

(figura 16 A).

Os resultados obtidos usando EOM (em pH 6 a 20ºC) são consistentes com um

modelo no qual a enzima TpMan adota um conjunto de conformações limitadas

representadas pela nuvem de modelos na figura 18. Na figura 19 também pode ser visto

a estrutura com mais alta frequência na população otimizada.

5.2.5 Modelo tridimensional para a enzima TpMan intacta a 20 ºC

A modelagem de corpo rígido foi realizado para construir um modelo para a

enzima TpMan intacta pelo ajuste da curva de espalhamento experimental. As estruturas

67

tridimensionais do TpManGH5, TpManIg-like e TpManCBM27 foram organizadas em

suas posições e orientações relativas foram otimizadas. Os ajustes de corpo rígido das

estruturas tridimensionais resultaram em um excelente ajuste das curvas experimentais

de SAXS (Figura 17 A). A sobreposição do modelo de baixa resolução obtido por

SAXS e o modelo de corpo rígido (RBM) para TpMan, ambos obtidos a 20ºC a pH 6,

mostram uma excelente correspondência (figura 12 B) e é visivelmente claro que o

modelo da enzima TpMan obtido por SAXS é compatível com um monômero composto

de três domínios distintos. O modelo de corpo rígido construído mostra que TpManGH5

e TpManCBM27 ocupam as extremidades opostas do envelope molecular, enquanto

TpManIg-like ocupa a região central. Finalmente, a sobreposição do modelo de alta

frequência (EOM) com o modelo de corpo rígido obtido utilizando-se o programa

CORAL indicou que os resultados estão em excelente concordância (figura 19). Isto

indica que, embora a enzima intacta tenha algum grau de flexibilidade a 20ºC, pode

haver uma conformação preferível, o qual pode ser descrita pelo procedimento de

modelagem de corpo rígido.

5.2.6 SAXS revela que mudanças conformacionais na enzima TpMan é dependente

da temperatura

Para uma melhor compreensão da bioquímica e biofísica do processo de mudança

conformacional da TpMan como também a função da temperatura são muito

importantes para estudar a relação entre a estrutura, estabilidade, flexibilidade e

atividade enzimática da TpMan. Pouco se sabe sobre o quanto a mobilidade molecular

do domínio de ligação ao carboidrato com respeito ao domínio catalítico se correlaciona

com a atividade enzimática. Parece lógico assumir que mudanças na conexão entre

TpManCBM27 e TpManGH5 podem influenciar o acesso dos polissacarídeos no sitio

68

ativo da enzima e portanto ter um impacto sobre a atividade enzimática. No caso do

CBM27 de TmMan, foi proposto que a hidrólise de polissacarídeos é aumentada através

do direcionamento do substrato por meio do domínio de ligação. 55

O estudo de SAXS apresentado aqui, demonstra que a enzima TpMan sofre uma

transição dirigida pela temperatura através de estados conformacionais (Figura 11 e 12)

sem uma disrupção significativa da estrutura secundária (Figura 15), proporcionando

uma nova visão sobre a função da enzima. O aumento na separação média entre

TpManGH5 e TpManCBM27, com o aumento da temperatura de 20ºC para 65ºC é

relativamente sutil, mas pode ser visto nos dados e modelos nas figuras 11,12 e 16. Este

resultado indicou que o linker no caso da TpMan pode otimizar a geometria entre os

outros dois domínios em relação ao substrato a altas temperaturas.

69

6. Conclusões

O presente estudo estabeleceu um modelo composto de três domínios para a

enzima TpMan em solução, combinando dados de SAXS e modelagem com o

conhecimento das estruturas tridimensionais para cada domínio individual. Os nossos

resultados forneceram as conformações (modelo de baixa resolução) em solução da

enzima TpMan intacta como também o efeito do comprimento e flexibilidade do linker

sobre o arranjo espacial dos domínios constitutivos. Foi demonstrado que o linker ocupa

um pequeno volume em relação ao seu grande número de aminoácidos. Além disso, os

resultados também indicam que o linker é um domínio compacto e estruturalmente

muito semelhante ao domínio immunoglobulin-like β-sandwich. A 20ºC, apesar de a

enzima TpMan completa apresentar algum grau de flexibilidade, existe uma

conformação preferível, a qual pode ser descrita pelo procedimento de modelagem de

corpo rígido. Além disso, TpMan sofre uma transição dirigida pela temperatura entre

estados conformacionais sem a disrupção significativa de sua estrutura secundária.

Finalmente, os resultados de EOM indicam que TpMan torna-se mais alongada e menos

flexível quando a temperatura aumenta de 20ºC para 65ºC. Analisados em conjunto, os

resultados indicam que o linker no caso da TpMan pode otimizar a geometria entre os

outros dois domínios com respeito ao substrato a altas temperaturas.

Baseado em nossas observações, defendemos que o linker é muito importante para

garantir condições ótimas para atividade enzimática da TpMan devido a pelo menos três

fatores:

i) Termoestabilização da enzima completa;

ii) Adequado grau de flexibilidade molecular entre os domínios estruturais;

iii) Otimização da geometria entre os outros domínios com respeito ao

substrato a altas temperaturas.

70

Por fim, estes estudos proporcionarão bases úteis para futuros estudos biofísicos e

bioquímicos da enzima TpMan completa.

71

7. Perspectivas futuras

7.1 Determinar a estrutura tridimensional do domínio central (linker) da

enzima TpMan.

Conforme nosso trabalho publicado recentemente, o linker da enzima endo-1,4-

β-mananase da bactéria hipertemófila Thermotoga petrphila (TpMan) é um domínio

compacto e estruturalmente muito similar ao domínio imunoglobulina β-sanduiche.

Assim, como o primeiro objetivo deste projeto de pesquisa, será determinar a estrutura

tridimensional do linker da enzima TpMan através de cristalografia de raios-X. Também

é importante salientar que o domínio central (linker) da enzima TpMan apresenta apenas

14% de identidade sequencial quando comparado com proteínas disponíveis no PDB

(Protein Data Bank).

7.2 Comprovar que o linker da TpMan pode termoestabilizar a enzima

completa.

A região central (linker) da enzima TpMan é um domínio compacto de função

biológica desconhecida. O modelo molecular obtido para o linker é estruturalmente

muito similar ao domínio imunoglobulina β-sanduiche. No caso da enzima

celobiohidrolase de Clostridium thermocellum foi proposto que um possível papel de

um domínio similar (imunoglobulina β-sanduiche) foi estabilizar termicamente a

enzima completa [2]. No caso da enzima TpMan, a deleção do linker mais o domínio

CBM27 reduz a termoestabilidade do domínio catalítico GH5. A figura 7 mostra dados

de atividade enzimática onde o domínio catalítico (TpManGH5) perde

significativamente mais atividade catalítica do que a enzima completa (TpMan) a

elevadas temperaturas. Assim, como perspectivas para o futuro projeto de pesquisa para

doutorado é comprovar que o domínio central (linker) atua como um elemento

termoestabilizador da enzima completa.

72

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ANEXO

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