UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · Biofísica do Coração e por enriquecer...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS PÉLIGRIS HENRIQUE DOS SANTOS EFEITO PROTETOR DO COMPLEXO DE INCLUSÃO ÁCIDO ÚSNICO/β-CICLODEXTRINA EM CORAÇÃO ISOLADO DE RATO SUBMETIDO À LESÃO POR ISQUEMIA E REPERFUSÃO SÃO CRISTOVÃO 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FISIOLÓGICAS
PÉLIGRIS HENRIQUE DOS SANTOS
EFEITO PROTETOR DO COMPLEXO DE INCLUSÃO ÁCIDO
ÚSNICO/β-CICLODEXTRINA EM CORAÇÃO ISOLADO DE
RATO SUBMETIDO À LESÃO POR ISQUEMIA E
REPERFUSÃO
SÃO CRISTOVÃO
2015
i
PÉLIGRIS HENRIQUE DOS SANTOS
EFEITO PROTETOR DO COMPLEXO DE INCLUSÃO
ÁCIDO ÚSNICO/β-CICLODEXTRINA EM CORAÇÃO
ISOLADO DE RATO SUBMETIDO A LESÃO POR
ISQUEMIA E REPERFUSÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal de Sergipe como pré-requisito
à obtenção do grau de Mestre em Ciências
Fisiológicas.
Orientador: Prof.ª Drª Sandra Lauton Santos.
SÃO CRISTOVÃO
2015
ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237e
Santos, Péligris Henrique dos Efeito protetor do complexo de inclusão ácido úsnico/β-
ciclodextrina em coração isolado de rato submetido a lesão por isquemia e reperfusão / Péligris Henrique dos Santos ; orientador Sandra Lauton Santos. – São Cristovão, 2015.
65 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) – Universidade Federal de Sergipe, 2015.
1. Infarto do miocárdio. 2. Estresse oxidativo. 3. Antioxidante. I. Santos, Sandra Lauton, orient. II. Título.
CDU 616.1
iii
PÉLIGRIS HENRIQUE DOS SANTOS
EFEITO PROTETOR DO COMPLEXO DE INCLUSÃO
ÁCIDO ÚSNICO/β-CICLODEXTRINA EM CORAÇÃO
ISOLADO DE RATO SUBMETIDO A LESÃO POR
ISQUEMIA E REPERFUSÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal de Sergipe como requisito à
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Fisiológicas.
_______________________________________________________
Presidente: Profª. Drª. Sandra Lauton Santos
_______________________________________________________
1°Examinador: Prof. Dr. Josemar Sena Batista
_______________________________________________________
2° Examinador: Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo
iv
Dedicatória
Aos meus pais, meus eternos heróis
e minha fonte diária de motivação.
Aos meus irmãos, meus eternos
amigos e confidentes.
v
AGRADECIMENTOS
À Deus por me dar um dos maiores presentes que alguém pode ter: família, amigos e
motivação diária, para vencer as dificuldades que apareceram nessa jornada.
Aos meus amigos e à minha família e que, apesar de não entenderem meu trabalho,
sempre me motivaram a percorrer o caminho e estendeu a mão sempre que necessário.
Aos meus colegas de laboratório: Grace Kelly Melo de Almeida, Marden Mendes,
Jucilene Freitas, Rodrigo Miguel, Thássio Ricardo, Lucas Sá de Andrade, Franciele Feitosa,
Iris Alessandra, Alex, Evaldo Filho, Nilson e Fernando Sousa por todo companheirismo ao
longo dessa jornada. A esses sempre serei grato.
À minha orientadora, Prof. Drª Sandra Lauton, por me acolher no Laboratório de
Biofísica do Coração e por enriquecer minha vida com toda carga de conhecimento adquirida
neste local.
Ao Prof. Dr. Enilton Camargo por disponibilizar o Laboratório de Farmacologia de
Produtos Naturais e Inflamação (LAFAPI) para a execução de parte dos experimentos.
Ao Prof. Dr. Jader Cruz e aos alunos Humberto Joca, Artur Miranda e demais
membros do Laboratório de Membranas Excitáveis (LAMEX) pelo apoio no projeto.
Ao Prof. Dr. Adriano Antunes de Souza Araújo e à aluna Paula P. Menezes pela
realização da complexação do ácido úsnico a β-ciclodextrina.
Aos Professores. Dr. Eduardo Antônio Conde Garcia e a Dr.ª Carla Maria Lins de
Vasconcelos pela ajuda com os experimentos de contratilidade cardíaca.
Aos Professores membros da banca PROASA por todas as valiosas sugestões feitas
durante as reuniões semestrais.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas (PROCFIS) pelo trabalho
árduo em garantir recursos para tornar possível a execução desse trabalho.
À CAPES e à FAPITEC pelo financiamento do presente trabalho.
vi
RESUMO
EFEITO PROTETOR DO COMPLEXO DE INCLUSÃO ÁCIDO ÚSNICO/β-
CICLODEXTRINA EM CORAÇÃO ISOLADO DE RATO SUBMETIDO A LESÃO
POR ISQUEMIA E REPERFUSÃO. Santos, P.H., São Cristovão, 2015.
A interrupção do suprimento sanguíneo causa alteração do status redox celular, promove estresse
oxidativo, danos teciduais e alteração da função cardíaca. Diante disso, compostos antioxidantes,
como o ácido úsnico, podem prevenir essas alterações, uma vez que são capazes de reestabelecer o
status redox celular e de preservar as funções teciduais. Assim, o objetivo desse estudo foi verificar se
o pré-tratamento com complexo de inclusão ácido úsnico (AU)/β-ciclodextrina (βCD) promove a
cardioproteção após a lesão por isquemia e reperfusão. Inicialmente, foi realizada a caracterização do
complexo de inclusão entre o AU e a βCD através das técnicas de termogravimetria/termogravimetria
derivada (TG/DTG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), espectrofotometria na região do
infravermelho (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Após a caracterização e
confirmação da formação de complexo de inclusão entre o AU e a βCD, foi iniciado a avaliação dos
efeitos cardioprotetores do complexo de inclusão AU/βCD. Para tanto, foram utilizados ratos wistar
(250-300 g) distribuídos em dois grupos: o grupo pré-tratado com 50 mg/kg/dia de AU/βCD e o grupo
pré-tratado com βCD. Após o pré-tratamento, o coração dos animais foi removido para ser montado
em sistema de perfusão de órgão isolado para a indução da lesão por isquemia e reperfusão, onde
foram avaliados a pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE), frequência cardíaca (FC) e o
índice de severidade de arritmia (ASI). Em seguida, foi determinado em fígado e coração a quantidade
de lactato desidrogenase (LDH) liberada, a formação de malondialdeído (MDA), a atividade das
enzimas Superóxido Dismutase (SOD) e Catalase (CAT) e verificado a quantidade de grupamentos
tióis. Os resultados da caracterização físico-química demonstraram que o AU foi complexado a
cavidade da βCD, podendo ser visto na TG na segunda etapa de perda de massa, onde o complexo de
inclusão apresentou Δm=19,2% enquanto a mistura física, Δm=16,2%. Além disso, foi demonstrado
pela MEV que a mistura física não interagiu com a βCD ao passo que o complexo de inclusão sofreu
alteração de forma. Os espectros de FTIR indicaram a presença do AU no complexo de inclusão em
maior proporção, por sua vez, na mistura física foi observada a presença do AU em menor proporção.
Ao avaliar os efeitos cardioprotetores do complexo de inclusão AU/βCD, verificou-se que o pré-
tratamento preservou a PDVE (AU: 89,9 + 6,3% vs βCD: 53,9 + 8,6%; p < 0,05), reduziu os escores
obtidos no ASI (AU: 2,5 + 0,5 u.a. vs βCD: 11,00 + 0,57 u.a.; p < 0,0001) e não alterou a FC
(AU/βCD: 78,5 + 8,6% vs βCD: 79,6 + 9,2%, p > 0,05). Nos ensaios bioquímicos, o pré-tratamento
reduziu a quantidade de LDH liberada (AU: 0,063 + 0,026 U/L vs βCD: 0,224 + 0,036 U/L; p < 0,05),
diminuiu a formação de MDA (AU: 5,87 + 0,57 nmol de MDA/g de tecido vs βCD: 13,02 + 1,04 nmol
de MDA/g de tecido, p < 0,0001), promoveu a atividade da SOD (AU: 0,086 + 0,013 U SOD/mg de
proteína vs βCD: 0,050 + 0,004 U SOD/mg de proteína; p < 0,05) e da CAT (AU: 0,054 + 0,006
ΔE/min/mg de proteína vs βCD: 0,023 + 0,002 ΔE/min/mg de proteína; p < 0,001) e aumentou a
presença de grupos tióis (AU: 97,83 + 4,23 µmol/mg de proteína vs βCD: 54,31 + 3,28 µmol/mg de
proteína; p < 0,0001). Ademais, ao investigar a toxicidade, não foi evidenciada alteração dos níveis
basais de LDH (AU: 0,068 + 0,021 U/L vs βCD:0,070 + 0,023U/L; p > 0,05) e de MDA (AU: 8,59 +
0,27 nmol de MDA/g de tecido vs βCD: 8,43 + 0,21 nmol de MDA/g de tecido, p > 0,05) , nem
alteração da atividade da SOD (AU: 0,025 + 0,001 U SOD/ mg de proteína vs βCD: 0,026 + 0,001 U
SOD/mg de proteína, p > 0,05) e nem da CAT (AU: 0,020 + 0,004 ΔE/min/mg de proteína vs βCD:
0,015 + 0,002 ΔE/min/mg de proteína; p > 0,05) no tecido hepático, promovendo apenas aumento de
grupamentos tióis (AU: 245,4 + 15,6 µmol/mg de proteína vs βCD: 181,8 + 14,3 µmol/mg de proteína,
p < 0,05). Assim, verificou-se que o pré-tratamento com o complexo de inclusão preservou a função
contrátil, promoveu cardioproteção e não mostrou sinais de toxicidade.
Descritores: Antioxidante; Estresse oxidativo; Infarto do miocárdio; Líquens; Polifenóis.
vii
ABSTRACT
PROTECTIVE EFFECT OF INCLUSION COMPLEX USNIC ACID/β-
CYCLODEXTRIN RAT ISOLATED HEART SUBMITTED TO INJURY ISCHEMIA
AND REPERFUSION. Santos, P.H., São Cristovão, 2015.
The interruption of the blood supply causes a change in the cellular redox status, promotes oxidative
stress, tissue damage and changes in heart function. Therefore, antioxidant compounds, such as usnic
acid, can prevent these changes, since they are able to re-establish cellular redox status and preserve
the tissue functions. The goal of this study was to determine whether pretreatment with inclusion
complex usnic acid (UA) / β-cyclodextrin (βCD) promotes cardioprotection after ischemia and
reperfusion. Initially, the characterization of inclusion complex between the AU and the βCD was
performed through thermogravimetry / derivative thermogravimetry (TG / DTG), differential scanning
calorimetry (DSC), spectrophotometry in the infrared (FTIR) and scanning electron microscopy
(MEV). After characterization, was initiated evaluating the cardioprotective effects of the inclusion
complex AU / βCD. For this, Wistar rats (250-300 g) divided into two groups: the group pretreated
with 50 mg / kg / day AU / βCD and pretreated with βCD group. After the pretreatment, the heart of
the animal was removed to be mounted in an isolated organ perfusion system for induction of ischemia
and reperfusion and were evaluated the pressure developed in the left ventricle (LVDP), heart rate
(HR) and arrhythmia severity index (ASI). Also was determined in liver and heart the amount of
lactate dehydrogenase (LDH) released, the formation of malondialdehyde (MDA), the activity of
superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). Furthermore was verified the amount of thiol
groups. The results of the physico-chemical characterization showed that UA was complexed in the
cavity of βCD and may be seen in the TG weight loss in the second step, where the inclusion complex
showed Δm = 19.2% while the physical mixture, Δm = 16.2%. Furthermore, it was demonstrated by
SEM that the physical mixture has not interacted with βCD while the inclusion complex underwent
shape change. The FTIR spectra indicated the presence of the AU in the inclusion complex in a higher
proportion, in turn, the physical mixture was observed in the presence of AU lesser extent. When
evaluating the cardioprotective effects of the inclusion complex AU / βCD, it was found that the
pretreatment preserved LVDP (AU: 89.9% vs. 6.3 + βCD: 53.9 + 8.6%, p < 0 05) reduced the scores
obtained in ASI (AU: 2.5 + 0.5 ua vs. βCD: 11.00 + 0.57 ua; p < 0.0001) and did not change the FC
(AU / βCD: 78 5 + 8.6% vs βCD: 79.6 + 9.2%, p > 0.05). In biochemical assays, pretreatment reduced
the amount of LDH released (AU: 0.063 + 0.026 U / L vs βCD: 0.224 + 0.036 U / L, p < 0.05) reduced
the formation of MDA (AU: 5, 87 + 0.57 nmol MDA / g vs βCD: 13.02 + 1.04 nmol MDA / g, p <
0.0001), promoted the SOD activity (AU: 0.086 + 0.013 U SOD / mg protein vs. βCD: 0,050 + 0,004
U SOD / mg protein, p < 0.05) and CAT (AU: 0.054 + 0.006 ΔE / min / mg protein vs. βCD: 0.023 +
0.002 ΔE / min / mg protein; p < 0.001) and increased presence of thiol groups (AU: 97.83 + 4.23 mol
/ mg protein vs. βCD: 54.31 + 3.28 mol / mg protein, p < 0.0001 ). Moreover, to investigate the
toxicity was not observed change in baseline levels of LDH (AU: 0.068 + 0.021 U / L vs βCD: 0.070 +
0,023U / L; p > 0.05) and MDA (AU: 8.59 + 0.27 nmol MDA / g vs βCD: 8.43 + 0.21 nmol MDA / g,
p > 0.05) nor change in the SOD activity (AU: 0,025 + 0,001 U SOD / mg protein vs. βCD 0.026 +
0.001 U SOD / mg protein, p > 0.05), or CAT (AU: 0.020 + 0.004 ΔE / min / mg protein vs. βCD:
0.015 + 0.002 ΔE / min / mg protein, p > 0.05) in the liver by promoting increase of thiol groups only
(AU: 245.4 + 15.6 mmol / mg protein vs. βCD: 181.8 + 14.3 mmol / mg protein , p < 0.05). Thus, it
was found that the pretreatment with the inclusion complex preserved contractile function, heart
protection promoted and showed no signs of toxicity.
Keywords: Antioxidant; Oxidative stress; Myocardial infarction; Lichens; Polyphenols.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 – Estrutura da NADPH oxidase (Nox).................................................................07
Figura 02 - Eventos mediados pela ativação da Nox............................................................08
Figura 03 - Formação de espécies reativas de oxigênio e atuação do sistema enzimático
antioxidante na mitocôndria durante a fosforilação oxidativa...........................................09
Figura 04 – Formação de radicais hidroxila (OH•) através das reações de Fenton e
Haber-Weiss.............................................................................................................................10
Figura 05 – Alterações no metabolismo celular presentes no período de
isquemia....................................................................................................................................11
Figura 06 – Alterações no metabolismo celular presentes no período de
reperfusão................................................................................................................................12
Figura 07 – Fórmula estrutural plana do ácido úsnico.......................................................13
Figura 08 – Estrutura molecular plana da β-ciclodextrina.................................................15
Figura 09 – Esquema ilustrativo do protocolo experimental adotado...............................20
Figura 10 – Representação esquemática do sistema de perfusão de coração isolado
Langendorff.............................................................................................................................21
Figura 11 – Protocolo para a realização da isquemia global...............................................21
Figura 12 - Curvas TG/DTG do AU, β-CD, MF e CE obtidas em atmosfera de
N2..............................................................................................................................................25
Figura 13 – Curvas DSC do AU, βCD, MF e CE obtidas em atmosfera de
N2..............................................................................................................................................27
Figura 14 - Espectros de infravermelho do AU, βCD, MF e CE obtidos na faixa espectral
de 4000 a 500cm-1
....................................................................................................................27
Figura 15 - Fotomicrografias do AU, βCD, MF e CE obtidas nos aumentos de 800 e
1000x, sob aceleração de voltagem de 8eV............................................................................29
ix
Figura 16 – PDVE e FC de animais pré-tratados com o complexo de inclusão ácido
úsnico (AU)/β-ciclodextrina (βCD) e de animais tratados somente com βCD durante a
situação basal...........................................................................................................................30
Figura 17 – PDVE e FC de animais pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e
de animais tratados somente com βCD durante o período de
reperfusão................................................................................................................................31
Figura 18 – ASI obtido pelos corações isolados de ratos pré-tratados com o complexo de
inclusão AU/βCD e com βCD após a indução da lesão por isquemia e
reperfusão................................................................................................................................31
Figura 19 – Quantidade liberada de LDH mensurada durante a situação basal e após o
período de reperfusão em animais pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD ou
βCD...........................................................................................................................................32
Figura 20 – Concentração de MDA em fígado e em coração de ratos pré-tratados com o
complexo de inclusão AU/βCD e com βCD...........................................................................33
Figura 21 – Atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT dosadas em fígado de ratos
pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e com
βCD...........................................................................................................................................33
Figura 22 – Atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT dosadas em coração de
ratos pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e pré-tratados com βCD, ambos
submetidos a lesão por isquemia e
reperfusão................................................................................................................................34
Figura 23 – Concentração de grupamentos tióis em amostras de fígado e em amostras de
corações de ratos pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD ou pré-tratados com
somente βCD............................................................................................................................35
x
LISTA DE TABELAS
Tabela – 01. Tipos de NADPH oxidase (Nox) e sua distribuição no corpo
humano.....................................................................................................................................06
Tabela – 02. Determinação do Índice de severidade de arritmia
(ASI).........................................................................................................................................22
Tabela – 03. Percentuais de perdas de massa obtidas por TG/DTG do AU, CD, MF e
CE.............................................................................................................................................26
Tabela – 04. Grupos funcionais identificados a partir do espectro de
FTIR.........................................................................................................................................28
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ASI Índice de Severidade de Arritmia
AU Ácido Úsnico
CAT Enzima Catalase
βCD β-ciclodextrina
CE Co-evaporação
CDs Ciclodextrinas
CKMB Creatina quinase isoenzima-MB
CoQH2 Ubiquinol
CPK Creatina fosfoquinase
DSC Calorimetria Exploratória Diferencial
DTG Termogravimetria derivada
FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo
FTIR Espectrofotometria na região do infravermelho
FC Frequência Cardíaca
FDA Food and Drug Administration
GPx Enzima Glutationa Peroxidase
LDH Lactato Desidrogenase
MDA Malonaldeído
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MF Mistura física
mPTP Poro de Permeabilidade Transitória mitocondrial
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase
NO• Óxido Nítrico
Nox NADPH oxidase
O2•- Radical Superóxido
OH• Radical hidroxila
ONOO•- Radical peroxinitrito
PCI Intervenção Coronariana Percutânea
PDVE Pressão Desenvolvida no Ventrículo Esquerdo
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
SOD Enzima Superóxido Dismutase
TBARS Teste de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
TG Termogravimetria
TnI Troponina I
xii
SUMARIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................01
2. REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................................03
2.1. Infarto Agudo do Miocárdio..............................................................................................03
2.2. Estresse oxidativo..............................................................................................................05
2.3. Ácido Úsnico (AU)............................................................................................................13
2.4. Ciclodextrinas (CD)...........................................................................................................15
3 . OBJETIVOS........................................................................................................................17
3.1. Objetivo Geral....................................................................................................................17
3.2. Objetivos Específicos.........................................................................................................17
4. MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................18
4.1. Preparação do complexo de inclusão com β-ciclodextrina (βCD).....................................18
4.2. Caracterização físico-química do complexo de inclusão AU/βCD....................................18
4.2.1. Termogravimetria/ termogravimetria derivada (TG/DTG).............................................18
4.2.2. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)……….....................................................18
4.2.3. Espectrofotometria na região do infravermelho (FTIR).................................................19
4.2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)..................................................................19
4.3. Grupos Experimentais........................................................................................................19
4.4. Tratamento com AU.....................................................................................................19
4.5. Aspectos éticos.............................................................................................................20
xiii
4.6. Local da pesquisa.........................................................................................................20
4.7. Procedimentos..............................................................................................................20
4.7.1. Determinação da pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE) e
determinação da Frequência Cardíaca (FC)..................................................................20
4.7.2. Modelo de isquemia......................................................................................................21
4.7.3. Determinação do índice de severidade da arritmia (ASI).............................................22
4.7.4. Ensaios bioquímicos......................................................................................................22
4.7.4.1. Determinação da concentração total de proteínas.............................................22
4.7.4.2. Mensuração da atividade enzimática.................................................................23
4.7.4.2.1. Determinação da atividade da SOD........................................................................23
4.7.4.2.2. Determinação da atividade da CAT.........................................................................23
4.7.4.2.3. Determinação da atividade da Lactato Desidrogenase (LDH)................................23
4.7.4.3. Determinação da concentração de grupamentos tióis.......................................24
4.7.4.4. Mensuração de produtos da peroxidação lipídica através do teste de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS).........................................................24
4.8. Análise estatística…………………………………………………………………......24
5. RESULTADOS..................................................................................................................25
5.1. Caracterização físico-química do complexo de inclusão AU/βCD....................................25
5.1.1. TG/ DTG..........................................................................................................................25
5.1.2. DSC.................................................................................................................................26
xiv
5.1.3. FITR................................................................................................................................27
5.1.4. MEV................................................................................................................................29
5.2. Determinação da PDVE e da FC........................................................................................30
5.3. Determinação do ASI.........................................................................................................31
5.4. Determinação da atividade da LDH...................................................................................32
5.5. Mensuração de produtos da peroxidação lipídica..............................................................32
5.6. Atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT.............................................................33
5.7. Determinação dos grupamentos tióis.................................................................................35
6. DISCUSSÃO........................................................................................................................36
7. CONCLUSÃO.....................................................................................................................44
REFÊRENCIAS......................................................................................................................45
ANEXO – I...............................................................................................................................51
1
1. INTRODUÇÃO
O aumento da expectativa de vida quando associado aos hábitos de vida não saudável
como o sedentarismo, o tabagismo e o alcoolismo, têm contribuído para o surgimento de
doenças crônicas que acometem o sistema cardiovascular (AVEZUM et al, 2005;
CARNEIRO et al, 2013; SAAD, 1990; SHIOI & INIZUKA, 2012).
Dentre estas doenças, o infarto agudo do miocárdio (IAM) constitui a maior causa de
disfunção (ROGER et al, 2011), sendo responsável por 30% dos óbitos que ocorrem no
mundo (CIRUZZI, 2003). No Brasil, o IAM é uma das principais causas de morte
(ECOSTEGUY, 2003), sendo que em 2010, este evento foi responsável por 29% dos óbitos.
O IAM representa a terceira causa de hospitalização (PIEGAS, 2013) e estima-se que em
2020 figure como a principal causa de morte no país (AVEZUM, 2005).
Nos Estados Unidos, em 2012, foi registrado a cada 43 segundos um novo caso de
IAM, de modo que ao final desse ano foram contabilizados 525.000 novos casos de IAM em
indivíduos com a idade em torno dos 65 anos e 210.000 casos recorrentes de IAM
(MOZAFFARIAN et al, 2015). Em 2011 as doenças cardíacas foram responsáveis por um
sétimo dos óbitos registrados nesse país (MOZAFFARIAN et al, 2015). Desse modo, a
comunidade científica tem buscado formas de intervenção para minimizar os danos
ocasionados por essa patologia e, consequentemente, diminuir a morbidade e a mortalidade.
Dentre as estratégias atualmente utilizadas, tem-se o uso de β-bloqueadores, a
intervenção coronariana percutânea primária (PCI), bloqueadores de canais para Ca2+
, terapia
antitrombótica e antiplaquetária, todavia essas intervenções têm apresentado resultados
limitados em relação à preservação do tecido cardíaco (BAINEY & ARMSTRONG, 2014).
Assim, a suplementação do organismo com compostos antioxidantes pode configurar
uma boa opção para a prevenção, melhora ou atenuação da condição apresentada pelo tecido
cardíaco afetado pelas diversas patologias cardiovasculares (KHURANA et al, 2013). Estes
compostos são capazes de atuar na célula promovendo o equilíbrio entre a produção e
eliminação de radicais livres, favorecendo a homeostase celular (BARREIROS et al, 2006;
LI-RONG et al, 2013).
2
Desse modo, o estudo de substâncias obtidas de produtos naturais tem chamado
atenção da comunidade científica cardiovascular em virtude das propriedades antioxidantes e
anti-inflamatórias apresentadas por esses compostos, propriedades as quais permitem atuar no
estresse oxidativo e no processo inflamatório gerado pelo IAM, podendo resultar em proteção
do tecido cardíaco.
O ácido úsnico (AU) (2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3[2H,9bH]-dibenzo-
furandiona) é um produto natural que apresenta diversas propriedades, dentre elas, a ação
anti-inflamatória (ODABASOGLU et al, 2006) e a antioxidante (FERNANDES, 2013;
BEHERA et al, 2012; ODABASOGLU et al, 2006; RABELO et al, 2012). Assim, levando-se
em consideração o potencial terapêutico do AU e sua ação antioxidante já evidenciada, aliado
ao fato da limitação encontrada na terapêutica atual para o IAM, torna-se de grande relevância
a investigação dos possíveis efeitos cardioprotetores do AU em modelo de lesão por isquemia
e reperfusão. A elucidação destes efeitos pode contribuir para o conhecimento das ações
biológicas do AU no coração, bem como servir como estratégia terapêutica na prevenção das
lesões oriundas do IAM.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Infarto Agudo do Miocardio (IAM)
O IAM, uma das patologias mais antigas descritas, é definido como um processo
patológico ocasionado por um desequilíbrio entre a demanda de oxigênio e o suprimento
sanguíneo oferecido pelas artérias coronárias, resultando em necrose tecidual (THYGENSEN
et al, 2007).
As alterações ocasionadas pelo IAM foram descritas, experimentalmente, pela
primeira vez em 1960 por Jennings et al, onde relataram a presença de lise celular e contratura
dos miofilamentos. Depois, em 1974, Kloner et al relataram a presença de impedância no
fluxo sanguíneo microvascular após a reperfusão e perceberam que tal impedância resultava
em eventos cardíacos deletérios, os quais atribuíram o nome de no-reflow.
Em 1977, Bulkely & Hutchins relataram a ocorrência de acúmulo de cálcio e edema
celular após a revascularização cardíaca com enxerto. Assim, em virtude da natureza
controversa do uso da reperfusão como recurso terapêutico, denominaram tal fenômeno de
paradoxo da necrose do miocárdio.
Diante disso, em 1985, Braunwald & Kloner ao estudar os mecanismos deletérios e
multifatoriais desenvolvidos durante a reperfusão após o IAM, perceberam que apesar da
reperfusão ser a intervenção utilizada para normalizar o fluxo sanguíneo e garantir a
viabilidade no tecido cardíaco, ela ocasiona danos à função cardíaca e assim a caracterizaram
como ―uma espada de dois gumes‖.
Levando-se em consideração a participação controversa da reperfusão como recurso
terapêutico ao IAM, a comunidade científica tem buscado novas estratégias para o tratamento
dessa patologia. Dentre elas, se tem destacado a utilização de uma classe de agentes
farmacológicos capazes de bloquear competitivamente os receptores β-adrenérgicos situados
na membrana celular, protegendo o tecido cardíaco da ativação reflexa do sistema nervoso
simpático durante o IAM (DUNCKER et al, 2009).
Assim, os β-bloqueadores, como o carvedilol, impedem a ocorrência da
vasoconstrição periférica, reduzem a frequência cardíaca e a contratilidade do miocárdio,
reduzem a sobrecarga de volume e a demanda por oxigênio, resultando em melhora da
4
disfunção ventricular induzida pelo IAM (DUNCKER et al, 2009). Desse modo, os β-
bloqueadores diminuem a mortalidade, a recidiva de infarto e a ocorrência de fibrilação atrial
(ANDERSON et al, 2011). Todavia esses compostos são contraindicados para pacientes com
bloqueio atrioventricular e que não utilizem marcapasso, pacientes com propensão a choques
(pacientes idosos, hipotensos e taquicárdicos), pacientes com histórico de hipertensão e que
apresentam anormalidades detectadas no ECG (ANDERSON et al, 2011).
Além dos β-bloqueadores, outra classe de agentes farmacológicos utilizada como
intervenção no IAM são os bloqueadores dos canais para Ca2+
. Esses agentes controlam a
concentração intracelular deste íon, reduzindo sua a interação com a calmodulina, resultando
em diminuição do tônus vasomotor que provoca dilatação das artérias coronarianas e dos
vasos de resistência, diminuindo a pós-carga, a contratilidade e o consumo de oxigênio
(ANDERSON et al, 2011).
Ademais, os bloqueadores de canais para Ca2+
causam bloqueio atrioventricular,
menor ativação do nodo sinusal, redução da frequência cardíaca e relaxamento do ventrículo
esquerdo (ANDERSON et al, 2011). Assim, atenuam os eventos decorrentes da reperfusão e
minimizam a lesão celular. Todavia, o uso desses agentes é contraindicado em pacientes com
edema pulmonar ou com evidência de disfunção ventricular esquerda grave (ANDERSON et
al, 2011), pois podem levar à hipotensão, bradicardia e bloqueio atrioventricular. Assim,
pioram a insuficiência cardíaca, bem como, podem causar eventos deletérios, como a
taquicardia reflexa (KLEINBONGARD et al, 2012).
Os nitratos são outra classe de agentes farmacológicos utilizados para intervenção no
IAM em virtude de sua capacidade de aumentar a oferta de oxigênio (ANDERSON et al,
2011). Assim, por ser um potente vasodilatador, exerce efeitos na circulação coronariana e na
circulação periférica, onde causa dilatação dos vasos de capacitância, diminuição da pré-
carga, reduz a demanda de oxigênio e aumenta a frequência cardíaca, devido à ativação
reflexa do sistema nervoso autônomo (ANDERSON et al, 2007).
Além disso, os nitratos levam a inibição plaquetária, diminuindo a chance de se
desenvolver trombos (ANDERSON et al, 2011). Entretanto, a utilização dos nitratos é
contraindicada em pacientes hipotensos e/ou em pacientes que apresentem bradicardia ou
taquicardia (ANDERSON et al, 2011).
5
Por sua vez, os anticoagulantes podem ser utilizados em associação a outras
intervenções, como a intervenção coronariana percutânea (PCI), para tratar o IAM ou, ainda,
podem ser utilizados para prevenir esta patologia em virtude de inibirem a agregação
plaquetária, evitando a formação de trombos que podem impedir o fluxo sanguíneo (ELIS et
al, 2008).
Quando utilizados para o tratamento, a recomendação é que os anticoagulantes sejam
utilizados o mais breve possível após a admissão hospitalar do paciente, devendo ser ajustado
conforme a necessidade do mesmo, sendo mantido, geralmente, por até dois anos
(ANDERSON et al, 2007).
Dentre as contraindicações ao uso de anticoagulantes se incluem pacientes com
intolerância ou alergia a esta classe de medicamentos, indivíduos com sangramentos ativos,
pessoas hemofílicas, hipertensos não tratados, pacientes com úlcera gástrica ou com outras
fontes de sangramento gastrointestinal ou genitourinário, e ainda, pacientes com náuseas e
dispepsia (ANDERSON et al, 2011).
Por fim, o PCI, uma das primeiras estratégias a serem empregadas para eliminar de
forma mecânica, a obstrução presente na artéria coronariana, refere-se a uma família de
técnicas percutâneas destinadas a reperfusão do tecido isquêmico (ELIS et al, 2008). Sendo,
habitualmente indicado para pacientes que apresentam lesões coronarianas (ANDERSON et
al, 2011). Apesar dos benefícios alcançados pela PCI, essa técnica tem como desvantagem o
curto tempo hábil entre o início do IAM e a admissão do paciente no ambiente hospitalar para
a realização da PCI. Assim, o procedimento deve ocorrer o mais rápido possível para que seja
capaz de preservar o tecido cardíaco contra os danos ocasionados pelo IAM (ELIS et al,
2008).
2.2. Estresse oxidativo
Fisiologicamente, durante o metabolismo celular, são produzidas diversas moléculas
sinalizadoras, dentre as quais, as espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham funções
importantes na sinalização celular. Dentre as ações ativadas por tais moléculas estão a
manutenção do tônus vascular, a regulação da contratilidade celular, a apoptose e ações
relacionadas à destruição de micro-organismos invasores (YOUNG-HWAN et al, 2010;
VASCONCELOS et al, 2007). Estas moléculas são produzidas por diversas fontes celulares,
6
dente elas, se destacam a xantina oxidase, NADPH oxidase (Nox) e a cadeia transportadora de
elétrons.
A xantina oxidase é uma enzima que esta expressa nos vasos sanguíneos, fígado,
intestino, superfície das células endoteliais e que circula em baixa quantidade no plasma
sanguíneo (MARTINEZ-HERVAS et al, 2010). Essa enzima é responsável por catalisar a
conversão da hipoxantina à xantina e, posteriormente, a xantina desidrogenase converte a
xantina em ácido úrico e gera radical superóxido (O2•-
) (MARTINEZ-HERVAS et al, 2010;
VASCONCELOS et al, 2007).
As Nox são enzimas encontradas em diversas células de mamíferos e em diversos
tipos de tecidos (Tabela 01), constituindo o primeiro exemplo identificado de enzimas
responsáveis pela produção de O2•- (CAVE et al, 2006; KURODA & SADOSHIMA, 2010;
PARAVICINI & TOUYZ, 2008). O sítio catalítico dessa enzima é constituído pelas
subunidades p22phox
, p40phox
, p67phox
e gp91phox
(CAVE et al, 2006; KURODA &
SADOSHIMA, 2010; PARAVICINI & TOUYZ, 2008).
Tabela – 01. Tipos de NADPH oxidase (Nox) e sua distribuição no corpo humano.
Nox Distribuição
Nox1 Encontradas comumente em células vasculares e em células do cólon,
estão envolvidas no crescimento celular e nos processos de defesa;
Nox2 São expressas geralmente em células vasculares, renais, cardíacas e
neurais;
Nox3 Presentes em tecidos fetais e na orelha interna de adultos, onde participam
da função vestibular;
Nox4 São encontradas em células renais, células vasculares e nos osteoclastos;
Nox5 Presente em células dos testículos, células vasculares e tecido linfoide,
essa enzima é dependente do Ca2+
e geralmente camundongos e ratos não
expressam o gene da Nox5;
Duox1 Participação na síntese do hormônio tireoidiano;
Duox2 Participação na síntese do hormônio tireoidiano.
7
Normalmente, quando não estimuladas, as subunidades p40phox
, p47phox
e p67phox
se
encontram no citosol, enquanto que as subunidades p22phox
(Figura 01) e gp91phox
se
encontram integradas à membrana formando uma proteína heterodimérica denominada de
citocromo b558 (CAVE et al, 2006). Esse dímero contém dois hemes na região N-terminal e
dois domínios de ligação na região C-terminal, um para a ligação da nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH) e outro para a ligação da flavina adenina
dinucleotídeo (FAD), formando uma estrutura para a transferência de elétrons (CAVE et
al,2006).
Figura 01 – Estrutura da NADPH oxidase (Nox). FAD = Flavina adenina dinucleotídeo; NADPH =
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase. Figura adaptada de KURODA & SADOSHIMA, 2010.
A subunidade p47phox
quando ativada (Figura 02) por fosforilação, se transloca,
juntamente com as subunidades p40phox
e p67phox
para se associarem ao citocromo b558,
formando um complexo denominado de Nox. Então este complexo, transfere elétrons ao O2
transformando-o em O2•-, havendo, durante esse processo, a participação das proteínas Rac1
ou Rac2 e Rap1A (CAVE et al, 2006).
8
Figura 02 - Eventos mediados pela ativação da Nox. NADPH = Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
oxidase. NADP = Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato. MMP = Metaloproteínase. MAPK = Proteínas
quinases ativadas por mitógenos. SOD = Superóxido dismutase. Esquema adaptado de PARAVICINI &
TOUYZ, 2008.
Assim, o O2•-
produzido pela Nox atua no controle do tônus vascular após sua reação
com o óxido nítrico (NO•), agente vasodilatador, que resulta na formação do peroxinitrito
(ONOO•-), e indisponibilizando, desta forma, o NO
• ( CAVE et al,2006; KURODA &
SADOSHIMA, 2010; PARAVICINI & TOUYZ, 2008). Além disso, o O2•- participa da
regulação do fator indutor de hipóxia-1, que é essencial para a manutenção do suprimento de
O2 (PARAVICINI & TOUYZ, 2008).
Outra fonte celular produtora de ROS é a cadeia transportadora de elétrons que,
durante o metabolismo aeróbico, contribui significativamente para a geração de tais espécies
em um processo denominado de fosforilação oxidativa (KOWALTOWSKI et al, 2009). Nesse
processo, grande parte do volume de O2 sofre redução monoeletrônica ao passar pelos
complexos I e III da cadeia transportadora de elétrons (Figura 03), resultando na geração de
O2•- que, por sua vez, pode sofrer várias reações originando outras ROS (KOWALTOWSKI
et al, 2009).
9
Figura 03 - Formação de espécies reativas de oxigênio e atuação do sistema enzimático antioxidante na
mitocôndria durante a fosforilação oxidativa. NADPH = Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase;
NAD= Nicotinamida adenina dinucleotído ; NADP = Nicotinamida adenina dinucleotído fosfato redutase;
TrxSH = Tioredoxina oxidase; TrxS = Tioredoxina redutase; MnSOD = Superóxido dismutase Manganês;
CuZnSOD = Superóxido dismutase cobre e zinco; Cyt c = Citocromo c; GSH = Glutationa reduzida; GSSG =
Glutationa oxidada; H2O2 = Peróxido de hidrogênio. Figura adaptada de KOWALTOWSKI et al, 2009.
Dentre as ROS formadas a partir do O2•- (Figura 03), o peróxido de hidrogênio (H2O2)
pode ser gerado a partir da dismutação do O2•- na matriz mitocondrial, no espaço
intermembrana ou no citosol por ação da enzima Superóxido Dismutase (SOD) ou pode ser
formado através de reações entre dois O2•- (BARREIROS et al, 2006; BRADY et al, 2006;
KOWALTOWSKI et al, 2009).
Uma vez formado o H2O2, este pode, através da reação de Fenton (Figura 04), reagir
com metais de transição, bem como, reagir com o O2•-, através da reação de Haber-Weiss
(Figura 04), resultando na formação do radical hidroxila (OH•).
10
Figura 04 – Formação de radicais hidroxila (OH•) através das reações de Fenton e Haber-Weiss. Adaptado de
BARREIROS et al, 2006.
Dentre as espécies reativas formadas habitualmente, a OH• e o ONOO
- estão entre as
que apresentam maior reatividade, podendo, portanto reagir com os lipídeos das membranas
celulares, formando o malonaldeído (MDA) (BARREIROS et al, 2006; KOWALTOWSKI et
al, 2009; VASCONCELOS et al, 2007). Logo, é de vital importância que a célula disponha de
um sistema de defesa antioxidante para equilibrar a quantidade de ROS formadas pela xantina
oxidase, Nox e pela cadeia transportadora de elétrons.
Diante disso, para garantir a homeostase a célula apresenta dois sistemas de defesa,
um sistema antioxidante enzimático, composto pelas enzimas SOD, catalase (CAT) e pela
glutationa peroxidase (GPx). E um sistema antioxidante não enzimático, composto
principalmente pelo α-tocoferol (vitamina E), β-caroteno (vitamina A), ubiquinol (CoQH2),
ácido ascórbico (vitamina C) e o ácido diidrolipóico (BARREIROS et al, 2006;
VASCONCELOS et al, 2007).
Todavia, em situações patológicas como no IAM, a interrupção do suprimento
sanguíneo leva a perturbação do equilíbrio entre a produção de ROS e sua remoção pelo
sistema de defesa antioxidante (SHI et al, 2010; WALTERS et al, 2012). Assim, uma série de
fenômenos é iniciada durante a isquemia e se exacerba durante a reperfusão, levando ao
surgimento de arritmias, danos microvasculares (fenômeno no-reflow), atordoamento do
miocárdio e a morte celular.
Durante o período de isquemia (Figura 05), a interrupção do suprimento sanguíneo
devido a obstrução vascular, resulta em diminuição da quantidade de O2 disponível na célula e
11
interrupção da fosforilação oxidativa (WALTERS et al, 2012). Assim, o metabolismo
anaéróbico é acionado, entretanto, este é insuficiente para atender as demandas metabólicas
da célula (WALTERS et al, 2012).
Figura 05 – Alterações no metabolismo celular presentes no período de isquemia. ANT = Transportador adenina
nucleotídeo translocase; ATP = Trifosfato de adenosina; Fox – ox = Fosforilação oxidativa; NADH = Hidreto de
nicotinamida adenina dinucleotídeo; NCX = Trocador sódio-cálcio; NHE = Trocador sódio-hidrogênio; RYR =
Receptor de rianodina; ∆ψ = Potencial de membrana mitocondrial. Esquema adaptado de WALTERS et al, 2012.
Assim, a produção de lactato ao invés de piruvato, resulta em acidificação do meio
intracelular (WALTERS et al, 2012), modulando a atividade do trocador de Na+/H
+. Este
trocador promove o transporte de H+ para o meio extracelular e a entrada do Na
+ para o
citoplasma. Por sua vez, a entrada do Na+ ativa o funcionamento do trocador Na
+/Ca
2+ no
modo reverso. Normalmente, esse trocador atua transportando o íon Ca2+
para o meio
extracelular e o íon Na+ para o citosol, assim no IAM, a atuação de forma reversa desse
sistema de transporte leva à remoção de Na+ do citoplasma e a entrada de Ca
2+, causando a
sobrecarga intracelular deste íon no interior da célula (WALTERS et al, 2012).
Paralelamente, a redução na produção de ATP inibe a SERCA, o transportador ANT e
as ATPases responsáveis pela retirada do Ca2+
intracelular, agravando a sobrecarga de Ca2+
e
12
promovendo alterações no formato e no volume ventricular (WALTERS et al, 2012).
Ademais, o aumento na concentração intracelular desse íon, leva à maior ativação da enzima
xantina oxidase, aumentando a formação de O2•- (DAHALA, 2000; PARAVICINI &
TOUYZ, 2008).
Todavia, durante a reperfusão (Figura 06), o re-estabelecimento do aporte de O2
normaliza o pH intracelular e reativa a fosforilação oxidativa. Entretanto, a cadeia
transportadora de elétrons volta a operar em maior intensidade e produz O2•- em grandes
quantidades, resultando em maior disponibilidade desse radical e, consequentemente, maior
geração de H2O2 (WALTERS et al, 2012). Além disso, o O2•- promove a geração de grandes
quantidades de ONOO•- (PAGLIARO et al, 2011) causando disfunção endotelial e
peroxidação dos lipídeos da membrana celular (BARREIROS et al, 2006).
Figura 06 – Alterações no metabolismo celular presentes no período de reperfusão. ANT = Transportador
adenina nucleotídeo translocase; ATP = Trifosfato de adenosina; Fox – ox = Fosforilação oxidativa; NADH =
Hidreto de nicotinamida adenina dinucleotídeo; NCX = Trocador sódio-cálcio; NHE = Trocador sódio-
hidrogênio; RYR = Receptor de rianodina; ∆ψ = Potencial de membrana mitocondrial. Esquema adaptado de
WALTERS et al, 2012.
A produção aumentada de H2O2, além de sensibilizar maior quantidade de canais para
Ca2+
(YOUNG-HWAN et al, 2010), aumenta a ocorrência das reações de Fenton e de Haber-
13
Weiss gerando mais radicais OH•
(BARREIROS et al, 2006). Esses reagem com os
aminoácidos que compõem as proteínas, gera danos estruturais como fragmentações e
ligações cruzadas, resultando, muitas vezes, em perda da atividade enzimática e danos as
proteínas e aos lipídeos (BARREIROS et al, 2006).
Ademais, o OH• pode prejudicar o transporte ativo, causar danos ao DNA e ao RNA e
levar a abertura do poro mitocondrial de permeabilidade transitória (mPTP), resultando em
morte celular (BARREIROS et al, 2006; VASCONCELOS et al, 2007). Além disso, durante
o estresse oxidativo, ocorre aumento de expressão das Nox1, Nox2, Nox3 e Nox4,
aumentando a quantidade de ROS produzida (PARAVICINI & TOUYZ, 2008), bem como, a
geração de danos ao miocárdio (GALLUZZI et al, 2012).
Em síntese, durante o estresse oxidativo que ocorre no IAM, as células se tornam
propensas a danos estruturais e metabólicos tais como a oxidação dos lipídeos de membrana,
atenuação da atividade enzimática, carbonilação de proteínas, oxidação de aminoácidos e
danos ao DNA e ao RNA (BARREIROS et al, 2006) que culminam no surgimento de lesões
no tecido cardíaco.
2.3. Ácido Úsnico (AU)
O AU (2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3[2H,9bH]-dibenzo-furandiona –
Figura 07) é um produto natural de cor amarelada que pode ser extraído como metabólito
secundário do líquens Cetraria islandica, Usnea dasypoga, Lobaria pulmonaria e Cladonia
substellata (DE CARVALHO et al, 2005).
Figura 07 – Fórmula estrutural plana do ácido úsnico.
14
Essa substância apresenta propriedade lipofílica, sendo, portanto, capaz de passar
livremente através da membrana plasmática, facilitando a sua metabolização (JOSEPH et al,
2009). Além disso, o AU pode ser obtido dos líquens na forma enantiomérica (+),
enantiomérica (-) ou na forma racêmica, sendo o enantiômero (+) a constituição mais estável
e ativa (DE CARVALHO et al, 2005).
Os líquens são organismos simbióticos formados pela associação entre a alga e um
fungo (ODABASOGLU et al, 2006), sendo, portanto, capazes de sintetizar vários metabólitos
alifáticos, cicloalifáticos e aromáticos que, por sua vez, podem exercer ações terapêuticas
sobre o organismo. Assim, diante dessa possibilidade, têm-se estudado a ação desses
metabólitos no organismo.
Dentre os metabólitos estudados, o AU se destaca em função das suas propriedades
descritas, dentre as quais chamam a atenção a ação antimicrobiana (POMPILIO et al, 2013),
antitumoral (SONG et al, 2012), anti-inflamatória (ODABASOGLU et al, 2006) e
antioxidante (BEHERA et al, 2012; FERNANDES, 2013; ODABASOGLU et al, 2006;
RABELO et al, 2012).
Ademais, também foi descrita sua ação gastroprotetora (ODABASOGLU et al, 2006)
e antiprotozoária (DE CARVALHO et al, 2005; SUSSMANN et al, 2011), porém, tem sido
verificado que em altas doses o AU induz hepatotoxicidade, promove o desacoplamento da
cadeia transportadora de elétrons (JOSEPH et al, 2009), aumenta a peroxidação lipídica
(RABELO et al, 2012) e induz a expressão de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo
(YOKOUCHI et al, 2013).
Dentre as utilizações populares do AU, essa substância já foi utilizada em perfumes,
cremes dentais, enxaguante bucal, desodorante, filtro solar, como conservante, corante e como
emagrecedor (JOSEPH et al, 2009). Essa gama de possibilidades evidenciam que os
compostos naturais são, não somente, fontes terapêuticas promissoras (SOKOLOV, 2012)
uma vez que tem potencial para ser usado como fármaco pela indústria farmacêutica
(BEHERA et al, 2012), mas também, como matéria-prima para a indústria de modo geral.
15
2.4. Ciclodextrinas (CDs)
As CDs foram caracterizadas estruturalmente e quimicamente em meados da década de
70 e sua primeira patente foi registrada em 1953. Atualmente, figuram na lista de compostos
seguros publicada pela Food and Drug Administration - FDA (DEVI et al, 2010), órgão
norte-americano responsável pelo controle de alimentos, drogas e outros suplementos. As CDs
são compostos formados por unidades de D-(+) glicopiranose obtidos a partir da degradação
do amido pelas enzimas produzidas pelo Bacilus macerans (SEGURA-SANCHEZ et al,
2009).
As CDs apresentam em sua estrutura cadeias unidas por ligações α-(1,4) glicosídicas
(Figura 08), conferindo-lhes um formato de cone, onde a abertura maior é formada por grupos
2-hidroxil e 3-hidroxil, e a abertura menor é formada por grupos 6-hidroxil (SEGURA-
SANCHEZ et al, 2009).
Figura 08 – Estrutura molecular plana da β-ciclodextrina.
Em virtude dessa conformação, as CDs apresentam, em sua região interna, afinidade
lipofílica e na região externa afinidade hidrofílica, desse modo, quando uma substância com
baixa solubilidade é complexada à CDs, as regiões mais polares da substância interagem com
16
as regiões externas, enquanto que as porções apolares da substância interagem com a região
interna da CDs (SEGURA-SANCHEZ et al, 2009).
A escolha das CDs como excipiente farmacêutico é motivada pelo fato de melhorar a
solubilidade, por não ser tóxica (CEBORSKA et al, 2013) e por diminuir a toxicidade causada
pelas substâncias (DEVI et al, 2010). Além disso, outra vantagem de se complexar compostos
às CDs consiste no aumento da biodisponibilidade, permitindo que a substância complexada
alcance concentrações terapêuticas nos fluidos biológicos com uma farmacocinética desejável
(CEBORSKA et al, 2013; SEGURA-SANCHEZ et al, 2009).
Ademais, as CDs são capazes de proteger as substâncias da degradação do meio
externo (CIOBANU et al, 2012; MOYA-ORTEGA et al, 2012), reduzir a volatilidade
(CIOBANU et al, 2012) e conferir estabilidade química e física (DEVI et al, 2010), além
disso, diminui as chances de polimorfismo (CEBORSKA et al, 2013).
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3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Estudar os efeitos cardioprotetores do pré-tratamento com o complexo de inclusão
Ácido Úsnico (AU)/β-ciclodextrina (βCD) na lesão por isquemia e reperfusão.
3.2. Específicos
Investigar o efeito do pré-tratamento com o complexo de inclusão AU/βCD na
preservação da função contrátil cardíaca após a isquemia e reperfusão;
Avaliar o efeito deste pré-tratamento sobre as arritmias de reperfusão;
Verificar se o pré-tratamento com o complexo de inclusão AU/βCD promove efeito
tóxico ao tecido cardíaco e ao tecido hepático;
Estudar o efeito do pré-tratamento com o complexo de inclusão AU/βCD sobre o
status redox do tecido cardíaco após a isquemia e reperfusão.
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4. MATERIAL & MÉTODOS
4.1. Preparação do complexo de inclusão com β-ciclodextrina (βCD)
O AU (lote: 04028BJ; pureza: 98%) e a βCD (lote: #041M1759V; pureza ≥ 97%)
foram adquiridos da Sigma-Aldrich®. A mistura física (MF) foi preparada mediante mistura
mecânica de 344 mg do AU e 1135 mg da βCD, na proporção molar de 1:1, e a co-evaporação
(CE) foi preparada de acordo com o procedimento anterior seguida de adição de 20 mL de
água destilada e posterior agitação magnética por 36 horas, realizando-se em seguida a
secagem em dessecador de vidro. Todos os procedimentos foram realizados a temperatura
ambiente (MENEZES et al, 2012).
4.2. Caracterização físico-química do complexo de inclusão AU/βCD
Para confirmar a formação do complexo de inclusão entre o AU e a βCD, foram
realizados os experimentos de termogravimetria, termogravimetria derivada, calorimetria
exploratória diferencial, espectrofotometria na região do infravermelho e microscopia
eletrônica de varredura (MENEZES et al, 2012; MENEZES et al, 2014; QUINTANS-
JÚNIOR et al, 2013; SIQUEIRA-LIMA et al, 2014).
4.2.1. Termogravimetria/ termogravimetria derivada (TG/DTG)
As amostras do AU, βCD, MF e CE foram submetidas ao ensaio de TG/DTG. As
curvas TG/DTG foram obtidas por meio de uma termobalança TGA-51, da marca Shimadzu®,
utilizando razão de aquecimento de 10°C/min. As curvas foram obtidas de 25-900ºC, sob
atmosfera dinâmica de N2 (100 mL/min), empregando-se cadinho de platina (Pt),
respectivamente, contendo ~2 mg de amostra.
4.2.2. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
As amostras do AU, βCD, MF e CE foram submetidas ao ensaio de DSC utilizando
um equipamento DSC-60, da marca Shimadzu®
, com razão de aquecimento de 10°C/min. As
curvas foram obtidas de 25-500ºC, sob atmosfera dinâmica de N2 (100 mL/min),
empregando-se cadinho de alumínio contendo ~2 mg de amostra.
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4.2.3. Espectrofotometria na região do infravermelho (FTIR)
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos no comprimento
de onda de 4000-500 cm-1
, em pastilhas de KBr, utilizando equipamento FTIR-Shimadzu®
modelo IRTracer-100, em temperatura ambiente.
4.2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras do AU, βCD, MF e CE foram montadas em stubs de alumínio,
posteriormente metalizados com feixes de ouro e visualizadas em um microscópio eletrônico
(JEOL modelo JSM-6390-LV) em aceleração de voltagem de 8 kV.
4.3. Grupos experimentais
Para a investigação dos efeitos cardioprotetores do complexo de inclusão AU/βCD
foram utilizados ratos Wistar adultos, obtidos do Biotério Central da Universidade Federal de
Sergipe (UFS), pesando entre 250 e 300 g, onde os mesmos foram mantidos na Sala de
animais do Laboratório de Biofísica do Coração (LBC/UFS), em gaiolas com água e ração Ad
libitum, ciclo claro/escuro de 12/12 horas e temperatura controlada (24 ± 1°C). Para o
delineamento experimental, os animais foram distribuídos nos seguintes grupos: ácido úsnico
complexado a β-ciclodextrina (AU) e β-ciclodextrina (βCD)
4.4. Tratamento com AU
Os animais do grupo AU foram pré-tratados por gavagem com 50 mg/ kg/ dia de AU
complexado a βCD, diluidos em solução salina a 0,9%, durante sete dias consecutivos. No
oitavo dia (Figura 09) realizou-se a eutanásia desses animais e a extração do fígado e do
coração para a realização dos ensaios bioquímicos e para a avaliação de parâmetros da função
cardíaca (frequência cardíaca e pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo).
Por sua vez, os animais do grupo βCD receberam igual volume de solução veículo,
sendo adotados os mesmos procedimentos. A dose de AU utilizada foi determinada com base
no estudo de Fernandes (2013), onde foi constatado que a dose de 50 mg/ kg/ dia de AU
complexado a βCD, durante sete dias, não foi prejudicial ao tecido hepático e nem provocou
alterações na contratilidade do miocárdio.
20
Figura 09 – Esquema ilustrativo do protocolo experimental adotado.
4.5. Aspectos éticos
O estudo em questão foi devidamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
com Animais (CEPA/UFS: #55/2012 – Anexo I), durante a execução dos experimentos,
foram obedecidas às normas de manipulação dos animais propostas pelo Conselho Nacional
de Controle de Experimentação Animal (CONCEA/MCT).
4.6. Local da pesquisa
O presente estudo foi realizado no LBC, situado no Departamento de Fisiologia da
UFS, campus São Cristovão, Sergipe.
4.7. Procedimentos
4.7.1 Determinação da pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE) e
determinação da Frequência cardíaca (FC).
Após o término do tratamento, foram administrados 1500 U de heparina e após 15
minutos os animais foram eutanasiados por decaptação, em seguida, o tórax foi aberto para a
retirada do coração. Uma vez retirado, o coração foi canulado no sistema de perfusão de órgão
isolado do tipo Langendorff (BELL et al, 2011).
Logo após, o átrio esquerdo foi retirado para a colocação de um balonete (Figura 10)
conectado a um transdutor pressórico para o registro da PDVE e da FC nas condições basais
do coração e durante o período de reperfusão. Em seguida, os dados foram captados pelo
software WindaqEX® (DataQ Instruments) e analisados através do LabChart7
® (AD
Instruments), onde os dados obtidos de PDVE e de FC durante a reperfusão foram
21
representados em percentual da linha de base.
Figura 10 – Representação esquemática do sistema de perfusão de coração isolado Langendorff. Adaptada de
SKRZYPIEC-SPRING et al. 2007. Onde ―LV‖ representa o balonete colocado no ventrículo esquerdo a partir da
retirada do átrio esquerdo.
4.7.2. Modelo de isquemia
Após a montagem do sistema, foi aguardado um período de 20 minutos de
estabilização (Figura 11), sob a perfusão de tampão de Krebs (contendo em mmol/L: NaCl,
118; KCl, 4,7; KH2PO4, 1,2; MgSO4.7H2O, 1,2; Glicose, 11,1; NaHCO3, 25 e CaCl2, 1,8)
oxigenado (95% de O2 e 0,5% de CO2, 37 °C,) a uma pressão de perfusão constante (80
cmH2O). Depois disso, o fluxo foi ocluído de forma global durante 30 minutos, após esse
tempo, o fluxo foi reestabelecido e o tampão foi reperfundido por 60 minutos sob o
monitoramento da PDVE e da FC.
Figura 11 – Protocolo para a realização da isquemia global.
22
4.7.3. Determinação do índice de severidade da arritmia (ASI).
Conforme Ferreira et al (2001), a severidade das arritmias cardíacas (ASI) foi avaliada
quanto a sua duração nos 30 minutos iniciais do período de reperfusão, considerando-se como
irreversível as arritmias com duração superior a 30 minutos. Todavia, o surgimento de
arritmias com duração menor que 30 minutos foram classificadas conforme a tabela 02.
4.7.4. Ensaios bioquímicos
Amostras de tecidos hepático e cardíaco foram pesadas e utilizadas em conformidade
com os respectivos protocolos para a realização dos ensaios bioquímicos.
4.7.4.1. Determinação da concentração total de proteínas
A concentração de proteínas foi determinada em triplicata pelo método de Lowry
(1951). Para tanto, foram adicionados às amostras NaOH (0,5 mmol/L) e após 15 minutos
adicionado Na2CO3 3%, KNaC4H4O6·4H2O 4%, CuSO4 2% e reagente de Folin (1:1). Em
seguida, foram incubadas por 30 minutos e depois realizada leitura a 630 nm em
Tabela – 02. Determinação do Índice de severidade de arritmia (ASI).
Duração (min) Fator
<3 2
3-6 4
7-10 6
11-15 8
16-20 10
21-25 11
26-30 12
>30 Irreversível
23
espectrofotômetro de placa (ELx800, BIOTEK Instruments®) e por fim, foi construída uma
curva padrão de albumina bovina (Sigma-Aldrich®) para aferição da concentração de
proteínas nas amostras testes.
4.7.4.2. Mensuração da atividade enzimática
4.7.4.2.1. Determinação da atividade da SOD
As amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão salina fosfato (PBS - 50
mmol/L, pH 7,4) e centrifugadas a 12000 rpm (Heal Force, Neofuge 15R) por 30 minutos. A
reação foi realizada pipetando-se em triplicata na microplaca: o sobrenadante obtido, PBS,
MTT (1,25 mmol/L) e pirogalol (100 µmol/L). Em seguida, a microplaca foi agitada por 5
minutos e adicionado DMSO. A leitura foi realizada em espectrofotômetro de microplaca
(Biotek, ELx800 Absorbance Microplate Reader) a 570 nm e a atividade da SOD expressa em
unidade de SOD por miligrama de proteína (MADESH & BALASUBRAMANIAN, 1998).
4.7.4.2.2. Determinação da atividade da CAT
As amostras foram homogeneizadas em PBS, em seguida, os homogenatos
centrifugados (Heal Force, Neofuge 15R) a 12000 rpm por 30 minutos a 4 °C. Em cubeta de
quartzo foram pipetados tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7,0) e o sobrenadante. A reação foi
iniciada com a adição de H2O2 (0,3 mol/L), em ambiente protegido de luz, e as medidas
realizadas em espectrofotômetro (Hitachi, Japão), em intervalos de 15 segundos, a 25 ºC, no
comprimento de onda de 240 nm. A atividade da enzima foi expressa pela diferença da
variação das absorbâncias (ΔE) /minuto/miligrama de proteínas (NELSON & KIESOW,
1972).
4.7.4.2.3. Determinação da atividade da Lactato desidrogenase (LDH)
Para a determinação da atividade dessa enzima, foi coletado o perfusato durante o
período de estabilização e durante o período de reperfusão, em seguida, foi adicionado o kit
para determinação da atividade da LDH (LabTeste) a 340 nm em espectrofotômetro (Hitachi,
Japão) conforme instruções do fabricante.
24
4.7.4.3. Determinação da concentração de Grupamentos Tióis
Resumidamente, os tecidos foram homogeneizados em PBS, centrifugado a 12000
rpm (Heal Force, Neofuge 15R) por 30 minutos. Em seguida, as amostras em triplicata foram
incubadas com DTNB (0,3 mmol/L) durante 10 minutos e depois foram lidas em
espectrofotômetro a 412 nm para posteriormente serem comparadas a uma curva padrão de
cisteína (SEDLAK & LINDSAY, 1967).
4.7.4.4. Mensuração de produtos da peroxidação lipídica através do teste de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
As amostras foram pesadas e homogeneizadas em 10 vezes o volume de solução de
tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7,4), contendo butil-hidroxitoluol (BHT; 12,6 mmol/L). Em
seguida, 200 µL do homogenato foram incubados a 90°C por 45 minutos com solução
contendo ácido tiobarbitúrico (TBA 0,37%), em meio ácido (15% de ácido tricloroacético-
TCA e 0,25 mol/L de ácido clorídrico).
Em seguida, as amostras foram centrifugadas por cinco minutos a 14.000 rpm. Ao
sobrenadante, acrescentou-se o n-butanol e a solução saturada de NaCl. A mistura foi agitada
em vórtex por 30 segundos e novamente centrifugada a 14.000 rpm (Heal Force, Neofuge
15R) por dois minutos.
Alíquotas do sobrenadante foram pipetadas em placas de 96 poços para a leitura da
absorbância em espectrofotômetro de microplaca (Biotek, ELx800 Absorbance Microplate
Reader) a 535 nm, corrigindo pelos valores de absorbância a 572 nm. A quantidade de MDA
produzida foi expressa em nanomol por gramas de tecido e interpretada como marcador de
peroxidação lipídica formado pela reação com o ácido tiobarbitúrico (BOSE et al., 1989).
4.6. Análise estatística
Os dados obtidos foram tabulados no Microsoft Exel 2010, em seguida, as médias
calculadas foram exportadas para o software Prisma 5.1 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) e
analisadas através do teste t Student, não pareado, representando-se os dados em média + erro
padrão da média, adotando-se como nível de significância p < 0,05.
25
5. RESULTADOS
5.1. Caracterização físico-química do complexo de inclusão AU/βCD
5.1.1. TG/ DTG
As curvas TG/ DTG (Figura 12) demonstram as perdas de massa das amostras em
estudo nas faixas de temperatura descritas na Tabela 03. A curva TG/ DTG do AU apresenta
duas etapas de perdas de massa, a primeira na faixa de 200 a 330ºC, onde há decomposição
de material, e a segunda entre 330 a 713ºC onde houve formação de material carbonáceo da
amostra. A curva TG/ DTG da βCD apresentou perda de água no intervalo de 26 a 120ºC,
seguida da decomposição da amostra. Já nas curvas TG/ DTG da MF e da CE, na faixa de 26
a 120ºC, pode-se observar a liberação de água característica da βCD.
A segunda etapa é característica da decomposição do AU presente nas amostras. A
perda de massa da MF representa 31,3% da decomposição do AU, enquanto a CE representa
37,2% dessa etapa. Na faixa de 316 a 386ºC é possível sugerir a complexação do AU a
molécula de βCD, uma vez que a decomposição do AU foi de 6,8% e valores superiores
foram apresentados por MF e CE, sendo atribuídos a decomposição de AU/βCD. A última
etapa relatada na Tabela 03 representa a formação de material carbonáceo das amostras.
Figura 12 - Curvas TG/DTG do AU, β-CD, MF e CE obtidas em atmosfera de N2. AU = ácido úsnico;
β-CD = β-ciclodextrina; MF = mistura física; CE = co-evaporado; TG = termogravimetria; DTG =
termogravimetria derivada.
26
Tabela – 03. Percentuais de perdas de massa obtidas por TG/DTG do AU, CD, MF e CE.
AU = ácido úsnico; βCD = β-ciclodextrina; MF = mistura física; CE = co-evaporado
5.1.2. DSC
A curva DSC do AU (Figura 13) apresentou um evento endotérmico na faixa de 190 a
214ºC característico da fusão da amostra. Na curva DSC da βCD foram observados dois
eventos endotérmicos, o primeiro na faixa de 35 a 124ºC típico de liberação de moléculas de
água da sua estrutura e o segundo evento ocorreu na faixa de 283 a 341ºC relativo a sua fusão.
A curva da MF apresentou três eventos endotérmicos, o primeiro na faixa de 50 a 117ºC, o
segundo 194 a 212ºC característico da fusão do AU, demonstrando que o método não é
eficiente para formar complexos de inclusão e o último, 293 a 337ºC, refere-se a fusão da
βCD. Ao analisar a curva da CE, é possível observar o desaparecimento do evento de fusão do
AU, o que sugere a complexação por esse método, visto que na curva da MF foi observada a
fusão do AU. No que se refere aos eventos relativos a βCD presente no complexo, os mesmos
ocorreram nas faixas de 31-137°C e 291-359°C respectivamente.
Amostra m1 (%) m2 (%) m3 (%) m4 (%)
26-120°C 120-316°C 316-386°C 386-900°C
AU 0,4 51,6 6,8 41,2
βCD 11,7 1,9 61,4 25,0
MF 10,8 16,2 54,4 18,7
CE 10,4 19,2 54,4 16,0
27
Figura 13 – Curvas DSC do AU, βCD, MF e CE obtidas em atmosfera de N2. AU = ácido úsnico; βCD = β-
ciclodextrina; MF = mistura física; CE = co-evaporado; DSC = calorimetria exploratória diferencial; ENDO =
endotérmico.
5.1.3. FITR
A Figura 14 apresenta o espectro de FTIR de AU, βCD, MF e CE. No espectro que
corresponde ao AU é possível observar uma banda na região de 3088 cm-1
(Tabela 04) que
está relacionado ao grupo funcional C-C. A banda encontrada na região espectral de 2980-
2929 cm-1
corresponde ao modo de estiramento C-H (CH3 ligado a carbono primário). É
possível observar outra banda na região de 1690 cm-1
que está relacionada ao grupo cetônico
conjugado e a faixa de 1716 cm-1
caracteriza grupos cetônicos não conjugados.
Figura 14 - Espectros de infravermelho do AU, βCD, MF e CE obtidos na faixa espectral de 4000 a 500cm-1
.AU
= ácido úsnico; βCD = β-ciclodextrina; MF = mistura física; CE = co-evaporação.
28
Tabela – 04. Grupos funcionais identificados a partir do espectro de FTIR.
Grupo Funcional Faixa do espectro de absorbância (cm-1
)
OH 3341
C-C 3088
CH3 ligado a carbono primário 2980 a 2929
CH e CH2 2926
Grupo cetônico não conjugado 1716
Grupo cetônico conjugado 1690
OH 1647
Grupos conjugados e grupos doadores de elétrons
em anéis aromáticos
1630
CH 1411, 1368, 1335, 1301 e 1246
Grupo C-O-C de éteres alifáticos 1283, 1190, 1144, 1114, 1069, 1039
Grupos éter e OH 1154, 1080 e 1027
Por sua vez, a banda em 1630 cm-1
corresponde aos grupos conjugados e grupos
doadores de elétrons em anéis aromáticos. Também foi possível observar bandas simétricas
referentes ao grupo C-O-C de éteres alifáticos em 1283, 1190, 1144, 1114, 1069, 1039 cm-1
.
O espectro de infravermelho da βCD pura mostra uma banda larga com o máximo de
absorção a cerca de 3341 cm-1
, devido as vibrações do alongamento dos diferentes grupos
hidroxila (OH) da βCD.
A banda em 1647 cm-1
, bem visível, está relacionada com as vibrações desses grupos
OH. O espectro apresenta uma série de outras bandas, principalmente a 2926 cm-1
(vibrações
C-H e de alongamento dos grupos CH e CH2), em 1411, 1368, 1335, 1301 e 1246 cm-1
devido
as vibrações de alongamento C-H, e em 1154, 1080 e 1027 cm-1
são atribuídas as vibrações
do alongamento C-O, das ligações entre os grupos éter e hidroxila.
Na análise dos espectros que correspondem a MF e CE, pode-se observar a presença
do AU nas amostras nas regiões de 1716, 1690 e 1144, cm-1
, com maiores intensidades no
espectro da CE.
29
5.1.4. MEV
Na Figura 15 são apresentadas as fotomicrografias do AU, βCD, MF e CE, onde
podem ser observados os cristais do AU com formas retangulares bem definidas. Da mesma
forma, os cristais da βCD também se apresentam retangulares, no entanto, mais largos e com
pequenas partículas aderidas a sua superfície.
Figura 15 - Fotomicrografias do AU, βCD, MF e CE obtidas nos aumentos de 800 e 1000x, sob aceleração de
voltagem de 8eV. AU = ácido úsnico; βCD = β-ciclodextrina; MF = mistura física; CE = co-evaporação.
Na MF, pode-se observar a não formação de complexo de inclusão, uma vez que os
cristais de AU e βCD estão separados, demonstrando a falta de interação entre ambos.
Entretanto, na amostra preparada pelo método da CE pode-se observar a alteração na forma
dos cristais demonstrando a interação entre eles. Dessa forma, pode-se inferir que houve
formação de complexo de inclusão por esse método.
30
5.2. Determinação da PDVE e da FC
Com o objetivo de verificar os possíveis efeitos do pré-tratamento com o complexo de
inclusão AU/βCD sobre a contratilidade de corações submetidos à isquemia e reperfusão,
foram determinados os valores de PDVE e de FC. Nas condições basais (Figura 16), ficou
evidenciado que o pré-tratamento não interfere neste dois parâmetros analisados (Painel A -
PDVE: AU/βCD - 4,6 + 0,3 cmHg vs βCD - 4,5 + 0,4 cmHg, e Painel B - FC: AU/βCD -
258,7 + 27,2 BPM vs βCD - 273,3 + 9,7 BPM).
Figura 16 – PDVE (Painel A) e FC (Painel B) de animais pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e
de animais tratados somente com βCD durante a situação basal. PDVE = Pressão Desenvolvida no Ventrículo
Esquerdo; FC = Frequência Cardíaca; BPM = Batimentos por minuto; AU/βCD = ácido úsnico/β-ciclodextrina;
βCD = β-ciclodextrina. Teste t Student não pareado.
Durante o período de reperfusão (Figura 17 - painel A), foi observado que o pré-
tratamento com o complexo de inclusão foi capaz de manter a PDVE nos grupos estudados
(AU/βCD: 89,9 + 6,3% vs βCD: 53,9 + 8,6%; p < 0,05), porém não houve alterações na FC
(Figura 17, painel B – AU/βCD: 78,5 + 8,6% vs βCD: 79,6 + 9,2%, p > 0,05).
31
Figura 17 – PDVE (Painel A) e FC (Painel B) de animais pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e
de animais tratados somente com βCD durante o período de reperfusão. Os valores estão representados em
percentual (%) da linha de base (período da estabilização). PDVE = Pressão Desenvolvida no Ventrículo
Esquerdo; FC = Frequência cardíaca; AU/βCD = ácido úsnico /β-ciclodextrina; βCD = β-ciclodextrina. *p<0,05
Teste t Student não pareado.
5.3. Determinação do ASI
As alterações no ritmo cardíaco durante a reperfusão foram determinadas pela
pontuação do ASI nos 30 primeiros minutos do período de reperfusão (Figura 18). Assim, foi
constatado que o pré-tratamento com o complexo de inclusão AU/ βCD (2,5 + 0,5 u.a.)
conferiu menores pontuações no ASI quando comparado ao grupo pré-tratado com βCD
(11,00 + 0,57 u.a; p < 0,0001).
32
Figura 18 – ASI obtido pelos corações isolados de ratos pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e
com βCD após a indução da lesão por isquemia e reperfusão. Na tabela superior encontra-se o fator atribuído, a
cada coração, de acordo com a duração dos eventos arrítmicos apresentados durante a reperfusão.ASI = Índice
de Severidade de Arritimia; u.a. = unidades arbitrárias.; AU/βCD = ácido úsnico (AU)/β-ciclodextrina;βCD = β-
ciclodextrina.***p < 0,001. Teste t Student não pareado.
5.4. Determinação da atividade da LDH
Na perspectiva de se investigar se o pré-tratamento com o complexo de inclusão
AU/βCD induziu lesão no tecido cardíaco, a quantidade da enzima LDH liberada (Figura 19)
foi determinada na situação basal, constatando-se que essa medida não está alterada nestes
animais (AU/βCD: 0,071 + 0,023 vs βCD:0,071 + 0,028). Entretanto, durante o período de
reperfusão o pré-tratamento com o complexo de inclusão AU/βCD se mostrou capaz de
diminuir a quantidade de LDH liberado no perfusato (0,063 + 0,026 U/L) , quando comparado
ao grupo pré-tratado com βCD (0,223 + 0,036 U/L; p < 0,05), evidenciando ação protetora.
Figura 19 – Quantidade liberada de LDH mensurado durante a situação basal e após o período de reperfusão em
animais pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD ou βCD. LDH = Lactato Desidrogenase. AU/βCD =
ácido úsnico/ β-ciclodextrina; βCD = β-ciclodextrina. *p < 0,05 em relação a sua respectiva condição basal; ##p
< 0,01 em relação ao periodo de reperfusão do grupo βCD. Teste t Student.
5.5. Mensuração de produtos da peroxidação lipídica
Para verificar se o pré-tratamento induz alteração da peroxidação lipídica pela sua
possível toxicidade, no tecido hepático foi medido a concentração de MDA (Figura 20 –
painel A). Constando-se que esta medida não foi alterada pelo pré-tratamento (AU/βCD: 8,59
+ 0,27 nmol de MDA/g de tecido vs βCD: 8,43 + 0,21 nmol de MDA/g de tecido). Todavia,
33
ao investigar a formação de produtos da peroxidação lipídica no coração após a lesão por
isquemia e reperfusão (Figura 20 – painel B), verificou-se que o pré-tratamento com o
complexo de inclusão AU/βCD foi capaz de reduzir a formação de tais produtos (5,87 + 0,57
nmol de MDA/g de tecido) quando comparado ao grupo tratado com βCD (13,02 + 1,04 nmol
de MDA/g de tecido; p < 0,001).
Figura 20 – Concentração de MDA em fígado (Painel A) e em coração (Painel B) de ratos pré-tratados com o
complexo de inclusão AU/βCD e com βCD. MDA = malondialdeído, AU/βCD = ácido úsnico/ β-ciclodextrina;
βCD = β-ciclodextrina. ***p<0,0001. Teste t Student, não pareado.
5.6. Atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT
Para confirmar se o pré-tratamento com o complexo de inclusão não induz toxicidade
no fígado (Figura 21) bem como, verificar sua ação antioxidante no coração submetido à
isquemia e reperfusão (Figura 22), as atividades das enzimas SOD e CAT foram mensuradas.
Assim, constatou-se que, em tecido hepático, o pré-tratamento não interferiu com a atividade
da SOD (AU/βCD: 0,025 + 0,001 U SOD/ mg de proteína vs βCD: 0,026 + 0,001 U SOD/mg
de proteína - Figura 21 – painel A) e nem com a atividade da CAT (AU/βCD: 0,020 + 0,004
ΔE/min/mg de proteína vs βCD: 0,015 + 0,002 ΔE/min/mg de proteína - Figura 21 – painel
B).
34
Figura 21 – Atividade das enzimas antioxidantes SOD (Painel A) e CAT (Painel B) dosadas em fígado de ratos
pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e com βCD. SOD = superóxido dismutase. CAT = catalase;
AU/βCD = ácido úsnico/ β-ciclodextrina; βCD = β-ciclodextrina. Teste t Student, não pareado.
Entretanto, ao se investigar a atividade antioxidante do complexo de inclusão AU/βCD
em corações submetidos a lesão por isquemia e reperfusão, verificou-se que o pré-tratamento
promoveu a atividade da SOD (AU/βCD: 0,086 + 0,013 U SOD/mg de proteína vs βCD 0,050
+ 0,004 U SOD/mg de proteína; p < 0,05 - Figura 22 – painel A) e da CAT (AU/βCD: 0,054 +
0,006 ΔE/min/mg de proteína vs βCD: 0,023 + 0,002 ΔE/min/mg de proteína, p < 0,001 -
Figura 22 – painel B).
Figura 22 – Atividade das enzimas antioxidantes SOD (Painel A) e CAT (Painel B) dosadas em coração de
ratos pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD e pré-tratados com βCD, ambos submetidos a lesão por
isquemia e reperfusão. SOD = superóxido dismutase. CAT = catalase; AU/βCD = ácido úsnico/ β-ciclodextrina;
βCD = β-ciclodextrina.*p < 0,05. ***p < 0,001. Test t Student, não pareado.
35
5.7. Determinação dos grupamentos Tióis
Investigando-se ainda a toxicidade e a atividade antioxidante do complexo de inclusão
AU/βCD, foi determinado a concentração de grupamentos tióis no fígado e coração. Assim,
ficou evidenciado, em tecido hepático (Figura 23 – painel A), o aumento da presença desses
grupamentos nos animais pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD (AU/βCD:245,4
+ 15,6 µmol/mg de proteína vs βCD: 181,8 + 14,3 µmol/mg de proteína; p < 0,05),
denotando-se que o pré-tratamento teve atividade antioxidante.
Do mesmo modo, após submeter o coração isolado à isquemia e reperfusão (Figura 23
– painel B) também foi observado maior concentração de grupamentos tióis nos animais pré-
tratados com AU/βCD (AU/βCD: 97,83 + 4,23 µmol/mg de proteína vs βCD: 54,31 + 3,28
µmol/mg de proteína, p < 0,001).
Figura 23 – Concentração de grupamentos tióis em amostras de fígado (Painel A) e em amostras de corações
(Painel B) de ratos pré-tratados com o complexo de inclusão AU/βCD ou pré-tratados com somente βCD.
AU/βCD = ácido úsnico/ β-ciclodextrina; βCD = β-ciclodextrina. *p<0,05; ***p<0,0001. Teste t Student, não
pareado.
36
6. DISCUSSÃO
A doença cardíaca isquêmica secundária ou IAM é um dos problemas de saúde mais
prevalentes no mundo, e uma das principais causas de morbidade e mortalidade (ZWEIER &
TALUKDER, 2006). A reoxigenação miocárdica desencadeia as lesões de reperfusão que são
responsáveis pelo surgimento de alterações tanto contráteis quanto oxidantes, as quais são
representadas por arritmias ventriculares e até mesmo por morte celular (BRASILEIRO,
1997).
O tratamento do IAM tem focado basicamente na redução da demanda metabólica da
maquinaria cardíaca contrátil para minimizar os danos provocados pelo baixo suprimento de
O2, todavia, esta intervenção é ineficiente no controle do estresse oxidativo gerado no
IAM (BAINEY & ARMSTRONG, 2014).
A interrupção do suprimento sanguíneo para o coração causa, além da produção
aumentada de ROS, a diminuição da ativação do sistema de defesa antioxidante que promove
o estresse oxidativo celular (WALTERS et al, 2012). As ROS reagem com fosfolípideos e
proteínas, produzindo a peroxidação lipídica, oxidação de grupos tióis e mudanças na
configuração estrutural e na permeabilidade da membrana celular (BARREIROS et al, 2006;
GALLUZZI et al, 2012). Além disso, no IAM ocorre diminuição da produção de ATP, menor
atividade da SERCA e da bomba de Na+-K
+, acúmulo intracelular de Ca
2+, geração de
arritmias, diminuição da contratilidade do miocárdio e morte celular (BRADY et al, 2006;
IMAHASHI et al, 1999; TAKAMATSU, 2008).
A diminuição da função cardíaca é uma complicação frequentemente observada em
situações de estresse oxidativo (TEMSAH et al, 1999) sendo, geralmente, justificado pelas
alterações presentes na SERCA e o receptor da rianodina, favorecendo o aumento da
concentração intracelular do íon Ca2+
(WAGHORN et al, 2011; WALTERS et al, 2012).
Assim, ocorrem a hipercontração cardíaca, ativação descoordenada da maquinaria contrátil e
falha no mecanismo de acoplamento-excitação-contração (PAGLIARO et al, 2011;
WALTERS et al, 2012). Observa-se ainda diminuição da pressão ventricular durante a sístole,
aumento da pressão diastólica e da FC, resultando em déficit no volume de ejeção, podendo
evoluir para a insuficiência cardíaca, que é uma complicação bastante comum após o IAM
37
(DUNKER et al, 2009; PAGLIARO et al, 2011; QI et al, 2011; WAGHORN et al, 2011;
WALTERS et al, 2012).
Em humanos foi demonstrado a ocorrência de depleção de antioxidantes endógenos
não enzimáticos durante a isquemia e reperfusão do miocárdio. Este achado indica que a
suplementação com produtos antioxidantes tem importância como terapia alternativa ao
tratamento convencional da isquemia cardíaca (AKAHLAGHI & BANDY, 2009).
Muitos antioxidantes encontrados em produtos naturais podem intervir e ajudar na
prevenção de lesões de reperfusão (SUZUKI et al., 2007; TOUFEKTSIAN, 2008) uma vez
que a utilização dos agentes farmacológicos para atenuar as consequências de tais lesões
mostra limitações (FERDINANDY et al, 2007).
Desse modo, compostos antioxidantes podem atuar protegendo as estruturas celulares
envolvidas com o controle do ciclo de Ca2+
a partir do sequestro das ROS, dessa forma, os
antioxidantes impedem a oxidação dos resíduos de cisteína presentes nas estruturas
responsáveis pela captação do íon Ca2+
, assegurando a preservação do mecanismo de
acoplamento-excitação-contração (BARREIROS et al, 2006; PAGLIARO et al, 2011; QI et al,
2011). Neste contexto, o AU é um metabólito secundário abundante em líquens que apresenta
propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias descritas na literatura (BEHERA et al, 2012;
DE CARVALHO et al, 2005; ODABASOGLU et al, 2006; WHITE et al, 2014). Tais
propriedades nos levaram a propor o presente estudo, no qual, inicialmente investigamos uma
dose de AU que não produzisse efeito inotrópico positivo (Figura 16, painéis A e B), evitando
assim alterações na concentração intracelular de Ca2+
e o aumento da carga de trabalho,
fatores que poderiam ser prejudiciais ao coração após a indução da lesão por isquemia e
reperfusão.
Depois disso, buscamos investigar se a sua utilização seria capaz de atuar sobre o
estresse oxidativo gerado pelo IAM e, assim, promover a cardioproteção. Nossos resultados
mostraram que, de fato, o pré-tratamento dos animais com o AU complexado a βCD, durante
sete dias, foi capaz de preservar a PDVE após a lesão por isquemia e reperfusão (Figura 17).
Em situação semelhante, Brookes et al (2002) e Barteková et al (2010) ao utilizarem o
produto natural quercetina para promover a cardioproteção após a lesão por isquemia e
reperfusão, verificaram que essa substância foi capaz de preservar a força de contração
38
cardíaca, mostrando que a utilização de produtos naturais antioxidantes pode preservar a
função cardíaca a partir da atuação sobre o estresse oxidativo.
Testai et al (2013) ao compararem o efeito cardioprotetor do pré-tratamento de ratos
com os diferentes produtos naturais: crisina, apigenina e narigenina, na dose de 100 mg/kg,
cada, observaram que as substâncias promoveram cardioproteção e preservaram a pressão
produto apesar de terem sido administradas 02 horas antes de se induzir a lesão por isquemia
e repefusão em modelo ex-vivo.
Da mesma forma, Senthamizhselvan et al (2014) ao investigar o efeito cardioprotetor
do pré-tratamento de ratos com Diosmina, durante 07 dias, em modelo ex-vivo de isquemia e
reperfusão, nas doses de 50 mg/kg e de 100 mg/kg observaram que o pré-tratamento com esse
produto natural foi capaz de manter os valores de pressão produto.
Duan et al (2012) ao investigarem, em modelo de isquemia e reperfusão, ex-vivo, o
efeito do tratamento de ratos com curcumina, observou que o tratamento com esse produto
natural, na concentração de 1 µmol/L, foi capaz de preservar a força de contração do
ventrículo esquerdo.
Por sua vez, Lin, J-F. et al (2008) ao investigar, em modelo in vivo de isquemia e
reperfusão, os efeitos do tratamento com resveratrol nas doses de 0,1 mg/kg e 1 mg/kg,
durante 04 semanas, verificaram que o resveratrol não produziu efeitos na pressão ventricular
sistólica, todavia reduziu a pressão diastólica no ventrículo esquerdo, promovendo o
relaxamento. Yamazaki et al (2008) ao investigarem o efeito preventivo da utilização da (-)-
epicatecina, na dose de 1 mg/kg/dia em modelo de isquemia e reperfusão, in vivo, durante 10
dias também não observaram efeitos na pressão ventricular esquerda. Além da propriedade
intrínseca das substâncias utilizadas, os resultados desses dois últimos trabalhos podem ser
justificados pela baixa dose de antioxidante administrada.
Outra complicação causada pelo estresse oxidativo gerado no IAM são as arritmias de
reperfusão (TAKAMATSU, 2008). As arritmias são conceituadas como distúrbios do ritmo
do coração provocados por anormalidades na formação ou na condução dos impulsos
cardíacos (TAKAMATSU, 2008). Tais anormalidades podem ser resultantes do acúmulo
intracelular de Ca2+
em áreas de lesão isquêmica, resultando em ativação do funcionamento
inverso do trocador Na+/Ca
2+ e produção de uma corrente despolarizante de entrada ao final
39
do período de despolarização, facilitando a deflagração de potenciais de ação (NECO et al,
2012). Desse modo, ocorre perda da homogeneidade na condução dos estímulos, favorecendo
a gênese de arritmias, disfunções ventriculares e morte do paciente, sendo, portanto, as
arritmias consideradas um fator de risco (TAKAMATSU et al, 2008). Assim, a utilização de
agentes antioxidantes pode se tornar uma medida eficaz na prevenção das arritmias, pois esses
compostos são capazes de minimizar a concentração intracelular de Ca2+
(DAHALA et al,
2010).
No presente estudo, foi demonstrado que a utilização do complexo de inclusão
AU/βCD diminuiu a duração de eventos arrítmicos, observado pela menor pontuação do ASI
(Figura 18). Desta maneira, podemos propor, com este achado, que o complexo de inclusão
provavelmente pode estar diminuindo a concentração intracelular de Ca2+
por três diferentes
mecanismos, (1) por ação direta sobre as ROS, (2) através da ativação do sistema de defesa
antioxidante, preservando o funcionamento das estruturas relacionadas ao ciclo do Ca2+
ou (3)
bloqueando os canais para Ca2+
. Corroborando essa última hipótese, Mendonça (2009)
observou, em átrio isolado, que 100 µmol/L de AU é capaz de bloquear o canal para Ca2+
.
Liao et al (2011) ao demonstrar que, em modelo in vivo de isquemia e reperfusão, o
pré-tratamento de ratos com o produto natural Luteolina reduziu a presença e a duração de
eventos arrítmicos, nas doses de 1µg/kg e 10µg/kg quando administrados 15 minutos antes de
induzir a lesão por isquemia e reperfusão, desse modo, evidenciando os efeitos
cardioprotetores deste produto natural.
Além das arritmias e das alterações na função cardíaca, a lesão celular é outro achado
comum no IAM (BROOKES et al, 2002; DAHALA et al, 2010; SENTHAMIZHSELVAN et
al, 2014). Essas lesões provocadas pela interação das ROS com moléculas biológicas são
resultado da peroxidação lipídica e formação do MDA, havendo extravasamento da enzima
LDH (BARREIROS et al, 2006; SUN et al, 2012; VASCONCELOS et al, 2007; ZI-LIN L. et
al, 2013; WALTERS et al, 2012). O LDH é, portanto, um marcador bioquímico de lesão
celular comumente utilizado em situações cardíacas patológicas (DAHALA et al, 2010; ZI-
LIN L. et al, 2013).
Em nosso trabalho, ao mensurarmos as quantidades de LDH liberados e de MDA
formadas após a lesão por isquemia e reperfusão (Figura 19 e figura 20 – painel B),
40
verificamos que o pré-tratamento dos animais com AU/βCD reduziu a liberação de LDH, bem
como a formação de MDA. Este resultado é corroborado pelo estudo de Zu-Qing Su et al
(2014) que ao investigar, os efeitos anti-inflamatórios do pré-tratamento com AU, durante 05
dias, em modelo de lesão pulmonar induzido por LPS em camundongos, verficou que o pré-
tratamento com AU nas doses de 50 mg/kg e 100 mg/kg reduz a formação de MDA
A reativação da cadeia transportadora de elétrons após a isquemia e reperfusão
cardíaca resulta na produção de grandes quantidades de O2•- que se somam a outras frações de
O2•- produzidos por outras vias, tais como a via da xantina oxidase e via da Nox, tornando-se
a ROS predominante nestas células (LENOVEN et al, 2008). Assim, o O2•- produzido se
acumula tanto intra quanto extracelularmente e interage com outras moléculas biológicas,
dando início a uma série de eventos responsáveis por gerar mais ROS, além de resultar em
acúmulo de Ca2+
, abertura do poro mPTP e ativação da cascata de sinalização envolvida com
a morte celular (BRADY et al, 2006).
Nesse contexto, a atuação de um sistema antioxidante é um recurso necessário para
eliminar esse radical, restabelecendo o status redox celular fisiológico e preservando os
componentes regulatórios do poro mPTP, impedindo sua abertura (BRADY et al, 2006;
PAGLIARO et al, 2011). A SOD, enzima pertencente ao sistema antioxidante, pode ser
encontrada nos compartimentos extra e intracelulares nas isoformas CuZnSOD e MnSOD,
ambas responsáveis pela dismutação do radical O2•- (DAHALA et al, 2010; LENOVEN et al,
2008).
No presente estudo foi observado que o pré-tratamento dos animais com o complexo
de inclusão AU/βCD promoveu o aumento da atividade da SOD (Figura 22 – painel A) e
aumentou a quantidade de grupamentos tióis (Figura 23 – painel B) no tecido cardíaco após a
lesão por isquemia e reperfusão, provavelmente, conferindo proteção contra as alterações
provocadas pelo estresse oxidativo. De forma semelhante, Odabasoglu et al (2006) ao
verificar os efeitos do pré-tratamento em ratos, durante 06 horas, com AU nas doses de 25,
50, 100 e 200 mg/kg na lesão gástrica induzida por indometacina, verificou que todas as doses
promoveram a atividade da SOD e causaram efeito gastroprotetor.
Zu-Qing S. et al (2014) também observaram que o pré-tratamento de ratos com AU foi
capaz de promover o aumento da atividade da SOD. Em estudo realizado in vitro, Fernandes
41
(2012) observou que o complexo de inclusão AU/βCD, na concentração de 10 nmol/L, foi
capaz de reduzir a formação de O2•-em células cardíacas isoladas tratadas com esta substância.
Outra enzima antioxidante que se destaca é a CAT. Essa enzima, em situações de
estresse oxidativo protege a célula contra os efeitos deletérios provocados pelo aumento da
concentração de H2O2, uma das ROS com grande potencial de interação com outras moléculas
celulares (BARREIROS et al, 2006; LENOVEN et al, 2008). Desse modo, esta enzima
catalisa a reação que converte o H2O2 em H2O e O2, diminuindo a quantidade de H2O2
presente na célula e, consequentemente, reduz a interação dessa ROS com os canais para Ca2+
tipo L. Além disso, essa enzima reduz a produção de OH•, impedindo a abertura do poro
mPTP e a geração de morte celular (BRADY et al, 2006; YOUNG-HWAN et al, 2010).
No presente estudo, ao analisarmos a atividade da enzima CAT em corações
submetidos a lesão por isquemia e reperfusão ficou evidenciado que o pré-tratamento dos
animais com o complexo de inclusão AU/βCD promoveu o aumento da atividade dessa
enzima (Figura 22 – painel B). Contrariamente, Odabasoglu et al (2006) observaram que o
pré-tratamento com AU reduziu a atividade da CAT no estômago de ratos com úlcera gástrica
induzida por indometacina. Esta divergência do nosso resultado pode ser devido ao fato de
que, neste estudo, o pré-tratamento aumentou a atividade da GPx, enzima que atua sobre o
mesmo substrato da CAT e que, consequentemente, exerce as mesmas funções. Além disso,
houve a instauração de quadro inflamatório, que provavelmente levou a produção de
moléculas envolvidas com esse processo, logo o AU por ser o uma substância com
propriedade anti-inflamatória, promove alteração da atividade e da expressão desta enzima
nesta condição patológica.
Após verificarmos os efeitos protetores do pré-tratamento com o complexo de inclusão
AU/βCD em corações submetidos a lesão por isquemia e reperfusão, o passo seguinte foi
verificarmos se o complexo de inclusão com AU promove efeito tóxico ao organismo. Para
isso foi determinada, em condição basal, a quantidade liberada de LDH pelo coração dos
animais pré-tratados e mensurada a concentração de MDA em tecido hepático. Além destas
medidas, foram verificadas as atividades das enzimas antioxidantes SOD e CAT no fígado,
bem como a quantificação dos grupamentos tióis.
42
Verificamos que, em condições basais, o pré-tratamento dos animais com o complexo
de inclusão AU/βCD não promoveu aumento da liberação de LDH (Figura 19), sugerindo que
esta molécula não gerou lesão no tecido cardíaco. Mendonça (2009), ao expor o átrio isolado
de cobaia a 100 µmol/L de AU, não encontrou alterações nos marcadores de lesão tecidual
creatina fosfoquinase (CPK), creatina quinase isoenzima-MB (CKMB) e Troponina I (TnI),
além disso, ao investigar as características morfológicas do tecido não foram encontrados
sinais de necrose muscular e de fibrose intersticial.
Yokouchi et al (2013) ao avaliar a toxicidade do tratamento com AU em miocárdio de
ratas, durante 14 dias, nas doses de 30 e de 100 mg/kg, também não encontrou alteração na
quantidade de LDH liberado, nem nas transaminases ALT, AST e Troponina T para a
respectivas doses. Porém ao investigar as características morfológicas do miocárdio e a
expressão de várias proteínas ligadas ao estresse oxidativo, ficou evidenciado que o pré-
tratamento com AU na dose de 100 mg/kg/dia levou ao surgimento de alterações
morfológicas do miocárdio e aumentou a expressão das proteínas relacionadas ao estresse
oxidativo, evidenciando sua ação citotóxica. Esses resultados podem ser explicados pela alta
dose de AU utilizada, pois Joseph et al (2009) demonstraram que o uso de AU em doses
elevadas, durante 14 dias, afeta a expressão de genes mitocondriais e causa desacoplamento
da cadeia transportadora de elétrons, sendo tóxico ao organismo, porém o AU em doses
baixas (~ 15 e 50 mg/kg/dia), durante 14 dias, não exerce efeitos na expressão dos genes
mitocondriais e não causa desacoplamento da cadeia transportadora de elétrons.
Ao investigarmos se o pré-tratamento dos animais com o complexo de inclusão
AU/βCD induz a formação de MDA no tecido hepático, não observamos alteração desse
parâmetro (Figura 20 – painel A). Este resultado evidencia que o pré-tratamento com o
complexo de inclusão não promoveu peroxidação lipídica e possivelmente não causou danos
hepáticos. Este achado corrobora o estudo de Behera et al (2012) que observaram que o AU
nas concentrações de 0,005; 0,025; 0,1 e 0,2 mg/mL foi capaz de diminuir a peroxidação
lipídica in vitro. Contrariamente, Rabelo et al (2012), ao realizar a caracterização redox do
AU em cultura de células SH-SY5Y observou que o tratamento com AU em concentrações a
partir de 2 ng/mL promoveu a peroxidação lipídica, tal divergência pode ser explicada pelo
fato de que a substância foi ofertada diretamente a célula, possivelmente em uma
concentração alta.
43
Em relação às atividades das enzimas SOD e CAT no tecido hepático, verificamos que
o pré-tratamento dos animais com AU complexado a βCD não causou qualquer alteração na
atividade dessas enzimas (Figuras 21 – painéis A e B, respectivamente). Estes dados
juntamente com a medida de LDH e MDA sugerem que a dose utilizada do complexo de
inclusão AU/βCD não causou efeito tóxico para o organismo. Ademais, quando avaliamos a
presença de grupos tióis em amostras de fígado, observamos que o pré-tratamento dos animais
com o complexo de inclusão levou a um aumento da quantidade desses grupamentos (Figura
23 – painel A), denotando efeito antioxidante, que pode ser oriundo da ação direta da
substância com as ROS.
44
7. CONCLUSÃO
No presente trabalho verificou-se que o pré-tratamento com o complexo de inclusão
AU/βCD protegeu o tecido cardíaco contra a lesão por isquemia e reperfusão, preservou a
função cardíaca contrátil, reduziu a duração de eventos arrítmicos e promoveu o status redox
celular. Ademais, o pré-tratamento não apresentou sinais bioquímicos de toxicidade ao tecido
hepático e nem ao tecido cardíaco. Todavia, fica a ser investigado, histologicamente, se o pré-
tratamento com o complexo de inclusão, durante 07 dias, não induziu de fato a alterações
morfológicas nos tecidos hepático e cardíaco, bem como, investigar se o pré-tratamento por
um período maior é capaz de induzir tais alterações.
Também, fica a ser estudado se o pré-tratamento é capaz de atuar sobre a cascata
intracelular envolvida no processo de apoptose após a lesão por isquemia e reperfusão,
verificar o seu papel sobre a expressão das enzimas antioxidantes e caracterizar por qual via
de sinalização celular o complexo de inclusão exerce seus efeitos.
45
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ANEXO I
