UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS

PATRICIA RABELO DOS SANTOS

EXPRESSÃO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO NUCLEAR

κB (NF-κB) EM NEURÔNIOS OCITOCINÉRGICOS DE

RATOS SUBMETIDOS À SOBRECARGA SALINA:

INFLUÊNCIA DA DEXAMETASONA

SÃO CRISTÓVÃO

2014

i

PATRICIA RABELO DOS SANTOS

EXPRESSÃO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO NUCLEAR

κB (NF-κB) EM NEURÔNIOS OCITOCINÉRGICOS DE

RATOS SUBMETIDOS À SOBRECARGA SALINA:

INFLUÊNCIA DA DEXAMETASONA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da

Universidade Federal de Sergipe como requisito à

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Fisiológicas

Orientador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Junior

Co-Orientador: Prof. Dr. Leandro Marques de

Souza

SÃO CRISTÓVÃO

2014

ii

iii

PATRICIA RABELO DOS SANTOS

Orientador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Junior

Co-Orientador: Prof. Dr. Leandro Marques de Souza

___________________________________________________________________

1° Examinador: Prof. Dr. Leandro Marques de Souza

_____________________________________________________________

2° Examinador: Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo

_____________________________________________________________

3° Examinador: Prof. Dr. André dos Santos Mecawi

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-graduação em

Ciências Fisiológicas da Universidade

Federal de Sergipe como requisito à

obtenção do grau de Mestre em

Ciências Fisiológicas.

iv

AGRADECIMENTOS

Ao meu Deus, SENHOR e consumador de todas as coisas, pela vida, sustento diário,

providência e capacitação. Sei que posso todas as coisas, pois o SENHOR me fortalece, e o

mestrado foi prova disso.

Aos meus pais, Osvaldo Henrique e Eliene, por terem sempre me proporcionado bases sólidas

de caráter, moral e educação. Obrigada pelo apoio, amor e carinho, incondicionais. Por

sempre acreditarem nos meus sonhos e permitir que eu alce voos, cada vez maiores e mais

independentes, ainda que para isso eu precise estar longe da convivência cotidiana. Eu os

amo!

Aos meus irmãos, Alan e Thaline, pelo amor puro e desprovido de interesses próprios. A

certeza de contar com vocês, incondicionalmente, é sempre uma força que propulsiona minha

vida, minhas decisões e empreitadas profissionais e pessoais. Este êxito é, também, de vocês!

Ao meu orientador, Daniel Badauê, por proporcionar, sem acepção, a oportunidade, à uma

então desconhecida, de realização de um sonho: o ingresso no mestrado. Desde então, a

caminhada foi preenchida por aprendizados diários, cada um singular e com fortes

implicações na construção de minha carreira profissional. Obrigada pelo apoio e orientação

durante todo o processo.

Ao meu co-orientador, Leandro Marques, por dispor, prontamente, parte de seu projeto para

ser desenvolvido por mim. Agradeço, também, o aceite em co-orientar esse trabalho e a

disponibilidade de sempre.

Aos amigos do Laboratório de Neuroendocrionologia Básica e Comportamental (LANBAC),

por terem caminhado junto comigo durante todo esse tempo, auxiliado na execução dos

procedimentos experimentais e vibrado pelo sucesso sempre e, principalmente, quando tudo

tornou-se mais difícil, quase impossível, de acontecer. À Belle, Dani, Dênia, Iura e Júlio, pós-

graduandos. Aos alunos de iniciação científica, Demetrius, Laís, Marília e Saulo. Em especial,

à amiga LANBAC Camila, que agrega muito valor à minha vida profissional e pessoal. És

muito querida!

Especialmente, minha eterna gratidão ao Dr. José Antunes Rodrigues, chefe do Laboratório de

Neuroendocrinologia da Faculdade de Medicina da USP/Ribeirão Preto, pela gentileza em

disponibilizar todo o aparato físico e humano de seu laboratório para que uma parte crucial

dos experimentos pudesse ser desenvolvida. Obrigada por ter proporcionado uma

oportunidade de êxito da pesquisa.

Ao André Mecawi, pós-doutorando do Laboratório de Neuroendocrinologia da Faculdade de

Medicina da USP/Ribeirão Preto, por ter me recebido de uma forma surpreendente e feito-me

sentir melhor ambientada. Foram mínimos e grandes gestos de cuidado que não terei como

descrever aqui e recompensar. Que Deus, então, o faça. Agradeço-lhe, também, e mais ainda,

v

pelo grande auxílio no planejamento e condução dos procedimentos técnicos,

proporcionando-me grandes ensinamentos.

Ao Rubinho (USP/Ribeirão Preto), que me recepcionou tão bem em seu ambiente de trabalho

e esteve sempre disposto a ajudar no manuseio do criostato e obtenção dos cortes utilizados

no presente estudo. Destaco a sua excelência em tudo o que faz. Meu muito obrigada!

Ao Fernando Cunha e Terezila (USP/Ribeirão Preto), por terem cedido os anticorpos contra a

subunidade p65 do NF-κB, utilizados durante o estudo.

Ao Professor Waldecy de Lucca, por disponibilizar a estrutura do Laboratório de Biologia

Celular (física e laboral), que está sob a sua chefia, para a realização dos experimentos.

Às amigas de república, Ivana, Sheilinha e Maíra, pela convivência e amizade que foram um

grande presente!

Às amigas que ganhei na pós-graduação, Camilinha e Rosana, e foram continuar a realização

de seus sonhos em outros locais, mas permanecem em minha vida! Obrigada por tudo!!!

Vocês são exemplos para mim!

Aos grandes amigos Ana Carla, Camila, Cibelle, Edênia, Fabíula, Katty, Larissa, Lívia,

Mateus, Priscila, Rafael e Renan. Essa caminhada de vida diária e científica não seria a

mesma sem a presença marcante e as contribuições de vocês. Não tenho palavras que possam

descrever o quão feliz sou em tê-los.

Ao Gerson, grande amigo e incentivador do ingresso no mestrado. Obrigada por me ajudar a

enxergar possibilidades mais abrangentes de vida profissional! Sei que não foi uma tarefa

fácil mas valeu a pena, pois me encontrei verdadeiramente nesse caminho que escolhi! Seu

apoio, paciência e companheirismo foram fundamentais para que eu conseguisse o êxito, tanto

no processo de seleção e ingresso quanto em boa parte da caminhada da pós-graduação. Que

Deus te recompense por tudo!

vi

RESUMO

EXPRESSÃO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO NUCLEAR - κB (NF-κB) EM

NEURÔNIOS OCITOCINÉRGICOS DE RATOS SUBMETIDOS A

SOBRECARGA SALINA: INFLUÊNCIA DA DEXAMETASONA, Patricia

Rabelo dos Santos, São Cristóvão, 2013. O sistema hipotálamo neuro-hipofisário (SHNH) é o

principal sistema pelo qual o cérebro mantém a homeostase dos líquidos corporais.

Especificamente, os núcleos supra-óptico (SON) e paraventricular (PVN) do hipotálamo estão

diretamente envolvidos com o controle do balanço hidroeletrolítico e são especializados na

síntese e secreção de vasopressina (AVP) e ocitocina (OT). Alterações no milieu intérieur são

vistas como estressoras pelo sistema nervoso central (SNC) e moduladas pelo eixo

hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA). O fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB) é

conhecido por mediar os efeitos imunossupressores e anti-inflamatórios dos glicocorticoides.

Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi verificar o perfil de expressão do componente

p65 da via clássica do NF-κB em neurônios ocitocinérgicos do PVN e SON, em resposta à

desidratação crônica, associada, ou não, ao tratamento com glicocorticoides. Métodos: Ratos

wistar (250-300 g) foram mantidos em ambiente com temperatura (23 ± 2ºC) e luminosidade,

ciclo claro-escuro de 12 horas (luz das 6 às 18 horas), controladas, com água e ração

específica para roedores (Labina®- Purina) ad libitum até o início dos experimentos. Todos os

procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da UFS

(Protocolo # 60/2012). Os animais foram divididos de modo a constituir os grupos Controle

(ratos com acesso à água ad libitum, durante quatro dias, n = 6 - 7); Controle + Dexa (ratos

com acesso à água ad libitum, durante quatro dias, e tratados com dexametasona, n = 6 - 7);

SL4 (ratos com acesso à sobrecarga salina ad libitum, solução de NaCl 1,8%, durante quatro

dias, n = 6 - 7); SL4 + Dexa (ratos com acesso à sobrecarga salina ad libitum, NaCl 1,8%,

durante quatro dias e tratados com dexametasona, n = 6 - 7). A dexametasona (10 mg / kg,

i.p.) foi administrada apenas no 4º dia, 12h e 2 h antes da perfusão para coleta do cérebro e

realização da dupla imunofluorescência OT/p65 ou eutanásia para coleta de sangue do tronco

e posterior dosagem de angiotensina II (ANGII). Os dados comportamentais e de dosagem

hormonal obtidos foram submetidos ao teste ANOVA de duas vias e pós-teste Bonferroni. Os

resultados obtidos da imuno-histoquímica, para a marcação de neurônios expressando

ocitocina e/ou p65, foram submetidos à avaliação qualitativa. Verificou-se que os animais

SL4 ingeriram mais fluido que seus controles, no segundo (p < 0,01), terceiro (p < 0,001) e

quarto (p < 0,001) dia experimental. A SL4 elevou a concentração plasmática de ANGII (p <

0,01). A análise qualitativa da dupla imunofluorescência OT/p65 no PVN e SON revelou uma

fraca imunorreatividade à ocitocina nos grupos SL4 e SL4 + Dexa, quando comparados aos

grupos Controle e Controle + Dexa. Observou-se expressão da subunidade p65 do NF-κB em

todas áreas hipotalâmicas estudadas, com imunorreatividade predominantemente

citoplasmática em todos os grupos. Estes dados mostram que a subunidade p65 do NF-κB está

presente em neurônios ocitocinérgicos das principais áreas hipotalâmicas que integram os

eixos do estresse (HHA) e do equilíbrio hidroeletrolítico (SHNH). Mais estudos são

necessários a fim de esclarecer sobre a real participação da via intracelular do NF-κB evocada

pela desidratação intracelular, nos ajustes hidroeletrolíticos endócrinos e comportamentais.

Palavras chave: p65/RelA, ocitocina, dexametasona, sobrecarga salina, núcleo supra-óptico,

núcleo paraventricular.

vii

ABSTRACT

EXPRESSION OF NUCLEAR TRANSCRIPTION FACTOR - κB (NF-κB) IN RAT

OCXYTOCINERGIC NEURONS SUBMITTED TO SALT LOADING: THE INFLUENCE

OF DEXAMETHASONE, Patricia Rabelo dos Santos, São Cristóvão, 2013.

The hypothalamic-neurohypophysial system is the main system through which the brain

maintains homeostasis of bodily fluids. Specifically, the supraoptic (SON) and paraventricular

(PVN) hypothalamic nuclei are directly involved with hydroelectrolytic equilibrium and are

specialized in the synthesis and secretion of vasopressin and oxytocin (OT). Changes in the

milieu intérieur are conceived as stressors by the central nervous system (CNS) and are

modulated by the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA). Nuclear transcription factor

kappa B (NF-κB) mediates immunosuppressant and anti-inflammatory of glucocorticoids.

Thus, the aim of this study was to verify the expression profile of component p65 of the NF-

κB classical pathway in SON and PVN oxytocinergic neurons in response to dehydration,

glucocorticoid treatment, and in normal conditions. Methods: Wistar rats (250-300g) were

maintained in controlled environment with temperature (23 ± 2ºC), light/dark cycle of 12

hours and water and food specific for rodents ad labitum until the beginning of experimental

period. All procedures were approved by Ethical Comitee of Research with Animals from

UFS (Protocol # 60/2012). Animals were grouped into Control (water ad libitum for 4 days, n

= 6-7); Control + Dexa (water ad libitum and treated with dexamethasone, n = 6-7); SL4 (salt

overloading ad libitum, 1.8% NaCl for 4 days, n = 6-7); SL4 + Dexa (salt overloading ad

libitum, 1.8% NaCl for 4 days and dexamethasone, n = 6-7). Dexamethasone (10 mg/kg i.p.)

was administered 12 and 2 hours before perfusion and removal of brains for OT/p65

immunofluorescence, or before sacrifice for blood sampling and angiotensin II (ANGII)

dosage. We applied two-way ANOVA and Bonferroni posthoc test to analyze behavioral and

hormonal dosage data. Results obtained from imunohistochemestry for evaluation of oxytocin

and/or p65 neuronal activity, were subjected to qualitative evaluation. We verified SL4

animals ingested more fluid than control, on second (p<0.01), third (p<0.01) and forth

(p<0.001) experimental day. SL4 also increased plasmatic concentration of ANGII (p<0.01).

Qualitative analysis of double labeling OT/p65 on PVN and SON revealed a weak

immunoreactivity for oxytocin on SL4 and SL4 + Dexa groups, when compared to control

and Control + Dexa groups. Was observed expression of p65 subunit of NF-κB in all

hypothalamic studied areas, with predominant cytoplasmic imunoreactivity in all groups.

These data demonstrate that p65 subunit of NF-κB are present in oxytocinergic neurons from

the most important hypothalamic areas that integrates the stress axis (HPA) and

hidroelectrolyte balance (SHNH). More studies are necessary to clarify the real participation

of NF-κB intracellular pathway evoked by intracellular dehydration on endocrines and

behavioral hidroelectrolyte adjustments.

Keywords: p65/ReL, oxytocin, dexamethasone, salt loading, supraoptic nucleus,

paraventricular nucleus.

viii

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1: Figura representativa do sistema hipotálamo neuro-hipofisário. Adaptada de Hazell

et al. (2012). ............................................................................................................................... 4

Figura 2: Via clássica de ativação do fator de transcrição NF-κB e seus mecanismos de

regulação. Modificada de Mattson (2005). ............................................................................... 14

Figura 3: Delineamento experimental do Protocolo I. ............................................................. 19

Figura 4: Delineamento experimental do Protocolo II ............................................................. 21

Figura 5: Influência da indução da hiperosmolaridade crônica e do tratamento com

dexametasona no 4° dia experimental na massa corpórea de ratos.. ....................................... 28

Figura 6: Perfil de ingestão de fluidos do protocolo de indução hiperosmótica e do tratamento

com dexametasona no 4° dia experimental.. ............................................................................ 30

Figura 7: Perfil de ingestão de ração do protocolo de indução hiperosmótica e do tratamento

com dexametasona no 4° dia experimental.. ............................................................................ 32

Figura 8: Efeitos do tratamento com dexametasona nos níveis plasmáticos de angiotensina II

dos grupos de animais submetidos ao protocolo de indução hiperosmótica.. .......................... 33

Figura 9: Fotomicrografias representativas da expressão de ocitocina e da subunidade p65 do

NF-κB em neurônios da divisão magnocelular medial do núcleo paraventricular (PaMM) de

ratos. ......................................................................................................................................... 35

Figura 10: Fotomicrografias representativas da expressão de ocitocina e da subunidade p65

do NF-κB em neurônios da divisão magnocelular lateral e parvocelular medial do núcleo

paraventricular (PaLMMP) de ratos ......................................................................................... 37

Figura 11: Fotomicrografias representativas da imunomarcação de ocitocina e da subunidade

p65 do NF-κB em neurônios da divisão parvocelular posterior do núcleo paraventricular

(PaPP) de ratos. ........................................................................................................................ 39

Figura 12: Fotomicrografias representativas da imunomarcação de ocitocina e da subunidade

p65 do NF-κB em neurônios do núcleo supra-óptico (SON) de ratos. .................................... 41

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACTH Hormônio adrenocorticotrópico

ANG II Angiotensina II

ANG III Angiotensina III

ANP Peptídeo natriurético atrial

AP Área postrema

AP-1 Proteína ativadora 1

AVP Arginina vasopressina

BSA Albumina sérica bovina

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa com Animais

CRH Hormônio liberador de corticotrofina

Dexa

DNA

Dexametasona

Ácido Desoxirribonucleico

DRN Núcleo dorsal da rafe

ECA Enzima conversora de angiotensina

GR Receptor de glicocorticoide

HHA Eixo hipotálamo hipófise adrenal

HPLC Cromatografia líquida de alta performance

IL

IκB

Interleucina

Proteínas inibidoras do NF-Κb

MnPO Núcleo mediano pré-óptico

MR Receptor de mineralocorticoide

NEMO Modulador essencial do NF-κB

NF-κB Fator de transcrição nuclear – kappa B

x

NH Neuro-hipófise

NTS Núcleo do trato solitário

OCVs Órgãos circunventriculares

OT Ocitocina

OVLT Órgão vasculoso da lâmina terminal

PaLMMP Divisão magnocelular lateral e parvocelular medial do núcleo

paraventricular

PaMM Divisão magnocelular medial do núcleo paraventricular

PaPP Divisão parvocelular posterior do núcleo paraventricular

PB Tampão fosfato

PBLN Núcleo parabraquial lateral

PBS

PCR

Tampão fosfato salina

Reação em cadeia da polimerase

PVN

RNAnh

RNAm

Núcleo paraventricular

Ácido ribonucleico heteronuclear

Ácido ribonucleico mensageiro

RIE Radioimunoensaio específico

SFO Órgão subfornical

SL4 Sobrecarga salina durante dias

SNC Sistema nervoso central

SON Núcleo supra-óptico

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

xi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 3

2.1. Regulação da homeostase hidroeletrolítica e o sistema hipotálamo-hipofisário ............. 3

2.2. Regulação da homeostase hidroeletrolítica ..................................................................... 6

2.3. Os glicocorticoides na regulação da secreção hormonal ................................................. 9

2.4. Fator nuclear de transcrição κB (NF-κB) e modulação exercida pelos glicocorticoides12

3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 17

3.1. Objetivo Geral ............................................................................................................... 17

3.2. Objetivos Específicos .................................................................................................... 17

4. METODOLOGIA .......................................................................................................... 18

4.1. Animais utilizados ......................................................................................................... 18

4.2. Drogas utilizadas ........................................................................................................... 18

4.3. Delineamento experimental ........................................................................................... 19

4.3.1. Protocolo I – Comportamento de ingestão, perfusão e coleta do cérebro ..................... 19

4.3.2. Protocolo II – Coleta de sangue para dosagem de ANG II ........................................... 21

4.4. Procedimentos experimentais ........................................................................................ 22

4.4.1. Medidas do comportamento de ingestão de fluidos ...................................................... 22

4.4.2. Perfusão transcardíaca ................................................................................................... 23

4.4.3. Expressão de ocitocina e p65 em tecido encefálico por imunofluorescência ................ 24

4.4.4. Métodos de captura e análise das imagens encefálicas obtidas pela reação de

imunofluorescência. .................................................................................................................. 25

4.4.5. Extração e dosagem de ANG II ..................................................................................... 26

4.5. Análise estatística .......................................................................................................... 27

5. RESULTADOS ............................................................................................................. 28

5.1. Comportamento de ingestão de fluidos e ração ............................................................. 28

5.2 Concentração plasmática de Angiotensina II ................................................................ 32

5.3. Dupla marcação OT/p65 nos núcleos paraventricular e supra-óptico do hipotálamo ... 33

6. DISCUSSÃO ................................................................................................................. 43

7. CONCLUSÃO ............................................................................................................... 52

8. PERSPECTIVAS .......................................................................................................... 53

9. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 54

1

1. INTRODUÇÃO

Estudos relacionados aos paradigmas da desidratação tem demonstrado que após esse

estímulo ocorre a síntese e secreção de ocitocina e vasopressina por neurônios dos núcleos

supra-óptico (SON) e paraventricular (PVN) do hipotálamo (BURBACH et al., 2001;

WINDLE et al., 1993; YUE et al., 2008), sendo que o glicocorticoide sintético,

dexametasona, reduz a liberação desses neuropeptídeos, tanto em condições basais quanto em

resposta à desidratação quanto (DURLO et al., 2004; LAUAND et al., 2007). Esses efeitos

são resultados das ações genômicas e não genômicas dos glicocorticoides sobre neurônios

hipotalâmicos, demonstrando que o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) exerce um

controle sobre a síntese e secreção de neuropeptídeos (DE SOUZA; FRANCI, 2013; DI et al.,

2003, 2005; EVANSON et al., 2010).

A literatura relata que o núcleo paraventricular do hipotálamo sofre forte influência

do sistema imunológico, principalmente via interleucinas pró-inflamatórias, IL-6 e 1β, que

culmina na ativação neuronal e liberação de neuropeptídeos (NAITO et al., 1991; PALIN et

al., 2009; SUMMY-LONG et al., 2006; WANG et al., 2006). É sabido, também, que a

sobrecarga salina hipertônica (NaCl 2%) diminui o conteúdo de interleucina 1β na neuro-

hipófise e aumenta a expressão do receptor de interleucina do tipo 1 no grupamento

magnocelular hipotalâmico e adenohipófise (SUMMY-LONG et al., 2006).

Sob essa perspectiva, duas cascatas de transdução de sinal, que são intercambiáveis,

destacam-se: i) o receptor de glicocorticoide (GR) e, ii) a via de sinalização do fator de

transcrição nuclear –κB (NF-κB). O NF-κB é uma família de fatores de transcrição

largamente expresso em eucariotos e descoberto em 1986, por Sen e David Baltimore. Seu

nome se deve a sua função, inicialmente descoberta, de promover a transcrição da cadeia leve

kappa de imunoglobulinas em células B (SEN; BALTIMORE, 1986a, 1986a). É amplamente

conhecido por mediar a expressão de uma variedade de citocinas envolvidas na resposta

imunológica pró-inflamatória, dentre outros genes. Já o GR é um fator de transcrição bastante

conhecido por sua clássica ação imunossupressora e anti-inflamatória. Na presença do ligante,

2

glicocorticoide, o receptor ativo se transloca para o núcleo, onde se liga à sequências

específicas do DNA, conhecidas como elementos responsivos aos glicocorticoides (GRE) e

negativos (GREn), ativando ou reprimindo a expressão de inúmeros genes (OAKLEY;

CIDLOWSKI, 2011). Dentre esses, destacam-se muitas citocinas, quimiocinas, receptores de

citocinas e mediadores do processo inflamatório, que possuem regiões consenso que são

reguladas negativamente pelos glicocorticoides (MCKAY; CIDLOWSKI, 1999).

Estudos demonstraram que o principal mecanismo pelo qual o GR desempenha as

funções supracitadas envolve a transrrepressão funcional do NF-κB, crosstalk, já que, como

evidenciado, possuem funções antagônicas. A interação física entre o GR e o NF-κB já foi

demonstrada, in vivo e in vitro, tanto no núcleo quanto no citoplasma, resultando na perda

mútua da capacidade de ligação ao DNA, competição por co-ativadores transcricionais em

comum ou indução da síntese do inibidor do NF-κB, IκBα (KHAN et al., 2013; LING;

KUMAR, 2012; SCHEINMAN et al., 1995; UNLAP; JOPE, 1995; WIDÉN; GUSTAFSSON;

WIKSTRM, 2003).

Estudos recentes também demonstraram a presença do NF-κB no hipotálamo de ratos

e, além disso, seu envolvimento na modulação autonômica, endócrina e fisiopatologia da

insuficiência cardíaca (CARDINALE et al., 2012; KANG et al., 2011; ZHANG et al., 2013).

Sobre esse fator de transcrição e a expressão de neuropeptídeos, como ocitocina e

vasopressina, nenhuma evidência de interação direta foi encontrada na literatura, apenas foi

evidenciado que a região promotora da expressão do gene do receptor de ocitocina, em células

miometriais, possui uma sequência consenso para o NF-κB (KHANJANI et al., 2011;

TERZIDOU et al., 2006).

Assim, tendo em vista a lacuna de estudos que se proponham a investigar a interação

do receptor de glicorticoide com o NF-κB, na modulação da síntese e secreção de ocitocina e

vasopressina, importantes componentes da regulação da homeostase hidroeletrolítica, o

presente trabalho se propôs a verificar a expressão do NF-κB em neurônios do SON e PVN do

hipotálamo em animais desidratados e a influência da dexametasona na ativação dessa via. O

melhor entendimento de como a interação de aspectos neuroimunoendócrinos e

comportamentais implica em uma modulação diferencial da homeostase hidroeletrolítica

propiciará um direcionamento terapêutico integrado, cada vez mais em voga na comunidade

científica.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Regulação da homeostase hidroeletrolítica e o sistema hipotálamo-

hipofisário

A homeostase dos fluidos corporais é mantida, centralmente, por um controle

restrito. Assim, alterações no líquido extracelular e/ou osmolalidade são percebidas e

integradas centralmente, desencadeando respostas fisiológicas e comportamentais. As

respostas comportamentais de ingestão de sódio e água são reguladas por sinais de apetite por

sódio e sede, ao mesmo tempo em que mecanismos fisiológicos compensatórios,

principalmente modulação da diurese e natriurese, acontecem no organismo animal

(BURBACH et al., 2001; PURYEAR et al., 2001).

Dentro desse contexto de regulação da homeostase hidroeletrolítica destaca-se o

sistema hipotálamo neuro-hipofisário (SHNH), localizado na região medial do hipotálamo

anterior, com destaque para estruturas conhecidas como núcleo paraventricular (PVN) e

núcleo supra-óptico (SON) (LANDGRAF et al., 1990). Atribui-se a essas estruturas uma

função central integradora, na medida em que recebe e processa aferências, excitatórias e

inibitórias, de regiões do sistema nervoso central (SNC) que veiculam informações sobre o

estado hídrico e osmótico do organismo, culminando na modulação da síntese e secreção de

ocitocina e vasopressina (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004).

O sistema hipotálamo neuro-hipofisário consiste primordialmente de neurônios

peptidérgicos com corpos celulares grandes, magnocelulares (entre 20 e 40 µm de diâmetro),

que estão localizados no núcleo paraventricular (PVN) e núcleo supra-óptico (SON) do

hipotálamo, com axônios que se projetam pela zona interna da eminência mediana e terminam

em capilares sanguíneos na neuro-hipófise (NH) (ALIAGA et al., 2002). O SON é

predominantemente magnocelular, enquanto o PVN possui dois distintos fenótipos neuronais.

Um grupamento de células neurosecretórias magnocelulares, ou Tipo I, na região lateral e

4

neurônios com corpos celulares de menor diâmetro, parvocelulares (entre 20 e 40 µm de

diâmetro), ou Tipo II, medialmente. São os neurônios magnocelulares do PVN e SON que se

projetam para a neuro-hipófise (NH), já os parvocelulares, restritos ao PVN, se projetam para

a hipófise anterior e, também, centros de controle autonômico (FERGUSON; LATCHFORD;

SAMSON, 2008; TASKER; DUDEK, 1991). O SHNH descrito está representado na Figura 1,

adaptada de Hazell et al. (2012).

Figura 1: Figura representativa do sistema hipotálamo neuro-hipofisário. PVN, núcleo paraventricular; SON,

núcleo supra-óptico; EM, eminência mediana; NH, neuro-hipófise; AH, adeno-hipófise; opt, trato óptico; 3 V,

terceiro ventrículo. Adaptada de Hazell et al. (2012).

Tanto o PVN quanto o SON, constituídoS de neurônios osmosensíveis, estão

diretamente envolvidos na regulação da homeostase hidroeletrolítica. Os neurônios

magnocelulares são células neuroendócrinas especializadas na síntese e secreção de grandes

quantidades de vasopressina (AVP) e ocitocina (OT). Esses neuropeptídeos são transportados

pelos axônios até a NH e possuem uma função dual: são secretados pelas terminações

5

nervosas na circulação sistêmica para agir como hormônios em vários órgãos-alvo periféricos

e são liberados de dendritos no sistema nervoso central (SNC) onde provavelmente agem

como neurotransmissores ou como moduladores dos transmissores clássicos (BURBACH et

al., 2001). Os neuropeptídeos AVP e OT também são produzidos por neurônios

parvocelulares, mas, em menor quantidade. Neurônios magnocelulares do PVN são

responsáveis pela liberação de OT e AVP na circulação, enquanto que neurônios

parvocelulares do PVN podem mediar sinais aferentes para os centros de saciedade ao sal, em

resposta a estimulação osmótica periférica e central (PURYEAR et al., 2001).

No SON, as células magnocelulares produtoras de ocitocina estão dispostas na região

rostral e dorsal, enquanto os fenótipos neuronais vasopressinérgicos estão localizados mais

caudal e ventral, sendo a região medial constituída de ambos. Os neurônios magnocelulares da

região medial do PVN consiste de células primariamente produtoras de ocitocina, enquanto

que a região lateral é formada por um grupamento central de neurônios vasopressinérgicos

circundado por fenótipos neuronais ocitocinérgicos, já a região posterior é constituída, em sua

maior parte, de células produtoras de ocitocina (RHODES; MORRELL; PFAFF, 1981).

Estudo recente objetivando elucidar o mecanismo pelo qual ocorre essa expressão gênica

diferenciada, específica de um tipo celular, demonstrou que uma determinada sequência da

região promotora da expressão da ocitocina possui elementos cruciais para a determinação de

sua expressão. Com base nisso, os autores hipotetizam existir um elemento repressor na

região do gene ocitocina, que inibe sua expressão em neurônios magnocelulares

vasopressinérgicos e um elemento ativador, que, por sua vez, promove a sua expressão.

Dentre os fatores de transcrição que podem estar envolvidos nessa diferenciação da expressão

de ocitocina no SON evidencia-se a proteína ativadora do tipo 1 (AP-1) (GAINER, 2012).

A vasopressina é sintetizada como parte de um pré-pró-peptídeo, que é processado

durante o transporte axonal anterógrado até os terminais na NH, onde, biologicamente, a AVP

ativa é estocada até ser secretada na circulação pela atividade elétrica neuronal (GOURAUD

et al., 2007). A AVP é o hormônio antidiurético da maioria dos mamíferos e sua liberação é

regulada por barorreceptores carotídeos, sinoaórticos e renais, receptores de volume

cardiopulmonares e pela concentração de angiotensina II (ANG II). A AVP age nos rins

promovendo a reabsorção tubular de água, com a indução de AMPc nas células dos ductos

coletores, via receptores V2. A liberação de AVP sob condições de hipovolemia envolve

estimulação de neurônios vasopressinérgicos por ANG II/III. Assim, este hormônio pode

6

manter o nível dos fluidos corporais constante, mesmo em períodos de restrição hídrica

(BURBACH et al., 2001).

A ocitocina também é derivada de um pré-pro-peptídeo, que é processado de forma

semelhante à AVP. É um hormônio classicamente conhecido por suas ações no parto e na

lactação. Além disso, está envolvido na regulação do balanço hídrico, bem como ações sobre

a pressão sanguínea, a função cardíaca e renal, o comportamento apetitivo e a motilidade

gástrica (PURYEAR et al., 2001; RIGATTO et al., 2003). À respeito de suas ações renais

estão o aumento na osmolalidade urinária, natriurese, diurese e caliurese, que são promovidos

em doses fisiológicas e independentes dos efeitos da AVP. Os estímulos para a secreção de

OT são a hipotensão, a hipovolemia, ANG II e o aumento em cerca de 2% da osmolalidade

plasmática (BURBACH et al., 2001; RIGATTO et al., 2003).

2.2. Regulação da homeostase hidroeletrolítica

A homeostase do sódio é ligada com o balanço hidríco corporal. Desta forma,

quando um animal se torna desidratado, o sódio, a osmolalidade do líquido extracelular e a

concentração de proteínas plasmáticas aumentam, simultaneamente com a diminuição do

volume do líquido extracelular, promovendo a ativação de mecanismos neuroendócrinos e

comportamentais que inibem a ingestão de sal e induzem a excreção de sódio, mediados

principalmente pela OT e peptídeo natriurético atrial (ANP), além de ativar mecanismos de

sede e redução da excreção urinária de água, mediados pela AVP, na tentativa de restaurar a

hidratação corporal (FITZSIMONS, 1998; PURYEAR et al., 2001; ROESCH;

BLACKBURN-MUNRO; VERBALIS, 2001).

O controle das respostas da sede e secreção de AVP é similar e responde a distúrbios

em três variáveis específicas: osmolalidade plasmática, volume sanguíneo e pressão arterial.

Quatro receptores foram identificados participando desse sistema em ratos: osmoreceptores

cerebrais, os quais estão localizados nos órgãos circunventriculares (OCVs), como o órgão

subfornicial (SFO) e órgão vasculoso da lâmina terminal (OVLT), mas também no núcleo

7

mediano pré-óptico (MnPO) e área postrema (AP). O SFO envia projeções diretas para o

sistema hipotálamo-neuro-hipofisário, enquanto o OVLT envia projeções diretas e projeções

que passam primeiro pelo MnPO. Pelo fato do SFO e do OVLT estarem localizados fora da

barreira hematoencefálica, eles podem integrar informações da osmolalidade com os sinais

endócrinos conferidos pela concentração de hormônios circulantes, como a ANG II, relaxina e

o ANP, levando à uma resposta neuroendócrina (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2013a;

BURBACH et al., 2001; GOURAUD et al., 2007).

Estudos demonstraram que, ambas as respostas de secreção de AVP e sede são

diminuídas ou abolidas pela lesão aos osmoreceptores cerebrais. Os neurônios magnocelulares

são osmosensíveis, mas necessitam de aferências da lâmina terminal para responder

completamente aos desafios osmóticos (BURBACH et al., 2001). Estas ações moduladoras

ocorrem por alterações na atividade simpática, ativação do sistema renina-angiotensina-

aldosterona, secreção de AVP, OT e do ANP (BOURQUE; OLIET, 1997; FITZSIMONS,

1998; MCCANN; GUTKOWSKA; ANTUNES-RODRIGUES, 2003). Enquanto aferências

neurais do vago, provenientes de sensores de volume torácicos, exercem ação sobre o

comportamento de ingesta hídrica, a diminuição do líquido extracelular causa secreção de

renina, e a ANG II resultante sinaliza o cérebro, através do sangue, promovendo sede

(DENTON; MCKINLEY; WEISINGER, 1996).

A ANG II presente no plasma é formada pela ação da enzima renina, liberada pelo

rim, sobre o substrato angiotensinogênio, que é formado no fígado. Primeiramente é

sintetizado um decapeptídeo, a ANG I, que então é convertida em um octapeptídeo, a ANG II,

pela ação da enzima conversora de angiotensina (ECA). A produção de ANG no SNC se dá

pela presença de angiotensinogênio na neuroglia (DENTON; MCKINLEY; WEISINGER,

1996). Enquanto a ANG II induz sede e apetite ao sódio, e subsequente absorção de água e

sódio pelo intestino, ela inibe a excreção renal de água e sódio por ações diretas nos túbulos e

glomérulos. Além disso, a ANG II estimula a secreção de AVP e aldosterona para reter mais

água e sódio no corpo (TAKEI, 2000). O sistema renina-angiotensina é importante na

regulação da pressão arterial, secreção de aldosterona, volume plasmático e extracelular, e

balanço do sódio (ZUCKER; GLEASON; SCHNEIDER, 1982).

A sede é induzida por três estímulos principais: desidratação celular, desidratação

extracelular e ANG II, e somente o ANP é conhecido como agente antidipsogênico

8

fisiológico. A depleção de volume causada pela privação hídrica ou de sódio causa aumento

da atividade da renina plasmática. No rato, a privação hídrica é uma condição fisiológica

progressiva, associada com o aumento da osmolalidade, hipovolemia e ativação do sistema

renina-angiotensina. Além disso, a desidratação resulta na liberação de hormônios neuro-

hipofisários, ativação do sistema nervoso simpático e sede (GOTTLIEB et al., 2006; YUE et

al., 2008). Este modelo experimental é clássico e tem sido utilizado há mais de meio século

como modelo de estimulação osmótica para o estudo do sistema hipotálamo-neuro-

hipofisário, contudo, existe a desvantagem de que os animais suportam poucos dias sem

nenhuma fonte de água (AMES; VAN DYKE, 1950; YOUNG; VAN DYKE, 1968). Um

método alternativo de desidratação é a sobrecarga salina, no qual os animais recebem solução

salina hipertônica (NaCl 1,8%), onde os animais podem ser mantidos por até 14 dias (YUE et

al., 2008).

Trabalhos constataram que, em ratos com sobrecarga salina crônica, a depleção dos

estoques neuro-hipofisários de OT é mais acentuada quando comparada com ratos privados de

água (JONES; PICKERING, 1969). Com privação hídrica, a concentração plasmática de

sódio mostra um aumento progressivo, assim como as concentrações plasmáticas de OT,

AVP, corticosterona e ANG II, enquanto diminui a de ANP e aumenta também a expressão de

c- Fos no PVN, SON, MnPO, OVLT e SFO (LAUAND et al., 2007).

A avaliação imunohistoquímica da expressão da proteína Fos, produto do gene c-fos,

contitui uma das maneiras mais utilizadas para avaliar a participação da AVP e da OT no

circuito osmoresponsivo, pois permite mapear a ativação de regiões especificas do SNC, em

situação de alterações homeostáticas agudas. A literatura relata a expressão de c-Fos em

neurônios magnocelulares do SON e PVN após injeção sistêmica ou intracerebroventricular

de salina hipertônica. A ativação destes núcleos pode ser mantida por estímulo osmótico

crônico induzido pela ingestão de salina hipertônica ou por restrição hídrica e é revertida com

a ingestão de água (GOTTLIEB et al., 2006). Trabalhos também demonstraram que, estímulo

osmótico crônico (hipernatremia) aumenta a expressão de RNAm da OT e AVP no SON e no

PVN; porém, a hipoosmolalidade prolongada (hiponatremia) promove a redução da

expressão de RNAm da AVP no hipotálamo, mostrando a plasticidade deste sistema pela

adaptação a cada tipo de estímulo (LIGHTMAN; YOUNG, 1987; ROESCH; BLACKBURN-

MUNRO; VERBALIS, 2001).

9

2.3. Os glicocorticoides na regulação da secreção hormonal

O eixo Hipotálamo hipófise adrenal (HHA) está envolvido na resposta adaptativa,

respondendo à diversos estímulos, via secreção de esteroides como os mineralocorticoides e

glicocorticoides (DE; VANDEN; HAEGEMAN, 2003).

Sob condições de estresse, sinapses excitatórias convergindo para os neurônios

parvocelulares do núcleo paraventricular do hipotálamo, que expressam o hormônio liberador

de corticotropina (CRH) e outros secretagogos peptidérgicos, como a vasopressina (AVP) e

OT (DABROWSKA et al., 2013), possibilitam a liberação de seu conteúdo na circulação

portal existente na região da eminência mediana. O CRH e AVP atuam sobre os corticotrofos

adenohipofiários por meio da ligação aos receptores CRH1 e V1b, respectivamente,

estimulando a secreção do hormônio adenocorticotrófico (ACTH). O ACTH, por sua vez, é

liberado na circulação sistêmica e atua sobre o córtex da adrenal estimulando a síntese e

liberação o hormônio glicocorticoide. (AGUILERA, 1994; GRINEVICH et al., 2001;

LEHOUX; FLEURY; DUCHARME, 1998; VALE; RIVER, 1977).

Os glicocorticoides, predominantemente cortisol em humanos e corticosterona em

roedores, constituem, assim, um dos produtos finais do eixo HHA (DE KLOET et al., 2009;

LEHOUX; FLEURY; DUCHARME, 1998), exercendo efeito direto sobre a regulação

endócrina (LAUAND et al., 2007; RUGINSK et al., 2007; UCHOA et al., 2012), resposta

inflamatória e imunológica (DE BOSSCHER; VANDEN BERGHE; HAEGEMAN, 2000;

LÖWENBERG et al., 2007), metabolismo (MORGAN et al., 2013; PECKETT; WRIGHT;

RIDDELL, 2011), bem como função autonômica (BOYCHUK et al., 2013).

A ação clássica dos corticosteroides, também conhecida como genômica, se dá por

meio de sua interação com receptores nucleares tipo I e II, que são sensíveis aos níveis

circulantes de corticosterona e são expressos em quase todos os tecidos, ativando ou inibindo

fatores de transcrição quando estimulados (ALMAWI; MELEMEDJIAN, 2002; HAYASHI et

al., 2006; HERMAN, 1995; JENKINS; PULLEN; DARIMONT, 2001). Os receptores do tipo

I, ou de mineralocorticoides (MR), são receptores de alta afinidade à corticosterona e os

receptores do tipo II, ou de glicocorticoides (GR), são receptores de baixa afinidade a

corticosterona (HERMAN; SHERMAN, 1993; MCEWEN; DE KLOET; ROSTENE, 1986;

ROESCH; BLACKBURN-MUNRO; VERBALIS, 2001).

10

Pela via genômica, quando ativado, o GR se desloca para o núcleo e interage

diretamente com os elementos responsivos aos glicocorticoides (GRE) presentes no DNA, o

que resulta então na regulação da transcrição gênica. Recentes evidências, no entanto,

sugerem que além da ligação do GR ativado aos elementos responsivos aos glicocorticoides,

existe um mecanismo onde o receptor ativado pode também interagir com fatores de

transcrição, como AP-1 e NF-κB, para regular a resposta celular, resultando em atenuação ou

suspensão da atividade transcricional (ALMAWI; MELEMEDJIAN, 2002; FERREIRA et al.,

2005; JENKINS; PULLEN; DARIMONT, 2001; UNLAP; JOPE, 1995).

Os glicocorticoides também podem exercer suas ações ao interagir com receptores de

membrana, essas ações são rápidas e conhecidas como não – genômicas (MCKAY;

CIDLOWSKI, 1999).

A distribuição do GR pelo cérebro é bastante ampla, o mesmo já foi identificado em

regiões como, na área septal lateral, giro dentado, NTS, PVN, locus coeruleus e amígdala

central (REUL; DE KLOET, 1985). Além disso, foi demonstrada a presença de GR em

neurônios magnocelulares do SON (KISS et al., 1988). Porém, a literatura recentemente

mostrou que os GR estariam restritos a neurônios parvocelulares do PVN (HAN et al., 2005).

Poucos estudos tem mostrado a capacidade de observar o MR no PVN ou SON, mas a

amígdala e a banda da estria terminal expressam este receptor e os OCVs tem sido observados

por acumularem ligantes MR específicos (SAKAI et al., 1996). Além disso, o hipocampo tem

se apresentado como a região onde ocorre a maior densidade de receptores MR e GR, quando

comparado a outras áreas cerebrais, e é reconhecido como um dos principais componentes

controladores da atividade do eixo HHA (DE KLOET; KARST; JOËLS, 2008; JAHNG et al.,

2007).

A atividade do eixo HHA é modulada por mecanismo de feedback negativo exercido

pelo glicocorticoide circulante. Essa regulação pode acontecer diretamente ao nível

hipotalâmico – hipofisário (DI et al., 2003, 2005; EVANSON et al., 2010) , ou, indiretamente,

modulando regiões límbicas que, por sua vez, agem sobre os neurônios CRH hipotalâmicos

(FURAY; BRUESTLE; HERMAN, 2008; JAFERI; BHATNAGAR, 2006).

Di et al. (2003) demonstraram que a ação dos glicocorticoides sobre, a atividade

elétrica de neurônios parvocelulares do PVN, dentro do mecanismo de feedback do eixo

HHA, é exercida pela ligação a receptores de membrana acoplados à proteína G, ativando vias

11

de sinalização que levam à síntese e liberação de endocanabinoides. Esses, por sua vez, agem

como mensageiros retrógrados, em receptores CB1, localizados em terminais pré-sinápticos,

suprimindo a liberação de glutamato para a fenda sináptica, promovendo inibição tônica e

down regulation da liberação hormonal de diferentes fenótipos neuronais parvocelulares

(CRH, AVP, OT e TRH) (DI et al., 2003; EVANSON et al., 2010). Posteriormente, o mesmo

grupo de pesquisadores verificou que tal princípio de redução da excitabilidade neuronal

exercido pelos glicocorticoides, via endocanabinoides, se aplica às populações neuronais

magnocelulares vasopressinérgicos e ocitocinérgicos do PVN e SON. Ao mesmo tempo,

evidenciaram ação facilitatória do glicocorticoide sobre a liberação de GABA em neurônios

magnocelulares, mediada por um mensageiro retrógrado, até então, desconhecido (DI et al.,

2005).

Estudo recente, utilizando a técnica de imunofluorescência, verificou co-

imunorreatividade do GR e neurônios GABAérgicos no núcleo periventricular anterior,

próximo às regiões parvocelular anterior e medial do hipotálamo, sugerindo um efeito direto

do glicocorticoide sobre neurônios GABA e deste, sobre grupamentos parvocelulares

circunvizinhos (DE SOUZA; FRANCI, 2013).

Utilizando o mecanismo de bloqueio farmacológico do receptor canabinoide do tipo

1 (CB1), estudos tem evidenciado a influência do sistema endocanabinoides na mediação dos

efeitos da dexametasona, glicocorticoide sintético, sobre a ativação neuronal, expressão e

liberação de hormônios neuro-hipofisários em resposta a desafios hidroeletrolíticos tem sido

relatado na literatura (RUGINSK et al., 2010, 2012).

O tratamento com dexametasona também inibe o aumento de AVP e OT induzido

pela sobrecarga salina por sete dias, potencializando o aumento do volume urinário e a carga

excretada de sódio, alterando também a liberação de OT, em resposta à expansão de volume

hipertônica (DURLO et al., 2004; VENTURA et al., 2005). Portanto, os glicocorticoides

atuam no hipotálamo inibindo os neurônios peptidérgicos, levando à uma diminuição da

síntese e liberação de hormônios.

Além disso, ações imunossupressoras também são atribuídas aos glicocorticoides,

mostrando que existe uma comunicação multidirecional entre o sistema imunológico,

autonômico, hormonal e o SNC. Estes sistemas possuem uma “linguagem química” comum,

apresentando ligantes e receptores para hormônios, citocinas, interleucinas, neuropeptídeos e

12

neurotransmissores. Tem sido sugerido que citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-1β

(IL-1β), IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) servem como sinalizadores entre o sistema

imunológico e o SNC (HAYLEY et al., 1999). As IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, o TNF-α e o

interferon-γ afetaram a secreção hormonal hipotalâmica e da hipófise anterior em

experimentos in vivo e in vitro, e receptores de alta afinidade para IL-1, IL-2 e IL-6 foram

encontrados em tecidos neuroendócrinos, como nos neurônios magnocelulares, onde são

expressos receptores do tipo 1 da IL-1β (BURBACH et al., 2001).

Estudos demonstraram que a IL-1β e o TNF-α promovem a ativação do eixo HHA

com o aumento resultante da corticosterona plasmática, podendo também ativar neurônios no

PVN e promover a liberação de OT e AVP (FRANCIS et al., 2003; WANG et al., 2006). Isto

mostra que as citocinas são centralmente interpretadas como agentes de estresse, podendo

ativar fatores de transcrição, entre eles o NF-κB (SPANGELO et al., 1995; TURNBULL;

RIVIER, 1999). Outra evidência deste efeito central das citocinas é a distribuição no

hipotálamo e na sua maioria neuronal de receptores IL-1R1 (principalmente) e TNFR p55

para IL-1β e TNF-α respectivamente (CONTI et al., 2008).

2.4. Fator nuclear de transcrição κB (NF-κB) e modulação exercida pelos

glicocorticoides

O fator nuclear de transcrição κB, NF-κB, representa uma família de fatores de

transcrição relatado de forma inédita na literatura em 1986 e descoberto pelo laboratório do

Dr. Baltimore, inicialmente devido à sua função para transcrição da cadeia leve κ da

imunoglobulina em células B. O NF-κB (SEN; BALTIMORE, 1986a, 1986b), é um fator de

transcrição largamente expresso em eucariotos, que exerce uma função importante na

regulação intracelular da resposta imune, inflamação e regulação do ciclo celular (CELEC,

2004; FERREIRA et al., 2005; GHOSH; MAY; KOPP, 1998; LISANTI; MARTINEZ-

OUTSCHOORN; SOTGIA, 2013; MUT; AMOS; HUSSAINI, 2010; PASPARAKIS, 2009;

RAHMAN, 2000).

13

O NF-κB é composto de duas subunidades variáveis que pertencem a família Rel/ NF-

κB. Os membros (RelA [p65], RelB, c-Rel, p100/p52 e p105/p50) contem o domínio de

homologia Rel, sendo o heterodímero p65/p50 o NF-κB clássico e são as subunidades

comumente expressas em neurônios (GHOSH; MAY; KOPP, 1998; MATTSON, 2005). O

heterodimero p65/p50 tem uma alta afinidade pela sequência consenso do NF-κB no DNA e é

considerado como a forma induzível (isto é, ativada por sinais extracelulares) do NF-κB na

maioria das células (MCKAY; CIDLOWSKI, 1999).

Os membros que pertencem a família Rel/ NF-κB (p65, RelB, c-Rel, p100/p52 e

p105/p50) podem formar homo e heterodímeros que são mantidos inativos no citoplasma pela

interação com moléculas inibitórias específicas, chamadas IκBs. Os IκBs constituem uma

família de sete inibidores que compreende o IκBα, IκBβ, IκBε, IκBγ, Bcl3, e outros que

ocultam o sinal de localização nuclear do NF-κB, resultando em sua retenção no citoplasma

(MEMET, 2006). Os complexos p50/p65 e p50/c-Rel são regulados por IκBα e IκBβ. O IκBα

é mais importante na regulação de respostas induzíveis, enquanto o IκBβ está envolvido na

ativação persistente do NF-κB (GHOSH; MAY; KOPP, 1998; KEMLER; FONTANA, 1999).

No cérebro, membros da família do NF-κB tem sido identificados em neurônios, astrócitos,

microglia e já foi demonstrado que o tratamento de astrócitos com IL-1 e TNF-α promove a

ativação da via do NF-κB (KEMLER; FONTANA, 1999).

A via clássica de ativação do NF-κB ocorre através do complexo IκB kinase, o

complexo IKK. Este complexo é composto por duas subunidades catalíticas IKKα e IKKβ e

uma subunidade regulatória fundamental a IKKγ, também conhecida como modulador

essencial do NF-κB (NEMO) (MALATO et al., 2012; SOLT; MADGE; MAY, 2009). A

Figura 2, modificada de (MATTSON, 2005), mostra de forma esquemática o fator de

transcrição NF-κB e seus mecanismos de regulação.

O complexo NF-κB inativo no citoplasma consiste de um dímero (tipicamente

p50/p65 em neurônios) ligado à subunidade inibitória IκBα. A ativação do NF-κB por sinais

extracelulares (TNF-α, IL-1, espécies reativas de oxigênio, luz ultravioleta, isquemia,

lipopolissacarideo (LPS), bactérias, vírus, amilóides, glutamato) induz a ativação do

complexo IKK, que consiste de duas subunidades catalíticas, IKKα e IKKβ, e uma

subunidade regulatória fundamental, a IKKγ. A subunidade IKKβ ativada fosforila a IκBα

resultando em sua degradação proteassomal. A degradação de IκBα resulta na translocação do

14

dímero p50/p65 para o núcleo, onde o mesmo se liga a elementos regulatórios de certos genes,

e, portanto, induz sua transcrição (MATTSON, 2005).

O término da ativação do NF-κB pode ser regulado por um mecanismo de feedback

clássico, onde há um aumento da expressão do IκB e a consequente exportação do complexo

NF-κB – IκB do núcleo para o citoplasma (ALMAWI; MELEMEDJIAN, 2002; CELEC,

2004; FERREIRA et al., 2005).

Dentro do complexo IKK, a subunidade IKKβ é muito importante para a degradação

rápida do NF-κB –ligado as IκBs, por outro lado, a subunidade IKKα está envolvida com o

controle do processamento de p100, o que leva à ativação de dímeros p52/RelB, um processo

bem mais lento que a ativação de IκBs ligado a dímeros (HACKER; KARIN, 2006). O

terceiro componente deste complexo é a subunidade regulatória fundamental a IKKγ, que

recebe nomes alternativos como NEMO, IKKAP1 ou FIP-3.

O mecanismo preciso de funcionamento da IKKγ ainda não é totalmente conhecido.

Estudos utilizando células gene deficientes, deleção e perda da função por mutação de IKKγ,

Figura 2: Via clássica de ativação do fator de transcrição NF-κB e seus mecanismos de regulação. Modificada

de Mattson (2005).

15

indicam que esta subunidade é essencial para a ativação da via clássica do NF-κB, sendo esta

via absolutamente dependente de IKKγ (MALATO et al., 2012; SOLT; MADGE; MAY,

2009). A IKKγ é essencial tanto para a formação do grande complexo IKK, quanto para

conexão das subunidades catalíticas (IKKβ e IKKα) às IκBs e consequente ativação da via

clássica do NF-κB (HACKER; KARIN, 2006; SOLT; MADGE; MAY, 2009).

Estudos recentes tem demonstrado a presença do NF-κB no hipotálamo de ratos.

Kang et al. (2011) verificaram que ratos com insuficiência cardíaca mostraram um aumento

na atividade da subunidade p65 do NF-κB no núcleo paraventricular associado ao aumento na

expressão de citocinas. Essa associação culminou no balanço de neurotransmissores

excitatórios e inibitórios no PVN e o tratamento com inibidor do NF-κB diminuiu a

exacerbação verificada da atividade simpática. Esses achados foram corroborados por estudo

no qual Cardinale et al. (2012) demonstraram ser o bloqueio do NF-κB capaz de reduzir as

ações de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio, além de modular

componentes do sistema renina angiotensina, no PVN e culminar com o controle da

hipertensão.

A via do NF-κB pode ser inibida por vários agentes, entre eles o TNF-α, IL-10, óxido

nitrico (NO), salicilatos (aspirina), além dos glicocorticoides (CELEC, 2004). Quando não

ativados, NF-κB e o GR ficam no citoplasma da maioria das células, e a associação de ambos

foi primeiramente confirmada com a co-imunoprecipitação de GR com p65 e p50 no

citoplasma de hepatócitos de ratos. Em experimentos in vitro, o GR foi encontrado em

associação com p65, uma interação que leva a um antagonismo transcricional, pois esta é a

subunidade transcricionalmente ativa (WIDENS et al., 2003).

Muitos mecanismos foram postulados para a regulação do NF-κB pelos

glicocorticoides. Entre eles incluem: (1) a indução da síntese do IκB; (2) um modelo de

interação proteína - proteína, que propõe que o glicocorticoide reprime a ativação e/ou função

do NF-κB pelo bloqueio ao acesso ao sitio do DNA (κB); (3) por formar um complexo com o

NF-κB que perde a capacidade de se ligar ao DNA; (4) por formar um complexo com o NF-

κB já ligado ao DNA; (5) e/ou por competição com coativadores nucleares do NF-κB. Assim,

múltiplos mecanismos podem estar envolvidos na repressão mediada pelo GR (ALMAWI;

MELEMEDJIAN, 2002; JENKINS; PULLEN; DARIMONT, 2001; SCHEINMAN et al.,

1995; WIDÉN; GUSTAFSSON; WIKSTRM, 2003). O modelo de interação do GR com seus

16

elementos responsivos no DNA tem a capacidade de elucidar os mecanismos moleculares da

modulação dos glicocorticoides na ativação gênica. Porém, recentes evidências demonstraram

que os glicocorticoides atuam no nível transcricional, antagonizando a função ou a ativação

de fatores de transcrição (ALMAWI; MELEMEDJIAN, 2002), como na indução da síntese de

IκBs, como citado anteriormente.

A influência do NF-κB na expressão gênica hipotalâmica foi recentemente

evidenciada por Zhang et al. (2013). De acordo com os autores, o envelhecimento sistêmico

está associado à redução hipotalâmica do RNAm do Gnrh1 e esse fato foi revertido pela

inibição do IKKβ e NF-κB. Apesar de não existir evidências na literatura que relatem a

influência direta do NF-κB sobre a transcrição do gene de neuropeptídeos, ocitocina e

vasopressina, foram identificados três sítios de ligação para o NF-κB na região promotora do

gene do receptor de ocitocina (KHANJANI et al., 2011; TERZIDOU et al., 2006).

Assim, o presente estudo propõe-se a testar a hipótese de que a modulação sobre a

síntese e liberação de ocitocina, por neurônios magnocelulares, exercida pelos

glicocorticoides, no modelo de desidratação por sobrecarga salina durante quatro dias, pode

ocorrer mediante a modulação da via do NF-κB.

17

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Verificar o perfil de expressão do componente p65 da via clássica do NF-κB em

neurônios ocitocinérgicos do PVN e SON em condições basais, ao tratamento com

glicocorticoides e em resposta à desidratação.

3.2. Objetivos Específicos

Avaliar os efeitos da dexametasona no modelo de desidratação por sobrecarga salina

(NaCl 1,8%) durante quatro dias e observar:

• O perfil de massa corpórea, ingestão de fluidos, NaCl (0,3 M) e água, e ração;

• A concentração plasmática de ANG II;

• Diferenças na expressão de OT em neurônios das divisões magnocelular medial e

lateral, parvocelular medial e posterior do núcleo paraventricular (PaMM, PaLMMP,

PaPP, respectivamente) e neurônios do núcleo supra-óptico (SON);

• Diferenças na expressão da subunidade p65 do NF-κB em neurônios das divisões

magnocelular medial e lateral, parvocelular medial e posterior do núcleo

paraventricular (PaMM, PaLMMP, PaPP, respectivamente) e neurônios do núcleo

supra-óptico (SON);

• Diferenças na co-expressão de OT com p65 em neurônios das divisões magnocelular

medial e lateral, parvocelular medial e posterior do núcleo paraventricular (PaMM,

PaLMMP, PaPP, respectivamente) e neurônios do núcleo supra-óptico (SON);

18

4. METODOLOGIA

4.1. Animais utilizados

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, apresentando 250-300 g de massa

corpórea, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe – UFS, que

foram mantidos no Biotério do Laboratório de Neuroendocrinologia Básica e

Comportamental (LANBAC) do Departamento de Fisiologia (DFS), em ambiente com luz e

temperatura controladas (ciclo claro-escuro de 12 horas, temperatura de 23 ± 2ºC) e livre

acesso a água e ração para roedores, até o início do experimento.

Todos os procedimentos aos quais os animais utilizados neste estudo estão de acordo

com as normas e princípios éticos preconizados pela Diretriz Brasileira para o Cuidado e a

Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos – DBCA, bem como pelas Diretrizes

da Prática de Eutanásia, ambas do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

(CONCEA), e ainda em consonância com as normas e princípios éticos preconizados pela

International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals. Toda a equipe

executora deste projeto estava ciente do conteúdo da lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008

(Lei Arouca). Além disso, este projeto foi apreciado e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS), sob protocolo de

n° 60/2012 (ANEXO A).

Todos os esforços foram feitos para reduzir o número de animais utilizados, bem

como para evitar a geração de desconforto e sofrimento.

4.2. Drogas utilizadas

Para o tratamento com corticosteroide utilizou-se o acetato de dexametasona (Dexa),

na dose de 10 mg/kg de massa corporal, i.p. (DECADRONAL, Aché Laboratórios

Farmacêuticos). Para a anestesia dos animais submetidos à perfusão transcardíaca foi

19

Figura 3: Delineamento experimental do Protocolo I – Comportamento de ingestão, perfusão e coleta do

cérebro.

utilizado uma combinação de Ketamina (Cetamin, SyntecVet) na dose de 60 mg/kg de massa

corpórea, via intraperitoneal (i.p.), com Xilazina (Vetbrands, Brasil) na dose de 7,5 mg/kg de

massa corpórea, via intraperitoneal (i.p.).

4.3. Delineamento experimental

4.3.1. Protocolo I – Comportamento de ingestão, perfusão e coleta do cérebro

Por meio do Protocolo I, adaptado de Lopes da Silva (2008), ilustrado na Figura 2, o

presente estudo avaliou o comportamento de ingestão de fluidos, ração e massa corpórea dos

animais durante os quatro dias experimentais. Durante esse período, os animais foram

agrupados de modo a constituir os grupos descritos a posteriori. Além disso, ao findar do

estudo comportamental, os mesmos animais foram submetidos ao procedimento de perfusão

transcardíaca para a coleta do cérebro e posterior realização da imunofluorescência. Por meio

dessa, estudou-se a expressão de ocitocina (OT) e da subunidade p65, nos núcleos

paraventricular e supra-óptico do hipotálamo de animais submetidos à sobrecarga salina

durante quatro dias (SL4) e/ou ao tratamento com Dexa.

20

Grupos:

• Controle - acesso somente à água e ração, durante quatro dias experimentais, tratados

com veículo, solução de cloreto de sódio isotônica, NaCl (0,9%), via intraperitoneal

(i.p.), 12 e 2 horas antes de serem perfundidos. Esse grupo foi constituído de 6 a 7

animais;

• Controle + Dexa - acesso somente à água e ração, durante quatro dias experimentais,

tratados com dexametasona (10 mg / kg de massa corpórea, i.p.), para supressão do

eixo hipotálamo – hipófise-adrenal, 12 e 2 horas antes de serem perfundidos. Esse

grupo foi constituído de 6 a 7 animais;

• SL4 - acesso somente à solução salina hipertônica, NaCl (0,3 M), e ração, durante os

quatro dias experimentais, tratados com veículo, solução de cloreto de sódio isotônica,

NaCl (0,9%), via intraperitoneal (i.p.), 12 e 2 horas antes de serem perfundidos. Esse

grupo foi constituído de 6 a 7 animais;

• SL4 + Dexa - acesso somente à solução de cloreto de sódio hipertônica, NaCl (0,3 M),

e ração, durante os quatro dias experimentais, tratados com dexametasona (10 mg / kg

de massa corpórea, i.p.), para supressão o eixo hipotálamo – hipófise-adrenal, 12 e 2

horas antes de serem perfundidos. Esse grupo foi constituído de 6 a 7 animais.

No dia do experimento os animais foram anestesiados com uma combinação de

Ketamina , na dose de 60 mg/kg de massa corpórea, i.p., com Xilazina , na dose de 7,5 mg/kg

de massa corpórea, i.p, sendo submetidos à perfusão do SNC, com a coleta do cérebro para

realização da imunofluorescência de OT e subunidade p65 do NF-κB. Todos os experimentos

desse protocolo foram realizados entre 9 h e 11 h .

21

Figura 4: Delineamento experimental do Protocolo II – Coleta de sangue para dosagem de ANG II

4.3.2. Protocolo II – Coleta de sangue para dosagem de ANG II

O Protocolo II, adaptado de Lopes da Silva (2008), ilustrado na Figura 3, foi

utilizado para avaliar os efeitos da sobrecarga salina durante quatro dias (SL4) e da interação

da Dexa sobre a concentração plasmática de angiotensina II. Assim, no quarto dia

experimental, após o tratamento com Dexa ou Veículo (12 h e 2 h antes de serem

eutanaziados), os animais dos quatro grupos experimentais foram decapitados (entre 9h e 11

h), sendo o sangue coletado do tronco para a realização da dosagem hormonal de ANG II. É

válido destacar que, para o procedimento de eutanásia, foi utilizada uma guilhotina apropriada

para rato.

Grupos:

• Controle - acesso somente à água e ração, durante quatro dias experimentais, tratados

com veículo, solução de cloreto de sódio isotônica, NaCl (0,9%), via intraperitoneal

(i.p.), 12 e 2 horas antes de serem perfundidos. Esse grupo foi constituído de 6 a 7

animais;

• Controle + Dexa - acesso somente à água e ração, durante quatro dias experimentais,

tratados com dexametasona (10 mg/kg de massa corpórea, i.p.), para supressão do eixo

22

hipotálamo – hipófise-adrenal, 12 e 2 horas antes de serem perfundidos. Esse grupo foi

constituído de 6 a 7 animais;

• SL4 - acesso somente à solução salina hipertônica, NaCl (0,3 M), e ração, durante os

quatro dias experimentais, tratados com veículo, solução de cloreto de sódio isotônica,

NaCl (0,9%), via intraperitoneal (i.p.), 12 e 2 horas antes de serem perfundidos. Esse

grupo foi constituído de 6 a 7 animais;

• SL4 + Dexa - acesso somente à solução de cloreto de sódio hipertônica, NaCl (0,3 M),

e ração, durante os quatro dias experimentais, tratados com dexametasona (10 mg/kg

de massa corpórea, i.p.), para supressão o eixo hipotálamo – hipófise-adrenal, 12 e 2

horas antes de serem perfundidos. Esse grupo foi constituído de 6 a 7 animais.

4.4. Procedimentos experimentais

4.4.1. Medidas do comportamento de ingestão de fluidos

Os animais foram, inicialmente, mantidos em gaiolas metabólicas individuais,

durante três dias, para habituação. No período de habituação, os animais tiveram acesso ad

libitum à água e ração. Ao findar desse período, a oferta de fluidos foi modificada,

obedecendo ao critério de formação dos grupos experimentais, como já descrito.

As gaiolas metabólicas são constituídas de um espaço individual para que o animal

seja alocado, bebedouro com capacidade para um volume de 100 mL, graduado em 1 mL, e

comedouro.

A massa corpórea dos animais, o volume inicial contido nos bebedouros e a massa de

ração inicialmente ofertada nos comedouros foram mensurados previamente ao início do

período experimental. Vale salientar que, a medida da ingestão (quantidade de fluido e ração

ingeridos) e massa corpórea foi realizada em intervalos de 24 horas, durante os quatro dias.

23

Para inferir a quantidade de ração consumida, diariamente, subtraiu-se a massa da

ração do dia anterior pela massa do dia subsequente. O volume de solução salina hipertônica,

NaCl (0,3 M), ou água ingeridos foi obtido seguindo o mesmo critério, diferindo apenas no

que concerne ao valor do qual se diminui, que, nesse caso, foi o volume do dia anterior

subtraído do volume do dia subsequente, em virtude do bebedouro (proveta graduada que foi

adaptada) estar invertido e com ele a ordem crescente de sua graduação.

4.4.2. Perfusão transcardíaca

Os animais foram anestesiados através da injeção intraperitoneal com uma

combinação de Ketamina e Xilazina. A perfusão transcardíaca foi realizada com o objetivo

de coletar o cérebro para a realização dos estudos imuno - histoquímicos. O protocolo

cirúrgico utilizado no referido projeto é o que vem sendo aplicado no Laboratório de Biologia

Experimental (LBE), tal como descrito a posteriori.

Após aprofundamento na anestesia e verificação da cessação de resposta raqui-

medular, realizou-se uma incisão longitudinal na região púbica até a incisura jugular para a

retirada de pele e visualização dos músculos. Uma segunda incisão foi realizada na região

púbica em direção ao processo xifoide para a retirada de tecido muscular e visualização do

diafragma (separando cuidadosamente o fígado do diafragma). Realizou-se, então, uma

pequena incisão inicial no diafragma, da região lateral em direção à região ventral, para

exposição da cavidade pleural e abertura da caixa torácica. Em seguida, deslocando

cuidadosamente os pulmões, fez-se um corte através da caixa torácica em direção à clavícula,

realizando-se um corte similar contralateralmente, expondo a porção ventral do gradil torácico

para rebatimento e livre acesso ao coração.

Após visualizar o coração, injetou-se no ventrículo esquerdo uma agulha sem bisel

conectada a um sistema de perfusão, cujo objetivo é trocar o tecido sanguíneo por uma

solução salina 0,9% tamponada (tampão fosfato, PB, pH 7,4; 0,1 M) à temperatura ambiente,

por um período de 5 minutos, a um fluxo de 8 mL/min. Ao término do tempo estimado, a

solução salina tamponada foi substituída por uma solução de Formol 10% tamponado

24

(tampão fosfato pH 7,4; 0,1 M) à temperatura ambiente, por um período de 40 minutos, a um

fluxo de 8 mL / min.

Posteriormente, os animais foram decapitados e uma incisão na linha média da

cabeça foi feita, a partir do pescoço em direção ao nariz, para a retirada de pele e tecido

subcutâneo, com consequente exposição da calota craniana. A seguir, retirou-se a calota

craniana e dura-máter, expondo o encéfalo. O cérebro foi, então, retirado e submetido ao

processo de pós-fixação, onde o tecido coletado permanece imerso na mesma solução de

fixação utilizada na perfusão (Formol 10% em PB) durante 2 horas.

Em seguida, o cérebro passou pelo processo de crioproteção, que consiste em

armazenar o cérebro em uma solução de sacarose 30% tamponada (tampão fosfato 0,1 M, pH

7,4), onde permaneceu até a sua completa precipitação (entre 48 e 72 horas), à temperatura de

- 4°C.

4.4.3. Expressão de ocitocina e p65 em tecido encefálico por imunofluorescência

Após a completa precipitação, os cérebros, armazenados em solução de sacarose 30%

tamponada, foram levados ao criostato, a -22°C, para a obtenção de secções coronais seriadas

(1:4) com 20 µm de espessura, através do núcleo paraventricular (PVN) e núcleo supra-óptico

(SON) do hipotálamo, de acordo com o atlas estereotáxico de Swanson (SWANSON, 1992).

As secções cerebrais obtidas foram armazenadas em uma solução anticongelamento.

As secções cerebrais a serem analisadas foram processadas sobre livre flutuação, à

temperatura ambiente (25°C), e inicialmente lavadas em tampão (pH 7,4) fosfato salina (0,01

M), PBS, (três lavagens com duração de cinco minutos, cada). Além disso, o mesmo processo

de lavagem ocorreu após a exposição aos reagentes de cada etapa.

Em seguida, o tecido foi incubado em uma solução de soro de cavalo (10%) e Triton

X-100 (0,1%), diluídos em PBS (0,01 M) (durante uma hora), para bloqueio das ligações

inespecíficas.

25

Após essa etapa para bloqueio das ligações inespecíficas e lavagens, procedeu-se às

incubações com os anticorpos primários utilizados no presente estudo. As secções foram

incubadas em PBS (0,01 M) contendo Triton X-100 (0,1%), anticorpo contra ocitocina

(policlonal, produzido em cobaia, Penninsula Laboratories – Lote: A03808) na diluição

1:5000 e anticorpo contra a região C-20 da subunidade p65 do NF-κB (policlonal, produzido

em coelho, Santa Cruz Biotechnology – Lote: D0208) na diluição 1:200. O tecido foi

mantido incubado com solução contendo os anticorpos primários overnight.

Após o período de exposição aos anticorpos primários, os cortes foram incubados

com os anticorpos secundários anti-cobaia produzido em cabra e conjugado ao Alexa Fluor

488 (policlonal, Penninsula Laboratories) 1:500 e anti-coelho produzido em burro e

conjugado ao Alexa Fluor 555 (policlonal, Penninsula Laboratories) 1:500 em solução de

PBS (0,01 M) contendo Triton (0,1%), durante duas horas. Após as lavagens em PBS (0,01

M) (três vezes de cinco minutos, cada), as secções coronais foram montadas em lâminas

gelatinizadas com 100 µL de Vectashield (solução de montagem), cobertos com lamínulas e

vedados com tinta esmalte.

A imunofluorescência foi realizada no Laboratório de Neuroendocrinologia do

Departamento de Medicina da USP de Ribeirão Preto, seguindo o protocolo descrito

anteriormente e que é utilizado rotineiramente no mesmo.

4.4.4. Métodos de captura e análise das imagens encefálicas obtidas pela reação de

imunofluorescência.

As secções foram examinadas em microscópio de fluorescência (Olympus IX2- ICB/

EUA) e as imagens capturadas em câmera digital acoplada (XM-10). Para a detecção da

expressão de OT e p65 (RelA), as secções foram analisadas em série ao longo do PVN e do

SON no sentido rostro-caudal. Para análise das lâminas no microscópio foram utilizadas

objetivas e ocular que capturavam imagens do objeto de interesse em aumento total de 200 e

400 vezes. Os neurônios foram analisados qualitativamente e classificados ou não como

expressando OT e/ou p65 (RelA). O sítio celular (i.e. citoplasma ou núcleo) de localização da

molécula de interesse também foi objeto de análise.

26

A captura das imagens foi realizada no Laboratório de Biologia Experimental – LBE,

do Departamento de Morfologia – DMO, da Universidade Federal de Sergipe.

4.4.5. Extração e dosagem de ANG II

A dosagem hormonal foi realizada por radioimunoensaio específico (RIE), em

parceria com o Laboratório de Neuroendocrinologia do Departamento de Fisiologia da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, como descrito a posteriori. Todas as

amostras provenientes de um mesmo experimento foram determinadas em duplicata, em um

mesmo ensaio.

Para a mensuração da concentração plasmática de ANG II, o sangue coletado do

tronco dos animais, após decaptação, foram armazenados em tudos resfriados contendo

inibidores de peptidases. O plasma foi obtido após centrifugação (1600 g durante 20 min, a

4°C) e armazenado a -20°C. Os peptídeos plasmáticos foram extraídos numa coluna para

extração de fase sólida Bond Elut (Peninsula Laboratories Inc., Belmont, CA, USA). As

colunas foram pré-ativadas por lavagens sequenciais com 4 mL de acetonitrila (60%)/TFA

(0,1%) e 20 mL de TFA (0,1%). As colunas foram , então, lavadas com 20 mL de TFA

(0,1%). Os peptídeos absorvidos foram eluídos com 3 mL de acetonitrila (60%)/ TFA (0,1%)

em tubos de polipropileno. Após evaporação, as concentrações do peptídeo ANG II foram

mensurados por radioimunoensaio. O anticorpo contra ANG II foi obtido da Peninsula

Laboratories (ANG II: T4007). A sensibilidade do radioimunoensaio e os coeficientes de

variação intra e inter-ensaio foram 0,39 pg/mL, 10,9% e 17,1%, respectivamente (ARAUJO et

al., 2013; MECAWI et al., 2013).

27

4.5. Análise estatística

Os resultados obtidos estão expressos em valores de média e erro padrão da média.

Para comparação entre mais de dois grupos submetidos à interferência simultânea de dois

fatores de variação foi utilizado ANOVA two-way, seguida do pós-teste de Bonferroni. O

nível crítico fixado foi de 5% (p<0,05) para se admitir uma diferença de médias como

estatisticamente significante. Para realização dos testes estatísticos foi utilizado o programa

Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

28

5. RESULTADOS

5.1. Comportamento de ingestão de fluidos e ração

No Painel A da Figura 5, a análise de variância (ANOVA) de duas vias mostrou não

haver interação dos fatores „tempo‟ e „sobrecarga salina (SL)‟ sobre a massa corpórea dos

animais estudados (p = 0,4306). Ademais, nenhum destes fatores, isoladamente, apresentou

efeito significativo ao longo dos 3 primeiros dias de sobrecarga salina (p = 0,3669 e p

= 0,4879, respectivamente). No 4º dia (Fig. 5B), a ANOVA de duas vias, da mesma forma,

mostrou não haver interação dos fatores „SL4‟ e „administração da dexametasona‟ sobre a

massa corpórea dos mesmos animais (p = 0,3486). Também não foi verificado efeito

significativo isolado de nenhum dos fatores (p = 0, 5478 e p = 0,4063, respectivamente)

Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 30

100

200

300

400Controle

SL4

(A)

Massa c

orp

óre

a (

g)

Veículo Dexa0

100

200

300

400Controle

SL4

(B)

Massa c

orp

óre

a (

g)

Figura 5: Influência da indução da hiperosmolaridade crônica (Paineis A e B) e do tratamento com

dexametasona no 4° dia experimental (Painel B) na massa corpórea de ratos. Painel A: Controle (n = 15);

SL4 (n = 16). Painel B; Controle (n = 7); SL4 (n = 8); Controle + Dexa (n = 8); SL4 + Dexa (n = 8). Análise

estatística: ANOVA de duas vias seguido do pós-teste de Bonferroni. SL4: Sobrecarga salina durante quatro

dias; Veículo: (solução salina isotônica, 0,9% de NaCl); Dexa: Dexametasona.

29

Ao analisar a ingestão absoluta de fluidos ao longo dos três primeiros dias de SL (Fig.

6A), precedendo a administração da dexametasona, a ANOVA de duas vias evidenciou a

presença de interação dos fatores „tempo‟ e „SL‟ sobre esta variável (F(2, 46) = 8,382; p

= 0,0008). Além disso, também observou-se efeito significativo da SL isoladamente (F(1, 46) =

4,775; p = 0,0393) (Fig. 6A). Ademais, a mesma análise revelou não haver diferença para o

fator tempo isoladamente (p = 0,8321). Após a aplicação do pós-teste de Bonferroni, foi

constatada diferença entre a ingestão dos grupos Controle e SL4, ao 2° e 3° dia experimental

(28,78 ± 1,75 versus 42,79 ± 4,94 mL, p < 0,05; 26,77 ± 1,90 versus 43,47 ± 6,06 mL, p

< 0,01, respectivamente). Quanto aos valores de ingestão absoluta de fluidos no quarto dia

experimental, o teste estatístico identificou interação dos fatores estudados, „SL‟ e

„administração da dexametasona‟ (F (1, 26) = 6,415; p = 0,0177). Efeito significativo do fator

„SL‟ isoladamente também foi constatado (F (1, 26) = 11,15; p = 0,0025). Não foi observado

efeito significativo do fator tratamento, isoladamente, sobre esta variável (p = 0,1014). O pós-

teste de Bonferroni revelou que, na ausência de dexametasona, o grupo SL4 ingeriu mais

fluido quando comparado ao seu respectivo Controle (59,00 ± 7,086 versus 29,86 ± 1,870 mL,

p < 0,01, respectivamente). Esta diferença foi revertida pelo tratamento com dexametasona

(Fig. 6B).

O perfil de ingestão permaneceu o mesmo quando os resultados foram normalizados

por 100 g de massa corpórea. Na Figura 6C, verificou-se a presença de interação dos fatores

„tempo‟ e „SL‟ (F(2, 48) = 3,713; p = 0,0317) e apenas efeito significativo do fator „SL‟,

isoladamente (F(1,48) = 14,66; p = 0,0008). O pós-teste de Bonferroni demonstrou haver

diferença estatisticamente significativa no perfil de ingestão de fluidos ao segundo e terceiro

dia experimental (9,50 ± 0,62 versus 18,27 ± 2,12 mL, p < 0,01; 8,91 ± 0,73 versus 18,71 ±

2,45 mL, p < 0,001, respectivamente). A análise estatística do perfil de ingestão normalizado,

no quarto dia experimental, como observado na Figura 6D, demonstrou presença de interação

dos fatores estudados, „SL‟ e „administração da dexametasona‟, (F (1, 21) = 5,513; p = 0,0287),

bem como efeito significativo isolado do fator „SL‟ (F (1, 21) = 21,20; p = 0,0002). O pós teste

de Bonferroni evidenciou diferença entre os perfis de ingestão no quarto dia experimental

entre os grupos Controle e SL4 (11,25 ± 1,23 versus 21,66 ± 1,75 mL, p < 0,001,

respectivamente).

30

Dia 1 Dia 2 Dia 30

20

40

60

80

* **

(A)

Ing

estã

o d

e f

luid

os (

mL

)

Veículo Dexa0

20

40

60

80Controle

SL4***

(B)

Ing

estã

o d

e f

luid

os (

mL

)

Dia 1 Dia 2 Dia 30

5

10

15

20

25

** ***

(C)

Ing

estã

o d

e f

luid

os

(mL

/100 g

de m

assa c

orp

óre

a)

Veículo Dexa0

5

10

15

20

25***

(D)

Ing

estã

o d

e f

luid

os

(mL

/100 g

de m

assa c

orp

óre

a)

Na figura 7, estão expressos os valores absolutos da ingestão de ração dos grupos

Controle e SL4 nos três primeiros dias experimentais (Painel A) e, acrescido dos grupos

Controle + Dexa e SL4 + Dexa no quarto dia experimental (Painel B). Em relação à ingestão

absoluta de ração nos três primeiros dias experimentais, não foi verificada a presença de

interação dos fatores estudados, „tempo‟ e „SL‟, (p = 0,215). Ademais, observou-se efeito

significativo dos fatores tempo (F (2, 50) = 5,49, p = 3,99) e „SL‟ (F (1, 50) = 8,66, p = 0,0069).

Nessa análise, o grupo SL4 ingeriu menor quantidade de ração em comparação ao grupo

Controle ao primeiro e segundo dia experimental (18,03 ± 1,16 versus 21,87 ± 1,23 g, p

= 0,031; 16,77 ± 0,99 versus 20,43 ± 1,32 g, p = 0,035, respectivamente) (Fig. 7A). Para os

valores absolutos de ingestão de ração no quarto dia experimental, a análise de variância de

Figura 6: Perfil de ingestão de fluidos do protocolo de indução hiperosmótica (Paineis A - D) e do

tratamento com dexametasona no 4° dia experimental (Paineis B e D). Os volumes ingeridos estão

expressos em valores absolutos (Paineis A e B) ou normalizados por 100 g de massa corpórea (Paineis C e D).

Análise estatística: ANOVA de duas vias seguido do pós-teste de Bonferroni; (*) p < 0,05; (**) p < 0,01; (***)

p < 0,001, quando comparados ao grupo controle. Paineis A e C: Controle (n = 14); SL4 (n = 11). Paineis B e

D; Controle (n = 7); SL4 (n = 8); Controle + Dexa (n = 8); SL4 + Dexa (n = 8). SL4: Sobrecarga salina durante

quatro dias; Veículo: (solução salina isotônica, 0,9% de NaCl); Dexa: Dexametasona.

31

duas vias não evidenciou interação dos fatores „SL‟ e „administração da dexametasona‟,

tampouco efeito significativo dos fatores isoladamente (interação: p = 0,321; SL: p = 0,637;

administração da dexametasona: p = 0,128) (Fig. 7B).

Ainda na figura 7 estão expressos os valores de ingestão de ração normalizados por

100 g de massa corpórea (Paineis C e D). Aos primeiros três dias experimentais, a análise de

variância de duas vias não demonstrou a existência de interação dos fatores, „tempo‟ e „SL‟,

estudados (p = 0,255) e do fator „SL‟ isoladamente (p = 0,181). No entanto, um efeito

significativo, isolado, do fator „tempo‟ foi verificado (Fig. 7C) (F (2, 56) = 5,63, p = 0,006).

Quando realizada a análise dos valores normalizados de ingestão de ração ao quarto dia

experimental não se evidenciou interação dos fatores „SL‟ e „administração da dexametasona‟

(p = 0,807), bem como dos fatores „SL‟ e „administração da dexametasona‟, isoladamente (p

= 0,82; p = 0,09, respectivamente).

32

DIA 1 DIA 2 DIA 30

10

20

30

* *

Ing

estã

o d

e r

ação

(g

)

Veículo Dexa0

10

20

30CONTROLE

SL4

Ing

estã

o d

e r

ação

(g

)

DIA 1 DIA 2 DIA 30

2

4

6

8

10

Ing

estã

o d

e r

ação

(g

/100 g

de m

assa c

orp

óre

a)

Veículo Dexa0

2

4

6

8

10

Ing

estã

o d

e r

ação

(g

/100 g

de m

assa c

orp

óre

a)

(A) (B)

(C)(D)

5.2.

5.2 Concentração plasmática de Angiotensina II

As concentrações plasmáticas de ANG II, mensuradas após o tratamento

hiperosmótico seguido, ou não, de administração de dexametasona, estão representados na

Figura 8. Ao analisar a concentração plasmática de ANG II, a análise de variância de duas

vias evidenciou presença de interação dos fatores „SL‟ e „administração da dexametasona‟,

estudados (F (1, 19) = 6,35, p = 0,0209) e efeito significativo isolado do fator „administração da

dexametasona‟ (F (1, 19) = 4,77, p = 0,0417). O pós teste de Bonferroni evidenciou diferença

Figura 7: Perfil de ingestão de ração do protocolo de indução hiperosmótica (Paineis A - D) e do

tratamento com dexametasona no 4° dia experimental (Paineis B e D). O consumo de ração ingerida está

expresso em valor absoluto (Paineis A e B) ou normalizado por 100g de massa corpórea (Paineis C e D). Análise

estatística: ANOVA de duas vias seguido do pós-teste de Bonferroni; (*) p < 0,05, quando comparado ao grupo

controle. Paineis A e C: Controle (n=14); SL4 (N=16). Paineis B e D; Controle (n = 7); SL4 (n = 8); Controle +

Dexa (n = 8); SL4 + Dexa (n = 8). SL4: Sobrecarga salina durante quatro dias; Veículo: (solução salina

isotônica, 0,9% de NaCl); Dexa: Dexametasona.

33

entre as concentrações plasmáticas de ANG II dos grupos Controle e SL4 (337,14 ± 95,35

versus 841,59 ± 110,46 pg/mL, p < 0,01, respectivamente ).

Veículo Dexa0

500

1000

1500Controle

SL4

**

AN

G I

I (p

g/m

L)

5.3. Dupla marcação OT/p65 nos núcleos paraventricular e supra-óptico do

hipotálamo

Os resultados descritos a posteriori são referentes à análise qualitativa da presença

da subunidade p65 do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB), bem como, inferências a

respeito do seu padrão de marcação intracelular (citoplasmática, nuclear ou em ambos), em

neurônios ocitocinérgicos do núcleo paraventricular (PVN) e supra-óptico (SON), por meio

da técnica de imunofluorescência para a marcação dupla de OT e p65. As divisões dos

núcleos hipotalâmicos estudados são apresentadas de acordo com o proposto pelo atlas de

Paxinos e Watson (2007).

Nas figuras 9, 10, 11 e 12 estão apresentadas fotomicrografias representativas de

secções coronais do cérebro de ratos ilustrando tecidos com neurônios marcados para

ocitocina (OT) e/ou subunidade p65 do NF-κB, nas divisões magnocelular medial (PaMM),

Figura 8: Efeitos do tratamento com dexametasona nos níveis plasmáticos de angiotensina II dos grupos

de animais submetidos ao protocolo de indução hiperosmótica. Análise estatística: ANOVA de duas vias

seguido do pós-teste de Bonferroni; (**) p < 0,01. Controle (n = 5); SL4 (n = 7); Controle + Dexa (n = 5); SL4

+ Dexa (n = 7). SL4: Sobrecarga salina de quatro dias; Veículo: (solução salina isotônica, 0,9% de NaCl);

Dexa: Dexametasona.

34

magnocelular lateral e parvocelular medial (PaLMMP), parvocelular posterior (PaPP) do

núcleo paraventricular e núcleo supra-óptico, respectivamente. Os Paineis de A a D destacam

os neurônios ocitocinérgicos (verde) dos grupos Controle (Painel A), Controle + Dexa (Painel

B), SL4 (Painel C) e SL4 + Dexa (Painel D). Nos Paineis de E a H, por sua vez, podemos

visualizar os neurônios marcados para p65 (em vermelho) nos grupos experimentais já

destacados. As sobreposições das marcações encontradas estão ilustradas nos paineis de I a L.

Nesses, também encontram-se destacados, no canto inferior direito, amostras de fenótipos

neuronais nas quais se evidencia a ocorrência e a localização da dupla marcação.

Na Figura 9, encontram-se destacados, nos Paineis de A a L, as fotomicrografias

representativas da divisão magnocelular medial do núcleo paraventricular (PaMM). Como

pode ser visualizado nos Paineis de A a D, após análise qualitativa, podemos inferir que a

ocitocina apresentou marcação citoplasmática. O grupo Controle + Dexa apresentou marcação

mais acentuada de ocitocina (Painel B) quando comparado aos grupos Controle (Painel A),

SL4 (Painel C) e SL4 + Dexa (Painel D). Nos grupos experimentais submetidos à SL4 e SL4

+ Dexa (Paineis de C a D) houve baixa marcação de ocitocina, quando compara-se à

marcação visualizada nos grupos Controle e Controle + Dexa (Paineis de A e B).

A marcação da subunidade p65 do NF-κB no PaMM demonstra se

predominantemente citoplasmática (Fig. 9, paineis de E a H). Como pode ser visualizado no

Painel F, o grupo Controle + Dexa apresentou baixa expressão da subunidade p65, quando

contraposto aos perfis fenotípicos apresentados nas fotomicrografias dos grupos Controle

(Painel E), SL4 (Painel G) e SL4 + Dexa (Painel H).

Os Paineis de I a L, da Figura 9, evidenciam as fotomicrografias resultantes das

sobreposições das marcações OT/p65. Uma maior densidade de células positivas para OT/p65

pode ser vista no Painel I, onde demonstram uma maior marcação citoplasmática para a p65

em detrimento de sua menor marcação nuclear. A observação do Controle + Dexa (Painel J)

sugere uma marcação de aspecto citoplasmático, e ainda menos intensa, de neurônios

positivos para OT/p65, em relação aos demais grupos. Por outro lado, a observação dos

neurônios ocitocinérgicos dos grupos SL4 e SL4 + Dexa (Paineis K e L), mostra uma intensa

marcação positiva para OT/p65. Além disso, sugerimos considerável marcação citoplasmática

nesse grupo.

35

3 V

OT

Controle Controle + Dexa SL4 SL4 + Dexa

Figura 9: Fotomicrografias representativas da expressão de ocitocina (OT; Paineis A, B, C e D) e da subunidade

p65 do NF-κB (Paineis E, F, G e H) em neurônios da divisão magnocelular medial do núcleo paraventricular

(PaMM) de ratos tratados durante 4 dias com água ad libitum (Controle; Paineis A, E e I); ou com água ad libitum

e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes da perfusão (Controle + Dexa; Paineis B, F e

J); ou com sobrecarga salina ad libitum, NaCl (1,8%), durante 4 dias (SL4; Paineis C, G e K); ou com sobrecarga

salina ad libitum (NaCl 1,8%) durante 4 dias e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes

da perfusão (SL4 + Dexa; Paineis D, H e L). As imagens foram capturadas em aumento de 200 e 400 vezes), n = 2

– 3 por grupo. Dimensão da escala: 50 μm. 3V: terceiro ventrículo. Os retângulos amarelos indicam a localização

de neurônios duplamente marcados e destacados em maior aumento no canto inferior direito dos Paineis I, J, K e L.

So

bre

posi

ção

p65

OT

36

As divisões magnocelular lateral e parvocelular medial do núcleo paraventricular

(PaLMMP) estão representadas na Figura 10. A análise comparativa de seus paineis permite

sugerir a presença de marcação citoplasmática para a ocitocina (Paineis de A a D). Os grupos

SL4 e SL4 + Dexa apresentaram uma maior expressão de ocitocina (Paineis C e D), quando

comparados aos grupos Controle e Controle + Dexa (Paineis A e B).

Como revelado nas fotomicrografias, a subunidade p65 está presente em todos os

grupos experimentais estudados e a observação do padrão de marcação intracelular observado

se mostra predominantemente citoplasmático (Fig. 10, paineis de E a H). O grupo Controle

(Painel E) apresenta uma marcação de p65 mais acentuada em relação ao grupo Controle +

Dexa (Painel F), e o grupo SL4 (Painel G) uma marcação mais acentuada para p65 quando

comparado ao grupo SL4 + Dexa (Painel H).

Na análise qualitativa das fotomicrografias representativas das duplas marcações

obtidas, verifica-se que todos os grupos experimentais apresentaram células neuronais

marcadas positivamente duplamente OT/p65. A observação ainda nos permite inferir a

respeito de uma localização intracelular predominantemente citoplasmática (Figura 10,

paineis de I a L). Os grupos Controle e SL4 apresentaram menor marcação nuclear para o p65

(Paineis I e K). A observação dos grupos SL4 e SL4 + Dexa (Paineis K e L), nos leva a

destacar uma marcação menos intensa de neurônios positivos para OT/p65, em relação aos

demais grupos.

37

3 V 3 V

3 V

3 V 3 V

3 V

3 V

3 V 3 V

3 V

3 V 3 V

Figura 10: Fotomicrografias representativas da expressão de ocitocina (OT; Paineis A, B, C e D) e da subunidade

p65 do NF-κB (Paineis E, F, G e H) em neurônios da divisão magnocelular lateral e parvocelular medial do núcleo

paraventricular (PaLMMP) de ratos tratados durante 4 dias com água ad libitum (Controle; Paineis A, E e I); ou com

água ad libitum e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes da perfusão (Controle + Dexa;

Paineis B, F e J); ou com sobrecarga salina ad libitum, NaCl (1,8%), durante 4 dias (SL4; Paineis C, G e K); ou com

sobrecarga salina ad libitum (NaCl 1,8%) durante 4 dias e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e

2 h antes da perfusão (SL4 + Dexa; Paineis D, H e L). As imagens foram capturadas em aumento de 200 e 400

vezes, n = 2 – 3 por grupo. Dimensão da escala: 50 μm. 3V: terceiro ventrículo. Os retângulos amarelos indicam a

localização de neurônios duplamente marcados e destacados em maior aumento no canto inferior direito dos Paineis

I, J, K e L.

Controle Controle + Dexa SL4 SL4 + Dexa

So

bre

posi

ção

p65

OT

38

A análise das fotomicrografias representativas da divisão parvocelular posterior do

núcleo paraventricular (PaPP) demonstraram a presença de neurônios marcados positivamente

para ocitocina com característica predominantemente citoplasmática em todos os grupos

experimentais (Fig. 11, paineis de A a D). Podemos observar que a marcação foi menos

intensa nos Grupos tratados com Dexa, Controle + Dexa e SL4 + Dexa (Paineis B e D)

quando comparados com os seus respectivos controles, grupos Controle e SL4 (Paineis A e

C).

A região parvocelular posterior apresentou-se com marcação positiva para de p65 em

todos os grupos experimentais estudados e com caraterística predominantemente

citoplasmática (Fig. 11, paineis de E a H).

Ainda em relação à divisão parvocelular posterior (PaPP), pode-se destacar a

presença de poucos neurônios marcados positivamente para OT/p65, em todos os grupos

experimentais (Fig. 11, paineis de I a L).

39

3 V

3 V 3 V

3 V 3 V

3 V 3 V 3 V 3 V

3 V 3 V 3 V

Figura 11: Fotomicrografias representativas da imunomarcação de ocitocina (OT; Paineis A, B, C e D) e da

subunidade p65 do NF-κB (Paineis E, F, G e H) em neurônios da divisão parvocelular posterior do núcleo

paraventricular (PaPP) de ratos tratados durante 4 dias com água ad libitum (Controle; Paineis A, E e I); ou com

água ad libitum e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes da perfusão (Controle +

Dexa; Paineis B, F e J); ou com sobrecarga salina ad libitum, NaCl (1,8%), durante 4 dias (SL4; Paineis C, G e K);

ou com sobrecarga salina ad libitum (NaCl 1,8%) durante 4 dias e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado

apenas 12h e 2 h antes da perfusão (SL4 + Dexa; Paineis D, H e L). As imagens foram capturadas em aumento de

200 e 400 vezes, n = 2 – 3 por grupo. Dimensão da escala: 50 μm. 3V: terceiro ventrículo. Os retângulos amarelos

indicam a localização de neurônios duplamente marcados e destacados em maior aumento no canto inferior direito

dos Paineis I, J, K e L.

Controle Controle + Dexa SL4 SL4 + Dexa

So

bre

posi

ção

p65

OT

40

O núcleo supra-óptico está destacado em fotomicrografias representativas, na Figura

12. Nos paineis de A a D, nossa observação sugere uma marcação predominantemente

citoplasmática para a ocitocina.

Observamos a marcação de p65 em todos os grupos (Paineis de E a H), com

característica de marcação predominantemente citoplasmática. Além disso, constatamos a

presença de neurônios magnocelulares do SON marcados positivamente para OT/p65 na

totalidade dos grupos analisados.

41

QO QO QO

QO

QO

QO

QO QO

QO

QO

QO QO

Figura 12: Fotomicrografias representativas da imunomarcação de ocitocina (OT; Paineis A, B, C e D) e da

subunidade p65 do NF-κB (Paineis E, F, G e H) em neurônios do núcleo supra-óptico (SON) de ratos tratados

durante 4 dias com água ad libitum (Controle; Paineis A, E e I); ou com água ad libitum e dexametasona (10

mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes da perfusão (Controle + Dexa; Paineis B, F e J); ou com

sobrecarga salina ad libitum, NaCl (1,8%), durante 4 dias (SL4; Paineis C, G e K); ou com sobrecarga salina ad

libitum (NaCl 1,8%) durante 4 dias e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes da

perfusão (SL4 + Dexa; Paineis D, H e L). As imagens foram capturadas em aumento de 200 e 400 vezes, n = 2 – 3

por grupo. Dimensão da escala: 50 μm. QO: quiasma óptico. Os retângulos amarelos indicam a localização de

neurônios duplamente marcados e destacados em maior aumento no canto inferior direito dos Paineis I, J, K e L.

Controle Controle + Dexa SL4 SL4 + Dexa

So

bre

posi

ção

p65

OT

42

Quadro 1: Resumo dos resultados referentes à análise qualitativa da dupla expressão OT/p65 no PVN e

SON de ratos tratados durante 4 dias com água ad libitum (Controle); ou com água ad libitum e

dexametasona (10 mg/ kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes da perfusão (Controle + Dexa); ou

com sobrecarga salina ad libitum (NaCl 1,8%) de 4 dias (SL4); ou com sobrecarga salina ad libitum

(NaCl 1,8%) de 4 dias e dexametasona (10 mg/kg, i.p.) administrado apenas 12h e 2 h antes da perfusão

(SL4 + Dexa), n = 2 - 3 por grupo. PaMM (região magnocelular medial do núcleo paraventricular);

PaLMMP (região magnocelular lateral e parvocelular medial do núcleo paraventricular); PaPP (região

parvocelular posterior do núcleo paraventricular); SON (núcleo supra-óptico).

Controle Controle + Dexa SL4 SL4 + Dexa

Pa

MM

Colo

cali

zaçã

o

celu

lar

de

OT

e

p65 Sim Sim Sim Sim

Lo

cali

zaçã

o d

a

dup

la m

arca

ção

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática

PaL

MM

P

Co

-loca

liza

ção

celu

lar

de

OT

e

p65 Sim Sim Sim Sim

Lo

cali

zaçã

o d

a

dup

la m

arca

ção

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática

PaP

P

Co

-loca

liza

ção

celu

lar

de

OT

e

p65 Sim Sim Sim Sim

Lo

cali

zaçã

o d

a

dup

la m

arca

ção

Citoplasmática

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)*

SO

N

Co

-loca

liza

ção

celu

lar

de

OT

e

p65 Sim Sim Sim Sim

Lo

cali

zaçã

o d

a

dup

la m

arca

ção

Citoplasmática

Nuclear (pouco

intensa)

Citoplasmática Citoplasmática Citoplasmática

43

6. DISCUSSÃO

A via de sinalização do NF-κB, objeto de estudo do presente trabalho, está envolvida

na homeostase de várias funções teciduais, bem como na fisiopatologia de uma vasta gama de

quadros clínicos. Mais precisamente, tendo em vista seu envolvimento direto na resposta

imunológica e, estando essa associada à uma modulação positiva sobre a liberação de

neuropeptídeos (OT e AVP), essenciais para a manutenção da homeostase hidroeletrolítica, a

via de sinalização do NF-κB destaca-se como uma etapa importante na interface da resposta

imunológica e endócrina. Sob essa perspectiva, este trabalho, pela primeira vez, demonstrou,

por meio de análise qualitativa e através da utilização da técnica de imunofluorescência, a

presença da subunidade ativa, p65, da via de sinalização do NF-κB, em fenótipos neuronais

ocitocinérgicos. Foram observados neurônios imunorreativos para OT/p65 no núcleo

paraventricular e supra-óptico do hipotálamo, tanto em condições basais, quanto sob estímulo

osmótico crônico, associados ou não ao tratamento farmacológico com dexametasona.

Fez parte do escopo do presente trabalho o estudo do comportamento ingestivo dos

animais submetidos à condição de desidratação crônica. A diminuição na massa corpórea de

animais submetidos à modelos de desidratação e tratamento com glicocorticoide é um achado

comumente evidenciado na literatura (GODINO et al., 2013; GOTTLIEB et al., 2006;

THUNHORST; BELTZ; JOHNSON, 2007; YUE et al., 2008). No entanto, esse déficit não

foi verificado neste estudo, tanto em resposta à sobrecarga salina quanto ao tratamento com

dexametasona, associados entre si, ou não (Fig. 5). Essas evidências podem ser melhor

entendidas quando se observa que os animais submetidos à sobrecarga salina ingeriram um

volume significativamente maior de fluido e, em contrapartida (baseando-se em observações

experimentais), excretaram um volume urinário visivelmente maior e mais concentrado, em

comparação ao grupo controle, culminando para um balanço hídrico provavelmente pouco

alterado. Essa linha de raciocínio encontra respaldo no perfil de análise utilizado por

Thunhorst, Beltz e Johnson (2007).

44

Conjectura-se, também, que o fato da inobservância de modificações no perfil de

massa corpórea dos animais submetidos ao tratamento com sobrecarga salina possa estar

associado à janela temporal do presente estudo, constituída de quatro dias. Talvez essa não

seja suficiente para a detecção da modificação já mencionada. Sugere-se, então, a

investigação em uma janela temporal maior.

A conhecida ação da dexametasona na função renal, aumentando oferta de água e

eletrólitos ao néfron por meio da diminuição da resistência pré-glomerular e eferente

(BAYLIS; HANDA; SORKIN, 1990), justificaria um balanço hídrico negativo, uma vez que

os animais dos grupos Controle + Dexa e SL4 + Dexa apresentaram perfis de ingestão

semelhantes. Porém, isso não refletiu na mensuração da massa corpórea dos animais tratados

com dexametasona.

Como supracitado, no presente estudo, os animais com acesso ad libitum à solução

salina, NaCl (0,3 M), ingeriram um volume maior de fluido quando comparados ao controle,

do segundo ao quarto dia experimental (Fig. 6). Estes achados estão em consonância com a

literatura (SUMMY-LONG et al., 2006), além de, também, corroborar a perspectiva de que a

sobrecarga salina é um modelo alternativo de desidratação, utilizado como potente estímulo

para ativação do sistema hipotálamo-neuro-hipofisário (JONES; PICKERING, 1969;

VENTURA et al., 2002, 2005).

As alterações do status natrêmico, da osmolidade e volemia, consequências da

desidratação celular, são percebidas e integradas centralmente. Os osmorreceptores centrais

localizados no OVLT, SFO e MnPO estão interconectados, direta ou indiretamente, a

grupamentos neuronais hipotalâmicos localizados no SON e PVN. Conectam-se ainda a

estruturas ao nível do tronco encefálico, como o NTS, PBLN, DRN e AP, para mediar tanto

as respostas comportamentais aos sinais de sede e apetite ao sódio, autonômicas e endócrinas,

tais como a modulação do sistema renina-angiotensina-aldosterona, ativação da secreção de

OT, AVP e do ANP (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004, 2013b).

É sabido que o estímulo hiperosmótico leva à diminuição dos estoques neuro-

hipofisários de ocitocina e vasopressina, com consequente aumento das concentrações

plasmáticas dos referidos hormônios (JONES; PICKERING, 1969; YUE et al., 2008). No

45

entanto, a circuitaria neural prosencefálica que estimula a sede como consequência da

ativação dos osmorreceptores não está totalmente elucidada (VERBALIS, 2007). Egan et al

(2003) induziram sede em humanos conscientes, por meio da infusão de salina hipertônica, e,

utilizando ferramentas da neuroimagem, verificaram que a sensação de sede esteve associada

à grande ativação de regiões como a parede anterior do terceiro ventrículo, córtex cingulado

anterior, giro parahipocampal, giro frontal médio e inferior, ínsula e cerebelo (EGAN et al.,

2003). Assim, justifica-se a busca por água como mecanismo de defesa do organismo, no

intuito de restaurar o balanço hídrico corporal (GODINO et al., 2013).

Apesar de não haver evidência direta, a permanência da ingestão de fluido em animais

submetidos à ingestão de solução salina hipertônica, NaCl (0,3 M), aversiva para a percepção

gustatória de ratos, pode estar associada a alguma mudança na palatabilidade, ou seja, na

percepção sensorial do gosto do sal. Sabe-se da presença de canais de sódio do tipo epitelial

na porção anterior da língua que, por sua vez, traduzem o sinal da presença de sódio

conduzindo esta informação ao SNC, passando pelo NTS e daí para o PBLN (MORRIS; NA;

JOHNSON, 2008). Assim, uma diminuição na responsividade ao sódio, pelo nervo corda do

tímpano, pode estar implicando diretamente na detecção, aceitabilidade e ingestão de sal. NA,

MORRIS e JOHNSON (2012) verificaram que o tratamento com agonista opioide, morfina,

promoveu um aumento na ingestão de salina hipertônica em ratos com depleção de sódio.

Além disso, também evidenciaram que o mesmo tratamento diminuiu a resposta negativa à

ingestão de salina (0,3 M), no teste de reatividade gustativa, tanto em animais depletados

quanto com estado normonatrêmico, sugerindo que opioides endógenos possam modular

centralmente o comportamento de ingestão de sódio e palatabilidade.

Vale salientar, também, que o paradigma do presente estudo se encontra em duas

entradas sensoriais, que são integradas centralmente: i) um sinal natrêmico inibitório e ii)

sinal hipovolêmico excitatório sobre a ingestão de fluido, que nesse caso, parece estar sendo

preponderante como determinante da resposta de ingestão.

No presente trabalho, a SL4 foi capaz de elevar a ingestão de fluidos e a dexametasona

reverteu esse perfil (Fig. 6, paineis B e D). Este achado contradiz os dados de Thunhorst et al.

(2007) que verificaram que a dexametasona eleva a excreção de água e eletrólitos, mais

especificamente a natriurese e a caliurese, em animais normo-hidratados com acesso

46

exclusivo à água durante 24 horas, promovendo um balanço hídrico negativo, ainda que

diante do aumento da ingestão de água. Porém, deve-se considerar que, antes da

administração da dexametasona, os animais utilizados no presente estudo estão cronicamente

desidratados, diferentemente da condição de normo-hidratação utilizada por Thunhorst et al.

(2007). Isso poderia justificar, ao menos em parte, as diferenças observadas nos dois

trabalhos.

Relacionando essa evidência ao já conhecido aumento na concentração plasmática de

angiotensina II em resposta a um status hipovolêmico, desencadeando mecanismos

compensatórios de sede e apetite por sódio (FITZSIMONS, 1998; THORNTON, 2010),

esperava-se um efeito sinérgico, resultando em um aumento no volume de fluido ingerido.

Entretanto, a dexametasona, no presente estudo, parece desempenhar um papel modulatório

diferenciado nos mecanismos compensatórios fisiológicos associados à condição

hiperosmolar.

Ainda com relação à analise comportamental, pode-se destacar que a ingestão de ração

permaneceu inalterada em animais com acesso ad libitum à solução salina, NaCl (0,3 M) e

que a ingestão dos animais controle diferiu significativamente do grupo submetido à

sobrecarga salina ao primeiro e segundo dia experimental (Fig. 7A). Com base nesses

achados, conjectura-se que a maior ingestão de ração no grupo controle, nesses dias

experimentais, possa estar associado ao estímulo de novidade que, nesse caso, prolongou-se

além dos três dias de habituação. Além disso, esperava-se que, sendo a ração uma fonte de

componente osmótico (sal), houvesse uma menor ingestão no grupo submetido à sobrecarga

salina (MORRIS; NA; JOHNSON, 2008), mas o grupo sustenta um perfil de ingestão

uniforme ao longo dos dias experimentais. Ademais, apesar do reconhecido efeito

anorexigênico da dexametasona, em nosso protocolo nenhuma diferença foi observada (LIU

et al., 2011; THUNHORST; BELTZ; JOHNSON, 2007).

O aumento na concentração plasmática de ANG II no grupo de animais submetidos à

ingestão de solução salina hipertônica, NaCl (0,3 M), observado no presente estudo, é

consequência do já conhecido efeito da desidratação (Fig. 8). Verifica-se na literatura que um

dos estímulos para a secreção de renina pelas células do aparato justaglomerular renal, com

consequente formação de ANG II, é a redução da pressão de perfusão arterial característica do

47

estado hipovolêmico (FITZSIMONS, 1998). Além disso, apesar de não verificarmos efeito

significativo isolado do tratamento com dexametasona, destaca-se que, na presença do

mesmo, os animais controle tratados com dexametasona apresentaram maior concentração

plasmática de ANG II em comparação ao grupo controle tratado com veículo e, curiosamente,

o grupo SL4 permaneceu com concentração média praticamente inalterada (Fig. 8).

O aumento na concentração plasmática de angiotensina II, no grupo controle tratado

com dexametasona, pode ser consequência do efeito desse fármaco na atividade nervosa

simpática renal, que deve estar aumentada nesse caso, e constitui um drive positivo para a

secreção de renina (FITZSIMONS, 1998). É reconhecido que os glicocorticoides exercem

efeito excitatório sobre grupamentos neuronais pré-simpáticos bulbares (região

rostroventrolateral) e que a atividade simpática renal está aumenta em animais submetidos à

injeção intracerebroventricular de cortisol (RONG et al., 1999; TAKAHASHI et al., 1983;

WANG et al., 2002).

Assim, a presença desse drive simpático associado à evidências da literatura que

demonstram regulação transcricional positiva dos glicocorticoides sobre os níveis de RNAm

do angiotensinogênio e expressão de receptores angiotensinérgicos AT1 e AT2, justifica a

permanência do perfil aumentado e pouco alterado da concentração plasmática de ANG II nos

animais SL4 tratados com dexametasona (DODIC et al., 2002; DOSTAL; BOOZ; BAKER,

2000; MORITZ et al., 2002; SHELAT; FLANAGAN-CATO; FLUHARTY, 1999; ZHANG

et al., 2002).

No que tange à análise qualitativa da imunorreatividade da subunidade p65/RelA do

NF-κB em neurônios ocitocinérgicos do PVN e do SON, nossas observações sugerem uma

marcação predominantemente citoplasmática da ocitocina, em todas as divisões celulares do

PVN e SON (Fig. 9 - 12). Estas observações corroboram a literatura, uma vez que,

sabidamente, a ocitocina é sintetizada no núcleo sob a forma de um pré-pró-hormônio e

armazenado em vesículas no complexo de Golgi. Nessas vesículas, ocorrem modificações

pós-transcricionais que culminam com a formação do peptídeo biologicamente ativo,

localizado no citoplasma das células neuronais e ao longo do axônio (BURBACH et al.,

2001).

48

Observou-se, também, que nos grupos experimentais submetidos à SL4 e SL4 + Dexa

a marcação de ocitocina se mostra menos intensa, em relação à marcação dos grupos Controle

e Controle + Dexa, independente da região do PVN e SON (Fig. 9 - 12, paineis C-D e A-B,

respectivamente). Esses achados corroboram os de Yue et al. (2008), que verificaram redução

significativa no conteúdo neuro-hipofisário de ocitocina associado ao aumento significativo

na concentração plasmática desse neuropeptídeo nos animais submetidos à sobrecarga salina

durante cinco dias. Os autores verificaram diferenças no perfil de decaimento do conteúdo

neuro-hipófisário, ao longo dos dias, e na concentração plasmática, a partir do segundo dia

experimental, associado ao retardo observado na cinética de aumento dos níveis de RNAhn da

ocitocina no SON, em comparação ao RNAhn da vasopressina. Esses achados levaram os

autores a concluírem que os neurônios magnocelulares do SON respondem com diferentes

mudanças de taxa transcricional, para a AVP e OT, ao estímulo osmótico crônico, sugerindo a

possibilidade de envolvimento de diferentes mecanismos de transdução de sinal nos diferentes

fenótipos neuronais magnocelulares.

Porém, nossa análise qualitativa nos permite inferir a ausência de qualquer efeito do

tratamento com Dexa no perfil de marcação da ocitocina nos núcleos estudados (Fig. 9 - 12,

paineis A-B e C-D).

A modulação negativa sobre a ativação neuronal parvocelular e magnocelular do

hipotálamo exercida pelos glicocorticoides é uma evidência clássica encontrada na literatura

(DE KLOET; KARST; JOËLS, 2008; DURLO et al., 2004; LAUAND et al., 2007;

RUGINSK et al., 2007, 2009; SAWCHENKO, 1987). Essa inibição neuronal é resultado de

efeitos rápidos, não-genômicos, dos glicocorticoides suprimindo as entradas sinápticas

excitatórias glutamatérgicas e/ou facilitando as inibitórias (GABAérgicas). Foi verificado que

os glicocorticoides ativam receptores de membrana acoplados à proteína G, resultando na

inibição de correntes glutamatérgicas por meio de endocanabinoides (via receptor CB1), que

agem, nesse caso, como mensageiros retrógrados (DI et al., 2003, 2005; EVANSON et al.,

2010; TASKER; DI; MALCHER-LOPES, 2006; TASKER; HERMAN, 2011). Ademais,

recente estudo demonstrou a presença de co-localização de receptores de glicocorticoide em

neurônios GABAérgicos, nas proximidades de neurônios parvocelulares, fornecendo, assim,

evidências de um possível efeito direto do glicocorticoide sobre neurônios GABAérgicos e

49

modulação diferencial desses sobre a subdivisão parvocelular do hipotálamo (DE SOUZA;

FRANCI, 2013).

Em suma, se a secreção hormonal se dá em resposta à ativação neuronal, e se os

glicocorticoides possuem efeito inibitório sobre essa ativação, esperava-se por um perfil de

marcação de ocitocina menor. No entanto, uma modificação na imunorreatividade desses

grupos não foi passível de observação. Fato esse, que pode ser atribuído à limitações inerentes

ao padrão de análise predominantemente qualitativo, sem a utilização de ferramentas que

quantifiquem intensidades de fluorescência, o que permitiria um estudo mais acurado e

possibilitaria a detecção de nuances de marcação que passariam despercebidas à visão

humana. Sob outra perspectiva, o presente estudo sugere, tal como (DE SOUZA; FRANCI,

2010), que uma possível dessensibilização desses neurônios possa ter acontecido por ação de

glicocorticoide endógeno, nos grupos experimentais do presente estudo.

Nosso trabalho demonstrou a presença de marcação da subunidade p65 do NF-κB no

PVN e SON de todos os grupos experimentais estudados. Com destaque, a presença de

neurônios duplamente marcados para OT/p65 evoca possíveis inferências à respeito do papel

biológico do NF-κB em fenótipos neuronais ocitocinérgicos. A literatura não fornece

evidências diretas à respeito da ação do fator de transcrição nuclear –κB na modulação da

expressão gênica de ocitocina e/ou vasopressina. Apenas foi evidenciado três sítios de ligação

para o NF-κB na região promotora do gene do receptor de ocitocina em células miometriais

(KHANJANI et al., 2011; TERZIDOU et al., 2006). Esses autores verificaram que a deleção

dos sítios do NF-κB inibiu a ativação do promotor da expressão gênica do receptor de

ocitocina. Sendo assim, conjecturas à respeito do nível de participação do NF-κB na

modulação das ações da ocitocina se fazem pertinentes, ampliando, quem sabe, perspectivas

de influência direta desse fator de transcrição nas ações centrais ocitocinérgicas, quiçá na

população neuronal do PVN e SON envolvida na homeostase hidroeletrolítica.

Sabe-se que o NF-κB está presente no citoplasma da maioria das células, na forma

inativa, ligado a proteínas inibitórias da família IκB (IκBα, IκBβ), que impedem a

translocação nuclear. Frente a um estímulo apropriado, essas proteínas inibitórias são

fosforiladas por membros da família de IκB com atividade quinase (IKK) e,

consequentemente, o NF-κB se desliga do seu inibidor e transloca para o núcleo celular, onde

50

se liga a regiões promotoras de genes e promove a expressão induzível de proteínas (GHOSH;

MAY; KOPP, 1998). Dados atuais contabilizam cerca de 222 genes passíveis de modulação

transcricional pelo NF-κB (SHAPSHAK, 2012), o que enfatiza a importância do estudo de

uma via com tamanha capacidade modulatória.

A análise realizada em nosso trabalho nos leva a sugerir uma marcação

predominantemente citoplasmática da subunidade p65 do NF-κB. Sendo assim, poderíamos

inferir que a via de sinalização do NF-κB provavelmente não foi ativada em nosso modelo

experimental de sobrecarga salina, independente da região celular analisada e do tratamento

(Figs.de 9 a 12, paineis de E a H). No entanto, Mut et al. (2010) verificaram, em linhagem de

células de gliobastoma, que a fosforilação do NF-κB e translocação para o núcleo é

dependente do tempo, e relataram ainda que a fosforilação ocorreu dentro de 15 minutos após

o estímulo e se sustentou por 240 minutos, com translocação nuclear progressivamente

aumentada dentro desse período de tempo (MUT; AMOS; HUSSAINI, 2010). Essa evidência

pode justificar a localização citoplasmática da subunidade p65 do NF-κB, tendo em vista o

caráter crônico do experimento, e não descartar a hipótese de que uma possível ativação da

via do NF-κB tenha ocorrido, no modelo de sobrecarga salina durante 4 dias.

Com relação ao padrão de marcação predominantemente citoplasmática da subunidade

p65 do NF-κB, nos grupos tratados com dexametasona (Controle + Dexa e SL4 + Dexa, do

PVN e SON), esperávamos tal resultado, uma vez que, ao interagir com o receptor de

glicocorticoide ativo, o NF-κB perde a sua capacidade de ativar a transcrição gênica, pelo

bloqueio da translocação nuclear ou devido à perda de capacidade de se ligar ao DNA

(SCHEINMAN et al., 1995; UNLAP; JOPE, 1995; WIDÉN; GUSTAFSSON; WIKSTRM,

2003). O complexo glicocorticoide + receptor de glicocorticoide pode interagir com o NF-κB

tanto no núcleo quanto no citoplasma, como observado em linhagem de células hepáticas

(WIDÉN; GUSTAFSSON; WIKSTRM, 2003).

Além disso, muitas células expressando p65 não estavam duplamente marcadas com a

ocitocina e que nem todos os neurônios ocitocinérgicos apresentaram marcação para p65. No

entanto, esses achados não apresentaram um padrão de aparecimento, tanto em relação ao

tratamento com sobrecarga salina de quatro dias ou administração da dexametasona, ao menos

nas fotomicrografias analisadas.

51

De alguma forma, os fenótipos bioquímicos de neurônios ocitocinérgicos podem estar

sendo dinâmica e diferencialmente regulados em resposta às demandas ambientais. Além

disso, os achados supracitados indicam que o NF-κB está co-expresso em outros fenótipos

neuronais do PVN e SON, desempenhando funções diversas.

Por exemplo, recente estudo abriu novas perspectivas para o entendimento do papel do

hipotálamo no envelhecimento sistêmico associado à redução no RNAm Gnrh1. Os autores

verificaram, em uma linhagem de neurônios GnRH, que esse fator é regulado negativamente

pelo NF-κB e IKKβ (ZHANG et al., 2013). Kang et al. (2011) demonstraram que ratos com

insuficiência cardíaca apresentaram maior atividade do NF-κB no hipotálamo, importante

centro regulador da ativação simpática. O tratamento com inibidores específicos do NF-κB

reduziu a expressão de citocinas pró-inflamatórias, ANG II e noradrenalina (KANG et al.,

2011). Cardinale et al (2012) corroboram esse estudo ao demonstrarem que o bloqueio do NF-

κB no PVN reduz as ações das citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio

(ROS) no PVN, além de modular negativamente a expressão do receptor de angiotensina II

tipo 1 (AT1R) e a enzima conversora de angiotensina (ECA), culminando na modulação do

sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAS) e, consequentemente, atenuando a hipertensão

(CARDINALE et al., 2012).

Tais achados da literatura reforçam a importância de levantar conhecimento a respeito

da via clássica de ativação do NF-κB, uma via de sinalização muito importante envolvida em

mecanismos de manutenção da homeostase do organismo.

52

7. CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos no presente estudo podemos concluir que :

1. A janela temporal de quatro dias utilizada no presente estudo não foi suficiente para

detectar uma diminuição na massa corpórea dos animais submetidos à ingestão de

salina hipertônica, tratados com dexametasona ou veículo;

2. O protocolo de indução hiperosmótica foi efetivo promoveu um perfil de ingestão de

fluido aumentado, salina (0,3 M), do segundo ao quarto dia experimental, que foi

revertido pelo tratamento com a dexametasona no quarto dia experimental;

3. Houve um aumento na concentração plasmática de ANG II nos animais submetidos à

sobrecarga salina, sendo que o tratamento com dexametasona propiciou elevação na

concentração hormonal dos animais controle e perfil inalterado nos animais SL4;

4. O presente estudo verificou a presença da subunidade p65 do NF-κB em neurônios

ocitocinérgicos das principais áreas hipotalâmicas que integram os eixos do estresse

(HHA) e do equilíbrio hidroeletrolítico (SHNH).

53

8. PERSPECTIVAS

Mais estudos são necessários a fim de esclarecer as bases moleculares da dinâmica de

recrutamento da via intracelular do NF-κB tanto nos fenótipos neuronais ocitocinérgicos

objetos do nosso estudo quanto vasopressinérgicos, evocada pela desidratação intracelular,

nos ajustes hidroeletrolíticos, endócrinos e comportamentais. Assim, para quantificar a

imunorreatividade do NF-κB nos diferentes grupamentos neuronais e, assim, complementar

tais achados, sugere-se a realização da dupla marcação imunofluorescente com um número

significativo de animais por grupo. Isso possibilitará que a ferramentas de análise quantitativa

das marcações, bem como métodos de análise da intensidade de fluorescência, sejam

utilizadas para obtenção de dados mais concisos. Estudos in vitro que mimetizem as

condições in vivo desse modelo experimental seria uma estratégia para estudar, por exemplo,

o decurso temporal de ativação do NF-κB no modelo proposto. Aliado à quantificação de

proteínas (p65 total, p65 fosforilado, receptor do glicocorticoide) por western blot, tanto no

compartimento nuclear quanto citoplasmático, estudos de co-imunoprecipitação do receptor

de glicocorticoide associado ao NF-κB, também forneceriam dados importantes.

54

9. REFERÊNCIAS

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ANEXO A – DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA

JUNTO AO CEPA/UFS