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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE ROSANA SILVA AMARANTE ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA OROFACIAL E ANTI- INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Stachys lavandulifolia Vahl. (Laminaceae) E DE (-)-α-BISABOLOL, SEU COMPONENTE MAJORITÁRIO, EM ROEDORES LAGARTO-SE 2017

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

APLICADAS À SAÚDE

ROSANA SILVA AMARANTE

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA OROFACIAL E ANTI-

INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Stachys

lavandulifolia Vahl. (Laminaceae) E DE (-)-α-BISABOLOL, SEU

COMPONENTE MAJORITÁRIO, EM ROEDORES

LAGARTO-SE

2017

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ROSANA SILVA AMARANTE

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA OROFACIAL E ANTI-

INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Stachys

lavandulifolia Vahl. (Laminaceae) E DE (-)-α-BISABOLOL, SEU

COMPONENTE MAJORITÁRIO, EM ROEDORES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde da

Universidade Federal de Sergipe como requisito

parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências

Aplicadas à Saúde.

Orientadora: Profª. Dra. Rosana de Souza Siqueira Barreto.

LAGARTO-SE

2017

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ROSANA SILVA AMARANTE

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA OROFACIAL E ANTI-

INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Stachys

lavandulifolia Vahl. (Laminaceae) E DE (-)-α-BISABOLOL, SEU

COMPONENTE MAJORITÁRIO, EM ROEDORES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde da

Universidade Federal de Sergipe como requisito

parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências

Aplicadas à Saúde.

Aprovada em: 14/07/2017

____________________________________________________

Presidente: Profª. Dra. Paula Santos Nunes

____________________________________________________

1º Examinador: Profª. Dra Adriana Gibara Guimarães

____________________________________________________

2º Examinador: Profª. Dra Jullyana de Souza Siqueira Quintans

PARECER

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AGRADECIMENTOS

Como dizer “obrigada” quando há tanto o que agradecer? Será que essa palavra será

suficiente, diante de tudo ocorreu nesses dois anos? Penso em todos aqueles que me

ajudaram, E então, agradeço... (mesmo sabendo que palavras não serão suficientes para

expressar minha gratidão).

A Deus, a quem sempre entrego todos os projetos, angústias e anseios. Gratidão pela força

para percorrer mais esta caminhada, ânimo para vencer os obstáculos e esperança para

continuar buscando meus sonhos.

Ao meu príncipe, Luís Otávio, a pessoa mais doce que conheço no mundo. Obrigada por me

inspirar e ajudar a ser uma pessoa melhor a cada dia. O seu sorriso e seu abraço me

renovam. Te amo daqui até Plutão.

A meu pai, não importa o tempo e nem as circunstâncias quando se ama para sempre. Só os

seres que amam sentem saudades. Obrigada por todos os seus ensisamentos.

A minha Mãe, a mulher que me ensinou a viver a vida com dignidade, se doou por inteiro,

que muitas vezes renunciou seus sonhos para que eu e meus irmãos vivêssemos os nossos. Te

amo, mãezoca.

Aos meus irmãos Márcio, Rosemary, Rosilene e Rosineide, obrigada pela cumplicidade,

amizade, conselhos, amor, mas principalmente por serem minha fortaleza quando eu

esmoreci. Meu amor por vocês é incondicional. Esse amor se estende aos seus companheiros

e filhos.

As minhas tias Antônia, Maria do Carmo e minha prima Suzana por serem meus exemplos de

fé e de amor. E por acalentarem meu coração muitas vezes angustiado e principalmente pelas

orações.

A minha orientadora Prof. Dra. Rosana de Souza Siqueira Barreto por esta oportunidade,

por agregar conhecimento a minha vida profissional, pela paciência e compreensão durante

os momentos em que mais precisei. Enfim, pelo somatório fundamental não só para a

construção do pensamento que se explana por todas as páginas seguintes hoje entregue, bem

como pela maturidade de toda uma vida que terei. Antes de mais nada, nesta ocasião se

dedica a mestre com carinho.

A família LANEF por me acolherem sempre tão bem, pelo convívio durante esses anos, em

especial aos professores Dr. Lucindo Quintans, Dra. Jullyanna Quintans, Dra. Adriana

Gibara sempre dispostos a me ajudar no que fosse necessários. Aos amigos dessa família

Daniele, Edla, Marlange, Priscila, Renan, Heitor, Silvia, Laíza, Lícia. Todos vocês foram

fundamentais nesse processo, as reuniões científicas agregaram em mim um senso crítico

fundamental. Às minhas queridas alunas de iniciação científica: minha amada prima Ruthy,

Thainá, Alexandra, Juliana, Mayara obrigada por me ajudarem no desenvolvimento de todas

as pesquisas.

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Aos professores e alunos do LAFAC, em especial, ao professor André Barreto, por tantas

contribuições em meus seminários, aulas do PPGCAS, por contribuir para meu crescimento

profissional.

Aos professores do programa PPGCAS os quais eu tive a honra de poder compartilhar de

seus conhecimentos, seja durante as disciplinas que cursadas, os seminários e palestras que

assistidas ou mesmo nas conversas pelos corredores da UFS.

Ao prof. Ricardo Luiz Albuquerque Júnior por ter me recebido tão bem no LBME/ITP/UNIT,

por todas as explicações sempre oportunas. A Rose Nely por sua paciência e presteza junto

ao LBME.

As professoras da banca examinadora Dra. Paula Santos Nunes, Dra Luana Heimfarth e

Dra. Thalita Kelly Ribeiro que fizeram todas as sugestões e contribuições para o

aperfeiçoamento desse trabalho.

A Universidade Federal de Sergipe pela oportunidade e suporte necessário para o

desenvolvimento deste mestrado.

A CAPES pelo auxílio financeiro durante o período de estudo.

Enfim, a todos aqueles que de alguma maneira contribuiu para a realização desta etapa:

OBRIGADA.

Rosana Silva Amarante

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RESUMO

Atividade antinociceptiva, orofacial e anti-inflamatória do óleo essencial de Stachys

Lavandulifolia Vahl. (Laminaceae) e de (-)-α-Bisabolol, seu componente majoritário, em

roedores. Rosana Silva Amarante. Lagarto, Sergipe, 2016.

Stachys lavandulifolia Vahl (Lamiaceae) é uma planta medicinal amplamente utilizada na

Turquia e na medicina popular iraniana devido às suas propriedades analgésicas e anti-

inflamatórias. Diante disso, objetivou-se avaliar os efeitos antinociceptivos e anti-

inflamatórios do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-bisabolol (BIS), seu

principal composto, em camundongos. A análise cromatográfica do EOSl demonstrou a

presença de (-)-α-bisabolol (56,4%), biciclogermacreno (5,3%), δ-cadineno (4,2%) e

espatulenol (2,9%) como compostos principais. Camundongos Swiss machos foram pré-

tratados com EOSl (25 ou 50 mg/kg, v.o.), BIS (25 ou 50 mg/kg, v.o.), morfina (3 mg/kg, i.p.)

ou veículo (solução salina 0,9% com tween 80 a 0,2%). Formalina (20μl, 2%), capsaicina

(20μl, 2,5μg) ou glutamato (20μl, 25Mm) foram injetados no lábio superior direito dos

camundongos. O perfil anti-inflamatório de EOSl ou BIS (50mg/kg) foi avaliado pela

resposta inflamatória induzida por carragenina (2% em 0,2 mL) (modelo de pleurisia)

(CEPA/UFS: 72/2015). Os dados foram expressos como média ± E.P.M. e a diferença entre

os grupos foi analisada por ANOVA, uma via, com pós-teste de Tukey (p<0,05 foi

considerado significativo). O tratamento com EOSl e BIS mostrou efeitos inibitórios

significativos (p<0,05 ou p<0,01 ou p<0,001) em diferentes testes de nocicepção orofacial,

porém o BIS demonstrou-se eficaz, reduzindo significativamente o comportamento

nociceptivo em todos os testes, incluindo ambas as fases do teste da formalina. O efeito

analgésico não está relacionado com qualquer desequilibrio, uma vez que os camundongos

tratados com EOSl ou BIS não apresentaram alteração de desempenho na força de preensão.

Além disso, EOS1 e BIS apresentaram efeito anti-inflamatório significativo (p<0,001) no

modelo de pleurisia, o que parece estar relacionado a uma redução significativa (p<0,05) da

citocina pró-inflamatória TNF-α no tratamento com BIS, e da IL-1β (p<0,01) no tratamento

com EOS1. Nossos resultados corroboram com o uso de S. lavandulifolia na medicina

tradicional como analgésico, sobretudo na dor orofacial, e anti-inflamatório, o que parece

estar relacionado ao (-)-α-bisabolol, principal composto do EOSl.

Descritores: Dor orofacial; Inflamação; Plantas Medicinais; Terpenos; Óleos essenciais.

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ABSTRACT

Antinociceptive, anti-inflammatory activity of the essential oil of Stachys Lavandulifolia

Vahl. (Laminaceae) and in (-)-α-Bisabolol, it’s majority component, in rodents. Rosana

Silva Amarante. Lagarto, Sergipe, 2016.

Stachys lavandulifolia Vahl (Lamiaceae) is a medicinal plant widely used in Turkey and in

Iranian folk medicine because of its analgesic and anti-inflammatory properties. The objective

of this study was to evaluate the antinociceptive and anti-inflammatory effects of the essential

oil of S. lavandulifolia (EOSl) and (-)-α-bisabolol (BIS), its main compound, in mice.

Chromatographic analysis of EOSl showed the presence of (-)-α-bisabolol (56.4%),

bicyclogermacrene (5.3%), δ-cadinene (4.2%) and spatulenol (2.9%) as main compounds.

Male Swiss mice were pretreated with EOSl (25 or 50 mg/kg, po), BIS (25 or 50 mg/kg, po),

morphine (3 mg/kg, ip) or vehicle (saline solution 0.9% with two drops of tween 80).

Formalin (20 μl, 2%), capsaicin (20 μl, 2.5 μg) or glutamate (20 μl, 25 μm) were injected into

the right upper lip of the mice. The anti-inflammatory profile of EOSl or BIS (50mg/kg) was

evaluated by the carrageenan-induced inflammatory response (2% in 0.2mL) (pleurisy model)

(CEPA/UFS # 72/2015). Data were expressed as mean ± S.E.M. and the difference between

groups was analyzed by ANOVA (one-way) with Tukey post-test (p<0.05 was considered

significant). Treatment with EOS1 and BIS showed significant inhibitory effects (p<0.05 or

p<0.01 or p<0.001) in different orofacial nociception tests, but BIS was effective,

significantly reducing nociceptive behavior in all the tests including both phases of the

formalin test. The analgesic effect is not related to any anomaly, since the mice treated with

EOSl or BIS did not present change in performance in the grip strength. In addition, EOS1

and BIS presented a significant anti-inflammatory effect (p<0.001) in the pleurisy model,

which seems to be related to a significant (p <0.05) reduction of the pro-inflammatory

cytokine TNF-α in BIS treatment, and IL-1β (p<0.01) on treatment with EOS1. Our results

corroborate the use of S. lavandulifolia in traditional medicine as an analgesic, especially in

orofacial pain, and anti-inflammatory, which seems to be related to (-)-α-bisabolol, the main

compound of EOS1.

Key-words: Orofacial Pain; Inflammation; Plants, Medicinal; Terpenes;

essencial oils.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Inervação cutânea dos três ramos do nervo trigêmeo.................................... 15

Figura 2. Via trigeminal.................................................................................................. 16

Figura 3. Local de administração de algógenos, por via subcutânea, nos testes de

nocicepção orofacial induzida por formalina, capsaicina e glutamato, em roedores....... 19

Figura 4. Staphys lavandulifolia..................................................................................... 20

Figura 5. Estrutura molecular do (-)-α-bisabolol............................................................ 22

Figura 6. Resumo esquemático do teste da Formalina .................................................. 28

Figura 7. Resumo esquemático do teste da Capsaicina ................................................. 29

Figura 8. Resumo esquemático do teste do Glutamato .................................................. 30

Figura 9. Cromatografia iônica total do EOSl (a) e o espectro de massa para o α-

Bisabolol ......................................................................................................................... 35

Figura 10. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-Bisabolol

(BIS) no comportamento nociceptivo induzido por formalina....................................... 37

Figura 11. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-Bisabolol

(BIS) no comportamento nociceptivo induzido por capsaicina...................................... 39

Figura 12. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-Bisabolol

(BIS) no comportamento nociceptivo induzido por glutamato....................................... 41

Figura 13. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS)

sobre a força muscular..................................................................................................... 42

Figura 14. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS)

sobre a pleurisia induzida por carragenina....................................................................... 43

Figura 15. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS)

sobre os níveis de TNF-α................................................................................................. 43

Figura 16. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS)

sobre os níveis de IL-1β.................................................................................................. 45

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AP-1 - Proteína ativadora 1;

BIS - (-)-α-Bisabolol;

ACF - Adjuvante Completo de Freund

CEPA/UFS - Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Federal de

Sergipe;

CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal;

SNC – Sistema Nervoso Central

COX - Ciclo-oxigenase;

COX-2 - Ciclo-oxigenase 2;

EOSl - Óleo essencial de Stachys lavandulifolia/ Essential oil from Stachys lavandulifolia;

E.P.M. - Erro padrão da média;

ERK - Quinases reguladas por sinal extracelular;

GC-FID - Cromatografia de massa com detector de ionização de chama;

GC/MS - Cromatografia gasosa com espectrometria de massa;

GSH - Glutationa reduzida;

IASP - Associação Internacional para o Estudo da Dor;

IL-1β - Interleucina-1β

IL-6 - Interleucina-6;

iNOS - Óxido nítrico sintetase induzível;

LPS - Lipopolissacarídio;

MOR - Morfina;

NF-κB - Fator nuclear κB;

NK-1 - Neuroquinina 1;

PGE2 - Prostaglandina E2;

TBARS - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TNF-α - Fator de necrose tumoral α;

TPA - 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato;

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TRPA1 - Receptor de potencial transitório do tipo ankirina 1;

TRPV1 - Receptor de potencial transitório do tipo vaniloide 1;

5-HT - 5-Hidroxitriptamina.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 10

2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 13

2.1 FISIOPATOLOGIA DA DOR OROFACIAL ......................................................... 13

2.2 MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E A DOR OROFACIAL............................... 15

2.3 TRATAMENTO DA DOR OROFACIAL................................................................ 16

2.4 PRODUTOS NATURAIS COMO FONTE DE NOVOS FÁRMACOS.................. 17

3 OBJETIVOS ............................................................................................................... 24

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 24

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 24

4 CASUÍSTICA E MÉTODOS..................................................................................... 26

4.1 SUBSTÂNCIAS........................................................................................................ 26

4.2 MATERIAL VEGETAL........................................................................................... 26

4.3 OBTENÇÃO E ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL............................................... 26

4.4 ANIMAIS.................................................................................................................. 27

4.5 TESTE DE NOCICEPÇÃO OROFACIAL INDUZIDA POR FORMALINA......... 27

4.6 TESTE DE NOCICEPÇÃO OROFACIAL INDUZIDA POR CAPSAICINA........ 29

4.7 TESTE DE NOCICEPÇÃO OROFACIAL INDUZIDA POR GLUTAMATO....... 30

4.8 AVALIAÇÃO DA FORÇA MUSCULAR............................................................... 31

4.9 PLEURISIA INDUZIDA POR CARRAGENINA.................................................... 31

4.9.1 Determinação dos níveis de IL-1β e TNF-α no líquido pleural.............................. 32

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................................................... 32

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................ 34

6 CONCLUSÃO............................................................................................................. 47

7 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 49

REFERÊNCIAS............................................................................................................. 51

ANEXO - Artigo publicado no periódico Journal of Ethnopharmacology (Fator de

impacto - JCR 2015: 3,055)............................................................................................. 60

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INTRODUÇÃO

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10

1 INTRODUÇÃO

A dor orofacial é um sintoma relacionado a um grupo heterogêneo de transtornos, tais

como redução dos movimentos mandibulares, diminuição da função da articulação

temporomandibular, dor ou sensibilidade muscular à palpação, ou movimento da mandíbula,

cefaleia, dentre o dor facial. Estas condições são altamente prevalentes e debilitantes e que

causam dor contínua de cabeça, face e região do pescoço, além de representar um desafio para

os clínicos, uma vez que a região orofacial é complexa e, portanto, a dor tem origem

multifatorial (GANZBERG, 2010; ROMERO-REYES; UYANIK, 2014).

Uma grande variedade de classes de medicamentos é comumente utilizada como

analgésicos para a dor orofacial, incluindo anti-inflamatórios não esteroidais, relaxantes

musculares, opióides, antidepressivos, particularmente os antidepressivos tricíclicos, os

inibidores seletivos de reabsorção de serotonina-noradrenalina e fármacos antiepilépticos

(ARNOLD et al., 2004; COLLINS et al., 2000; MCQUAY et al., 1995, 1996). Contudo, os

efeitos secundários e a toxicidade são evidentes com a administração destes medicamentos a

longo prazo, podendo causar desde intoxicação a dependência química (BECKER, 2010;

DIONNE, 2001; GANZBERG, 2010).

Nos últimos anos, tem existido uma busca constante de medicamentos alternativos

com maior eficácia e segurança na redução da dor inflamatória e neuropática, a fim de

interromper a transição da dor aguda para a crônica, com poucos efeitos secundários ou

tóxicos (DENGLER et al., 2014; JI; XU; GAO, 2014). Neste sentido, os produtos naturais,

principalmente óleos essenciais e terpenos, têm se mostrado uma importante fonte de novos

fármacos com atividade biológica significativa (BRITO et al., 2013; GUIMARÃES et al.,

2012; LIMA et al., 2013; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010; SIQUEIRA-LIMA et al., 2014).

A Stachys lavandulifolia Vahl (Lamiaceae), um tipo de Stachys também conhecido

como “chá das montanha” (Chay-e-Kouhi), é utilizada na medicina popular para tratar a dor e

a inflamação, incluindo a dor de dente e outros problemas orofaciais, e ainda, ansiolítico e

grastroproteção (MOSADDEGH et al., 2012; MINAE et al., 2015). Estudos demonstraram

que S. lavandulifolia possui efeitos ansiolítico (RABBANI; SAJJADI; JALALI, 2005;

RABBANI; SAJJADI; ZAREI, 2003), antimicrobiano, antidepressivo, antibacteriano

(FOOLADVAND; FAZELI-NASAB, 2014), antioxidante (IŞCAN et al., 2012), analgésico e

anti-inflamatório (HAJHASHEMI; GHANNADI; SEDIGHIFAR, 2007).

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11

Em geral, os óleos essenciais de várias populações de S. lavandulifolia são ricos em

monoterpenoides e sesquiterpenoides (PIRBALOUTI; MOHAMMADI, 2013), tais como (-)-

α-bisabolol (BIS). S. lavandulifolia, como foi dito, já é utilizada na medicina popular,

contudo, pouco se sabe sobre o seu óleo essencial e os seus componentes que podem variar

com o ecótipo (variedade geograficamente distinta), as condições ambientais e a origem

geográfica (PIRBALOUTI; MOHAMMADI, 2013).

O BIS, um sesquiterpeno monocíclico alcoólico, foi o principal composto encontrado

no óleo essencial da S. lavandulifolia (EOSl), também estando presente na camomila

(Matricaria chamomilla), e tem sido identificado como o principal componente responsável

pela maioria das ações farmacológicas desses óleos essenciais (GUIMARÃES; QUINTANS;

QUINTANS-JÚNIOR, 2013; KAMATOU; VILJOEN, 2010). Este composto tem sido

amplamente utilizado como ingrediente em formulações dermatológicas e cosméticas, tais

como cremes pós-barba, loções para mãos e corpo, desodorantes, batons e produtos para o

cuidado do bebê (KAMATOU; VILJOEN, 2010). Adicionalmente, o BIS tem se apresentado

como um composto promissor para tratar a dor inflamatória, uma vez que parece ser eficaz na

diminuição de citocinas pró-inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e

interleucina-6 (IL-6) (MAURYA et al., 2014; ROCHA et al., 2011). Tendo em vista todas as

atividades descritas para o EOSl e o BIS, chegamos a hipotetizar que esses compostos

apresentam efeito antinociceptivo sobre a dor orofacial.

Assim, objetivou-se estudar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório do óleo

essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-bisabolol (BIS), seu principal composto, no

comportamento nociceptivo induzido por algógeno orofacial e em resposta a estímulos

inflamatórios (evocados por carragenina) em camundongos. Além disso, avaliou-se o possível

envolvimento da inibição de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β) no perfil

farmacológico do EOSl e do BIS. Os resultados obtidos podem ser valiosos para o

desenvolvimento de novos fármacos funcionais.

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REVISÃO DA LITERATURA

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13

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 FISIOPATOLOGIA DA DOR OROFACIAL

Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), a dor é uma

experiência sensorial e emocional desagradável associada a dano tecidual real ou potencial ou

descrita em termos de tal lesão (MERSKEY; BOGDUK, 1994). A dor orofacial é decorrente

principalmente de alterações em neurônios do Sistema Nervoso Central (SNC) que estão

vinculados a via trigeminal. Esta via é a responsável por inervar os tecidos orofaciais, e recebe

este nome, em virtude de seu principal nervo, o trigêmeo que, por meio de seus três ramos

principais (mandibular, maxilar e oftálmico), realiza a inervação sensitiva da face (Figura 1)

(NIXDORF et al., 2012; SESSLE, 2005).

Figura 1. Inervação cutânea dos três ramos do nervo trigêmeo.

Fonte: Adaptado de PAZHANIAPPAN, 2017.

O gânglio trigeminal contém os corpos celulares das fibras aferentes primárias que

transmitem os sinais nociceptivos da região orofacial para o SNC. Estas fibras, que podem ser

do tipo Aδ (mielinizadas, com diâmetro de 1 a 5 mm e velocidade de condução de 5 a 30 m/s)

ou do tipo C (não mielinizadas, com diâmetro de 0,2 a 1,5 mm e velocidade de condução de

0,5 a 2 m/s), projetam seus axônios para os tecidos periféricos e para o sistema nervoso

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central, através do tronco encefálico, onde realiza sinapses com os neurônios de segunda

ordem, especialmente no complexo nuclear trigeminal espinhal, que inclui o núcleo trigeminal

sensorial e o núcleo do trato espinhal, o qual divide-se nos subnúcleos oral, interpolar e caudal

(Figura 2) (NIXDORF et al., 2012; SESSLE, 2005; WILCOX et al., 2015).

Figura 2. Via trigeminal

Fonte: Adaptado de SESSLE, 2011.

Alterações na condução da via trigeminal podem resultar em dor orofacial, como a

disfunção temporomandibular, neuralgia do trigêmeo e a migrânea. Tais distúrbios

apresentam elevada taxa de prevalência e o seu tratamento ainda encontra-se ineficaz para boa

parte dos pacientes (LAM et al., 2005; ROMERO-REYES; UYANIK, 2014; SESSLE, 2005).

Em estudo realizado nos Estados Unidos estimou-se que cerca de 22% da população acima de

18 anos já havia apresentado algum quadro de dor orofacial (NIXDORF et al., 2012). Ainda

nos Estados Unidos, projetou-se que a dor orofacial em idosos estaria presente em 35 milhões

de habitantes em 2000 (12,4% da população total) a 70 milhões em 2030 (20,6% da

população) (HOLM-PEDERSEN; WALLS; SHIP, 2015). No Brasil, um estudo realizado no

município de Piracicaba, São Paulo, demonstrou uma prevalência de 54,75% de dor orofacial

nos indivíduos entrevistados (RUIVO et al., 2015).

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Em virtude da diversidade etiológica da dor orofacial, novos estudos tornam-se

necessários para melhor compreender seus mecanismos. Distúrbios temporomandibulares têm

se apresentado como a dor orofacial de maior frequência na população, caracterizando-se pelo

envolvimento de músculos mastigatórios, da junção temporomandibular, ou ambos; pacientes

acometidos podem queixar-se de dor de garganta, de ouvido, de dente, dor facial e/ou dor de

cabeça (DE LEEUW, 2008). A neuralgia do trigêmeo apresenta-se como uma dor do tipo

neuropática geralmente decorrente de compressão vascular, seguida de desmielinização;

referida como dor unilateral severa, que acomete principalmente os ramos maxilar e

mandibular do nervo trigêmeo, nas regiões intra e/ou extraoral (KITT et al., 2000; DE

LEEUW, 2008). No caso da migrânea, relatada como dor unilateral localizada por trás do

olho, pescoço e crânio, acredita-se que haja a liberação de neuropeptídios vasoativos, como

substância P, neurokinina A e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, resultando em

inflamação neurogênica e consequente alodínia e hiperalgesia (ROMERO-REYES; UYANIK,

2014).

3.2 MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E A DOR OROFACIAL

A inflamação dos tecidos periféricos pode estar associada à liberação de mediadores

químicos (histamina e TNF-α, por exemplo) pelas células do sistema imunológico, tais como

mastócitos e macrófagos, ou a partir das próprias terminações aferentes nociceptivas, por

liberação de substância P, por exemplo. Muitos desses mediadores podem atuar sobre as

terminações nociceptivas no local da lesão aumentando a sua excitabilidade. Isso ocorre

devido a ação desses mediadores em certos receptores e canais iônicos das terminações

nociceptivas, resultando em sinalização e ativação de sistemas de segundo mensageiro

(SESSLE, 2005, 2011).

Dentre os principais mediadores inflamatórios liberados pelos macrófagos estão as

interleucinas (IL) e o fator de necrose tumoral α (TNF-α). A IL-1β é uma das principais

citocinas que regulam o processo inflamatório, caracterizando-se como pirógeno endógeno,

desencadeando a febre. Tal citocina atua ainda na produção de proteínas de fase aguda, no

aumento da permeabilidade dos vasos, bem como na produção de prostaglandinas por meio da

enzima ciclo-oxigenase (COX) e na indução de moléculas de adesão na parede dos vasos,

facilitando a quimiotaxia (DINARELLO, 2009).

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O TNF-α é a primeira citocina a ser liberada após um estímulo inflamatório, sendo

outra citocina de extrema importância no desenvolvimento desse processo, pelo aumento da

expressão de COX e de prostaglandina E2 (PGE2). O TNF-α participa da quimiotaxia para

neutrófilos por meio da estimulação de macrófagos, além de induzir a migração de neutrófilos

pela via dos leucotrienos. Dois receptores foram descritos para o TNF-α (TNFR1 e TNFR2),

onde o primeiro está relacionado com a apoptose, dor neuropática e inflamatória, e o segundo

com o processo inflamatório (CUNHA et al., 2005; SOMMER; SCHMIDT; GEORGE,

1998).

Substâncias irritantes aplicadas nos tecidos também podem desencadear o processo

inflamatório. Tais substâncias atuam sobre canais iônicos, como ocorre com a capsaicina que

atua sobre o receptor de potencial transitório do tipo vaniloide 1 (TRPV1) e o óleo de

mostarda sobre o receptor de potencial transitório do tipo ankirina 1 (TRPA1). Como

resultado, as terminações podem mostrar uma resposta aumentada a estímulos nocivos

subsequentes, refletindo uma sensibilização das terminações nociceptivas, que pode ser

conduzida ao longo dos aferentes nociceptivos para o sistema nervoso central (SESSLE,

2011).

3.3 TRATAMENTO DA DOR OROFACIAL

A Associação Internacional para Estudos da Dor (IASP) conceituou a dor como uma

experiência sensorial e emocional desagradável, relacionada a lesão tecidual real ou potencial,

ou descritas em termos desse tipo de dano. Desse modo, a dor envolve transdução de

estímulos nocivos do ambiente, além do processamento emocional do cérebro. Já a

nocicepção, a dor é capaz de incorporar componentes sensoriais com influências pessoais e

ambientais importantes, ou seja é o estímulo doloroso propriamente dito, não envolvendo

aspectos emocionais (KENDAL et al., 2003).

Embora diversos estudos tenham sido realizados sobre a dor orofacial, mas pouco se

sabe sobre a real causa de manutenção da dor via sistema nervoso central, o que torna difícil o

seu tratamento. Atualmente, anti-inflamatórios não esteroidais, sedativos analgésicos,

anticonvulsivantes, além de antidepressivos tricíclicos têm sido indicados para o tratamento

da neuralgia do trigêmeo, por exemplo, porém, quando há sensibilização central, tais

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medicamentos não apresentam efeito eficaz, além de, com o uso crônico, desencadearem uma

série de efeitos colaterais (ROMERO-REYES; UYANIK, 2014; ZAKRZEWSKA, 2010).

Tais indícios reforçam a necessidade de busca por novos medicamentos que atendam a esses

pacientes.

Assim, com o intuito de entender melhor sobre dor orofacial e de descobrir novas

substâncias que possam atuar de maneira eficaz sobre este tipo de dor, modelos animais têm

sido desenvolvidos afim de mimetizar os sintomas presentes na dor orofacial onde, por meio

da administração de algógenos, pode-se desencadear a liberação de mediadores inflamatórios,

bem como de neuropeptídios, como a substância P, que irão desencadear um processo

inflamatório e consequentemente a desmielinização do nervo. Testes como o de nocicepção

orofacial induzida por formalina, capsaicina e glutamato, são exemplos de possibilidade de

estudo para a dor orofacial, em roedores (Figura 3) (CLAVELOU et al., 1989; QUINTANS-

JÚNIOR et al., 2010).

3.4 PRODUTOS NATURAIS COMO FONTE DE NOVOS FÁRMACOS

Pesquisadores em todo o mundo têm voltado seus estudos para os produtos naturais

como fonte de novos fármacos direcionados aquelas doenças ou sintomas que ainda não

possuem tratamento eficaz (HARVEY; EDRADA-EBEL; QUINN, 2015). Fármacos

amplamente utilizados na clínica, como a aspirina® (o ácido acetilsalicílico extraído da casca

da planta Salix alba, popularmente conhecida como “salgueiro”) (VANE, 1971) e a morfina

(derivada da planta Papaver somniferum) derivam de produtos naturais. No Brasil, o

laboratório farmacêutico Aché desenvolveu o analgésico e anti-inflamatório Acheflan,

Figura 3. Local de administração de algógenos, por via

subcutânea, nos testes de nocicepção orofacial induzida

por formalina, capsaicina e glutamato, em roedores.

Fonte: Adaptado de WIEGERT; OERTNER, 2015.

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derivado do óleo essencial da planta Cordia verbanacea DC, com vendas superiores a R$ 20

milhões por ano (SHINZATO; POLLI; PORTO, 2015). No Brasil, há uma estimativa que no

ano de 1996, 25% dos US$ 8 bilhões referentes ao faturamento da indústria farmacêutica

foram decorrentes de medicamentos derivados de plantas. (GUERRA et al., 2001). As vendas

neste setor apresentam crescimento 10% ao ano (KNAPP, 2001).

A família Laminaceae compreende a maioria das plantas floríferas, o que corresponde

a cerca de 258 gêneros e mais de 7000 espécies. O gênero Stachys, um dos mais amplos

gêneros desta família apresenta cerca de 300 espécies. Dentre estas espécies, podemos

destacar a Stachys lavandulifolia (Figura 4), também conhecida como “chá das montanhas”,

amplamente utilizada na medicina popular turca e iraniana (Chay-e-Kouhi) no tratamento de

distúrbios da pele, bem como analgésico e anti-inflamatório (MINAE et al., 2015;

PIRBALOUTI; KOOHPYEH, 2011). Atividades ansiolítica (RABBANI; SAJJADI; JALALI,

2005; RABBANI; SAJJADI; ZAREI, 2003), antidepressiva, antibacteriana

(FOOLADVAND; FAZELI-NASAB, 2014), antimicrobiana (IŞCAN et al., 2012),

antioxidante (IŞCAN et al., 2012; RAHZANI et al., 2013), analgésica e anti-inflamatória

(HAJHASHEMI; GHANNADI; SEDIGHIFAR, 2007) já foram descritas para a S.

lavandulifolia.

Figura 4. Stachys lavandulifolia.

Fonte: MINAE et al, 2015.

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Rabbani et al. (2003) descreveram o efeito ansiolítico do extrato hidroalcoólico de S.

lavandulifolia, administrado intraperitonealmente, em modelo labirinto em cruz elevado. A

partir da dose de 100 mg/kg, os animais apresentaram um aumento na porcentagem de tempo

gasto e a porcentagem de entradas nos braços abertos do labirinto e diminuição da

porcentagem do tempo gasto e de entradas nos braços fechados do mesmo equipamento.

Além disso, o tempo de sono induzido por ketamina foi aumentado e a atividade locomotora

reduzida a partir desta mesma dose, mostrando o efeito ansiolítico com a atividade sedativa

para o extrato hidroalcoólico de S. lavandulifolia a partir da dose de 100 mg/kg (i.p.). Ao

testar o óleo essencial desta planta, nenhum efeito ansiolítico ou sedativo foi observado para

as mesmas doses estudadas.

Posteriormente, Rabbani et al. (2005) estudaram o extrato hidroalcoólico da S.

lavundifolia e suas frações em éter de petróleo, acetato de etila, butanol e água sobre a

movimentação espontânea, e ainda, ansiedade, medo e fármacos que alteram esse estado

através do modelo de labirinto em cruz elevado. O material foi extraído utilizando-se éter de

petróleo, acetato de etila, butanol e água. Trinta minutos após a injeção intraperitoneal dos

compostos estudados, o extrato hidroalcoólico (50 mg/kg), as frações de éter de petróleo (25 e

50 mg/kg), de acetato de etila (25 e 50 mg/kg) e de água (50 mg/kg) foram capazes de

aumentar a porcentagem de tempo gasto e a porcentagem de entrada nos braços abertos do

labirinto em cruz elevada. Entretanto, a fração de butanol não foi capaz de alterar o

comportamento animal no labirinto. Durante a investigação da movimentação espontânea,

todas as frações da planta diminuíram esta atividade. Tais achados corroboram com dados

descritos anteriormente, demonstrando a atividade ansiolítica da S. lavundifolia em diferentes

frações.

O EOSl também apresentou atividade antimicrobiana e reduzir a liberação de radicais

livres, atuando como um antioxidante. O EOSl apresentou efeito antimicrobiano sobre a

Candida tropicalis (MIC 0,094 mg/ml). Além disso, a uma concentração de 0,375 mg/ml o

EOSl foi capaz de inibir o crescimento de Staphylococcus aureus e Salmonella typhimurium.

Um efeito antimicrobiano significativo foi observado para todos os microrganismos testados,

porém a diminuição de radicais livres foi observada de forma notável, com uma IC50

de 3,9

µg/ml para o EOSl, destacando a atividade antioxidante deste óleo. (IŞCAN et al., 2012).

Rahzani et al. (2013) avaliaram o efeito antioxidante do extrato aquoso da S.

lavandulifolia em humanos. O estudo foi desenvolvido com 26 voluntários saudáveis que

foram convidados a consumir a infusão preparada a partir de 3 g de partes aéreas da S.

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lavandulifolia, diariamente, com administração pela manhã e à noite. Após 14 dias foi

observado um aumento nos antioxidantes totais do sangue e uma redução na peroxidação

lipídica, indicando a S. lavandulifolia como uma possível alternativa para o tratamento de

doenças relacionadas ao estresse oxidativo.

A atividade anti-inflamatória e analgésica da S. lavandulifolia foi avaliada utilizando-

se os extratos hidroalcoólico (1, 2 e 4 g/kg, v.o. ou i.p.), polifenólico (1, 2 e 4 g/kg, v.o. ou

i.p.) e cozido (0,5, 1 e 2 g/kg, v.o.). O efeito anti-inflamatório foi investigado por meio do

edema de pata induzido por carragenina. Apenas o extrato polifenólico na dose de 2 g/kg,

administrado por via oral ou intraperitoneal foi capaz de reduzir o edema. Quando avaliada a

atividade analgésica, todos os extratos foram capazes de reduzir as contorções abdominais

induzidas por ácido acético e de suprimir as respostas comportamentais em ambas as fases do

teste da formalina na pata. No teste tail flick os extratos não apresentaram atividade

analgésica, indicando a necessidade de novos estudos acerca dos efeitos anti-inflamatório e

analgésico da S. lavandulifolia (HAJHASHEMI; GHANNADI; SEDIGHIFAR, 2007).

A atividade toxicológica aguda e subcrônica da S. lavandulifolia também foi

investigada. Ratos foram tratados por via oral com dose única do extrato aquoso da S.

lavandulifolia, em diferentes doses, e avaliados por 14 dias. Nenhuma morte foi observada.

Análises histológicas foram realizadas 45 dias após o tratamento diário com o extrato. Não foi

observada nenhuma alteração hematológica, porém houve aumento da aspartato

aminotransferase e de creatinina no soro. Presença de gordura, degeneração de hepatócitos e

atrofia renal glomerular foi observada em ratos machos. Nas fêmeas, observou-se atrofia de

hepatócitos e dilatação de sinusóides no fígado, hiperemia e degeneração do epitélio renal

principalmente na região cortical. No entanto, nenhum nível de efeito adverso foi observado

para 250 e 100 mg/kg/dia do extrato aquoso de S. lavandulifolia para ratos machos e fêmeas,

respectivamente (MODARRESI et al., 2014).

Assim como a maioria dos óleos essenciais, o EOSl é rico em terpenos, que são

substâncias derivadas do metabolismo secundário das plantas, a exemplo do BIS. O BIS

(Figura 5) é um sesquiterpeno monocíclico alcoólico cujas propriedades para o tratamento de

distúrbios da pele (CROCCO et al., 2015), nefroprotetora (SAMPAIO et al., 2016), anticâncer

(UNO et al., 2016), anti-inflamatória (ROCHA et al., 2011), antinociceptiva (ROCHA et al.,

2011; TEIXEIRA; COSTA; CAMPOS, 2017) e redução da excitabilidade nervosa através do

bloqueio irreversível dos canais de sódio dependente da voltagem (ALVES et al., 2010), já

foram descritas na literatura.

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Figura 5. Estrutura molecular do (-)-α-bisabolol (Nomenclatura segundo

a IUPAC: 6-metil-2-(4-metilciclohex-3-en-1-il)hept-5-en-2-ol).

Fonte: BARRETO et al., 2016.

Crocco et al. (2015) estudaram a aplicação tópica, uma vez ao dia, de uma formulação

creme contendo nicotinamida (4%), arbutina (3%), bisabolol (1%) e retinaldeído (0,05%) no

tratamento de melasma epidérmico, uma desordem de hiperpigmentação, em humanos. Com a

aplicação do creme, a área de superfície total do melasma foi reduzida. Além disso, os perfis

de tolerância e segurança e a satisfação dos pacientes, apontaram a formulação testada como

alternativa para o tratamento de melasma.

O efeito do (-)-α-bisabolol foi investigado em ratos submetidos à nefrectomia direita,

com isquemia de 60 min e reperfusão de 48 h no rim esquerdo. O tratamento oral com BIS

(100 mg/kg) melhorou alterações na diurese, ingestão de água, osmolalidade urinária, nível de

creatinina plasmática, de uréia e de ácido úrico, depuração de creatinina, proteinúria e

microlbuminúria. O BIS também atenuou as alterações morfológicas obtidas com a isquemia

e reperfusão, congestionamento vascular e depósito intratubular de material proteináceo, além

de reduzir alterações nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e de

glutationa reduzida (GSH), o que corresponde ao seu efeito nefroprotetor e antioxidante

(SAMPAIO et al., 2016).

A atividade anticâncer do (-)-α-bisabolol foi descrita por Uno et al. (2016). O estudo

foi realizado em células pancreáticas cancerosas de humanos, onde o BIS apresentou efeito

antiproliferativo mediado pelo receptor Kisspeptin 1, necessitando de novas investigações

acerca deste mecanismo antiproliferativo do BIS.

Rocha et al. (2011) estudaram a atividade anti-inflamatória do BIS (100 e 200 mg/kg,

v.o.), onde este sesquiterpeno foi capaz de reduzir o edema induzido por carragenina,

dextrano e 5-hidroxitriptamina (5-HT), mas não por histamina. O BIS ainda foi capaz de

reduzir o número de leucócitos totais e de proteínas no fluido peritoneal de animais com

peritonite induzida por carragenina, bem como os níveis de mieloperoxidase e de TNF-α. A

atividade analgésica foi confirmada no teste de contorções abdominais induzidas por ácido

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acético, na segunda fase do teste da formalina e na hiperalgesia mecânica induzida por

carragenina em animais tratados com BIS nas doses de 25 e 50 mg/kg, por gavagem. Outro

estudo avaliou o bloqueio irreversível de canais para Na+

dependentes de voltagem,

importantes para a despolarização neuronal, sobretudo na via sensorial, foi descrito por Alves

et al. (2010), utilizando a técnica sucrose gap.

Tendo em vista a busca por novos medicamentos que sejam eficazes no tratamento de

doenças ou sintomas de etiologia complexa, como é o caso da dor orofacial, bem como o uso

de produtos naturais como fonte de novas descobertas vinculadas à indústria farmacêutica, o

estudo do EOSl e do BIS torna-se interessante diante das diversas ações biológicas já

descritas para essas substâncias.

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OBJETIVOS

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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-bisabolol

(BIS) sobre a nocicepção orofacial e inflamação em camundongos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Extrair o óleo essencial das partes aéreas da S. lavandulifolia;

Caracterizar o EOSl quanto ao seu perfil cromatográfico;

Avaliar o possível efeito do EOSl e do BIS em modelos de nocicepção orofacial em

camundongos;

Verificar o efeito do EOSl e do BIS sobre a atividade motora em roedores;

Avaliar o possível efeito anti-inflamatório do EOSl e do BIS em modelo de

inflamação em camundongos;

Avaliar a participação de mediadores inflamatórios sobre a ação do EOSl ou BIS.

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CASUÍSTICA E MÉTODOS

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4 CASUÍSTICA E MÉTODOS

4.1 SUBSTÂNCIAS

Sulfato de morfina (Dimorf-Cristália, Brasil), glutamato, capsaicina, etanol, dimetil

sulfóxido (DMSO), indometacina (Sigma, EUA), naloxona (Res. Biochemicals Inc., EUA),

diazepam (União Química, Brasil), formaldeído (Merck, EUA), Tween 80 (Sigma, EUA) e

kits ELISA para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-1-beta (IL-1β) (BD-

Bioscience Pharmingen, EUA).

4.2 MATERIAL VEGETAL

A Stachys lavandulifolia Vahl. foi coletada a caminho do Campus do vilarejo

Yukselen, Konya, Turquia, na primavera (junho 2014). A identificação taxonômica do

material vegetal foi confirmada pelo taxonomista sênior Dr. Murad Aydin Sanda,

Departamento de Cultivos de Campo, Universidade de Igdir. O espécime do voucher foi

depositado no Herbário do Departamento de Biologia, Universidade de Selcuk, Konya,

Turquia.

4.3 OBTENÇÃO E ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL

As partes aéreas secas ao ar e em pó da planta (100 g) foram submetidas à destilação

aquosa durante 5 h utilizando um aparelho britânico do tipo Clevenger (ILDAM Ltd., Ankara-

Turquia). O óleo essencial obtido foi seco sobre sulfato de sódio anidro e, após filtração,

armazenado a 4°C até ser testado e analisado.

A amostra de óleo essencial foi analisada por cromatografia gasosa com detector de

ionização de chama (GC-FID) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa

(GC/MS). A análise GC/MS foi realizada com um sistema Agilent 5975 GC-MSD acoplado a

um Agilent 7890A GC (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). Utilizou-se uma coluna

HP-Innowax FSC (60 m x 0,25 mm), 0,25 μm de espessura de filme, em um fluxo constante

de hélio (pureza de 99,99%) como gás transportador (1,2 mL/min). A temperatura do forno

GC foi mantida a 60 °C durante 10 min. Em seguida, programada para aumentar para 220 °C

a uma taxa de 4 °C/min antes de ser mantida constante a 220 °C, durante 10 min, para

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posteriormente aumentar para 240 °C a uma taxa de 1 °C/min. A proporção de separação

utilizada foi de 40:1. A temperatura do injetor estava a 250 °C, os espectros de massa foram

registados a 70 eV. A escala de massa foi de 35 a 450 m/z. A análise GC-FID foi realizada

por auto-injeção simultânea utilizando um auto-amostrador Agilent 7693 A; 1 μl de óleo

essencial diluído com n-hexano (10%, v/v) foi injetado no sistema GC/MS. A análise de GC

foi realizada utilizando um sistema GC Agilent 7890A. A fim de obter a mesma ordem de

eluição com GC/MS, as injeções foram realizadas em triplicatas simultâneas utilizando a

mesma coluna e as mesmas condições operacionais. A temperatura do FID foi de 300 °C.

A identificação dos constituintes foi obtida com base na comparação dos índices de

retenção determinados por co-injeção em referência a uma série homóloga de n-alcanos (C8-

C30), nas mesmas condições experimentais. A identificação adicional foi realizada pela

comparação de seus espectros de massa com aqueles da versão NIST 05 e Wiley 8, bem como

pela comparação de seus índices de retenção com os valores descritos na literatura (ADAMS,

2007).

4.4 ANIMAIS

Camundongos Swiss machos, adultos jovens (28-33 g), foram utilizados em todos os

protocolos experimentais. Os animais foram divididos em grupo veículo (Salina 0,9% +

Tween 0,2%), EOSl (doses 25 ou 50 mg/kg; v.o.), BIS (doses 25 ou 50 mg/kg; v.o) ou

morfina (MOR, 3mg/kg, i.p.). Os camundongos foram alojados em condições controladas de

temperatura (22 ± 2 °C) e iluminação (ciclo claro: 6 às 18 horas) e tiveram livre acesso à

comida e água. Todos os procedimentos descritos no presente trabalho foram aprovados pelo

Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Sergipe (CEPA/UFS:

72/2015) e estavam de acordo com o preconizado pela Sociedade Brasileira de Ciência em

Animais de Laboratório (SBCAL) e os procedimentos e cuidados para o manuseio de animais

foram realizados de acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP).

Todos os protocolos experimentais foram realizados de forma duplamente cega para evitar

qualquer influência nos resultados. Desconfortos desnecessários para os animais também

foram evitados.

4.5. TESTE DE NOCICEPÇÃO OROFACIAL INDUZIDA POR FORMALINA

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O teste da formalina é um dos testes mais empregados para a avaliação da nocicepção,

sendo mais adequado que testes mecânicos e térmicos. A formalina desencadeia uma resposta

precoce, também conhecida como primeira fase onde ocorre um efeito direto sobre os

nociceptores seguido de uma resposta inflamatória, característica da fase tardia, ou ainda

também denominada, como segunda fase. Quando injetada na região orofacial, a formalina

estimula os neurônios nociceptivos convergentes do núcleo trigeminal espinhal,

caracterizando este teste como mais específico na análise do componente central da dor

(LUCCARINI et al., 2006; CLAVELOU et al., 1989).

A nocicepção orofacial foi induzida por injeção (s.c.) de 20 μl de formalina (2%) no

lábio superior direito (área de perinasal) dos camundongos, conforme descrito por Luccarini

et al. (2006) e adaptado por Quintans-Júnior et al. (2010). Este volume e porcentagem de

concentração da formalina desencadeiam uma resposta comportamental bifásica (face-

rumbbing) relacionada com o estímulo nociceptivo de grande intensidade em períodos de 0-5

min (primeira fase) e 15-40 min (segunda fase). O comportamento nociceptivo foi

quantificado nesses períodos medindo o tempo (s) em que o animal passou esfregando a face

da área injetada com suas patas dianteiras ou traseiras. Para avaliar os efeitos dos fármacos de

teste, diferentes grupos de camundongos (n = 6/por grupo) foram pré-tratados com veículo

(solução salina 0,9% com Tween 80 0,2%, v.o.); OESl (25 e 50 mg/kg, v.o.) ou BIS (25 e 50

mg/kg, v.o.) 1 h antes da injeção local de formalina. A morfina (MOR, 3 mg/kg, i.p.) foi

administrada 0,5 h antes da inclusão do algógeno como controle positivo.

Figura 6. Resumo esquemático do teste da formalina.

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29

4.6 TESTE DE NOCICEPÇÃO INDUZIDO POR CAPSAICINA

A capsaicina representa o componente majoritário da pimenta vermelha, é uma

ferramenta bastante empregada em estudos dos mecanismos fisiológicos da dor. Usar a

capsaicina como algógeno químico oferece diversas vantagens, pois a mesma possui ação

seletiva sobre as fibras sensoriais que transmitem as sensações dolorosas e térmicas. Com

isto, há uma ativação do receptor vanilóide 1, canal iônico presente em neurônios sensoriais,

principalmente na via trigeminal, mais especificamente no gânglio trigeminal. A injeção da

capsaicina é capaz de aumentar a excitabilidade de neurônios nociceptivos espinhais, sendo

muito utilizada em estudos pré-clínico de mecanismos centrais envolvidos na nocicepção

(HOLZER, 1991; PELISSIER; PAJOT; DALLEL, 2002).

Figura 7. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina.

A nocicepção orofacial foi induzida por capsaicina em camundongos, como descrito

anteriormente (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Os camundongos (n = 6/ por grupo) foram

injetados com 20 μl de capsaicina (2,5 μg, s.c.), a uma concentração de 2% no lábio superior

direito (área perinasal), usando uma agulha de 27 G. A capsaicina foi dissolvida em etanol,

DMSO e água destilada (1:1:8). Em estudos-piloto, os camundongos manifestaram

comportamento de fricção de face relacionado com a nocicepção após a injeção de capsaicina

com uma intensidade elevada no período de 10-20 min. Portanto, a quantificação de

nocicepção foi realizada neste período, medindo o tempo (s) em que os animais passaram

esfregando a face da área injetada com as patas dianteiras ou traseiras. EOSl ou BIS (25 e 50

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mg/kg, v.o.) ou veículo (solução salina 0,9% com Tween 80 0,2%, v.o.) foram administrados

aos animais como descrito no teste de nocicepção induzida por formalina, 1 h antes da injeção

local do algógeno (capsaicina). A morfina (MOR, 3 mg/kg, i.p.) foi administrada 0,5 h antes

da inclusão do algógeno como controle positivo.

4.7 TESTE DE NOCICEPÇÃO INDUZIDA POR GLUTAMATO

O glutamato é um neurotransmissor excitatório que apresenta um papel fundamental

no mecanismo da dor. Níveis de glutamato periféricos são aumentados na pele ou tecidos

profundos, como uma resposta à lesão de tecidos, estimulação elétrica do nervo e na

inflamação. A administração subcutânea local do glutamato evoca um processo doloroso ou

ainda, uma hiperalgesia térmica ou mecânica (GAZERANI et al., 2006; RO, 2003).

Figura 8. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por glutamato.

Na tentativa de fornecer informação sobre qualquer interação de EOSl ou BIS com o

sistema glutamatérgico, investigamos se estas substâncias seriam capazes de antagonizar a

nocicepção orofacial induzida por glutamato em camundongos. O procedimento foi

semelhante ao descrito anteriormente (BEIRITH; SANTOS; CALIXTO, 2002), mas com

algumas alterações. Um volume de 40 μl de glutamato (25 μM) foi injetado no lábio superior

direito. Os animais foram observados individualmente durante 15 min após a injeção de

glutamato. A quantificação da nocicepção foi realizada medindo-se o tempo (s) em que o

animal passou esfregando a face da área injetada com suas patas dianteiras ou traseiras. Os

animais (n = 6/ por grupo) foram pré-tratados com veículo (solução salina 0,9% com Tween

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80 0,2%, v.o.), EOSl ou BIS (25 e 50 mg/kg, v.o.), ou MOR (3 mg/kg, i.p.), 1 ou 0,5 h antes

da injeção local de glutamato.

4.8 AVALIAÇÃO DA FORÇA MUSCULAR

Realizou-se um teste de força de preensão utilizando um medidor de força de preensão

(Grip strength meter, Modelo EFF-305, Insight, Ribeirão Preto, SP), conforme descrito

anteriormente (MEYER et al., 1979). Uma hora após a administração de EOSl ou BIS (50

mg/kg, v.o.) ou veículo (solução salina 0,9% com Tween 80 0,2%, v.o.), os camundongos

foram colocados na placa e puxados horizontalmente pela cauda com força crescente até se

tornarem incapazes de agarrar o trapézio, ocorrendo perda da pega. O instrumento captou e

exibiu digitalmente a força de pico de preensão alcançada e a força muscular foi definida

como o peso máximo (g) indicado no mostrador.

4.9 PLEURISIA INDUZIDA POR CARRAGENINA

A carragenina é um polissacarídeo adquirido através de algas marinhas. A injeção de

carragenina provoca um processo inflamatório localizado, capaz de sensibilizar os

nociceptores aferentes primários. A indução da inflamação provocada pela carragenina é

considerada um modelo clássico, muito utilizado no desenvolvimento de fármacos (URBAN;

GEBHART, 1999; CHATTOPADHYAY et al, 2012).

Diferentes grupos de camundongos foram submetidos a doses orais do EOSl (50

mg/kg, v.o.) ou do BIS (50 mg/kg, v.o.) dissolvidos em soro fisiológico (0,9%) com Tween

80 (0,2%). O veículo administrado foi soro fisiológico (0,9%) com Tween 80 (0,2%) e o

grupo controle positivo recebeu indometacina (10 mg/kg) a mesma via 1 h antes da injeção

pleural de carragenina. A pleurisia foi induzida nos camundongos por administração

intrapleural de 100 μl de suspensão de carragenina a 1% (p/v) em solução salina estéril

(OLIVEIRA et al., 2012). Uma agulha 13 mm x 5 mm especialmente adaptada foi introduzida

no lado direito da cavidade torácica para injeção da solução de carragenina. Quatro horas após

a indução da pleurisia, os animais foram submetidos à eutanásia e o exsudato pleural foi

coletado através de lavagem pleural com 1 mL de PBS contendo ácido etileno diamino tetra-

acético (EDTA, 10 mM). O volume de exsudato foi medido e uma alíquota de 50 μl foi

diluída com solução de Turk (1:20). Os leucócitos totais foram contados numa câmara de

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Neubauer, examinando quatro quadrantes externos, utilizando um microscópio óptico

(VINEGAR; TRUAX; SELPH, 1973).

4.9.1 Determinação dos níveis de IL-1β e TNF-α no líquido pleural

Os níveis de exsudato das citocinas IL-1β e TNF-α foram determinados 4 h após a

indução da pleurisia por injeção de carragenina como descrito anteriormente (BRITO et al.,

2012; DE SANTANA et al., 2015). Os ensaios foram realizados utilizando-se kits ELISA

colorimétricos comerciais (BD-Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, EUA) seguindo as

recomendações do fabricante. O equipamento ELISA teve um limite de detecção inferior de 5

pg/mL.

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores foram expressos como média ± E.P.M. Os dados obtidos foram analisados

pela análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. Em todos os

casos, as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. Todas

as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Graph Pad Prism 5 (Graph Pad

Prism Software Inc., San Diego, CA, EUA).

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33

RESULTADOS E DISCUSSÃO

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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O óleo essencial obtido da S. lavandulifolia (EOSl) foi analisado por técnicas GC-FID

e GC-MS. O óleo essencial revelou a presença de trinta e quatro componentes, representando

89,9% do óleo total. Todos os componentes voláteis identificados estão listados na Tabela 1.

Como pode ser visto na Tabela, o α-bisabolol (56,4%) foi determinado como o componente

principal, seguido por biciclogermacreno (5,3%), δ-cadineno (4,2%) e espatulenol (2,9%).

Tabela 1 – Componentes voláteis no óleo essencial de Stachys lavandulifolia.

ªÍndice de Retenção relativo ao n-alcalanos na coluna capilar HP-innowax.

O cromatograma de íons totais e os dados espectrais de MS para o BIS são mostrados

na Fig. 6. EOSl é caracterizado por uma alta concentração de sesquiterpenos. Vários estudos

No IRa Componentes % Método de Identificação

1 1215 β-Felandreno 0,1 RI,MS

2 1500 Pentadecano 0,2 RI,MS

3 1501 α-Copaeno 1,3 RI,MS

4 1531 β-Bourboneno 0,5 RI,MS

5 1600 Hexadecano 0,3 RI,MS

6 1601 β-Elemeno 0,1 RI,MS

7 1614 β-Cariofileno 1,0 RI,MS

8 1670 (Z)- β-Farneceno 0,8 RI,MS

9 1700 Heptadecano 0,3 RI,MS

10 1704 γ-Muuroleno 0,2 RI,MS

11 1706 p-Mentano 1,8 diol 0,1 RI,MS

12 1715 Borneol 0,1 RI,MS

13 1729 Germacreno D 2,3 RI,MS

14 1738 β-Bisabolona 1,9 RI,MS

15 1757 Bicyclogermacreno 5,3 RI,MS

16 1776 δ-Cadineno 4,2 RI,MS

17 1786 (E)-α-Bisabolona 0,2 RI,MS

18 1800 Octadecano 0,2 RI,MS

19 1802 Selina-3,7(11)-dieno 1,8 RI,MS

20 1900 Nonadecano 0,4 RI,MS

21 1943 α-Calacorene 0,1 RI,MS

22 2000 Eicosano 0,5 RI,MS

23 2100 Heneicosano 1,0 RI,MS

24 2147 Espatulenol 2,9 RI,MS

25 2153 Valeranona 1,0 RI,MS

26 2166 α-Bisabolol oxide B 0,7 RI,MS

27 2200 Docosane 0,8 RI,MS

28 2237 α-Bisabolol 56,4 RI,MS

29 2248 α-Eudesmol 0,8 RI,MS

30 2254 α-Cadinol 1,4 RI,MS

31 2258 β–Eudesmol 0,8 RI,MS

32 2300 Tricosano 0,9 RI,MS

33 2400 Tetracosano 0,1 RI,MS

34 2500 Pentacosano 0,6 RI,MS

Total identificado 89.9

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de composição realizados no óleo essencial de S. lavandulifolia (AGHAEI; HOSSEIN

MIRJALILI; NAZERI, 2013; KHADIVI-KHUB; AGHAEI; MIRJALILI, 2014;

MESHKATALSADAT et al., 2007) identificaram seu componente principal como sendo

compostos diferentes, incluindo: β-felandreno, bicilogermacreno, germacreno D, δ-cadineno e

α-pineno, dentre outros. Estas diferenças observadas em constituintes voláteis podem estar

associadas a fatores climáticos, geográficos e genéticos, por exemplo. Resultados semelhantes

foram observados por vários investigadores para diferentes óleos essenciais (DHOUIOUI et

al., 2016; YOU et al., 2015).

Figura 9. Cromatografia iônica total do EOSL (a) e o espectro de massa para o α-bisabolol (no EOSl (b), na

biblioteca Match (c) e na biblioteca NIST (d)).

S. lavandulifolia é uma planta medicinal amplamente utilizada como antimicrobiana,

analgésica e anti-inflamatória na medicina popular de países da Ásia Ocidental, inclusive no

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tratamento da dor de dente e outros problemas como a periodontite (MINAE et al., 2015).

Apesar de seus importantes e amplos usos etnofarmacológicos, pouco se sabe sobre as

propriedades de seu óleo essencial. Assim, objetivou-se avaliar os efeitos antinociceptivos e

anti-inflamatórios do EOSl e do BIS, no comportamento nociceptivo orofacial induzido por

formalina, glutamato ou capsaicina em camundongos. Além disso, também avaliamos o

possível envolvimento de IL-1β e TNF-α nos seus perfis analgésicos e anti-inflamatórios.

Nossos resultados mostraram que o tratamento oral com EOSl e BIS apresentou efeitos

inibitórios significativos (p<0,05; p<0,01; p<0,001) em diferentes modelos de dor orofacial

em camundongos. O BIS reduziu significativamente o comportamento nociceptivo e a

resposta inflamatória, parecendo estes efeitos serem mediados pela inibição de citocinas pró-

inflamatórias.

A administração de EOSl e BIS produziu uma redução significativa no

comportamento de fricção facial induzida por formalina (Fig. 10). Apenas a dose mais

elevada de BIS (50 mg/kg, v.o.) produziu efeitos inibitórios significativos (35,50 ± 4,405;

p<0,001) na resposta comportamental nociceptiva de fricção da face na primeira fase do teste

de formalina quando comparado com o grupo de controle (86,00 ± 2,951) e ao grupo EOSl

(25 mg/kg, v.o., 69,50 ± 3,188) (Fig. 10 (A)). No entanto, todas as doses de EOSl ou BIS (25

e 50 mg/kg, v.o.) produziram efeitos inibitórios significativos (91,50 ± 13,07 e 87,50 ± 9,293;

p<0,01 ou 79,50 ± 6,967 e 45,50 ± 13,71; p<0,001, respectivamente) na resposta nociceptiva

do comportamento de fricção da face na segunda fase do teste de formalina, quando

comparado com o grupo controle (141,5 ± 13,33) (Fig. 10 (B)).

Vehicle 25 50 25 50 Morphine0

20

40

60

80

100

EOSl (mg/kg)

A)

Bisabolol (mg/kg)

###

***

***Fa

ce

ru

bb

ing

(s)

Veículo Morfina

Fri

cção

da

regiã

o o

rofa

cial

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37

Vehicle 25 50 25 50 Morphine0

50

100

150

200B)

EOSl (mg/kg) Bisabolol (mg/kg)

*****

***

*****

Fa

ce

ru

bb

ing

(s)

Figura 10. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-Bisabolol (BIS) no comportamento

nociceptivo induzido por formalina. Veículo (controle), EOSl (25 e 50 mg/kg), BIS (25 e 50 mg/kg) ou MOR (3

mg/kg) foram administrados oralmente ou intraperitonialmente 1 ou 0,5 h antes da injeção de formalina. (A)

Primeira fase (0–5 min) e (B) segunda fase (15–40 min) do teste da formalina. Valores expressos em media ±

E.P.M. (n=6, por grupo). **p<0.01;***p<0.001 versus controle; ###p<0.001 versus EOSl (25 mg/kg) (ANOVA

uma via seguido pelo teste de Tukey).

O pré-tratamento agudo com EOSl ou BIS, por via oral, causou efeito antinociceptivo

no teste da formalina em camundongos, o que foi evidenciado por uma diminuição do

comportamento de fricção facial, particularmente durante a segunda fase.

Surpreendentemente, o BIS numa dose de 50 mg/kg produziu uma redução no

comportamento da dor na primeira fase, em contraste com os resultados do estudo de ROCHA

et al., 2011 com a mesma dose mas utilizando o teste da formalina na pata. Isso pode ser

explicado pela ideia de que, de acordo com LUCCARINI et al., 2006, a formalina

administrada na região orofacial pode sensibilizar fortemente os receptores sensoriais,

produzindo a condução de impulsos dolorosos através do nervo trigêmeo, tornando o modelo

mais sensível do que o teste de nocicepção na pata induzido pela formalina. Nossos resultados

para o BIS corroboram com esta hipótese (LUCCARINI et al., 2006; SESSLE, 2011).

Além disso, o componente bifásico da nocicepção induzida pela formalina reflete

diferentes mecanismos subjacentes. A primeira fase está relacionada com a estimulação

química direta das terminações nervosas nociceptivas, que reflete dor mediada centralmente

com a liberação de substância P (LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001; RABOISSON;

DALLEL, 2004), enquanto a segunda fase depende de uma combinação de insumos de

aferentes nociceptivos, devido à liberação de aminoácidos excitatórios, PGE2, óxido nítrico,

taquicinina, cininas e outros peptídeos (CAPUANO et al., 2009).

Veículo Morfina

Fri

cção

da

regiã

o o

rofa

cial

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Alguns estudos têm proposto que a inibição por monoterpenos em ambas as fases do

teste de formalina pode estar associada ao bloqueio dos canais para Na+ dependentes de

voltagem, causando uma estabilização da membrana excitável (GONÇALVES et al., 2008;

SOUSA et al., 2006) ou pelo envolvimento dos sistemas de dor moduladores descendentes

(BRITO et al., 2013, 2015; GUIMARÃES et al., 2014). Além disso, Alves et al. (2010)

demonstraram que a diminuição da excitabilidade nervosa induzida pelo BIS pode ser causada

por um bloqueio irreversível de canais para Na+ dependentes de voltagem e, portanto, é

possível sugerir que a resposta antinociceptiva observada para o EOSl e o BIS está

relacionada a esse efeito.

Seguindo a hipótese racional de modulação de ambas as fases do teste de formalina, o

BIS tem sido descrito como tendo efeitos anti-inflamatórios na redução do edema (ROCHA et

al., 2011; TOMIĆ et al., 2014), na redução da degranulação de neutrófilos, na diminuição da

migração de leucócitos, no aumentando do extravasamento de proteínas e na quantidade de

TNF-α na cavidade peritoneal em resposta à carragenina (ROCHA et al., 2011).

Além disso, Kim et al. (2011) mostraram que a produção de óxido nítrico induzida por

lipopolissacarídeo e PGE2 reduziram a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2) e da enzima

óxido nítrico sintetase induzível (iNOS), além de reduzir a ativação dos promotores da

proteína ativadora 1 (AP-1) (quinases reguladas por sinal extracelular - ERK - e por p38),

induzida por lipopolissacarídio (LPS) e fator nuclear kB (NF-kB). Chen et al. (2010)

observaram que a detecção de um acúmulo de p53 nuclear do tipo selvagem e a expressão

crescente de NF-kB indicaram que estes dois reguladores chave, que têm uma função de

tomada de decisão transcricional em várias vias de sinalização, também podem desempenhar

um papel na apoptose induzida por BIS. Assim, estas propriedades farmacológicas de EOSl e

de BIS podem envolver a inibição de mediadores inflamatórios e também têm sido implicadas

no efeito antinociceptivo demonstrado em nosso estudo.

Para melhor compreensão do perfil farmacológico de EOSl e BIS, avaliamos suas

atividades em testes de nocicepção orofacial induzida por capsaicina e glutamato. No teste da

capsaicina, todas as doses de EOSl ou BIS (78,50 ± 12,68 e 63,00 ± 9,495; p<0,05; p<0,01 ou

59,50 ± 13,57 e 48,50 ± 11,48; p<0,001, respectivamente) reduziram o comportamento

nociceptivo em camundongos quando comparados ao grupo controle (133,5 ± 12,60) (Fig.

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11).

Vehicle 25 50 25 50 Morphine0

60

120

180

EOSl (mg/kg) Bisabolol (mg/kg)

***

*** ***

***Fa

ce

ru

bb

ing

(s)

Figura 11. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-Bisabolol (BIS) no comportamento

nociceptivo induzido por capsaicina. Veículo (controle), EOSl (25 e 50 mg/kg), BIS (25 e 50 mg/kg) ou MOR (3

mg/kg) foram administrados oralmente ou intraperitonialmente 1 ou 0,5 h antes da injeção de capsaicina. Valores

expressos em media ± E.P.M. (n=6, por grupo). *p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001 versus controle (ANOVA uma

via seguido pelo teste de Tukey).

A capsaicina tem uma ação seletiva sobre as fibras sensoriais que transmitem

sensações de dor e provoca vasodilatação reflexa axonal resultante da ativação dos receptores

vanilóides sensíveis à capsaicina (TRPV1). Isto induz um influxo de cátions que produz

despolarização e excitação de neurónios causando a liberação de neuropeptídios tais como

taquiquininas, substância P, peptídio relacionado com o gene da calcitonina, aminoácidos

excitatórios (aspartato e glutamato), óxido nítrico e mediadores pró-inflamatórios de terminais

periféricos (SAKURADA et al., 1992). A injeção de capsaicina também é capaz de aumentar

a excitabilidade dos neurônios nociceptivos espinhais e trigeminais (PELISSIER; PAJOT;

DALLEL, 2002). Este modelo é interessante em relação ao possível envolvimento de

receptores vaniloides envolvido no mecanismo farmacológico de novos analgésicos

(HOLANDA PINTO et al., 2008; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010).

Os efeitos observados nos testes da formalina e da capsaicina podem ser resultado de

uma inibição da liberação de substância P, ou por uma ação de bloqueio direto no seu

receptor, neuroquinina-1 (NK-1) (HOLANDA PINTO et al., 2008), em virtude de estudos

demonstrarem que a ativação dos receptores NK-1, através da administração do antagonista

de NK-1, bloqueou o teste da formalina de segunda fase (LUCCARINI et al., 2003). Por outro

lado, (LEITE et al., 2012) demonstraram que o BIS não parece atuar como um agonista de

Fri

cção d

a r

egiã

o o

rofa

cial

(s)

Veículo

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40

TRPV1, mas pode possivelmente induzir uma influência moduladora sobre outros receptores

vanilóides.

Waning et al. (2007) demonstraram que o receptor TRPV1, sensível à capsaicina, que

desempenha um papel importante na transdução da dor, é um dos canais de influxo de Ca+2

envolvido na migração celular. Foi também demonstrado que a ativação de TRPV1 aumenta

as espécies reativas de oxigênio que atuam como molécula de sinalização para aumentar o

TNFR1 (MA; ZHANG; WESTLUND, 2009). Desse modo, o efeito antinociceptivo

demonstrado pelo EOSl e pelo BIS no teste da capsaicina parece ser o resultado de sua

possível inibição de neurotransmissores envolvidos na ativação de fibras sensoriais

responsáveis pela transmissão de estímulos nociceptivos.

Adicionalmente, os resultados também mostraram que a administração oral de EOSl

(50 mg/kg) e BIS (25 e 50 mg/kg) produziu um aumento significativo (53,00 ± 5,057; p

<0,05, 40,00 ± 7,990; p<0,001, 34,50 ± 4,527, p<0,001, respectivamente) do comportamento

nociceptivo induzido pela injeção de glutamato em face quando comparado ao grupo controle

(84,00 ± 9,580) (Fig. 12).

Vehicle 25 50 25 50 Morphine0

40

80

120

EOSl (mg/kg) Bisabolol (mg/kg)

* ##

*** ###

***

***Face r

ub

bin

g (

s)

Figura 12: Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do (-)-α-Bisabolol (BIS) no comportamento

nociceptivo induzido por glutamato. Veículo (controle), EOSl (25 e 50 mg/kg), BIS (25 e 50 mg/kg) ou MOR (3

mg/kg) foram administrados oralmente ou intraperitonialmente 1 ou 0,5 h antes da injeção de glutamato. Valores

expressos em media ± E.P.M. (n=6, por grupo). *p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001 versus controle (ANOVA uma

via seguido pelo teste de Tukey).

O glutamato está presente nos terminais central e periférico dos neurônios do gânglio

trigeminal e da raiz dorsal. A estimulação nociva das fibras aferentes primárias resulta na

liberação de glutamato a partir dos terminais periféricos, bem como dos terminais centrais das

Fri

cção d

e reg

ião o

rofa

cial

(s)

Morfina Veículo

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fibras aferentes espinhais e do trigêmeo (KEAST; STEPHENSEN, 2000; LAM et al., 2005).

Esta resposta nociceptiva causada pelo glutamato parece envolver locais periféricos, espinhais

e supra-espinhais. Além disso, tem sido relatado que a injeção de glutamato provoca respostas

nociceptivas pronunciadas, que são mediadas por neuropeptídeos (Substância P) liberados de

fibras C, e ativa receptores de glutamato (por exemplo, o receptor NMDA). Isto pode

estimular a produção de uma variedade de segundos mensageiros intracelulares, tais como o

óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α e IL-1β, que atuam

sinergicamente na excitação dos neurônios (BEIRITH; SANTOS; CALIXTO, 2002).

Além disso, Leite et al. (2012) observaram que quando os camundongos foram pré-

tratados com l-NAME, um inibidor da enzima óxido nítrico sintetase, e o antagonista 5-HT3,

a ondansetrona, aparentemente resultou em uma resposta potencializada, que desperta a

necessidade de melhor análise. Estudos demonstraram que os receptores de aminoácidos

excitatórios estão envolvidos na transmissão nociceptiva primária aferente, tanto no

desenvolvimento como na manutenção de respostas dolorosas (CARLTON; HARGETT;

COGGESHALL, 2001; COGGESHALL; CARLTON, 1997). Assim, a inibição da

nocicepção induzida pelo glutamato pelo tratamento com EOSl e BIS pode estar associada à

sua interação com o sistema glutamatérgico.

Estudos anteriores sugeriram que a depressão do sistema nervoso central e os efeitos

de relaxamento muscular inespecíficos podem reduzir a resposta da coordenação motora, o

que pode invalidar os resultados encontrados em testes comportamentais (DE ALMEIDA et

al., 2004; SOUSA et al., 2006). Assim, procuramos demonstrar que as doses utilizadas em

nosso estudo não foram capazes de produzir qualquer déficit motor. Nossos resultados

demonstraram que o efeito analgésico não está relacionado a qualquer anomalia motora, uma

vez que os camundongos tratados com EOSl ou BIS não apresentaram alteração de

desempenho no medidor de força de preensão quando comparado ao grupo controle (Figura

10). Os animais tratados com EOSl demonstraram um aumento significativo na força no teste

de aderência, que pode estar relacionado com um efeito direto no músculo esquelético ou

devido à estimulação direta do sistema nervoso central (SUOKAS et al., 2014).

Como alguns de nossos resultados sugerem um perfil anti-inflamatório para EOSl ou

BIS, procurou-se caracterizá-los melhor usando o teste de pleurisia induzido por carragenina.

EOSl ou BIS exibiram um efeito anti-inflamatório significativo (p<0,001) no teste de

pleurisia (Figura 11). Além disso, este efeito está relacionado com a inibição das citocinas

pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β, visto que o tratamento com EOSl (50 mg/kg) resultou em

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uma redução significativa (p<0,05 e p<0,01) de ambas as citocinas. No entanto, embora os

animais tratados com BIS tivessem um nível de TNF-α significativamente reduzido (p<0,05)

no exsudato inflamatório pleural, resultado semelhante não foi observado em relação ao nível

de IL-1β (Figuras 13 e 14).

0 10

100

200

300Vehicle

BIS (50 mg/kg)

EOSl (50 mg/kg)***

Time (h)

Mu

scle

str

en

gh

t (g

)

Figura 13. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS) sobre a força muscular.

Veículo (controle), EOSl (50 mg/kg) ou BIS (50 mg/kg) foram administrado oralmente 1 h antes. Valores

representados como média ± E.P.M. (n=6, por grupo). ***p<0,001 versus controle (ANOVA uma via seguido

pelo teste de Tukey).

Sham Vehicle 50 500

5

10

15

20###

*** ***

EOSl (mg/kg) Bisabolol (mg/kg)

To

tal L

eu

ko

cyte

s (

10

6 c

ell

/ cavit

y)

Figura 14. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS) sobre a pleurisia induzida

por carragenina. Veículo (controle), EOSl (50 mg/kg) ou BIS (50 mg/kg) foram administrados oralmente 1 h

antes da injeção de carragenina. Valores foram expressos como média ± E.P.M. (n=6, por grupo). ***p<0,001

versus controle; ###

p<0,001 versus Sham (ANOVA uma via seguido pelo teste de Tukey).

Força

Mu

scu

lar

(g)

Veículo

EOSl (50mg/kg)

BIS (50mg/kg)

Tempo (h)

Tota

l d

e L

eucó

cito

s (1

06 c

élu

las/

cavid

ad

e)

Sham Veículo

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Vehicle 50 500

50

100

150

*

EOSl (mg/kg) Bisabolol (mg/kg)

TN

F-a

lph

a (

pg

/ml)

Figura 15. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS) sobre os níveis de TNF-α.

Veículo (controle), EOSl (50 mg/kg) ou BIS (50 mg/kg) foram administrados oralmente 1 h antes da injeção de

carragenina. Valores foram expressos como média ± E.P.M. (n=6, por grupo). *p<0,05 versus controle (ANOVA

uma via seguido pelo teste de Tukey).

O recrutamento celular durante a inflamação depende da liberação orquestrada de

mediadores locais que são responsáveis pelas alterações vasculares e teciduais locais, bem

como pelo recrutamento de células de defesa do hospedeiro (LUSTER; ALON; VON

ANDRIAN, 2005). A inflamação induzida pela carragenina envolve a migração celular, a

exsudação de plasma e a produção de mediadores, tais como o óxido nítrico, a prostaglandina

E2, IL-1β, IL-6 e TNF-α (LORAM et al., 2007a, 2007b). Estes mediadores demonstraram ser

capazes de recrutar leucócitos, tais como neutrófilos, em vários modelos experimentais. Uma

vez que EOSl e BIS inibiram a migração de leucócitos induzida pela injeção de carragenina,

sugere-se que estas atividades podem inibir a síntese de muitos mediadores pró-inflamatórios

cujo envolvimento na migração celular está bem estabelecido. Assim, isso parece corroborar o

uso da Stachys lavandulifolia na medicina popular para o tratamento de processos

inflamatórios, relacionados à formação de exsudação plasmática e à produção de mediadores

(RAHZANI et al., 2013).

As citocinas são pequenas proteínas reguladoras produzidas pelos glóbulos brancos e

por uma variedade de outros tipos de células. Atualmente, é amplamente aceito que as

citocinas constituem uma ligação entre lesões celulares e sinais de inflamação (DINARELLO,

1998; FACCIOLI et al., 1990; VERRI et al., 2006). A IL-1β é uma citocina pró-inflamatória

que induz a produção de outros mediadores inflamatórios envolvidos no recrutamento celular,

Veículo

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febre, liberação de proteínas de fase aguda, aumento da permeabilidade vascular e

hiperalgesia (DINARELLO, 1998).

Vehicle 50 500

50

100

150

200

250

**

EOSl (mg/kg) Bisabolol (mg/kg)

IL-1

(p

g/m

l)

Figura 16. Efeito do óleo essencial de S. lavandulifolia (EOSl) e do α-bisabolol (BIS) sobre

os níveis de IL-1β. Veículo (controle), EOSl (50 mg/kg) ou BIS (50 mg/kg) foram

administrados oralmente 1 h antes da injeção de carragenina. Valores foram expressos como

média ± E.P.M. (n=6, por grupo). **p<0,01 versus controle (ANOVA uma via seguido pelo

teste de Tukey).

Considerando-se o importante papel da IL-1β durante a resposta inflamatória, pode-se

sugerir que o efeito anti-inflamatório do EOSl, mas não o do BIS, está relacionado com a

capacidade de inibir esta citocina. Conforme previamente descrito por Maurya et al. (2014),

BIS é capaz de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6) induzida por

12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA) em macrófagos. Além disso, sabe-se que a

liberação de IL-1β precede a produção dos mediadores inflamatórios finais, tais como

prostaglandinas (CUNHA et al., 2005; VERRI et al., 2006). Tanto IL-1β como TNF-α

aumentam a expressão da proteína COX-2 com subsequente produção de prostaglandinas

(CHANG et al., 2003).

Com base na ação anti-inflamatória relevante dos fármacos anti-inflamatórios não

esteroidais e seu efeito inibitório sobre as enzimas ciclo-oxigenases, aceita-se que as

prostaglandinas possuem importante contribuição para a resposta inflamatória. Uma vez que a

inibição da liberação de IL-1β e TNF-α pode conduzir à inibição da produção de prostanóides,

é possível que EOSl e BIS atuem impedindo a produção dos mediadores finais da inflamação.

Corroborando esta hipótese, o efeito do BIS sobre os níveis de PGE2 e expressão de COX-2

Veículo

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foi demonstrado por Kim et al. (2011). Estes autores demonstraram que o BIS pode reduzir a

expressão de COX-2 e os níveis de PGE2 na pata após estímulos com adjuvante completo de

Freund (ACF). Uma vez que a via da COX-2/PGE2 é um evento chave durante diferentes

condições inflamatórias, a redução dos níveis de PGE2 e a expressão de COX-2 pode ser

responsável pelos efeitos anti-inflamatórios do BIS, o que certamente contribui para o efeito

anti-inflamatório do EOSl.

Em conjunto, os resultados aqui apresentados sugerem fortemente que o óleo essencial

de S. lavandulifolia e o BIS modulam dor central e inflamatória nos de teste de nocicepção

orofacial induzida por formalina, capsaicina e glutamato. Os mecanismos precisos pelos quais

EOSl e BIS exercem sua ação estão atualmente sob investigação, mas podem estar

relacionados à modulação da produção de moléculas pró-inflamatórias. Assim, nossos

resultados corroboram com o uso da medicina tradicional de S. lavandulifolia como

analgésico e anti-inflamatório, o que parece estar relacionado ao BIS, principal composto

presente no EOSl. Todos esses achados sugerem também que o EOSl e o BIS podem

representar ferramentas importantes para o manejo da dor orofacial e de distúrbios

inflamatórios.

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CONCLUSÃO

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6 CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho envolvendo a avaliação do

efeito antinociceptivo orofacial e anti-inflamatório do EOSl e do BIS nos leva a concluir que:

O componente majoritário presente no óleo essencial extraído das partes aéreas da S.

lavandulifolia foi o BIS;

EOSl apresentou atividade antinociceptiva em roedores na segunda fase do teste da

formalina e na nocicepção induzida por capsaicina e glutamato;

BIS demonstrou efeito antinociceptivo orofacial em todos os testes realizados;

Não houve redução da força muscular pela administração do EOSl ou do BIS em

nenhuma dose testada, havendo aumento da força após tratamento com o EOSl;

EOSl e BIS reduziram a migração leucocitária em modelo de pleurisia induzida por

carragenina em camundongos;

EOSl e BIS reduziram os níveis de TNF-α no lavado pleural de roedores com pleurisia

induzida por carragenina;

EOSl, mas não o BIS, reduziram os níveis de IL-1β no lavado pleural de camundongos

com pleurisia induzida por carragenina.

Diante destes resultados podemos afirmar que o EOSl e o BIS apresentaram-se como

importantes alternativas no tratamento álgico e anti-inflamatório, em estudo com roedores,

podendo ser direcionados como possíveis alternativas para o tratamento de dores orofaciais ou

de origem inflamatória.

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PERSPECTIVAS

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7 PERSPECTIVAS

Diante dos resultados obtidos, considerando a ação anti-inflamatória do EOSl, esta

substância apresenta-se como um candidato de interesse desenvolvimento de novas opções

terapêuticas para a dor crônica, como por exemplo dor neuropática. Ademais, este estudo

propõe o desenvolvimento de novos estudos com complexação da substância para torna-la

mais hidrofílica em meio aquoso, como sugestão para tal, temos a β – Ciclodextrina.

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REFERÊNCIAS

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ANEXO

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ANEXO - Artigo publicado no periódico Journal of Ethnopharmacology (Fator de impacto -

JCR 2015: 3,055).