UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO …...No dia 25 de fevereiro de 2011, às 08h30, na Sala 8 da...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL THACIANNA BARRETO DA COSTA INFECÇÃO, IN VITRO, POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILINA-SENSÍVEL E METICILINA-RESISTENTE: PRODUÇÃO DE IL-12, IFN-γ E IL-10 POR MACRÓFAGOS/LINFÓCITOS DE RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO NEONATAL RECIFE 2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
THACIANNA BARRETO DA COSTA
INFECÇÃO, IN VITRO, POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILINA-SENSÍVEL E METICILINA-RESISTENTE: PRODUÇÃO DE IL-12, IFN-γ E IL-10 POR
MACRÓFAGOS/LINFÓCITOS DE RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO NEONATAL
RECIFE 2011
THACIANNA BARRETO DA COSTA
INFECÇÃO, IN VITRO, POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILINA-SENSÍVEL E METICILINA-RESISTENTE: PRODUÇÃO DE IL-12, IFN-γ E IL-10 POR
MACRÓFAGOS/LINFÓCITOS DE RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO NEONATAL
Dissertação apresentada a Banca Examinadora do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Medicina Tropical.
Orientadora: Profa. Dra. Célia Maria Machado Barbosa de Castro
RECIFE 2011
Costa, Thacianna Barreto da Infecção, in vitro, por Staphylococcus aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente: produção de IL-12, IFN-γ e IL-10 por macrófagos/linfócitos de ratos submetidos à desnutrição neonatal / Thacianna Barreto da Costa . – Recife: O Autor, 2011.
xiv + 123 folhas: il., fig., gráf., quadros. ; 30 cm .
Orientador: Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2011.
Inclui bibliografia, apêndice e anexos.
1. Staphylococcus aureus. 2. Macrófago alveolar. 3. Linfócitos . 4. Citocinas. 5. Desnutrição. I. Castro, Célia Maria Machado Barbosa de. II.Título.
UFPE 616.97 CDD (20.ed.) CCS2011-058
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. José Tadeu Pinheiro
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Profa Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
TROPICAL
Profa Heloísa Ramos Lacerda de Melo
CORPO DOCENTE
Profa Ana Lúcia Coutinho Domingues
Profa Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Prof. Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Profa Elizabeth Malagueño de Santana
Profa Fábio André Brayner dos Santos
Profa Heloisa Ramos Lacerda de Melo
Profa Maria Amélia Vieira Maciel
Profa Maria do Amparo Andrade
Profa Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque
Profa Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
Profa Marli Tenório Cordeiro
Prof Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Profa Valdênia Maria Oliveira de Souza
Profa Vera Magalhães da Silveira
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO (UFPE) PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO (PROPESQ) CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE (CCS) PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL (PPGMEDTROP)
RELATÓRIO DA BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DA MESTRANDA
T H A C I A N N A B A R R E T O D A C O S T A
No dia 25 de fevereiro de 2011, às 08h30, na Sala 8 da Sede do Programa de Pós-
Graduação em Nutrição (POSNUTRI) do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Pernambuco (CCS/UFPE), os Membros Doutores: a Profa.
Dra. Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho (Presidente da Banca - UFPE), a
Profª. Dra. Ana Catarina de Souza Lopes (UFPE), e a Profa. Dra. Débora
Catarine Nepomuceno de Pontes Pessoa (UFPE), componentes da Banca
Examinadora, em sessão pública, arguiram a mestranda THACIANNA BARRETO DA
COSTA sobre a sua Dissertação intitulada “INFECÇÃO, in vitro, por
Staphylococcus aureus METICIILINA-SENSÍVEL E METICILINA-
RESISTENTE: PRODUÇÃO DE IL-12, IFN-y, E IL-10 POR
MACRÓFAGOS/LINFÓCITOS EM RATOS SUBMETIDOS À
DESNUTRIÇÃO NEONATAL”, a qual foi orientada pela Profª. Dra. Célia
Maria Machado Barbosa de Castro (UFPE). Ao final da arguição de cada membro
da Banca Examinadora e resposta da mestranda, as seguintes menções foram
publicamente fornecidas.
Aos meus pais, Edson Rodrigues e Maria do Carmo
Ao meu Irmão Victor Hugo
À minha orientadora Professora Célia Maria Machado Barbosa de Castro
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela força constante para enfrentar as dificuldades e o amor necessário para seguir o meu caminho, permitindo a realização de mais um sonho. Aos meus pais, Edson e Maria do Carmo, pelo amor incondicional, incentivo em todos os momentos, por não me deixarem desistir nunca, pelos valores passados com tanto carinho, pela dedicação e exemplo de vida. Vocês são a razão pela qual tenho lutado pelos meus sonhos. Ao meu querido irmão Victor Hugo, pelo amor incondicional, cumplicidade, paciência, por se dedicar inteiramente à realização dos meus sonhos. Cada pedacinho desse trabalho tem uma contribuição sua. Você é o meu orgulho e a minha maior fonte de alegria. À minha orientadora professora Célia Maria Machado Barbosa de Castro, pela amizade, carinho, paciência, pelo incentivo e por todos os ensinamentos. A senhora foi a minha primeira orientadora, a pessoa que me apresentou o mundo fascinante da pesquisa e que acreditou na minha capacidade mesmo nos momentos em que eu mesma não acreditava. Prof, obrigada por tudo. À minha amiga Natália Morais, por ser minha co-orientadora, minha estagiária, pelo apoio incansável durante várias horas, dias, meses e anos de experimentos e acima de tudo muito obrigada pela amizade e pelo carinho, sem você esse trabalho não seria o mesmo e as dificuldades passadas nesses dois anos de mestrado seriam mais árduas. À minha amiga Alice Bezerra pela amizade, carinho, paciência, pelas alegrias e tristezas compartilhadas e pelas várias horas de sua vida dedicadas as minhas realizações. Obrigada por tudo migas. As minhas amigas Amanda Marcelino e Marthyna Pessoa, amigas de hoje e sempre, obrigada por tudo, cada conquista dessa minha vida na universidade tem uma parcela de apoio e de carinho de cada uma de vocês. Que a nossa amizade se fortaleça cada vez mais. À Thays Miranda pela amizade, carinho, pelo apoio e por toda sua dedicação durante a realização deste trabalho. À Maiara Severo que me iniciou nesse trabalho e que mesmo distante continua sendo fonte de grandes ensinamentos e amizade. À Juliana Félix, pela amizade, carinho, incentivo, por todos os ensinamentos, pelas valiosas contribuições no presente trabalho e por toda sua dedicação ao nosso querido laboratório. À Flávia Regina, pela amizade, carinho, pelas longas conversas e por ser um exemplo de profissionalismo. A todos os professores, funcionários e colegas do Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical pela atenção, ensinamentos e apoio durante o desenvolvimento desse trabalho. As Professoras da disciplina de Microbiologia e Imunologia, Amelia Maciel, Ana Catarina Sousa Lopes, Cleide Miranda e Ivanize da Silva Aca, pelos ensinamentos e por toda atenção durante o período em que fui monitora e estagiária de docência do departamento. À minha orientadora de monitoria e estágio de docência Profª Kêsia Xisto, por contribuir para a minha formação profissional, sempre com muito carinho e generosidade.
A todos que fazem parte do Laboratório de Microbiologia do LIKA, André, Bruno, Danielly, Fátima, Guilherme Firmino, Guilherme Magalhães, Kedma, Ketlin, Renata, Rodrigo, Simone, Suzan e Thales, pelo carinho e por todo apoio durante a realização deste trabalho. Aos funcionários do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Edson, Felipe, Paulo e Rafael por todo apoio durante a realização deste trabalho. Aos funcionários do Departamento de Nutrição da UFPE, Sr. França e Sr. Paulino por todo apoio durante a realização deste trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos de mestrado. Ao Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), pelo espaço físico e toda a sua estrutura cedida. Ao Departamento de Nutrição da UFPE pela gentileza do espaço na realização dessa pesquisa. Muito Obrigada!
“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa,
nunca tem medo e nunca se arrepende”. Leonardo da Vinci
RESUMO
Staphylococcus aureus resistentes a meticilina constituem um grave problema para a saúde
mundial. Alguns fatores relacionados às condições do hospedeiro predispõem às infecções por
esses micro-organismos, dentre eles destaca-se a desnutrição. Assim, torna-se importante avaliar
repercussões da desnutrição neonatal na resposta imune frente à patógenos com perfis distintos
de resistência, como o S. aureus. Para isso foram utilizados ratos machos Wistar amamentados
por mães cuja dieta continha 17% de proteína (grupo nutrido) e 8% de proteína (grupo
desnutrido). Após desmame, ambos os grupos foram alimentados com dieta normoprotéica até a
idade adulta. Os Macrófagos alveolares foram obtidos após traqueostomia, através da coleta do
lavado broncoalveolar. Para a obtenção dos linfócitos foi realizado o procedimento cirúrgico de
punção cardíaca. Após o isolamento dos diferentes tipos celulares em placas tipo Falcon,
procedeu-se com a realização dos estímulos. Sendo especificados quatro sistemas de análise:
controle negativo, composto apenas por macrófagos/linfócitos em cultura; controle positivo,
semelhante ao anterior, adicionado de lipopolissacarídeo (sorotipo de Escherichia coli; 055:B5,
Sigma); e dois sistemas teste, composto por macrófagos/linfócitos estimulados com as cepas de
Staphylococcus aureus sensível e resistente a meticilina. A dosagem das citocinas foi realizada
pelo método de ELISA, a partir de amostras coletadas do sobrenadante das culturas após de 24
horas de incubação. Os resultados demonstram que modelo de desnutrição neonatal produziu
sequela no peso corporal e reduziu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12 e IFN-γ),
indicando que esse modelo de desnutrição pode comprometer a resolução de um processo
infeccioso. A cepa de Staphylococcus aureus resistente a meticilina, estimulou uma maior
produção de IFN-γ e IL-10 de macrófagos alveolares sugerindo estimulação imunológica mais
intensa por parte dessa cepa.
Palavras-chave: Staphylococcus aureus; Meticilina; Macrófago alveolar; Linfócitos; Citocinas;
Desnutrição.
ABSTRACT
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus are a serious health problem worldwide. Some
factors related conditions the host predispose to infections by these micro-organisms, among
which stands out malnutrition. Thus, it becomes important to assess effects of malnutrition in the
neonatal immune response against the pathogens with distinct profiles of resistance, such as S.
aureus. For this purpose male Wistar rats were suckled by mothers whose diet contained 17%
protein (fed group) and 8% protein (experimental group). After weaning, both groups were fed a
normal diet until adulthood. The alveolar macrophages were obtained after tracheostomy,
through the collection of bronchoalveolar lavage. To obtain the lymphocytes was performed the
surgical procedure for cardiac puncture. After isolation of different cell types in type plaque
Falcon, we proceeded with the completion of the stimuli. As specified four systems analysis:
negative control, consisting only of macrophages / lymphocytes in culture, positive control,
similar to the previous addition of lipopolysaccharide (serotype Escherichia coli 055: B5, Sigma)
and two test systems, composed of macrophages / lymphocytes stimulated with Staphylococcus
aureus sensitive and resistant to methicillin. The measurement of cytokines was performed by
ELISA, using samples collected from the culture supernatants after 24 hours of incubation. The
results show that model neonatal malnutrition produced sequel on body weight and reduced
production of proinflammatory cytokines (IL-12 and IFN-γ), indicating that this model of
malnutrition can affect the resolution of an infectious process. The strain of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus, has stimulated a higher production of IFN-γ and IL-10 by alveolar
macrophages suggesting more intense immune stimulation by this strain.
KEY-WORDS: Staphylococcus aureus; Methicillin; Alveolar macrophage; Lymphocytes;
Cytokines; Malnutrition.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CD Cluster de diferenciação
DN Desnutrido
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ensaio imunoenzimático)
IL Interleucina
IFN Interferon
JAK Janus de Proteína quinase
LBA Lavado broncoalveolar
LIKA Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
LPS Lipopolissacarídeo
LT Linfócito
MA Macrófagos alveolares
MRSA Staphylococcus aureus meticilina resistente
MSSA Staphylococcus aureus meticilina sensível
N Nutrido
NK
Natural Killer
NLRs
Nod Like Receptors
ON
Óxido nítrico
PAMPs
Padrões moleculares associados à patógenos
X
PBS Phosphate-buffered saline (Tampão fosfato/salina)
PRRs
Receptores reconhecedores de padrão
RLH RIG-I Like Receptors
S. aureus Staphylococcus aureus
SCC-mec Staphylococcus cassete chromosome mec (Cassette estafilocócico cromossomal mec)
SI Sistema imunológico
TGF-β Fator transformador de crescimento
Th Linfócitos T helper
TLR Receptores Toll like
TNF Fator de necrose tumoral
UFC Unidade formadora de colônia
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UTI Unidade de Terapia Intensiva
XI
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1: Organograma geral da distribuição dos grupos............................ 30
Figura 1: Colônias de Staphylococcus aureus............................................... 33
Figura 2: Inóculo bacteriano padronizado a 0,15 nm.................................... 33
Figura 3: Coleta do Lavado Broncoalveolar.................................................. 34
Figura 4: Preparação da cultura e contagem dos macrófagos alveolares...... 36
Figura 5: Punção cardíaca............................................................................ 36
Figura 6: Separação das células mononucleares........................................... 38
ARTIGO I
Figura 1: Produção de IL-12 por macrófagos alveolares de ratos adultos para os
sistemas: C-, C+, MSSA e MRSA......................................................
61
Figura 2: Produção de IL-12 por linfócitos de ratos adultos para os sistemas: C-,
C+, MSSA e MRSA...................................................................
61
Figura 3: Produção de IFN-γ por macrófagos alveolares de ratos adultos para os
sistemas: C-, C+, MSSA e MRSA......................................................
62
Figura 4: Produção de IFN-γ por linfócitos de ratos adultos para os sistemas: C-,
C+, MSSA e MRSA...................................................................
62
Figura 5: Produção de IL-10 por macrófagos de ratos adultos para os sistemas: C-,
C+, MSSA e MRSA...................................................................
63
Figura 6: Produção de IL-10 por linfócitos de ratos adultos para os sistemas: C-,
C+, MSSA e MRSA..................................................................
63
ARTIGO II
Figura 1- Evolução da curva ponderal durante a desnutrição neonatal (21 dias) e
reposição nutricional (23-90 dias) dos grupos Caseína a 17% e a
8%.....................................................................................................................
88
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição da dieta Caseína a 8% e a 17%, utilizada na
alimentação dos animais..................................................................
30
Tabela 2 - Composição da dieta padrão LABINA® (Purina do Brasil) utilizada
na alimentação dos animais.................................................
31
Tabela 3 – Características das cepas Staphylococcus aureus
utilizadas......................................................................................................
32
ARTIGO II
Tabela 1- Produção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de macrófagos
(n=24) e linfócitos (n=12)............................................................................
89
Tabela 2- Produção de IL-12 em sobrenadante de cultura de macrófagos
(n=24) e linfócitos (n=12)............................................................................
90
Tabela 3- Produção de IL-10 em sobrenadante de cultura de macrófagos
(n=24) e linfócitos (n=12)............................................................................
91
XIII
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1
2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................ 5
2.1. Sistema Imune ................................................................................................................... 6
2.1.2. Macrófagos ................................................................................................................. 6 2.1.3. Linfócitos ................................................................................................................... 8 2.1.4. Citocinas: IL-12, IFN-γ e IL-10 ................................................................................10
2.2. Staphylococcus aureus......................................................................................................14
2.2.1. Staphylococcus aureus e sistema imune ...................................................................15 2.2.2. Staphylococcus aureus meticilina resistente .............................................................16
2.3. Desnutrição .......................................................................................................................19
2.3.1 Desnutrição e sistema imune ......................................................................................20 2.3.2. Desnutrição neonatal .................................................................................................21
3. HIPÓTESES ............................................................................................................................24
4. OBJETIVOS ............................................................................................................................26
5. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................28
5.1. Desenho do estudo ................................................................................................................29
5.2. Animais e dietas ....................................................................................................................29
5.3. Cepas de Staphylococcus aureus ..........................................................................................32
5.4. Lavado broncoalveolar ..........................................................................................................34
5.5. Cultura de macrófagos alveolares .........................................................................................35
5.6. Punção Cardíaca ....................................................................................................................36
5.7. Cultura de Linfócitos ............................................................................................................36
5.8. Produção de IL-12, IFN-γ e IL-10 por macrófagos e linfócitos em cultura ..........................38
5.9. Análise estatística ..................................................................................................................38
5. 10. Considerações éticas ..........................................................................................................38
6. ARTIGO I ................................................................................................................................39
7. ARTIGO II ...............................................................................................................................64
8. CONCLUSÕES .......................................................................................................................92
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................................94
APÊNDICE ................................................................................................................................105
Planilha de evolução ponderal ...............................................................................................106
ANEXOS ...................................................................................................................................107
ANEXO 1 – Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética em Experimental Animal ................108
ANEXO 2 – Normas para publicação na revista (Artigo I) .......................................................109
ANEXO 3 – Normas para publicação na revista (Artigo II) ......................................................114
ANEXO 4 – Apresentação do Trabalho em Congresso nacional ..............................................120
ANEXO 5 – Submissão do Trabalho em Congresso internacional ...........................................122
1
1. INTRODUÇÃO
2
O Staphylococcus aureus é um micro-organismo versátil com características virulentas e
diversos mecanismos de resistência a sua disposição (KANAFANI & FOWLER, 2006). O uso
indiscriminado da meticilina e outras penicilinas semi-sintéticas, na década de 60, permitiram a
emergência do Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA), que tem se tornado um dos
mais importantes patógenos nosocomiais em todo o mundo, capaz de causar uma ampla
variedade de infecções hospitalares (STEVENS, 2003).
A bacteremia por MRSA tem sido relacionada a taxas de mortalidade significativamente
maiores do que aquela provocada pelo Staphylococcus aureus meticilina sensível (MSSA)
(COSGROVE et al., 2003). Estudos indicam que o MRSA está associado a índices maiores de
falha de tratamento e morte por mediastinite quando comparado ao MSSA (MEKONTSO-
DESSAP et al., 2001). Nesse sentido estudos sugerem que além de impor dificuldades
terapêuticas limitando as opções das drogas de escolha, fatores intrínsecos do MRSA podem
influenciar na sua virulência (SALGADO et al., 2004). Porém, ainda não está claro se o MRSA
constitui per se fator de risco independente para morbidade e mortalidade (COMBES et al.,
2004).
Estudos prévios têm relatado que uma vez ativado, os macrófagos são células efetoras da
imunidade inata em infecções por MRSA (TANAKA et al., 2004; KATAKURA et al., 2005).
Classicamente, o macrófago ativado apresenta um alto consumo de oxigênio, citotoxicidade
frente a células tumorais, além de secretar citocinas pró-inflamatórias como interleucina (IL)-1,
IL-6, fator de necrose tumoral alfa (TNF- α) e citocinas do perfil Th1 como interferon (IFN)-γ,
IL-12 e IL-18 (GOERDT & ORFANOS, 1999; MANTOVANI et al., 2002). Numa outra frente
da resposta imunológica, os linfócitos, constituem uma parte importante da resposta imune
adaptativa frente a processos infecciosos. Antígenos proteicos presentes em bactérias
extracelulares, como Staphylococcus aureus, podem ativar células T CD4 +. Estas células, por
sua vez produzem citocinas que estimulam produção de anticorpos, induzem inflamação local e
3
aumentam a atividade fagocítica e microbicida dos macrófagos (ABBAS, LICHTMAN &
PILLAI, 2008; GRÖNLUND et al., 2005).
Apesar dos avanços observados na situação da saúde brasileira, representados pelo
processo de transição epidemiológica, as doenças infecciosas ainda constituem importante causa
de óbito. Dentre os fatores associados ao aumento da susceptibilidade às infecções e à redução
da qualidade de vida, encontra-se a desnutrição (BARBOSA-SILVA & BARROS, 2002). No
período neonatal, agressões nutricionais poderão ocasionar comprometimento do sistema
imunológico, com sequelas na capacidade de defesa do indivíduo adulto (CUNNIGHAN-
RUNDLES et al., 2005) uma vez que, durante a fase pós-natal imediata em mamíferos, a função
imune adquirida se torna pela primeira vez evidente. Além disso, um padrão maduro da resposta
imune a antígenos é alcançado somente um mês após o nascimento em roedores (GHIA et al.,
1998).
Células de extrema importância no controle e resolução dos processos infecciosos, por
estarem envolvidas tanto na reposta imune inata quanto adaptativa, os macrófagos, encontram-se
em número reduzido e têm muitas das suas funções comprometidas em animais desnutridos
(MELO et al., 2008). Ao mesmo tempo, disfunções no processo de ativação dos linfócitos T
parecem ser um dos principais mecanismos que impedem a ativação completa da imunidade
durante a desnutrição. Está bem estabelecido que os canais de potássio são vitais para a ativação
de células T. Neste sentido, Fernández et al. (2005), relataram alterações significativas nesse
processo de ativação em linfócitos de ratos desnutridos.
Animais de laboratório vêm sendo empregados de forma crescente em pesquisas
envolvendo os efeitos dos graus variáveis de desnutrição nos diferentes parâmetros da resposta
imunológica, assim como na susceptibilidade às infecções (WINTERGEST et al., 2007;
KATONA & KATONA, 2008). A grande vantagem do uso destes modelos é permitir avaliação
altamente controlada de cada parâmetro nutricional o que não é possível no caso das populações
4
humanas. Camundongos e ratos adultos (isogênicos ou outbred), alimentados com quantidades
reduzidas de proteínas, vitaminas e outros nutrientes, constituem os modelos mais utilizados.
Neste contexto, a dieta à base de caseína tem destaque, sendo amplamente utilizada como dieta
controle em estudos que analisam dietas experimentais, e como dieta de escolha em estudos com
diferentes modelos de deficiência, como o modelo de desnutrição neonatal (DERIVI et al., 2002;
PERCEGONI et al., 2004; PORTO et al., 2007).
Embora as interações entre infecção e desnutrição estejam bem esclarecidas e
extensivamente revisadas (AMBRUS, 2004), são escassos os trabalhos que demonstram seu
efeito tardio pós-reposição nutricional sobre a resposta imune em quadros infecciosos
envolvendo micro-organismos resistentes a antibióticos. Grande parte dos estudos é realizada em
animais desnutridos, mas que não foram recuperados totalmente ou parcialmente da desnutrição,
deixando com isso, lacunas sobre as possíveis repercussões dessa condição sobre sistema imune
(MELO et al., 2008).
Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo analisar o comportamento de citocinas
produzidas por células imunes após processo de infecção celular, in vitro, em grupos de animais
submetidos ou não ao processo de desnutrição neonatal de forma a compreender melhor o
comportamento imunológico dessas células de defesa frente a um patógeno de importância
hospitalar como MRSA, correlacionando esse quadro com os possíveis efeitos da desnutrição
neonatal, seguida de reposição nutricional.
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
6
2.1. Sistema Imune
O conjunto de células e substâncias responsáveis pela defesa do organismo, bem como
suas respectivas ações, é denominado sistema imunológico (SI) (JUN & YANG, 2007).
Classicamente o sistema imune dos mamíferos consiste de mecanismos inatos e adaptativos que
protegem o hospedeiro de patógenos ambientais. Mecanismos inatos são a primeira linha de
defesa contra micro-organismos, funcionam independentemente de uma exposição prévia do
hospedeiro ao agente infeccioso, e incluem barreiras mecânicas (ex. pele, mucosa epitelial) e
componentes celulares, como monócito/macrófago e neutrófilos (WOLOWCZUK et al., 2008).
Diferentemente da imunidade inata, a imunidade adaptativa constitui uma resposta mais
lenta, sendo mediada por linfócitos T e B, bem como pelas células apresentadoras de antígenos
(APCs - do inglês, antigen presenting cells) (SCHILLER et al., 2006). É caracterizada por
distinguir macromoléculas e também por sua habilidade de memorização, produzindo uma
resposta secundária exacerbada frente à re-exposição ao antígeno. A imunidade adquirida
apresenta uma extraordinária capacidade de distinguir patógenos e macromoléculas através de
receptores de células T e B altamente específicos (BOLLER, 2007).
O SI é formado por estruturas individualizadas, que incluem os órgãos linfóides
primários, medula óssea e timo, os quais produzem os componentes celulares do sistema
imunológico como linfócitos e macrófagos. É constituído também pelos órgãos linfóides
secundários como linfonodos, baço, tonsilas e placas de Peyer (GLEESON, 2000).
2.1.2. Macrófagos
Os componentes celulares são uma parte essencial do complexo funcionamento da
resposta imune inata (LEWIS et al., 1992). Uma gama extensa de funções antimicrobianas e
uma ampla distribuição no organismo caracterizam o sistema de fagócitos mononucleares, o qual
é constituído de monócitos circulantes (4-6 % do total de células leucocitárias) e macrófagos
teciduais (VAN FURTH, 1992). Os macrófagos são células relativamente grandes, que medem
7
entre 25-50μm de diâmetro, apresentam núcleo irregular, possuem um ou mais nucléolos,
cromatina pouco condensada, citoesqueleto bem desenvolvido, inúmeras projeções
citoplasmáticas, grande número de lisossomos, complexo de Golgi e mitocôndrias (AUGER &
ROSS, 1992).
Essa célula de defesa constitui um dos principais componentes do sistema imunológico,
sendo uma das primeiras células a serem ativadas para participar de uma resposta imunológica,
propriamente dita, quando o organismo é exposto a fatores exógenos, como, por exemplo,
bactérias, vírus, fungos, venenos, dentre outros. Esses fagócitos podem ser ativados, portanto,
por uma variedade de estímulos e suas principais funções incluem fagocitose das partículas
estranhas, produção de citocinas e de mediadores químicos. Dessa forma, além de seus papéis na
imunidade inata, os macrófagos funcionam como células reguladoras e efetoras na resposta
imunológica humoral e celular (ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008; KAUFMANN et al.,
2004).
Macrófagos teciduais recebem uma nomenclatura em particular segundo sua localização
anatômica. Especificamente: células de Kupffer no fígado; microglia no sistema nervoso central;
células de Langerhans na pele e Macrófagos Alveolares (MA) no pulmão (VAN FURTH, 1992).
No pulmão, mais especificamente nos alvéolos, existem dois principais tipos de células
imunes residentes: células dendríticas, que medeiam à imunidade adaptativa, e macrófagos
alveolares, que possuem papel central na manutenção da estrutura normal deste órgão.
Neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e células natural killer também estão presentes, mas tendem a
ser menos frequentes na ausência de inflamação (WEGLARCZYK et al., 2004). O trato
respiratório é um alvo frequente de infecção por bactérias capazes de produzir um amplo
espectro de doenças desde lesões superficiais até severas infecções sistêmicas, no homem e em
outros animais (HAMPTON et al, 1996).
8
Um dos principais mecanismos de defesa do trato respiratório posterior contra a invasão
de micro-organismos e outras partículas inaladas depende da capacidade fagocítica dos
macrófagos alveolares (LAEGREID et al., 1988; WONG et al., 1990). Métodos de avaliação, in
vitro, da atividade dos MA são importantes ferramentas para a investigação da integridade
funcional dessas células, bem como para o estudo de interações entre os micro-organismos e o
hospedeiro (RAIDAL et al., 1998a; RAIDAL et al., 1998b).
2.1.3. Linfócitos
Existe, também, uma inter-relação entre a atividade de macrófagos e a ativação de
linfócitos durante a resposta imune específica. Na maioria dos tecidos não neurais, macrófagos
são células apresentadoras de antígenos, significando que as mesmas, ao expressarem antígenos
em suas membranas, estimulam linfócitos específicos para os antígenos em questão. Os
linfócitos secretam citocinas, as quais podem ativar macrófagos amplificando a resposta imune
(GORDON, 2001; ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008).
Linfócitos são leucócitos do tipo agranulócitos presentes no sangue em quantidades que
variam em condições fisiológicas (como idade e sexo) e patológicas (como proliferações
malignas e benignas). Correspondem à cerca de 30% das células circulantes do sangue e são as
principais células envolvidas no reconhecimento e destruição de antígenos não-próprios ou
prejudiciais ao organismo (LORENZI, 2003).
Para alcançar a fase de linfócito adulto os precursores passam por estágios intermediários,
como linfoblastos e pró-linfócitos, sendo essa diferenciação um processo regulado de maneira
complexa e dependente de fatores de crescimento e diferenciação específicos para cada linhagem
linfocitária (ZHU & EMERSON, 2002).
Após a diferenciação, os linfócitos sofrem o processo de maturação final, que pode
ocorrer na própria medula óssea ou em outro tecido. As células maduras, de acordo com seu
papel fisiológico, podem ser classificadas como linfócitos T, que sofrem maturação no timo;
9
linfócitos B e células natural killers (NK) as quais, no homem, sofrem maturação na medula
óssea (LÉCUYER & HOANG, 2004).
Os linfócitos T são encarregados da imunidade mediada por células, atuam em sincronia
com os linfócitos B, possuindo funções efetoras e reguladoras da resposta imune. São
subdivididos em linfócitos T citotóxicos (CD8+) que, quando ativados, atuam eliminando células
infectadas e em linfócitos T helper (CD4+), que atuam secretando citocinas reguladoras do
sistema imune (ADAM et al., 2003).
As células CD4+ podem ainda se diferenciar em subpopulações efetoras, incluindo as
clássicas Th1 e Th2, a mais recentemente descrita Th17 e as células T regulatórias (Treg). A
diferenciação destas células é coordenada predominantemente pelas citocinas presentes no
microambiente e, em certo ponto, pela força de interação do receptor de células T com o
antígeno (BOYTON & ALTMANN, 2002). A polarização para um perfil Th1 ocorre
principalmente em altas concentrações de IL-12 e/ou IFN-γ e está envolvida na resposta imune
contra micro-organismos intracelulares. A polarização para o perfil Th2 acontece em presença de
altos níveis de IL-4, estas células, por sua vez, produzem IL-4, IL-5 e IL-13 e são importantes
durante a imunidade humoral, no controle de infecções helmínticas e de outros patógenos
extracelulares. A diferenciação Th17 (em camundongos) ocorre em presença da IL-6 e do fator
transformador de crescimento (TGF)-β. Estas células são responsáveis pela produção de IL-17 e
IL-22 e possuem um importante papel na eliminação de infecções por fungos especialmente em
superfícies mucosas. As células Treg, por sua vez, são caracterizadas pela expressão do fator de
transcrição Foxp3 e podem ser divididas em duas categorias: as células Treg naturais (nTreg)
que surgem no timo e as células Treg induzidas (iTreg) produzidas na periferia em presença do
TGF-β (CHEN et al., 2003).
Os linfócitos B estão incumbidos da imunidade humoral, são células que, quando
ativadas, produzem anticorpos (imunoglobulinas) contra antígenos específicos, ou transformam-
10
se em células de memória, capazes de reconhecer especificamente o antígeno agressor, caso
ocorra uma posterior exposição a esse (ADAM et al., 2003).
2.1.4. Citocinas: IL-12, IFN-γ e IL-10
A iniciação bem sucedida de uma resposta imune a antígenos é dependente de diversos
elementos celulares incluindo macrófagos e células T, sendo a complexa rede de comunicação
entre essas células realizada pelas citocinas. Essas moléculas determinam a resposta inflamatória
a diferentes estímulos e promovem sinais que determinam o desencadeamento da resposta imune
adaptativa ao antígeno (MUIIOZ et al., 1995; FRANKENSTEIN et al., 2006). Em quadros
infecciosos, elas podem elevar a temperatura corpórea, o que pode ser deletério para crescimento
de organismos invasores. Na resposta inflamatória aguda, elas agem sobre o fígado, estimulando
a liberação de proteínas de fase aguda, as quais ativam o sistema complemento e a fagocitose
(OBERHOLZER et al., 2001).
Uma vez liberadas no microambiente, as citocinas transmitem sinais biológicos que
interagem com receptores de superfície celular de alta afinidade (KISHIMOTO et al., 1994).
Dessa forma diferentes citocinas atuam em seus respectivos receptores e esses receptores
utilizam várias combinações de mediadores intracelulares para induzir suas funções,
normalmente os da família Janus de poteína quinases (JAKs) e os tradutores de transcrição
(STATs) (CHENG, 2005). Assim, as citocinas fazem a comunicação entre as células produtoras
de citocinas e as células-alvo das citocinas, sendo muitas vezes referidas como mensageiros
intercelulares (BOZKURT, 2000).
Essas moléculas são essencialmente pleiotrópicas e redundantes em sua ação biológica,
cada uma exibindo uma variedade de atividades e uma mesma atividade exercida por uma
diversidade de citocinas. Sabe-se que esses mediadores são altamente interdependentes e podem
agir sobre as células-alvo de forma sinérgica, antagônica ou em cascata (MUIIOZ et al., 1995).
11
Inicialmente durante a resposta imunológica, as células apresentadoras de antígenos,
como os fagócitos e as células dentríticas produzem a IL-12 (TRINCHIERI, 1995). Esta citocina
pró-inflamatória é um regulador fundamental da rede de citocinas e, como tal, representa um
importante mediador durante processos infecciosos (CHEHIMI & TRINCHIERI, 1994).
A IL-12 é uma molécula heterodimérica constituída por duas proteínas ligadas
covalentemente, 40 kDa (p40) e 35 kDa (p35), e a sua produção requer a expressão coordenada
de ambas as subunidades (TRINCHIERI et al., 2003). O receptor da IL-12 é composto por duas
subunidades, denominadas IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2 (CHUA et al., 1994; PRESKY et al., 1996) e
sua via de sinalização intracelular envolve dois membros da família Janus Kinase, Jak2 e Tyk2,
além de diversos membros da família STAT como fatores de transcrição. Sendo a STAT4 a
principal proteína STAT envolvida, a qual é necessária para a maioria dos efeitos biológicos da
IL-12 (GOLLOB, 1998; ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008).
A produção de IL-12 é fortemente modulada por sinais de feedback. O controle negativo
da sua produção é realizado através da secreção de IL-10 pelas células Th2 (FIORENTINO et
al., 1991). O controle positivo pode ser exemplificado pela secreção do IFN-γ por células T e
Natural killer, induzidas pela IL-12 e nesse sentido o próprio IFN-γ passa a atuar estimulando a
produção de mais IL-12 por monócitos e células polimorfonucleares (MA et al.,1996).
Os interferons compreendem um grupo de citocinas, assim chamado em virtude da sua
capacidade de interferir em processos de infecção viral. Este grupo de citocinas pode ser
subdividido em três classes principais: IFN-α, IFN-β e IFN-γ. Esta última pode ser produzida e
secretada por macrófagos, células T e natural killer (BOZKURT, 2000). Nas células NK, a
produção de IFN-γ é estimulada por citocinas derivadas de macrófagos, como TNF-α e IL-12 ou
pelo próprio IFN-γ secretado (BANCROFT et al.,1991).
O INF-γ é uma proteína homodimérica que atua regulando a expressão de moléculas de
classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), a síntese induzida de óxido
12
nítrico, interações entre os leucócitos e o endotélio, além de promover a indução de componentes
da cascata do sistema complemento (JOHNSON, 2001). Essa citocina encontra-se envolvida
também na produção de metabolitos intermediários do oxigênio, como o ânion superóxido,
estimulando sua síntese a partir do sistema NADPH oxidase, por esta razão o IFN-γ é
considerado um potente ativador dos mecanismos microbicidas realizados por macrófagos
(WOODMAN et al., 1992; ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008). A ausência desses
mecanismos oxidativos está intimamente relacionada a um aumento na suscetibilidade
característica à infecção fúngica e bacteriana recorrente (GOEBEL & DINAUER, 2003).
O receptor para o IFN-γ é composto de dois polipeptídios estruturalmente homólogos,
chamados IFNγR1 e IFNγR2. IFN-γ se liga e induz a heterodimerização de IFNγR1 e IFNγR2,
os quais se associam respectivamente às cinases Jak1 e Jak2. A ativação dessas enzimas leva a
fosforilação e dimerização da STAT1, ligação dos dímeros de STAT1 as sequências GAS (locais
IFN-γ ativados) nas regiões reguladoras de vários genes, e consequente transcrição desses genes.
Os genes induzidos pelo IFN-γ codificam muitas moléculas diferentes envolvidas em aumentar
as respostas imunes adquiridas e a função efetora dos macrófagos (SKALINK, 2002; ABBAS,
LICHTMAN & PILLAI, 2008).
A atividade de citocinas pró-inflamatorias, como IFN-γ e IL-12 é regulada pelas citocinas
anti-inflamatórias. Dentre elas, pode-se citar a IL-10, o TGF-β, o antagonista de receptor para
IL-1 (IL-1ra) e receptores TNFRI e TNFRII (MAZOTI, 2009).
A IL-10 é considerada uma importante citocina anti-inflamatória pela sua capacidade de
inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias em macrófagos, monócitos e células dendriticas
(WAAL MALEFYT & BENNETT, 1991; MOORE et al., 2001). A ação da IL-10 sobre
citocinas pró-inflamatórias não consiste em apenas inibir a sua liberação, mas também em inibir
as atividades biológicas de citocinas como IL-2, TNF-α, IL-4 e IFN-γ (MAZOTI, 2009). A IL-10
13
é produzida principalmente por macrófagos ativados e células T regulatórias (O'GARRA &
VIEIRA , 2007; PESTKA et al., 2004).
A inibição da síntese de citocinas pela IL-10 e a modulação de mecanismos imunológicos
por esta citocina podem ser verificados pela sua capacidade em regular a expressão do MHC de
classe II por macrófagos e células dendríticas, inibindo assim sua capacidade de apresentação de
antígenos (WAAL MALEFYT & BENNETT, 1991; MOORE et al., 2001). Outros mecanismos
moduladores de IL-10 incluem o bloqueio da expressão de moléculas coestimulatórias como
CD80 e CD86 e a modificação da expressão de receptores para quimiocinas (SOZZANI et al.,
1998; TAKAYAMA et al., 2001).
A IL-10 é membro de uma família de citocinas diméricas ligadas não covalentemente,
cada cadeia dessa citocina contém um domínio com um feixe de seis hélices que se intercala com
a outra cadeia. O receptor de IL-10 consiste em duas cadeias, as quais se associam a cinases Jak1
e Tyk2. STAT3 é a principal molécula de sinalização induzida pela IL-10 (ABBAS,
LICHTMAN & PILLAI, 2008).
Estudos demonstram que camundongos IL-10(-/-) apresentam altas taxas de mortalidade
após sepse induzida experimentalmente (BERG et al., 1995) e desenvolvem exacerbada e
prolongada febre em resposta a injeção intraperitoneal de LPS (LEON et al., 1999). Assim, por
suas muitas atividades biológicas, especialmente por sua propriedade anti-inflamatória, a IL-10
caracteriza-se por limitar a magnitude da resposta inflamatória e imune (MAZOTI, 2009).
Para reconhecer os diferentes micro-organismos e desencadear toda cascata de
mediadores como a produção de citocinas, os diferentes tipos celulares que compõem a resposta
imune inata dispõem de Receptores Reconhecedores de Padrão (PRRs) que são capazes de
reconhecer marcadores altamente conservados, específicos para os micróbios, chamados padrões
moleculares associados à patógenos (PAMPs). Entre estes receptores estão incluidos os
receptores Toll-like (TLRs: Toll Like Receptors), Nod-Like (NLRs: Nod Like Receptors), RIG-
14
I-Like (RLHs: RIG-I Like Receptors). Diferentes classes de micro-organismos expressam
diferentes PAMPs. Essas estruturas incluem complexos que são sintetizados por micro-
organismos, mas não por células de mamíferos, como o lipopolissacarídeo (LPS) presente em
bactérias Gram-negativas, o β-glucan presente em fungos e os ácidos teicóicos encontrados em
bactérias Gram-positivas como Staphylococcus aureus (S.aureus) (ABBAS, LICHTMAN &
PILLAI, 2008; PEDRA et al., 2007).
2.2. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus permanece como um dos patógenos mais comuns em infecções
sistêmicas de origem comunitária e hospitalar. Diversos estudos epidemiológicos mostraram que
a incidência de infecções por S. aureus vem aumentando consideravelmente nas últimas décadas
em todas as faixas etárias, incluindo recém-nascidos (LADHANI et al., 1999; CORKILL et al.,
2003).
S. aureus é uma bactéria Gram-positiva, do gênero Micrococcaceae, e é assim denominada
por sua tendência a formar cachos (“staphyle” é uma expressão grega para “cacho de uva”) e sua
pigmentação dourada (“aureus” é do latim “dourado”) (STEINBERG et al., 1996). Medem
cerca de 0-1,5 µm de diâmetro, são imóveis, não esporulados, anaeróbios facultativos, porém,
desenvolvem-se melhor em atmosfera aeróbia (KLOSS & BANNERMAN, 1995;
BANNERMAN et al., 1995; KLOSS, 1997).
Esse micro-organismo é frequentemente encontrado na pele e nas fossas nasais de pessoas
saudáveis, sendo carreado por cerca de 30 a 40% da população (PEACOCK et al., 2001).
Podendo provocar doenças, que vão desde uma simples infecção (espinhas e furúnculos) até
infecções graves (pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico, septicemia e
outras (SANTOS et al., 2007).
15
2.2.1. Staphylococcus aureus e sistema imune
A análise do mecanismo de invasão do S. aureus revela que, no primeiro momento, essa
bactéria adere à pele ou à mucosa e em seguida, rompe barreiras epiteliais, comprometendo
estruturas de ligações intercelulares, como desmossomos e junções de aderência (IWATSUKI,
2006). Após transpor as barreiras físicas do organismo, o S. aureus enfrenta inicialmente a
imunidade inata e posteriormente a imunidade específica. A infecção com S. aureus estimula
uma resposta inflamatória acentuada envolvendo a migração de neutrófilos e macrófagos para o
sítio da infecção. Estas células tentam internalizar e destruir estas bactérias com o auxílio de
anticorpos específicos e componentes do sistema complemento presentes no soro (FOSTER,
2005). A resposta imune específica ocorre quando a bactéria e seus produtos são internalizados
pelos macrófagos e outras APCs e transportados para os linfonodos regionais ou para o baço,
onde células B são estimuladas a se diferenciar em plasmócitos e secretar anticorpos. Estes
anticorpos podem neutralizar as toxinas liberadas e também facilitar o processo de fagocitose
destas bactérias por opsonização (FOSTER, 2005).
Apesar de ser combatido por uma série de mecanismos imunológicos, tanto não
específicos quanto específicos, o S. aureus dispõe de uma série de estratégias de escape que lhe
permite evasão das defesas do hospedeiro. Os principais mecanismos de evasão descritos
incluem: inibição de quimiotaxia de neutrófilos (MURDOCH et al., 2000); liberação de toxinas
que destroem os leucócitos (MONTOYA & GOUAUX, 2003); resistência à fagocitose
(PALMQVIST et al., 2002); inativação do sistema complemento (ROOIJAKKERS et al., 2005)
e liberação de moléculas imunomoduladoras as quais podem determinar imunossupressão
(FOSTER, 2005).
Assim, patogenicidade do S. aureus é consequência de seus fatores de virulência, os quais
podem ser classificados, basicamente, em três seguintes categorias: a) fatores relacionados com a
aderência às células do hospedeiro ou à matriz extracelular, como a produção de moléculas de
16
fibrinogênio, fibronectina, colágeno ou enzima coagulase; b) fatores relacionados com a invasão
na célula do hospedeiro e a penetração nos tecidos ou adesão em superfícies de cateteres e
próteses, os quais incluem as proteínas (toxinas) α, β, δ, γ, δ-hemolisinas e c) fatores
relacionados com a evasão da defesa do hospedeiro como a proteína A, lipases, polissacarídeos
capsulares e diversas enterotoxinas estafilocócicas (VELÁZQUEZ, 2005).
Enterotoxinas estafilocócicas são proteínas superantigênicas produzidas pelo S. aureus,
que apresentam importante função no estabelecimento e manutenção da infecção (DINGES et
al., 2000). As toxinas superantigênicas não possuem ação lítica direta, mas causam lesões
através da elevada indução de citocinas por células T e macrófagos ativados (BALABAN &
RASOOLY, 2000). Estes superantígenos desencadeiam uma série de efeitos tóxicos, como a
síndrome do choque tóxico e as intoxicações (DINGES et al., 2000).
Esses entre outros fatores transformam o S. aureus em um incrível agente patológico,
podendo causar uma vasta gama de infecções associadas a altas taxas de mortalidade e
morbidade (OLIVEIRA et al., 2000). Sua versatilidade e alta capacidade de disseminação
causaram os relatos de clones epidêmicos em diferentes países, que se não passaram a adotar
medidas específicas e onerosas contra a disseminação tiveram que conviver com taxas
endêmicas dessas infecções (VANDENBROUCKE-GRAULS et al, 1991; BANFIELDA &
KERRB, 2005).
2.2.2. Staphylococcus aureus meticilina resistente
Staphylococcus aureus é um micro-organismo presente na história da infecção
nosocomial que rapidamente desenvolveu resistência aos antibióticos (FILE, 2000). O
surgimento dessa resistência entre isolados clínicos tem dificultado o tratamento das infecções
estafilocócicas (LEE et al., 1996 ; MICHIE et al., 2002). Os fatores de risco para a aquisição de
organismos resistentes incluem hospitalização prolongada e tratamento prévio com antibióticos
(UENO, 2001).
17
A implantação da antibioticoterapia no início da década de 1930, com o emprego da
sulfanilamida, aparentemente ditava o fim as doenças infecciosas. Contudo, ao analisarmos a
evolução da resistência do S. aureus, observamos que, já no final daquela década, surgiam as
primeiras cepas dessa bactéria resistentes àquele quimioterápico. Com a entrada da penicilina em
uso clínico, o S. aureus passou a desenvolver resistência a esse betalactâmico pela produção da
betalactamase (penicilinase), capaz de hidrolisar o anel betalactâmico da penicilina, tornando-a
inativa. Em 1944, apenas 5% dos S. aureus eram resistentes à penicilina, enquanto em 1959 essa
resistência já alcançava a taxa de 80%, sendo estendida tanto à amoxicilina como à ampicilina
(FREITAS et al., 1987; MAMISUKA, 2005; TAVARES, 2002).
Em 1960 foi descoberta uma droga do grupo das penicilinas, denominada meticilina (a
primeira penicilina semi-sintética posta em uso clínico), que não era suscetível à ação da beta-
lactamase. Logo em seguida à meticilina vieram as cefalosporinas. Porém, no início da década de
70, começaram a surgir, com muita rapidez, cepas de S. aureus com resistência à meticilina
identificadas pela sigla MRSA (S. aureus resistente à meticilina), também resistentes aos demais
beta-lactâmicos (cefalosporinas e outros). As cepas MRSA rapidamente se disseminaram em
ambientes hospitalares, limitando, assim, a antibioticoterapia de combate às estafilococcias por
S. aureus, aos glicopeptídios, vancomicina e teicoplanina (SANTOS et al., 2007).
A resistência aos antimicrobianos em S. aureus pode ser codificada cromossomicamente
ou mediada por plasmídios. Staphylococcus aureus possui dois mecanismos distintos de
resistência à meticilina: hiperprodução de beta-lactamases e a presença de uma proteína ligadora
de penicilina (PBP protein binding penicilin) alterada denominada PBP 2a (PALAVECINO,
2004).
Staphylococcus aureus possui cinco PBPs. As PBPs são enzimas que catalisam a etapa
terminal da síntese da parede bacteriana e localizam-se na membrana celular da bactéria. As PBP
1, 2 e 3 são essenciais e têm alta afinidade (sítios-alvo) com os antibióticos beta-lactâmicos,
18
unindo-se a esses por ligações covalentes. A resistência à meticilina em estafilococos devido à
produção de uma PBP adicional, anômala, denominada PBP 2a ocorre porque essa proteína
alterada apresenta baixa afinidade com os antibióticos beta-lactâmicos. A PBP 2a é codificada
por um gene cromossômico denominado mecA, que é responsável pela resistência intrínseca dos
estafilococos à meticilina e a todos os antibióticos beta-lactâmicos (CHAMBERS, 1997).
O MRSA é considerado atualmente a causa mais comum de infecção nosocomial (GOLL
& BALMER, 2007). Septicemias por MRSA estão associadas a taxas significantes de
morbidades e mortalidades, requerendo métodos rápidos de identificação e sensibilidade aos
antibióticos. Cerca de 80% das infecções estafilocócicas vêm sendo tratadas com glicopeptídeos
como vancomicina e teicoplanina. Esta é, ainda, a classe antimicrobiana de escolha no
tratamento de infecções causadas por MRSA, embora estirpes com reduzida sensibilidade à
vancomicina já tenham sido isoladas (BERNARDES et al., 2004).
Estudos relatam que as cepas de MRSA seriam mais virulentas quando comparadas ao
MSSA, por produzirem mais catalase, uma vez que um maior nível de produção dessa enzima
correlaciona-se com um maior tempo de permanência do micro-organismo no interior de
fagócitos (MANDELL, 1975; PEACOCK et al., 1981). Outros trabalhos, porém não
demonstraram diferenças entre essas cepas quando analisadas a função fagocítica de neutrófilos
e do plasma total frente à infecção por MRSA e MSSA em pacientes submetidos à cirurgia
cardíaca (MEKONTSO-DESSAP et al., 2005). Salgado e colaboradores (2004) não
demonstraram qualquer correlação entre o fenótipo de multirresistência do MRSA e sua
sobrevivência aos mecanismos fagocíticos efetores de células da reposta imune.
Schlievert (2001) demonstrou que a enterotoxina estafilocócica C é comumente
produzida por isolados de S. aureus invasivos, especialmente isolados resistentes a meticilina.
Essas enterotoxinas estimulam a proliferação das células T, resultando numa maciça ativação
dessas células e conseqüente liberação de citocinas como IL-1, IL-10, TNF-α e IFN-γ
19
(FLORQUIN et al., 1994; HASKO et al., 1998). A analise dessas enterotoxinas e seus receptores
específicos têm demonstrado que pacientes que desenvolveram glomerulonefrite, depois da
infecção com MRSA, apresentam níveis elevados de diversas citocinas, possivelmente induzidas
por superantígenos (YOH et al., 2000).
Neste contexto, estudos sugerem que além de impor dificuldades terapêuticas, limitando
as opções de drogas de escolha, fatores intrínsecos do MRSA podem influenciar sua virulência
(SALGADO et al., 2004). Contudo, estas constatações ainda não estão bem estabelecidas na
literatura, constituindo campo aberto para estudos, e sendo assim alvo de pesquisas na
atualidade.
2.3. Desnutrição
Tem sido amplamente aceito que as disfunções na resposta imune e a suscetibilidade a
diversas doenças infecto-parasitárias podem estar diretamente relacionadas ao estado nutricional
dos indivíduos (MALAFAIA et al., 2009). As doenças infecciosas, a desnutrição e o sistema
imunológico apresentam uma intrincada e complexa relação. As infecções são responsáveis por
importantes problemas de desnutrição em crianças no mundo inteiro, a desnutrição, por sua vez,
conduz a uma variedade de disfunções do sistema imune, e a imunidade ineficaz, permite que as
doenças infecciosas se desenvolvam. Estes eventos intimamente ligados podem iniciar um “ciclo
vicioso” que pode levar inexoravelmente à morte (BEISEL, 1995).
Estimativas feitas em 2000 - 2002 indicavam a existência de 852 milhões de pessoas
desnutridas, entretanto, dados recentes publicados pela Organização das Nações Unidas da
Agricultura e Alimentação (FAO) mostram que este número aumentou para 963 milhões entre os
anos de 2007 - 2008. Deste número total de pessoas desnutridas, estima-se que 815 milhões
vivam em países em desenvolvimento, particularmente no sul da Ásia e África subsaariana
(MÜLLER & KRAWINKEL, 2005; FAO, 2008).
20
O processo de desnutrição é caracterizado por um desequilíbrio e/ou uma deficiência de
nutrientes no organismo. Tais desequilíbrios são frequentemente produzidos pela deficiência
relativa de proteínas, carboidratos e gorduras como fontes de energia e micronutrientes. Essas
deficiências são seguidas de alterações fisiopatológicas que primeiro traduzem-se em prejuízo
funcional e, posteriormente, em danos bioquímicos e físicos. Inicialmente ocorre perda de peso
que, quando se torna crônica, é seguida pela parada no crescimento (GURMINI et al., 2005).
2.3.1 Desnutrição e sistema imune
As alterações imunológicas resultantes da desnutrição afetam tanto a imunidade inata
quanto a específica. A desnutrição afeta de forma acentuada a resposta imune associada às
barreiras epiteliais determinando, principalmente, achatamento e hipotrofia das vilosidades
intestinais, redução no número de linfócitos presentes nas placas de Peyer e redução na secreção
de imunoglobulina A (BEISEL, 1996).
A disponibilidade de componentes do sistema complemento e a função fagocítica
também estão comprometidas na subnutrição e isto afeta diretamente a eliminação dos
patógenos. Isto ocorre porque o sistema complemento pode destruir diretamente bactérias e vírus
e também porque os receptores para fragmentos de componentes deste sistema, os quais se
encontram na superfície das células fagocíticas, auxiliam na captura de patógenos. Tanto o nível
de C3, que é o principal componente opsônico, quanto à capacidade dos fagócitos de internalizar
e destruir patógenos encontram-se reduzidos em estados de desnutrição (SAKAMOTO et al.,
1998; CHANDRA, 2002).
A desnutrição protéica grave está claramente associada à atrofia nos órgãos linfóides
primários em recém-nascidos e crianças pequenas. As consequências dessa atrofia podem ser
devastadoras, uma vez que estes órgãos são os geradores do repertório de linfócitos T e B. A
desnutrição pode afetar ainda a hematopoiese, determinando anemia, leucopenia e também
redução na síntese de IL-6 e TNF-α (FOCK et al., 2007).
21
Pesquisas em humanos e em animais experimentais mostraram que a produção de várias
citocinas, incluindo IL-1 e IL-2 e IFN-γ estão diminuídas em estados de desnutrição energético-
protéica. Além disso, a desnutrição altera a capacidade dos linfócitos T de responder
adequadamente a diversas citocinas (CHANDRA, 1997). Os fatores nutricionais podem,
portanto, alterar os mecanismos de defesa influenciando profundamente na resistência à infecção
(KEUSCH, 2003).
2.3.2. Desnutrição neonatal
Há várias décadas tem sido apontada à relação entre nutrição no período perinatal e
repercussão na vida adulta (FORSDAHL, 1997; DELGADO et al., 1982; BARKER et al., 2002;
HALE S & OZANE, 2003). Dobbing (1968) propôs a hipótese dos períodos críticos do
desenvolvimento ao observar os efeitos irreversíveis da desnutrição perinatal sobre o cérebro.
Segundo Morgane e colaboradores (2002) durante o período crítico de crescimento e
desenvolvimento - que, em ratos, constitui o período de aleitamento -, existe uma “janela
precoce de plasticidade fisiológica”, que corresponde ao período em que diversos sistemas estão
muito susceptíveis a estímulos ambientais, uma vez que esta é uma fase de rápida proliferação e
diferenciação celular. Hales e Barker (1992) sugeriram o modelo da influência fenotípica para
explicar a associação entre agressões nos períodos críticos do desenvolvimento e eventuais
repercussões tardias, propondo que o organismo se adapta a viver em um ambiente hostil prévio.
Assim, a constatação dos períodos críticos do desenvolvimento é englobada pela hipótese da
influência fenotípica e permite a explicação das enventuais consequências tardias (OZANNE e
HALES, 1999).
A hipótese da influência fenotípica é a sugestão de uma programação epigenética do
padrão metabólico do organismo, em decorrência da submissão do indivíduo às modificações
nutricionais em períodos vulneráveis do seu desenvolvimento. Em ratos, modelos experimentais
de restrição nutricional materna, durante a lactação são usados para investigar a curto ou longo
22
prazo as consequências das agressões nutricionais no crescimento dos filhotes. Dessa forma, os
efeitos da desnutrição neonatal envolveriam um mecanismo chamado de “programming” no qual
um estímulo ambiental durante os períodos críticos de desenvolvimento tem efeito subsequente
sobre estruturas e funções dos sistemas orgânicos (FERREIRA, 2008; LUCAS et al., 1999).
Assim uma agressão nutricional durante o período perinatal pode afetar padrões
morfofuncionais permanentemente em uma variedade de sistemas fisiológicos, inclusive no
sistema imune. Uma vez que os mamíferos apresentam o desenvolvimento de componentes
essenciais do sistema imunológico no período perinatal, alguns destes estão, por exemplo,
envolvidos com a ativação de leucócitos e sua migração para o local da infecção. Por exemplo,
em ratos e camundongos, mecanismos fundamentais da resposta imune estão completamente
desenvolvidos somente no primeiro mês de vida (QUEIROS-SANTOS, 2000; FERREIRA E
SILVA, 2008). Assim nessa etapa da vida, as agressões nutricionais poderão ocasionar
comprometimento do sistema imunológico, com sequelas na capacidade de defesa do indivíduo
adulto. De forma geral, os efeitos da desnutrição são mais intensos e permanentes quanto mais
precocemente ocorrer à agressão e mais tarde for iniciada a reabilitação nutricional
(CUNNINGHAM-RUNDLES et al., 2005; GURMINI et al., 2005).
A restrição protéica em ratas lactantes pode conduzir a alterações metabólicas e fisiológicas
na prole e estas podem ser permanentes mesmo que o animal tenha livre acesso à ração normal
após o desmame (MOURA et al., 1996; RAMOS et al., 1997; PASSOS et al., 2000). Melo et al.
(2008) relataram em seu estudo que a desnutrição imposta no período neonatal, seguida de
reposição nutricional, produziu sequela no animal adulto, observada pela redução no
recrutamento de células inflamatórias para o pulmão na presença ou não de estímulo com
lipopolissacarídeo, e pelo comprometimento da atividade oxidante-antioxidante de macrófagos
alveolares antes e após endotoxemia. Além de acarretar um déficit ponderal com início ainda no
aleitamento e que persistiu até a vida adulta do animal.
23
Porto et al. (2007) utilizando a dieta caseína a 8% para promover a desnutrição no período
de lactação, seguida de reposição nutricional com a dieta padrão do biotério (Labina),
constataram uma redução do peso corporal a partir do 5o dia de vida pós-natal que se manteve
até a vida adulta. Além de uma alteração da microbiota oral consistindo em aumento no número
de bactérias. Esse aumento na quantidade de bactérias da microbiota oral, mesmo mantendo o
padrão bacteriano, pode desencadear um desequilíbrio acarretando prejuízo na resposta de defesa
do hospedeiro, constatando mais uma vez a intricada relação entre desnutrição e infecção.
Apesar de estar bem estabelecido, tanto em modelos experimentais quanto em seres
humanos que a desnutrição diminui a eficácia da resposta imune e consequentemente aumenta a
susceptibilidade aos agentes infecciosos (CALDER & JACKSON, 2000), existem poucos
trabalhos que analisam a relação entre o modelo experimental de desnutrição neonatal, com
reposição nutricional e repercussões sobre a resposta imune na vida adulta (PORTO et al., 2007;
MELO et al., 2008). Nesse sentido ainda são necessários estudos que visem elucidar possíveis
consequências, decorrentes da desnutrição em períodos considerados críticos para o
desenvolvimento, sobre o comportamento imunológico de células de defesa, frente a bactérias
com perfil de resistência. De forma a contribuir com resultados proveitosos que enriquecerão a
literatura científica e poderão dar base para definir estratégias adequadas no sentido de reduzir
índices de morbidade e mortalidade de quadros infecciosos graves provocados por bactérias
resistentes a antibióticos em indivíduos desnutridos.
24
3. HIPÓTESES
25
Os macrófagos alveolares e linfócitos infectados, in vitro, por Staphylococcus aureus
meticilina-resistente, apresentam uma diminuição dos níveis de IL-12 e IFN-γ e aumento dos
níveis de IL-10 quando comparado com a infecção celular por Staphylococcus aureus meticilina-
sensível.
Os macrófagos alveolares e linfócitos de ratos submetidos à desnutrição neonatal seguida
de reposição nutricional, após infecção, in vitro, por Staphylococcus aureus meticilina-sensível e
meticilina-resistente apresentam diminuição dos níveis de IL-12, IFN-γ e IL-10 quando
comparado com o grupo de animais nutridos.
26
4. OBJETIVOS
27
Geral: Analisar os níveis de IL-12, IFN-γ e IL-10 produzidos por macrófagos alveolares e
linfócitos após infecção celular, in vitro, com Staphylococcus aureus meticilina-sensível e
meticilina-resistente, em grupos de ratos nutridos (N) ou submetidos à desnutrição neonatal
(DN).
Específicos:
• Avaliar a repercussão das dietas aplicadas sobre a evolução ponderal dos animais;
• Verificar os níveis de IL-12, IFN-γ e IL-10 produzidos por macrófagos alveolares e
linfócitos, após infecção celular, in vitro, com Staphylococcus aureus meticilina-sensível
e meticilina-resistente, em grupos de ratos N ou DN.
• Comparar as cepas de Staphylococcus aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente,
no que diz respeito aos níveis de IL-12, IFN-γ e IL-10 produzidos por macrófagos
alveolares e linfócitos de ratos N frente à infecção celular, in vitro.
• Comparar as cepas de Staphylococcus aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente,
no que diz respeito aos níveis de IL-12, IFN-γ e IL-10 produzidos por macrófagos
alveolares e linfócitos de ratos DN frente à infecção celular, in vitro.
• Comparar entre grupos de ratos N e DN, os níveis de IL-12, IFN-γ e IL-10 produzidos
por macrófagos alveolares e linfócitos, após infecção celular, in vitro, por Staphylococcus
aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente.
28
5. MATERIAIS E MÉTODOS
29
5.1. Desenho do estudo
O presente trabalho empregou o desenho de estudo tipo experimental. Este tipo de
desenho é apontado como um dos mais pertinentes para elucidar as possíveis interações entre a
desnutrição em períodos considerados críticos para o desenvolvimento, aspectos da resposta
imune como à produção de citocinas e processos infecciosos. A opção por esse tipo de desenho
metodológico é determinada pela facilidade de formar grupos comparáveis e homogêneos em
termos de fatores de confusão, além da possibilidade de formação de grupos controle. A
comparabilidade é garantida pela homogeneidade que os grupos apresentam quanto à idade,
sexo, raça, tipo de dieta etc.
5.2. Animais e dietas
Foram utilizados 48 ratos machos, albinos, da linhagem Wistar, provenientes da colônia
de criação do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais
foram mantidos em biotério com temperatura controlada (22 ± 1ºC), ciclo claro-escuro de 12:12
h (com luzes acesas às 6 h), tiveram livre acesso à água e à ração até a data de início da
manipulação experimental. Os experimentos foram baseados nas recomendações éticas do
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e do National Institute of Health Guide
for Care and Use of Laboratory Animals.
Ratos com idade entre 90 e 120 dias foram acasalados pelo sistema poligâmico ou harém,
com a combinação de 1 macho/3 fêmeas alojados em gaiola de arame (49x27,5x19,5cm) durante
16 dias. Após esse período, as fêmeas grávidas foram transferidas para gaiolas individuais de
polipropileno (49x34x16cm), onde permaneceram até o final da gestação e por todo o período de
aleitamento. Um dia após o nascimento, filhotes machos foram mantidos com suas mães, em nº.
de seis. Neste mesmo dia, adotado como primeiro dia de vida do animal, as ninhadas foram
divididas em dois grupos (QUADRO 1):
30
1) Nutrido - constituído por filhotes amamentados por mães submetidas à dieta
contendo 17% de proteína à base de caseína utilizada como fonte protéica
(TABELA 1);
2) Desnutrido - constituído por filhotes amamentados por mães submetidas à dieta
contendo 8% de proteína à base de caseína utilizada como fonte protéica
(TABELA 1).
QUADRO 1 - Organograma geral da distribuição dos grupos.
TABELA 1 - Composição da dieta Caseína a 8% e a 17%, utilizada na alimentação dos animais.
INGREDIENTES CASEÍNA A 8% CASEÍNA A 17%
Caseína 79,3g 179,3g
Mix Vitamínico 10g 10g
Mix Mineral 35g 35g
Celulose 50g 50g
Bitartarato de |Colina 2,5g 2,5g
DL-Metionina 3,0g 3,0g
Óleo de Soja 70mL 70mL
Amido de Milho 750,2g 650,2g
Fonte: AIN - 93G.
Grupos experimentais
NUTRIDO Caseína 17%
DESNUTRIDO Caseína 8 %
31
Os animais dos dois grupos foram amamentados durante os primeiros 21 dias após o
nascimento - período de aleitamento. Nesse período foram registrados diariamente (em balança
eletrônica digital – Marte, modelo S-4000-com sensibilidade de 0,1g) os pesos corporais (PC) de
cada animal, a fim de acompanhar o peso corporal durante a manipulação nutricional. A partir do
22o dia de vida até o final do experimento, o peso corporal era aferido duas vezes por semana,
objetivando acompanhar a reposição nutricional dos animais (APÊNDICE). Após o desmame, no
22o dia de vida, os animais foram separados de suas mães, mantidos em gaiolas coletivas
contendo 3 ratos em cada gaiola, e passaram a receber Labina ®, dieta padrão do biotério
(TABELA 2).
TABELA 2 - Composição da dieta padrão LABINA® (Purina do Brasil) utilizada na
alimentação dos animais.
Enriquecimento Enriquecimento Níveis de garantia (%)
Vitamina A 20000UI Piridoxina 6mg Umidade (máx) 13
Vitamina D3 6000UI Biotina 0,1mg Proteína (min) 23
Vitamina E 30UI Colina 2000mg Extrato Etéreo 2,5
Vitamina K 6mg Manganês 50mg Matéria Fibrosa (máx) 9,0
Vitamina B12 10mg Iodo 2mg Matéria Mineral (máx) 8,0
Vitamina B2 8mg Ferro 65mg Cálcio (máx) 1.8
Pantetonato de
Cálcio 24 mg Zinco 35mg Fósforo (min) 0,0
Niacina 95mg Cobre 26mg
Tiamina 4mg Antioxidante 100mg
Ácido Fólico 0,5mg
Fonte: Agribrands do Brasil Ltda.
32
5.3. Cepas de Staphylococcus aureus
Após levantamento bibliográfico em busca de cepas de referência segundo o The
American Type Culture Collection (ATCC), foram selecionadas as cepas Staphylococcus aureus
meticilina resistente (ATCC 33591) e Staphylococcus aureus metilicina sensível (ATCC 29213)
devido ao seu perfil distinto de resistência (TABELA 3). Estas foram obtidas junto ao Instituto
de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Departamento de Microbiologia Médica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, sendo mantidas em caldo Tryptic Soy Broth (TSB), adicionado de
20% de glicerol, em câmara -80°C, até a sua utilização.
Vinte e quatro horas antes de cada experimento, as cepas foram semeadas em placas de
Ágar Sangue (ágar suplementado com sangue de carneiro à 5%) e incubadas em estufa a 37ºC
(FIGURA 1). No início do ensaio, algumas colônias foram transferidas para tubos contendo
tampão fosfato/salina (PBS- do inglês, phosphate-buffered saline) estéril, de forma a obter, com
auxílio de espectrofotômetro a 570nm, uma turbidez de aproximadamente 0,15nm (FIGURA 2).
Esta absorbância, segundo Lu, em 2004 corresponde aproximadamente à concentração de 1 x 106
Unidades Formadoras de colônias (UFC) /mL de PBS.
TABELA 3 - Características das Cepas Staphylococcus aureus utilizadas.
Número ATCC® 33591™
Organismo Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach
Isolamento Não informado
Nível de Biossegurança 2
Condições de crescimento Ágar ou Caldo Nutriente, Temperatura: 37.0°C
Comentários
Resistente à Meticilina
33
Número ATCC® 29213™
Organismo Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach
Isolamento Ferida
Nível de Biossegurança 2
Condições de crescimento Ágar Trypticase soy , Temperatura: 37.0°C
Comentários Sensibilidade à Oxacilina
Aplicação Controle de qualidade Testes de susceptibilidade a antibióticos
Fonte: ATCC
Figura 1: Colônias de S. aureus Fonte: O autor.
Figura 2: Inóculo bacteriano padronizado a 0,15 nm. Fonte: O autor.
34
5.4. Lavado broncoalveolar
O lavado broncoalveolar (LBA) foi obtido de acordo com a técnica utilizada por De
Castro et al. (2000). Sob efeito do anestésico, uretana 12.5% na proporção de 8 mL/kg i.p., o
animal foi colocado em superfície plana de parafina e em decúbito dorsal. Com o objetivo de
realizar o procedimento cirúrgico de traqueostomia, inicialmente, realizou-se uma assepsia do
animal com álcool etílico a 70%. Em seguida, retiraram-se os pêlos e a pele na porção média do
pescoço, abrindo-se e afastando-se as camadas musculares até obter acesso à traquéia (FIGURA
3A). Com uma pequena pinça, isolou-se a traquéia e, com uma tesoura foi feito um pequeno
orifício entre dois anéis traqueais na porção ventral da mesma. Na sequência, foi inserida uma
cânula plástica acoplada a uma seringa contendo 3 ml de solução de NaCl a 0,9% (soro
fisiológico-SF), à temperatura ambiente. Várias alíquotas de SF foram injetadas e imediatamente
coletadas (FIGURA 3B). O LBA recolhido foi depositado em tubo de centrífuga, tipo Falcon de
50 ml. O procedimento de coleta do material foi realizado até se obter cerca de 30ml do LBA,
para cada rato (FIGURA 3C). O LBA foi armazenado em banho de gelo e ao abrigo da luz, até o
início da etapa seguinte.
Figura 3: A) Início do procedimento cirúrgico de traqueostomia; B) Retirada do Lavado Broncoalveolar. Fonte: O autor. C) Lavado broncoalveolar coletado.
A B C
35
5.5. Cultura de macrófagos alveolares
Centrifugou-se amostras do LBA a 1500 rpm durante 15 minutos (FIGURA 4A). O
precipitado que corresponde às células foi ressuspendido em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco-
Invitrogen Corporation) contendo 3% de soro bovino fetal (Gibco-Invitrogen Corporation). A
contagem foi realizada na Câmara de Neubauer colocando-se a suspensão de células e o corante
Azul Tripan a 0.05% em uma diluição de 1:10. O Azul Tripan é um corante vital utilizado para
avaliar a viabilidade e ao mesmo tempo promover a contagem das células (FIGURA 4B). Após a
contagem, as células foram ressuspendidas em RPMI 1640 contendo soro fetal bovino a 3%.
As células foram transferidas para placas de cultura de 6 poços com 35 mm de diâmetro
cada (Falcon), em uma proporção de 106 células/mL de RPMI 1640 em cada poço (FIGURA
4C). Após 1h na incubadora a 37°C e 5% CO2, desprezou-se o sobrenadante com as células não
aderentes e adicionou-se RPMI, deixando-se as placas por mais 1h em incubadora para
estabilização das células. Após o período de estabilização das células, a cultura de macrófagos
foi estimulada com as cepas de MRSA e MSSA padronizando-se a proporção de 1 x 106 UFC
por 1 x 106 de macrófagos/ml de meio de cultura.
Na formação dos grupos foram especificados 4 sistemas: controle negativo, composto por
macrófagos em cultura (1mL/poço contendo 106 macrófagos/mL de RPMI 1640); controle
positivo, semelhante ao anterior, adicionado de 10µl de LPS (sorotipo de Escherichia coli;
055:B5, Sigma); e dois sistemas teste, MSSA (ATCC 29213), composto por macrófagos em
cultura, adicionados desta cepa, na proporção de 106 UFC/ 106 de macrófagos/mL de RPMI
1640; e MRSA (ATCC 33591), com composição semelhante, diferindo apenas quanto à cepa
adicionada.
36
Figura 4: A. Precipitado de células após centrifugação; B. Visualização da célula em Câmara de Neubauer (seta: célula corada com Azul Tripan); C. Células em placa tipo Falcon de 6 poços para cultura. Fonte: O autor.
5.6. Punção Cardíaca
Sob efeito do anestésico, uretana 12.5% na proporção de 8 mL/kg i.p., o animal foi
posicionado em decúbito dorsal sobre superfície plana e estéril, realizou-se a anti-sepsia da
região torácica, procedendo-se em seguida com a toracotomia. Exposto o coração, cerca de 3-5
mL de sangue foram aspirados por punção cardíaca, utilizando-se seringa de 5 mL e agulha
0,70x25 22G1 (BD Biosciences) (FIGURA 5). Depois de desacoplar a agulha da extremidade da
seringa, o volume sanguíneo coletado foi imediatamente transferido para tubo contendo
anticoagulante (EDTA 15%).
Figura 5: Punção cardíaca. Fonte: Araújo, 2010.
5.7. Cultura de Linfócitos
Para a cultura de linfócitos, o sangue obtido a partir da punção cardíaca (FIGURA 6A)
foi diluído em meio de cultura RPMI 1640 (5 mL de sangue + 5mL de RPMI 1640). Aos 10mL
A B C
37
da suspensão resultante foram adicionados 5mL de histopaque (1077-SIGMA), centrifugados a
1500 rpm/30 min (FIGURA 6B). Após a centrifugação a camada formada pelas células
mononucleares foi aspirada e transferida para um segundo tubo (FIGURA 6C). A este, foram
adicionados 10mL de meio de cultura RPMI 1640 e centrifugados por 10 min nas mesmas
condições anteriores. O sobrenadante foi desprezado e as células do sedimento resultante foram
ressuspendidas em meio de cultura e contadas com o auxílio do corante Azul Tripan. A
concentração foi ajustada para 1x106 células para cada 1mL de meio de cultura, sendo dispostos
1mL em cada poço de placas tipo Falcon. As mesmas foram mantidas em incubadoras durante
uma hora a 37°C em atmosfera úmida com 5% CO2.
Decorrido esse intervalo de tempo, o sobrenadante das culturas, contendo os linfócitos,
foi transferido para novos tubos, centrifugados a 1500 rpm/10 min, tiveram então seu
sobrenadante desprezado e seu precipitado ressuspendido em meio de cultura RPMI 1640, e
após nova contagem com o corante azul de tripan e novo ajuste no número de células, a cultura
foi dispensada em novas placas tipo falcon de seis poços, procedendo-se então com os diferentes
estímulos.
Foram formados 4 sistemas in vitro: controle negativo, composto por linfócitos em
cultura (1mL/poço contendo 105 linfócitos/mL de RPMI 1640); controle positivo, semelhante ao
anterior, adicionado de 10µL de LPS (sorotipo de Escherichia coli; 055:B5, Sigma); e dois
sistemas teste, MSSA (ATCC 29213), composto por linfócitos em cultura, adicionados desta
cepa, na proporção de 106 UFC/ 105 de linfócitos /mL de RPMI 1640; e MRSA (ATCC 33591),
com composição semelhante, diferindo apenas quanto à cepa adicionada.
38
Figura 6: A. Sangue coletado com anticoagulante; B. Sangue adicionado do Histopaque; C. Seta: camada de células monucleares; Fonte: Pardin, 2008.
5.8. Produção de IL-12, INF-γ e IL-10 por macrófagos alveolares e linfócitos em cultura Esta dosagem foi realizada pelo método de ELISA utilizando-se o kit Quantikine® m,
R&D Systems. As amostras foram coletadas a partir do sobrenadante da cultura de macrófagos
alveolares e linfócitos após um período de 24 horas de incubação.
5.9. Análise estatística Na comparação entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student e Mann-Whitney. Os
resultados foram representados em média ±erro padrão. A significância foi definida para p<0,05.
O software utilizado para as análises foi o SigmaStat®.
5. 10. Considerações éticas Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Centro
de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Pernambuco e seguiu as normas sugeridas
pelo Comitê Brasileiro de Experimentação Animal, com o título “Infecção, in vitro, por
staphylococcus aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente: produção de IL-12, IFN-γ e
IL-10 por macrófagos/linfócitos em ratos submetidos à desnutrição neonatal” (ANEXO).
A B C
39
6. ARTIGO I
40
Com os dados obtidos através da análise da produção de IL-12, IFN-γ e IL-10 por
macrófagos alveolares e linfócitos em ratos saudáveis e eutróficos, confeccionou-se o artigo
intitulado: “Produção de IL-12, IFN-γ e IL-10 por macrófagos alveolares/linfócitos infectados, in
vitro, por Staphylococcus aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente”. Este artigo será
submetido à revista Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical®,
versão impressa, ISSN:0037-8682, Qualis B2 nacional, medicina II.
41
ARTIGO ORIGINAL
Produção de IL-12, IFN-γ e IL-10 por macrófagos alveolares/linfócitos infectados, in vitro, por
Staphylococcus aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente
Production of IL-12, IFN-γ and IL-10 by alveolar macrophages/lymphocytes infected in vitro by
methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Thacianna Barreto da CostaI, Natália Gomes de MoraisI, Thays Miranda AlmeidaII e
Célia Maria Machado Barbosa de CastroIII
IMestrandas em Medicina Tropical pela Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.
IIIniciação cientifica do Setor de Microbiologia, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami,
Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
IIIProfa Associada 2 da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
Endereço para correspondência:
Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Setor de Microbiologia, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal de
Pernambuco, Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife-PE-Brasil. CEP: 50670-901.
Tel.: + 55 81 2126 8484. E-mail: [email protected].
Título Corrente: Produção de citocinas e infecção, in vitro, por Staphylococcus aureus.
42
RESUMO
INTRODUÇÃO: Os Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) são responsáveis por um
elevado número de infecções hospitalares. Estudos sugerem que além de impor dificuldades
terapêuticas, limitando as opções das drogas de escolha, fatores intrínsecos do MRSA podem
influenciar em sua virulência. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estudar em ratos
adultos a produção de IL-12, IFN-γ e IL-10 em cultura de macrófagos alveolares/linfócitos infectados,
in vitro, com Staphylococcus aureus sensível e resistente à meticilina.
MÉTODOS: Foram utilizados 24 ratos machos Wistar com idade entre 90 e 120 dias. Os Macrófagos
alveolares foram obtidos após traqueostomia, através da coleta do lavado broncoalveolar. Para a
obtenção dos linfócitos foi realizado o procedimento cirúrgico de punção cardíaca. Após o isolamento
dos diferentes tipos celulares em placas tipo Falcon, procedeu-se com a realização dos estímulos com
as cepas de estudo. A dosagem das citocinas foi realizada pelo método de ELISA, a partir de amostras
coletadas do sobrenadante das culturas após 24 horas de incubação.
RESULTADOS: A produção de IFN-γ e IL-10, em cultura de macrófagos alveolares mostrou-se
elevada no sistema estimulado com a cepa resistente ao ser comparado a cepa sensível.
CONCLUSÕES: Diante da importância do macrófago como célula efetora nas respostas imunes
envolvendo infecções por Staphylococcus aureus e do papel crucial das interleucinas, IFN-γ e IL-10,
no desenrolar do processo infeccioso, podemos sugerir a possibilidade de uma estimulação
imunológica mais intensa por parte da cepa resistente, no que diz respeito à resposta imunológica
desenvolvida pelo macrófago alveolar.
Palavras-Chave: Staphylococcus aureus. Meticilina. Macrófago alveolar. Linfócitos. Citocinas.
43
ABSTRACT
INTRODUCTION: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are responsible for a
large number of hospital infections. Studies suggest that in addition to imposing therapeutic
difficulties, limiting the options of the drugs of choice, intrinsic factors of MRSA may influence
its virulence. Thus, this work was to study in adult rats the production of IL-12, IFN-γ and IL-10
in cultured macrophage/lymphocytes infected in vitro with methicillin-sensitive and methicillin-
resistant Staphylococcus aureus.
METHODS: We used 24 male Wistar rats with age between 90 and 120 days. The Alveolar
macrophages were obtained after tracheostomy, through the collection of bronchoalveolar
lavage. To obtain the lymphocytes was performed the surgical procedure for cardiac puncture.
After isolation of different cell types in type plaque Falcon, we proceeded with the completion of
the stimuli with the strains studied. The measurement of cytokines was performed by ELISA,
using samples collected from the culture supernatants after 24 hours of incubation.
RESULTS: The production of IFN-γ and IL-10 in cultured alveolar macrophages was high in
the system stimulated by the resistant strain compared to strain to be sensitive.
CONCLUSIONS: Given the importance of macrophages as effector cell in immune responses
involving infections by Staphylococcus aureus and the crucial role of interleukins, IFN-γ and IL-
10, in the course in the infection process, we suggest the possibility of a more intense immune
stimulation by part of the resistant strain, with respect to the immune response developed by the
alveolar macrophage.
KEY-WORDS: Staphylococcus aureus. Methicillin. Alveolar macrophage. Lymphocytes.
Cytokines.
44
INTRODUÇÃO
Citocinas compreendem um grupo de polipeptídeos que agem como mensageiros autócrinos,
parácrinos e endócrinos, formando uma complexa rede de comunicação entre as células de defesa1,2.
Através desta rede, as citocinas definem a resposta inflamatória a diferentes estímulos e promovem
sinais que determinam o desencadeamento da resposta imune adaptativa ao antígeno2. Em quadros
infecciosos, esses mediadores podem elevar a temperatura corpórea, tendo assim um efeito deletério
para crescimento de diferentes patógenos. Além disso, promovem a ativação de macrófagos e indução
da síntese de óxido nítrico, exercendo, portanto, efeito antimicrobiano3.
Para reconhecer os diferentes micro-organismos e desencadear toda cascata de mediadores
como a produção de citocinas, os diferentes tipos celulares que compõem a resposta imune inata
dispõem de Receptores Reconhecedores de Padrão (PRRs) que são capazes de reconhecer marcadores
altamente conservados, específicos para os micróbios, chamados padrões moleculares associados à
patógenos (PAMPs)3,4. Em bactérias Gram-positivas os PAMPs instituem vários componentes da
parede celular microbiana, tais como: lipoproteínas, peptidoglicano e ácido lipoteicóico. Posterior a
fase de reconhecimento pelas células da imunidade inata, antígenos proteicos presentes em bactérias
extracelulares, como Staphylococcus aureus, podem ativar linfócitos T CD4+ e assim promover a
síntese de diversos mediadores pró-inflamatórios com a função de estimular a produção de anticorpos,
induzir e ampliar a inflamação local capacitando fagócitos para a atividade microbicida3,5.
Staphylococcus aureus é responsável por uma grande diversidade de problemas médicos,
incluindo infecções de pele e tecidos moles, infecções de sítios cirúrgicos, endocardites e bacteremias
adquiridas em hospitais6. Esta bactéria encontra-se na ponte entre o comensalismo e a patogenicidade,
tendo assim desenvolvido interessantes estratégias para enfrentar inúmeras condições adversas.
Formação de biofilme, aquisição de resistência a antibióticos diversos, bem como a enorme
flexibilidade do genoma estafilocócico, são pré-requisitos para sua sobrevivência em ambientes
45
específicos. Estas são as principais razões pelas quais os estafilococos tornaram-se importantes
patógenos nas infecções7.
Na década de 60, os S. aureus tornaram-se rapidamente resistentes à meticilina (MRSA), em
virtude da síntese de uma proteína ligadora de penicilina (PBP protein binding penicilin) alterada
denominada PBP 2a. Essa proteína é codificada pelo gene mecA, o qual confere resistência a
meticilina ou a outras penicilinas semi-sintéticas como a oxacilina8. Apesar dos contínuos esforços em
controlar a transmissão do MRSA em ambientes hospitalares, especialmente em unidades de terapia
intensiva (UTI), as infecções por esse patógeno continuam associadas a altos indices de morbidade e
mortalidade, constituindo um grave problema de saúde pública9.
Em função desses elevados índices envolvendo infecções por MRSA, muitos estudos vêm
investigando a possibilidade de fatores intrínsecos desse micro-organismos estarem influenciando sua
virulência em relação ao hospedeiro10,11. Estudos clínicos em pacientes com bacteremia, limitados por
pequenos tamanhos amostrais e coleta retrospectiva de dados, demonstraram resultados contraditórios
ao comparar infecções por Staphylococcus aureus resistentes e sensíveis a meticilina (MSSA)12,13.
Ensaios in vitro comparando cepas de MSSA e MRSA, no que diz respeito a produção de fatores de
virulência e ao seu comportamento frente aos diferentes mecanismos de defesa do hospedeiro, também
revelam dados conflitantes14,15.
Dessa forma o presente trabalho teve como objetivo avaliar possíveis diferenças entre cepas de
MRSA e MSSA, no que diz respeito à produção das citocinas IL-12, IFN-γ e IL-10 por macrófagos
alveolares e linfócitos após infecção celular, in vitro.
MÉTODOS
Animais
Foram utilizados 24 ratos machos, albinos, da linhagem Wistar, provenientes da colônia do
biotério de criação do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais
foram mantidos em biotério com temperatura controlada (22 ± 1ºC), ciclo claro-escuro de 12:12 h
46
(com luzes acesas às 6 h), tiveram livre acesso à água e à ração até a data de início da manipulação
experimental. Os experimentos foram baseados nas recomendações éticas do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e do National Institute of Health Guide for Care and Use of
Laboratory Animals.
Cepas de Staphylococcus aureus
Após levantamento bibliográfico em busca de cepas de referência segundo o The American
Type Culture Collection (ATCC), foram selecionadas as cepas Staphylococcus aureus meticilina
resistente (ATCC 33591) e Staphylococcus aureus metilicina sensível (ATCC 29213) devido ao seu
perfil distinto de resistência. Estas foram obtidas junto ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, Departamento de Microbiologia Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sendo
mantidas em caldo Tryptic Soy Broth (TSB), adicionado de 20% de glicerol, em câmara -80°C, até a
sua utilização.
Vinte e quatro horas antes de cada experimento, as cepas foram semeadas em placas de Ágar
Sangue (ágar suplementado com sangue de carneiro à 5%) e incubadas em estufa a 37ºC. No início do
ensaio, algumas colônias foram transferidas para tubos contendo tampão fosfato/salina (PBS- do
inglês, phosphate-buffered saline) estéril, de forma a obter, com auxílio de espectrofotômetro a
570nm, uma turbidez de aproximadamente 0,15nm. Esta absorbância, segundo Lu 16 corresponde
aproximadamente à concentração de 1x 106 UFC/mL de PBS.
Lavado broncoalveolar
O lavado broncoalveolar (LBA) foi obtido de acordo com a técnica utilizada por De Castro et
al.17 Para isso, os animais foram anestesiados com uretana 12.5% na proporção de 8 mL/kg i.p. O LBA
foi coletado após a introdução de salina a 0,9% através de uma cânula plástica inserida na traquéia, e
em seguida aspirada em várias alíquotas de 3 mL, sendo coletadas em tubos cônicos de polipropileno
de 50 mL (Falcon, Sigma). Recuperou-se aproximadamente 30 mL de LBA para cada animal.
47
Cultura de macrófagos alveolares
Centrifugou-se amostras do LBA a 1500 rpm durante 15 minutos. O precipitado que
corresponde às células foi ressuspendido em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen
Corporation) contendo 3% de soro bovino fetal (Gibco-Invitrogen Corporation). As células, contadas
com o auxílio do corante Azul de Tripan, foram transferidas para placas de cultura de 6 poços com 35
mm de diâmetro cada (Falcon), em uma proporção de 106 células/mL de RPMI 1640 em cada poço.
Após 1h na incubadora a 37°C e 5% CO2, desprezou-se o sobrenadante com as células não aderentes e
adicionou-se RPMI, deixando-se as placas por mais 1h em incubadora para estabilização das células.
Após o período de estabilização das células, foram especificados 4 sistemas (n=12): controle
negativo (C-), composto por macrófagos em cultura (1mL/poço contendo 106 macrófagos/mL de
RPMI 1640); controle positivo (C+), semelhante ao anterior, adicionado de 10µL de LPS (sorotipo de
Escherichia coli; 055:B5, Sigma); e dois sistemas teste, MSSA (ATCC 29213), composto por
macrófagos em cultura, adicionados desta cepa, na proporção de 106 UFC/ 106 de macrófagos /mL de
RPMI 1640; e MRSA (ATCC 33591), com composição semelhante, diferindo apenas quanto à cepa
adicionada.
Punção Cardíaca
Sob efeito do anestésico, uretana 12.5% na proporção de 8 mL/kg i.p., o animal foi posicionado
em decúbito dorsal sobre superfície plana e estéril. Realizou-se a anti-sepsia da região torácica,
procedendo-se em seguida com a toracotomia. Exposto o coração, cerca de 3-5 mL de sangue foram
aspirados por punção cardíaca, utilizando-se seringa de 5 mL e agulha 0,70x25 22G1 (BD
Biosciences). Depois de desacoplar a agulha da extremidade da seringa, o volume sanguíneo coletado
foi imediatamente transferido para tubo contendo anticoagulante (EDTA 15%).
48
Cultura de Linfócitos
Para a cultura de linfócitos, o sangue obtido a partir da punção cardíaca foi diluído em meio de
cultura RPMI 1640 (5 mL de sangue + 5mL de RPMI 1640). Aos 10mL da suspensão resultante foram
adicionados 5mL de histopaque (1077-SIGMA), centrifugados a 1500 rpm/30 min. Após a
centrifugação, a camada formada pelas células mononucleares foi aspirada e transferida para um
segundo tubo. A este, foram adicionados 10mL de meio de cultura RPMI 1640 e centrifugados por 10
min nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante foi desprezado e as células do sedimento
resultante foram ressuspendidas em meio de cultura e contadas com o auxílio do corante Azul Tripan.
A concentração foi ajustada para 1x106 células para cada 1mL de meio de cultura, sendo dispostos
1mL em cada poço de placas tipo Falcon. As mesmas foram mantidas em incubadora durante uma
hora a 37°C em atmosfera úmida com 5% CO2.
Decorrido esse intervalo de tempo, o sobrenadante das culturas, contendo os linfócitos, foi
transferido para novos tubos, centrifugados a 1500 rpm/10 min, tiveram então seu sobrenadante
desprezado e seu precipitado ressuspendido em meio de cultura RPMI 1640, e após nova contagem
com o corante azul de tripan e novo ajuste no número de células, a cultura foi dispensada em novas
placas tipo falcon de seis poços, procedendo-se então com os diferentes estímulos.
Foram formados 4 sistemas in vitro (n=6): controle negativo (C-), composto por linfócitos em
cultura (1mL/poço contendo 105 linfócitos/mL de RPMI 1640); controle positivo (C+), semelhante ao
anterior, adicionado de 10µL de LPS (sorotipo de Escherichia coli; 055:B5, Sigma); e dois sistemas
teste, MSSA (ATCC 29213), composto por linfócitos em cultura, adicionados desta cepa, na proporção
de 106 UFC/ 105 de linfócitos/mL de RPMI 1640; e MRSA (ATCC 33591), com composição
semelhante, diferindo apenas quanto à cepa adicionada.
49
Produção de IL-12, IFN-γ, e IL-10 por macrófagos alveolares e linfócitos em cultura
Esta dosagem foi realizada pelo método de ELISA utilizando-se o kit Quantikine® m, R&D
Systems. As amostras foram coletadas a partir do sobrenadante da cultura de macrófagos alveolares e
linfócitos após um período de 24 horas de incubação.
Análise estatística
Na comparação entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student para os dados paramétricos e o
teste de Mann-Whitney para os dados não paramétricos. Os resultados foram representados em média
± erro-padrão. A significância foi definida para p<0.05.
RESULTADOS
Dosagem de IL-12 em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos
Os níveis de IL-12 em sobrenadante de cultura de macrófagos alveolares foram mais elevados
no sistema C+ (144,44±4,58) quando comparado ao C-(126,74±4,65; p=0,013). De forma semelhante
os sistemas MSSA (147,73±4,18; p=0,003) e MRSA(139,47±2,54; p=0,009) apresentaram níveis
maiores dessa citocina quando comparado ao controle negativo. Não foram observadas diferenças
estatísticas entre os referidos sistemas teste (p=0,106) (Figura 1).
A produção de IL-12 em sobrenadante de cultura de linfócitos mostrou-se aumentada no
sistema C+(363,5±19) quando comparada ao C-(317,89±5,92; p= 0,045). Da mesma forma os sistemas
MSSA (389,82±27,8; p=0,015) e MRSA (412,63±38,1; p=0,015) apresentaram níveis maiores dessa
citocina quando comparados ao controle negativo. Não foi encontrada diferença entre os referidos
sistemas teste (p=0,639) (Figura 2).
Dosagem de IFN- γ em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos
Os níveis de IFN-γ em cultura de macrófagos alveolares foram mais elevados no sistema
C+(213,59±9,75) quando comparado ao C-(142,75±13,8; p=<0,001). De forma semelhante o sistema
MRSA (215,13±9,43) apresentou níveis maiores dessa citocina quando comparado ao C- (p=<0,001) e
50
ao MSSA (156,38±10,3; p=<0,001). No entanto não foram observadas diferenças estatísticas entre o
MSSA e C- (p=0,312) (Figura 3).
A produção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de linfócitos mostrou-se aumentada no
sistema C+ (294,01±7,99) quando comparado ao C- (259,59±4,32; p=0,004). Não foram observadas
diferenças estatísticas quando os dois sistemas testes MSSA (271,7±7,49; p= 0,192) e MRSA
(269,15±8,63; p=0,345) foram comparados ao controle negativo. Também não foi encontrada
diferença entre os referidos sistemas teste (p= 0,828) (Figura 4).
Dosagem de IL-10 em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos
A IL-10 em cultura de macrófagos alveolares foi produzida em níveis mais elevados no sistema
C+ (173,83±3,05) quando comparado ao C-(154,14±3,12; p=<0,001). O sistema MSSA (179,97±3,89)
produziu níveis mais elevados que o C- (p=<0,001). De forma semelhante o sistema MRSA
(198,17±4) apresentou valores maiores dessa interleucina quando comparado com o C- (p=<0,001) e
MSSA (p= 0,012) (Figura 5).
A análise dos níveis de IL-10 em sobrenadante de cultura de linfócitos revelou níveis maiores
dessa citocina no C+ (347,49±3,38) quando comparado ao C- (334,76±1,2; p=0,005). Da mesma forma
os sistemas testes MSSA (365,6±7,57; p=0,002) e MRSA (377,99±1,4; p=<0,001) apresentaram
valores mais elevados que o controle negativo. Não foi encontrada diferença entre os referidos
sistemas teste (p= 0,485) (Figura 6).
DISCUSSÃO
De uma forma geral no início de um processo infeccioso a IL-12 induz um aumento na
produção de IFN-γ por células Natual killer e células T ou linfócitos T. O IFN-γ por sua vez ativa
fagócitos e aumenta a sua capacidade de produzir IL-12 em níveis mais elevados. Diferentemente a IL-
10 e outras citocinas associadas ao perfil Th2 são potentes reguladores negativos da produção e
atividade de IL-12. Assim, observa-se em vários modelos de doenças infecciosas que o equilíbrio entre
51
a IL-12 e IL-10 pode ter um impacto significativo sobre a progressão e resolução de processos
infecciosos18,19.
No presente estudo a análise da produção de IL-12 em cultura de macrófagos alveolares mostra
uma maior produção dessa citocina no controle positivo ao ser comparado ao controle negativo, assim
como, níveis maiores de IL-12 nos sistemas estimulados com cepas sensíveis e resistentes quando
comparado ao controle negativo. Não constatando-se diferença entre as referidas cepas. O mesmo
padrão de resposta foi observado quando analisados os níveis dessa citocina em cultura de linfócitos.
Corroborando com esses resultados Lawrence & Nauciel20, demonstraram que peptideoglicano
presente no Staphylococcus aureus induz a produção de IL-12 por macrófagos. Esses dados
assemelham-se também aqueles obtidos por Scott et al.21 os quais descreveram em seu estudo,
realizado com células dendríticas, que patógenos como o S.aureus, são capazes de induzir uma maior
produção de IL-12. De forma semelhante, Bost et al.22 detectaram níveis maiores de IL-12 em cultura
de osteoblastos infectadas com S. aureus.
Estudos demonstram que, in vivo e in vitro, a primeira resposta das células T a enterotoxina
estafilocócica B, é caracterizada por um padrão de citocinas Th1, com exacerbada expressão de IL-12,
TNF-α e IFN-γ versus uma baixa expressão de IL-10, assemelhando-se a uma variedade de infecções
por patógenos intracelulares23.
Diferentes estudos revelam que cepas de MRSA produzem altas concentrações das
enterotoxinas estafilocócicas B e C24,25, essas enterotoxinas têm alto potencial antigênico, o que
poderia ter conduzido à altas concentrações de citocinas, principalmente do perfil inflamatório, por
parte da cepa resistente quando comparada a sensível em cultura de linfócitos. Esse tipo de resposta
não foi evidenciada em nosso estudo, possivelmente, pela não produção dessas enterotoxinas na cepa
de MRSA utilizada no presente estudo como estímulo ou pela produção equivalente por parte da cepa
sensível.
52
No que diz respeito à produção de IFN-γ em cultura de macrófagos alveolares observamos que
o sistema estimulado com LPS, controle positivo, apresentou níveis maiores dessa citocina quando
comparado ao controle negativo. De forma semelhante, o sistema estimulado pela cepa resistente
apresentou níveis maiores dessa citocina ao ser comparado ao controle negativo e a cepa sensível. Não
sendo observada diferença entre os sistemas MSSA e controle negativo. Esses resultados sugerem uma
maior indução da produção dessa citocina por parte da cepa resistente, acompanhada de uma produção
menos expressiva por parte da cepa sensível a qual se assemelhou aos níveis basais produzidos pelo
controle negativo. Diversos estudos descrevem os macrófagos como células efetoras da imunidade
inata em infecções por MRSA26,27. Dessa forma, a sua resposta frente à cepa resistente pode ser
representativa de uma maior potencialidade dessa cepa em induzir a produção de IFN-γ. Esses
resultados vão de encontro a alguns estudos que analisaram outros parâmetros imunológicos frente às
referidas cepas, os quais não detectaram quaisquer diferenças no percentual de fagocitose por
monócitos/macrófagos e neutrófilos28,29, tampouco na produção de radicais livres por macrófagos
alveolares quando comparadas às cepas sensíveis e resistentes à meticilina29.
Analisando a produção de IFN-γ em cultura de linfócitos, os resultados do presente estudo
revelam que, apenas o sistema que constituiu o controle positivo, produziu níveis maiores dessa
citocina quando comparado ao controle negativo. As demais comparações realizadas entre as cepas
bacterianas em estudo e os respectivos controles adotados não diferiram entre si. Estes dados podem
ser justificados em parte pelos estudos de Yoshihara et al.30, os quais verificaram que IFN-γ é
produzido especificamente por células Natural Killer e não por células T, após estímulo com S.aureus.
Entretanto, estudos envolvendo infecções por esse micro-organismo descrevem que a fase inicial da
infecção disseminada por S. aureus é caracterizada pela produção endógena de citocinas inflamatórias,
como TNF-α e IFN-γ31.
IFN-γ é considerada uma citocina reguladora fundamental produzida principalmente por
linfócitos T, sendo caracterizada por orquestrar tanto a resposta inata como a adquirida frente às
53
infecções estafilocócicas32.Assim, era de se esperar que houvesse níveis elevados de IFN-γ em cultura
de linfócitos estimuladas in vitro, com esse patógeno, independente da bactéria ter ou não um perfil de
resistência aos antimicrobianos. Possivelmente o período de 24 horas, escolhido para a análise dessa
citocina, não tenha sido adequado para se verificar o real padrão da produção dessa citocina em cultura
de linfócitos estimulada com S. aureus.
A análise da produção de IL-10 em sobrenadante de cultura de macrófagos alveolares revelou
níveis maiores dessa citocina no controle positivo quando comparado ao controle negativo. De forma
semelhante, os sistemas estimulados pelas cepas sensível e resistente a meticilina, apresentaram níveis
mais elevados de IL-10 ao serem comparados ao controle negativo. Analisando a produção dessa
interleucina em cultura de linfócitos, observamos o mesmo padrão de resposta com exceção da
diferença entre as cepas sensível e resistente, esta observada apenas em cultura de macrófagos
alveolares. Ambas as cepas estudadas apresentaram níveis maiores dessa interleucina quando
comparadas ao controle negativo, demonstrando uma participação ativa da IL-10 nas infecções por
S.aureus. De acordo com Wang et al.33 culturas de monócitos e linfócitos T estimuladas com
peptidoglicano e ácido lipoteicóico isolados de Staphylococcus aureus induzem a produção de IL-10.
Estudos mostram claramente que a ausência de IL-10 agrava a frequência e a gravidade de quadros de
artrite induzida por S. aureus34.
Essa interleucina está envolvida em diversos mecanismos de regulação da resposta
inflamatória, de modo a proteger o hospedeiro contra possíveis danos provocados pela resposta
imune35. Do ponto de vista do hospedeiro, níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, apesar de
estarem atrelados à eliminação do patógeno, podem ser prejudiciais, em virtude dos efeitos pirogênicos
e deletérios. Da mesma forma, uma elevação posterior nos níveis de citocinas anti-inflamatórias, como
a IL-10, podem ter tanto implicações benéficas, por atuarem proporcionando um equilíbrio do perfil
imunológico, como implicações prejudiciais por se relacionarem com cronicidade da doença.
54
Assim, existem muitos questionamentos no que diz respeito ao papel da IL-10 no decorrer de
processos infecciosos. De acordo com Roilides et al. 36 a IL-10 atua em infecções por S. aureus
reduzindo a atividade bactericida de monócitos humanos infectados, apesar de não alterar a sua
capacidade fagocitica. Partindo desse princípio, a IL-10 prolongaria o tempo de permanência do
patógeno no hospedeiro. E é nesse sentido que sugerimos uma possível virulência exacerbada da cepa
resistente à meticilina quando comparada à cepa sensível, visto que no presente estudo o sistema
estimulado com cepa resistente produziu níveis maiores dessa citocina, em cultura de macrófagos
alveolares.
Nesse contexto diversos estudos têm analisado possíveis diferenças no perfil de virulência entre
cepas de S. aureus sensíveis e resistentes à meticilina. Alguns autores relataram que isolados
nosocomiais de MRSA produzem quantidades maiores de coagulase37 e catalase14 do que linhagens
sensíveis a meticilina. O conteúdo da catalase do S. aureus se correlaciona bem com a sobrevivência
dos micro-organismos no interior dos fagócitos38 e, portanto, pode representar um importante fator de
virulência. Jordens et al.39 relataram que a enterotoxina A, considerada mais potente que as
enterotoxinas estafilocócicas B e C, é produzida por MRSA, mas não por MSSA40. Em contrapartida,
outros estudos descrevem que a produção de toxinas independe do perfil de resistência41 e que fatores
de virulência como a produção de hemolisinas42 não diferem entre cepas sensíveis e resistentes à
meticilina. Como se pode perceber, apesar da diversa gama de estudos existentes, a relação entre
possíveis diferenças no que diz respeito aos fatores de virulência das cepas de MSSA e MRSA, e
conseqüentes influências sobre a resposta imune ainda é muito controversa.
É importante ressaltar que para os dois tipos de células estudadas na presente pesquisa, o
sistema estimulado com LPS apresentou níveis mais elevados das diferentes citocinas dosadas quando
comparado ao controle negativo. Da mesma forma, diferentes estudos, in vivo e in vitro, também
constataram níveis maiores das referidas citocinas após estímulo com LPS43,35. De maneira geral, após
estímulo com essa endotoxina ocorre uma produção intensa de citocinas pró-inflamatórias que
55
posteriormente é seguida por aumento da síntese de IL-1021. A diferença detectada entre os controles
adotados pelo estudo confere uma segurança maior às demais análises realizadas, visto que, o LPS é
reconhecidamente um ativador em potencial dos macrófagos.
No presente estudo, podemos concluir que apenas a produção de IFN-γ e IL-10, em cultura de
macrófagos alveolares, diferiu entre as cepas em estudo. Diante da importância do macrófago como
célula efetora nas respostas imunes envolvendo infecções por S. aureus e do papel crucial dessas
interleucinas no desenrolar do processo infeccioso, podemos sugerir a possibilidade de uma
estimulação imunológica mais intensa, por parte da cepa resistente à nível de macrófago alveolar.
Entretanto é importante estar atento a necessidade de investigações mais aprofundadas, como o
envolvimento de um maior número de parâmetros imunológicos, no sentido de caracterizar, de forma
mais abrangente, o real padrão da resposta imune frente à esse tipo de patógeno.
56
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61
Figura 1: Produção de IL-12 por macrófagos alveolares de ratos adultos para os sistemas:
C-, C+, MSSA e MRSA. Teste t de Student. Valores expressos como média ± erro padrão
(n= 12). *p<0,05 na comparação com C-.
Figura 2: Produção de IL-12 por linfócitos de ratos adultos para os sistemas: C-, C+,
MSSA e MRSA. Teste t de Student. Valores expressos como média ± erro padrão (n=
6).*p<0,05 na comparação com C-.
62
Figura 3: Produção de IFN-γ por macrófagos alveolares de ratos adultos para os
sistemas: C-, C+, MSSA e MRSA. Teste t de Student. Valores expressos como média ±
erro padrão (n= 12). *p<0,05 na comparação com C-. #p<0,05 na comparação com
MSSA.
Figura 4: Produção de IFN-γ por linfócitos de ratos adultos para os sistemas: C-, C+,
MSSA e MRSA. Teste t de Student. Valores expressos como média ± erro padrão (n= 6).
*p<0,05 na comparação com C-.
63
Figura 5: Produção de IL-10 por macrófagos alveolares de ratos adultos para os sistemas:
C-, C+, MSSA e MRSA. Teste t de Student. Valores expressos como média ± erro padrão
(n= 12). *p<0,05 na comparação com C-. #p<0,05 na comparação com MSSA.
Figura 6: Produção de IL-10 por linfócitos de ratos adultos para os sistemas: C-, C+,
MSSA e MRSA. Teste t de Student. Valores expressos como média ± erro padrão (n= 6).
*p<0,05 na comparação com C-.
64
7. ARTIGO II
65
Com os dados obtidos através da análise da produção de IFN-γ, IL-12 e IL-10 por
macrófagos alveolares e linfócitos em ratos nutridos e desnutridos durante o período de lactação,
confeccionou-se o artigo intitulado: “Desnutrição neonatal e produção de IFN-γ, IL-12 e IL-10
por macrófagos/linfócitos: estudo da infecção celular, in vitro, por Staphylococcus aureus
meticilina sensível e meticilina resistente”. Este artigo será submetido à revista Revista de
Nutrição®, versão impressa ISSN 1415-5273, Qualis B2 nacional, medicina II.
66
ARTIGO ORIGINAL
Desnutrição neonatal e produção de IFN-γ, IL-12 e IL-10 por macrófagos/linfócitos: estudo da
infecção celular, in vitro, por Staphylococcus aureus meticilina sensível e meticilina resistente
Early malnutrition and production of IFN-γ, IL-12 and IL-10 by macrophages/ lymphocytes:
study of in vitro cellular infection by methicillin sensitive and methicillin resistant
Staphylococcus aureus
Thacianna Barreto da CostaI; Natália Gomes de MoraisI;Thays Miranda de AlmeidaII; Célia
Maria Machado Barbosa de CastroIII
I Mestrandas em Medicina Tropical pela Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. II Iniciação cientifica do Setor de Microbiologia, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami,
Universidade Federal de Pernambuco – UFPE III Profa Associada 2 da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
*Endereço para correspondência:
Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Setor de Microbiologia, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal de
Pernambuco, Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife-PE-Brasil. CEP: 50670-901.
Tel.: + 55 81 2126 8484. E-mail: [email protected].
Título abreviado: Desnutrição neonatal e citocinas
Short title: Neonatal malnutrition and cytokines
1. Artigo elaborado a partir da dissertação de COSTA, T.B., intitulada “Infecção, in vitro, por
Staphylococcus aureus meticilina-sensível e meticilina-resistente: produção de IL-12, INF-γ e
IL-10 por macrófagos/linfócitos em ratos submetidos à desnutrição neonatal”. Universidade
Federal de Pernambuco, 2011, páginas -123.
67
RESUMO
OBJETIVO: Estudar em ratos adultos e submetidos à desnutrição neonatal, a produção de IFN-
γ, IL-12 e IL-10 em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos infectados, in vitro, com
Staphylococcus aureus sensível/resistente à meticilina. MÉTODOS: Ratos machos Wistar
foram amamentados por mães cuja dieta continha 17% de proteína (grupo nutrido) e 8% de
proteína (grupo desnutrido). Após desmame, ambos os grupos foram alimentados com dieta
normoprotéica. Os macrófagos foram obtidos após traqueostomia, através da coleta do lavado
broncoalveolar. Para a obtenção dos linfócitos foi realizado o procedimento cirúrgico de punção
cardíaca. Após o isolamento dos diferentes tipos celulares, procedeu-se com a realização dos
estímulos. A dosagem das citocinas foi realizada pelo método de ELISA, a partir de amostras
coletadas do sobrenadante das culturas após 24 horas de incubação. RESULTADOS: A
desnutrição acarretou diminuição do crescimento ponderal, redução na produção de IFN-γ em
cultura de macrófagos alveolares e linfócitos e diminuição na produção de IL-12 em cultura de
macrófagos alveolares. Apenas a produção de IFN-γ e IL-10 em cultura de macrófagos
alveolares apresentou diferença entre as cepas analisadas, em ambos os grupos estudados.
CONCLUSÕES: O modelo de desnutrição neonatal produziu sequela no peso corporal e
reduziu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12 e IFN-γ), indicando que esse modelo de
desnutrição pode comprometer a resolução de um processo infeccioso. A cepa de Staphylococcus
aureus resistente a meticilina, estimulou uma maior produção de IFN-γ e IL-10 por macrófagos
alveolares sugerindo estimulação imunológica mais intensa, por parte dessa cepa, nesse tipo
celular em particular.
Termos de indexação: desnutrição; Staphylococcus aureus; meticilina; macrófago alveolar;
linfócitos; citocinas.
68
ABSTRACT
OBJECTIVE: The aim of this work was study in adult rats submitted to neonatal malnutrition,
the production of IFN-γ, IL-12 and IL-10 in cultured macrophages and lymphocytes infected in
vitro with Staphylococcus aureus sensitive / resistant to methicillin. METHODS: Male Wistar
rats were suckled by mothers whose diet contained 17% protein (fed group) and 8% protein
(experimental group). After weaning, both groups were fed a normal diet. The macrophages
were obtained after tracheostomy, through the collection of bronchoalveolar lavage. To obtain
the lymphocytes was performed the surgical procedure for cardiac puncture. After isolation of
different cell types, we proceeded with the completion of the stimuli. The measurement of
cytokines was performed by ELISA, using samples collected from the culture supernatants after
24 hours of incubation. RESULTS: Malnutrition let to decreased weight growth, reduction in
IFN-γ in cultured alveolar macrophages and lymphocytes and decreased production of IL-12 in
cultured alveolar macrophages. Only IFN-γ and IL-10 in cultured alveolar macrophages was
different between the strains analyzed in both groups. CONCLUSIONS: The model of neonatal
malnutrition sequel produced in body weight and reduced production of proinflammatory
cytokines (IL-12 and IFN-γ), indicating that this model of malnutrition can affect the resolution
of an infectious process. The strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, has
stimulated a higher production of IFN-γ and IL-10 by alveolar macrophages suggesting immune
stimulation more intense by this strain, this cell type in particular.
Indexing terms: malnutrition; Staphylococcus aureus; methicillin; alveolar macrophage;
lymphocytes; cytokine.
69
INTRODUÇÃO
O processo de desnutrição é caracterizado por um desequilíbrio e/ou uma deficiência de
nutrientes no organismo1. Incidindo no período de aleitamento, a deficiência nutricional pode ser
um agente estressor indutor de alterações tardias na resposta imunológica2, uma vez que em
humanos, eventos importantes para a imunocompetência são iniciados ainda no embrião e
continuam na primeira semana de vida. Em ratos, a competência imunológica também é
adquirida gradualmente após o nascimento3. Nesse sentido, os efeitos da desnutrição são mais
intensos e permanentes quanto mais precocemente ocorrer à agressão e mais tarde for iniciada a
reabilitação nutricional1.
Diferentes aspectos, tais como número de células dendríticas, produção de citocinas e
capacidade de desencadear proliferação de linfócitos T de memória encontram-se
significativamente afetados durante a subnutrição4. Células de extrema importância no controle
e resolução dos processos infecciosos, por estarem envolvidas tanto na reposta imune inata
quanto adaptativa, os macrófagos, encontram-se em número reduzido e têm muitas das suas
funções comprometidas em animais desnutridos5.
No pulmão, são encontrados os macrófagos alveolares, que possuem papel central na
manutenção da estrutura normal deste órgão e são de grande importância para a defesa contra
micro-organismos que comumente infectam o homem através das vias respiratórias6. Esses
fagócitos atuam como células acessórias para os linfócitos e em resposta à infecção liberam um
grupo estruturalmente diferenciado de moléculas que incluem as interleucinas: IL-1, IL-10, IL-
12, fator de necrose tumoral (TNF-α), dentre outras 7.
A relação de causalidade entre desnutrição, supressão imunológica e
infecção, tem sido alvo frequente de pesquisas na atualidade8. Dados epidemiológicos revelam
que a relação da deficiência nutricional com maior mortalidade se deve ao fato da mesma
aumentar a susceptibilidade aos agentes infecciosos e também a gravidade destas infecções9. No
70
Brasil, o Staphylococcus aureus é uma das bactérias mais frequentemente isoladas em infecções
hospitalares, trata-se de um micro-organismo com características virulentas e diversos
mecanismos de resistência a sua disposição10.
O uso indiscriminado da meticilina e outras penicilinas semi-sintéticas, na década de 60,
permitiu a emergência do Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA), que tem se
tornado o mais importante patógeno nosocomial em todo o mundo, capaz de causar uma ampla
variedade de infecções11. Estudos sugerem que além de impor dificuldades terapêuticas
limitando as opções das drogas de escolha, fatores intrínsecos do MRSA podem influenciar na
sua virulência12. Porém, ainda há muito a ser esclarecido no que diz respeito à gravidade dos
quadros infecciosos envolvendo esse micro-organismo.
Apesar de estar bem estabelecido, tanto em modelos experimentais quanto em seres
humanos que a desnutrição diminui a eficácia da resposta imune e consequentemente aumenta a
susceptibilidade aos agentes infecciosos13, são escassos os trabalhos que demonstram seu efeito
tardio pós-reposição nutricional sobre a resposta imune em quadros infecciosos envolvendo
micro-organismos resistentes a antibióticos. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo
avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre o comportamento de citocinas produzidas por
células imunes após processo de infecção celular, in vitro, analisando possíveis diferenças no
padrão dessas citocinas entre cepas sensíveis e resistentes a meticilina.
MÉTODOS
Animais e dietas
Foram utilizados 48 ratos machos, albinos, da linhagem Wistar, provenientes da colônia
de criação do biotério Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco. Os
animais foram mantidos em biotério com temperatura controlada (22 ± 1ºC), ciclo claro-escuro
de 12:12 h (com luzes acesas às 6 h), tiveram livre acesso à água e à ração até a data de início da
manipulação experimental. Os experimentos foram baseados nas recomendações éticas do
71
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e do National Institute of Health Guide
for Care and Use of Laboratory Animals.
Um dia após o nascimento, filhotes machos foram mantidos com suas mães, em nº. de
seis. Neste mesmo dia, adotado como primeiro dia de vida do animal, as ninhadas foram
divididas em dois grupos: Nutrido - constituído por filhotes amamentados por mães submetidas à
dieta contendo 17% de proteína à base de caseína utilizada como fonte protéica (AIN93G);
Desnutrido - constituído por filhotes amamentados por mães submetidas à dieta contendo 8% de
proteína à base de caseína utilizada como fonte protéica (AIN93G).
Os animais dos dois grupos foram amamentados durante os primeiros 21 dias após o
nascimento - período de aleitamento. Nesse período foram registrados diariamente (em balança
eletrônica digital – Marte, modelo S-4000-com sensibilidade de 0,1g) os pesos corporais (PC) de
cada animal, a fim de acompanhar o peso corporal durante a manipulação nutricional. A partir do
22o dia de vida até o final do experimento, o peso corporal foi aferido duas vezes por semana,
objetivando acompanhar a reposição nutricional dos animais. Após o desmame, no 22o dia de
vida, os animais foram separados de suas mães, mantidos em gaiolas coletivas contendo 3 ratos
em cada gaiola, e passaram a receber Labina ®, dieta contendo 23% de proteína (Labina-Purina
do Brasil).
Cepas de Staphylococcus aureus
Após levantamento bibliográfico em busca de cepas de referência segundo o The
American Type Culture Collection (ATCC), foram selecionadas as cepas Staphylococcus aureus
meticilina resistente (ATCC 33591) e Staphylococcus aureus metilicina sensível (ATCC 29213)
devido ao seu perfil distinto de resistência. Estas foram obtidas junto ao Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Departamento de Microbiologia Médica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, sendo mantidas em caldo Tryptic Soy Broth (TSB), adicionado de
20% de glicerol, em câmara -80°C, até a sua utilização.
72
Vinte e quatro horas antes de cada experimento, as cepas foram semeadas em placas de
Ágar Sangue (ágar suplementado com sangue de carneiro à 5%) e incubadas em estufa a 37ºC.
No início do ensaio, algumas colônias foram transferidas para tubos contendo tampão
fosfato/salina (PBS- do inglês, phosphate-buffered saline) estéril, de forma a obter, com auxílio
de espectrofotômetro a 570nm, uma turbidez de aproximadamente 0,15nm. Esta absorbância,
segundo Lu14, em 2004 corresponde aproximadamente à concentração de 106 UFC/mL de PBS.
Lavado broncoalveolar
O lavado broncoalveolar (LBA) foi obtido de acordo com a técnica utilizada por De
Castro et al15. Para isso, os animais foram anestesiados com uretana 12.5% na proporção de 8
mL/kg i.p. O LBA foi coletado após a introdução de salina a 0,9% através de uma cânula plástica
inserida na traquéia, e em seguida aspirada em várias alíquotas de 3 mL, sendo coletadas em
tubos cônicos de polipropileno de 50 mL (Falcon, Sigma). Recuperou-se aproximadamente 30
mL de LBA para cada animal.
Cultura de macrófagos alveolares
Centrifugou-se amostras do LBA a 1500 rpm durante 15 minutos. O precipitado que
corresponde às células foi ressuspendido em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen
Corporation) contendo 3% de soro bovino fetal (Gibco-Invitrogen Corporation). As células,
contadas com o auxílio do corante Azul de Tripan, foram transferidas para placas de cultura de 6
poços com 35 mm de diâmetro cada (Falcon), em uma proporção de 106 células/mL de RPMI
1640 em cada poço. Após 1h na incubadora a 37°C e 5% CO2, desprezou-se o sobrenadante com
as células não aderentes e adicionou-se RPMI, deixando-se as placas por mais 1h em incubadora
para estabilização das células.
Após o período de estabilização das células, foram especificados 4 sistemas (n=24):
controle negativo (C-), composto por macrófagos em cultura (1mL/poço contendo 106
macrófagos/mL de RPMI 1640); controle positivo (C+), semelhante ao anterior, adicionado de
73
10µL de LPS (sorotipo de Escherichia coli; 055:B5, Sigma); e dois sistemas teste, MSSA
(ATCC 29213), composto por macrófagos em cultura, adicionados desta cepa, na proporção de
106UFC/ 106 de macrófagos/mL de RPMI 1640; e MRSA (ATCC 33591), com composição
semelhante, diferindo apenas quanto à cepa adicionada.
Punção Cardíaca
Sob efeito do anestésico, uretana 12.5% na proporção de 8 mL/kg i.p., o animal foi
posicionado em decúbito dorsal sobre superfície plana e estéril. Realizou-se a anti-sepsia da
região torácica, procedendo-se em seguida com a toracotomia. Exposto o coração, cerca de 3-5
mL de sangue foram aspirados por punção cardíaca, utilizando-se seringa de 5 mL e agulha
0,70x25 22G1 (BD Biosciences). Depois de desacoplar a agulha da extremidade da seringa, o
volume sanguíneo coletado foi imediatamente transferido para tubo contendo anticoagulante
(EDTA 15%).
Cultura de Linfócitos
Para a cultura de linfócitos, o sangue obtido a partir da punção cardíaca foi diluído em
meio de cultura RPMI 1640 (5 mL de sangue + 5mL de RPMI 1640). Aos 10mL da suspensão
resultante foram adicionados 5mL de histopaque (1077-SIGMA), centrifugados a 1500 rpm/30
min. Após a centrifugação a camada formada pelas células mononucleares foi aspirada e
transferida para um segundo tubo. A este, foram adicionados 10mL de meio de cultura RPMI
1640 e centrifugados por 10 min nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante foi
desprezado e as células do sedimento resultante foram ressuspendidas em meio de cultura e
contadas com o auxílio do corante Azul Tripan. A concentração foi ajustada para 1x106 células
para cada 1mL de meio de cultura, sendo dispostos 1mL em cada poço de placas tipo Falcon. As
mesmas foram mantidas em incubadora durante uma hora a 37°C em atmosfera úmida com 5%
CO2.
74
Decorrido esse intervalo de tempo, o sobrenadante das culturas, contendo os linfócitos,
foi transferido para novos tubos, centrifugados a 1500 rpm/10 min, tiveram então seu
sobrenadante desprezado e seu precipitado ressuspendido em meio de cultura RPMI 1640, e
após nova contagem com o corante azul de tripan e novo ajuste no número de células, a cultura
foi dispensada em novas placas tipo falcon de seis poços, procedendo-se então com os diferentes
estímulos.
Foram formados 4 sistemas in vitro (n=12): controle negativo (C-), composto por
linfócitos em cultura (1mL/poço contendo 105 linfócitos/ml de RPMI 1640); controle positivo
(C+), semelhante ao anterior, adicionado de 10µL de LPS (sorotipo de Escherichia coli; 055:B5,
Sigma); e dois sistemas teste, MSSA (ATCC 29213), composto por linfócitos em cultura,
adicionados desta cepa, na proporção de 106 UFC/ 105 de linfócitos/mL de RPMI 1640; e MRSA
(ATCC 33591), com composição semelhante, diferindo apenas quanto à cepa adicionada.
Produção de IFN-γ, IL-12 e IL-10 por macrófagos alveolares e linfócitos em cultura
Esta dosagem foi realizada pelo método de ELISA utilizando-se o kit Quantikine® m,
R&D Systems. As amostras foram coletadas a partir do sobrenadante da cultura de macrófagos
alveolares e linfócitos após um período de 24 horas de incubação.
Análise estatística
Na comparação entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student para os dados
paramétricos e o teste de Mann-Whitney para os dados não paramétricos. Os resultados foram
representados em média ± erro-padrão. A significância foi definida para p<0.05.
RESULTADOS
Evolução ponderal
Nos primeiros dias de vida, os pesos corporais (g) dos grupos nutrido (N) e desnutrido
(DN) foram semelhantes até o 3º dia. A partir do 4º dia até o 21º dia pós-natal, os valores dos
pesos corporais dos animais desnutridos foram menores em relação aos dos animais nutridos.
75
Entre o 23º e o 90º dia de vida ocorreu a reposição nutricional e os valores dos pesos do grupo
desnutrido permaneceram menores (p=<0.001) quando comparados aos do grupo nutrido (Figura
1).
Dosagem de IFN- γ em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos
A análise dos níveis de IFN-γ em sobrenadante de cultura de macrófagos alveolares
indica que a desnutrição neonatal ocasionou redução nos valores dessa citocina em animais
desnutridos quando comparados aos animais nutridos, para os sistemas C+ e MRSA. No entanto,
não foram observadas diferenças entre os referidos grupos para os sistemas C- e MSSA. A
análise intragrupo indica que o sistema C+ apresentou valores maiores dessa citocina quando
comparado aos respectivos C-N (p=<0,001) e C-DN(p=<0,001). Essa análise revela ainda que, o
sistema MRSA nos dois grupos de estudo produziu níveis mais elevados dessa citocina quando
comparado ao MSSA N (p=<0,001) e MSSA DN (p=<0,001) (Tabela 1).
A produção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de linfócitos mostrou-se reduzida no
grupo de animais desnutridos em relação ao grupo nutrido em todos os sistemas de análise. Na
análise intragrupo, observamos um aumento na produção dessa citocina no sistema C+ quando
comparado aos referentes C-N(p=0,004) e C-DN(p=0,005). Não foi observada diferença na
produção intragrupo, quando realizada a comparação entre os sistemas teste, MSSA e MRSA em
grupos de animais nutridos e desnutridos (Tabela 1).
Dosagem de IL-12 em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos
A análise dos níveis de IL-12 em sobrenadante de cultura de macrófagos alveolares
demonstra que a dieta deficiente durante os primeiros 21 dias de vida, acarretou no animal
adulto, redução nos valores dessa citocina em todos os sistemas de análise. A análise intragrupo
revela que o C+ em ambos os grupos apresentou valores maiores dessa citocina quando
comparado aos respectivos C-N (p=0,013) e C-DN (p=<0,001). Os sistemas MSSA e MRSA não
diferiram entre si em nenhum dos grupos de estudo (Tabela 2).
76
A IL-12 em sobrenadante de cultura de linfócitos foi produzida em concentrações
similares entre grupos de animais desnutridos e nutridos em todos os sistemas de análise. Na
análise intragrupo, observamos um aumento na produção dessa citocina no sistema C+ quando
comparado aos referentes C-N (p=0,045) e C-DN (p=0,001). Não foi observada diferença na
produção intragrupo, quando realizada a comparação entre os sistemas teste, MSSA e MRSA em
grupos de animais nutridos e desnutridos (Tabela 2).
Dosagem de IL-10 em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos
Os níveis de IL-10 em sobrenadante de cultura de macrófagos alveolares indicam que a
desnutrição neonatal não alterou a produção dessa citocina, quando comparados os grupos
nutrido e desnutrido, em nenhum dos sistemas estudados. A análise intragrupo indica que, o
sistema C+ apresentou valores maiores dessa citocina quando comparado aos respectivos C-
N(p=<0,001) e C-DN(p=0,017). Essa análise revela ainda que, o sistema MRSA nos dois grupos
de estudo produziu níveis mais elevados dessa citocina quando comparado ao MSSA N
(p=0,012) e MSSA DN (p=0,037) (Tabela 3).
A produção de IL-10 em sobrenadante de cultura de linfócitos não diferiu entre grupos de
animais nutridos e submetidos à desnutrição neonatal, em nenhum dos sistemas de análise. A
análise intragrupo revela que o C+ em ambos os grupos apresentou valores maiores dessa
citocina quando comparado aos referentes C-N (p=0,005) e C-DN (p=0,007). Os sistemas MSSA
e MRSA não diferiram entre si em nenhum dos grupos de estudo (Tabela 3).
DISCUSSÃO
Os dados do presente estudo revelam que durante o período de lactação o ganho de peso
corporal foi menor no grupo desnutrido quando comparado ao grupo nutrido. Os resultados
revelaram diferença significativa entre os grupos desde o quarto dia de vida pós-natal, sugerindo
que a desnutrição no período neonatal, seguida de reposição nutricional interferiu de forma
negativa no ganho de peso dos animais. Esse dados assemelham-se a aqueles obtidos por Porto et
77
al.16 os quais utlizaram a mesma dieta e o mesmo modelo de desnutrição aplicado no presente
estudo.
O baixo peso em animais desnutridos durante o período de lactação já foi descrito em
estudos anteriores2,5 que empregaram a dieta básica regional (DBR), deficiente em todos os seus
constituintes. Apesar dos diferentes modelos experimentais de desnutrição usados, neste estudo,
a deficiência de proteínas promovida através de dieta contendo caseína em diferentes
concentrações, mostrou-se eficiente para promover a desnutrição. A dieta contendo caseína a 8%
caracteriza-se por ser hipoprotéica, acarreta comprometimento do teor protéico do leite de
lactantes que a consomem, sendo determinante para a gênese de seus efeitos deletérios
observados na prole16.
A oferta da dieta normoprotéica a partir do desmame não se mostrou eficiente em
equilibrar a diferença de peso dos animais desnutridos com os animais nutridos, constatando-se
no presente estudo, um déficit permanente no peso corporal do grupo de animais submetidos à
dieta hipoprotéica. Estes dados corroboram com aqueles obtidos por Ferreira17 e Porto et al.16
que também encontraram redução do peso corporal verificada, inclusive, até a idade adulta. De
acordo com Guzmán-Silva et al.18, animais desnutridos durante o período pré e pós-natal ao
serem alimentados com dieta adequada nutricionalmente, rapidamente melhoram seu peso, no
entanto, o peso alcançado após o período de recuperação é inferior ao dos animais controle.
Os efeitos da desnutrição sobre as infecções podem ser apreciados, tanto no hospedeiro
(condicionando o seu estado de susceptibilidade e/ou de resistência), como no agente infeccioso
(favorecendo ou inibindo o seu crescimento e o seu poder patogênico)19. Nas últimas décadas o
Staphylococcus aureus tem adquirido papel de destaque, não só por ser um patógeno humano
responsável por infecções superficiais e sistêmicas, que atingem indivíduos em diferentes faixas
etárias, como também pela multirresistência aos antimicrobianos20. Ainda não existem pesquisas
relacionando desnutrição neonatal seguida de reposição nutricional com a produção de citocinas
78
por células de defesa infectadas, in vitro, com MRSA. A maioria dos estudos a respeito é
realizada em animais desnutridos, mas que não foram recuperados totalmente ou parcialmente da
desnutrição, além disso, usualmente não envolvem micro-organimos com perfil de
resistência21,22. No presente estudo foi analisada a produção de IFN-γ, IL-12 e IL-10 por
macrófagos e linfócitos após infecção celular, in vitro, com cepas de Staphylococcus aureus
reconhecidas pelo ATCC e com perfis distintos de sensibilidade e resistência à meticilina.
Na presente pesquisa a análise da produção de INF-γ em cultura de macrófagos
alveolares revela que apenas os sistemas estimulados com LPS e com a cepa resistente a
meticilina apresentaram diferença entre grupos de animais nutridos e desnutridos, sugerindo que
o processo de deficiência nutricional não altera de maneira uniforme a resposta imunológica a
diferentes estímulos em um mesmo tipo celular. Estes resultados corroboram em parte com
aqueles obtidos por França23, o qual constatou diminuição na produção IL-12 em grupos de
animais desnutridos quando comparado ao grupo de animais nutridos, em cultura de células
esplênicas estimuladas com LPS, mas não observou diferenças nesse mesmo ensaio em culturas
estimuladas com concanavalina A. Corroborando com os nossos resultados diferentes estudos
têm demonstrado que a desnutrição resulta em diminuição dos níveis de IFN-γ produzidos por
células mononucleares24,25.
No que diz respeito à liberação de INF-γ em sobrenadante de cultura de linfócitos, o
modelo de desnutrição adotado ocasionou uma redução na produção dessa citocina em todos os
sistemas de análise. Este achado pode ser justificado pelos estudos de Nájera et al.26 os quais
verificaram que tanto a estrutura quanto a função do timo encontram-se prejudicados em
situações de desnutrição e, consequentemente, a resposta de células T é reduzida. Esta ativação
comprometida de células T tem sido amplamente associada à baixa produção de citocinas. Esta
relação ficou claramente evidenciada em um estudo envolvendo crianças desnutridas, no qual
ocorreu redução acentuada na produção de citocinas do perfil Th1 (IL-2 e IFN-γ)22.
79
Corroborando com esses achados, Flo et al.27 observaram que a desnutrição, em ratos,
durante o aleitamento, provoca alterações em linfócitos T e B. Outros estudos envolvendo seres
humanos e em modelos experimentais também revelam redução na produção de IFN-γ em
estados de desnutrição energético-protéica28,29. Entretanto nenhum dos estudos citados utilizou o
modelo de infecção aplicado no presente trabalho.
O IFN-γ é uma citocina chave no desenvolvimento da resposta imune Th1, a qual é
necessária para eliminação de diferentes patógenos, além disso, essa citocina atua aumentando a
ativação de monócitos/macrófagos e suas funções microbicidas efetoras. Assim, uma diminuição
na produção dessa citocina poderia estar diretamente relacionada ao aumento da susceptibilidade
a infecção em quadros de desnutrição22.
De forma semelhante, a produção de IL-12 em sobrenadante de cultura de macrófagos
parece ser alterada pela desnutrição neonatal. Os dados obtidos neste estudo demonstram que
macrófagos alveolares de ratos desnutridos apresentam menor produção de IL-12, tanto nos
sistemas controle, quanto frente a estímulo bacteriano. Hughes et al30 observaram em um estudo
realizado em humanos que a desnutrição severa reduz os níveis de IL-12 produzidos por células
dendríticas. De acordo com Melo et al.5 a desnutrição reduz a imunidade em geral, sobretudo,
provoca alterações no pulmão, comprometendo a função dos macrófagos alveolares. No âmbito
dessa pesquisa De castro et al15 descreveram em seu estudo que desnutrição neonatal, mesmo
após a reposição nutricional, acarreta no rato adulto sequela duradoura na atividade funcional do
macrófago alveolar. Todos esses aspectos podem ter sido refletidos na redução da produção da
IL-12 observada no presente trabalho, uma vez que esta citocina tem como principais fontes de
sua produção, os macrófagos ativados e as células dendríticas. Os macrófagos são reconhecidos
por sua atuação na defesa contra a invasão do organismo por antígenos estranhos. Essas células
podem migrar para o interstício do foco de reação após aderir às células endoteliais31. A
desnutrição energética protéica altera esse mecanismo reduzindo a expressão de moléculas de
80
adesão e a ativação de macrófagos, podendo assim interferir de forma negativa no mecanismo de
sinalização celular desses fagócitos, como o fluxo de cálcio e a fosforilação das proteínas
quinases32, mecanismos estes que estão diretamente relacionados à forma de atuação das
diferentes citocinas.
O modelo de desnutrição aplicado no presente estudo não modificou a produção de IL-12
em sobrenadante de cultura de linfócitos, tanto nos ensaios controles como nos estimulados com
as cepas em estudo. Os resultados obtidos vão de encontro a diferentes trabalhos envolvendo
processos de desnutrição que relatam redução na produção de citocinas tanto em modelos
experimentais como em estudos com humanos4,21. Entretanto sabe-se que diferentes estados de
desnutrição podem modular as defesas do hospedeiro contra um único patógeno em graus
variados33. Assim, podemos supor que uma mesma citocina pode ter sua produção comprometida
em um tipo celular em particular, mas não em outro, potencialmente menos afetado pela
desnutrição.
Similarmente não foi observada diferença na produção de IL-10 entre grupos de animais
nutridos e submetidos à desnutrição neonatal em ambas as culturas celulares realizadas, como
também em ambos os sistemas de análise. Esses dados assemelham-se aqueles obtidos por Jakab
et al.33 os quais verificaram que a desnutrição não altera a resistência a infecção e atividade de
macrófagos alveolares frente a infecção por S.aureus. De encontro com este resultado Anstead et
al.34 relataram níveis menores de IL-10 em cultura de macrófagos peritoneais de animais
desnutridos quando comparado ao grupo nutrido, após estímulo com LPS.
De forma contrária aos inúmeros estudos envolvendo diferentes modelos de
desnutrição,4,21,30, Fock et al.35 constataram que a animais desnutridos são capazes de produzir
níveis maiores de IL-10 quando comparado com grupo de animais controles, após infecção com
LPS. Acredita-se que esses resultados, discrepantes em relação ao presente estudo, sejam
consequencia de uma adaptação do organismo para manter a homeostase em resposta a injeção
81
intraperitoneal de LPS, uma vez que trata-se de um estudo, in vivo, onde as repercursões
sistemicas podem ser intensas.
No que diz respeito a possíveis diferenças entre cepas sensíveis e resistentes a meticilina,
o presente estudo constatou que apenas a produção de IFN-γ e IL-10 por cultura de macrófagos
alveolares foi mais elevada por parte das cepas resistentes quando comparada a cepa sensível à
meticilina. Em consequência da reconhecida capacidade da IL-10 em inibir a produção de
citocinas pró-inflamatórias36 e dos trabalhos que descrevem o IFN-γ como uma citocina essencial
para eliminação do Staphylococcus aureus37, poderíamos sugerir que os altos níveis de IL-10
produzidos pela cepa resistente à meticilina poderiam caracterizar um mecanismo de escape
desse patógeno, o qual permitiria sua sobrevivência por mais tempo no hospedeiro, visto que
essa interleucina atuaria anulando a ação de citocinas pró-inflamatórias, capazes de intensificar o
potencial microbicida de células de defesa como os macrófagos. Entretanto, os altos níveis de
IFN-γ revelam questões conflitantes a respeito da resposta imune frente à cepa resistente a
meticilina, que poderiam ser elucidadas através da realização de uma cinética de produção dessas
citocinas avaliando assim possíveis picos de produção desses mediadores por um período
superior a 24 horas de incubação.
As demais comparações realizadas entre as cepas bacterianas segundo a
sensibilidade/resistência à meticilina não revelaram diferença estatística. Este achado
correlaciona-se de maneira positiva com outros parâmetros da resposta imune, frente a estas
cepas, analisados por Salgado et al.12, Duckworth et al.38 os quais não observaram diferença no
potencial de aderência celular, bem como na função fagocítica de neutrófilos e monócitos
quando comparadas às cepas sensível e resistente à meticilina. Estudos comparando fatores de
virulência entre as referidas cepas não constataram diferença significativa no que diz respeito à
produção de α, β, δ, γ-hemolisinas39, além disso outros autores sugerem que a capacidade de
produzir toxinas independe do perfil de resistência ou sensibilidade a meticilina40. Dessa forma,
82
apesar de muitos trabalhos associarem a infecção por MRSA a altos índices de morbidade e
mortalidade41,42, ainda há muito a ser investigado no que diz respeito a sua potencialidade
intrínseca em promover infecções de maior gravidade.
É importante ressaltar que no presente estudo houve um padrão de resposta no grupo
nutrido e desnutrido no que diz respeito às comparações realizadas entre as cepas de MSSA e
MRSA. Observando diferença estatística na análise das mesmas citocinas e culturas celulares.
Sugerindo que a desnutrição neonatal não atuou como fator modificador da relação entre
produção de citocinas e perfil de resistência/sensibilidade a meticilina. Dessa forma, são
necessárias investigações adicionais no sentido de compreender melhor as alterações promovidas
pela desnutrição em períodos considerados críticos para o desenvolvimento e suas eventuais
repercussões sobre diferentes parâmetros da resposta imunológica frente a bactérias de
importância hospitalar como MRSA.
CONCLUSÕES
Nas condições deste trabalho, a desnutrição no período de lactação e seguida de reposição
nutricional, acarreta redução do peso corporal a partir do 4o dia de vida pós-natal, mantendo-se
até a vida adulta. Ainda, o modelo de desnutrição adotado promoveu uma redução na produção
das citocinas, IFN-γ em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos e IL-12 em cultura de
macrófagos alveolares, indicando que esse modelo de desnutrição pode comprometer a resolução
de um processo infeccioso. A cepa de MRSA estimulou uma maior produção das citocinas, IFN-
γ e IL-10 em cultura de macrófagos alveolares, sugerindo assim a possibilidade de uma
estimulação imunológica mais intensa por parte da cepa resistente a meticilina, no que diz
respeito à cultura de macrófagos alveolares.
83
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88
Figura 1- Evolução da curva ponderal durante a desnutrição neonatal (21 dias) e reposição
nutricional (23-90 dias) dos grupos Caseína a 17% e a 8%. Dados expressos em média ± erro-
padrão para 24 animais.
*p<0,05 na comparação N e DN.
89
Tabela 1- Produção de INF-γ em sobrenadante de cultura de macrófagos (n=24) e linfócitos (n=12). Os resultados são representados em média ± erro-padrão. pg/mL.
* p<0,05 na comparação entre os grupos N e DN.
Células Sistemas
Nutrido
Desnutrido
Valor de p
Macrófagos Alveolares
C-
142,75±13,8
143,47±1,11
p= 0,707
C+
213,59±9,75
156,35±1,7
p= <0,001*
MSSA 156,38±10,3
142,97±2,62
p = 0,065
MRSA 215,13±9,43
160,64±3,22
p= <0,001*
Linfócitos
C-
259,59±4,32
235,69±3,02
p = 0,001*
C+
294,01±7,99
253,85±4,09
p = 0,001*
MSSA
271,7±7,49
238,55±6
p= 0,006*
MRSA 269,15±8,63
233,14±1,34
p= 0,002*
90
Tabela 2- Produção de IL-12 em sobrenadante de cultura de macrófagos (n=24) e linfócitos (n=12). Os resultados são representados em média ± erro-padrão. pg/mL.
* p<0,05 na comparação entre os grupos N e DN.
Células Sistemas
Nutrido
Desnutrido
Valor de p
Macrófagos Alveolares
C-
126,74±4,65
116,1±1,59
p= 0,006*
C+
144,44±4,58
127,8±1,52
p= 0,009*
MSSA
147,73±4,18
126,74±1,36
p = <0,001*
MRSA
139,47±2,54
124,22±1,55 p= <0,001*
Linfócitos
C-
317,89±5,92
314,38±3,23
p = 0,614
C+
363,5±19
368,77±11,9
p = 0,485
MSSA
389,82±27,8
386,31±9,01
p= 0,818
MRSA
412,63±38,1
367,89±1,16
p= 0,699
91
Tabela 3- Produção de IL-10 em sobrenadante de cultura de macrófagos (n=24) e linfócitos (n=12). Os resultados são representados em média ± erro-padrão. pg/mL.
* p<0,05 na comparação entre os grupos N e DN.
Células Sistemas
Nutrido
Desnutrido
Valor de p
Macrófagos Alveolares
C-
154,14±3,12
148,53±4,84
p= 0,341
C+
173,83±3,05
176,42±9,64
p= 0,729
MSSA
179,97±3,89
176,86±6,35
p = 0,680
MRSA
198,17±4
197,66±6,87 p= 0,908
Linfócitos
C-
334,76±1,2
335,98±0,8
p = 0,394
C+
347,49±3,38
348,92±3,69
p = 0,781
MSSA
365,6±7,57
370,57±2,1
p= 0,937
MRSA
377,99±1,4
372,07±3,23
p= 0,124
92
8. CONCLUSÕES
93
• A desnutrição no período de lactação e seguida de reposição nutricional, acarreta redução
do peso corporal a partir do 4o dia de vida pós-natal, mantendo-se até a vida adulta;
• A produção de IFN-γ e IL-10, em cultura de macrófagos alveolares mostrou-se elevada
no sistema estimulado com a cepa resistente ao ser comparado a cepa sensível em grupos
de animais nutridos e desnutridos;
• Os níveis de IL-12 em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos e de IFN-γ e IL-10
em cultura de linfócitos foram semelhantes nos sistemas estimulados pelas cepas
sensíveis e resistentes a meticilina, em ambos os grupos estudados;
• O modelo de desnutrição neonatal adotado promoveu uma redução na produção das
citocinas, IFN-γ em cultura de macrófagos alveolares e linfócitos e IL-12 em cultura de
macrófagos alveolares;
• Os níveis de IL-12 em cultura de linfócitos e IL-10 em cultura de macrófagos alveolares e
linfócitos foram semelhantes em grupos de animais nutridos e desnutridos.
94
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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STEINBERG, J.P; CLARK, C.C.; HACKMAN, B.O. Nosocomial and community acquired Staphylococcus aureus bacteremias from 1980 to 1993: impact of intravascular devices and methicillin resistance. Clin Infect Dis., v.23, p.255-259, 1996. STEVENS, D. L. Community-acquired Staphylococcus aureus infections: increasing virulence and emerging methicillin resistance in the new millennium. Curr. Opin. Infect. Dis., v.16, p.189–191, 2003. TAKAYAMA, T. et al. Mammalian and viral IL-10 enhance C-C chemokine receptor 7 expression by myeloid dendritic cells: impact on chemotactic responses and in vivo homing ability. J Immunol. 2001; 166:136-43. TANAKA, H.; MIYAZAKI, S.; SUMIYAMA, Y.; KAKIUCHI, T. Role of macrophage in a mouse model of postoperative MRSA enteritis. J Surg Res, v.118, p.114-121, 2004. TAVARES, W. Manual de antibióticos e quimioterápicos antiinfecciosos. Rio de Janeiro: Editora Atheneu,. caps. 1 e 5, 2002. TRINCHIERI G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nat Rev Immunol, v.3, n.2, p.133-146, 2003. TRINCHIERI, G.. Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity. Annu. Rev. Immunol. v.13, p.251-276, 1995. UENO, M. Characterization of methicillin-resistant staphylococcus aureus by phenotypic methods and plasmid profile. Rev. biociênc., v.7, n.2, p.15-22, 2001. VAN FURTH, R. Phagocytic cells: development and distribution of mononuclear phagocytes in normal steady state and inflammation. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, 2nd ed, J.I. Gallin, R. Snyderman, eds. Raven, NewYork. p.50-73, 1992. VANDENBROUCKE-GRAULS, C. M.; FRÉNAY, H. M. E.; VAN KLINGEREN B.;
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105
APÊNDICE
106
Planilha de evolução ponderal
GRUPO: ______________________ GAIOLA:_________ D.N.: ______/_____/______
OBSERVAÇÕES: GRUPO DESNUTRIDO
Até o 21º dia, as mães serão alimentadas com caseína a 8% e os filhotes serão pesados diariamente;
A partir do 22º dia, os filhotes passarão a ser alimentados com Labina®. A partir de agora, os filhotes serão pesados em dias alternados.
GRUPO NUTRIDO Até o 21º dia, as mães serão alimentadas com caseína a 17% e os filhotes serão pesados
diariamente; A partir do 22º dia, os filhotes passarão a ser alimentados com Labina®. A partir de
agora, os filhotes serão pesados em dias alternados.
DATAS PESO DOS ANIMAIS (g) PAD - 1 PAE - 2 DM - 3 DP - 4 PPD - 5 PPE - 6
1º dia 2º dia 3º dia 4º dia 5º dia 6º dia 7º dia 8º dia 9º dia 10º dia 11º dia 12º dia 13º dia 14º dia 15º dia 16º dia 17º dia 18º dia 19º dia 20º dia 21º dia
Desmame ------------ ------------ ------------ ------------ ----------- ------------ ------------
107
ANEXOS
108
ANEXO 1 – Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética em Experimental Animal
109
ANEXO 2 – Normas para publicação na revista (Artigo I)
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical®,
Versão impressa, ISSN:0037-8682.
Instruções aos autores
Escopo
A Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical é um periódico multidisciplinar
que publica pesquisas originais relacionadas a doenças tropicais, medicina preventiva, saúde
pública, doenças infecciosas e assuntos relacionados. A preferência para publicação será dada a
artigos que relatem pesquisas e observações originais. A revista possui um sistema de revisão por
pares, para a aceitação de artigos, e sua periodicidade é bimestral. Atualmente, a versão impressa
da revista é publicada em Português e Inglês, enquanto a versão eletrônica está disponível apenas
em Inglês (acesso aberto). A partir de 22 de Setembro de 2010, por decisão tomada em
Assembléia Geral da SBMT em 17/03/2010, todos os artigos, tanto na versão impressa quanto na
eletrônica, passarão a ser publicados na língua inglesa. Todos os artigos deverão conter também
título, resumo e palavras-chaves em português.
Preparação do manuscrito
Todo manuscrito deve ser submetido através do sistema online nos endereços
http://submission.scielo.br/index.php/rsbmt/login ou http://www.scielo.br/rsbmt. A carta de
apresentação deve conter uma declaração assegurando que o material não foi publicado ou está
sob consideração por outro periódico científico. O autor deve escolher dentro do item Diretriz
para Submissão uma categoria para o manuscrito (Artigos Originais, Editoriais, Artigos de
Revisão, Comunicações Breves, Relatos de Casos, Relatórios Técnicos, Imagens em Doenças
Infecciosas, Obituários e Cartas ao Editor, ou outros quando não se encaixar em nenhuma das
categorias listadas). A responsabilidade pelo conteúdo do manuscrito é inteiramente do autor e
seus co-autores.
Formatação de Artigo Original
O manuscrito deve ser preparado usando software padrão de processamento de textos e
deve ser impresso (fonte times new Roman tamanho 12) com espaço duplo em todo o texto,
legendas para as figuras e referências, margens com pelos menos 3cm. O limite de palavras é de
6.000 com até 5 inserções (figuras e tabelas). O manuscrito deve ser dividido nas seguintes
seções: Carta de envio, endereçada ao editor chefe, resumo estruturado, palavras-chaves,
introdução, métodos, resultados, discussão, conclusões, agradecimentos e referências.
Abreviações devem ser usadas com moderação.
110
Página de Título: deve incluir o nome dos autores na ordem direta e sem abreviações,
graduações mais elevadas possuídas, afiliações em instituições com endereço acadêmico do
autor correspondente e todos os co-autores e apoio financeiro.
Título: deve ser conciso, claro e o mais informativo possível, não deve conter abreviações e não
deve exceder a 200 caracteres, incluindo espaços.
Título Corrente: com no máximo 70 caracteres.
Resumo Estruturado: deve condensar os resultados obtidos e as principais conclusões de tal
forma que um leitor, não familiarizado com o assunto tratado no texto, consiga entender as
implicações do artigo. O resumo não deve exceder 250 palavras (100 palavras no caso de
comunicações breves) e abreviações devem ser evitadas. Deve ser subdivido em: Introdução,
Métodos, Resultados e Conclusões.
Palavras-chaves: 3 a 6 itens devem ser listados imediatamente abaixo do resumo estruturado.
Introdução: deve ser curta e destacar os propósitos para o qual o estudo foi realizado. Apenas
quando necessário citar estudos anteriores de relevância.
Métodos: devem ser suficientemente detalhados para que os leitores e revisores possam
compreender precisamente o que foi feito e permitir que seja repetido por outros. Técnicas-
padrões precisam apenas ser citadas.
Ética: em caso de experimentos em seres humanos, indicar se os procedimentos realizados estão
em acordo com os padrões éticos do comitê de experimentação humana responsável
(institucional, regional ou nacional) e com a Declaração de Helsinki de 1964, revisada em 1975,
1983, 1989, 1996 e 2000. Quando do relato de experimentos em animais, indicar se seguiu um
guia do conselho nacional de pesquisa, ou qualquer lei sobre o cuidado e uso de animais em
laboratório foram seguidas.
Resultados: devem ser um relato conciso e impessoal da nova informação. Evitar repetir no
texto os dados apresentados em tabelas e ilustrações.
Discussão: deve relacionar-se diretamente com o estudo que está sendo relatado. Não incluir
uma revisão geral sobre o assunto, evitando que se torne excessivamente longa.
Agradecimentos: devem ser curtos, concisos e restritos aqueles realmente necessários, e, no
caso de órgãos de fomento não usar siglas.
Conflito de Interesse: todos os autores devem revelar qualquer tipo de conflito de interesse
existente durante o desenvolvimento do estudo.
Referências: devem ser numeradas consecutivamente, na medida em que aparecem no texto.
Listar todos os autores quando houver até seis. Para sete ou mais, listar os seis primeiros, seguido
por "et al". Digitar a lista de referências com espaçamento duplo em folha separada. Referências
111
de comunicações pessoais, dados não publicados ou manuscritos "em preparação" ou
"submetidos para publicação" não devem constar da lista de referência. Se essenciais, podem ser
incorporados em local apropriado no texto, entre parênteses da seguinte forma: (AB Figueiredo:
Comunicação Pessoal, 1980); (CD Dias, EF Oliveira: dados não publicados). Citações no texto
devem ser feitas pelo respectivo número das referências, acima da palavra correspondente,
separado por vírgula (Ex.: Mundo.1,2,3; Vida.30,42,44-50). As referências no fim do manuscrito
devem estar de acordo com o sistema de requisitos uniformes utilizado para manuscritos
enviados para periódicos biomédicos (Consulte: http://www.nlm.nih.gov/citingmedicine). Os
títulos dos periódicos devem ser abreviados de acordo com o estilo usado no "Index Medicus"
(Consulte: http://ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals&TabCmd=limits).
Alguns exemplos de referências:
1. Russell FD, Coppell AL, Davenport AP. In vitro enzymatic processing of radiolabelled big
ET-1 in human kidney as a food ingredient. Biochem Pharmacol 1998;55:697-701.
2. Porter RJ, Meldrum BS. Antiepileptic drugs. In: Katzung BG, editor. Basic and clinical
pharmacology. 6th ed. Norwalk (CN): Appeleton and Lange; 1995. p. 361-80.
3. Blenkinsopp A, Paxton P. Symptoms in the pharmacy: a guide to the management of common
illness. 3rd ed. Oxford: Blackwell Science; 1998.
Figuras: devem preferencialmente ser submetidas em alta resolução no formato TIFF. As
figuras devem ser colocadas em arquivos separados, nomeados apenas com o número das figuras
(ex.: Figura 1; Figura 2). Certifique-se que as mesmas têm uma resolução mínima de 300dpi.
Fotografias: devem ser enviadas com boa resolução (mínimo de 300dpi) no formato TIFF,
preferencialmente, preparadas utilizando o Adobe Photoshop.
Gráficos: criados usando Microsoft Word ou Excel, devem ser salvos com a extensão original
(.doc ou .xls). Eles não devem ser copiados ou colados de um programa para o outro.
Mapas e Ilustrações: devem ser vetorizadas (desenhados) profissionalmente utilizando os
softwares CorelDraw ou Illustrator em alta resolução, e suas dimensões não devem ter mais que
21,5 x 28,0cm.
Imagens: produzidas em software estatístico devem ser convertidas para o formato Excel ou
PowerPoint. Caso não seja possível, converter o arquivo para o formato TIFF com resolução de
300dpi, e enviar juntamente com o arquivo no formato original.
Legendas: nas figuras, as legendas devem ser digitadas juntas com espaçamento duplo em uma
folha separada.
Ilustrações Coloridas: devem ser aprovadas pelos editores e as despesas extras para confecção
de fotolitos coloridos serão de responsabilidade dos autores.
112
Tabelas: devem ser digitadas com espaçamento duplo, com um título curto e descritivo e
submetido online em um arquivo separado. Legendas para cada tabela devem aparecer no rodapé
da mesma página que a tabela. Todas as tabelas devem ter numeração arábica, citadas no texto,
consecutivamente. Tabelas não devem ter linhas verticais, e linhas horizontais devem ser
limitadas ao mínimo, com notas de rodapé logo abaixo. Tabelas devem ter no máximo 17cm de
largura.
Processo de Envio: a partir de 21 de Outubro de 2009, os artigos submetidos à Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical deverão utilizar apenas a via eletrônica. Todos os
manuscritos deverão ser enviados via internet para
http://submission.scielo.br/index.php/rsbmt/login, seguindo as instruções no topo de cada tela. A
partir desta data o processo de revisão pelos pares também será totalmente pela via eletrônica.
Sobre Re-envio e revisões: a revista diferencia entre: a) manuscritos que foram rejeitados e b)
manuscritos que serão re-avaliados após a realização das correções que foram solicitadas aos
autores.
Re-envio: caso o autor receba uma carta informando que seu trabalho foi rejeitado e queira que
os editores reconsiderem tal decisão, o autor poderá re-enviá-lo. Neste caso será gerado um novo
número para o manuscrito.
Revisão: caso seja necessário refazer seu manuscrito com base nas recomendações e sugestões
dos revisores, ao devolvê-lo, para uma segunda análise, por favor, encaminhe o manuscrito
revisado e informe o mesmo número do manuscrito.
Após a aceitação: quando o trabalho for aceito para publicação, os autores devem fornecer:
a) Formulário de concessão de direitos autorais, fornecido pela secretaria da revista, assinado
pelo autor correspondente.
b) Provas: serão enviadas ao autor correspondente para que o texto seja cuidadosamente
conferido. Mudanças ou edições ao manuscrito editado não serão permitidas nesta etapa do
processo de edição. Os autores deverão devolver as provas corrigidas dentro de quatro dias após
serem recebidas.
c) Os artigos aceitos comporão os números impressos obedecendo ao cronograma em que foram
submetidos, revisados e aceitos.
d) Os artigos aceitos remanescentes a cada número da revista serão disponibilizados on line
enquanto aguardam a prioridade para publicação na versão impressa.
Re-impressões: a revista fornece ao autor, gratuitamente, excertos do artigo em formato PDF, via
e-mail.
113
Custos de Publicação: Não haverá custos de publicação, exceto as despesas que, a Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical tiver com tradução de artigos do Português para o
Inglês. Neste caso os autores pagarão estes custos.
114
ANEXO 3 – Normas para publicação na revista (Artigo II)
Revista de Nutrição®
Versão impressa ISSN 1415-5273.
Escopo e política
A Revista de Nutrição é um periódico especializado que publica artigos que contribuem
para o estudo da Nutrição em suas diversas subáreas e interfaces. Com periodicidade bimestral,
está aberta a contribuições da comunidade científica nacional e internacional.
Os manuscritos podem ser rejeitados sem comentários detalhados após análise inicial, por
pelo menos dois editores da Revista de Nutrição, se os artigos forem considerados inadequados
ou de prioridade científica insuficiente para publicação na Revista.
Preparo do manuscrito
Submissão de trabalhos
Serão aceitos trabalhos acompanhados de carta assinada por todos os autores, com
descrição do tipo de trabalho e da área temática, declaração de que o trabalho está sendo
submetido apenas à Revista de Nutrição e de concordância com a cessão de direitos autorais e
uma carta sobre a principal contribuição do estudo para a área. Caso haja utilização de figuras ou
tabelas publicadas em outras fontes, deve-se anexar documento que ateste a permissão para seu
uso.
Enviar os manuscritos para o Núcleo de Editoração da Revista em quatro cópias,
preparados em espaço entrelinhas 1,5, com fonte Arial 11, acompanhados de cópia em CD-
ROM. O arquivo deverá ser gravado em editor de texto similar ou superior à versão 97-2003 do
Word (Windows). Os nomes do(s) autor(es) e do arquivo deverão estar indicados no rótulo do
CD-ROM.
Das quatro cópias descritas no item anterior, três deverão vir sem nenhuma identificação
dos autores, para que a avaliação possa ser realizada com sigilo; porém, deverão ser completas e
idênticas ao original, omitindo-se apenas esta informação. É fundamental que o escopo do artigo
não contenha qualquer forma de identificação da autoria, o que inclui referência a trabalhos
anteriores do(s) autor(es), da instituição de origem, por exemplo.
O texto deverá contemplar o número de palavras de acordo com a categoria do artigo. As
folhas deverão ter numeração personalizada desde a folha de rosto (que deverá apresentar o
número 1). O papel deverá ser de tamanho A4, com formatação de margens superior e inferior
115
(no mínimo 2,5cm), esquerda e direita (no mínimo 3cm). Os artigos devem ter,
aproximadamente, 30 referências, exceto no caso de artigos de revisão, que podem apresentar em
torno de 50. Sempre que uma referência possuir o número de Digital Object Identifier (DOI),
este deve ser informado.
Versão reformulada: a versão reformulada deverá ser encaminhada em três cópias
completas, em papel, e em CD-ROM etiquetado, indicando o número do protocolo, o número da
versão, o nome dos autores e o nome do arquivo. O(s) autor(es) deverá(ão) enviar apenas a
última versão do trabalho. O texto do artigo deverá empregar fonte colorida (cor azul) ou
sublinhar, para todas as alterações, juntamente com uma carta ao editor, reiterando o interesse
em publicar nesta Revista e informando quais alterações foram processadas no manuscrito. Se
houver discordância quanto às recomendações dos revisores, o(s) autor(es) deverão apresentar os
argumentos que justificam sua posição. O título e o código do manuscrito deverão ser
especificados.
Página de título: deve conter:
a) título completo - deve ser conciso, evitando excesso de palavras, como "avaliação do....",
"considerações acerca de..." 'estudo exploratório....";
b) short title com até 40 caracteres (incluindo espaços), em português (ou espanhol) e inglês;
c) nome de todos os autores por extenso, indicando a filiação institucional de cada um. Será
aceita uma única titulação e filiação por autor. O(s) autor(es) deverá(ão), portanto, escolher,
entre suas titulações e filiações institucionais, aquela que julgar(em) a mais importante.
d) Todos os dados da titulação e da filiação deverão ser apresentados por extenso, sem siglas.
e) Indicação dos endereços completos de todas as universidades às quais estão vinculados os
autores;
f) Indicação de endereço para correspondência com o autor para a tramitação do original,
incluindo fax, telefone e endereço eletrônico;
Observação: esta deverá ser a única parte do texto com a identificação dos autores.
Resumo: todos os artigos submetidos em português ou espanhol deverão ter resumo no idioma
original e em inglês, com um mínimo de 150 palavras e máximo de 250 palavras.
Os artigos submetidos em inglês deverão vir acompanhados de resumo em português, além do
abstract em inglês.
Para os artigos originais, os resumos devem ser estruturados destacando objetivos, métodos
básicos adotados, informação sobre o local, população e amostragem da pesquisa, resultados e
conclusões mais relevantes, considerando os objetivos do trabalho, e indicando formas de
continuidade do estudo.
116
Para as demais categorias, o formato dos resumos deve ser o narrativo, mas com as mesmas
informações.
O texto não deve conter citações e abreviaturas. Destacar no mínimo três e no máximo seis
termos de indexação, utilizando os descritores em Ciência da Saúde - DeCS - da Bireme
<http://decs.bvs.br>.
Texto: com exceção dos manuscritos apresentados como Revisão, Comunicação, Nota Científica
e Ensaio, os trabalhos deverão seguir a estrutura formal para trabalhos científicos:
Introdução: deve conter revisão da literatura atualizada e pertinente ao tema, adequada à
apresentação do problema, e que destaque sua relevância. Não deve ser extensa, a não ser em
manuscritos submetidos como Artigo de Revisão.
Métodos: deve conter descrição clara e sucinta do método empregado, acompanhada da
correspondente citação bibliográfica, incluindo: procedimentos adotados; universo e amostra;
instrumentos de medida e, se aplicável, método de validação; tratamento estatístico.
Em relação à análise estatística, os autores devem demonstrar que os procedimentos utilizados
foram não somente apropriados para testar as hipóteses do estudo, mas também corretamente
interpretados. Os níveis de significância estatística (ex. p<0,05; p<0,01; p<0,001) devem ser
mencionados.
Informar que a pesquisa foi aprovada por Comitê de Ética credenciado junto ao Conselho
Nacional de Saúde e fornecer o número do processo.
Ao relatar experimentos com animais, indicar se as diretrizes de conselhos de pesquisa
institucionais ou nacionais - ou se qualquer lei nacional relativa aos cuidados e ao uso de animais
de laboratório - foram seguidas.
Resultados: sempre que possível, os resultados devem ser apresentados em tabelas ou figuras,
elaboradas de forma a serem auto-explicativas e com análise estatística. Evitar repetir dados no
texto.
Tabelas, quadros e figuras devem ser limitados a cinco no conjunto e numerados consecutiva e
independentemente com algarismos arábicos, de acordo com a ordem de menção dos dados, e
devem vir em folhas individuais e separadas, com indicação de sua localização no texto. É
imprescindível a informação do local e ano do estudo. A cada um se deve atribuir um título
breve. Os quadros e tabelas terão as bordas laterais abertas.
O(s) autor(es) se responsabiliza(m) pela qualidade das figuras (desenhos, ilustrações, tabelas,
quadros e gráficos), que deverão ser elaboradas em tamanhos de uma ou duas colunas (7 e 15cm,
respectivamente); não é permitido o formato paisagem. Figuras digitalizadas deverão ter
extensão jpeg e resolução mínima de 300 dpi.
117
Gráficos e desenhos deverão ser gerados em programas de desenho vetorial (Microsoft Excel,
CorelDraw, Adobe Illustrator etc.), acompanhados de seus parâmetros quantitativos, em forma
de tabela e com nome de todas as variáveis.
A publicação de imagens coloridas, após avaliação da viabilidade técnica de sua reprodução, será
custeada pelo(s) autor(es). Em caso de manifestação de interesse por parte do(s) autor(es), a
Revista de Nutrição providenciará um orçamento dos custos envolvidos, que poderão variar de
acordo com o número de imagens, sua distribuição em páginas diferentes e a publicação
concomitante de material em cores por parte de outro(s) autor(es).
Uma vez apresentado ao(s) autor(es) o orçamento dos custos correspondentes ao material de seu
interesse, este(s) deverá(ão) efetuar depósito bancário. As informações para o depósito serão
fornecidas oportunamente.
Discussão: deve explorar, adequada e objetivamente, os resultados, discutidos à luz de outras
observações já registradas na literatura.
Conclusão: apresentar as conclusões relevantes, considerando os objetivos do trabalho, e indicar
formas de continuidade do estudo. Não serão aceitas citações bibliográficas nesta seção.
Agradecimentos: podem ser registrados agradecimentos, em parágrafo não superior a três
linhas, dirigidos a instituições ou indivíduos que prestaram efetiva colaboração para o trabalho.
Anexos: deverão ser incluídos apenas quando imprescindíveis à compreensão do texto. Caberá
aos editores julgar a necessidade de sua publicação.
Abreviaturas e siglas: deverão ser utilizadas de forma padronizada, restringindo-se apenas
àquelas usadas convencionalmente ou sancionadas pelo uso, acompanhadas do significado, por
extenso, quando da primeira citação no texto. Não devem ser usadas no título e no resumo.
Referências de acordo com o estilo Vancouver
Referências: devem ser numeradas consecutivamente, seguindo a ordem em que foram
mencionadas pela primeira vez no texto, conforme o estilo Vancouver.
Nas referências com dois até o limite de seis autores, citam-se todos os autores; acima de seis
autores, citam-se os seis primeiros autores, seguido de et al.
As abreviaturas dos títulos dos periódicos citados deverão estar de acordo com o Index Medicus.
Não serão aceitas citações/referências de monografias de conclusão de curso de graduação, de
trabalhos de Congressos, Simpósios, Workshops, Encontros, entre outros, e de textos não
publicados (aulas, entre outros).
Se um trabalho não publicado, de autoria de um dos autores do manuscrito, for citado (ou seja,
um artigo in press), será necessário incluir a carta de aceitação da revista que publicará o referido
artigo.
118
Se dados não publicados obtidos por outros pesquisadores forem citados pelo manuscrito, será
necessário incluir uma carta de autorização, do uso dos mesmos por seus autores.
Citações bibliográficas no texto: deverão ser expostas em ordem numérica, em algarismos
arábicos, meia linha acima e após a citação, e devem constar da lista de referências. Se forem
dois autores, citam-se ambos ligados pelo "&"; se forem mais de dois, cita-se o primeiro autor,
seguido da expressão et al.
A exatidão e a adequação das referências a trabalhos que tenham sido consultados e
mencionados no texto do artigo são de responsabilidade do autor. Todos os autores cujos
trabalhos forem citados no texto deverão ser listados na seção de Referências.
Exemplos
Artigo com mais de seis autores
Oliveira JS, Lira PIC, Veras ICL, Maia SR, Lemos MCC, Andrade SLL, et al. Estado nutricional
e insegurança alimentar de adolescentes e adultos em duas localidades de baixo índice de
desenvolvimento humano. Rev Nutr. 2009; 22(4): 453-66. doi: 10.1590/S1415-
52732009000400002.
Artigo com um autor
Burlandy L. A construção da política de segurança alimentar e nutricional no Brasil: estratégias e
desafios para a promoção da intersetorialidade no âmbito federal de governo. Ciênc Saúde
Coletiva. 2009; 14(3):851-60. doi: 10.1590/S1413-81232009000300020.
Livro
Alberts B, Lewis J, Raff MC. Biologia molecular da célula. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed; 2010.
Livro em suporte eletrônico
Brasil. Alimentação saudável para pessoa idosa: um manual para o profissional da saúde
[Internet]. Brasília: Ministério da Saúde; 2009 [acesso 2010 jan 13]. Disponível em:
<http://200.18.252.57/services/ebooks/alimentacao_saudavel_idosa_profissionais_saude.pdf>.
Documentos
Declaração de responsabilidade e transferência de direitos autorais
Cada autor deve ler e assinar os documentos (1) Declaração de Responsabilidade e (2)
Transferência de Direitos Autorais, nos quais constarão:
- Título do manuscrito:
- Nome por extenso dos autores (na mesma ordem em que aparecem no manuscrito).
- Autor responsável pelas negociações:
1. Declaração de responsabilidade: todas as pessoas relacionadas como autoras devem assinar
declarações de responsabilidade nos termos abaixo:
119
- "Certifico que participei da concepção do trabalho para tornar pública minha responsabilidade
pelo seu conteúdo, que não omiti quaisquer ligações ou acordos de financiamento entre os
autores e companhias que possam ter interesse na publicação deste artigo";
- "Certifico que o manuscrito é original e que o trabalho, em parte ou na íntegra, ou qualquer
outro trabalho com conteúdo substancialmente similar, de minha autoria, não foi enviado a outra
Revista e não o será, enquanto sua publicação estiver sendo considerada pela Revista de
Nutrição, quer seja no formato impresso ou no eletrônico".
2. Transferência de Direitos Autorais: "Declaro que, em caso de aceitação do artigo, a Revista de
Nutrição passa a ter os direitos autorais a ele referentes, que se tornarão propriedade exclusiva da
Revista, vedado a qualquer reprodução, total ou parcial, em qualquer outra parte ou meio de
divulgação, impressa ou eletrônica, sem que a prévia e necessária autorização seja solicitada e, se
obtida, farei constar o competente agradecimento à Revista".
Assinatura do(s) autores(s) Data __ / __ / __
Justificativa do artigo
Destaco que a principal contribuição do estudo para a área em que se insere é a seguinte:
__________________________________
(Escreva um parágrafo justificando porque a revista deve publicar o seu artigo, destacando a sua
relevância científica, a sua contribuição para as discussões na área em que se insere, o(s)
ponto(s) que caracteriza(m) a sua originalidade e o conseqüente potencial de ser citado)
Dada a competência na área do estudo, indico o nome dos seguintes pesquisadores (três) que
podem atuar como revisores do manuscrito. Declaro igualmente não haver qualquer conflito de
interesses para esta indicação.
120
ANEXO 4 – Apresentação do Trabalho em Congresso nacional
121
122
ANEXO 5 – Submissão do Trabalho em Congresso internacional
123
