UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Obtenção e seleção de segregantes através da técnica BSA - Bulk segregants

analysis com maior ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática a partir

de linhagem Saccharomyces cerevisiae PJ694a

Autora: Patrícia Gonçalves Prates Barbosa

Ouro Preto – Minas Gerais

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Obtenção e seleção de segregantes através da técnica BSA - Bulk segregants

analysis com maior ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática a partir

de linhagem Saccharomyces cerevisiae PJ694a

Autora: Patrícia Gonçalves Prates Barbosa

Orientador: Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão

Co-orientadora: Dra. Margarete Alice Fontes Saraiva

Dissertação apresentada ao programa de

Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas Em

Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do título de Mestre

em Ciências Biológicas, área de

concentração Bioquímica e Biologia

Molecular.

Ouro Preto – Minas Gerais

2016

v

DEDICATÓRIA

Aos meus pais Geovane e Anilda, obrigada por

tudo, pelo amor, incentivo, educação e pelos

valores, peças fundamentais na construção da

minha vida.

vi

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão, pela orientação, pela confiança e

por me proporcionar a oportunidade de fazer o mestrado, obrigado pelo aprendizado

científico, que foi fundamental para o desenvolvimento deste trabalho e para o meu

amadurecimento.

A Dra. Margarete Alice F. Saraiva, pela co-orientação, pelo aprendizado constante, pela

grande dedicação, incentivo e todo auxílio prestado, obrigada pela amizade, pela

paciência, enfim, pela pessoa e pela pesquisadora que você é.

Ao prof. Dr. Ieso Miranda Castro, pelo auxílio e disponibilidade nos momentos que

precisei.

Ao Dr. Fabio Faria, Dr. Rafhael Hermano, Dra. Fernanda Godoy e Dra. Fernanda Piló

pelo auxílio no desenvolvimento deste trabalho.

Ao prof. Dr. Luiz Carlos Crocco, pela disponibilização do Laboratório de Imunologia e

Parasitologia.

À Zezé Trópia, por toda sabedoria, entusiasmo e apoio, a Geraldo Sampaio por toda

ajuda prestada.

À Anna Clara Campos, Diogo Castanheira e Thalita Araújo, pelo companheirismo e

amizade ao longo de todo este tempo e por tornar tudo mais divertido.

Aos amigos atuais e antigos do LBCM: Aureliano, Bruna, Eduardo, Filipe, Hygor,

Maria Ana e Lorena pelo conhecimento compartilhado, pela convivência e amizade.

Aos professores do NUPEB, pelos ensinamentos.

A Marcel Barbosa, pelo carinho, compreensão e apoio nos momentos difíceis e a minha

família que sempre me incentivaram e me apoiaram.

À UFOP, pelo ensino público, gratuito e de qualidade.

A FAPEMIG pelo financiamento do projeto de pesquisa.

vii

RESUMO

A H+-ATPase de membrana citoplasmática de Saccharomyces cerevisiae

mantem o gradiente eletroquímico necessário para o transporte de íons, de nutrientes

essenciais e pelo controle do pH interno. A ativação da H+-ATPase da membrana

citoplasmática em S. cerevisiae induzida pela glicose é dependente de cálcio e o

metabolismo do fosfatidilinositol parece estar envolvida neste processo de ativação da

enzima. A proteína Arg82 p é uma inositol quinase que tem como uma das suas funções

fosforilar o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) em inositol 1,3,4,5-tetrafosfato (IP4) e inositol

1,3,4,5,6-pentafosfato (IP5) considerados importantes mensageiros na regulação da

homeostase de Ca2+

citosólico. O mutante arg82 da linhagem de S. cerevisiae PJ69

apresenta uma atividade da H+-ATPase superior a linhagem selvagem, indicando uma

relação da ausência dessa proteína com o aumento nas concentrações de IP3 e de cálcio

citosólico com subsequente ativação da H+-ATPase. Curiosamente, esse efeito não é

observado com o mesmo mutante obtido para a linhagem BY4742. Para estudar essa

aparente contradição foram realizados cruzamentos o mutante arg82 do background

PJ69 (apresentando maior ativação da Pma1 p induzida por glicose) e a estirpe

selvagem do background BY4742 (com menor ativação da Pma1), com posterior

seleção de segregantes que possuem os fenótipos similares ao da linhagem parental

superior (arg82 do background PJ69). Após cruzamento dessas linhagens, 600

segregantes F1 foram testados quanto à suscetibilidade ao antibiótico higromicina e ao

cloreto de lítio. Aproximadamente 34 segregantes que apresentaram comportamento

similar ao parental superior foram selecionados para análise da acidificação induzida

por glicose para confirmação da maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose.

Dentre esses segregantes, vinte com fenótipo superior podem ser utilizados para o

mapeamento de QTLs relacionados à maior ativação da H+-ATPase induzida por

glicose na linhagem S. cerevisiae PJ694a.

viii

ABSTRACT

The plasma membrane H+-ATPase of Saccharomyces cerevisiae maintains the

electrochemical proton gradient necessary for ion and essential nutrient transport and

plays an important role in internal pH control. Glucose induced activation of plasma

membrane H+-ATPase in the S. cerevisiae is dependent on calcium and it seems that the

phosphatidylinositol metabolism could be involved in this activation process of enzyme.

Arg82p is a multikinase inositol polyphosphate with functions of phosphorylate inositol

1,4,5-triphosphate (IP3) to inositol 1,3,4,5-tetraphosphate (IP4), and inositol 1,3,4, 5,6-

pentaphosphate (IP5) that are important messengers in the regulation of cytosolic Ca2 +

homeostasis. S. cerevisiae PJ69-4a strain with mutations in the ARG82 gene showed a

higher activation of the H+-ATPase than the wild strain, indicating the possible

relationship between the absence this protein and increasing of IP3 concentrations and

cytosolic calcium with subsequently activation of the H+-ATPase. Intriguingly, the

Euroscarf (BY4742) arg82Δ mutante presented different response. In order to study this

contrary response, it was carried out cossing between the S. cerevisiae PJ69-4a, superior

parental strain (with increased glucose induced activation of Pma1 p) and S. cerevisiae

BY4742 (inferior parental strain) with subsequent selection of segregants that showed

good phenotypes similar the superior parental strain. After crossing of these strains, the

600 segregants (F1) were tested for susceptibility to hygromycin B and lithium chloride.

Approximately 34 segregants that showed profile similar to the superior parental strain

were selected to analysis of acidification-induced glucose for confirmation of the

activation of plasma membrane H+-ATPase. Among these segregants twenty with

superior phenotype may be used for mapping QTL related to higher glucose induced

activation of plasma membrane H+-ATPase in the S. cerevisiae strain PJ69-4a.

ix

LISTA DE ABREVIAÇÕES

µ (h-1

): taxa de crescimento específica

AMPc: Adesosina monofosfato cíclico

Arg82p: Fator transcricional envolvido na regulação de genes controlados por arginina

ARG82: Gene que codifica para o fator transcricional Arg82p.

DAG: diacilglicerol

EUROSCARF: European Saccharomyces cerevisiae Archive for Functional Analysis

GAL: Genes envolvidos no metabolismo de galactose

GAL1: Gene que codifica para a galactoquinase

GAL2: Transportador de glicose

Gal4p: Fator transcricional envolvido na regulação de genes controlados por galactose

Gal80p: Fator transcricional envolvido na repressão do fator transcricional Gal4p.

Glc-6P: Glicose-6-fosfato

Glc-1P: Glicose-1-fosfato

Glk: Glicoquinase

Gpa2p: subunidade α da proteína G

Hxtp: Proteínas transportadoras de hexose

Hxkp: Proteína hexoquinase

IP3: Inositol 1,4,5 -trifosfato

IP4: Inositol 1,3,4,5 - tetrafosfato

IP5: Inositol - 1,3,4,5,6 pentafosfato

kDa: quilodáltons

MAT: gene que cofifica para o fator de acasalamento da levedura

PIP2: fosfatidilinositol bifosfato

PGM1: Gene que codifica para a proteína fosfoglicomutase que é responsável pela

conversão de glicose 6-fosfato a glicose 1-fosfato.

x

PGM2: Gene que codifica para a proteína fosfoglicomutase que é responsável pela

conversão de glicose 1-fosfato a glicose 6-fosfato

Plc1p: Proteína fosfolipase C inositol específica

PMA1: gene que codifica Pma1p

Pma1p: proteína próton-ATPase (H+-ATPase)

Pmc1p: Cálcio ATPase vacuolar; capta cálcio do citosol para o vacúolo

Ptk2p: Proteína serina/treonina quinase envolvida na regulação do transporte de

íons na membrana plasmática de leveduras.

Snf3p: Proteína que atua como sensor de alta afinidade para glicose

Yvc1p: proteína presente na membrana do vacúolo que libera cálcio para o citoplasma.

QTL: Quantitative traits locus – Locus de características quantitativas

BSA: Bulk segregants analysis – Análise de segregantes agrupados

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo. ............................. 22

Tabela 2: Crescimento cellular dos segregantes em presença de higromicina (150 µg/mL) ..... 47

Tabela 3: Valores da densidade ótica obtidos pelos segregantes selecionados no teste de

sensibilidade a cloreto de lítio (50mM) ....................................................................................... 50

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Ciclo de vida heterotálico e homotálico em Saccharomyces cerevisiae. ....................... 4

Figura 2: Modelo da estrutura da H+-ATPase na membrana citoplasmática em leveduras ......... 6

Figura 3: Via hipotética de ativação da H+-ATPAse induzida por glicose ................................ 11

Figura 4: Via da galactose e genes envolvidos em S. cerevisiae.. ............................................. 12

Figura 5: Via hipotética de ativação da H+-ATPase e metabolismo da galactose.. ................... 15

Figura 6: Esquema da técnica BSA, análise de segregantes agrupados em levedura.. .............. 19

Figura 7: Disposição e identificação das colônias dos haploides na placa do micromanipulador

..................................................................................................................................................... 28

Figura 8: Perfis de crescimento de S. cerevisiae ........................................................................ 32

Figura 9: Acidificação extracelular induzida por glicose. ......................................................... 35

Figura 10: PCR mating type das S. cerevisiae. .......................................................................... 39

Figura 11: Histograma do conteúdo de DNA das leveduras parentais e híbridas obtidos por

citometria de fluxo após marcação com iodeto de propídio ........................................................ 40

Figura 12: Acidificação extracelular induzida por glicose da levedura PJ69arg82Δ e das cepas

resultantes do cruzamento ........................................................................................................... 41

Figura 13: Células esporuladas do híbrido 10 resultante do cruzamento entre S. cerevisiae .... 42

Figura 14: Crescimento das cepas de leveduras parentais BY4742 (wt) e PJ69arg82Δ em

diferentes concentrações de higromicina .................................................................................... 44

Figura 15: Crescimento dos segregantes em presença de higromicina. ..................................... 46

Figura 16: Crescimento das cepas de leveduras parentais BY4742 (wt) e PJ69arg82Δ em

diferentes concentrações de cloreto de lítio ................................................................................ 48

Figura 17: Crescimento de segregantes em presença de cloreto de lítio (50mM).. ................... 49

Figura 18: Acidificação extracelular induzida por glicose dos segregantes selecionados no teste

de sensibilidade a cloreto de lítio (50mM). ................................................................................. 51

xiii

Sumário

LISTA DE ABREVIAÇÕES ...................................................................................................... ix

LISTA DE TABELAS ................................................................................................................. xi

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ xii

1.0 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 1

1.1 Introdução .......................................................................................................................... 1

1.2 Leveduras Saccharomyces cerevisiae ......................................................................... 2

1.3 H+-ATPase de membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae ................ 4

1.4 Via de transdução de sinal da ativação da H+-ATPase por glicose ......................... 7

1.5 Atividade da H+ATPase e o metabolismo da galactose .......................................... 12

1.6 Arg82 p, proteína bifuncional em S. cerevisiae e atividade da H+-

ATPase ................ 14

1.7 Mapeamento de QTL (Quantitative Traits Locus) e análise de agrupamento de

segregantes (BSA-Bulk Segregant Analysis) ....................................................................... 17

2.0 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 20

3.0 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 21

4.0 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 22

4.1 Microrganismos ............................................................................................................... 22

4.2 Meios de cultivo ............................................................................................................... 23

4.3 Cultivo de S. cerevisiae em duas diferentes fontes de carbono .................................... 23

4.4 Acidificação extracelular ................................................................................................ 23

4.4.1 Condições de crescimento e preparo das células de leveduras para medida da

acidificação ......................................................................................................................... 24

4.4.2 Medida da acidificação extracelular induzida por glicose .................................... 24

4.4.3 Medida da acidificação extracelular induzida por galactose ............................... 25

4.4.4 Determinação do peso seco das células de levedura .............................................. 25

4.4.5 Cálculo da taxa de acidificação extracelular ......................................................... 25

4.5 Obtenção e seleção de haploides com maior ativação da H+-ATPase à partir do

cruzamento entre S. cerevisiae PJ694a e S. cerevisiae BY4742 ......................................... 26

4.5.1 Confirmação das linhagens parentais com fenótipo superior e inferior para

ativação da H+-ATPase ..................................................................................................... 26

4.5.2 Cruzamento entre S. cerevisiae PJ69-4a e S. cerevisiae BY4742 .......................... 26

4.5.3 Determinação do mating type das leveduras .......................................................... 26

4.5.4 Esporulação das leveduras obtidas do cruzamento ............................................... 27

4.5.5 Dissecação de tétrades e obtenção dos segregantes haploides .............................. 27

4.6 Análise da ploidia por Citometria de Fluxo ...................................................................... 28

xiv

4.7 Avaliação do crescimento dos haploides em presença de higromicina ....................... 29

4.8 Avaliação do crescimento dos haploides em presença de cloreto de lítio ................... 29

5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 31

5.1 Crescimento de S. cerevisiae em duas diferentes fontes de carbono ........................... 31

5.2 Análise da acidificação extracelular induzida por glicose e galactose .................... 34

5.3.3 Avaliação do crescimento dos segregantes em presença de higromicina ............ 43

5.3.4 Seleção de segregantes sensíveis ao cloreto de lítio................................................ 48

5.3.5 Seleção de segregantes com maior taxa de bombeamento de prótons ......................... 51

6.0 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 53

7.0 PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 54

REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 55

1.0 REVISÃO DE LITERATURA

1.1 Introdução

Saccharomyces cerevisiae é uma das leveduras mais investigada entre os

organismos eucariotos, servindo como organismo modelo para a compreensão de

diversos fenômenos celulares. Nessas leveduras é imprescindível o papel de proteínas

presentes na membrana plasmática que atuam na percepção dos sinais e estímulos,

provindos do meio exterior com subsequente transmissão de sinais intracelulares

gerando respostas fisiológicas, caracterizando um processo de transdução de sinal (Hug

e Sarre, 1993; Carvalho, 2007). Muitas estratégias de estudo da sinalização celular em

organismos superiores são baseadas em experimentos utilizando vias de sinalização

celular conservadas em fungos (Fontana et al., 2010; Hetz, 2012; Treusch et al., 2015).

Em S. cerevisiae a atividade da H+-ATPase da membrana plasmática é regulada

por modificações pós-traducionais envolvendo uma via de sinalização induzida por

glicose e metabolismo de cálcio (Tropia, 2003; Tropia et al., 2006; Bouillet et al.,

2012). Além disso, está bem estabelecido na literatura que a ativação da H+-ATPase é

mediada por fosforilação (Mcdonough e Mahler, 1982). Embora a via de sinalização

ainda não esteja totalmente elucidada, algumas proteínas e enzimas envolvidas nessa

cascata de sinalização tem sido progressivamente descoberta.

Recentemente, alguns genes que codificam proteínas sensores e reguladoras da

via de sinalização MAPK foram identificados em linhagens de S. cerevisiae utilizando a

metodologia de mapeamento de QTL (quantitative traits locus) (Treusch et al., 2015)

Essa técnica se baseia no sequenciamento do genoma de um pool de segregantes

haploides que apresentam o fenótipo de interesse (Steinmetz et al., 2002, Ehrenreich et

al., 2010). Assim, os QTLs podem ser identificados pela inter-relação entre o fenótipo e

os marcadores genéticos, os SNPs (single nucleotide polymorphisms). Além das

contribuições individuais de cada QTL para determinada característica, também haverá

influência dos efeitos epistáticos, ou seja, das interações existentes entre diferentes

QTLs, e as interações gene-ambiente (Steyer et al., 2012; Pais et al., 2013).

Abordamos nessa revisão os estudos dos mecanismos de ativação da H+-ATPase

de membrana plasmática de S. cerevisiae; a relação da sua ativação com o metabolismo

de galactose e a proteína bifuncional codificada pelo gene ARG82 e a importância da

1

2

técnica BSA (Bulk Segregant Analysis) e de mapeamento de QTL como suporte para

identificação de múltiplas regiões do genoma relacionadas a características de interesse.

1.2 Leveduras Saccharomyces cerevisiae

Leveduras são fungos unicelulares de formato esférico, amplamente encontrados

na natureza e que apresentam capacidade de fermentar açúcares em diferentes meios,

tendo como produtos finais o etanol e dióxido de carbono (Sherman, 2002). S.

cerevisiae é considerada a levedura mais estudada por ser atrativa industrialmente,

sendo muito utilizada na panificação, na fabricação de bebidas como, cervejas, vinhos e

destilados e na produção de bioetanol (Dornelles et al., 2009; Amata, 2013).

O genoma de S. cerevisiae foi o primeiro genoma eucarioto a ser completamente

sequenciado, sendo composto por 16 cromossomos e mais de 13 milhões de bases

(Goffeau et al., 1996), tornando-se acessível para estudos de genômica comparativa,

técnicas de clonagem e engenharia genética (Sherman, 2002; Wolfe, 2006). Atualmente

é possível obter qualquer um dos aproximadamente 6.000 genes de S. cerevisiae

substituídos por alelos mutantes ou completamente silenciados no seu genoma (Wach et

al., 1994; Cherry et al., 1997).

S. cerevisiae apresenta crescimento em presença de várias fontes de carbono,

como glicose, galactose, entre outras. A sua multiplicação e divisão ocorre por

brotamento, em que a célula mãe forma uma protuberância (broto) na sua superfície

externa. À medida que o broto se desenvolve, ocorre a divisão nuclear com formação da

parede celular e finalmente separação das células ou divisão direta (Sherman, 2002).

Normalmente, cepas haploides laboratoriais possuem tempo de geração de

aproximadamente 90 minutos em meio de cultivo YPD (extrato de levedura, peptona e

glicose) e em temperatura ótima de 30 oC. Mas podem apresentar tempo de duplicação

significativamente menor em condições especiais de controle de pH, adição de

nutrientes e em sistema de aeração (Sherman, 1998; Amata, 2013).

O ciclo de vida de S. cerevisiae ocorre por multiplição, cruzamento e divisão por

meiose, esses processos dependem da disponibilidade de nutrientes. Em presença de

nutrientes (por exemplo, uma fonte de carbono fermentável) ocorre à mitose com

consequentes clones de leveduras diploides (2n) e em ausência de nutrientes as células

3

sofrem meiose e esporulam, formando os ascos contendo esporos haploides (n) (Liti,

2015).

O cruzamento entre as leveduras é determinado por alelos de um único locus,

conhecido como MAT, que determina o fator de acasalamento (mating type), assim as

leveduras apresentam MATa ou MATα ou MATa/α. As células haploides MATa ou

MATα liberam feromônios, denominados Fator a e α, respectivamente, o que não ocorre

em células diploides (MATa/α) (Sherman, 1998; Montelone, 2002). Esses feromônios

possuem receptores específicos, sendo que o Fator a se liga ao receptor Ste2 p, presente

na parede das células vizinhas (MATα) e o fator α se liga ao receptor Ste3 p, presente

somente na parede das células MATa (Montelone, 2002; Katz Ezov et al., 2010). Os

feromônios facilitam o processo de acasalamento induzindo a formação de aglutininas

de superfície celular promovendo a fusão das células de mating opostos, desencadeando

a formação de "shmoos" que consiste no alongamento da fusão dessas células. Essa

fusão origina células diploides (a/α) que não respondem a feromônios (Herskowitz e

Oshima, 1981; Thorner, 1981; Jenness et al., 1983).

Os ciclos de vida das leveduras são classificados como homotálico ou

heterotálico, como mostrado na Figura 1. O ciclo heterotálico ocorre em leveduras que

possuem fatores de acasalamento compatíveis, sendo estáveis em cepas haploides e

diploides (Figura 1A). As linhagens de leveduras que possuem ciclo homotálico,

apresentam fase diploide estável, mas as células haplóides possuem capacidade de

trocarem seus tipos de fatores de acasalamento (mating type), apresentando mating

oposto ao de origem, sendo capazes de cruzarem ente si, tornando-se diploides (Figura

1B) (Sherman, 1998; Katz Ezov et al., 2010). Essa capacidade de trocar o mating type

decorre do fato dessas leveduras apresentarem o gene HO ativo. O gene HO codifica

uma endonuclease responsável pela conversão do MATa para Matα ou vice versa,

permitindo as células haploides cruzarem entre si (Sherman, 1998; Katz Ezov et al.,

2010; Haber, 2012).

4

Figura 1 Ciclo de vida heterotálico e homotálico em Saccharomyces cerevisiae. As

leveduras heterotálicas (A) podem ser estavelmente mantidas como diploides (MATa/α)

ou haploides (MATa ou MATα), enquanto que cepas homotálicas (B) são estáveis

somente como diploides (MATa/α), pois as células haploides são transitórias e trocam

seu mating type cruzando entre si (Sherman, 1998).

1.3 H+-ATPase de membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae

A proteína H+-ATPase está presente na membrana citoplasmática de diferentes

tipos de organismos como, algas, fungos e plantas, podendo também ser encontrada em

archaea e protozoários (Meade et al., 1987; Bult et al., 1996; Portillo, 2000). Ela

pertence à família das ATPases do tipo P (P-ATPases) capazes de transportar cátions

contra um gradiente eletroquímico usando ATP como fonte de energia (Axelsen e

Palmgren, 1998). Essa enzima utiliza a energia da hidrólise de ATP para o transporte de

prótons do citoplasma para o meio extracelular, criando um gradiente eletroquímico de

H+, processo indispensável para manter o pH intracelular, captação de nutrientes através

do sistema de transporte ativo secundário e manutenção da homeostase de íons, similar

as Na+, K

+ e Ca

++ -ATPases de mamíferos, que são essenciais para a viabilidade celular

(Chang e Slayman, 1991; Volkov, 2015) (Broach e Volkert, 1991). Além disso, a H+-

ATPase tem papel na indução da alcalinização intracelular que antecede a síntese do

5

DNA no início do ciclo celular (Gillies et al., 1981; Perona e Serrano, 1988; Chang e

Slayman, 1991).

A enzima H+-ATPase é codificada pelo gene PMA1, localizado no cromossomo

VII, essa enzima é essencial para o crescimento celular, um outro gene PMA2,

homologo ao gene PMA1, também codifica uma H+-ATPase, porém é expresso em

baixos níveis (Portillo, 2000).

A atividade da H+-ATPase está intimamente relacionada a aumento do potencial

de membrana celular, já que mutantes do gene PMA1 apresentam menor potencial de

membrana com consequente resistência a higromicina. Com a ativação da H+-ATPase

haveria um aumento do potencial de membrana favorecendo a entrada de nutrientes bem

como aumento da sensibilidade a higromicina e alguns cátions como lítio, sódio e

outros (Perlin et al., 1988; Rogowska‐Wrzesinska et al., 2001).

A estrutura da H+-ATPase é composta por uma única cadeia polipeptídica, com

massa molecular de 100 KDa, que se encontra ancorada na bicamada lipídica das

células. Ela possui uma estrutura terciária com dois grandes domínios hidrofílicos e 10

segmentos transmembranares, como ilustrado na Figura 2. A função da H+-ATPase está

relacionada a mudanças conformacionais nos sítios de fosforilação durante a hidrólise

do ATP que estão intimamente relacionadas ao transporte de cátions (Pedersen e

Carafoli, 1987; Serrano e Portillo, 1990).

6

Figura 2: Modelo da estrutura da H+-ATPase na membrana citoplasmática em

leveduras. Estão representados os segmentos transmembranares (M1-M10); o sítio de

fosforilação (P); região de ligação ao ATP (ATP) (Ambesi et al., 2000).

A atividade da H+-ATPase pode ser regulada a nível de transcrição, por meio do

aumento da síntese de RNA mensageiro do gene PMA1 e pós-tradução com a indução

da atividade da enzima (Moreno e Lagunas, 1991; Portillo, 2000; Brandao, 2014). No

entanto, dados da literatura sugerem que a quantidade da enzima H+-ATPase permanece

praticamente constante durante o crescimento e que a regulação da atividade seria,

sobretudo, decorrente das modificações pós-traducionais (Tropia et al., 2006). Em S.

cerevisiae a atividade dessa enzima é regulada em resposta às condições de crescimento

da célula. Dois principais fatores são responsáveis pela regulação pós-traducional: a

presença de glicose no meio e o pH ácido (Romero et al., 1997). Dependendo do estado

fisiológico das células de levedura, a atividade da H+-ATPase é aumentada durante o

metabolismo da glicose com consequente acidificação do meio de crescimento (Eraso e

Portillo, 1994). Além disso, situações de estresse como presença de etanol, ácidos

7

orgânicos e choque térmico também promovem aumento da atividade da H+-ATPase

(Tropia et al., 2006).

1.4 Via de transdução de sinal da ativação da H+-ATPase por glicose

Em geral, uma via de transdução de sinal (processo de ativação de eventos

intracelulares por estímulos externos) apresenta uma molécula sinal, um receptor que

normalmente está presente na membrana, e um alvo que pode ser uma enzima, canais

iônicos ou um fator de transcrição de genes, e em alguns casos pode ocorrer também a

participação de um mensageiro secundário (Brandao, 2014). A via de ativação da H+-

ATPase de membrana citoplasmática em S. cerevisiae apresenta características inerentes

de uma via de sinalização intracelular relacionada com o metabolismo de cálcio (Tropia

et al., 2006; Brandao, 2014).

Estudos demonstram que ocorre um aumento da atividade da enzima H+-

ATPase, mediada por sua fosforilação, quando S. cerevisiae é crescida em presença de

glicose. Esses dados indicam um mecanismo de regulação por meio de uma via de

transdução de sinal, induzida por glicose envolvendo uma proteína quinase e

subsequente ativação da H+ATPase (Mcdonough e Mahler, 1982; Chang e Slayman,

1991; Brandao, 2014). Um dos processos caracterizados pela adição de glicose no meio

com células de leveduras é o aumento da concentração de AMP cíclico (AMPc)

intracelular, que afeta fisiologicamente as células via uma cascata de fosforilação

dependente da proteina quinase A (Van Der Plaat, 1974). Mas essa via do AMPc parece

não está envolvida na ativação da H+ATPase induzida por glicose (Dos Passos et al.,

1992). Brandão et al., 1994 sugeriram o envolvimento da via do fosfatidilinositol (PI)

na ativação da H+-ATPase induzida por glicose. Outros trabalhos também

demonstraram a relação entre a adição de glicose em meio com células de levedura e a

via do fosfatidilinositol (Kaibuchi et al., 1986; Coccetti et al., 1998).

A ativação da H+ATPase induzida por glicose consistiria inicialmente na

internalização da glicose pelo transportador de hexose Hxtp, seguida da sua fosforilação

catalisada pelas proteínas quinases específicas, Hxk1p, Hxk2p e Glk1p (Hohmann e

Mager, 2007). Considerando a glicose fosforilada como molécula de sinalização que

regula os aspectos fisiológicos da levedura, foram realizadas tentativas para identificar

seus receptores. Em leveduras, três receptores Gpr1p, Rgt2p e Snf3p poderiam estar

envolvidos (Souza et al., 2001). O receptor Gpr1p está associado a Gpa2p (uma

8

proteína G) e à Plc1p (uma fosfolipase), formando um complexo trimérico em células

de leveduras (Ansari et al., 1999; Lemaire et al., 1999). Estudos do nosso laboratório

demonstraram que Gpr1 p não parece estar envolvida na ativação da H+-ATPase; no

entanto, mutantes gpa2Δ não apresentam uma ativação da H+-ATPase, induzida por

glicose, quando comparada com cepas selvagens (Tropia et al., 2006), indicando o papel

da Gpa2p na via de ativação da H+-ATPase. A Plc1 p que hidrolisa fosfatidilinositol

4,5-bifosfato (Flick e Thorner,1993) e apresenta um papel importante na sinalização de

cálcio induzido por glicose (Ansari et al., 1999), é também necessária para a ativação da

H+-ATPase, induzida por glicose (Tisi et al., 2002; Tisi et al., 2004).

Por sua vez, os receptores Snf3p e Rgt2p atuam na geração de sinais

intracelulares envolvidos na transcrição de genes que codificam os transportadores de

hexoses (Hxtp). Snf3p é importante para a indução de alguns genes transportadores de

glicose em baixas concentrações de glicose, enquanto Rgt2p é importante para indução

de outros genes HXT em altos níveis de glicose (Ozcan et al., 1996; Özcan e Johnston,

1999). O receptor Snf3p apresenta a capacidade de detectar os níveis intracelulares de

Glc-6-P e/ou Glc-1-P, e isso desencadeia uma sinalização de cálcio com subsequente

ativação da H+-ATPase da membrana citoplasmática (Tropia et al., 2006).

No intuito de verificar qual proteína quinase estaria envolvida diretamente na

ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática induzida por glicose, estudos

foram realizados e sugeriram que durante o metabolismo de glicose ocorre mudanças

conformacionais na enzima que interferem com a interação inibitória entre a região C-

terminal e o domínio de ligação ao ATP. Isso permitiria a enzima adotar uma

conformação mais ativa, pela fosforilação da enzima nos resíduos de aminoácidos

serina-899 e treonina-912 por uma proteína quinase (Mcdonough e Mahler, 1982; Eraso

e Portillo, 1994). Trabalhos posteriores mostraram que a Ptk2p seria a quinase

envolvida na fosforilação do resíduo Ser-899 (Eraso e Portillo, 1994; Tisi et al., 2004),

a Ptk2p pertence a uma família de proteína quinase serina/treonina relacionada à

ativação de transportadores da membrana citoplasmática (Goossens et al., 2000).

Além disso, a ativação induzida por glicose da H+-ATPase seria dependente da

sinalização de cálcio intracelular, uma vez que estudos paralelos evidenciaram a

fosforilação do açúcar com participação da Plc1p e Gpa2p como sendo proteínas

essenciais para a sinalização de cálcio (Nakajima-Shimada et al., 2000; Tisi et al., 2002;

Tökés‐Füzesi et al., 2002; Brandao, 2014). Esses dados levaram a pressupor que a

9

sinalização de cálcio e a ativação da H+-ATPase atuavam como eventos integrativos

uma vez que a ativação da enzima e a absorção e/ou mobilização interna de cálcio seria

estimulados pela glicose.

Existe uma alteração nos níveis de cálcio citosólico em presença de glicose e

galactose, estudos mostraram que altos níveis de cálcio foram observados com a adição

de 100 mM de glicose em células de leveduras cultivadas em glicose, ao contrário com

a adição de 100 mM de galactose nenhum aumento de cálcio foi observado. Quando as

células foram cultivadas em galactose houve baixa intensidade de cálcio tanto com a

adição de galactose como de glicose, sugerindo que a homeostase de cálcio em

leveduras poderia está associado aos níveis de glicose-6-fosfato (Glc6P) e glicose-1-

fosfato (Glc1P) (Aiello et al., 2002; Groppi et al., 2011).

A relação entre Glic-1P e os níveis de cálcio foi demonstrada ao realizar cultivo

de leveduras que apresentam mutações no gene PGM2 (que codifica uma

fosfoglicomutase) em galactose. Estas células apresentaram aumento nos níveis de

Glic1P com acumulação de cálcio vacuolar (Fu et al., 2000; Aiello et al., 2002; Aiello

et al., 2004). Mutantes pgm2Δ apresentam uma deficiência na homeostase e sinalização

de cálcio e menor atividade da H+-ATPase (Tropia et al., 2006; Brandao, 2014). Além

disso, leveduras com deleção no gene PMC1 (que codifica a Ca2+

-ATPase responsável

pela acumulação de cálcio no interior vacúolo) em uma cepa que apresenta pgm2Δ

restaura a homeostase de cálcio em níveis comparáveis a cepa selvagem, sugerindo, que

a acumulação intracelular de Glc1-P estimula a atividade Pmc1 p (Fu et al., 2000;

Aiello et al., 2002; Aiello et al., 2004).

Esses dados parecem confirmar que Pmc1 p desempenha papel importante na

disponibilidade de cálcio intracelular, cuja atividade influencia na ativação de H+-

ATPase. Além disso, esses dados indicam que o sensor de glicose Snf3p seria inibido

pelo aumento da relação entre a Glc-1P e Glc-6P induzindo um aumento de cálcio no

citoplasma via inibição da Pmc1p e, consequentemente, ativação da H +ATPase (Tropia

et al., 2006; Brandao, 2014).

Um canal de alta afinidade (GIC) atua como transportador, sendo o principal

responsável pelo influxo de cálcio do meio externo para o citosol por adição de glicose

(Brandao, 2014). E o canal de cálcio Yvc1p é um componente importante na via de

sinalização de ativação da H+-ATPase induzida por glicose, uma vez que a ativação

deste canal parece estar correlacionada com as mudanças nas concentrações

10

intracelulares de IP3 (Bouillet et al., 2012). No entanto, resultados demonstraram que

não é o IP3 que está envolvido diretamente com a ativação do canal de cálcio Yvc1 p, é

possível que outros componentes possam mediar à ação do IP3 sobre a mobilização de

cálcio do vacúolo (Palmer et al., 2001).

O aumento nas concentrações de cálcio intracelular foi observado em leveduras

que possuem mutações no gene ARG82 (que codifica uma multiquinase inositol

polifosfato) (Tisi et al., 2004). Esses mutantes apresentaram também um aumento na

concentração de fosfatidil inositol trifosfato (IP3) e maior ativação da H+-ATPase

(Tropia et al., 2006).

Essas informações permitiram propor um modelo hipotético relacionando níveis

intracelular de cálcio, induzido por glicose, e regulação pós-transcricional da H+ATPase

(Figura 3). A via de ativação da H +ATPase dispõe de duas vertentes em que a adição

de glicose controla a disponibilidade de cálcio citosólico com consequente ativação

desta enzima (Tropia et al., 2006).

Em síntese, o primeiro lado da via está relacionado ao transporte de glicose e sua

fosforilação por diferentes quinases, gerando um sinal que ativa a proteína Gpa2p que,

por sua vez, estimula a atividade da Plc1p. Subsequentemente, o fosfatidil inositol

bifosfato (PIP2) seria hidrolisado à diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3), que

possuiria interação direta ou indireta com o canal de cálcio Yvc1p, regulando dessa

forma a intensidade da sinalização de cálcio no citoplasma. O outro lado da via estaria

relacionado com a inibição do sensor de glicose Snf3p pelas concentrações de Glc-1P e

Glc-6P com sucessiva inibição da Pmc1p, gerando uma maior concentração de cálcio no

citoplasma e consequentemente maior atividade da H+-ATPase. O aumento de cálcio

citosólico em ambos os lados da via hipotética ativa uma quinase (Ptk2p) que seria a

responsável pela fosforilação da calda carboxi-terminal da H+-ATPase, levando a

extrusão de prótons (Figura 3).

11

Figura 3: Via hipotética de ativação da H+-ATPAse induzida por glicose. A glicose

é internalizada por Hxt p, fosforilada por Hxk1p e Hxk2p e Glk1p. Gpa2p receptor do

sinal (glicose fosforilada) ativa Plc1p convertendo PIP2 em DAG e IP3. O IP3 ativa uma

proteína ainda em estudo que ativa Yvc1 p levando a saída de cálcio do vacúolo,

induzindo uma quinase a fosforilar e ativar a H+-ATPAse. O outro lado da via consiste

na internalização da glicose por Hxt p, fosforilação pelas Hxk1p e Hxk2p e Glk1p sendo

posteriormente convertida em Glic-1P por Pgm1p e Pgm2p. O aumento da relação entre

as concentrações de Glc-1P e Glc-6P inibiria a Snf3p, com consequente inibição da

Pmc1p, aumentando o cálcio citoplasmático e subsequnete ativação da H+-ATPase

(Brandao, 2014).

12

1.5 Atividade da H+-ATPase e o metabolismo da galactose

O metabolismo de galactose em levedura inicia quando a galactose é

transportada para dentro das células através da permease específica Gal2p, seguida da

sua converção em glicose-1-fosfato pela enzima galactoquinase Gal1p (Bhat e Murthy,

2001).

A Figura 4 ilustra a via de metabolismo da galactose e os genes envolvidos

(Adhikari et al., 2014).

Figura 4: Via da galactose e genes envolvidos em S. cerevisiae. A via da da

galactose inicia com a proteína Gal4p, responsável pela ativação da transcrição dos

genes envolvidos na ativação da via da galactose (MEL1, GAL7, GAL10, GAL1, GAL2,

GAL3. Na ausência de galactose a proteína repressora da transcrição Gal80 p se associa

a proteína Gal4p impedindo a ativação da via. Em presença de galactose a proteína

repressora Gal80p é afastada pelas proteínas Gal1p e Gal3p, deixando Gal4p livre para

subsequente ativação da transcrição dos genes da via (Adhikari et al., 2014).

Os principais genes envolvidos na via da galactose são GAL1, GAL7 e GAL10

que se encontram associados, mas são transcritos separadamente a partir dos promotores

individuais, GAL2 e MEL1 que se encontram em diferentes cromossomos. O gene

13

GAL4 codifica uma proteína ativadora da transcrição dos genes envolvidos na via da

galactose e do gene GAL80, que possui repercussão oposta, uma vez que codifica a

proteína repressora Gal80p com ação direta sobre Gal4p.

A expressão dos genes é estritamente regulada, induzida pelo crescimento em

presença de galactose e reprimida durante o crescimento em glicose (Johnston et al.,

1994; Gancedo, 1998; Conrad et al., 2014). A proteína intracelular Gal3p atua como

transdutor de sinal e se liga a galactose e ao ATP o que a permite se ligar a Gal80p,

favorecendo a ativação da transcrição dos genes GAL envolvidos na via da galactose. É

importante ressaltar que a interação entre Gal3p e Gal80p só é possível em presença de

galactose e ATP (Lavy et al., 2012; Conrad et al., 2014).

O complexo Gal1p e Gal3p impede a acumulação de Gal80p no núcleo, o que

reduz a inibição de Gal4p, ativador transcricional. A Gal4p é uma proteína que se liga

fortemente a região UAS do DNA e ativa a expressão do genes estruturais. A ativação

de Gal4p facilita a associação dos complexos de cromatina, e a maquinaria

transcricional basal que conduz a expressão dos genes GAL (Keegan et al., 1986; Ma e

Ptashne, 1987; Bhat e Murthy, 2001; Bhat e Iyer, 2009; Adhikari et al., 2014; Conrad et

al., 2014).

A proteína bifuncional Gal1p possui a função de sinalização, ativando a proteína

quinase Snf1p que fosforila as proteínas repressoras Mig1p e Mig2p, favorecendo a

dissociação da Gal80p com consequente afastamento para o citoplasma (Keegan et al.,

1986; Ma e Ptashne, 1987; Bhat e Murthy, 2001; Bhat e Iyer, 2009; Adhikari et al.,

2014; Conrad et al., 2014).

Em síntese, a indução de GAL4, pode ocorrer por dissociação de Gal80p ou por

impedimento de Gal80p se ligar a Gal4p. Assim sendo, na ausência de galactose, Gal80

p se liga a Gal4p, já em presença de glicose a expressão dos genes GAL é reprimida da

seguinte forma: glicose é internalizada através transportadores de hexoses (Hxt p) e com

o aumento dos níveis de glicose intracelular, Gal3p se dissocia de Gal80p possibilitando

a mesma a entrar com consequente inibição de Gal4p. A glicose também provoca

inativação da quinase Snf1p, o que favorece o deslocamento dos repressores

transcricionais Mig1p e Mig2p para o nucleo, com regulação negativa dos genes GAL

(Conrad et al., 2014).

Linhagens de levedura com mutação no gene PGM2 quando cultivadas em meio

com galactose acumulam glicose 1-fosfato (Glc-1P) e aumenta o acúmulo de Ca2+

nos

14

compartimento celulares. A enzima fosfoglicomutase realiza a conversão de Glc-6-P em

glicose 1-fosfato (Glc-1P), quando se utiliza glicose. Ao utilizar a galactose como fonte

de carbono a um aumento de Glc-1P pela ausência de da Pgm2p, além disso, usando

galactose, a galactose-1-fosfato em presença da transferase Gal7p e da epimerase Gal10

p seria convertida em glicose-1fosfato. Esse aumento da concentração de glicose-1-

fosfato levaria a um aumento da relação entre Glc-1P e Glc-6P provocando assim uma

inibição do sensor de glicose Snf3p, o que consequentemente levaria a uma não inibição

da Ca2+

ATPase Pmc1p, responsável por transportar o Ca2+

do citoplasma para o

vacúolo, diminuindo assim a disponibilidade de cálcio no citoplasma com consequente

diminuição da atividade da H+ ATPase e menor extrusão de prótons.

1.6 Arg82p, proteína bifuncional em S. cerevisiae e atividade da H+-ATPase

O gene ARG82, codifica a proteína Arg82p, que é uma inositol quinase, que

fosforila o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) em inositol 1,3,4,5-tetrafosfato (IP4) e inositol

1,3,4,5,6-pentafosfato (IP5), envolvidos na regulação da homeostase de Ca2+

na célula

(Xia e Guang, 2005). As suas atuações como mensageiros ocorrem quando o IP3 é

liberado do retículo endoplasmático para o citosol e o IP4 é responsável por mediar à

entrada de Ca2+

através da membrana plasmática e mobilizar Ca2+

intracelular agindo

sinergicamente com IP3 (Vetter e Leclerc, 2003).

O inositol polifosfato são moléculas de sinalização importantes nos processos

envolvidos na transcrição, tais como, a exportação de RNAm, reparação do DNA,

remodelação da cromatina, sinalização de cálcio induzido por glicose e alongamento

dos telômeros (El Alami et al., 2003; Steger et al., 2003; Tisi et al., 2004).

15

Figura 5: Via hipotética de ativação da H+-ATPase e metabolismo da galactose. A

galactose é internalizada por Gal2p, fosforilada por Gal1p, sendo posteriormente

convertida em Glic-1P por Gal7p e Gal10p. O aumento da concentração de Glc-1P

levaria a um aumento da relação entre as concentrações de Glc-1P e Glc-6P provocando

assim uma inibição do sensor de glicose Snf3p e uma não inibição da Ca2+

ATPase

Pmc1p, aumentando as concentrações de cálcio no vacúolo, diminuindo o cálcio

citosólico disponível e diminuindo a ativação da H+-ATPAse.

A Arg82 p forma um complexo com Arg80p, Arg81p e Mcmlp com função de

regular a expressão de genes do metabolismo da arginina. O mutante arg82Δ apresenta

aumento da expressão dos genes catabólicos da arginina e repressão dos genes

anabólicos. Esses mutantes apresentam efeitos pleiotrópicos, incluindo dificuldade no

cruzamento e na esporulação das leveduras (Dubois e Messenguy, 1994; Saiardi et al.,

2000).

16

Em relação à homeostase de Ca2+

e o seu envolvimento na atividade da H+-

ATPase, um vínculo pode ser criado já que ambas as vias apresentam componentes em

comum, sendo um deles o IP3 (Pereira, 2006; Tropia et al., 2006).

A fosfolipase C (Plc1p), codificada pelo gene PLC1, está envolvida no aumento

de cálcio citosólico transitório, induzido por glicose em S. cerevisiae, além dos

receptores de hexoquinases Gpr1p / Gpa2p / complexo de proteína (Tisi et al., 2004).

O inositol-trifosfato (IP3) em levedura é rapidamente convertido em IP4 e IP5

pela quinase Arg82p, seguido da fosforilação em IP5 em IP6. Em células com mutação

em ARG82, o sinal de cálcio induzido por glicose é maior quando comparado à estirpe

selvagem. A ativação da Plc1p por glicose leva a clivagem de PIP2 formando IP3 que

está relacionado com o aumento de cálcio citosólico.

Mutantes com deleção no gene ARG82 apresentam maiores concentrações de IP3

e maior sinalização de cálcio (Tisi et al., 2004). No entanto, Carvalho (2007) verificou

que o mutante arg82Δ nos backgrounds BY4742 e PJ69 apresentaram taxas de

bombeamento de prótons diferentes no teste de acidificação extracelular induzido por

glicose, medida indireta da H+ATPase, quando comparados às respectivas estirpes

selvagens. O mutante arg82Δ no background PJ69 apresentou maior taxa de

bombeamento de prótons quando comparado ao mutante arg82Δ do background

BY4742, sugerindo que o metabolismo do fosfatidilinositol embora relacionado ao

fenótipo de maior taxa de bombeamento de prótons apresenta diferentes, quando as

estirpes das linhagens PJ69 e BY4742 são comparadas (Carvalho, 2007).

17

1.7 Mapeamento de QTL (Quantitative Traits Locus) e análise de agrupamento de

segregantes (BSA-Bulk Segregant Analysis)

O estudo de fenótipos poligênicos por meio da análise de QTLs (Quantitative

Traits Locus) consiste em um método estatístico que correlaciona fenótipo e genótipo,

identificando as bases genéticas de uma característica de interesse. Essa técnica

relaciona características complexas a regiões específicas dos cromossomos, o que

confere benefícios nos estudos genéticos em várias áreas (Consortium, 2003; Miles e

Wayne, 2008). As células de leveduras são muito utilizadas no estudo de propriedades

poligênicas devido a sua fácil manipulação e propagação no laboratório, por exemplo,

milhões de células segregantes meióticas podem ser facilmente obtidas a partir da

esporulação de cepas diploides (Pais et al., 2014).

As características fenotípicas podem ser classificadas em qualitativas e

quantitativas. Quando a característica é controlada por um único locus, ou seja, possui

pequena influencia no fenótipo, a mesma é considerada qualitativa. Quando a variação

fenotípica é mensurável, essa característica vem a ser considerada quantitativa com

envolvimento de dois ou mais genes. A técnica de QTL vem sendo muito empregada

em estudos de características quantitativas visando à identificação de vários locus

(Botstein e Risch, 2003; Swinnen, Thevelein, et al., 2012).

Inicialmente, a análise de QTL era limitada devido a altos custos, baixa

resolução de mapeamento e grandes tamanhos de amostras, o que vem sendo reajustado

ao longo tempo com significativo progresso (Parts et al., 2011). Assim, o mapeamento

de QTLs apresenta várias aplicações e tem revelado em leveduras regiões envolvidas

com tolerância e máxima acumulação de etanol (Swinnen, Schaerlaekens, et al., 2012;

Pais et al., 2013), termotolerância (Marullo et al., 2009), produção de glicerol

(Hubmann et al., 2013), produção e alta tolerância a ácido acético (Marullo et al., 2007;

Meijnen et al., 2016) e a via de sinalização da MAP quinase (Treusch et al., 2015).

A utilização de grandes populações para os mapeamentos são necessários para

desvendar de forma abrangente as bases genéticas. Dessa forma, a análise de grupos de

indivíduos foi viabilizada por meio do sequenciamento de alta performance, associados

a técnica BSA (bulk segregant analysis), que é capaz de alcançar as regiões, genes e até

mutações de base única (SNPs) relacionados com as características de interesse

(Ehrenreich et al., 2010; Pais et al., 2013). O método de análise de segregantes

18

agrupados em leveduras (BSA) permite a detecção de múltiplos locus relacionados a

determinado fenótipo. Ele consiste inicialmente na obtenção de um grande número de

descendentes haploides com posterior fenotipagem, que consiste na seleção dos

segregantes que apresentam fenótipo similar ao parental superior, e finalmente a

genotipagem do pool de segregantes selecionados. Na prática ocorre como demonstrado

na Figura 5, o cruzamento de uma linhagem teste (fenótipo de interesse) com uma

linhagem referência (fenótipo inferior). Após o cruzamento, a cepa híbrida é submetida

a esporulação. Durante a esporulação ocorre a meiose, que está relacionada com a

mistura dos alelos, consequentemente aumento na diversidade genética associada a

variação na expressão fenotípica da característica quantitativa (Mancera et al., 2008;

Swinnen, Thevelein, et al., 2012). Posteriormente, os segregantes que possuem fenótipo

superior são selecionados compondo o pool superior e ao comparar seus genomas com o

das linhagens parentais (superior e inferior) e do pool randômico (não selecionado) é

possível identificar os QTLs. Desse modo, a frequência de polimorfismos encontrada no

pool de segregantes é determinada pelo sequenciamento, quando o pool for analisado

em relação à cepa de fenótipo superior esta apresentará um aumento na porcentagem de

polimorfismos acima de 50% caso algum(s) gene(s) determinante(s) ao fenótipo

esteja(m) presente(s) no cromossomo em estudo, em contraste o pool não selecionado

apresentará distribuição de frequências de polimorfismos em torno de 50% (Ehrenreich

et al., 2010; Swinnen, Thevelein, et al., 2012; Pais et al., 2014).

19

Figura 6: Esquema da técnica BSA, análise de segregantes agrupados em levedura.

Duas estirpes parentais que possuem fenótipos superior (n) e inferior (n). A cepa híbrida

(2n) é esporulada. Os segregantes (n) são selecionados por apresentar característica

como a parental superior. Adaptado, Pais, 2012.

A análise genética de características complexas continua sendo uma tarefa

desafiadora, vários critérios são necessários, entre eles o grande número de segregantes

que precisam ser fenotipados com posterior seleção de fenótipos (Swinnen,

Schaerlaekens, et al., 2012).

Dessa forma, resolvemos lançar mão desse tipo de análise para estudar as

diferenças existentes nas estirpes de dois backgrounds genéticos diferentes que

poderiam explicar as razões pelas quais o mutante arg82Δ no background PJ69

apresenta uma maior taxa de bombeamento de prótons quando comparado ao mutante

arg82Δ do background BY4742.

20

2.0 JUSTIFICATIVA

A via de sinalização da H+-ATPase ainda está sendo desvendada; portanto,

estudar o fenótipo poligênico do background PJ69 por meio da metodologia de QTL

pode nos favorecer na descoberta de marcadores moleculares (alelos ou SNPs),

eventualmente presentes no background genético PJ69 e ausentes em BY4742 que

poderiam estar direta ou indiretamente relacionados a ativação da H+-ATPase. A análise

poligênica por mapeamento de QTL é um importante mecanismo para esclarecer

possíveis genes envolvidos a um fenótipo de interesse e até mesmo genes envolvidos

em vias de sinalização celular.

Diante disso, apresentamos nesse trabalho uma abordagem da técnica de seleção

de segregantes agrupados presente na metodologia de QTL, com objetivo de identificar

futuramente variantes genéticas subjacente a diferenças fenotípicas de ativação da H+-

ATPase.

21

3.0 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Obter e selecionar segregantes através da técnica BSA - Bulk segregants

analysis com maior ativação da H+

ATPase (Pma1p), a partir da linhagem

Saccharomyces cerevisiae PJ69-4a.

3.2 Objetivos específicos

Comparar o comportamento das cepas Saccharomyces cerevisiae BY4742(wt),

BYarg82Δ, BYgal4Δ, BYgal80Δ, PJ69(wt) e PJ69arg82Δ através do crescimento em

glicose e galactose através do teste de acidificação extracelular induzida por glicose e

galactose;

Selecionar as cepas parentais superior e inferior através do teste de acidificação

extracelular induzido por glicose, medida indireta da atividade da H+-ATPase a partir do

cruzamento das cepas BY4742 e PJ69arg82Δ.

Realizar cruzamento, esporulação e dissecação de tétrades para obter

segregantes;

Selecionar os segregantes utilizando teste de sensibilidade a higromicina, ao

cloreto de lítio e a análise de acidificação extracelular.

22

4.0 MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Celular e Molecular

do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto.

4.1 Microrganismos

Para realização deste trabalho foram utilizadas as leveduras Saccharomyces

cerevisiae obtidas da coleção Euroscarf (European Saccharomyces cerevisiae Archive

for Functional Analysis), linhagens gentilmente cedidas pelo Dr. Enzo Martegani

(Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università degli Studi di Milano, Itália) e

pelo Dr. Johan Thevelein (Katholieke Universiteit Leuven, Bélgica) (Tabela 1).

Tabela 1: Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo.

Código Genótipo Origem

PJ69-2a

MATa; trp-901; leu2-3; 112

ura3-52; his3-200; gal4

gal80; LYS::GAL1-HIS3;

GAL2-ADE2; met2::GAL7-

lacZ.

Dipartimento di Biotecnologie

e

Bioscienze, Università degli

Studi di Milano-

Bicocca, Itália.

PJ69-4a PJ69-2a; arg82::KanMX4

Dipartimento di Biotecnologie

e

Bioscienze, Università degli

Studi di Milano-

Bicocca, Itália.

BY4742

MATα, his3Δ1; leu2Δ0;

lys2Δ0; ura3Δ0.

Coleção Euroscarf.

Y23531 BY4742; arg82:: KanMX4 Coleção Euroscarf.

Y01044

BY4741; MATa; ura3Δ0;

leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0;

GAL4,GAL81::kanMX4

Coleção Euroscarf.

Y00520 BY4741; MATa; ura3Δ0;

leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0;

GAL80::kanMX4

Coleção Euroscarf.

23

4.2 Meios de cultivo

Meio YPD - Composto por extrato de levedura 1% (p/v), peptona de carne 2% (p/v) e

glicose 2% (p/v). O meio sólido foi acrescido de ágar 1,5% (p/v).

Meio YPG - Composto por extrato de levedura 1% (p/v), peptona de carne 2% (p/v) e

galactose 2% (p/v).

Meio para esporulação – Composto por acetato de potássio 1% (p/v), bicarbonato de

potássio 0,05% (p/v) e ágar 2% (p/v), pH 6,0.

Meio para micromanipulação – meio YPD com redução de alguns componentes para

melhorar a transparência. Composto por extrato de levedura 0,5% (p/v), peptona de

carne 1% (p/v), 2% de glicose e ágar 1,5%.

4.3 Cultivo de S. cerevisiae em duas diferentes fontes de carbono

As cepas S. cerevisiae BY4742(wt), BYarg82Δ, PJ69(wt) e PJ69arg82Δ foram

pré-cultivadas em 5 mL de caldo YPD e YPG a 30 ºC por 24 horas sob agitação.

Posteriormente, as culturas foram cultivadas em batelada em frascos Erlemeyer,

contendo um volume final de 25 mL dos meios YPD e YPG sob agitação constante a

200 rpm em incubador rotatório (New Brunswick Modelo G25) à temperatura de 30 ºC.

A absorbância inicial a 600 nm (A600) foi de 0.15 para todas as culturas.

Amostras de 1 mL foram retiradas em intervalos de 3 horas até 60 horas de

crescimento. Tais amostras foram lidas em espectrofotômetro (DU-68

Spectrophotometer- Beckman) em absorbância de 600 nm, a fim de obter o perfil de

crescimento da população das leveduras.

4.4 Acidificação extracelular

A medida do efluxo de prótons através da membrana plasmática das células de

leveduras foi realizada através do método descrito por Coccetti et al., 1998 modificado

por Trópia, 2003.

24

4.4.1 Condições de crescimento e preparo das células de leveduras para medida da

acidificação

As células de leveduras foram crescidas em tubos de ensaio contendo 5 ml de

caldo YPD durante 24 horas a 30 oC e sob agitação. Em seguida, as culturas foram re-

inoculadas em 50 ml do mesmo meio líquido, procedendo-se o crescimento nas mesmas

condições anteriormente descritas.

O volume de 50 mL de células, previamente cultivadas, foi transferido para

Erlemeyer contendo 300 ml de meio YPD e incubado a 30 oC, sob agitação constante a

200 rpm até o final da fase exponencial de crescimento (entre 18 e 20 horas). As células

foram então coletadas por centrifugação a 3.750 rpm por 5 minutos, a 4 oC (centrífuga

Beckman GS-6R) e lavadas 2 vezes em água destilada gelada.

4.4.2 Medida da acidificação extracelular induzida por glicose

Amostras de 0,4 g das células, previamente preparadas, foram coletadas em 5

béqueres, contendo 4,5 ml de tampão de acidificação (Tris-HCl 100 mM, KCl 100 mM,

pH 4.5). Em dois desses béqueres foram adicionados 0,49 ml de água destilada e a

suspensão de células foi homogeneizada acompanhando-se a estabilização do pH por 2

minutos (potenciômetro Ankersmt, ORION, Modelo 720A). Em seguida as células

foram submetidas a um pulso de 1 mmol de H+ pela adição de 10 µl de HCl 100 mM. A

variação de pH foi acompanhada por 6 minutos, e os valores foram registrados de 30 em

30 segundos. Esse procedimento foi realizado duas vezes para cada amostra de célula.

Nas outras três amostras de células foram adicionados 500 µl de glicose 1.0 M

(concentração final de 100 mM), acompanhando-se a variação do pH como descrito

anteriormente para o pulso de HCl.

25

4.4.3 Medida da acidificação extracelular induzida por galactose

Esse procedimento foi realizado como descrito no item 4.5.2 com substituição da

glicose 1.0 M pela galactose 1.0 M. Além disso, as condições de crescimento e preparo

das células de leveduras para medida da acidificação foram realizadas utilizando

galactose como fonte carbono.

4.4.4 Determinação do peso seco das células de levedura

A determinação do peso seco foi realizada em triplicata ao final de cada

experimento de acidificação. Uma alíquota de 100 µl da suspensão de células foi

coletado por filtração a vácuo em membranas de celulose 0,45 µm de porosidade

(Sartorius Stedim Biotech) previamente pesadas. Após a filtração as membranas

contendo as células foram secas em estufa a 80 oC por 24 h e pesadas a fim de

determinar o peso seco das células.

4.4.5 Cálculo da taxa de acidificação extracelular

Os valores de pH obtidos nos experimentos de acidificação foram registrados e

analisados utilizando os programas Microsoft Excel® e Prism 5, em que as taxas de

bombeamento de prótons foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

mmol H+ . h

-1. g

-1 de células = ΔpH ÷ ΔpH (HCl) x 60

Δt x PS x volume da solução (50) x 1000

Onde:

ΔpH = variação de pH na presença de glicose ou galactose;

ΔpH (HCl) = refere-se à variação de pH após a adição de 1 mol H+ (controle)

PS = valor do peso seco médio em gramas

Multiplicou-se por 60 para converter o valor para hora.

Foi dividido pelo peso seco obtendo o resultado em gramas.

Multiplicação por 1.000 na equação, para que a extrusão de prótons seja apresentada em

moles de H+. h

-1 . g

-1 de célula.

26

4.5 Obtenção e seleção de haploides com maior ativação da H+-ATPase à partir do

cruzamento entre S. cerevisiae PJ694a e S. cerevisiae BY4742

4.5.1 Confirmação das linhagens parentais com fenótipo superior e inferior para

ativação da H+-ATPase

Considerando que a adição de glicose promove a ativação da H+-ATPase, a

confirmação dos fenótipos foram realizadas por meio da medida da acidificação

extracelular induzida por glicose como descrito anteriormente no item 4.5.

4.5.2 Cruzamento entre S. cerevisiae PJ69-4a e S. cerevisiae BY4742

As culturas S. cerevisiae PJ69 arg82Δ e S. cerevisiae BY4742(wt) foram

crescidas em YPD a 30°C por 24 horas, sob agitação constante a 200 rpm em incubador

rotatório (New Brunswick Modelo G25). As células foram lavadas com água gelada e

amostras das duas células foram transferidas para placa com ágar YPD. As células

foram misturadas com adição de 10 µL de água destilada estéril na superfície do ágar

YPD. Após a mistura de células secar, as placas foram incubadas a 30 °C por 48 horas.

Após esse período, amostras da biomassa foram coletadas, diluídas e plaqueadas em

ágar YPD para obtenção de colônias isoladas. Após esse período, o matting type dos

híbridos foi confirmado por meio da PCR.

4.5.3 Determinação do mating type das leveduras

O mating type foi determinado por PCR conforme descrito por (Huxley et al.,

1990). As reações foram realizadas em termociclador T100 Thermal Cycler (Bio-Rad)

usando a combinação de primers para as regiões MATlocus, MATa e MATα (MATlocus:

AGTCACATCAAGATCGTTTATGG, MATa: ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG,

MATα: GCACGGAATATGGGACTACTTCG) sintetizados pela Integrated DNA

technology, Brasil. As reações foram conduzidas em 25 µL utilizando 0.2 mM de cada

dNTP, 1 mM de MgCl2, 25 pmol de cada primer, Tampão 1X Green Gotaq® Flexi e

Gotaq® Flexi DNA polimerase (Promega, USA) conforme recomendações do

27

fabricante. As amostras de DNA foram preparadas a partir de suspenções de células de

cada colônia em 8 µL de H2O estéril e posterior aquecimento a 100 ºC por 5 minutos.

As condições das reações foram: temperatura inicial de desnaturação 94 ºC por 4

minutos; 30 ciclos de amplificação a 94 ºC por 1 minuto; 58 ºC por 2 minutos; 72 ºC por

1 minuto e temperatura de extensão final de 72 ºC por 10 minutos. Os produtos de PCRs

foram visualizados usando o equipamento AlphaImager Mini System (Alpha Innotech,

USA) após separação por eletroforese em gel de agarose 1,2% corado com GelRedTM

Nucleic Acid (Biotium, USA).

4.5.4 Esporulação das leveduras obtidas do cruzamento

As células foram pré-cultivadas em 3 mL de meio YPD a 30°C sob agitação

constante a 200 rpm por 24 horas. Após o crescimento, as células foram coletadas por

centrifugação (3.750 rpm por 5 minutos a 4 oC) e lavadas 2 vezes em 1 ml de água

destilada estéril gelada e 1 vez com solução de acetato de potássio. As células foram

ressuspendidas em 20 µL de água destilada estéril e inoculadas em forma de microgotas

na superfície do meio de esporulação em placas. As placas foram incubadas a 22 °C por

aproximadamente sete dias, ou até a visualização da formação de esporos em

microscópio óptico.

4.5.5 Dissecação de tétrades e obtenção dos segregantes haploides

As células que apresentaram formação de esporos foram submetidas à

dissecação de tétrades em micromanipulador (MSM System 400, Singer Instruments,

UK).

Uma pequena porção da biomassa presente no meio de esporulação foi

transferida para microtubos Eppendorf estéril contendo 45µl de água destilada estéril,

5µl de solução de liticase (5000U/mL de liticase, 1.0 M sorbitol, 0.1 M citrato de tri-

sódio, 0.06 M EDTA e 0.14 M β-mercaptoetanol) e rapidamente agitada. Após

incubação por 5 minutos a temperatura ambiente, uma alíquota de 10µl foi colocada em

uma placa de Petri estéril descartável (92 mm X 16 mm, Thermo Scientific Nunc™,

Danmark) contendo meio para micromanipulação acrescido de 300 µg de geneticina,

para crescimento apenas dos esporos com o gene ARG82 deletado. A placa foi levada

para o micromanipulador para dissecação dos ascos e os ascósporos (esporos) foram

ordenados na placa conforme Figura 2. Cada esporo (segregante haplóide) foi

28

individualmente cultivado em 3 mL de YPD e estocados a -80 ºC. Para melhor

identificação dos segregantes, para cada um foi dado um número referente ao asco, uma

letra minúscula referente a posição do esporo e uma letra maiúscula referente a

identificação da placa como o exemplo apresentado na Figura 7.

Figura 7: Disposição e identificação das colônias dos haploides na placa do

micromanipulador. Exemplo do segregante identificado como 1a.A, está localizado na

posição 1 (número do asco), a (letra referente ao esporo), A (letra referente a placa

utilizada na dissecação no micromanipulador).

4.6 Análise da ploidia por Citometria de Fluxo

A ploidia das leveduras foi determinada por quantificação do conteúdo DNA

celular analisado por citometria de fluxo conforme descrito por Popolo et al. (1982)

com algumas modificações. Tal técnica tem como princípio a intensidade da

fluorescência emitida pelo iodeto de propidio intercalados aos ácidos nucléicos.

As células de leveduras previamente cultivadas em 3 mL de YPD por 12 horas

foram coletadas por centrifugação e lavadas 3 vezes em tampão Tris-HCl (50 mM Tris-

HCl, 15 mM MgCl2, pH 7.7). Uma amostra de 2 x 107 células/mL foi fixada com 1 mL

de etanol 70% (p/v) gelado, a temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, as células

foram coletadas por centrifugação, ressuspendidas em 100 µL de tampão Tris-HCl com

RNAse (0,25 mg/mL) e incubadas a 37 °C por 24 horas. Após esse período as células

29

foram tratadas com proteinase K (1mg/mL) por 1 hora a 50 °C. Posteriormente, as

células foram centrifugadas e ressuspensas em 100 µL de solução de iodeto de propídio

(0.046 mM) e mantidas a 4 °C por 48 horas. As amostras foram analisadas em citômetro

FACScalibur (Becton-Dickinson) emitindo laser a 488 nm. As amostras foram

detectadas a 564-606 nm (FL2-A) e a quantidade de DNA foi estimada com base na

intensidade da fluorescência e comparado ao conteúdo de DNA das células de leveduras

de referência (S. cerevisiae S288C MATα e S288c MATa/α).

4.7 Avaliação do crescimento dos haploides em presença de higromicina

Os segregantes foram previamente cultivados em caldo YPD a 30 ºC por 24

horas. Após esse período, os segregantes foram submetidos ao teste de crescimento em

caldo YPD acrescido de 150 µg/mL de higromicina medido por (A600 nm) em um

espectrofotômetro (Reader Model 680 BIO-RAD) mediante incubação a 30ºC por 48

horas. A absorbância inicial a 600 nm foi de 0.1 para todas as culturas. O crescimento

foi avaliado em microplacas de 96 poços (86 x 128 mm, fundo chato) com leitura a cada

6 horas e agitações prévias de 30 segundos antes das leituras. Em cada microplaca foi

realizado o crescimento das linhagens parentais com fenótipo superior (PJ69-4a) e

fenótipo inferior (BY4742). Os segregantes que apresentaram D.O. final próximas ou

semelhantes a cepa parental S. cerevisiae PJ694a (arg82Δ) foram selecionados para o

teste de tolerância ao cloreto de lítio.

4.8 Avaliação do crescimento dos haploides em presença de cloreto de lítio

Os segregantes selecionados pela susceptibilidade a higromicina foram

previamente cultivados em caldo YPD a 30ºC por 24 horas. Após esse período, as

culturas foram submetidas ao teste de crescimento em caldo YPD acrescido de cloreto

de lítio (concentração final de 50 mM) medido por (A600 nm) em espectrofotômetro

(Reader Model 680 BIO- RAD), mediante incubação a 30ºC por 48 horas. A

absorbância inicial a 600 nm foi de 0.1 para todas as culturas. O crescimento foi

avaliado em microplacas de 96 poços (86 x 128 mm, fundo chato) com leitura a cada 6

horas e agitações prévias de 30 segundos antes das leituras. Em cada microplaca foi

realizado o crescimento das linhagens parentais com fenótipo superior PJ69 (arg82Δ) e

com fenótipo inferior BY4742 (wt).

30

Os segregantes que apresentaram D.O. final próximas ou semelhantes a cepa

parental S. cerevisiae PJ694a (arg82Δ) foram selecionados e submetidos a análise da

acidificação extracelular induzida pela glicose (item 4.5). A seleção dos segregantes foi

mediante ao maior ou igual valor da taxa de acidificação em comparação com a parental

superior.

4.9 Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa Prisma 5. As

médias obtidas na análise da acidificação extracelular foram comparadas pelo método

de Tukey, ANOVA, p<0,05 de significância, nos demais testes foram realizados média

e desvio padrão.

31

5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Crescimento de S. cerevisiae em duas diferentes fontes de carbono

Estudos anteriores mostraram que estirpes S. cerevisiae com dois diferentes

background genético (PJ69 e BY4742) com deleção no gene ARG82 apresentaram

diferenças nas taxas de acidificação induzida por glicose quando comparadas as suas

respectivas células selvagens (Carvalho, 2007). Ao analisarmos as informações de seus

genótipos, verificamos que o background PJ69 apresenta também deleções em dois

genes, GAL4 e GAL80 ambos envolvidos na regulação da expressão de genes

envolvidos no metabolismo da galactose. Essas informações fizeram com que

avaliássemos inicialmente o crescimento de diferentes estirpes dos dois background em

glicose e galactose.

Assim, S. cerevisiae PJ69 (wt), PJ69 arg82Δ, BY4742 (wt), BY4742 arg82Δ,

BY4741 gal4Δ e BY4741 gal80Δ foram cultivadas em presença de glicose e galactose,

e os seus perfis de crescimento estão apresentados na Figura 8.

32

Figura 8: Perfis de crescimento de S. cerevisiae PJ69 (wt), PJ69 arg82Δ, BY4742

(wt), BY4742 arg82Δ, BY4741 gal4Δ e BY4741 gal80Δ em glicose e galactose. A e B,

crescimento em glicose; C e D, crescimento em galactose.

As estirpes S. cerevisiae BY4742 (wt), BY4742 arg82Δ, BY4741 gal4Δ e

BY4741 gal80Δ apresentaram diferentes crescimentos em presença de glicose. As

estirpes BY4742 (wt) e BY4741 gal4Δ atingiram D.O. de 4,78 e 3,96, respectivamente

após 30 horas de cultivo (Figura 8A). Enquanto, as leveduras BY4742 arg82Δ e

BY4741 gal80Δ alcançaram D.O. de 3,35 e 2,80, respectivamente após 24 horas (Figura

8A). Nessas mesmas condições, S. cerevisiae PJ69 (gal4Δ, gal80Δ) e PJ69 (gal4Δ,

33

gal80Δ, arg82Δ) apresentaram um baixo crescimento, alcançando D.O. igual a 1.0 com

18 e 33 horas de cultivo, respectivamente (Figura 8B).

Em presença de galactose como fonte de carbono, a cepa BY4742 (wt)

apresentou D.O. de 3,35 em 30 horas de crescimento (Figura 8C). Neste mesmo tempo,

as cepas BY4742 arg82Δ, BY4741 gal4Δ e BY4741 gal80Δ, apresentaram D.O igual a

1,70, 0,78 e 3,70, respectivamente (Figura 8C). Como prevíamos, a cepa BY4741 gal4Δ

apresentou um menor crescimento uma vez que a proteína indutora da transcrição dos

genes do catabolismo da galactose, Gal4p, não estava funcionalmente presente. S.

cerevisiae PJ69-2a (gal4Δ, gal80Δ) e PJ69-4a (gal4Δ, gal80Δ, arg82Δ) apresentaram

crescimento menor após aproximadamente 50 horas de crescimento em presença de

galactose (Figura 8D). As cepas PJ69-2a (gal4Δ, gal80Δ) e PJ69-4a (gal4Δ, gal80Δ,

arg82Δ) não apresentaram fase logarítmica definida tanto quando cultivadas em

galactose quanto em glicose (Figura 8B e 8D).

Os mutantes gal4Δ e gal80Δ do background BY4741 e a estirpe PJ69-2a (gal4Δ,

gal80Δ) apresentaram crescimentos completamente diferentes tanto em presença de

glicose quanto de galactose (Figura 8A e 8C). Comparando o comportamento dos

mutantes arg82Δ dessas duas linhagens (PJ69 e BY4742) a diferença de crescimento foi

sete vezes menos para a cepa PJ69 arg82Δ em glicose e aproximadamente 20 vezes

menos em galactose (Figura 8). Esse crescimento lento nas cepas com deleção do gene

ARG82 pode ser devido ao maior consumo de energia causado pela maior ativação da

H+-ATPase em detrimento ao crescimento celular, ou seja o maior consumo de energia

para a ativação da H+-ATPase comprometeria o crescimento das celulas (Dubois e

Messenguy, 1994).

Os resultados mostraram que as cepas BY4742 arg82Δ, BY4741 gal4Δ e

BY4741 gal80Δ apresentaram pouco crescimento ao mudar a fonte de carbono para

galactose como observado pelas cepas PJ69 (wt) e PJ69 arg82Δ. Esses dados

confirmam a dificuldade do crescimento da levedura mutante PJ69 arg82Δ em presença

de galactose como observado também por Carvalho, 2007.

Os mutantes gal4Δ e gal80Δ do background BY4741 apresentaram

comportamentos diferentes das cepas PJ69 (wt) e PJ69 arg82Δ em presença de glicose e

de galactose (Figura 8A e 8D). Assim, é importante ressaltar que quando cultivados em

galactose os mutantes BY4742 arg82Δ, BY4741 gal4Δ apresentaram menores

34

crescimentos quando comparados aos outros mutantes nesta mesma condição (Figura

8C).

Durante o crescimento de células em meio contendo glicose os genes GAL de S.

cerevisiae são expressos em baixos níveis, exceto para o repressor GAL80, para evitar

gastos de energias sintetizando proteínas que não seriam utilizadas, permitindo assim o

rápido crescimento celular (Orr, 2005; Rockman, 2012; Roop et al., 2016).

5.2 Análise da acidificação extracelular induzida por glicose e galactose

Como os nossos resultados mostraram que as estirpes BY4741 arg82Δ, BY4741

gal4Δ e BY4741 gal80Δ não apresentaram alterações drásticas de crescimento ao

mudar a fonte de carbono de glicose para galactose como observado pelas cepas PJ69

(wt) e PJ69 arg82Δ, decidimos comparar a atividade da H+-ATPase induzida por

glicose e galactose nas linhagens BY4741 arg82Δ, BY4741 gal4Δ e BY4741 gal80Δ

através do teste de acidificação extracelular.

Os valores das taxas de acidificação encontrados estão mostrados na Figura 9.

35

Fig

ura

9:

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PJ6

9 (

wt)

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J69 a

rg82

Δ.

36

Todas as linhagens apresentaram maiores taxas de bombeamento de prótons

quando induzidas por glicose (Figura 9-A e 9-C) do que por galactose (Figura 9-B). Nas

ativações induzidas por glicose, a estirpe BY4741 arg82Δ apresentou maior taxa, 0.55

mmol.h-1

.g-1

células, enquanto que as demais apresentaram valores de aproximadamente

0.4 mmol.h-1

.g-1

células (Figura 9-A). Quando a atividade da H+-ATPase foi induzida

por galactose as cepas BY4742, BY4741 arg82Δ e BY4741 gal80Δ apresentaram taxas

de bombeamento de prótons de 0.14, 0.3 e 0.2, respectivamente (Figura 9-B). O mutante

BY4742 arg82Δ apresentou maior taxa de bombeamento de prótons quando comparado

aos demais mutantes do background BY4741. Não foi possível realizar o teste de

acidificação com indução por galactose com as estirpes BY4741 gal4Δ, PJ69 (wt) e

PJ69 arg82Δ uma vez que essas células apresentam pouco crescimento em galactose

por possuirem o gene ativador da via da galactose deletado.

De acordo com os resultados obtidos, podemos constatar que a deleção dos

genes GAL4 e GAL80 não influenciaram positivamente na taxa de bombeamento de

prótons, isto é, não houve aumento da atividade da H+-ATPase nos respectivos mutantes

tanto por indução de glicose como por galactose. Isso indica que não é a deleção dos

genes GAL4 e GAL80 que está relacionada a uma maior ativação da H+-ATPase no

background PJ69.

Os resultados mostram que S. cerevisiae BY4742 (wt) apresentou a menor taxa

de bombeamento de prótons, 0,39 mmol.h-1

.g-1

células (Figura 9-A). As cepas S

cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ, apresentaram as maiores taxas, 0,5 e 0,74,

respectivamente (Figura 9A e 9C) quando a acidificação foi induzida por glicose. Esses

dados confirmam a diferença desse fenótipo entre as cepas do background PJ69 e

BY4742, em que foi observado uma maior atividade da H+-ATPase induzida por

glicose, pelo mutante PJ69 arg82Δ. As cepas contendo deleção no gene ARG82 não

codifica a quinase responsável por fosforilar IP3 logo, mutantes arg82Δ apresentam

aumento nas concentrações de IP3 no citoplasma que atua como mensageiro na resposta

intracelular de cálcio, logo o aumento de IP3, estaria relacionado a um aumento nas

concentrações de cálcio no citoplasma via saída de cálcio do vacúolo e esse aumento da

disponibilidade de cálcio no citoplasma resultaria em um aumento da atividade da H+-

ATPas (Steger et al., 2003; Tisi et al., 2004; Tropia et al., 2006). A metabolização do

IP3 está relacionada ao metabolismo de fontes alternativas de carbono e poderia está

relacionada a expressão gênica regulada por glicose induzindo a ativação da H+ATPase

37

em leveduras através da relação com a via de sinalização de cálcio citosólico (Saiardi et

al., 2000; Carvalho, 2007). Os nossos resultados confirmam dados anteriores, em que o

mutante arg82Δ derivado do background PJ69, quando induzido por glicose apresenta

maior acidificação extracelular e maior ativação enzimática in vitro da H+-ATPase

quando comparado ao BY4742 arg82Δ (Tropia et al., 2006).

A taxa de bombeamento de prótons em todas as cepas foi maior quando induzida

por glicose, sendo perceptível que todas as células quando induzidas por glicose

apresentaram aproximadamente o dobro de bombeamento de prótons quando

comparado às taxas induzidas galactose (Figura 9a, 9B e 9C). Esses dados sugerem uma

menor ativação da H+-ATPase quando utilizada a galactose como fonte de carbono o

que talvez seria justificado pelo modelo hipotético de ativação em que o aumento da

relação Glc1P e Glc6P (ocorrendo em presença de galactose como fonte de carbono)

atuaria inibindo o sensor Snf3 p. Nesse estado de inibição o Snf3 p não inibiria a Pmc1p

(Ca2+

ATPase) com consequente diminuição de cálcio no citoplasma e subsequente

diminuição da atividade da H+-ATPase (Tropia et al., 2006; Brandao, 2014).

A resposta de S. cerevisiae à galactose é uma das vias de sinalização eucarióticas

mais estudadas, acredita-se que os genes GAL não sejam induzidos unicamente quando

os níveis de glicose estão baixos. A indução desses genes também pode ocorrer

dependendo da razão entre galactose e glicose. Há evidências de que detecção dessa

razão ocorra em nível de via de sinalização canônica e com ligação competitiva dos dois

açúcares pelos transportadores de hexoses (Escalante-Chong et al., 2015).

Em resumo, parece então que a diferença dos níveis de ativação da H+-ATPase

da membrana citoplasmática das leveduras nos dois diferentes backgrounds genéticos

não podem ser atribuídos à diferenças no metabolismo de galactose. Dessa forma, e

considerando que a evolução de novas características pode envolver mutações

espalhadas no genoma, escolhemos a análise poligênica por meio da metodologia de

mapeamento de QTLs para verificar as possíveis diferenças genéticas das cepas

BY4742(wt) e PJ69 arg82Δ que estariam relacionadas com o fenótipo de aumento da

atividade da H+-ATPase. Essa metodologia permite a identificação de novos alelos em

organismos que apresentam características fenotípicas diferentes (Orr, 2005; Rockman,

2012; Roop et al., 2016).

38

5.3 Obtenção e seleção de segregantes com maior ativação da H+-ATPase à partir

do cruzamento entre S. cerevisiae PJ69-4a e S. cerevisiae BY4742

As diferenças no nível de ativação da H+ ATPase induzida por glicose foram

confirmadas para as estirpes de S. cerevisiae PJ69 (wt), PJ69 arg82Δ, BY4742 (wt) e

BY4742 arg82Δ, através do teste de acidificação extracelular, representado pela taxa de

bombeamento de prótons em mmoles h-1

g-1

de células como já demonstrado na Figura

9A e 9C.

Diante da confirmação do fenótipo de acidificação extracelular das estirpes do

background BY4742 e PJ69, escolhemos a cepa S. cerevisiae PJ69 arg82Δ (Mata)

como parental superior (maior atividade da H+-ATPase) e a S. cerevisiae BY4742 (wt,

Matα), como parental inferior (menor atividade da H+-ATPase) para o cruzamento e

seleção do pool de segregantes superiores para posterior análise poligênica relacionada

com o fenótipo de maior ativação da H+-ATPase induzida por glicose.

5.3.1 Cruzamento entre S. cerevisiae PJ694a e S. cerevisiae BY4742

Inicialmente, tentamos realizar o cruzamento entre os mutantes arg82 dos dois

background BY4742 e PJ69. Após algumas tentativas foi possível obter dois híbridos

(a/α), entretanto, esses híbridos não foram capazes de esporular. Estudos mostraram que

leveduras com deleções no gene ARG82 são consideradas incapazes de esporular, sendo

o fenótipo restaurado após a transformação da célula com a inserção de um plasmídeo

contendo o gene ARG82 (Dubois e Messenguy, 1994).

Diante disso, resolvemos fazer outra tentativa de cruzamento, o cruzamento foi

realizado com a estirpe PJ69 arg82Δ e a cepa selavagem BY4742 (wt), na expectativa

de que as células conseguissem realizar o cruzamento com subsequente recuperação do

fenótipo de esporulação.

As cepas S. cerevisiae PJ69 arg82Δ e S. cerevisiae BY4742 (wt) apresentam

mating type opostos, MATa e MATα, respectivamente (Figura 10A) e o cruzamento foi

feito como descrito no item 4.6.2. Dezoito colônias, resultantes da diluição da biomassa

formada pela mistura das duas leveduras, foram escolhidas aleatoriamente para realizar

a PCR a fim de confirmar o mating type. Foram obtidos apenas três híbridos,

39

denominamos 10, 12 e 15, resultantes do cruzamento, demonstrado pela amplificação

dos dois amplicons, um com 404 pb (MATα) e outro com 544 pb (MATa) (Figura 10B).

Figura 10: PCR mating type das S. cerevisiae PJ69 arg82Δ e BY4742 (A) e das

colônias obtidas do cruzamento, híbridos (B). PP, DNA ladder 100pb, C1, C2, C3: S.

cerevisiae S288c Matα, Mat a e Mata/α, respectivamente.

Para confirmar também a obtenção dos híbridos foi realizada a análise da ploidia

por citometria de fluxo, a quantidade de material genético dos híbridos e dos parentais

foram comparadas com cepas controles haploides e diploides, como monstrado na

Figura 11.

40

Figura 11: Histograma do conteúdo de DNA das leveduras parentais e híbridas

obtidos por citometria de fluxo após marcação com iodeto de propídio. As linhas

azuis mostram os perfis de conteúdo de DNA da levedura BY4742 (wt) (A); PJ69

arg82Δ (B) e dos híbridos 10 (C), 12 (D) e 15 (E). As linhas vermelhas mostram os

perfis das cepas referências S. cerevisiae haploide e diploide (S288c Matα e Mata/α).

Com a utilização do iodeto de propídio que marca os ácidos nucléicos foi

possível obter o conteúdo relativo de DNA das leveduras por citometria de fluxo. O

histograma ilustra a possibilidade de obter distribuições do DNA com picos de células

em G0/G1 e G2/M (Figura 11). Os híbridos 10, 12 e 15 apresentaram quantidade de

material genético comparáveis a cepas controles diploides marcadas em azul na Figura

11 (Painéis C, D e E respectivamente) com o dobro de conteúdo de DNA que as cepas

parentais (Painéis A e B) . Os parentais BY4742(wt) e PJ69 arg82Δ foram confirmados

41

como haploides de acordo com as cepas controles haploides marcadas em vermelho na

Figura 11 (A e B).

Esses dados da citometria de fluxo e da PCR de mating type, confirmam o

obtenção de três híbridos após o cruzamento das estirpes BY4742(wt) com PJ69arg82Δ.

Embora, células de leveduras com mutação no gene ARG82 sejam consideradas

incapazes de realizar o cruzamentos (Dubois e Messenguy, 1994), foi possível obter

híbridos. Os três híbridos foram submetidos ao teste de acidificação extracelular e

comparado com a cepa parental PJ69arg82Δ para verificar o fenótipo dos mesmos

através das taxas de bombeamento de prótons. As taxas calculadas estão representadas

na Figura 12.

Figura 12: Acidificação extracelular induzida por glicose da levedura PJ69arg82Δ

e das cepas resultantes do cruzamento. Os valores das taxas de bombeamento de H+

seguidos da mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, p<0,05.

A taxa de bombeamento de prótons da S. cerevisiae PJ69 arg82Δ foi 0,72

mmol.h1.g

1.células e das cepas híbridas 10, 12 e 15 foram 0,71, 0,44 e 0,77 mmol.h

-1.g

-

1.células, respectivamente (Figura 13). Houve diferença significativa do valor da taxa de

acidificação apenas para o híbrido 12 (Figura 13). A levedura híbrida 10 foi escolhida

para a etapa posterior de esporulação, dissecação e seleção dos segregantes superiores.

42

5.3.2 Esporulação da levedura obtida do cruzamento

As células de S. cerevisiae diploides inoculadas em ausência de nutrientes

sofrem meiose e esporulam (Neiman, 2005). As células do híbrido 10, resultantes do

cruzamento entre S. cerevisiae BY4742(wt) e PJ69arg82Δ, foram submetidas as

condições de esporulação até visualização da formação de esporos (tétrades) em

microscópio óptico, como mostrado na Figura 13.

Figura 13: Células esporuladas do híbrido 10 resultante do cruzamento entre S.

cerevisiae BY4742 (wt) e PJ69arg82Δ. As setas mostram a formação das tétrades

observadas em microscopia ótica.

O hibrido 10 apresentou boa esporulação, com visualização da formação de

tríades e tétrades após aproximadamente cinco dias de incubação (Figura 13). Tem sido

relatado que levedura mutante arg82Δ não possui capacidade de esporular, sendo

observado formação de ascos somente após inserção de plasmídeo contendo o gene

ARG82 (Dubois e Messenguy, 1994). Como podemos observar na Figura 13 o híbrido

10 foi capaz de esporular evidenciando assim a recuperação de fenótipo pelo

cruzamento com a cepa BY4742 (wt), provavelmente pela incorporação do gene

ARG82.

43

Foram obtidas 18 placas com 16 a 18 tétrades dissecadas por cada placa a fim de

obter uma população de 600 segregantes para seleção do pool superior conforme

sugerido por (Pais et al., 2014), uma vez que quanto maior o número de segregantes

maior a possibilidade de identificação dos QTLs relacionado à característica de

interesse (Ehrenreich et al., 2010). Essa elevada quantidade de tétrades dissecadas foi

necessária, pois o meio de cultura para micromanipulação foi suplementado com

geneticina, a fim de obter segregantes com ARG82 deletado, como a parental superior, o

mutante arg82::KanMX4) no background PJ69. Assim, foi realizada uma triagem à

partir dos 600 segregantes que apresentavam resistência a geneticina (segregantes que

apresentam deleção no gene ARG82) com objetivo de selecionar aqueles que

apresentam um fenótipo similar ao da cepa parental superior (PJ69arg82Δ), que

apresenta a maior atividade da H+-ATPase.

5.3.3 Avaliação do crescimento dos segregantes em presença de higromicina

A atividade da H+-ATPase está diretamente relacionada ao aumento do potencial

de membrana o que auxilia na entrada de nutrientes e cátions na célula. Células com

mutação no gene PMA1 são mais resistentes a higromicina quando comparadas a cepas

do tipo selvagem. Mutantes pma1Δ apresentam diminuição no potencial de membrana

devido a menor atividade da H+-ATPase e consequentemente menor transporte da

higromicina para o interior da célula. Dessa forma, o transporte de prótons está

diretamente relacionado ao aumento do potencial de membrana com consequente

aumento na sensibilidade a algumas drogas como, por exemplo, a higromicina (Perlin et

al., 1988; Rogowska‐Wrzesinska et al., 2001).

Nós escolhemos a sensibilidade a higromicina como primeiro teste para triagem

dos segregantes. Inicialmente foi realizado um teste com as cepas parentais, superior e

inferior para escolha da concentração do antibiótico a ser utilizada, os parentais foram

testados em diferentes concentrações de antibiótico (entre 0 a 800 µg/ml de

higromicina) e a sensibilidade a essas concentrações está demostrado na Figura 14 que

apresenta o crescimento dessas estipes em medidas de densidade ótica (D.O).

44

Figura 14: Crescimento das cepas parentais BY4742 (wt) e PJ69arg82Δ em

diferentes concentrações de higromicina. A, ausência de higromicina; B, 50µg; C,

100µg; D, 150µg; E, 200µg; F, 400µg; G, 600µg; H, 800µg higromicina por mL de

meio YPD.

45

A Figura 14 demonstra o aumento da sensisibilidade das estirpes a higromicina

com o aumento das concentrações. É possível observar que a estirpe PJ69arg82Δ é mais

sensível que a estirpe BY4742 (wt) em todas as concentrações de higromicina (Figura

14).

S. cerevisiae PJ69arg82Δ apresentou crescimento inferior atingindo uma D.O.

de 0.6, enquanto que S. cerevisiae BY4742 (wt) apresentou um maior crescimento

alcançando uma D.O. de 1.3 em 150 µg de higromicina, o crescimento dessa estirpe só

diminuiu a partir de 400 µg de higromicina. Esse resultado mostra que a maior

sensibilidade a higromicina da parental superior (PJ69arg82Δ) (Figura 14), pode ser

devido a uma maior atividade da H+-ATPase que atuaria no aumento do potencial de

membrana com consequente aumento na sensibilidade a cátions (Goossens et al., 2000).

Foi escolhida a concentração de 150 µg (Figura 14 D) para realização de seleção

dos segregantes, uma vez que nessa concentração já é possível observar as diferenças no

crescimento entre as cepas controles (PJ69arg82Δ e BY4742 (wt) . A Figura 15

demonstra o perfil de alguns segregantes durante o processo de seleção.

46

Figura 15: Crescimento dos segregantes em presença de higromicina. Alguns

segregantes selecionados (A e B) e não selecionados (C e D).

A Figura 15 mostra o perfil de alguns segregantes cultivados em presença de

higromicina. Os segregantes 11bF, 12bF, 11dG e 12dG apresentaram crescimento

menor que a cepa PJ69 com 24 horas de crescimento (Figura 15A e 15B). Os demais

segregantes não foram selecionados, pois apresentaram crescimento superior a cepa

PJ69 (Figura 15 A, C e D). A partir dos 600 segregantes, 90 apresentaram crescimento

em higromicina igual ou inferior a parental superior (Tabela 2).

A realização do teste de sensibilidade a higromicina em microplaca permitiu

comparar o crescimento dos segregantes com as cepas controles e verificar pequenas

diferenças de crescimento entre os segregantes (Figura 15) favorecendo assim a

identificação daqueles que apresentaram fenótipo igual ou semelhante ao parental

superior (Perlin et al., 1988; Withee et al., 1998; Marešová e Sychrová, 2007; Pereira et

al., 2015).

47

Tabela 2: Crescimento celular dos segregantes em presença de higromicina (150

µg/mL)

Segregante D.O final Desvio padrão Segregante D.O final Desvio padrão

PJ694a 0,7745 ±0,028284271 1a.A 0,32 ±0,03959798

BY4742 1,51775 ±0,023051681 9a.F 0,751 ±0,080610173

1e.B 0,289 ±0,009899495 12a.F 0,0631 ±0,015414928

3d.A 0,299 ±0,107480231 11b.F 0,0609 ±0,004101219

3h.C 0,25985 ±0,008273149 12b.F 0,07365 ±0,008838835

4a.A 0,0524 ±0,004949747 11c.E 0,06865 ±0,008555992

6b.A 0,395 ±0,212132034 12d.G 0,501 ±0,070710678

6d.B 0,255 ±0,001414214 11e.G 0,052675 ±0,01516744

3d.B 0,249 ±0,036769553 12e.G 0,0645 ±0,035638182

3h.A 0,06555 ±0,000212132 11f.H 0,3046 ±0,059679812

4a.A 0,474 ±0,021213203 12f.H 0,06558 ±0,007382195

6b.A 0,3685 ±0,051618795 11g.H 0,07645 ±0,00205061

6d.A 0,355 ±0,001414214 6c.J 0,07755 ±0,025384391

7a.A 0,0616 ±0,02192031 1d.J 0,055025 ±0,098328573

7c.A 0,0459 ±0,018950462 4d.J 0,074 ±0,021267777

10e.B 0,0591 ±0,016263456 6e.J 0,732 ±0,016445288

8d.B 0,3685 ±0,053033009 4e.J 0,72 ±0,041965631

9d.B 0,3675 ±0,154856385 3g.K 0,723 ±0,052286757

9f.B 0,04675 ±0,006858936 2h.K 0,0701 ±0,040540124

9h.C 0,0438 ±0,002828427 9b.I 0,07785 ±0,047112949

10e.B 0,2671 ±0,299671854 7c.J 0,24305 ±0,210945886

12b.A 0,0542 ±0,001838478 9c.J 0,2268 ±0,210959546

12d.B 0,05095 ±0,008131728 8c.J 0,4926 ±0,063980016

12g.C 0,0518 ±0,010182338 10c.J 0,03545 ±0,053882983

4d.D 0,05375 ±0,000707107 11c.J 0,04765 ±0,033324365

7b.D 0,0511 ±0,014142136 7d.J 0,03705 ±0,008129524

10c.D 0,0559 ±0,005091169 11d.J 0,0436 ±0,013716505

6b.F 0,7645 ±0,198697006 12e.K 0,048905 ±0,064213359

12a.O 0,060365 ±0,000799031 9h.K 0,06825 ±0,030444321

8b.P 0,06575 ±0,011525841 10g.K 0,07599 ±0,097612582

12b.P 0,0617 ±0,011879394 11g.k 0,07245 ±0,068940385

12d.P 0,064435 ±0,028418622 8a.O 0,047 ±0,001202082

11e.Q 0,067 ±0,012869343 8b.L 0,05355 ±0,010889444

12e.Q 0,06115 ±0,019021172 1a.O 0,0721875 ±0,013169864

11c.Q 0,6845 ±0,113844192 3a.O 0,04815 ±0,002404163

8g.R 0,618 ±0,183847763 7a.O 0,05615 ±0,002828427

7h.R 0,548 ±0,230516811 5b.O 0,07205 ±0,020930361

2a.L 0,71865 ±0,029981328 11a.R 0,07655 ±0,01880904

6a.L 0,08455 ±0,020293965 1b.R 0,0562 ±0,006576093

4f.N 0,714875 ±0,06310928 11h.R 0,063875 ±0,013611806

1d.M 0,081575 ±0,02556191 8b.S 0,04865 ±0,011313708

1f.N 0,0849 ±0,016475588 3a.O 0,0577325 ±0,00506642

2b.L 0,08835 ±0,025455844 5b.O 0,0578 ±0,008697413

8c.M 0,09895 ±0,029981328 3c.P 0,0666775 ±0,008948436

12b.M 0,09056 ±0,00125865 4c.P 0,0664375 ±0,024589638

10a.O 0,070862 ±0,015941015 5d.P 0,0780225 ±0,00414011

48

5.3.4 Seleção de segregantes sensíveis ao cloreto de lítio

Considerando a relação da ativação da H+-ATPase e a absorção de cátions, foi

escolhido também o teste de sensibilidade ao cloreto de lítio para seleção dos

segregantes. O lítio inibe o crescimento em concentrações suficientemente baixas

quando comparado a outros cátions, além disso, algumas cepas (mutantes para genes

associados ao transporte através da membrana) podem apresentar resistência específica

a lítio (Goossens et al., 2000; Pereira et al., 2015).

Inicialmente, foi realizado o teste de sensibilidade a cloreto de lítio em diferentes

concentrações (0 a 200mM) nas cepas controles (BY4742 e PJ69arg82Δ) como no teste

anterior. A Figura 16 demonstra o crescimento dessas cepas em diferentes

concentrações de cloreto de lítio.

Figura 16: Crescimento das cepas parentais BY4742 (wt) e PJ69arg82Δ em

diferentes concentrações de cloreto de lítio. A, ausência de cloreto de lítio; B, 50mM;

C, 100mM; D, 200mM.

49

A estirpe PJ69arg82Δ é mais sensível a cloreto de lítio do que a estirpe BY4742

(wt) em todas as concentrações testadas (Figura 16). Foi escolhida a concentração de

50mM para o teste de seleção dos segregantes.

O teste de sensibilidade a cloreto de lítio foi realizado com os 90 segregantes

selecionados no teste de sensibilidade a higromicina (Tabela 2) e o critério de seleção

foi crescimento igual ou inferior a parental superior PJ69 arg82Δ. A Figura 17 mostra

curvas de crescimento de alguns segregantes selecionados (9a.F, 11b.F, 2b.L e 8b.L) e

não selecionados.

Figura 17: Crescimento de segregantes em presença de cloreto de lítio (50mM).

Alguns segregantes selecionados (A e B) e não selecionados (C e D).

Dos 90 segregantes testados quanto a sensibilidade ao cloreto de lítio, 34

apresentaram crescimento igual ou inferior a cepa parental PJ69 arg82Δ (Tabela 3).

Estudos anteriores mostraram que seis cepas contendo algumas mutações (ptk2Δ, yck1Δ,

50

yck2Δ, ire1Δ, sak1Δ e bmt6Δ) apresentaram sensibilidade a higromicina e que entre

estas cepas apenas 3 apresentaram sensibilidade ao cloreto de lítio (Pereira et al., 2015).

O transportador da higromicina ainda não é conhecido, mas há uma hipótese que

esse transportador é mais sensível quando comparado a outros transportadores de

cátions visto que mutantes com deleções no gene TRK2 e HRK1 de estirpes YOR267c

apresentam pequenas mudanças no potencial de membrana. Há uma hipótese em que a

atividade relativa do sistema de transporte de prótons pela Pma1 p, e o transporte de K+

pelas proteínas TrK1 p e TrK2 p definem o estado estacionário do potencial de

membrana modulando assim a atividade dos sistemas de transporte ativos secundários,

como os envolvidos na absorção de nutrientes e de cátions tóxicos (Goossens et al.,

2000). Diante desses dados é possível supor que algumas mutações podem afetar a

sensibilidade a alguns cátions e não afetar outros por isso usamos o teste de

sensibilidade a higromicina e cloreto de lítio para seleção dos segregante.

Tabela 3: Valores da densidade ótica obtidos pelos segregantes selecionados no

teste de sensibilidade a cloreto de lítio (50mM)

Segregante D.O. final Desvio padrão Segregante D.O.

final

Desvio padrão

PJ694a 0,94375 ±0,008485281 4a.A 0,921125 ±0,144886179

BY4742 1,3783 ±0,026728636 9c.J 0,820025 ±0,024395184

6b.A 0,905375 ±0,080539462 11c.E 0,840975 ±0,056427121

10e.B 0,962425 ±0,157048416 11c.J 0,993675 ±0,085277078

6b.F 0,874625 ±0,249891536 11d.J 0,963625 ±0,033304729

9a.F 0,7851 ±0,029910617 7d.J 0,624825 ±0,014707821

11b.F 0,962875 ±0,017889802 11g.K 0,763725 ±0,309500638

11f.H 0,98355 ±0,031890516 9h.K 0,98224 ±0,025102291

4d.J 0,93545 ±0,01463711 3a.O 0,9123 ±0,008131728

3g.K 0,960875 ±0,004949747 11h.R 0,96745 ±0,012162237

2h.K 0,979275 ±0,047446865 1b.R 0,9861 ±0,129117698

4c.P 0,96175 ±0,021213203 2b.L 0,759725 ±0,029557063

8b.P 0,9565 ±0,026501403 8b.L 0,746925 ±0,02503158

12d.P 0,83135 ±0,006717514 8c.M 0,967425 ±0,014990664

10g.K 0,96735 ±0,000353553 4f.N 0,94235 ±0,064558849

11a.R 0,9843 ±0,052891587 11e.Q 0,96335 ±0,033021887

8b.S 0,9778 ±0,061346666 5b.O 0,55715 ±0,724855161

7c.J 0,9587 ±0,006081118 11c.Q 0,5265 ±0,083226468

51

5.3.5 Seleção de segregantes com maior taxa de bombeamento de prótons

Os trinta e quatro segregantes selecionados na etapa anterior (sensibilidade ao

cloreto de lítio) foram submetidos à análise da acidificação extracelular induzida por

glicose. As taxas de bombeamento de prótons foram calculadas e os valores encontrados

estão representados na Figura 18.

Figura 18: Acidificação extracelular induzida por glicose dos segregantes

selecionados no teste de sensibilidade a cloreto de lítio (50mM).

Dos 34 segregantes avaliados no teste de acidificação extracelular, 13

segregantes apresentaram taxa de bombeamento de prótons maior a parental superior

PJ69arg82Δ (Figura 18) e 7 segregantes apresentaram taxas iguais a parental superior.

52

14 segregantes apresentaram taxa de bombeamento igual e menor a cepa parental

inferior BY4742 (Figura 18). Assim, 20 segregantes foram selecionados por apresentar

fenótipo igual ou superior a estirpe PJ69arg82Δ. Embora esse número de segregantes

seja inferior a 30, que é o recomendado para formação de um pool superior (Pais 2014),

trabalhos recentes mostraram identificação de QTLs com um número de segregantes

mais limitado (Pais et al., 2014), principalmente em se tratando de características que

não são facilmente mensuráveis (Hubmann et al., 2013; Pais et al., 2013; Den Abt et al.,

2016).

O fato de nem todos os 34 segregantes selecionados no teste de sensibilidade a

cátions não terem sido selecionados no teste de acidificação extracelular pode indicar

que a relação entre atividade da H+-ATPase, potencial da membrana e a resistência a

diferentes cátions não ocorre de forma direta, corroborando com estudos que sugerem

que outras proteínas estariam envolvidas na absorção de cátions (Barreto et al., 2011).

53

6.0 CONCLUSÃO

Os testes realizados com cepas contendo deleções nos genes envolvidos no

metabolismo da galactose sugerem que a diferença dos níveis de ativação da H+-ATPase

de membrana citoplasmática nos dois diferentes backgrounds genéticos não podem ser

atribuídos à diferenças no metabolismo de galactose.

Nós obtivemos 600 segregrantes a partir do cruzamento das cepas BY4742 (wt)

e PJ69arg82Δ e 34 segregantes foram selecionados nos testes de sensibilidade a

higromicina e lítio. Desses 34 segregantes, 20 apresentaram taxa de bombeamento de

prótons igual ou maior que o parental superior PJ69arg82Δ no teste de acidificação

extracelular induzido por glicose.

Esse pool de segregantes (20) contendo fenótipo superior será utilizado em

estudos posteriores para identificação dos QTLs relacionados à ativação da H+-ATPase,

o que poderá confirmar a existência de novos elementos ou alelos no mecanismo de

ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática em Saccharomyces cereviseae.

54

7.0 PERSPECTIVAS

Identificar e confirmar os QTLs através de deleções nos possíveis genes

relacionados a maior atividade da H+-ATPase através de reciprocidade homozigótica.

Tendo em vista que poderia haver uma relação entre atividade da H+-ATPase e

desempenho fermentativo, pretendemos introduzir os genes/alelos identificados em

cepas industriais visando melhorar a eficiência dos processos fermentativos.

55

REFERÊNCIAS

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