UNIVERSIDADE FEDERAL DE .orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me

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Pelotas, 2007

Joo Rodrigo Gil de los Santos

Construo e avaliao de vacinas de toxina recombinante de Clostridium perfringens A

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia

Agrcola

Tese

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1

JOO RODRIGO GIL DE LOS SANTOS

Construo e avaliao de vacinas de toxina recombinante de Clostridium perfringens A

Orientador: Carlos Gil Turnes

Pelotas, 2007

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia Agrcola daUniversidade Federal de Pelotas, comorequisito parcial obteno do ttulo deDoutor em Cincias (rea de conhecimento:Doenas Infecciosas de Animais).

2

Dados de catalogao na fonte: Ubirajara Buddin Cruz CRB-10/901 Biblioteca de Cincia & Tecnologia - UFPel

G463c Gil de los Santos, Joo Rodrigo

Construo e avaliao de vacinas de toxina recombi-nante de Clostridium perfringens A / Joo Rodrigo Gil de los Santos ; orientador Carlos Gil Turnes. Pelotas, 2007. 82f. : il. Tese (Doutorado). Programa de Ps-Graduao em Bio-tecnologia Agrcola. Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2007.

1.Biotecnologia. 2.Enterite necrtica aviar. 3. Clostridium

perfringens A. 4.Toxina recombinante. 5.Vacinas. I.Gil Tur-nes, Carlos . II.Titulo.

CDD: 615.372

3

Banca examinadora:

Prof. Dr. Fabricio Rochedo Conceio, Fundao Universidade do Rio Grande

Prof. Dr. Itabajara da Silva Vaz Jr, Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Dr. Ricardo Alfredo Soncini, Sadia SA

Prof. Dr. Carlos Gil Turnes, Universidade Federal de Pelotas

4

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo o que Ele me ofereceu.

Ao meu pai, que alm de amigo, aconselha-me pelos caminhos da vida e

orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me.

A minha me, cujos conselhos foram essenciais para a concluso do curso.

A minha futura esposa, Rafaela, cuja compreenso, amizade e amor

sustentaram a realizao deste trabalho.

Ao amigo Fabricio Rochedo Conceio, sempre disposto a ensinar-me.

Aos amigos Alceu e Rodrigo, que cuidaram dos animais utilizados nos

experimentos.

A todos que de alguma forma contriburam.

Muito Obrigado

5

RESUMO

GIL DE LOS SANTOS, Joo Rodrigo. Construo e avaliao de vacinas de

toxina recombinante de Clostridium perfringens A. 2007. 82 f. Tese

(Doutorado) - Programa de Ps - Graduao em Biotecnologia Agrcola.

Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

A Enterite Necrtica Aviar (ENA) uma enterotoxemia aguda, causada pelos

Clostridium perfringens A e C, cujo controle baseia-se na adio de antibiticos na

rao. A restrio dessa prtica pelo mercado consumidor, que tornou seu controle o

maior desafio para o setor avcola, exigiu a adoo de novas estratgias para o

controle, entre elas a imunizao. Vacinas recombinantes vm despertando grande

interesse entre pesquisadores e empresas do setor. O objetivo deste trabalho foi

elaborar vacinas de toxina recombinante de C. perfringens (rAT) utilizando como

adjuvantes Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3) e subunidade B recombinante da enterotoxina

termolbil de Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), e construir e avaliar uma protena

quimrica contendo rAT fusionada a rLTB (rLTB-AT). A rAT+Al(OH)3 foi incua e

protetora contra agresso de toxina nativa (sT) em camundongos, e imunognica

em frangos de corte, sem afetar a produtividade. A rAT+rLTB demonstrou relao

dose-proteo em camundongos, entanto a rLTB-AT no protegeu camundongos

contra agresso de sT. A rAT demonstrou ser uma alternativa para controlar a ENA.

Palavras-chave: Enterite Necrtica Aviar, Clostridium perfringens A, toxina

recombinante, vacinas.

6

ABSTRACT

GIL DE LOS SANTOS, Joo Rodrigo. Construction and evaluation of Clostridium

perfringens A recombinant toxin vaccines. 2007. 82 f. Tese (Doutorado) -

Programa de Ps - Graduao em Biotecnologia Agrcola. Universidade Federal de

Pelotas, Pelotas.

Avian Necrotic Enteritis (NE) is an acute enterotoxaemia caused by Clostridium

perfringens A and C. The control of the disease is based on antibiotics added to

animal feed. The ban of this practice by consumer markets, considered the biggest

challenge to industrial aviculture, demanded the adoption of other alternatives for its

control, among others, immunization with recombinant vaccines. The aim of this work

was to produce and evaluate C. perfringens recombinant toxin (rAT) vaccines

adjuvanted with either Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3 or recombinant B subunit of the heat-

labile enterotoxin of Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), and a chimeric protein

containing the toxin fused to rLTB (rLTB-AT). The rAT+Al(OH)3 was innocuous and

protected mice against a challenge with native toxin (sT), and it was immunogenic

and did not affect productivity parameters in broilers. The rAT+rLTB showed a dose-

protection relationship in mice, while rLTB-AT did not protect mice against sT

challenge. The rAT could be an alternative for controlling NE.

Key words: Avian Necrotic Enteritis, Clostridium perfringens A, recombinant toxin,

vaccines.

7

SUMRIO

1 INTRODUO 7

2 ARTIGO 1: Enterite Necrtica Aviar 10

3 ARTIGO 2: Evaluation of Clostridium perfringens recombinant toxin vaccines

in mice 32

Summary 33

Introduction 34

Material and Methods 35

Results 40

Discussion 45

References 47

4 ARTIGO 3: Evaluation of Clostridium perfringens recombinant toxin vaccines in

broilers 52

Summary 53

Introduction 54

Material and Methods 55

Results 58

Discussion 61

References 64

5 CONCLUSES 68

6 ATIVIDADES FUTURAS 68

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 69

7

1 INTRODUO

Atualmente a carne de frango est em primeiro lugar na produo animal no

Brasil. No primeiro trimestre de 2007 foi abatido mais de 1 bilho de frangos, o que

representa mais de 2 milhes de toneladas de produto, com um aumento no abate

de 2,1% em relao ao mesmo perodo de 2006. Comercializaram-se no mercado

externo 697,2 mil toneladas de frangos no primeiro trimestre de 2007, com aumento

de 14,3% com relao ao mesmo perodo de 2006 e 18,2% no faturamento (IBGE,

2007).

Parte desses ndices foi obtida utilizando antimicrobianos adicionados s

raes animais, prtica comum e necessria na avicultura industrial, para controlar

doenas e manter ou melhorar ndices de produtividade. O Clostridium perfringens

sorotipo A, um dos cinco sorotipos da espcie, agente etiolgico da gangrena

gasosa em humanos e animais, de infeces alimentares em humanos (ROBERTS,

1959) e da Enterite Necrtica Aviar (ENA) (PARISH, 1961), facilmente controlado

por essa prtica. Porm, a Unio Europia baniu, a partir de 2006, a utilizao de

antibiticos promotores de crescimento nas raes animais (COUNCIL OF

EUROPEAN UNION, 2003), comprometendo a eficincia dos sistemas intensivos de

produo animal. Uma das doenas mais afetadas por essa medida a ENA

(KALDHUSDAL & LOVLAND, 2002), um problema freqente (HOFACRE et al.,

1998) e economicamente importante (ENGSTRM et al., 2003) em vrios pases. A

doena apontada como um dos maiores desafios para o futuro da avicultura

mundial aps a restrio ao uso de antibiticos (PHILLIPS, 2002; SESTI, 2002;

KALDHUSDAL, 2003).

8

A ENA uma enterotoxemia aguda, que se apresenta em forma clnica ou

subclnica (VAN IMMERSEEL et al., 2004) causada por Clostridium perfringens A e

C. Caracteriza-se por leses ulcerativas e necrose confluente da mucosa do

intestino delgado e debilidade que se apresenta rapidamente, e afeta principalmente

animais entre duas e cinco semanas de idade, aparecendo subitamente, geralmente

associada imunossupresso, provocando morte rpida com elevada prevalncia

(SCHOCKEN-ITURRINO & ISHI, 2000). Embora os casos de ENA no sejam

reportados s autoridades sanitrias, conhecido seu impacto negativo na produo

avcola. Estimou-se que nos Estados Unidos o custo dessa doena de mais de U$

0,05 por animal (VAN DER SLUIS, 2000), podendo o produtor ter prejuzo de at

33% na produo, devido piora da converso alimentar, reduo do peso vivo e

aumento na condenao de carcaas (LOVLAND & KALDHUSDAL, 2001).

O controle e a preveno da ENA foram baseados, durante as ltimas

dcadas, na administrao de antibiticos, como promotores de crescimento, na

rao. Entretanto, a restrio a essa prtica lanou o desafio de criar novas

estratgias para controlar a doena. Vrias alternativas vm sendo estudadas em

todo o mundo, dentre elas, as vacinas, especialmente as recombinantes, de

produo mais simples e controlvel que as tradicionais, vm despertando grande

interesse entre pesquisadore