UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

JOÃO FIGUEIRA SCARINI

EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA DE HIF-1α, GLUT-1, FASN E

ADIPOFILINA NO DESENVOLVIMENTO DO CARCINOMA EX-ADENOMA

PLEOMORFO

Piracicaba

2019

JOÃO FIGUEIRA SCARINI

EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA DE HIF-1α, GLUT-1, FASN E

ADIPOFILINA NO DESENVOLVIMENTO DO CARCINOMA EX-ADENOMA

PLEOMORFO

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia de Piracicaba da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de

Mestre em Estomatopatologia, na Área de

Patologia.

Orientador: Profa Dra Fernanda Viviane Mariano Brum Corrêa

Coorientador: Profª Drª Débora Campanella Bastos

Este exemplar corresponde à versão final da

dissertação defendida pelo aluno João Figueira

Scarini e orientada pelo Profa. Dra. Fernanda

Viviane Mariano Brum Corrêa.

Piracicaba

2019

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, processo nº.: 153411/2017-1

FAPESP, processo nº.: 15/07304-0


FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA


Faculdade de Odontologia de Piracicaba

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada em

26 de Julho de 2019, considerou o candidato JOÃO FIGUEIRA SCARINI aprovado.

PROFª. DRª. FERNANDA VIVIANE MARIANO BRUM CORRÊA

PROF. DR. FABRICIO PASSADOR-SANTOS

PROF. DR. LUIZ PAULO KOWALSKI

A Ata da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.

DEDICATÓRIA

Dedico esta dissertação a cada RNA que não teve a chance de se

expressar nas páginas deste trabalho. Saiba que sofri convosco a todo

descongelamento, manuseio e dosagem. Eterna gratidão por todo o

aprendizado.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

“Eu gostaria de agradecer pelas inúmeras vezes que você me enxergou melhor do que eu sou.

Pela sua capacidade de me olhar devagar, já que nessa vida muita gente me olhou depressa

demais.” ― Padre Fábio de Mello

Agradeço a todos que tiveram paciência para me enxergar melhor:

Deus,

Você que me reviveu quando estava morto, que me achou quando estava

perdido. Você que fala comigo da maneira mais bonita e inesperada. Você que é o mar revolto,

mas a paz de mergulhar em um oceano desconhecido. Você que é tudo que tenho certeza que

tenho. Muito obrigado por ter cuidado e modelado minha vida em suas mãos. Se foi possível

caminhar sobre estas águas, foi porque minha fé me manteve sobre as ondas.

São Jorge da Capadócia,

Carreguei seu manto, vesti suas armas. Obrigado pela proteção.

Mãe, pai e irmã,

Vocês são o motivo da minha persistência. Obrigado pelo abraço apertado, afeto

inabalável e inafiançável. Saibam que o maior ensinamento que me deram, com toda a

humildade que carregam, é de que a maior nobreza da vida é o amor. Tenho orgulho de dizer

que foram os responsáveis pela minha educação e de lembrar, que mesmo após tudo que

passamos, superamos. Serei eternamente grato por nunca terem deixado de apaziguar a

tempestade do meu coração.

Minha orientadora: Profa. Dra. Fernanda Viviane Mariano,

É imensurável o meu respeito pela profissional que se tornou e a admiração pela

coragem, ousadia e responsabilidade que conduz sua vida e trabalho. De todos os dias

convividos, experiências e conhecimentos trocados – resta um ensinamento e este guardarei

com carinho ao longo de toda minha jornada: se posso sonhar, posso fazer. Muito obrigado por

ser o mestre que este jovem padawan precisava. Ainda falta muito para ser Jedi, mas me sinto

um pouco mais preparado porque a tive para me guiar em todos os desafios que enfrentamos.

Gratidão.

Minha coorientadora: Profa. Dra. Débora Campanella Bastos,

Muito obrigado por ter visto o meu desejo de aprender e para mais do que me

treinar, ter tido paciência para ensinar. Saiba que lembrarei com carinho de cada experimento

que fizemos e da forma cuidadosa e responsável que me apresentou o alfabeto molecular. Seu

amor pela ciência inspira e o que me tornei ao longo destes anos, em grande parte, devo ao seu

investimento. Vou levar comigo o modo pelo qual suja as mãos em busca de uma coisa tão

simples, mas valiosa, que é o perfume das flores. Te admiro demais.

Raísa Sales de Sá,

É como a história de um caminhante que encontrou outro pelo caminho e vendo

sua necessidade, estendeu sua mão. Você que viu minha pior e melhor versão. Você que teve

paciência para aceitar que fazíamos parte da evolução do outro. Você que foi amiga, irmã e

porto seguro nestes anos. Você que foi paz... Obrigado por ter me dado a mão. Te amo.

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado com apoio da Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), processo nº 153411/2017-1.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP), processo nº 15/07304-0.

“Eu sou parte de uma equipe. Então, quando venço, não sou eu apenas quem vence.

De certa forma termino o trabalho de um grupo enorme de pessoas!” ― Ayrton Senna

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de

Campinas, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Francisco Haiter Neto.

À Coordenadoria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de

Piracicaba, na pessoa da Profa. Dra. Karina Gonzales Silveiro Ruiz e ao Programa de Pós-

Graduação em Estomatopatologia, em nome do coordenador Prof. Dr. Márcio Ajudarte

Lopes.

Aos Profs. Drs. Alan Roger dos Santos Silva, Edgard Graner, Jacks Jorge

Júnior, Márcio Ajudarte Lopes, Pablo Augustin Vargas, Oslei Paes de Almeida e Ricardo

Della Coletta, professores das áreas de Patologia e Semiologia da Faculdade de Odontologia

de Piracicaba por todo suporte, comprometimento e ensinamentos.

Em especial, ao Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes por ter me concedido a

oportunidade de atender no Orocentro, ao Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva pelo zelo

profissional, atenção aos pacientes e ensinamentos ao longo dos meses em que passei sob sua

supervisão nas terças-feiras e ao Prof. Dr. Edgar Graner pelos valiosos conselhos ao longo

deste trabalho.

Ao Prof. Roman Carlos, colaborador do Programa de Pós-Graduação em

Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, por ter me recebido em sua casa

e em seu ambiente de trabalho com tanto entusiasmo e respeito. Carrego comigo os

ensinamentos que adquiri nos momentos que compartilhamos ao longo do mês em que estive

na Guatemala.

Ao Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas

da Universidade Estadual de Campinas, que me recebeu com tanto amor. Obrigado por ter

colaborado tanto em minha formação. Sinto uma admiração imensa por todos os professores e

profissionais que compõem esta família. Agradeço também aos funcionários do Departamento,

sobretudo à Ana Paula Godoy, Beth Giusti, Arethuza Souza, Ana Claudia Piaza, Adilson

Piaza e Dario Bernardo Silva. Cada um ao seu modo foi parte fundamental na construção

deste trabalho.

À Profa. Dra. Albina Altemani por toda colaboração neste e em tantos outros

projetos. Obrigado por me ensinar mais que Patologia: ensinar valores como humildade e

solidariedade. Não tenho palavras para dizer o quanto sou grato. Quando vou ao microscópio

na sua presença, sinto como se estivesse diante de alguém que verdadeiramente tem o dom.

Muito obrigado por esta chance de ‘aprender a conversar com a lâmina’.

Aos Profs. Drs. Antonio Santos Martins e Alfio José Tincani, professores do

Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas, aos médicos assistentes, Dr. André Del Negro e Dr.

André M. Casarim e aos médicos residentes, Drs. Rebeca Dias e Mário Fernandez, que ao

longo dos últimos meses me proporcionaram momentos de grande aprendizado no Ambulatório

de Cabeça e Pescoço do Hospital de Clínicas.

Ao A. C. Camargo Cancer Center por ter nos concedido boa parte das amostras

deste trabalho. Em especial, ao Dr. Luiz Paulo Kowalski, Dra. Cláudia Malheiros e aos

técnicos Lais Takata, Rafaela Batista e Severino Ferreira, por sempre serem tão solícitos e

proativos. Sem vocês isto não seria possível.

Ao Bruno Mariz, amigo que aprendi a respeitar e admirar. Agradeço a amizade

que construímos, por me ouvir e aconselhar. Você foi o irmão mais velho que não tive, o irmão

que a pós-graduação me deu. À Iara Aquino, que me ensinou muitas vezes em silêncio; que

me fez enxergar meu olhar mais sincero; que fez a diferença em me visitar todas às noites para

simplesmente mostrar que estava lá. Com toda certeza, vocês dois foram peças fundamentais

nesta conquista.

Ao Reydson Souza, companheiro de trabalho, dramas e surtos diários. Agradeço

pelos exemplos de dedicação e esforço, pelos ensinamentos e amizade. Obrigado por tantas

vezes repetir que daria certo, que eu iria conseguir e que você tinha certeza disso. Esta conquista

também é sua!

Ao Luan César, por ter me ajudado quando nem se quer me conhecia e por, nestes

anos, ter sempre nos recebido de coração aberto e sorriso no rosto. À Isabel Schausltz e Juliana

Nascimento, que me acolheram e aconselharam desde o primeiro dia. Obrigado por todos os

momentos que vivemos naqueles primeiros meses. À Patrícia Fernandes, por ser esta pessoa

incrivelmente autêntica, solidária e carinhosa. Serei eternamente grato por todas as vezes que

me ajudou sem cobrar nada em troca. À Maria Helena, por sua alegria contagiante, pelos

almoços e cafés nos finais de semana científicos. Obrigado por ser este ser de luz. À Isadora

Ferrari por toda contribuição no tempo em que estivemos juntos na Orocentro e ao Renato

Assis por todos os conselhos acadêmicos e orientações em trabalhos paralelos.

À Semiologia, minha segunda casa: do café, dos bolos de sexta-feira, da alegria, do

companheirismo, do desespero pré-qualificação, do artigo aceito, do artigo negado, da família

tradicional brasileira... Evidências não faltam para dizer o quanto adoro todos vocês: Raísa

Sales, Bruno Mariz, Iara Aquino, Luan César, Isabel Schausltz, Patrícia Fernandes, Diego

Tetzner, Mariana Paglioni, Mauricio Dourado, Leonardo Reis, Marisol Galvis, Gabriell

Borgato, Rachel Lamarck, Pedro Curioso (in memorian), Juliana Nascimento e Carolina

Carneiro.

Aos demais amigos e colegas da pós-graduação e até mesmo de outros programas,

em especial, Rocharles Fontenele e Juliana Campos, pelas conversas, boas risadas e amizade.

À Érika Egal, pela grata surpresa nos últimos meses. Acho que algumas conexões

sensoriais aconteceram e demos certo. Obrigado por me ensinar tantas coisas, por se doar de

corpo e alma, por embarcar em nossas aventuras, por ser tão solícita, tão humilde, tão você. Sua

originalidade me fascina. Lembrarei com carinho de todas as nossas aventuras.

Às colegas de trabalho: Leisa Lopes, Camila de Angelis e Fernanda Borges,

pelas tardes produtivas, boas risadas e companheirismo.

Aos Profs. Drs. Rebeca de Souza Azevedo, Renata Tucci, Adriele Gouvêa e

Ademar Takahama Junior, profissionais que conheci na Universidade Federal Fluminense

(UFF). Se hoje estou neste caminho, em grande parte, é porque estive durante toda minha

graduação sobre o ombro de gigantes como vocês.

À Prof. Daniele Garcia, que conheci ainda no Ensino Médio. Admiro sua

dedicação para fazer do ensino público um ensino de qualidade. Coincidentemente, a Genética,

que me apaixonei ainda em suas aulas, hoje é minha rotina de trabalho. Muito obrigado por ter

contribuído para isso.

Aos meus amigos Michelle Guimarães, Gabriela Medeiros, Nathale Cruz,

Barbara Fonseca, Fernanda Ximenes, Josué Miguel, Gustavo Vieira, Natália Lucena,

Rhayssa Caetano, Mario Junior, Luiz Cláudio Pessanha pela amizade sincera e incontáveis

momentos de alegria que vivemos ao longo de tantos anos. Mesmo com a distância, o incentivo

de vocês me fez mais forte. Em especial, ao Antônio Miranda pela paciência e sensibilidade

em dizer que Deus é bom o tempo inteiro.

Às minhas avós, Pulcéria Souza (in memorian) e Anita Scarini (in memorian),

que me ensinaram a amar como se não houvesse amanhã. Aos meus padrinhos, Marlene

Juliace e Gersy Scarini, por terem sido um porto seguro e cheio de amor por todos estes anos.

À tia Regina Célia, que sempre foi meu maior exemplo de fortaleza inabalável. Às minhas tias

do coração, Vanda Bizzo e Ira Rímolo, por todas as orações e vibrações positivas nestes dois

anos.

À Família Brito, em nome do Seu Valdir Brito e Dona Lenir Brito, pelo

acolhimento e cuidado ao longo dos últimos anos. O carinho de vocês deixou a saudade de casa

mais amena.

Ao microscópio, que se tornou meu sabre de luz desde o terceiro semestre da

graduação. A música – companheira de tantos experimentos, redações e pensamentos. Ao café,

amigo de tantas noites. Às incertezas da vida, dificuldades, desafios e erros...

Meu mais sincero obrigado.

EPÍGRAFE

“O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa,

sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem. O que Deus quer é ver a

gente aprendendo a ser capaz de ficar alegre a mais, no meio da alegria, e inda mais alegre

ainda no meio da tristeza! Só assim de repente, na horinha em que se quer, de propósito – por

coragem. Será? Era o que eu às vezes achava. Ao clarear do dia.”

Guimarães Rosa, em Grande Sertão: Veredas

RESUMO

O carcinoma ex-adenoma pleomorfo (CXAP), também conhecido como tumor

maligno misto, é um tumor agressivo que surge em um adenoma pleomorfo (AP) pré-existente.

Vários estudos tentaram elucidar sua patogênese, todavia investigações acerca das alterações

metabólicas ainda são preliminares em vários tumores de glândula salivar. Neste contexto, as

células tumorais conseguiriam se adaptar as condições de baixa tensão de oxigênio ativando

vias de sobrevivência, como a ativação do fator de transcrição induzido por hipóxia 1 alfa (HIF-

1α). Por outro lado, níveis aumentados do gene facilitador do membro 1 do transportador de

glicose (GLUT-1), que possui alta afinidade pela glicose, já foram relatados em diferentes tipos

de cânceres. O aumento da expressão da enzima ácido graxo sintase (FASN), que sintetiza

ácidos graxos (AG) de cadeia longa, vem sendo relacionada à lipogênese aumentada, marca do

metabolismo reprogramado no câncer. Como consequência, elevados níveis de lipídios

elevariam a biogênese das gotas lipídicas (GL), que se acumulariam nas células. Por sua vez, a

expressão de adipofilina, proteína relacionada com a GL, também estaria aumentada. Deste

modo, foram analisadas por qRT-PCR a expressão de marcadores do metabolismo glicolítico

(HIF-1α e GLUT-1) e lipídico (FASN e adipofilina) em 9 amostras de tecidos congelados de

glândula salivar normal (GSN), 13 AP, 10 CXAP e 4 AP residuais. Validamos as reações por

imunoistoquímica e verificamos se existem diferenças na expressão destes marcadores no

desenvolvimento do CXAP. Nossos resultados mostraram que não houve diferença

estatisticamente significante na expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α entre os

tecidos estudados, enquanto a expressão gênica e imunoistoquímica de FASN tendeu a

aumentar nos tecidos tumorais quando comparado com os normais. O gene GLUT-1 foi

significativamente mais expresso (p<0,01) em AP e CXAP do que em GSN enquanto a

expressão da proteína foi predominantemente maior em CXAP do que em GSN e AP. Em

contraste, o gene adipofilina foi significativamente mais expresso (p<0,01) em tecidos normais

enquanto a expressão da proteína aumento na sequência GSN-AP-CXAP. Portanto, os dados

aqui apresentados sugerem que as células da GSN, quando se tornam neoplásicas, reprogramem

a expressão de GLUT-1 e adipofilina para se adaptar ao microambiente tumoral e reforçam, por

meio dos resultados da imunoistoquímica, possíveis mecanismos reguladores transcricionais e

pós-traducionais que podem agir sobre a expressão destes genes.

Palavras-chave: Adenoma pleomorfo. Carcinoma ex-adenoma pleomorfo. Metabolismo

tumoral. qRT-PCR. Imunoistoquímica.

ABSTRACT

Carcinoma ex-adenoma pleomorphic (CXPA), or mixed malignant tumor, is an

aggressive tumor that appears in a pre-existing pleomorphic adenoma (PA). In the last decades,

several genetic and immunohistochemical studies have tried to elucidate the pathogenesis

related to the development of CXPA, however investigations about the metabolic alterations

are preliminary in several tumors of the gland. Tumor cells, when in hypoxia, can adapt to low

oxygen tension conditions by activating survival pathways. The most recognized pathway

adopted by hypoxic cells is the activation of the transcription factor induced by hypoxia 1 alpha

(HIF-1α). However, increased levels of GLUT-1 that has high affinity for glucose have been

reported in different types of cancers. Increased expression of the fatty acid synthase (FASN)

enzyme, which synthesizes long chain fatty acids (FA), has been linked to to increased

lipogenesis, the hallmark of reprogrammed metabolism in cancer. As a consequence, high lipid

levels would increase the biogenesis of lipid droplets (GL), which would accumulate in cells.

In turn, the expression of adipophylline, GL-related protein, would also be increased. Thus, the

expression markers of the glycolytic metabolism (HIF-1α and GLUT-1) and lipid metabolism

(FASN and Adipophilin) were analysed by the qRT-PCR method in 9 samples of frozen tissues

of normal salivary gland (NSG), 13 PA, 10 CXPA and 4 residual PA. The reactions were

validated by immunohistochemistry and differences in the expression of these markers in the

development of CXAP were also analysed. Our results showed that there was no statistically

significant difference in HIF-1α gene expression and immunohistochemistry among the tissues

studied, while FASN gene expression and immunohistochemistry tended to increase in tumor

tissues when compared to normal tissues. GLUT-1 was significantly more expressed (p<0.01)

in PA and CXPA than in normal tissues, although protein is mainly expressed in transformed

cells than in PA and NSG. In contrast, adipophilin (p<0.01) was significantly more expressed

in NSG than in tumor tissues while the expression of the protein was lower in NSG and higher

in tumor tissues. Therefore, the data presented here suggest that NSG cells, as they become

neoplastic, reprogram the expression of GLUT-1 and adipophilin to adapt to the tumor

microenvironment. The gene expression findings were reinforced through

immunohistochemical results and suggest that possible transcriptional and post-translational

regulatory mechanisms may be involved on the expression of these genes.

Keywords: Pleomorphic adenoma. Carcinoma ex pleomorphic adenoma. Tumor metabolism.

qRT-PCR. Immunohistochemistry.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACACA – Malonil-CoA pela Acetil-Coa Carboxilase

ADPR – Proteína Relacionada à Diferenciação de Adipócitos

AFIP – Armed Forces Institute Of Pathology – Instituto de Forças Armadas da Patologia

AG – Ácido Graxo

AKT – Proteína Quinase B

AO-519 – Antígeno Oncogênico-519

AP – Adenoma Pleomorfo

ARNT – Receptor de Hidrocarboneto de Arila

ATP – Adenosina Trifosfato

BSA – Albumina Sérica Bovina

CBP – Proteína de Ligação a CREB

CoA – Acetil-Coenzima A

CT – Limite do Ciclo

C-TAD – Terminal COOH

CXAP – Carcinoma Ex-Adenoma Pleomorfo

DAB – Diaminobenzidina Tetra-Hidroclorídrica

E3 – Proteína Ligase de Ubiquitina E3

EGFR – Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico

ERK1-2 – Sinal Quinase

FASN – Enzima Ácido Graxo Sintase

FBI-1 – Proto-Oncogene Pokemon

FDG-PET – Tomografia por Emissão de Pósitrons de 18F-Deoxi-Glicose

FIH-1 – Fator Inibidor de HIF-1

GL – Gotas Lipídicas

GLUT – Transportadores de Glicose

GLUT-1 – Facilitador do Membro 1 do Transportador de Glicose

GP – Glândula Parótida

GS – Glândula Submandibular

GSL – Glândula Sublingual

GSMA – Glândula Salivar Maior

GSME – Glândula Salivar Menor

GSN – Glândula Salivar Normal

H2O2 – Peróxido de Hidrogênio

HE – Hematoxilina e Eosina

HIF – Fator de Transcrição Induzido por Hipóxia

HIF-1α – Fator de Transcrição Induzido por Hipóxia 1 Alfa

HMGA2 – Grupo de Alta Mobilidade Humana A

HMIT – H+/Myo-Inositol Transporter

Hsp90 – Inibidores da Proteína 90 do Choque Térmico

IARC – Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer

IGF-I – Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I

IRS – Receptor de Insulina

kD - Kilodaltons

MALT – Tecido Linfoide Associado à Mucosa

Mdm2 – Homólogo do Duplo Minuto 2 do Rato

MEK – Proteína Quinase Ativada por Mitógeno

mTOR – Alvo Mecanicista da Rapamicina

MYC – Proto-Oncogene N-MYC

NADPH – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato

NCBI – National Center for Biotechnology Information – Centro Nacional de Informação

Biotecnológica

ng – Nanograma

nm – Nanômetro

N-TAD – Terminal NH2

OCT – Optimal Cutting Temperature – Composto com Temperatura de Corte Ideal

ODDD – Domínio de Degradação de Oxigênio

OMS – Organização Mundial de Saúde

OXPAT – Proteína de Gotículas Lipídicas do Miocárdio

P300 – Homólogo p300 da Proteína de Ligação a CREB

PBS - Solução Tampão Fosfato-Salino

pH – Potencial Hidrogeniônico

PHD – Prolil Hidroxilases

PI3K – Fosfatidil Inositol-4,5-Bisfosfato-3-Quinase

PLAG1 – Gene 1 do Adenoma Plemorfo

PPAR – Receptor Ativado por Proliferados de Peroxissomas

PTEN – Gene Supressor de Tumor

pVHL – Proteína Von Hippel-Lindau

qRT-PCR – Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

qsp – ‘Quantidade Suficiente Para’

RHEB – Homólogo RAS Enriquecido no Cérebro

RNA – Ácido Ribonucleico

mRNA – RNA mensageiro

SLC2A – Família de Portadores de Soluto 2

SOE – Sem Outra Especificação

SREBP-1c – Proteína de Ligação ao Elemento Regulador de Esterol

TAD – Domínios de Transativação

TIP47 – Proteína que Interage na Cauda de 47kD

TP53 – Gene Supressor de Tumor P53

USP2a – Protease 2a Específica de Ubiquitina

μl – Microlitro

μm – Micromolar

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17

2 REVISÃO DA LITERATURA 21 ADENOMA PLEOMORFO E SUA TRANSFORMAÇÃO MALIGNA 21 CARCINOMA EX-ADENOMA PLEOMORFO 25 METABOLISMO NA PATOGÊNESE DO CÂNCER 29 2.3.1 Efeito de Warburg 30 2.3.2 Microambiente tumoral e o fator de transcrição induzido por hipóxia 1α 32 2.3.3 Microambiente tumoral e o transportador de glicose 1 36 2.3.4 Microambiente tumoral e a enzima ácido graxo sintase 39 2.3.5 Microambiente tumoral, gotas lipídicas e a adipofilina 42 ALTERAÇÕES METABÓLICAS NO DESENVOLVIMENTO DO CXAP 44

3 PROPOSIÇÃO 46 PROPOSIÇÃO GERAL 46 PROPOSIÇÕES ESPECÍFICAS 46

4 MATERIAL E MÉTODOS 47 DESENHO EXPERIMENTAL 47 ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DA AMOSTRA 48 ANÁLISE MORFOLÓGICA DA PEÇA CIRÚRGICA 48 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA 49 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA 51 ANÁLISE ESTATÍSTICA 53

5 RESULTADOS 54 ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DA AMOSTRA 54 ANÁLISE MORFOLÓGICA DA CONGELAÇÃO E DA PEÇA CIRÚRGICA 57 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA 60 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA 63 CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA 70

6 DISCUSSÃO 73

7 CONCLUSÃO 82 EXPRESSÃO GÊNICA 82 EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA 82 CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA 83

REFERÊNCIAS* 84

APÊNDICES 108 APÊNDICE 1 – Fichas de avaliação utilizadas para análise neste estudo 108 APÊNDICE 2 – Análise microscópica dos fragmentos de tecido utilizados neste estudo 111 APÊNDICE 3 – Análise da integridade de amostras de GSN e AP utilizadas neste estudo 113 APÊNDICE 4 – Análise das expressões gênicas alteradas (outliers) neste estudo 114

ANEXOS 116 ANEXO 1 – Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa FOP/UNICAMP 116

ANEXO 2 – Verificação de originalidade e prevenção de plágio 117

17

1 INTRODUÇÃO

Estudos estimam que 0,5 a 3% das neoplasias malignas que acometem o corpo

humano se originam em uma glândula salivar (Frazell, 1954; Batsakis e Regezi, 1979;

Chatterjee e Panda, 2000; Speight e Barret, 2002; Lam et al., 2015). Em 2018, segundo a

Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC) cerca de 50 mil casos de neoplasias

malignas de glândulas salivares foram relatados, sendo 1462 apenas no Brasil. Estima-se para

o ano de 2040 o surgimento de aproximadamente 80 mil novos casos no mundo, dos quais 2554

ocorrerão na população brasileira. Além disso, cerca de 450 pacientes morreram em decorrência

desta doença no Brasil no último ano (Ferlay et al., 2019).

Os tumores de glândula salivar representam um grupo muito diversificado e

heterogêneo de neoplasias benignas e malignas com características e comportamento biológico

complexos (Batsakis et al., 1983; Chatterjee e Panda, 2000; Lubin et al., 2018; Carlson e

Schlieve, 2019). Dentre estes, o adenoma pleomorfo (AP) e o carcinoma ex-adenoma

pleomorfo (CXAP) constituem um interessante modelo para o estudo dos mecanismos

relacionados com a transformação maligna (Altemani et al., 2005; Mariano et al., 2013).

AP ou tumor misto é a neoplasia mais comum das glândulas salivares e representa

aproximadamente 50-60% destes tumores (Evenson e Cawson, 1985; Spiro, 1986; Dulguerov

et al., 2017; Bell et al., 2017; Silva et al., 2018). Pacientes de todas as faixas etárias podem ser

acometidos, embora uma maior prevalência em mulheres entre a 5ª e 6ª década de vida possa

ser observada (Eveson e Cawson, 1985; Lopes et al., 2017; Bell et al., 2017; Espinosa et al.,

2018). Os tumores surgem, principalmente na glândula parótida (GP), seguida pelas glândulas

salivares menores (GSME) do palato e glândula submandibular (GS) e apresentam-se, na

maioria dos casos, como nódulos discretos, assintomáticos e de crescimento lento (Eveson e

Cawson, 1985; Panoussopoulos et al., 2002; Jorge et al., 2002; Korba et al., 2017). Apesar de

benignos, 40% dos AP podem se tornar refratários ao tratamento inicial, sendo esta recorrência

associada à técnica cirúrgica empregada (Henriksson et al., 1998; Abu-Ghanem et al., 2016).

Além disso, a transformação maligna para um CXAP pode ocorrer em aproximadamente 6%

de todos os casos (Chooback et al., 2017; Singh et al., 2017; Silva et al., 2018).

CXAP, também conhecido como tumor maligno misto, é descrito como um tumor

raro e agressivo. Sua prevalência representa aproximadamente 3% a 5% de todas as neoplasias

de glândulas salivares e 11,6% de todas as neoplasias malignas nesta localização anatômica

(Mariano et al., 2013; Hu et al., 2016; Chooback et al., 2017; Sedassari et al., 2017). Manifesta-

se geralmente na 6ª e 7ª décadas de vida, preferencialmente em mulheres e frequentemente

18

afetando a GP, mas podendo acometer também GS e GSME (Sedassari et al., 2017; Seethala e

Stenman, 2017). Histologicamente, CXAP são subclassificados quanto à invasão, em (1)

carcinoma intracapsular (contido pela cápsula do AP pré-existente), (2) minimamente invasivo

(infiltração do tecido extracapsular a uma distância ≤ 1,5mm) e francamente invasivo

(infiltração > 1,5mm). CXAP intracapsular e minimamente invasivo tendem a exibir

comportamento biológico de baixo grau, semelhante ao do AP com margens livres. Em

contraste, o CXAP francamente invasivo apresenta comportamento mais agressivo e está

associado ao aparecimento de metástases, ocorrência de recidivas e piores taxas de sobrevida

(Zbären e Stauffer, 2007; Hu et al., 2016; Ihrler et al., 2017; Williams et al., 2017; Seethala e

Stenman, 2017; de Morais et al., 2019).

A literatura científica tem sido enriquecida com importantes trabalhos que visam

esclarecer os mecanismos de transformação maligna do AP, embora a exata patogênese de sua

carcinogênese permaneça obscura (Sedassari et al., 2017; Asahina et al., 2019; de Morais et al.,

2019). Recentemente, o avanço do conhecimento genético no CXAP tem demonstrado que a

sua patogênese pode estar associada ao acúmulo de alterações moleculares no AP (Sedassari et

al., 2017). O estudo do metabolismo, por outro lado, entusiasmado nas últimas décadas (mesmo

em outros tumores de glândulas salivares) ainda carece de mais investigações (Shinozaki et al.,

2008; Roh et al., 2008; Ito et al., 2009; Demasi et al., 2010; do Prado et al., 2011; Kim et al.,

2011; Mariano et al., 2013; Urano et al., 2015; Wang et al., 2015; dos Santos et al., 2016; de

Souza et al., 2017; Soares et al., 2018; Branco et al., 2019; Cardoso et al., 2019; Díaz et al.,

2019).

Neste contexto metabólico, sabe-se que as células malignas são caracterizadas pela

sua elevada capacidade de divisão, o que aumenta sua demanda de energia e macromoléculas

– percepção brilhantemente descrita por Otto Warburg e colaboradores em 1924 e mais bem

referida como Efeito de Warburg (Warburg et al., 1924). Segundo este fenômeno, na presença

de oxigênio as células normais usariam as mitocôndrias para metabolizar a glicose em

adenosina trifosfato (ATP), por meio da fosforilação oxidativa. No câncer, sob condições

anaeróbicas, as células produziriam grandes quantidades de lactato por meio da glicólise

aeróbica, o que propiciaria não só a proliferação celular como também a manutenção e

progressão da doença (Warburg et al.,1924; Cori e Cori, 1925; Warburg, 1927; Mokrowiecka

et al., 2017; Schcolnik-Cabrera et al., 2018).

Em tumores sólidos, à medida que a neoplasia se expande rapidamente, as células

malignas formam grandes massas tumorais, que levam à obstrução e compressão dos vasos

sanguíneos em torno dessas massas e/ou ultrapassam os limites de difusão de seu suprimento

19

sanguíneo local. Seja qual for a forma, a progressão tumoral levará à hipóxia e à estabilização

do fator de transcrição induzido por hipóxia 1 alfa (HIF-1α) (Wang e Semenza, 1993; Masoud

e Li, 2015; Schito e Semenza, 2016; Huang et al., 2018). Além disso, a fim de alcançar uma

taxa glicolítica que é aproximadamente 30 vezes maior do que o normal, as células neoplásicas

absorvem glicose rapidamente e em altas taxas. Os transportadores de glicose (GLUT) são

essenciais neste processo e permitem o transporte de glicose por um mecanismo de difusão

facilitada (Rumsey et al., 1997; Macheda et al., 2005; Barron et al., 2016; Galochkina et al.,

2019). A expressão do transportador de glicose 1 (GLUT-1) pode ser induzida pelo fator HIF-

1α em células malignas e tanto a expressão de GLUT-1 como HIF-1α vem sendo relatada e

relacionada com metabolismo glicolítico e invasão (Takata et al., 1990; Joost e Thorens, 2001;

Zhao e Keating, 2007; Denko, 2008; Vaupel e Mayer, 2014; Kujan et al., 2017; Seleit et al.,

2017; Soni e Padwad, 2017; Harrison et al., 2018).

Os lipídios, por sua vez, são biomoléculas importantes para o metabolismo e

armazenamento de energia, compõem membranas celulares e atuam como moléculas de

sinalização (Röhrig e Schulze, 2016). Muitos deles são sintetizados a partir de ácidos graxos

(AG), constituintes essenciais de todos os lipídios da membrana celular e importantes substratos

para o metabolismo energético (Menendez e Lupu, 2007). A enzima ácido graxo sintase

(FASN) é responsável pela biossíntese endógena de AG de cadeia longa, necessária para manter

principalmente um fornecimento constante de lipídios para produção de fosfolipídios de

membrana. Vários estudos demonstraram que FASN desempenha um papel importante no

desenvolvimento e progressão tumoral (Flavin et al., 2010; Bauerschlag et al., 2015; Lu et al.,

2018).

Gotas lipídicas (GL) são encontradas no citoplasma de quase todos os tipos de

células e desempenham um papel importante na homeostase lipídica celular. São constituídas

por um centro rico em lipídios e recobertas por uma camada única de fosfolipídios e inúmeras

proteínas, ao qual se inclui a adipofilina (Brasaemle, 2007; Boussahmain et al., 2013). A

adipofilina (ou perilipina-2 ou proteína relacionada com a diferenciação de adipócitos – ADPR)

vem sendo correlacionada com a tumorigênese por meio da adaptação à hipóxia (Saarikoski et

al., 2002; Conte et al., 2016; Westhoff et al., 2017) e no microambiente tumoral, o aumento de

sua expressão vem sendo relatada em vários tumores nos últimos anos, como linfoma de

Burkitt, câncer colorretal, adenocarcinoma de pulmão, melanomas, lipossarcomas e sarcomas

não lipomatosos e carcinoma renal de células claras (Matsubara et al., 2011; Ambrosio et al.,

2012; Zhang et al., 2014; Westhoff et al., 2016; Fujimoto et al., 2016; Fiorentzis et al., 2017;

Tolkach et al., 2017; Cao et al., 2018; Song et al., 2019).

20

Diante disso, a partir do crescente papel do metabolismo no desenvolvimento e

progressão tumoral, este estudo teve como objetivo verificar a expressão gênica e

imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina na progressão sequencial do AP

para CXAP.

21

2 REVISÃO DA LITERATURA

ADENOMA PLEOMORFO E SUA TRANSFORMAÇÃO MALIGNA

AP ou tumor misto é a neoplasia mais comum das glândulas salivares e representa

aproximadamente 50-60% destes tumores (Eveson e Cawson, 1985; Spiro, 1986; Bell et al.,

2017; Dulguerov et al., 2017; Silva et al., 2018). Segundo dados do Instituto de Patologia das

Forças Armadas dos Estados Unidos (AFIP) o AP constitui 66% dentre todos os tumores

benignos, sendo 67% dos benignos de GSMA e 63% dos de GSME (Ellis e Auclair, 2008).

Podem ocorrer em qualquer local onde o tecido salivar é encontrado. A maioria surge na GP,

seguida pelas glândulas salivares menores do palato e GS. Dentre outras localizações, em

sequência decrescente de acometimento, podem acometer mucosa jugal e o lábio superior,

sendo raros em lábio inferior e língua. Em glândulas lacrimais, o AP representa a neoplasia

epitelial mais comum, correspondendo a 50% dos tumores epiteliais desta localização (von

Holstein et al., 2013; Harrison et al., 2018). Entretanto, em raros casos já foram encontrados

no conduto auditivo externo, cavidade nasal, seio maxilar e nasofaringe (Sciandra et al., 2008;

Vento et al., 2016; Bowman et al., 2019). Além disso, AP formam cerca de 0,8% de todas as

neoplasias primárias de glândulas salivares na traqueia (Gaissert e Mark, 2006).

Dados epidemiológicos revelam que a idade média dos pacientes acometidos por

esta neoplasia é de 43 anos, sendo mais prevalente entre a 5ª e 6ª década de vida (Eveson e

Cawson, 1985; Bell et al., 2017; Lopes et al., 2017; Espinosa et al., 2018). Há discreta

predileção pelo sexo feminino e aproximadamente 17% dos pacientes têm menos de 30 anos de

idade (pico de prevalência entre os 20 e 29 anos). Além disso, mesmo que incomuns, AP podem

acometer crianças e adolescentes (Eveson e Cawson, 1985; Jorge et al., 2002; Bell et al., 2017;

Lopes et al., 2017; Espinosa et al., 2018).

Clinicamente, como esperado para lesões benignas de glândulas salivares, AP

apresentam-se normalmente como nódulos palpáveis bem definidos, discretos e móveis,

geralmente assintomáticos e de crescimento lento, mas que podem evoluir para grandes massas,

caso não sejam tratados (Panoussopoulos et al., 2002). Quanto aos sintomas, a queixa mais

comum é de uma assimetria do ângulo mandibular e da região pré-auricular, bem como um

abaulamento ou massa móvel bem definida que não está aderida à pele. Normalmente a

presença de sintomas está acompanhada do aumento de tamanho, que produz sensação de dor,

embora o traço característico seja a falta de paralisia facial, mesmo que o tumor atinja um

tamanho exacerbado (Korba et al., 2017).

22

Macroscopicamente, em GSM, AP apresentam-se como amostras únicas e

arredondadas, bem delimitadas e encapsuladas, de tamanho variável. Tumores de GSME, ao

contrário, tendem a ser não não-encapsulados e pouco delimitados. À superfície de corte,

exibem coloração branca e brilhante, e sua consistência varia de amolecida a fibrosa, a depender

da quantidade de estroma (Ellis e Auclair, 2008; Skálová et al., 2012). Microscopicamente, a

assinatura do AP é o pleomorfismo arquitetural. É notoriamente reconhecido que os elementos

epiteliais e glandulares se misturam em quantidades variáveis de estroma extracelular

(mucoide, mixoide ou condroide). Tem sido proposto que a neoplasia seja classificada de

acordo com a composição relativa de componentes celulares e estromais em (1) AP hipocelular

ou mixoide - com estroma rico (50-80% de estroma), (2) AP clássico – com equilíbrio entre os

componentes (30 a 50% de estroma) e (3) AP hipercelular (com menos que 30% de estroma).

AP mixóides são mais comuns e representam mais da metade dos casos, seguidos pelo subtipo

clássico e, por último, hipercelular (Naeim et al., 1976; Seifert et al., 1976; Stennert et al., 2001;

Webb e Eveson et al, 2001; Zbären e Stauffer, 2007; Park et al., 2012; Dulguerov et al., 2017).

Em GSMA, os AP são envolvidos por uma camada de tecido fibroso denominada

cápsula, que geralmente está incompleta em 69% dos AP mixóides, 30% dos AP clássicos e

18% dos AP hipercelulares (Naeim et al., 1976). Além disso, em alguns casos, nódulos tumorais

vistos como protuberâncias nas bordas do tumor e separados por tecido fibroso da massa

tumoral principal (mas ainda dentro da cápsula principal do tumor) podem ser encontrados e

são referidos como pseudópodes. Estes são diferentes dos nódulos tumorais que se configuram

na vizinhança da neoplasia, aproximadamente 5-8,5mm do nódulo tumoral principal, melhor

referidos como nódulos satélites, muito mais frequentes em tumores maiores (Stennert et al.,

2001; Zbären e Stauffer, 2007; Orita et al., 2010; Park et al., 2012; Li et al.; 2014; Dulguerov

et al., 2017). No mais, em 5% dos AP, ainda podem ser encontrados vários tipos de cristaloides,

como cristaloides colágenos e cristaloides ricos em tirosina, estruturas morfologicamente

compostas por fibras eosinofílicas que compreendem colágeno tipo I e III (Campbell et al.,

1985; Skalova et al., 1992; Bellizzi e Mills, 2008; Okano et al., 2019).

O tratamento de referência é a excisão cirúrgica completa da neoplasia primária,

sem necessidade de tratamento adjuvante de rotina (Loughlin et al., 2019). As opções incluem

enucleação, parotidectomia superficial e parotidectomia total. Recentemente, a dissecção

extracapsular tornou-se mais comum, envolvendo a excisão do tumor encapsulado com tecido

normal saudável, sem dissecção do nervo facial (Sood et al., 2016). A parotidectomia parcial e

a dissecção extracapsular estão associadas a taxas de recidiva de 2-5%, enquanto a radical é de

23

apenas 0-0,4% e com estudos anteriores na literatura relatando taxas de recorrências para a

enucleação entre 20 e 45% (Dulguerov et al., 2017; Loughlin et al., 2019).

A recorrência, que normalmente ocorre de 2-15 anos após cirurgias iniciais pode

estar relacionada aos fatores que constituem a identidade microscópica do tumor, bem como

àqueles inerentes e relacionados à cirurgia (Abu-Ghanem et al., 2016). Quanto as variáveis

relacionadas à microscopia, a espessura da cápsula ou a falta dela, pseudopodia, nódulos

satélites e o tamanho do tumor estão mais bem categorizados como agentes causais neste

contexto. Quanto as variáveis relacionadas à cirurgia, a excisão inadequada relacionada ao tipo

de cirurgia, as margens cirúrgicas positivas ou menores que 1mm, a punção tumoral durante a

cirurgia (rompimento da cápsula do tumor) e/ou derramamento tumoral no campo cirúrgico,

predispõem a recorrência (Henriksson et al., 1998; Stennert et al., 2001; Zbären e Stauffer,

2007; Orita et al., 2010; Park et al., 2012; Li et al.; 2014; Dulguerov et al., 2017), que são mais

frequentes no subtipo mixoide (onde a cápsula é mais fina e incompleta) e hipocelular (Patey e

Thackray et al., 1958; Seifert et al., 1976; Skalova et al., 2012; Robertson et al., 2014). Por

último, segundo alguns estudos, o acometimento inicial da neoplasia em idades mais precoces

também favorece a recorrência (McGregor et al., 1988; Abu-Ghanem et al., 2016; Andreasen

et al., 2016).

AP recorrentes são frequentemente multinodulares (50-100%) (Stennert et al.,

2004; Abu-Ghanem et al., 2016) e normalmente estão associados com um aumento na taxa de

complicações pós-operatórias (o risco de lesão do nervo facial é maior), na taxa de re-

recorrência e na transformação maligna (0–16%) (Andreasen et al., 2016; Dulguerov et al.,

2017; Chooback et al., 2017; Singh et al., 2017; Silva et al., 2018).

Na transformação maligna do AP, de modo simplório, o CXAP representaria a

transformação carcinomatosa do componente epitelial dentro de um AP. Alguns autores

mensuraram o risco desta transformação, que segundo suas conclusões, aumentaria com a

duração da doença: 1,5% aos 5 anos e 10% após 15 anos (Singh et al., 2017). Em contrapartida,

para AP negligenciados por longa data, o potencial de transformação aumentaria e estima-se

que 2 a 40% dos pacientes estariam propensos a desenvolver a neoplasia maligna (Abu-Ghanem

et al., 2016). Além do mais, para pacientes com recorrências de AP, a taxa de transformação

maligna seria de 3,3% (Andreasen et al., 2016). Um estudo recente, no entanto, estimou outros

indicadores de risco para a progressão do AP para CXAP por meio de modelos matemáticos.

Regressões ordinais uni e multivariadas evidenciaram que o tamanho do tumor e a idade do

24

paciente também são fatores de risco independentes para a transformação maligna dos AP (Egal

et al., 2018).

Neste contexto, vários fatores foram implicados ao desenvolvimento do CXAP,

principalmente concernentes a célula mioepitelial (Martins et al., 2005; de Araújo et al., 2006;

de Araújo et al., 2007; Silva et al., 2015). Intrigantemente, foi evidenciado que durante a

progressão maligna, células mioepiteliais – que circundam as células epiteliais malignas do

lúmen – se tornariam mais diferenciadas e produziriam grandes quantidades de matriz

extracelular e maior concentração de maspina (Sternlicht e Barsky; 1997; Barsky, 2003;

Martins et al., 2005; de Araújo et al., 2006). Assim, as áreas de carcinoma que se

desenvolveriam dentro do ducto, seriam separadas do estroma por uma barreira formada por

células mioepiteliais benignas, mas diferenciadas (Martins et al., 2005; de Araújo et al., 2006;

Ye et al., 2017).

Mesmo que a célula mioepitelial tenha um papel importante na contenção das

células epiteliais malignas, pelo menos na transformação maligna do AP, seus mecanismos

parecem falhar e elas tendem a desaparecer à medida que o tumor avança (Silva et al., 2015).

Por outro lado, referente a transformação das células mioepiteliais, o reconhecimento de uma

neoplasia verdadeiramente maligna é mais desafiador e os processos implícitos na

transformação ainda são pouco explorados. Ao que parece, esses tumores carecem de

pleomorfismo celular e a identificação de um crescimento invasivo é mandatório para o

diagnóstico de malignidade (Sedassari et al., 2017).

De todo modo, parece mais correto assumir que a patogênese da transformação

maligna do AP, independente da histogênese luminal ou mioepitelial, ainda não é clara.

Todavia, é inegável que um grande avanço tem sido alcançado nos últimos anos, principalmente

no que diz respeito a importância da instabilidade genômica, refletida nas modificações

epigenéticas e mutações sucessivas associadas a doença (de Morais et al., 2019).

Adicionalmente, rearranjos e fusões relacionadas com o gene 1 do AP (PLAG1) e grupo de alta

mobilidade humana A (HMGA2) foram relatadas, mesmo que ainda pouco se conheça sobre os

reais impactos destes mecanismos gênicos sobre a patogênese da transformação (Asahina et al.,

2019).

25

CARCINOMA EX-ADENOMA PLEOMORFO

O CXAP, também conhecido como tumor maligno misto, é descrito como uma

neoplasia rara e agressiva, que surge em um AP e que possui patogênese pobremente entendida.

Sua prevalência representa aproximadamente 3% a 5% de todas as neoplasias de glândulas

salivares e 11,6% de todas as neoplasias malignas que acometem estes sítios (Mariano et al.,

2013; Hu et al., 2016; Chooback et al., 2017; Sedassari et al., 2017). Interessantemente, a última

edição do texto da OMS esclareceu que o diagnóstico de CXAP não deve ser mais considerado

como autossuficiente, sendo sua biologia reflexo do fenótipo carcinomatoso desenvolvido no

AP e da sua extensão além da cápsula do AP pré-existente (como revisado em Williams et al.,

2017; Seethala e Stenman, 2017).

O tempo de evolução da doença é geralmente longo, podendo variar de meses até

décadas (média de nove anos). A apresentação clínica mais comum do CXAP é similar àquelas

comuns em todas as neoplasias malignas das glândulas salivares, onde um nódulo ou aumento

de volume acomete a área da glândula salivar acometida, com crescimento lento, assintomático,

mas que logo cursa com sintomas adjacentes significativos (como dor, crescimento rápido,

fixação nas estruturas adjacentes, envolvimento dos nervos ou metástase cervical) (Olsen e

Lewis, 2001; Lüers et al., 2009). A dor é consequência da extensão do tumor para tecidos

adjacentes e consequente envolvimento dos ramos do nervo facial (Zbären e Stauffer, 2007; Hu

et al., 2016).

Quanto ao sítio anatômico acometido, frequentemente afetam a GP (67%), ainda

que possam surgir também na GS (15%), GSL (<1%) e GSME (18%), principalmente naquelas

localizadas no palato (Moberger e Eneroth et al., 1968; Mariano et al., 2013; Seethala e

Stenman, 2017; Singh et al., 2017). Embora raro, CXAP também foram descritos em glândula

lacrimal, mama, traqueia e cavidade nasal (Cho et al., 1995; Baredes et al., 2003; Hayes et al.,

2005; Ding et al., 2007). Manifestam-se geralmente na 6ª e 7ª décadas de vida (cerca de 1 a 2

décadas mais tarde do que no AP), com trabalhos relatando predileção pelo sexo masculino

(Lewis et al., 2001; Stodulski et al., 2007; Lim et al., 2015; Hu et al., 2016; Ye et al., 2016;

Suzuki et al., 2016), feminino ou nenhuma predileção por sexo (Matsubayashi e Yoshihara,

2007; Mariano et al., 2013; Sedassari et al., 2017).

Macroscopicamente, na grande maioria dos casos, apresentam limites pouco

definidos, com infiltração do parênquima glandular normal e estruturas adjacentes. Focos de

necrose e hemorragia podem ser revelados à superfície de corte (Ellis e Auclair, 2008).

Microscopicamente, as neoplasias epiteliais que surgem em um AP abrangem um amplo

26

espectro de padrões histológicos. Mais frequentemente, apenas um tipo histológico é

encontrado, ainda que mais de um subtipo possa estar presente (Rosa et al., 1996; Lewis et al.,

2001; Mariano et al., 2013).

Por definição, CXAP deve surgir em associação com um componente benigno, que

exige evidência histológica de AP coexistente ou pré-existente (diagnóstico histológico prévio).

Normalmente, a neoplasia maligna pode ser dividida em dois grupos principais, a considerar

seu componente celular alterado: (1) carcinomas apenas com diferenciação epitelial (luminal),

provavelmente derivadas de células já comprometidas com a diferenciação das células do lúmen

ductal e (2) carcinomas com um componente mioepitelial, provavelmente derivadas de um

precursor comum entre as células mioepiteliais e ductais – as células bipotentes (Sato et al.,

1984; Altemani et al., 2005).

Além disso, o conceito de estratificação por invasão, parece ter sido mais bem

aceito e expandido nos dois últimos anos. Com isso, o tumor passa a ser classificado quanto à

extensão além de sua cápsula em (1) carcinoma não invasivo – intracapsular (contido pela

cápsula), (2) minimamente invasivo (infiltração do tecido extracapsular a uma distância ≤

1,5mm) e francamente invasivo (infiltração >1,5 mm) (LiVolsi e Perzin, 1977; Hu et al., 2016;

Williams et al., 2017; Seethala e Stenman, 2017; de Morais et al., 2019).

O diagnóstico histológico nem sempre é simples, primeiramente porque o próprio

AP pode apresentar características histológicas atípicas (embora genuínas) e segundo porque a

porção maligna pode substituir completamente o AP residual, que a depender do tamanho da

área transformada, pode estar restringido a pequenas áreas hialinizadas (Lewis et al., 2001).

Além disso, AP podem ser camuflados pelo carcinoma ou ainda apresentar alterações

degenerativas, como cicatrizes, calcificações distróficas, necrose e hemorragia (Di Palma,

2013).

Segundo a história evolutiva do CXAP, o componente carcinomatoso está

primeiramente contido pela cápsula do AP (Logasundaram et al., 2008). Como visto, durante a

transformação das células luminais presentes nas estruturas tubulares neoplásicas, as células

mioepiteliais seriam provavelmente estimuladas para alcançar uma diferenciação, na tentativa

de impedir a progressão. Este mioepitélio modificado vai à medida que os ductos vão se

dilatando preenchidos por células carcinomatosas, se comprimindo e desaparecendo (Altemani

et al., 2005). Além disso, a ruptura da membrana basal confinante das estruturas ductais permite

a infiltração consecutiva das células malignas na matriz do AP. Independente da origem (células

luminais ou mioepiteliais), a partir deste momento, à medida que evolui, a neoplasia tende a ser

mal definida e infiltrar o tecido glandular salivar adjacente. A área transformada, geralmente

27

apresenta contraste morfológico das áreas benignas, com células malignas apresentando

pronunciado pleomorfismo nuclear e aumento do número de mitoses. Invasão perineural,

vascular e linfática, necrose e hemorragia normalmente aumentam à medida que o tumor invade

a cápsula e torna-se francamente invasivo (Di Palma, 2013) (Figura 2).

Figura 2 – Ilustração esquemática evidenciando a progressão do AP para CXAP de acordo com a célula

transformada. Em A, o componente carcinomatoso está primeiramente contido pela cápsula do AP

(CXAP intracapsular). À medida que há ruptura da membrana basal confinante nas estruturas

ductais, a infiltração alcança a matriz do AP. Em B, transformação da célula mioepitelial, que nos

estágios iniciais de proliferação ainda está contida pela cápsula do AP (CXAP intracapsular).

Independente da origem, a partir do momento em que alcançam a matriz do AP, à medida que

evoluem, infiltram o tecido extracapsular: CXAP minimamente invasivo (infiltração do tecido

extracapsular a uma distância ≤ 1,5mm) e francamente invasivo (infiltração > 1,5mm)

Adaptado de Williams et al., 2017

Carcinomas compostos apenas por células luminais estão mais suscetíveis a se

desenvolver em um AP e podem ser, normalmente, adenocarcinoma SOE ou carcinoma do

ducto salivar (Ihrler et al., 2017). Os achados na literatura suportam a hipótese de que um

carcinoma intraductal é necessário como uma lesão precursora obrigatória (excluindo-se

carcinomas com diferenciação mioepitelial) (Ihrler et al., 2017). Porém, mesmo que raros, casos

28

de carcinoma mucoepidermoide, carcinoma de células acinares, carcinoma sarcomatóide,

carcinoma epidermoide, carcinoma indiferenciado, carcinoma oncocítico, carcinoma de células

basais, carcinosarcoma e adenocarcinoma de células claras já foram descritos (LiVolsi e Perzin

et al., 1977; Spiro et al., 1977; Tortoledo e Luna, 1984; Gnepp, 1993; Olsen e Lewis, 2001;

Altemani et al., 2005; Mariano et al., 2013; Endo et al., 2018).

CXAP com componente mioepitelial, por outro lado, também são relatados, embora

sejam menos comuns do que CXAP com apenas diferenciação epitelial. Podem ser subdivididos

em carcinomas que exibem tanto malignidades epiteliais e mioepiteliais quanto àqueles com

malignidade mioepitelial exclusiva (Demasi et al., 2010; Antony et al., 2012). Normalmente,

carcinomas com diferenciação mioepitelial podem se apresentar como carcinoma mioepitelial,

carcinoma epitelial-mioepitelial, carcinoma adenoide cístico e adenocarcinoma polimorfo

(Altemani et al., 2005; Kim et al., 2011). No entanto, quando apenas as células mioepiteliais se

transformam, os carcinomas mioepiteliais originados, normalmente se apresentam como

neoplasias com células policlonais e arredondadas, citoplasma moderado a abundante e núcleo

claro (Logasundaram et al., 2008).

A principal modalidade de tratamento é a remoção cirúrgica, que deve ser radical

em CXAP francamente invasivos ou com acometimento do nervo facial (em casos de

envolvimento da GP) (Olsen e Lewis, 2001; Nouraei et al., 2005). A necessidade de

esvaziamento cervical ocorre nos tumores com metástase regional. Radioterapia pós-operatória

é usada para doenças com alto grau de malignidade, em casos de margem comprometida, ou

quando há invasão linfonodal, vascular ou perineural (Lüers et al., 2009). A combinação de

radioterapia e quimioterapia é indicada para pacientes com doença disseminada (Olsen e Lewis,

2001; Lüers et al., 2009).

CXAP precoces (intracapsulares e minimamente invasivos) tendem a exibir

comportamento biológico de baixo grau, semelhante ao do AP com margens livres (Zbären e

Stauffer, 2007). Isto porque exibem bom prognóstico, sem metástases à distância ou óbito e

melhor sobrevida livre de doença, embora alguns casos relatados de CXAP intracapsular

tenham apresentado invasão vascular e perineural, bem como metástase linfonodal e óbito

(Katabi et al., 2010; Griffith et al., 2014; Rito e Fonseca, 2016; Ihrler et al., 2017).

Por outro lado, CXAP francamente invasivos representam a maior gama de

trabalhos publicados – o que provavelmente reflita sua maior prevalência quando comparado

aos outros subtipos – e apresentam comportamento mais agressivo, originando metástases à

distância (principalmente para pulmão), recidivas e morte (Tortoledo et al., 1984; Zbären e

Stauffer, 2007; Ihrler et al., 2017). Entretanto, enquanto o carcinoma mioepitelial e o carcinoma

29

epitelial-mioepitelial parecem representar subtipos histopatológicos de baixo grau de CXPA,

os outros carcinomas originados (carcinoma do ducto salivar, adenocarcinoma SOE e

carcinoma epidermoide) tendem a ter comportamento de alto grau (de Brito et al., 2016; Ye et

al., 2017). Além disso, CXAP são uma das neoplasias mais agressivas das glândulas salivares,

apresentando sobrevida em 5 anos próxima de 50% (Lingen, 2010; Som e Bandwein, 2003; Ye

et al., 2016).

Recorrências locais e regionais ocorrem em 23% e 18% respectivamente e mudam

drasticamente o prognóstico dos portadores de CXAP. Quando ocorrem, resultam em uma

média de sobrevida de menos de um ano após descoberta (Olsen e Lewis, 2001). As taxas de

sobrevida dos portadores deste carcinoma variam entre os diferentes estudos. Por exemplo,

Olsen e Lewis (2001) encontraram uma taxa de sobrevida livre de doença em 37% de 73 casos,

enquanto Zbären e Stauffer (2007) em 76% de 24 casos. As diferenças podem ser explicadas

pelas diferentes prevalências de grau de invasão e comportamento biológico de cada tumor

(Ihrler et al., 2017).

METABOLISMO NA PATOGÊNESE DO CÂNCER

O metabolismo pode representar a soma de todas as reações químicas que ocorrem

dentro de uma célula e entendê-lo, bem como compreender suas formas de regulação, é de certa

forma perceber como o organismo funciona (Ferreira, 2010). O metabolismo do câncer é uma

das áreas mais antigas de pesquisa em biologia do câncer, precedendo descobertas genômicas

importantes (como a descoberta dos oncogenes e genes supressores de tumor) em cerca de 50

anos (de Berardinis e Chandel, 2016).

Entretanto, foram só nas últimas décadas, que seu verdadeiro papel na

transformação maligna foi estabelecido na literatura científica mundial (Hsu e Sabatini, 2008;

Vander Heiden et al., 2009; Coller, 2014; Sullivan et al., 2016; Potter et al., 2016; Chen et al.,

2017; Schcolnik-Cabrera et al., 2018). Por outro lado, os avanços dos últimos anos ampliaram

o que se sabia acerca do conhecimento dos processos associados à transformação maligna de

um tecido. Em 2000, por exemplo, Hanahan e Weinberg em um estudo original causou impacto

na comunidade científica global ao citar seis marcas do câncer, a saber: (1) proliferação

descontrolada, (2) resistência à apoptose, (3) angiogênese, (4) imortalidade replicativa, (5)

invasão e metástase, e (6) evasão de genes supressores de tumor (Hanahan e Weinberg, 2000).

Alguns anos depois, adicionalmente, os mesmos autores ampliaram a lista original e a

reprogramação metabólica, a instabilidade genômica, a inflamação promotora de tumor, e o

30

escape do sistema imune foram referidos como fatores emergentes e essenciais para sustentar a

proliferação descontrolada das células neoplásicas (Hanahan e Weinberg, 2000; Hanahan e

Weinberg, 2011; Potter et al., 2016). Neste contexto, parece impraticável referir o fenótipo

metabólico na patogênese da doença, sem mencionar o Efeito de Warburg – hipótese postulada

há quase um século, mas que se mantém fundamentada até os dias atuais (Potter et al., 2016).

2.3.1 Efeito de Warburg

Em organismos multicelulares, as células são expostas a um suprimento constante

de nutrientes. Quando a disponibilidade de nutrientes excede o nível necessário para sustentar

a divisão celular, o organismo necessita de sistemas de controle que freiem a proliferação

celular individual exacerbada. Normalmente, isto é facilmente controlado, porque as células

humanas não absorvem nutrientes de seu ambiente, a menos que sejam estimuladas por fatores

de crescimento (Hsu e Sabatini, 2008).

Entretanto, no câncer, as células malignas conseguem superar a dependência do

fator de crescimento por meio de mutações genéticas que alteram funcionalmente vias de

captação e metabolismo de nutrientes (Vander Heiden et al., 2009; Icard et al., 2018). Com isso,

aumentam sua demanda de energia para sobreviver nas condições impostas pela neoplasia –

percepção brilhantemente descrita por Otto Warburg e colaboradores em 1924 e reconhecida

com o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1931 (Warburg et al., 1924; Brand, 2010).

Assim, na presença de oxigênio, as células normais usariam as mitocôndrias para

metabolizar a glicose em ATP, por meio da fosforilação oxidativa. Sob condições anaeróbicas,

por outro lado, as células produziriam grandes quantidades de lactato por meio da glicólise

aeróbica (Cori e Cori, 1925; Warburg, 1927). Além disso, diante das observações de Warburg,

acreditava-se que as células neoplásicas desenvolveriam um defeito na mitocôndria, que

ficariam disfuncionais. Isto prejudicaria à respiração aeróbica e tornaria a célula dependente do

metabolismo glicolítico para sobreviver, o que significa que indiretamente, as células

neoplásicas escolheriam produzir ATP pela glicólise e não pela fosforilação oxidativa, mesmo

na presença de amplo oxigênio (Warburg et al., 1924; Warburg, 1956).

Este fenômeno, denominado Efeito de Warburg (Warburg et al., 1924; Warburg,

1956), universalmente conhecido e considerado o padrão de referência para o metabolismo no

câncer, entretanto, apresenta um parodoxo. A glicólise não tem a mesma eficiência para a

produção de ATP que a fosforilação oxidativa, então por que as células em proliferação

mudariam para um metabolismo menos eficiente? Para Vander Heiden e colaboradores (2009),

31

duas explicações são possíveis: a primeira delas, é que a produção ineficiente de ATP se daria

apenas quando os recursos são escassos – o que não é o caso das neoplasias humanas, que

dispõem de um fornecimento contínuo de glicose e outros nutrientes no sangue circulante; e o

segundo, que se refere as reais necessidade metabólicas das células em proliferação, que se

estendem além do ATP (como revisado em Vander Heiden et al., 2009 e Zaidi et al., 2013).

A título de exemplo, uma célula em proliferação para replicar todo o seu conteúdo

celular e produzir duas células filhas viáveis na mitose, requerem não só ATP, mas também

nucleotídeos, ácidos graxos, lipídios de membrana e proteínas (Vander Heiden, Cantley e

Thompson, 2009; Zaidi et al., 2013; Valli et al., 2014; Schcolnik-Cabrera et al., 2018). A via

glicolítica se prestaria então à produção de biomassa, após um desvio efetivo de glicose para

fornecer fontes de carbono a outras vias metabólicas a fim de sintetizar substrato (aminoácidos,

lipídios e nucleotídeos) para sustentar a rápida taxa de crescimento durante a proliferação de

células tumorais (Courtnay et al., 2015; Gentric et al., 2017).

Mesmo que o Efeito de Warburg seja considerado uma marca metabólica do câncer,

sua patogênese, ainda no século XXI, continua incerta e controversa. Nas últimas décadas,

estudos que contrariam a teoria original de Warburg foram estipuladas e sugerem que a maioria

das mitocôndrias tumorais não apresentam defeitos na capacidade de realizar a fosforilação

oxidativa (Weinhouse, 1976; Burns e Manda, 2017). Em vez disso, nas células em proliferação,

o metabolismo mitocondrial seria reprogramado para enfrentar os desafios da síntese de

macromoléculas. Essa possibilidade nunca foi considerada por Warburg e seus

contemporâneos, mas vem sendo enfatizada na literatura nos últimos anos (Vander Heiden et

al., 2009; Ward e Thompson, 2012; Burns e Manda, 2017).

De qualquer forma, independente do mecanismo real implicado, é consenso

científico que a principal consequência deste fenômeno, após a produção maciça de ácido lático,

seja o aumento da acidez extracelular, que torna o microambiente ácido e compromete a

integridade e organização da matriz extracelular (Menendez e Lupu, 2007; Schwartz et al.,

2017; Icard et al., 2018). Há evidências de que um pH extracelular pode promover invasão e

comportamento metastático, bem como ativação de enzimas proteolíticas e destruição de matriz

(Harguindey et al., 2005; Cardone et al., 2005; Schwartz et al., 2017; Mokrowiecka et al., 2017;

Tekade e Sun, 2017; Schcolnik-Cabrera et al., 2018).

32

2.3.2 Microambiente tumoral e o fator de transcrição induzido por hipóxia 1α

Diante deste cenário, é interessante compreender o efeito de Warburg no

microambiente tumoral. Em tumores sólidos, à medida que o tumor se expande rapidamente,

as células malignas formam grandes massas tumorais, que levam à obstrução e compressão dos

vasos sanguíneos em torno dessas massas e/ou ultrapassam os limites de difusão de seu

suprimento sanguíneo local. Seja qual for a forma, a progressão tumoral levará à hipóxia e à

estabilização do fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF), recentemente descrito como

um regulador chave da hipóxia, gerindo respostas celulares e fisiológicas necessárias na

adaptação do microambiente diante dos baixos níveis de oxigênio (Wang e Semenza, 1993; Hsu

e Sabatini, 2008; Masoud e Li, 2015; Schito e Semenza, 2016; Huang et al., 2018).

A via mais reconhecida adotada pelas células hipóxicas é a ativação do fator de

transcrição induzido por hipóxia 1 (HIF-1). Estruturalmente, consiste em um heterodímero

composto por uma subunidade alfa, composta por três isoformas (1, 2 e 3), cuja expressão é

induzida sob condições hipóxicas, e outra subunidade β (HIF-1β), também conhecido como

translocador nuclear de receptor de hidrocarboneto de arila (ARNT), que é expresso

constitutivamente (Kujan et al., 2017).

A subunidade alfa do HIF-1 (HIF-1α) possui dois domínios de transativação

(TAD): terminal NH2 (N-TAD) e terminal COOH (C-TAD). Esses dois domínios são

responsáveis pela atividade transcricional do HIF-1α. Quando o C-TAD interage com a proteína

de ligação a CREB (CBP) e seu homólogo p300 (CBP/p300), sua transcrição gênica sob hipóxia

é modulada. O N-TAD, por outro lado, é responsável por estabilizar o HIF-1α contra a

degradação. Como consequência, enquanto o oxigênio está presente, o HIF-1α é rapidamente

degradado ou desativado (Kujan et al., 2017) e a partir do momento que os níveis diminuem,

HIF-1α se estabiliza e se transloca para o núcleo, onde dimeriza com HIF-1β e é ativado. HIF-

1β, diferentemente, possui domínio de degradação de oxigênio (ODDD) sobrepondo N-TAD

em todas as estruturas, o que explica sua estabilidade em condições estáveis de oxigênio

(Masoud e Li, 2015).

Três isoformas relacionadas ao HIF-α eram conhecidas: HIF-1α, HIF-2α, e HIF-3α.

Semelhante a isoforma 1, HIF-2α também é estabilizada por hipóxia e dimeriza com o HIF-1β,

apresentando 48% de similaridade na sequência de aminoácidos. Todavia, mesmo que possuam

muitas semelhanças, não são redundantes. A isoforma 1 regula a expressão de genes

relacionados a via glicolítica e direciona as vias apoptóticas, enquanto a isoforma 2 estimula o

crescimento do tumor e angiogênese. Mais do que isso, HIF-1α desempenha um papel crítico

33

nas respostas iniciais (2-24h) à hipóxia grave (<0,1% O2), enquanto o HIF-2α afeta a hipóxia

crônica (48-72h) (Soni e Padwad, 2017). Até 2013, por outro lado, pouco se sabia sobre a

isoforma 3, que hoje parece regular negativamente a capacidade de ligação de HIF-1α ao DNA

(Torii et al., 2013).

Independentemente dos níveis de oxigênio, HIF-1α é constitutivamente transcrito e

sintetizado. Porém, como discutido nos parágrafos anteriores, a normóxia leva à rápida

degradação do transcrito de HIF-1α, ao passo que sob condições de hipóxia, o transcrito torna-

se estável e com atividade transcricional ativa, por meio de várias vias e modificações pós-

traducionais (hidroxilação, acetilação, ubiquitinação, fosforilação, sumoilação, S-nitrosação)

(Masoud e Li, 2015; Soni e Padwad, 2017).

Sob normóxia, enzimas dependentes de oxigênio chamadas de prolil hidroxilases

(PHD) se ligam ao HIF-1α e hidroxilam 2 resíduos de prolina e acetilam um resíduo de lisina,

aumentando sua afinidade com a proteína von Hippel-Lindau (pVHL), uma proteína supressora

de tumor e um dos componentes reconhecidos de uma proteína ligase de ubiquitina E3 (E3). O

reconhecimento do HIF-1α pelo pVHL leva a ubiquitinação e degradação proteossomal de HIF-

1α – regulação negativa. Como a ação de hidroxilação de PHD requer a presença de oxigênio,

sob condições hipóxicas, nem hidroxilação nem acetilação de HIF-1α ocorrem, resultando na

estabilização de sua estrutura (Masoud e Li, 2015; Kujan et al., 2017; Soni e Padwad, 2017).

Por outro lado, uma via de regulação negativa independente de pVHL pode ser

ativada. Enquanto o pVHL regula a estabilização do HIF-1α, esta via regula sua transativação.

Como visto, O HIF-1α é estabilizado quando dimeriza com HIF-1β no núcleo. Em normóxia,

um fator inibidor de HIF-1 (FIH-1), também conhecido como asparginil hidroxilase,

dependente de oxigênio, bloqueia a interação entre o domínio C-TAD no HIF-1α e o co-ativador

CBP/p300, anulando a transcrição gênica mediada por HIF-1α. Sob hipóxia, a atividade de FIH

é reduzida, resultando na ativação transcricional dos genes alvo (Dann et al., 2002; Lando et

al., 2002; McNeill et al., 2002) (Figura 3).

Em condições não hipóxicas, fatores de crescimento, citocinas e outras moléculas

de sinalização tendem a acumular a proteína HIF-1α nas células. A via de sinalização fosfatidil

inositol-4,5-bisfosfato-3-quinase (PI3K)/ proteína quinase B (AKT) é um membro de uma

família de lipídios e proteínas quinases ativadas por fatores de crescimento que incluem o

receptor do fator de crescimento epidérmico – EGFR, o fator de crescimento semelhante à

insulina-I (IGF-I) e o receptor de insulina (IRS) (Barron et al., 2016; Zhang et al., 2018). A

ativação da via resulta em aumento da tradução de HIF-1α. Por outro lado, certos fatores de

crescimento ativam o RAS, que por sua vez, estimulam cascata de sinalização extracelular

34

regulada por sinal quinase (ERK1-2) da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK), também

aumentam a tradução da proteína HIF-1α. ERK quinase, ademais, regula a ativação a nível

transcricional, por aumentar a formação do complexo HIF-1α/p300 (Jiang et al., 2001;

Semenza, 2002; Masoud e Li, 2015).

Figura 3 – Mecanismo de hipóxia dependente de oxigênio. Enquanto o oxigênio está presente, o HIF-1α é

rapidamente degradado ou desativado. Entretanto, sob condições de hipóxia, a atividade de PHD e

FIH é reduzida e o HIF-1α é capaz de se translocar para o núcleo, onde o HIF1‐β é localizado. O

HIF1-α é estabilizado quando dimeriza com HIF1‐β. Em seguida, forma um complexo com proteína

de ligação a p300/CBP, ambos os quais são capazes de regular a estrutura da cromatina. Este

complexo ativado é capaz de ativar a transcrição de uma série de genes associados com a

manutenção da homeostase do oxigênio

Adaptado de Kujan et al., 2017

Além disso, foi observado que a perda do gene supressor de tumor p53 (ou TP53),

referido como guardião do genoma, em certos tipos de tumores, está associada a níveis elevados

de HIF-1α. Em condições de normóxia, HIF-1 se liga à p53, permitindo que o homólogo do

duplo minuto 2 do rato (Mdm2) regule a ubiquitinação do HIF-1α e a degradação proteossomal.

35

Em tumores sob hipóxia, perdas ou mutações em genes supressores de tumor anulam qualquer

hipótese da degradação do HIF-1α mediada por Mdm2. Inibidores da proteína 90 do choque

térmico (Hsp90), por outro lado, poderiam anular os níveis de HIF-1α, independentemente da

disponibilidade de oxigênio. Isto porque conseguem se ligar diretamente ao HIF-1α e assim

induzem mudanças conformacionais em sua estrutura, que impedem sua acoplagem a molécula

de HIF-1β durante a transativação (Ravi et al., 2000; Isaacs et al., 2002; Masoud e Li, 2015).

Há 20 anos, a primeira descrição da superexpressão de HIF-1α em cânceres

humanos causou um grande impacto global e contribuiu para as perspectivas futuras do papel

da reprogramação metabólica no câncer (Zhong et al., 1999). Conforme já descrito, os tumores

apresentam alto comprometimento do equilíbrio celular de O2 (cerca de 60% dos tumores

sólidos apresentam menos que 1% de O2) e, neste contexto, o principal maestro da resposta por

hipóxia seria HIF-1α (Vaupel e Mayer, 2014; Soni e Padwad, 2017; Harrison et al., 2018).

Níveis aumentados da proteína HIF-1α foram constatados em uma ampla gama de neoplasias,

por meio da análise de imunoistoquímica de biópsias de tumores malignos de cabeça e pescoço

(que inclui o carcinoma oral e tumores de glândula salivar), nasofaringe, laringe, esôfago,

gastrointestinal, fígado, pulmão, rim, bexiga, mama, ovário, cervical, cólon, endométrio,

próstata, colorretal, melanoma e oligodendroglioma (Haugland et al., 2002; Takahashi et al.,

2003; Yasuda et al., 2004; Jokilehto et al., 2006; Klatte et al., 2007; Horree et al., 2008; Chen

et al., 2009; Jo et al., 2010; Wu et al., 2010; Zhou et al., 2010; Malfettone et al., 2012; Abraham

et al., 2012; Xu et al., 2013; Huang et al., 2014; Slominski et al., 2014; Maroni et al., 2015;

Zapatero et al., 2015; Aquino-Galvez et al., 2016; Zhang e Wang, 2016; Zhou et al., 2017;

Huang et al., 2018; Peng et al., 2018; Xie et al., 2018; Cardoso et al., 2019).

Portanto, as células tumorais respondem as variações de oxigênio, por meio da

regulação positiva de HIF-1α, que quando estabilizado ativa mais de 100 genes à jusante, que

por sua vez, orquestram muitas funções celulares essenciais (angiogênese, eritropoiese,

metabolismo, sobrevivência e proliferação celular) (Kujan et al., 2017). Além disso, estudos

recentes têm destacado que níveis aumentados de HIF-1α se correlacionam com metástases de

tumores, que leva a um mau prognóstico do paciente (Zhou et al., 2017; Huang et al., 2018).

Em um tumor com alta capacidade de proliferação, por exemplo, HIF-1α ajudaria as células

tumorais sob hipóxia a mudar o metabolismo da glicose da fosforilação oxidativa para via

glicolítica, a fim de manter sua produção de energia (Efeito de Warburg, já mencionado) (Peng

et al., 2018; Vidimar et al., 2019). Por esse motivo, mediariam a conversão metabólica por meio

da indução de enzimas relacionadas com a via da glicólise e da superexpressão de

36

transportadores de glicose (GLUT), que por sua vez aumentariam a importação de glicose nas

células tumorais (Denko, 2008; Seleit et al., 2017).

2.3.3 Microambiente tumoral e o transportador de glicose 1

A captação de glicose através da membrana plasmática é considerada o primeiro

passo para o metabolismo da glicose. Neste cenário, os transportadores de glicose (GLUT),

também conhecidos como família de portadores de soluto 2 (SLC2A), são essenciais, pois

permitem o transporte de glicose por um mecanismo de difusão facilitada (a favor de um

gradiente de concentração) (Rumsey et al., 1997; Macheda et al., 2005; Barron et al., 2016;

Galochkina et al., 2019). A fim de alcançar uma taxa glicolítica que é aproximadamente 30

vezes maior do que o normal, as células neoplásicas absorvem glicose rapidamente e em altas

taxas. A glicose, por sua vez, devido à sua natureza hidrofílica, requer proteínas transportadoras

específicas para atravessar a membrana plasmática das células. Estruturalmente, catorze

membros da família já foram identificados em humanos, com diferentes especificidades de

substrato e expressão tecidual (Thorens e Mueckler, 2010; Yu et al., 2017).

No século XXI, entretanto, três grupos foram classificados: o primeiro deles refere-

se a classe I, que inclui GLUT-1 a GLUT-4 e GLUT-14; estes foram os primeiros

transportadores descritos e são os mais bem caracterizados. O segundo refere-se a classe II, que

inclui GLUT-5, GLUT-7, GLUT-9 e GLUT-11; que compartilham a capacidade de transportar

frutose. E o terceiro, que se refere a classe III, descobertos recentemente e ainda não tão bem

caracterizados, mas que incluem GLUT-6, GLUT-8, GLUT-10, GLUT-12, GLUT-13 ou

H+/myo-inositol transporter (HMIT) (Joost e Thores, 2001; Barron et al., 2016).

O registro mais antigo do papel dos GLUT no microambiente tumoral é da década

de 70, onde foi postulado a hipótese de que a captação de glicose e a expressão de seus

transportadores em células transformadas era o primeiro passo para regulação do metabolismo

da glicose (Hatanaka, 1974). Uma vez que estas células apresentariam uma maior demanda de

nutrientes para o crescimento celular, seria importante então que a taxa de absorção fosse maior

(Jóźwiak e Lipińska, 2012; Gonzalez-Menendez et al., 2018). Em suma, as proteínas GLUT

são expressas em níveis mais altos e em padrões anormais de tecido quando células saudáveis

se transformam em malignas (Barron et al., 2016; Galochkina et al., 2019).

O gene facilitador do membro 1 do transportador de glicose (GLUT-1) é uma

isoforma altamente conservada que possui alta afinidade pela glicose, mas que também pode

transportar galactose, manose, glucosamina e outros. GLUT-1 é expresso na maioria dos tecidos

37

normais (distribuição dita ubíqua) e é responsável pelo transporte basal de glicose. Altos níveis

também podem ser encontrados em células endoteliais e epiteliais no cérebro, olho, nervo

periférico, placenta e lactação da glândula mamária, embora venha sendo relatado em diferentes

tipos de cânceres nas últimas décadas (Takata et al., 1990; Joost e Thorens, 2001; Zhao e

Keating, 2007).

A regulação de GLUT-1, bem como sua expressão e distribuição subcelular, se dá

por diferentes moléculas e vias de sinalização (Barron et al., 2016; Zhao e Zhang; 2016). Em

síntese, quando nas células em contato direto com o estroma e vasos, é induzida principalmente

por oncogenes e fatores de crescimento, enquanto nas áreas centrais dos ninhos tumorais está

associada a hipóxia (Chen et al., 2000). HIF-1α regula sua transcrição gênica em resposta à

redução da oxigenação tecidual. Como visto anteriormente, quando ativado, medeia a regulação

transcricional de genes glicolíticos ao qual incluem-se GLUT-3 e predominantemente GLUT-

1 (Chen et al., 2000; Iglesias-Fernandez et al., 2017; Seleit et al., 2017; Shukla et al., 2018),

que são capazes de aumentar a captação de glicose ao superexpressar os GLUT na membrana

celular (Jóźwiak e Lipińska, 2012; Gonzalez-Menendez et al., 2018).

De modo geral, conforme descrito em sessão anterior, células submetidas a hipóxia

devem sofrer adaptações metabólicas para sobreviver. A hipóxia pode alterar a expressão de

genes específicos e contribuir para a diversidade celular dentro da lesão e neste contexto, a

expressão de GLUT-1 seria induzida via HIF-1α e aumentaria sob condições de baixos níveis

de oxigênio, uma vez que exigiria das células uma mudança no metabolismo da glicose para a

glicólise (Sadlecki et al., 2014; Kujan et al., 2017; Shukla et al., 2018).

A via PI3K participa do mecanismo de estimulação aguda do transporte de glicose

em tecidos normais responsivos à insulina, que envolve a rápida translocação do GLUT-4 dos

compartimentos de armazenamento intracelular para a membrana plasmática. IGF-1, por sua

vez, causa a translocação de GLUT-1 e GLUT-3 de um compartimento intracelular para a

membrana plasmática 1 (conforme revisado em Barron et al., 2016). Além disso, nas células

neoplásicas, AKT parece aumentar a expressão de GLUT-1 e GLUT-3, sendo um mediador de

translocação de GLUT-4 para a membrana plasmática (Barthel et al., 1999).

Por outro lado, a perda de p53 mostrou ser uma peça fundamental na condução de

um aumento expresso de GLUT-1, GLUT-3, GLUT-4 e GLUT-12 (Schwartzenberg-Bar-

Yoseph et al., 2004). A ativação de RAS, por sua vez, tem demonstrado levar a uma regulação

positiva de GLUT-1 (Yun et al., 2009). O aumento na expressão e atividade de c-Myc, da

família de oncogenes celulares denominada MYC, proposta em células neoplásicas, por

38

mutações dentro do gene c-Myc, parece induzir a expressão de GLUT-1 e GLUT-2, que

aumenta gradativamente a captação de glicose (Osthus et al., 2000). Finalmente, hormônios

ovarianos, particularmente o estrogênio, podem fornecer outro mecanismo de regulação do

GLUT (Macheda et al., 2005).

Ao passar do tempo, a superexpressão de proteínas transportadoras de glicose foi

observada em tecidos tumorais de diversos tipos de cânceres, que incluem o de pele, glândulas

salivares, oral, hipofaríngeo, laríngeo, gástrico, esofágico, hepático, pancreático, colorretal, de

vesícula biliar, adrenocortical, renal, pulmonar, mamário, ovariano, cervical, prostático e

neuroblástico (Kawamura et al., 2001; Mineta et al., 2002; Macheda et al., 2005; Godoy et al.,

2006; Mori et al., 2007; Fenske et al., 2009; Legan et al., 2009; Ganapathy et al., 2009; Knapp

et al., 2012; Ramani et al., 2013; Gonzalez-Menendez et al., 2014; Grimm et al., 2014; Starska

et al., 2015; Barron et al., 2016; Martel et al., 2016; Wang et al., 2017; Oh et al., 2017; Xiao et

al., 2018; Deng et al., 2018; Gonzalez-Menendez et al., 2018; Zhang et al., 2019), sendo que o

aumento de sua expressão estava correlacionado com o aumento da atividade proliferativa

(Younes et al., 1997; Chen et al., 2019), menor grau de diferenciação tumoral (Cantuaria et al.,

2001; Yu et al., 2017), mau prognóstico (Chen et al., 2017; Wang et al., 2017; Yu et al., 2017;

Deng et al., 2018; Zhang et al., 2019; Yu et al., 2019) e diminuição de sobrevida (Kang et al.,

2002; Chen et al., 2017; Giatromanolaki et al., 2017; Wang et al., 2017).

Interessantemente, atualmente, varreduras de tomografia por emissão de pósitrons

de 18F-deoxi-glicose (FDG-PET) utilizam a informação da atividade metabólica aumentada no

câncer, bem como o aumento da captação da glicose e expressão de GLUT, para detecção do

tumor, prognóstico e orientação na terapia do câncer (Zhang et al., 2019). No geral, além de

nos últimos anos GLUT-1 ter sido apresentado como um potencial biomarcador metabólico em

diversos tumores, estudos recentes têm se concentrado na inibição de GLUT para diminuir o

crescimento de células neoplásicas, sendo o GLUT-1 o mais bem estudado. Inibição da

proliferação celular e crescimento tumoral, além de indução de morte celular foram observadas

em ensaios in vivo e in vitro de leucemia e de tumores de pâncreas, próstata, tireoide, pulmão,

ovário, mama, colo de útero e cabeça e pescoço (Rastogi et al., 2007; Wood et al., 2008; Liu et

al., 2010; Young et al., 2011; Fei et al., 2012; Tuccinardi et al., 2013; Wang e Li, 2013; Zhang

et al., 2013; Gonzalez-Menendez et al., 2014; Martel et al., 2016; Wang et al., 2017).

39

2.3.4 Microambiente tumoral e a enzima ácido graxo sintase

Os lipídios (incluindo esteróis, isopenóides, acilgliceróis e fosfolipídios) são

biomoléculas importantes para o metabolismo e armazenamento de energia, uma vez que são

compostos ricos em energia que podem ser degradados para fornecer ATP. Além disso,

compõem membranas celulares e atuam como moléculas de sinalização. Muitos lipídios são

sintetizados a partir de ácidos graxos (AG) (Röhrig e Schulze, 2016). Existem duas fontes de

AG para o metabolismo animal: AG exógenos, que são derivados da dieta e AG endógenos. A

biossíntese endógena é realizada pela enzima ácido graxo sintase (FASN), que sintetiza AG de

cadeia longa, sendo o produto um AG saturado de 16 carbonos denominado palmitato

(Menendez e Lupu, 2007; Zaidi et al., 2013). O palmitato é então conjugado a proteínas ou

convertido em outros AG e lipídios complexos que poderão ser substrato para a síntese de

lipídios e membranas celulares, modificação e localização de proteínas, e sinalização de

receptores das principais vias de sinalização oncogênica (como a via PI3K/AKT/mTOR) (Jones

e Infante, 2015).

Parece correto afirmar que a síntese de macromoléculas é um desafio e se torna

possível durante a reprogramação metabólica e aumento da lipogênese (Lu et al., 2018; Zadra

et al., 2019). A lipogênese aumentada, marca do metabolismo reprogramado do câncer, é

refletida pelo aumento significativo da atividade e expressão de várias enzimas lipogênicas

(como revisado em Lu et al., 2018 e Zadra et al., 2019). Cerca de 25 enzimas estão relacionadas

com a síntese de novo de AG. Após a captação celular pelos GLUT (ao qual se inclui o GLUT-

1) presentes na membrana celular, a glicose é fosforilada e o piruvato originado é convertido

em acetil-coenzima A (CoA), que entra no ciclo de Krebs na mitocôndria. Uma porção da acetil-

CoA é carboxilada a malonil-CoA pela acetil-CoA carboxilase (ACACA). FASN, a principal

enzima biossintética, realiza então a condensação de acetil-CoA e malonil-CoA para produzir

o palmitato de AG saturado com 16 carbonos e outros ácidos graxos saturados de cadeia longa,

que dependem da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) como redutor

(Menendez e Lupu, 2007; Flavin et al., 2010).

No século XXI, é consenso que células normais (exceto fígado, glândulas mamárias

durante a lactação, endométrio na fase proliferativa, tecido adiposos e pulmões de recém-

nascidos) têm baixos níveis de expressão e atividade de FASN (Weiss et al., 1986; Kuhajda,

2000; Chirala et al., 2003, Menendez et al., 2005; Flavin et al., 2010). No entanto, as células

tumorais, dependendo do tumor, podem sintetizar de novo até 95% de AG e esta mudança de

40

cenário já se inicia durante a transformação fenotípica do tecido e expande-se à medida que a

neoplasia se configura como uma entidade comprovadamente maligna (Zaidi et al., 2013).

Em 1989, Kuhajda e colaboradores identificaram em pacientes com câncer de

mama com mau prognóstico, o antígeno oncogênico-519 (AO-519) (Kuhajda et al., 1989), cuja

expressão em 1992, foi correlacionada com tumores de próstata de alto grau (Shurbaji et al.,

1992). Alguns anos depois, os mesmos autores que descreveram AO-519 mostraram que, na

verdade, este antígeno correspondia a FASN (Kuhajda et al., 1994).

FASN está expressa em uma variedade de neoplasias malignas, tais como de

cérebro, boca, esôfago, tireoide, estômago, pâncreas, pulmão, rim, cólon e reto, bexiga, mama,

endométrio, ovário, próstata, sarcomas de tecido mole, mieloma múltiplo e linfoma não-

Hodgkin (Kuhajda et al., 2000; Wang et al., 2001; Agostini et al., 2004; Tsuji et al., 2004; Rossi

et al., 2006; Alo et al., 2007; Walter et al., 2009; Horiuchi et al., 2008; Uddin et al., 2010; Liu

e Brown, 2011; De Andrade et al., 2011; Notarnicola et al., 2011; Ito et al., 2014; Rossato et

al., 2014; Bauerschlag et al., 2015; Massari et al., 2016; Zhou et al., 2017; Zadra et al., 2019).

Níveis aumentados de FASN estão frequentemente associados à agressividade tumoral,

manutenção e progressão do tumor, bem como desenvolvimento de metástases (Menendez e

Lupu, 2007; Mounier et al., 2014; Bauerschlag et al., 2015; Sangeetha et al., 2015; Zhou et al.,

2017; Lu et al., 2018). Além disso, FASN pode ser considerada um marcador de pior

prognóstico (Abdelrahman et al., 2019) e pode estar associada com altas taxas de recorrências

(Kuhajda et al., 2000; Menendez e Lupu, 2007; Bauerschlag et al., 2015) e resistência das

células tumorais ao tratamento (Papaevangelou et al., 2018; Zhan et al., 2018).

A regulação da expressão de FASN em tumores malignos é complexa e envolve um

controle transcricional e outro pós-traducional (Kuhajda, 2006; Menendez e Lupu, 2007;

Mashima et al., 2009; Flavin et al., 2010) (Figura 4). É importante salientar que estes dois

controles reguladores da FASN podem ocorrer simultaneamente em células tumorais

(Menendez e Lupu, 2007). Os receptores do fator de crescimento, como ERBB-2 e EGF, podem

interagir e formar a via de sinalização PI3K/AKT e a cascata MEK/EKR1-2 com posterior

ativação transcricional da expressão do gene FASN (Menendez e Lupu, 2007). Da mesma

forma, em órgãos sensíveis a hormônios (como mama, endométrio, ovário e próstata) a ativação

de receptores de hormônios sexuais por estrogênio, progesterona e andrógeno pode induzir a

ativação aberrante de AKT e EKR1/2, amplificando a superexpressão de FASN (Menendez e

Lupu, 2007). De todo modo, ambas as vias podem regular a expressão de FASN por meio da

modulação da expressão da proteína de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP)-1c,

41

que se liga na região promotora do gene FASN. O proto-oncogene FBI-1 (Pokemon), um fator

de transcrição, pode interagir indiretamente com SREBP-1c por meio de seu domínio de ligação

ao DNA, ativando sinergicamente a transcrição de FASN (Flavin et al., 2010; Cheng et al.,

2018). AKT, ativado em condições de hipóxia, também é capaz de ativar SREBP-1. Logo, a

hipóxia, por meio da indução de AKT, seguida da ativação de HIF1 e SREBP-1 pode regular

FASN (Furuta et al., 2008) (Figura 4A).

Figura 4 – Principais vias de regulação de FASN no câncer. Em A, controle transcricional. Fatores de crescimento

(FC) se ligam aos seus receptores presentes na membrana celular, levando a ativação das vias PI3K-

AKT e MEK/EKR1-2. Estas vias podem ser ativadas pela interação entre os hormônios esteroides, tais

como estrógeno (E), andrógenos (A) e progesterona (A) e seus respectivos receptores (RE, RA, RP).

Ambas as vias estimulam a expressão de FASN por meio da modulação da expressão de SREBP1c que,

por sua vez, se liga na região promotora do gene FASN, resultando em sua transcrição. Em B, regulação

da expressão de FASN em nível pós-traducional. A interação entre FASN e a enzima desubiquitinante

USP2a, promove a remoção da ubiquitina e impede a degradação proteossômica de FASN

Adaptado de Menendez e Lupu, 2007

Em um estudo com tumor de próstata, a falta de expressão, perda ou mutação do

gene supressor de tumor, PTEN, ativou a via AKT e regulou positivamente os níveis de FASN

42

in vitro (Bandyopadhyay et al., 2005). Por outro lado, outro mecanismo de regulação pode

ocorrer por meio da indução translacional mediada por mTOR. A ativação de mTOR pela

superexpressão do homólogo RAS enriquecido no cérebro (RHEB) pode aumentar as taxas de

FASN sintetizadas enquanto o bloqueio da via de sinalização mTOR pode reduzir sua expressão

(Yoon et al., 2007).

Mecanismos pós-traducionais podem regular a expressão de FASN no câncer. A

protease 2a específica de ubiquitina (USP2a), uma enzima desubiquitinante, pode interagir e

estabilizar FASN por meio da remoção da ubiquitina (Graner et al., 2004) (Figura 4B).

2.3.5 Microambiente tumoral, gotas lipídicas e a adipofilina

Gotas lipídicas (GL) são encontradas no citoplasma de quase todos os tipos de

células e desempenham um papel importante na homeostase lipídica celular, armazenando

principalmente lipídios que poderão ser utilizados para a síntese de fosfolipídios de membrana.

São constituídas por um centro rico em lipídios e recobertas por uma camada única de

fosfolipídios e inúmeras proteínas (Brasaemle, 2007; Bozza e Viola, 2010; Boussahmain et al.,

2013). Além disso, podem atuar na expressão gênica desempenhando papéis de ligantes para

receptores nucleares e como abrigo temporário de proteínas específicas, diminuindo quando

não são necessárias ou desejáveis no local onde funcionam (Brasaemle, 2007; Boussahmain et

al., 2013).

As células, durante a lipogênese, requerem uma ou mais proteínas para manter a

integridade das GL (Bozza e Viola, 2010). A família PAT de proteínas inclui a perilipina-1 (ou

perilipina), a adipofilina (ou perilipina-2 ou proteína relacionada com a diferenciação de

adipócitos - ADPR), a perilipina-3 (TIP47 ou proteína que interage na cauda de 47 kD), a S3-12

(ou perilipina-4) e a OXPAT (proteína de gotículas lipídicas do miocárdio ou perilipina-5)

(Bickel et al., 2009; Kimmel et al., 2010; Straub et al., 2010; Cusano et al., 2012; Wang e

Sztalryd et al., 2011). Estas proteínas são cruciais para a formação, manutenção, modificação e

involução de GL e permitem o armazenamento de gordura rica em energia (Westhoff et al.,

2017). Os membros da família PAT diferem entre si em tamanho, expressão tecidual, afinidade

por GL, estabilidade quando não estão vinculados a GL e regulação transcricional. Perilipina,

S3-12 e OXPAT são expressas de maneira restrita ao tecido, enquanto a adipofilina e a TIP47

são ubiquamente expressas. Além disso, perilipina e adipofilina estão constitutivamente

relacionadas com a GL (Bickel et al., 2009).

43

A adipofilina é uma molécula importante na coordenação da atividade de lipases na

superfície de GL dentro do citoplasma celular e desempenha um papel vital tanto na captação

de AG como na formação da GL (Jiang et al., 1992; Westhoff et al., 2017; Cao et al., 2018).

Estruturalmente exibe vários domínios funcionais: a região N-terminal, que caracteriza a

família PAT e outros domínios que são capazes de ligar lipídios, incluindo o C-terminal (Conte

et al., 2016). É comumente expressa em numerosos tipos de tecidos, incluindo a glândula

mamária, gônadas, coração, enterócitos intestinais, macrófagos de células endoteliais, células

β pancreáticas, fígado e músculo esquelético (Phillips et al., 2005; Chong et al., 2011; Conte et

al., 2016).

Estudos recentes indicam que GL e proteínas associadas, ao qual se inclui a

adipofilina, também podem ser significativamente reguladas no nível pós-transcricional

(Eastman et al., 2009; Hall et al., 2009). A adipofilina que não se liga às GL é covalentemente

modificada com ubiquitina e direcionada para a degradação proteossômica. Por outro lado,

quando necessárias, sua expressão é regulada por receptores nucleares de hormônios da

subfamília do receptor ativado por proliferadores de peroxissomas (PPAR). A ativação

transcricional do gene por AG de cadeia longa pode fornecer um mecanismo de alimentação

direta, pelo qual o aumento de adipofilina abastece um reservatório para o sequestro de produtos

da reação de síntese de AG (Bickel et al., 2009). Ademais, por ser um gene induzido por

hipóxia, tem sido demonstrado que a regulação positiva da adipofilina pode ser ocasionada pelo

rompimento da via pVHL/HIF, que regula positivamente a expressão de HIF1-α e estimula

seletivamente a captação de AG (Yao et al., 2005; Bensaad et al., 2014).

No câncer, o aumento da lipogênese eleva os níveis de lipídios que elevam a

biogênese das GL, que se acumulam nas células malignas (Brasaemle, 2007; Straub et al., 2010;

Boussahmain et al., 2013). Numerosos estudos têm relatado o papel das GL e da adipofilina em

vários tipos de câncer, sendo a expressão de adipofilina aumentada em amostras de plasma

(Matsubara et al., 2011), urina (Morrissey et al., 2014) e tumor, a saber: linfoma de Burkitt,

câncer colorretal, adenocarcinoma de pulmão, adenocarcinomas sebáceos, melanomas,

lipossarcomas e sarcomas não lipomatosos e carcinoma renal de células claras (Matsubara et

al., 2011; Ambrosio et al., 2012; Zhang et al., 2014; Fujimoto et al., 2016; Fiorentzis et al.,

2017; Tolkach et al., 2017; Westhoff et al., 2017; Cao et al., 2018; Soares et al., 2018; Song et

al., 2019).

Além disso, altos níveis de adipofilina parecem estar correlacionados com pior

prognóstico, bem como relacionados com a tumorigênese e progressão do tumor (Lucenay et

44

al., 2016). Por outro lado, a sobreexpressão pode estar relacionada com bom prognóstico,

principalmente em estudos que utilizam amostras de carcinomas renais (Tolkach et al., 2017).

ALTERAÇÕES METABÓLICAS NO DESENVOLVIMENTO DO CXAP

Como esclarecido nas sessões anteriores, o metabolismo celular requer um conjunto

altamente ordenado de atividades nas quais sistemas cooperam para converter nutrientes em

substrato para síntese de macromoléculas, fornecimento de energia e biomassa. Nesta

perspectiva, a reprogramação metabólica pode ocorrer por um desiquilíbrio de enzimas-chaves

que regulam este processo ou pela ativação ou inibição de vias que resultam na alteração do

metabolismo celular (Pavlova e Thompson et al., 2016; Li et al., 2019).

Os tumores de glândula salivar, geralmente sólidos, à medida que se expandem,

podem suscitar uma resposta hipóxica, que leva a necrose e consequente estabilização do HIF-

1α. Diversos estudos na literatura tentaram relacionar os níveis de oxigênio no microambiente

tumoral com a patogênese das neoplasias de glândulas salivares. Nosso grupo, por exemplo,

em um trabalho de 2012, estudou por imunoistoquímica a expressão de HIF-1α em carcinoma

adenoide cístico com transformação para alto grau (Costa et al., 2012). Outros estudos, além

disso, tentaram definir o papel desta proteína para carcinoma do ducto salivar (Roh et al., 2008),

carcinoma adenoide cístico (Wang et al., 2015) e carcinoma mucoepidermoide (Branco et al.,

2019), mas nunca na transformação maligna do AP. Recentemente, o papel do gene HIF-1α foi

investigado em GSN e AP por expressão gênica (Cardoso et al., 2019).

Por outro lado, os transportadores de glicose são responsáveis pela captação de

glicose através da membrana plasmática. Nos tumores salivares, a expressão imunoistoquímica

do GLUT-1 foi avaliada por nosso grupo em AP, carcinoma adenoide cístico e carcinoma

mucoepidermoide (Demasi et al., 2010; de Souza et al., 2017). Outros poucos estudos

estudaram sua expressão em tumores de glândulas. Mori e colaboradores (2007), por RT-PCR,

avaliaram a expressão de GLUT-1 em carcinoma adenoide cístico e GSN (Mori et al., 2007) e

apenas um estudo avaliou sua expressão em CXAP (Kim et al., 2011).

Enquanto isso, a expressão aumentada de FASN está associada à manutenção e

desenvolvimento de neoplasias. No cenário das neoplasias de glândulas salivares, seu papel foi

pouco estudado, embora já tenha sido investigado por nosso grupo em AP, carcinoma

mucoepidermoide e carcinoma adenoide cístico (Ito et al., 2009; do Prado et al., 2011).

Recentemente, fomos pioneiros na avaliação da expressão da proteína FASN em AP e CXAP

(Díaz et al., 2019) e nos último dois anos, uma dissertação de mestrado em nosso departamento

45

tentou definir o papel de FASN em vários tumores malignos de glândula salivar (de Angelis,

2019).

Similarmente, estudos analisando a expressão de GL e de Adipofilina em tumores

salivares são escassos e concentram-se principalmente naqueles com diferenciação sebácea

(carcinoma epitelial-mioepitelial com diferenciação sebácea e adenocarcinomas sebáceos de

GSMA) (Shinozaki et al., 2008; Soares et al., 2018). Mais recentemente, porém, nosso grupo

avaliou a expressão de GL em vários carcinomas salivares, por meio de uma dissertação de

mestrado (dos Santos, 2014). Além disso, nossos achados quanto a expressão da adipofilina em

carcinomas secretórios de glândulas salivares (Mariano et al., 2013) e carcinoma adenoide

cístico de alto grau (dos Santos et al., 2016) já foram publicados e podem ser encontrados na

literatura.

Além disso, desde fevereiro de 2017, após aprovação do projeto “Estudo das

alterações genéticas e metabólicas do adenoma pleomorfo e carcinoma ex-adenoma pleomorfo

por Exoma, Expressão Gênica e Imunoistoquímica” na modalidade Jovens Pesquisadores em

Centros Emergentes, da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

(Processo 15/07304-0), iniciamos uma investigação pioneira no estudo da transformação

maligna do AP. Era importante avaliar metabolismo, afinal alterações metabólicas, descritas

por muito tempo como fenômenos secundários, atualmente, são reconhecidas como

fundamentais na consolidação do câncer. Entretanto, vale salientar que não pretendemos definir

o papel do metabolismo ao longo do desenvolvimento do CXAP. Ao contrário, este é um estudo

inicial embasado em resultados prévios com outros tumores de glândula e na nossa experiência

recente em numa série de melanomas mucosos (sinonasais e orais) e cutâneos avançados, bem

como lesões melanocíticas benignas orais e cutâneas (Nascimento, 2018).

Tendo em vista o exposto, esta dissertação de mestrado se propôs a verificar por

qRT-PCR a expressão de HIF-1α, GLUT-1, FASN e Adipofilina na progressão sequencial do

AP para CXAP e correlacionar os dados com a expressão de suas respectivas proteínas por

análise imunoistoquímica.

46

3 PROPOSIÇÃO

PROPOSIÇÃO GERAL

Verificar por qRT-PCR e imunoistoquímica se existem diferenças na expressão de

genes relacionados ao metabolismo tumoral lipídico e glicolítico no desenvolvimento do CXAP

e compará-las com características clínico-patológicas.

PROPOSIÇÕES ESPECÍFICAS

• Comparar a expressão gênica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre

amostras de GSN, AP e CXAP por qRT-PCR.

• Comparar a expressão destes genes com os níveis das respectivas proteínas por

análise imunoistoquímica entre amostras de GSN, AP e CXAP.

• Comparar os resultados da expressão gênica e imunoistoquímica com características

clínico-patológicas.

• Comparar os resultados da expressão gênica e imunoistoquímica de AP

convencionais e CXAP com AP residuais.

47

4 MATERIAL E MÉTODOS

DESENHO EXPERIMENTAL

Um estudo retrospectivo foi desenhado para avaliar a expressão gênica e

imunoistoquímica de genes relacionados ao metabolismo tumoral ao longo do desenvolvimento

do CXAP (Figura 5).

Figura 5 – Desenho experimental do estudo

48

Aprovação ética foi obtida pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da

Universidade Estadual de Campinas (Protocolo no.: 2.601.457), bem como CEP do A. C.

Camargo Cancer Center (Protocolo no.: 2.485.588) e Faculdade de Odontologia de Piracicaba

da Universidade Estadual de Campinas (Protocolo no.: 2.928.348) (Anexo 1). Um total de 36

amostras foram avaliadas, conforme Figura 5. Destas, 28 foram provenientes do Biobanco do

Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade

Estadual de Campinas, enquanto 8 foram provenientes do Biobanco do Departamento de

Anatomia Patológica do A. C. Camargo Cancer Center. Amostras de GSN adjacentes a

neoplasias de GP foram obtidas durante a cirurgia de pacientes provenientes do Hospital de

Clínicas da Universidade Estadual de Campinas.

Foram incluídas neste estudo amostras de GSN, AP e CXAP cujas lâminas em HE

do fragmento coletado em centro cirúrgico (congelação) representavam morfologicamente cada

grupo. As amostras coletadas como CXAP na qual a lâmina da congelação mostrava apenas

áreas de AP foram classificadas como um quarto grupo: AP residual.

ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DA AMOSTRA

Dados clínicos e epidemiológicos foram retirados dos prontuários do Serviço de

Arquivo Médico do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas. Para os casos

de AP, foram coletados os seguintes dados sempre que disponíveis: sexo, idade, cor da pele,

hábitos, localização da lesão, tempo de evolução, histórico de AP prévio, tamanho clínico do

tumor, tipo de cirurgia e situação do paciente no último registro médico. Adicionalmente, para

os casos de CXAP, foram coletados os dados referentes ao estadiamento, o local de metástase

(quando houvesse), tratamento, necessidade de esvaziamento cervical, presença de recorrência

e o tempo para recorrência.

ANÁLISE MORFOLÓGICA DA PEÇA CIRÚRGICA

Revisamos o diagnóstico histológico de todos os casos. Nos casos em que o material

não pode ser recuperado ou em que o material tenha sido entregue ao paciente, os dados

contidos no registro anatomopatológico foram analisados. Não tivemos acesso ao material

histológico de dois casos de GSN, um caso de AP e dois casos de CXAP incluídos neste estudo.

49

Uma análise cuidadosa do material histológico dos casos de CXAP disponível foi

realizada e a ficha utilizada para avaliação se encontra no Apêndice 1. Os carcinomas foram

classificados de acordo com a extensão de invasão além da cápsula do AP como: (1) carcinoma

intracapsular (contido pela cápsula); (2) minimamente invasivo (infiltração do tecido

extracapsular a uma distância ≤ 1,5mm) e francamente invasivo (infiltração >1,5 mm). Além

disso, foi avaliado o fenótipo transformado, de acordo com os critérios da última edição da

OMS (El-Naggar et al., 2017). Reações de imunoistoquímica para Receptor de Andrógeno (RA)

foram utilizadas para confirmar o diagnóstico de Carcinoma do ducto salivar. O tipo de

diferenciação celular também foi avaliado: as áreas malignas dos CXAP foram classificadas de

acordo com o tipo celular (luminal e/ou mioepitelial) proliferado. Por fim, foi observado a

presença ou ausência de margens comprometidas, linfonodos comprometidos (quando

removidos), invasão vascular, linfática e perineural, e necrose.

Um bloco de parafina de cada caso de AP, CXAP e AP residual, quando disponível,

foi selecionado no arquivo do qual os casos foram provenientes para serem submetidos a reação

imunoistoquímica.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA

Foi realizada uma macrodissecção da peça cirúrgica durante cirurgia e o fragmento

obtido foi congelado em nitrogênio líquido. Foram feitos cortes de 4μm de espessura em um

micrótomo manual com navalhas descartáveis. Os tecidos foram incluídos em Optimal Cutting

Temperature (OCT) (Tissue-Tek, EUA) e os cortes obtidos foram corados com hematoxilina e

eosina (HE) para análise e confirmação do diagnóstico de GSN, AP e/ou CXAP. Na análise,

foram observadas em uma escala visual e subjetiva, por meio do olhar de dois patologistas,

critérios que variaram de acordo com o grupo estudado. As fichas de avaliação utilizadas para

cada grupo também estão disponíveis no Apêndice 1.

O RNA total das amostras de tecidos congelados foi extraído utilizando o kit

RNeasy Mini (Qiagen, EUA) conforme as instruções do fabricante para tecidos com menos de

20mg de peso. Todo o procedimento foi realizado em ambiente estéril livre de RNAses e a

concentração do RNA total foi determinada utilizando o espectrofotômetro Nanodrop 2000c

(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) a 260nm e o grau de pureza das amostras foi

determinado pela razão entre as leituras de absorbância realizadas em 260nm e 280nm. Foram

utilizados como padrão os valores de referência entre 1.9 e 2.1 para A260/A280 e 1.8 e 2.2 para

50

A260/A230. Além disso, foi observada a qualidade do RNA total extraído em géis de agarose a

partir de 2μg de cada amostra e o resultado foi analisado por meio do programa Alliance

(UVITEC Imaging Systems, Reino Unido).

A síntese da molécula de cDNA foi realizada utilizando 50ng de Oligo d(T)20

(Invitrogen, EUA) e a enzima SuperScriptTM IV (Invitrogen, EUA), conforme especificações

do fabricante. Na primeira etapa, cada tubo de reação continha a amostra de RNA total

(1000ng/1µl), H2O RNa/DNase free (qsp 13µl), 1µl de oligo d(T)20 (50ng/µl) e 1µl de dNTP

mix (10μm cada), totalizando 15µl de volume final de reação. Os tubos foram transferidos para

o termociclador Applied Biosystems (Invitrogen, EUA) e mantidos a 65ºC por 5 minutos.

Foram adicionados 4µl de 5x SSIV Buffer, 1µl DTT (100μm), 1µl de Ribonuclease Inhibitor e

1µl da SuperScriptTM IV Reverse Transcriptase (200U/µl), totalizando 22µl de volume final

de reação. Os tubos foram novamente transferidos para o termociclador e mantidos a 50ºC por

10 minutos, seguido de outra incubação em 80ºC por 10 minutos. Por fim, foi colocado 1µl de

E. coli RNase H e o tubo foi incubado a 37ºC por 20 minutos. O cDNA sintetizado foi estocado

a -20 ºC.

Foram desenhados primers específicos para cada gene estudado a partir das

sequências das respectivas isoformas de RNA mensageiros provenientes do GenBank (NCBI -

National Center for Biotechnology Information - NIH, EUA.- http://www.ncbi.nIm.nih.gov/).

O programa Primer Express 3.0 (Thermo Fisher Scientific) foi utilizado no desenho de todos

os primers e as sequências foram escolhidas seguindo critérios especificados na literatura

(Taylor et al., 2010). Para verificação da especificidade, o par de primers foi submetido ao

Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Tabela 1).

Tabela 1 – Sequência de primers forward (F) e reverse (R) utilizados neste estudo

PRIMER TIPO SEQUÊNCIA NCBI

β-actina Forward ACCGAGCGCGGCTACAG NM_001101.3 β-actina Reverse CTTAATGTCACGCACGATTTCC

HIF-1α (variante 1) Forward TTTACCATGCCCCAGATTCAG NM_001530.3 HIF-1α (variante 1) Reverse GGTGAACTTTGTCTAGTGCTTCCA

GLUT-1 Forward TGCTCATGGGCTTCTCGAA NM_006516.2

GLUT-1 Reverse AAGCGGCCCAGGATCAG

FASN Forward CGCTCGGCATGGCTATCT NM_001122.3

FASN Reverse CTCGTTGAAGAACGCATCCA

Adipofilina Forward AAGCTAGAGCCGCAAATTGC NM_001122.3

Adipofilina Reverse CCTCAATCCTGTCTAGCCCCTTA

http://www.ncbi.nim.nih.gov/

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

51

A análise da expressão gênica foi realizada pelo método de PCR em Tempo Real

(qRT-PCR). A quantificação relativa foi realizada utilizando um StepOnePlus Real Time PCR

System (Applied Biosystems), reagentes SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

EUA) e placas de 96 wells MicroAmp® Optical (Applied Biosystems, EUA). Cada reação foi

realizada na presença de 12,5μl de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

EUA), 2µl de uma solução de Primer Mix (5nM) e 5,5μl de H2O DNase/RNase free. Além

disso, uma curva de diluição seriada (1; 0,5; 0,25; 0,125 e 0,0625ng) foi utilizada em cada

ensaio. Foram realizadas de duas a três replicatas técnicas em cada experimento, de acordo com

a quantidade de cDNA disponível. Um controle negativo (NTC) e um calibrador foram

incluídos em cada ensaio. As condições de ciclagem foram: incubação inicial a 95ºC durante

10 minutos, seguida por 40 ciclos a 95ºC durante 15 segundos e 60ºC durante 1 minuto. A

quantificação relativa foi determinada usando o valor do limiar do ciclo (CT). Foram feitas duas

normalizações: a primeira, pelo gene de referência, dividindo-se a quantidade do gene alvo pela

quantidade do gene de referência; e a segunda, pela amostra calibradora, dividindo-se a

quantidade do alvo normalizado pela quantidade de calibrador normalizado.

ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA

Reações de imunoistoquímica foram realizadas a partir de blocos de parafina

selecionados nos arquivos dos departamentos dos quais os casos foram provenientes. Quando

presentes, as amostras de GSN foram avaliadas nas mesmas lâminas em área de parênquima

glandular normal adjacente ao tumor. Cortes de 3,0μm de espessura foram realizados em tecidos

incluídos em parafina e o material colocado em lâminas tratadas com solução de organosilano

a 4% em acetona (3-aminopropil-trietoxi-silano, SIGMA código A3648). A seguir, as lâminas

foram colocadas em estufa à 70ºC por 16 horas, antes do início da reação. A desparafinação foi

feita com três banhos de xilol e hidratação em três banhos de álcool absoluto. Posteriormente,

as lâminas foram banhadas em álcool nas concentrações decrescentes de 80% e 50% e depois

lavadas em água destilada.

O bloqueio da peroxidase endógena para os anticorpos anti-HIF-1α e anti-

adipofilina foi realizado por meio de três banhos de imersão (3 minutos cada) em solução de

peróxido de hidrogênio (H2O2) a 10%, à temperatura ambiente, seguidos de lavagem e

passagem por água destilada. Para os anticorpos anti-GLUT-1, anti-FASN e anti-RA, o

52

bloqueio foi realizado por meio do sistema Envision Flex, onde a solução de H2O2 é colocada

sobre as lâminas e deixada à temperatura ambiente por 10 minutos.

A recuperação antigênica foi realizada utilizando-se panela à vapor. A solução

tampão de Citrato (pH 6,0) por 30 minutos à 95ºC foi utilizada para o anticorpo anti-HIF-1α,

enquanto para anti-GLUT-1, anti-FASN e anti-RA, foi utilizada a solução tampão do Kit

Envision Flex por 30 minutos à 95ºC. Para anti-adipofilina, não foi realizada a recuperação

antigênica.

Finalmente as lâminas foram incubadas com o anticorpo primário diluído em

albumina sérica bovina (BSA) por 30 minutos em câmara úmida à 37°C por 1 hora e overnight

à 4°C em geladeira. Anti-adipofilina é fornecido pronto para uso, portanto não precisa de

diluição. Em seguida, todas as lâminas passaram por três banhos com solução tampão fosfato-

salino (PBS), em pH de 7.4 (5 minutos cada) e foram incubadas com o anticorpo secundário

EnvisionTM Flex/HRP (com a solução de estreptavidina peroxidase, Agilent, DAKO) em estufa

à 37ºC por 1 hora. HIF-1α foi incubado com o anticorpo secundário NovoLink (Novocastra

Antibodies), da seguinte forma: incubação com NovoCastraTM Post Primary, por 30 minutos

em estufa à 37ºC por 1 hora, seguida de três lavagens em PBS (5 minutos cada) e uma nova

incubação com NovolinkTM Polymer em estufa à 37ºC por 1 hora.

Para a revelação do marcador, foi usada a substância cromógena diaminobenzidina

tetra-hidroclorídrica (DAB), por 5 minutos, à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas

com água e contra-coradas com hematoxilina de Mayer; desidratadas, clareadas, e montadas

com resina Entellan®. Os anticorpos primários, especificações e titulações empregadas

encontram-se discriminadas abaixo (Tabela 2).

A análise dos resultados da reação imunoistoquímica foi realizada considerando os

escores semiquantitativos descritos na Tabela 3. Foi considerada positiva a marcação nuclear

para o anti-HIF-1α, marcação de membrana para anti-GLUT-1, marcação citoplasmática para

anti-FASN, marcação citoplasmática vesicular (semelhante à gota) para anti-adipofilina e

marcação nuclear para anti-RA.

53

Tabela 2 – Anticorpos primários, clones, recuperação antigênica, diluição e fabricantes

Anticorpo Clone Recuperação Diluição Fabricante

anti-HIF-1α ab1606 Citrato 1:800 Abcam

anti-GLUT-1 ab652 Envision Flex 1:200 Abcam

anti-FASN HPA006461 Envision Flex 1:100 Sigma Aldrich

anti-Adipofilina AP125 S/R PPU Fitzgerald

anti-RA Ar441 Envision Flex 1:50 Cell Marque

S/R: Sem recuperação; PPU: pronto para uso

Tabela 3 – Escores semiquantitativos utilizados na análise dos resultados

Quantidade

Escore 0 Coloração ausente ou positividade <10% das células examinadas

Escore 1 Positividade menor que 50% das células examinadas (positivo focal)

Escore 2 Positividade maior ou igual a 50% das células examinadas (positivo difuso)

ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises foram realizadas usando o software GraphPad Prism (versão 8.0,

GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Os testes de Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-

Wilk foram realizados para avaliar a distribuição dos dados. Como os dados estavam

distribuídos de maneira anormal, o teste de Kruskal-Wallis foi realizado. Foi considerado

estatisticamente significativo p<0,05. Uma vez que o teste ANOVA tenha encontrado diferença

significativa em três ou mais médias, foi empregado o teste de Comparação Múltipla de Dunn’s.

54

5 RESULTADOS

ANÁLISE CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DA AMOSTRA

As características clínicas e epidemiológicas das 9 amostras de GSN, 13 amostras

de AP, 10 amostras de CXAP e 4 amostras de AP residual estão descritas nesta sessão.

Em relação as amostras de GSN, 7 (77,7%) foram provenientes de pacientes do

sexo masculino enquanto apenas 2 casos (22,3%) foram provenientes do sexo feminino. Todas

os casos envolveram a GP e a média de idade destes pacientes foi de 43,7 anos (16-58 ± 15,7).

Sete destas GSN (77,7%) estavam adjacentes a um tumor benigno de parótida enquanto 2

(22,3%) estavam adjacentes a um tumor maligno acometendo o mesmo sítio (Tabela 4). Seis

pacientes tiveram tanto a GSN quanto a contraparte neoplásica (AP ou CXAP) avaliada neste

estudo.

Quanto aos pacientes acometidos por AP houve uma leve predileção pelo sexo

feminino (7 de 13 – 53,85%) assim como nos casos de CXAP (6 de 10 – 60%). Todos os casos

de AP residual foram provenientes de pacientes do sexo feminino. Pacientes acometidos pela

neoplasia benigna estavam, em sua maioria, na quarta década de vida, com idade média de 36,4

anos (16-57 ± 14,8). Pacientes acometidos pela neoplasia maligna, por outro lado, foram

diagnosticados cerca de duas décadas de vida mais tarde, com idade média de 57,4 anos (22-83

Tabela 4 – Características clínicas e epidemiológicas de 9 pacientes cujas GSN foram avaliadas neste estudo

Características clínicas N (%)

Sexo

Masculino 7 (77,7%)

Feminino 2 (22,3%)

Idade (anos)

Média 43,7 (16-58)

Localização anatômica

Glândula salivar maior 9 (100%)

Glândula parótida direita 4 (44,5%)

Glândula parótida esquerda 5 (55,5%)

Parênquima neoplásico analisado

Sim 6 (66,7%)

Não 3 (33,3%)

N: número de casos

55

± 19,2). Os casos de AP residual avaliados foram provenientes de pacientes com idade média

de 51 anos (41-66 ± 11).

Em relação a localização anatômica, a GP foi a glândula mais acometida em AP (11

de 13 – 84,6%), CXAP (8 de 10 – 80%) e AP residual (3 de 4 – 75%). Diferentemente, GSME

foram raramente afetadas. Apenas 1 caso (7,7%) de AP atingiu as glândulas salivares do palato.

A glândula lacrimal foi o sítio atingido em apenas um caso de CXAP (1 de 10 – 10%) e um

caso de AP residual (1 de 4 – 25%). Em relação ao tempo de evolução, em média, tanto a lesão

benigna quanto a lesão maligna apresentaram os sintomas há pelo menos 3 anos no momento

do diagnóstico.

Não encontramos evidências de recorrências nos tumores benignos estudados.

Quatro casos (40%) apresentaram recorrência do tumor maligno, sendo a média para

recorrência de 3 anos e meio (6 meses – 8 anos ± 3,97). Quanto a história clínica, 40% dos

pacientes acometidos pelo CXAP (4 de 10 casos) apresentaram uma lesão benigna prévia,

embora o tempo de transformação maligna não estivesse claro nos prontuários clínicos. No

geral, os pacientes foram tratados com cirurgia e radioterapia adjuvante (7 de 10 – 70%).

Apenas um apresentou metástase em pulmão (10%). Todos os pacientes acometidos por AP e

40% dos pacientes acometidos pelo CXAP estão vivos na presente data. Os pacientes com

CXAP em que a contraparte benigna (AP residual) foi avaliada estão vivos e sem doença.

56

Tabela 5 – Características clínicas e epidemiológicas de 13 pacientes diagnosticados com AP, 10 diagnosticados

com CXAP em que apenas a área transformada foi avaliada e 4 pacientes com CXAP em que a área

benigna residual (AP residual) foi analisada neste estudo

Características clínicas AP

N (%)

CXAP

N (%)

AP residual

N (%)

Sexo

Masculino 6 (46,15%) 4 (40%) 0

Feminino 7 (53,85%) 6 (60%) 4 (100%)

Idade (anos)

Média 36,4 (16-57) 57,4 (22-83) 51 (41-66)

Localização anatômica

Glândula salivar maior 12 (92,3%) 9 (90%) 3 (75%)

Glândula salivar menor 1 (7,7%) 0 0

Glândula lacrimal 0 1 (10%) 1 (25%)

Tamanho (cm)

<2 3 (23,06%) 0 0

2<4 6 (46,14%) 4 (40%) 1 (25%)

>4 4 (30,8%) 2 (20%) 3 (75%)

Não informado 0 4 (40%) 0

Sintomas

Presente 5 (38,46%) 4 (40%) 2 (50%)

Não informado 8 (61,54%) 6 (60%) 2 (50%)

Tempo de evolução (anos)

Média 3,2 (0,5-15) 3,41 (0,41-17) 4 (0,08-15)

Histórico do tumor

Histórico de AP 0 3 (30%) 1 (25%)

Sem histórico de AP 13 (100%) 6 (60%) 3 (75%)

Não informado 0 1 (10%) 0

Fumante

Sim 5 (38,46%) 1 (10%) 1 (25%)

Não 7 (53,84%) 5 (50%) 3 (75%)

Não informado 1 (7,7%) 5 (40%) 0

Etilista

Sim 2 (15,38%) 2 (20%) 2 (50%)

Não 10 (76,9%) 4 (40%) 2 (50%)

Não informado 1 (7,7%) 4 (40%) 0

Tipo de cirurgia

Parotidectomia superficial 8 (61,5%) 3 (30%) 0

Parotidectomia total 3 (23,1%) 5 (50%) 3 (75%)

Maxilectomia parcial 1 (7,7%) 1 (10%) 0

Submandibulectomia 1 (7,7%) 1 (10%) 0

Exenteração orbitária 0 0 1 (25%)

Estado do paciente

Vivo com ou sem doença 13 (100%) 4 (40%) 4 (100%)

Morte pela doença 0 5 (50%) 0

Morte por outras causas 0 1 (10%) 0

AP: Adenoma Pleomórfico; CXAP: Carcinoma Ex-Adenoma Pleomórfico; N: número de casos

57

ANÁLISE MORFOLÓGICA DA CONGELAÇÃO E DA PEÇA CIRÚRGICA

Para análise inicial, os espécimes coletados durante cirurgia foram congelados e

cortados. Os cortes obtidos foram corados com HE com o objetivo de se confirmar o diagnóstico

de GSN, AP e/ou CXAP. A lâmina da congelação foi analisada (Figura 6) e o fragmento foi

utilizado para extração de RNA. As características histológicas encontradas após análise destes

fragmentos estão disponíveis no Apêndice 2.

Tabela 6 – Estadiamento, tratamento e recorrência de 10 pacientes diagnosticados com CXAP utilizados para

análise de expressão gênica e imunoistoquímica neste estudo

Características clínicas N (%)

Estadiamento (T)

T2 4 (40%)

T3 3 (30%)

T4 3 (30%)

Estadiamento (N)

N0 6 (60%)

N1 3 (30%)

N2 1 (10%)

Estadiamento (M)

M0 9 (90%)

M1 1 (10%)

Estádio clínico

I e II 3 (30%)

III e IV 7 (70%)

Radioterapia

Sim 7 (70%)

Não 3 (30%)

Quimioterapia

Sim 1 (10%)

Não 9 (90%)

Esvaziamento

Sim 6 (60%)

Não 4 (40%)

Recorrência

Presente

Local 2 (20%)

Distância 2 (20%)

Ausente 5 (50%)

Não informado 1 (10%)

Tempo para recorrência (anos)

Média 4,3 (intervalo 0,5-8)

N: número de casos

58

Figura 6 – Aspectos histopatológicos observados nas lâminas de congelação de alguns espécimes coletados em

centro cirúrgico e utilizados neste estudo. A, parótida normal composta por gordura e ácinos serosos.

B, parênquima neoplásico de um AP. Note matriz mixoide (*). D, proliferação de células epiteliais e

mioepiteliais de um AP distribuídos em um estroma mixoide. C, parênquima neoplásico de um CXAP

composto por células com intenso pleomorfismo celular. D, proliferação de células luminais em um

estroma mixoide e formação de estruturas ductiformes, compatível com área de AP residual. Aumento

original: A, B, C e D (x10); no detalhe de A, B, C e D (x40).

Em relação a peça cirúrgica do CXAP, áreas de AP residual foram identificadas em

7 casos (70%). Quanto a invasão capsular, 4 de nossos casos (40%) apresentaram invasão

franca a cápsula do adenoma ao passo que os outros 4 (40%) apresentaram fases precoces de

invasão, sendo classificados como minimamente invasivos. Nenhum de nossos casos foi

classificado como intracapsular. Além disso, não tivemos acesso ao material histológico de dois

casos (20%), o que impossibilitou a classificação da invasão capsular nestas amostras. Quanto

a diferenciação epitelial no fenótipo transformado, 8 casos (80%) exibiram diferenciação

luminal. Três deles (30%) foram classificados como adenocarcinoma SOE e 5 casos (50%)

como carcinoma do ducto salivar. Nenhum caso evidenciou diferenciação mioepitelial.

Margens cirúrgicas estavam comprometidas em metade dos casos (50%). Linfonodos estavam

livres de neoplasia em metade dos casos em que o esvaziamento cervical foi realizado. A

maioria dos casos não apresentou invasão angiolinfática, perineural e necrose.

59

Tabela 7 – Características microscópicas de 10 pacientes diagnosticados com CXAP neste estudo

Características microscópicas N (%)

AP residual

Presente 7 (70%)

Ausente 1 (10%)

Não pode ser avaliado 2 (20%)

Invasão capsular

Precoce

Minimamente invasivo 4 (40%)

Francamente invasiva 4 (40%)


Subtipo histológico

Luminal 8 (80%)

Adenocarcinoma SOE

Precoce 2 (20%)

Francamente invasivo 1 (10%)

Carcinoma do ducto salivar

Precoce 2 (20%)

Francamente invasivo 3 (30%)

Mioepitelial 0


Grau histológico

Baixo grau 3 (30%)

Alto grau 5 (50%)


Margens cirúrgicas

Livres 5 (50%)

Comprometidas 5 (50%)

Comprometimento de linfonodos

Presente 3 (50%)

Ausente 3 (50%)

Invasão perineural

Presente 2 (20%)

Ausente 8 (80%)

Invasão vascular

Presente 4 (40%)

Ausente 6 (60%)

Invasão linfática

Presente 2 (20%)

Ausente 8 (80%)

Necrose

Presente 4 (40%)

Ausente 6 (60%)

N: número de casos

60

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA

Todas as nossas amostras apresentaram RNA íntegro pela análise no gel de agarose

(Apêndice 3). Àquelas provindas do A. C. Camargo Cancer Center passaram por testes de

integridade na própria instituição. De acordo com a otimização da reação de qRT-PCR, o

método da curva padrão relativa foi escolhido para realização dos ensaios. β-actina apresentou

os melhores resultados dentre outros controles endógenos utilizados e, por esse motivo, foi

escolhido para ser o gene de referência. Além disso, os perfis de amplificação indicaram que a

amplificação mais eficiente ocorreu na temperatura de 60ºC.

Com isso, foram realizados 5 ensaios para os genes HIF-1α, FASN e adipofilina.

Apenas 4 ensaios foram utilizados para o gene GLUT-1. Em todos eles, a especificidade da

reação foi verificada pela execução de curvas de dissociação e eficiências maiores que 90% e

menores que 110% foram consideradas satisfatórias. Coeficiente de correlação (R2)

considerado ideal foi igual ou próximo de 1. Quanto a reprodutibilidade experimental, variações

de CT>0,5 entre as triplicatas técnicas foram excluídas. Nenhuma duplicata apresentou variação

de CT>0,5.

Quando comparamos a expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e

adipofilina entre amostras de GSN, AP e CXAP percebemos que não houve diferenças

estatisticamente significativas na expressão de HIF-1α entre os tecidos analisados (Gráfico

1A). A expressão de GLUT-1 foi significativamente maior nos tecidos tumorais do que em

GSN (Gráfico 1B). Houve uma tendência de que a expressão gênica de FASN fosse maior nos

tecidos tumorais do que em GSN, embora sem diferença estatística (Gráfico 1C). A expressão

de adipofilina, diferentemente dos outros genes, foi significativamente menor nos tecidos

tumorais do que em GSN (Gráfico 1D).

Além disso, algumas de nossas amostras se diferenciaram de todas as outras e foram

colocadas nos gráficos como pontos acima da barra de desvio de erro (outliers). Fizemos uma

análise cuidadosa destas amostras na tentativa de encontrar possíveis justificativas (Apêndice 4).

Como visto, características histológicas dos fragmentos utilizados para extração do RNA podem

ser encontradas no Apêndice 2.

61

Gráfico 1 – Análise de qRT-PCR para comparação da expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e

adipofilina entre amostras de GSN, AP e CXAP. Em A, não foi observada diferença estatística na

expressão de HIF-1α entre os tecidos analisados. Em B, expressão de GLUT-1 foi significativamente

maior nos tecidos tumorais do que em GSN. Em C, houve uma tendência de que a expressão de

FASN fosse maior nos tecidos tumorais do que nos tecidos normais estudados, embora sem diferença

estatística. Em D, a expressão de adipofilina nos tecidos tumorais foi menor nos tecidos tumorais do

que em GSN. **p<0,01; teste Kruskal-Wallis com comparação múltipla de Dunn’s. Pontos acima da

barra de erros representam outliers.

62

Além disso, verificamos a expressão destes genes em GSN de seis pacientes em que

a contraparte neoplásica (AP ou CXAP) também foi avaliada. Quando comparamos a expressão

relativa dos genes entre GSN e o tecido tumoral, percebemos que não houve diferenças

estatisticamente significativas na expressão de HIF-1α entre os grupos (Gráfico 2 A). Por outro

lado, a expressão de GLUT-1 foi significantemente maior no tecido tumoral do que em GSN

(Gráfico 2 B). FASN tendeu a ser mais expressa no tecido tumoral enquanto a adipofilina foi

significantemente maior em GSN (Gráfico 2 C e D).


adipofilina entre GSN e tecido tumoral (TT) provenientes dos mesmos pacientes (n=6). Em A, não

se observou diferença estatística na expressão de HIF-1α entre GSN e tecido tumoral. Em B,

expressão de GLUT-1 foi significativamente maior nos tecidos tumorais do que em GSN. Em C, não

se observou diferença estatística na expressão de FASN entre GSN e tecido tumoral. Em D, expressão

de adipofilina foi significativamente maior nas GSN do que no tecido tumoral. *p<0,05; **p<0,01;

teste Mann-Whitney. Pontos acima da barra de erros representam outliers.

63

Quando comparamos a expressão relativa dos genes HIF-1α, GLUT-1, FASN e

adipofilina entre as 4 amostras de AP residual, as 13 amostras de AP e as 10 amostras de CXAP,

percebemos que não houve diferenças estatisticamente significativas na expressão destes genes

entre os três grupos (Gráfico 3).


adipofilina entre 4 amostras de AP residual (APr), 13 amostras de AP e 10 amostras de CXAP. Em

A, B, C e D não foram observadas diferenças estaticamente significativas na expressão destes genes

entre os três grupos. Teste Kruskal-Wallis.

ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA

Investigamos por imunoistoquímica a expressão das proteínas HIF-1α, GLUT-1,

FASN e adipofilina. Sete amostras de GSN, 12 amostras de AP e 8 amostras de CXAP foram

submetidas a reação conforme descrito em Material e Métodos. Em relação a GSN, a maioria

dos casos não apresentou expressão para as proteínas GLUT-1 e adipofilina, enquanto apenas

1 caso apresentou expressão para as proteínas HIF-1α e FASN (14,3%) (Figura 7). Em relação

64

ao AP, apenas 1 caso (8,3%) expressou a proteína HIF-1α, 10 casos (83,3%) a proteína FASN

e 2 casos (16,7%) a proteína adipofilina. Nenhum caso expressou a proteína GLUT-1 (Figura

8). Nos casos de CXAP, a proteína GLUT-1 foi expressa em 6 casos (75%), enquanto a proteína

FASN foi expressa em 7 dos casos (87,5%). Adipofilina, por outro lado, foi expressa em metade

dos casos enquanto a proteína HIF-1α foi expressa em um caso (12,5%) (Figura 9). É

importante salientar que todos os casos positivos para HIF-1α apresentaram apenas escore 1. O

escore 2 aumentou em proporção para as proteínas GLUT-1, FASN e adipofilina à medida que

havia progressão da doença (Gráfico 4 A, B, C e D).

Gráfico 4 – Expressão das proteínas HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre amostras de GSN, AP e CXAP

por escores de quantidade. Em A, não se observam diferenças entre a expressão de HIF-1α nos

tecidos estudados. Em B, aumento da expressão de GLUT-1 apenas no CXAP. Em C e D foi

observado aumento na expressão de FASN e Adipofilina na sequência GSN-tecido tumoral.

Em relação a expressão imunoistoquímica do AP residual, a proteínas HIF-1α e

FASN foram expressas em 3 dos casos (75%). A proteína GLUT-1 foi expressa em apenas 1

caso (25%) enquanto adipofilina foi expressa em todos os casos. Não notamos diferenças entre

os resultados encontrados para as amostras de AP residual e as amostras de AP convencional e

CXAP estudadas, embora mais casos de AP residual tenham expressado as proteínas HIF-1α e

GLUT-1 (Gráfico 5) (Figura 10).

65

Gráfico 5 – Expressão das proteínas HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre 4 amostras de AP residual (APr),

13 amostras de AP convencional e 10 amostras de CXAP, por escores de quantidade. Em A, presença

de mais casos que expressam HIF-1α em APr do que AP convencional e CXAP. Em B, presença de

expressão de GLUT-1 no APr. Em C, semelhança na expressão de APr e as amostras de AP

convencional e CXAP. Em D, positividade de todos os casos de APr para a proteína adipofilina.

66

Figura 7 – Aspectos histológicos e imunoistoquímicos observados na GSN (cabeça de seta) adjacente a um AP

(A). Em B, fragmento de parótida normal, rico em ácinos serosos, tecido adiposo, ductos e vasos

hiperemiados. C, ausência da expressão da proteína HIF-1α na GSN analisada. D, ausência da expressão

da proteína GLUT-1 na GSN analisada. E, ausência de expressão da proteína FASN no citoplasma das

células da GSN analisada. F, ausência de expressão da proteína adipofilina nos ácinos da GSN

analisada. Aumento original: B (x40); C, D, E e F (x100).

67

Figura 8 – Aspectos histopatológicos e imunoistoquímicos observados no AP. A, fragmento de tecido mole

constituído por neoplasia bem encapsulada. Note área hipercelulares entremeadas em áreas

hipocelulares que correspondem a matriz produzida pelo tumor. B, proliferação de células epiteliais

em um estroma mixoide. Note formação importante de estruturas ductiformes. C, ausência da

expressão da proteína HIF-1α em células mioepiteliais. D, ausência da expressão da proteína GLUT-

1 na membrana celular das células luminais e mioepiteliais. E, expressão da proteína FASN nas células

luminais que revestem as estruturas ductiformes. F, expressão da proteína adipofilina nas células que

compõem o AP. Notar marcação dita “em gotas” no citoplasma das células. Aumento original: B, C,

D e F (x40); E (x100); no detalhe de C, D e F (x100).

68

Figura 9 – Aspectos histopatológicos e imunoistoquímicos encontrados no CXAP. A, Carcinoma do ducto salivar

em fase precoce de invasão a cápsula do adenoma. B, cordões de células luminais com alto

pleomorfismo celular, apresentando núcleos proeminentes e citoplasma eosinofílico. C, ausência de

expressão da proteína HIF-1α no núcleo das células, embora o citoplasma apresente marcação de fundo

inespecífica. D, expressão da proteína GLUT-1 na membrana de células luminais em carcinoma

intraductal. E, expressão da proteína FASN nas células luminais que revestem as estruturas ductiformes.

Notar ausência de expressão das células mioepiteliais (cabeça de seta). F, expressão da proteína

adipofilina nas células luminais em proliferação. Notar marcação dita “em gotas” no citoplasma das

células. Aumento original: B (x10); C e E (x100); D e F (x40); no detalhe de B (x40) e D (x100).

69

Figura 10 – Aspectos histopatológicos e imunoistoquímicos observados em área de AP residual (cabeça de seta)

utilizado neste estudo. A, fragmento de tecido mole evidenciando áreas de transformação

carcinomatosa e AP residual (8). B, proliferação de células epiteliais benignas em um estroma mixoide.

Note formação importante de estruturas ductiformes. C, expressão da proteína HIF-1α em raras células

benignas. D, ausência de expressão de GLUT-1 em células benignas. E, forte expressão da proteína

FASN restrita as células luminais benignas. F, expressão de adipofilina nas células mioepiteliais que

compõem o remanescente benigno que compõe a neoplasia. Notar marcação dita “em gotas” no

citoplasma das células. Aumento original: B, C e F (x20); D (x10); E (x40); no detalhe de C, D, E, F

(x100).

70

CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA

Quando comparamos a expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1,

FASN e adipofilina entre as amostras de GSN, AP e CXAP observamos que não houve

diferença entre a expressão gênica de HIF-1α e de sua respectiva proteína (Gráfico 6A). Por

outro lado, quando comparamos a expressão gênica e imunoistoquímica de GLUT-1 notamos

que em ambos os casos houve aumento de sua expressão nos tecidos tumorais quando

comparado com os normais, embora haja uma perda da expressão da proteína GLUT-1 no AP

(Gráfico 6B).

Para FASN, embora haja uma tendência de que sua expressão gênica aumente à

medida da carcinogênese do AP, os resultados não são significativos. A expressão da sua

respectiva proteína, por outro lado, aumenta em quantidade nos tecidos tumorais

(principalmente no CXAP) (Gráfico 6C). Ao contrário, a expressão gênica de adipofilina

diminui nos tecidos tumorais quando comparada com os tecidos normais, diferentemente dos

níveis de sua respectiva proteína, que aumentam nos tecidos tumorais (Gráfico 6D).

É importante salientar que diferenças estaticamente significantes não foram

encontradas na expressão gênica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre o AP e o

CXAP. Por outro lado, estas diferenças se tornam mais evidentes quando analisamos os

resultados da imunoistoquímica, principalmente para as proteínas GLUT-1 e FASN.

Além disso, quando comparamos a expressão gênica e imunoistoquímica do HIF-

1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre as 4 amostras de AP residual, as 13 amostras de AP

convencional e as 10 amostras de CXAP percebemos que não foram observadas diferenças na

expressão destes genes entre os três grupos, embora os padrões de expressão entre os grupos

estudados para FASN sejam semelhantes (Gráfico 7).

71

Gráfico 6 – Comparação entre a expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina

entre amostras de GSN, AP e CXAP. Em A, não foram observadas diferenças entre a expressão

gênica e imunoistoquímica de HIF-1α nos tecidos analisados. Em B, expressão gênica de GLUT-1

aumenta ao longo do desenvolvimento do CXAP e a expressão imunoistoquímica aumenta apenas

no CXAP. Em C, houve uma tendência de que a expressão gênica de FASN fosse maior nos tecidos

tumorais do que nos tecidos normais estudados como também pode ser observado na expressão

imunoistoquímica. Em D, a expressão gênica de adipofilina foi menor nos tecidos tumorais do que

nas GSN enquanto a expressão da proteína foi maior nos tecidos tumorais do que nas GSN. **p<0,01;

teste Kruskal-Wallis com comparação múltipla de Dunn’s. Pontos acima da barra de erros

representam outliers.

72

Gráfico 7 – Comparação entre a expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina

entre 4 amostras de AP residual (APr), 13 amostras de AP convencional e 10 amostras de CXAP.

Em A, B, C e D não foram observadas diferenças estaticamente significativas na expressão destes

genes entre os três grupos, bem como na expressão de suas respectivas proteínas. Em C, semelhança

na expressão gênica e imunoistoquímica do APr e das amostras de AP convencional e CXAP. Teste

Kruskal-Wallis.

73

6 DISCUSSÃO

O presente estudo avaliou a expressão de genes relacionados com o metabolismo

tumoral no desenvolvimento do CXAP. Nas últimas décadas, vários estudos genéticos e

imunoistoquímicos tentaram elucidar a patogênese do CXAP, todavia investigações acerca das

alterações metabólicas são preliminares em vários tumores de glândula e ao que diz respeito a

transformação maligna do AP, as conclusões são insuficientes (Shinozaki et al., 2008; Roh et

al., 2008; Demasi et al., 2010; Ito et al., 2009; do Prado et al., 2011; Kim et al., 2011; Mariano

et al., 2013; Urano et al., 2015; Wang et al., 2015; dos Santos et al., 2016; de Souza et al., 2017;

Soares et al., 2018; Branco et al., 2019; Cardoso et al., 2019; Díaz et al., 2019). Além disso, no

melhor de nosso entendimento, somos os primeiros a investigar genes associados ao

metabolismo tumoral por qRT-PCR no contexto da progressão do AP para CXAP.

Ineditamente, utilizando tecidos congelados provenientes de pacientes acometidos

por estes tumores, observamos a expressão de genes relacionados com o Efeito de Warburg e,

consequentemente, com o metabolismo tumoral (HIF1-α, GLUT-1, FASN e adipofilina) em

GSN, AP, CXAP e AP residuais. Além disso, fizemos uma análise dos aspectos morfológicos

e imunoistoquímicos relacionados com estas amostras e correlacionamos estes dados na

tentativa de explicar possíveis expressões alteradas destes genes. Não pretendemos definir o

papel do metabolismo nestes tumores. Ao contrário, este é um estudo inicial embasado em

resultados prévios com outros tumores de glândula e na nossa experiência recente em numa

série de melanomas mucosos (sinonasais e orais) e cutâneos avançados, bem como lesões

melanocíticas benignas orais e cutâneas (Nascimento, 2018).

Nossos resultados sugerem que ao longo do desenvolvimento do CXAP haja

mudança na expressão de alguns destes genes, embora seja prudente reconhecer limitações ao

longo deste caminho, ao qual se incluem o pequeno tamanho da amostra e, em particular, que

uma microdissecção prévia a expressão gênica poderia nos trazer resultados mais fiéis quanto

a expressão destes genes no tecido tumoral. Além disso, os dados obtidos após análise

semiquantitativa da expressão imunoistoquímica são categóricos, o que torna o cruzamento de

nossos achados com a expressão gênica limitado. De todo modo, o fato de estarmos analisando

amostras raras, extremamente heterogêneas, que naturalmente exibem diferentes

comportamentos epidemiológicos, clínicos e microscópicos, bem como genes complexos do

ponto de vista molecular, tornam todas estas limitações variáveis interessantes para análise. O

número amostral, especialmente pela raridade do CXAP e tendo em vista a dificuldade de se

74

conseguir tecidos congelados destes tumores, não compromete nossos resultados e nos parece

satisfatório.

Em relação ao perfil clínico-epidemiológico de nossos pacientes, na série atual,

avaliamos na maioria dos casos, amostras provenientes de mulheres adultas em estádios

avançados de progressão da doença, cuja microscopia evidenciava franca invasão à cápsula do

adenoma e alto grau de pleomorfismo celular. AP acometeram pacientes duas décadas mais

cedo do que sua contraparte maligna. Nenhum caso de CXAP com origem na célula mioepitelial

e nenhum caso de carcinoma restrito a cápsula do AP (carcinoma intracapsular) foi estudado.

Mesmo que com pontuais diferenças, certamente pelo pequeno número de amostras incluídas

neste estudo, nossos dados corroboram com as principais séries disponíveis na literatura

(Eveson e Cawson, 1985; Lewis et al., 2001; Stodulski et al., 2007; Matsubayashi e Yoshihara,

2007; Mariano et al., 2013; Lim et al., 2015; Hu et al., 2016; Ye et al., 2016; Suzuki et al., 2016;

Lopes et al., 2017; Sedassari et al., 2017; Espinosa et al., 2018).

As células tumorais quando em hipóxia, conseguem se adaptar em um ambiente

com baixos níveis de oxigênio ativando vias de sobrevivência. A via mais reconhecida adotada

pelas células hipóxicas é a ativação do fator de transcrição induzido por hipóxia 1 alfa (HIF-

1α) (Wang e Semenza, 1993; Hsu e Sabatini, 2008; Masoud e Li, 2015; Schito e Semenza,

2016; Huang et al., 2018). Níveis aumentados da proteína HIF-1α já foram encontrados em

neoplasias de nasofaringe, laringe, esôfago, trato gastrointestinal, fígado, pulmão, rim, bexiga,

mama, ovário, cérvix, cólon, endométrio, próstata, cólon e reto, pele (melanoma) e

oligodendroglioma (Jiang et al., 2001; Haugland et al., 2002; Takahashi et al., 2003; Yasuda et

al., 2004; Jokilehto et al., 2006; Klatte et al., 2007; Horree et al., 2008; Simiantonaki et al.,

2008; Chen et al., 2009; Jo et al., 2010; Wu et al., 2010; Zhou et al., 2010; Abraham et al., 2012;

Malfettone et al., 2012; Xu et al., 2013; Huang et al., 2014; Slominski et al., 2014; Maroni et

al., 2015; Zapatero et al., 2015; Aquino-Galvez et al., 2016; Zhang e Wang, 2016; Zhou et al.,

2017; Huang et al., 2018; Peng et al., 2018; Xie et al., 2018), no entanto, em tumores de glândula

salivar, os estudos são escassos.

Hara e colaboradores (2006), em um estudo in vitro utilizando linhagens celulares

de carcinomas de glândulas salivares demonstraram que quando as células eram cultivadas em

condições hipóxicas, a expressão de HIF-1α aumentava nestas linhagens (Hara et al., 2006).

Além disso, nosso grupo, em um trabalho de 2012, estudou por imunoistoquímica carcinoma

adenoide cístico com transformação para alto grau e descobriu que 100% dos carcinomas

adenoides císticos transformados expressavam a proteína HIF‐1α (Costa et al., 2012). De modo

similar, Wang e colaboradores (2015), também por imunoistoquímica, estudaram a expressão

75

de HIF-1α em carcinomas adenoides císticos, GSN e AP. Seus resultados demonstraram que a

expressão de HIF-1α estava significativamente aumentada no carcinoma adenoide cístico em

comparação com os outros dois grupos (Wang et al., 2015). Branco e colaboradores, mais

recentemente, estudando carcinoma mucoepidermoide observaram que a expressão de HIF-1α

estava aumentada nestes tumores (Branco et al., 2019).

Para verificar nossa hipótese de que a expressão de HIF-1α aumentaria ao longo do

desenvolvimento do CXAP, conforme para outros tumores de glândula salivar, avaliamos o

comportamento de sua expressão em GSN, AP e CXAP. Os resultados da expressão gênica e

imunoistoquímica não mostraram diferença significativa na expressão de HIF-1α entre os

diferentes tecidos estudados. Esta discrepância entre nossos resultados e àqueles da literatura

citados, pode ser explicada por uma limitação de nosso estudo. Como trabalhamos com

amostras coletadas ao longo do tempo e mantidas no Biobanco de duas instituições com

protocolos de coleta diferentes, não somos capazes de confirmar se o fragmento do tecido

tumoral de AP e CXAP foi coletado da região periférica do tumor (onde a resposta hipóxica

tenderia a ser menor) ou do interior (onde a proliferação celular seria mais intensa e a resposta

hipóxica maior). Reflexo disso é que a única amostra com nível de expressão discrepante das

demais e consequente maior expressão de HIF-1α, foi proveniente do único caso de CXAP que

apresentava necrose tecidual (comedonecrose) no fragmento de tecido utilizado para extração

de RNA. Além disso, o gene HIF-1α apresenta uma regulação complexa, que não depende

apenas da presença de oxigênio, mas sim de fatores de crescimento, citocinas e outras moléculas

de sinalização que tendem a acumular a proteína HIF-1α nas células (Barron et al., 2016; Zhang

et al., 2018).

Muito embora estudos prévios sustentem a ideia de um aumento na expressão de

HIF-1α em tumores malignos, nossos resultados são amparados por outros estudos na literatura

que também investigaram o papel do HIF1-α em tumores de glândula salivar. Recentemente,

utilizando as mesmas técnicas deste trabalho, um grupo brasileiro analisou a expressão gênica

de HIF-1α em 16 GSN obtidas a partir de excisões de mucocele, 22 tumores benignos (todos

AP) e 24 tumores malignos de glândula salivar, em que nenhum foi CXAP. Seus resultados,

em um grupo maior de amostras, mostraram que não existem alterações significativas na

expressão de HIF-1α nos diferentes tecidos estudados (Cardoso et al., 2019). Além disso,

Wijffels e colaboradores (2009), por imunoistoquímica, concluíram que, na maioria dos casos,

os tumores de glândula salivar não são hipóxicos e atribuíram seus achados ao fato de que

tumores salivares (seja de baixo ou alto grau) possuem crescimento lento, podendo a

angiogênese acompanhar a expansão do tumor (Wijffels et al., 2008; Wijffels et al., 2009).

76

Neste cenário, a mudança da fosforilação oxidativa para glicólise anaeróbica em

células tumorais hipóxicas é acompanhada pela necessidade aumentada de glicose e

consequentemente pelo aumento em seu transporte, que é mediado por GLUT-1 (Koppenol e

Dang, 2011; Burns e Manda, 2017). Ao passar do tempo, o aumento da expressão destas

proteínas foi observado em tecidos tumorais de diversos tipos de cânceres, que incluem cutâneo,

oral, hipofaríngeo, laríngeo, gástrico, esofágico, hepático, pancreático, colorretal, de vesícula

biliar, adrenocortical, renal, pulmonar, mamário, ovariano, cervical, prostático e neuroblástico

(Kawamura et al., 2001; Mineta et al., 2002; Macheda et al., 2005; Godoy et al., 2006; Mori et

al., 2007; Fenske et al., 2009; Legan et al., 2009; Ganapathy et al., 2009; Knapp et al., 2012;

Ramani et al., 2013; Gonzalez-Menendez et al., 2014; Grimm et al., 2014; Starska et al., 2015;

Barron et al., 2016; Martel et al., 2016; Oh et al., 2017; Wang et al., 2017; Deng et al., 2018;

Gonzalez-Menendez et al., 2018; ; Xiao et al., 2018; Zhang et al., 2019) e em relação aos

tumores de glândula salivar, poucos estão disponíveis.

Demasi e colaboradores (2010) investigaram por imunoistoquímica a expressão de

GLUT-1 em carcinoma mucoepidermoide e mostraram que sua expressão aumentava

significativamente à medida que os tumores se tornavam mais agressivos (Demasi et al., 2010).

Por outro lado, mais recentemente, de Souza e colaboradores (2017) investigaram também por

imunoistoquímica a expressão de GLUT-1 em AP, carcinoma adenoide cístico e carcinoma

mucoepidermoide e observaram diferenças na expressão de GLUT-1 entre os tumores

estudados, sendo significativamente maior em carcinoma mucoepidermoide do que em AP e

carcinoma adenoide cístico. Mori e colaboradores (2007), por RT-PCR, detectaram maior

expressão de GLUT-1 em carcinoma adenoide cístico do que em GSN (Mori et al., 2007).

Apenas um estudo investigou o papel do GLUT-1 no CXAP. Kim e colaboradores (2011)

mostraram que a proteína GLUT-1 estava expressa em dezessete CXAP, sendo sua que

expressão era maior nas áreas transformadas do que nas benignas residuais (Kim et al., 2011).

Para verificar nossa hipótese de que a expressão de GLUT-1, como imaginávamos

para o HIF-1α, aumentaria ao longo do desenvolvimento do CXAP, avaliamos o

comportamento de sua expressão nas mesmas amostras. Os resultados da expressão gênica

mostraram aumento significativo na expressão de GLUT-1 nos tecidos tumorais (AP e CXAP)

quando comparada com GSN, embora diferença estatística não tenha sido encontrada entre

ambas as neoplasias. Ademais, quando comparamos GSN e tecido tumoral dos mesmos

pacientes, o padrão de expressão aumentou significativamente no tecido tumoral. Enquanto

isso, a expressão da proteína aumentou apenas no CXPA. Nossos resultados sugerem que o

aumento na expressão gênica de GLUT-1 não esteja necessariamente associado com à

77

transformação maligna do AP, mas com a necessidade da célula (ainda que benigna) de adquirir

mais glicose para sobreviver sob todas as condições impostas pelo microambiente tumoral,

reforçando o papel da presença de controles regulatórios pós-transcricionais que atuam na

expressão da proteína GLUT-1 no AP. No entanto, antes que novas conclusões possam ser

tiradas, uma série maior precisará ser analisada.

Por outro lado, o aumento da lipogênese, marca do metabolismo reprogramado no

câncer, é refletida pela maior atividade e expressão de várias enzimas lipogênicas, entre elas a

FASN (como revisado em Lu et al., 2018 e Zadra et al., 2019). A expressão de FASN está

aumentada em uma variedade de neoplasias malignas, tais como de cérebro, boca, esôfago,

tireoide, estômago, pâncreas, pulmão, rim, cólon e reto, bexiga, mama, endométrio, ovário,

próstata, sarcomas de tecido mole, mieloma múltiplo e linfoma não-Hodgkin (Kuhajda et al.,

2000; Wang et al., 2001; Agostini et al., 2004; Tsuji et al., 2004; Rossi et al., 2006; Alo et al.,

2007; Horiuchi et al., 2008; Walter et al., 2009; Uddin et al., 2010; Liu e Brown, 2011; De

Andrade et al., 2011; Notarnicola et al., 2011; Ito et al., 2014; Rossato et al., 2014; Bauerschlag

et al., 2015; Massari et al., 2016; Zhou et al., 2017; Zadra et al., 2019) e ao que diz respeito aos

tumores de glândula salivar, as investigações se restringem a pouquíssimos estudos.

No passado, nosso grupo investigou sua expressão em AP, carcinoma adenoide

cístico e carcinoma mucoepidermoide. Os resultados da imunoistoquímica mostraram que

FASN foi mais comumente encontrada em AP e carcinoma mucoepidermoide, sugerindo que

estas proteínas pareciam ser importantes na tumorigênese dos tumores da glândula salivar (Ito

et al., 2009). Mais recentemente, voltamos a investigar o papel da FASN nestes tecidos e fomos

pioneiros ao analisar sua expressão no CXAP. Nossos resultados mostraram alta expressão de

FASN nas áreas transformadas do CXAP (Díaz et al., 2019). Alguns anos antes, porém, do

Prado e colaboradores (2011) já haviam analisado amostras de neoplasias de glândula salivar

benignas (que incluíram AP) e malignas (que inclui um caso de CXAP). Alta expressão de

FASN foi encontrada no AP, enquanto uma expressão variável foi encontrada para os tumores

malignos (do Prado et al., 2011).

Para verificar nossa hipótese de que a expressão de FASN também aumentaria no

desenvolvimento do CXAP, avaliamos o comportamento de sua expressão em GSN, AP e

CXAP. Os resultados da expressão gênica não mostraram diferença significativa na expressão

de FASN entre os diferentes tecidos estudados, embora um aumento progressivo do número de

casos que expressam a proteína ao longo da carcinogênese do AP tenha sido observado.

Interessantemente, a expressão da proteína era maior (escore 2) na neoplasia maligna do que na

neoplasia benigna. Esta discrepância entre os resultados da expressão gênica e

78

imunoistoquímica é esperada e ressalta os inúmeros controles regulatórios que atuam sobre a

expressão do gene FASN (Kuhajda, 2006; Menendez e Lupu, 2007; Mashima, Seimiya e

Tsuruo, 2009; Flavin et al., 2010).

Mesmo que a expressão gênica não nos forneça resultados estatisticamente

significantes entre os grupos, nossos resultados mostraram que FASN parece ser, dentre todos

os genes estudados neste trabalho, àquele que melhor denota a heterogeneidade entre nossas

amostras. Sua expressão, tanto em AP quanto em CXAP foi variável, com muitas amostras

apresentando níveis de expressão relativamente altos e discrepantes das demais. Após

analisarmos cuidadosamente características epidemiológicas, clínicas, além dos níveis de

expressão da proteína nestes casos, percebemos que FASN pode ser mais expressa em amostras

que apresentam maiores concentrações de células luminais (Apêndice 4) e fenótipos

transformados de alto grau, como os carcinomas do ducto salivar francamente invasivos e com

arquitetura morfológica em estágio avançado de diferenciação.

A maioria destes achados vão de encontro aos achados de Díaz e colaboradores

(2019) que mostraram que a expressão da proteína FASN estava limitada principalmente às

células luminais (Díaz et al., 2019). Do mesmo modo, durante o desenvolvimento de uma

dissertação de mestrado de nosso grupo – ainda em elaboração, foi avaliada a expressão da

proteína FASN em outros carcinomas de glândula salivar (carcinoma do ducto salivar,

carcinoma secretório, carcinoma de células acinares, carcinoma mucoepidermoide de alto grau

e carcinoma adenoide cístico de alto grau). Os resultados mostraram que a expressão de FASN

nestes tumores está relacionada com o grau de malignidade, sendo maior nos tumores de alto

grau e nos carcinomas do ducto salivar (de Angelis, 2019). Certamente, estes resultados

refletem o alto índice proliferativo destes tumores, uma vez que FASN está associada a

proliferação celular, conforme descrito para o carcinoma de células escamosas oral (Agostini

et al., 2004). Entretanto, estudos mais específicos observando a expressão gênica e

imunoistoquímica de FASN em cada tipo celular são necessários para confirmar nossos

achados.

GL são estruturas responsáveis pelo armazenamento de gordura rica em energia,

sendo essenciais no câncer para o crescimento e sobrevivência celular. A expressão aumentada

de adipofilina, constitutivamente relacionada com a GL e com a captação de AG, já foi relatada

em vários tumores nos últimos anos, como linfoma de Burkitt, câncer colorretal,

adenocarcinoma de pulmão, melanomas, lipossarcomas e sarcomas não lipomatosos e

carcinoma renal de células claras (Matsubara et al., 2011; Ambrosio et al., 2012; Zhang et al.,

79

2014; Fujimoto et al., 2016; Fiorentzis et al., 2017; Tolkach et al., 2017; Westhoff et al., 2017;

Cao et al., 2018; Song et al., 2019).

Estudos analisando a expressão de adipofilina em tumores salivares são escassos e

estão concentrados principalmente naqueles com diferenciação sebácea (carcinoma epitelial

mioepitelial com diferenciação sebácea e adenocarcinomas sebáceos de GSMA) e com

diferenciação secretória (carcinomas secretórios de glândula salivar) (Shinozaki et al., 2008;

Mariano et al., 2013; Urano et al., 2015; Soares et al., 2018). Todavia, alguns anos atrás,

investigamos as GL em carcinomas adenoides císticos convencionais e naqueles com

transformação para alto grau. Nossos resultados mostraram que a expressão de adipofilina foi

muito maior nas áreas transformadas e que isso possivelmente refletiria o aumento da

proliferação celular intensa nestas áreas (dos Santos et al., 2016). Sugerimos ainda, que nestes

casos, as GL seriam rapidamente liberadas para suportar a divisão celular das células

neoplásicas, conforme já descrito para alguns carcinomas mamários e hepáticos (Straub et al.,

2010).

Embora a expressão de adipofilina fosse maior nos tecidos tumorais do que nos

normais em todos os estudos aqui discutidos, sua sobreexpressão parece refletir em

consequências clínicas diferentes, de acordo com a origem do tumor. Em amostras de câncer

de mama e adenocarcinoma de pulmão, por exemplo, a superexpressão de adipofilina se

correlacionou com um prognóstico marcadamente pior (Fujimoto et al., 2016; Lucenay et al.,

2016). Diferentemente, para o carcinoma de células renais, ao longo dos anos, estudos relatam

que altos níveis da expressão de adipofilina estão associados com um bom prognóstico (Yao et

al., 2005; Yao et al., 2007; Tolkach et al., 2017; Cao et al., 2018).

De todo modo, até onde sabemos, somos os primeiros a investigar por expressão

gênica e imunoistoquímica o papel da adipofilina no desenvolvimento do CXAP. Para isso, na

tentativa de verificar nossa hipótese de que a expressão de adipofilina aumentaria ao longo da

carcinogênese do AP, avaliamos o comportamento de sua expressão em GSN, AP e CXAP.

Nossos resultados, surpreendentemente, mostraram o oposto: a expressão gênica de adipofilina

diminui significativamente nos tecidos tumorais estudados quando comparados com a GSN.

Straub e colaboradores (2010) avaliaram em um elegante estudo, a ocorrência de

GL e sua correlação com as proteínas da família PAT, em uma grande variedade de carcinomas

humanos. Eles perceberam que durante a hepatocarcinogênese, a expressão de adipofilina

aumentava e estava correlacionada com a proliferação celular, enquanto a expressão de

perilipina foi bastante reduzida ao longo do processo. Eles sugeriram que a perilipina estava

principalmente relacionada com o armazenamento a longo prazo de GL, enquanto a adipofilina,

80

que reveste as GL menores, tornaria as GL mais susceptíveis à rápida liberação. Neste contexto,

as células tumorais, que se dividem rapidamente, requereriam mais GL relacionadas à

adipofilina do que à perilipina (Straub et al., 2010).

Aqui, diferentemente, avaliamos a carcinogênese do AP e observamos que a

expressão de adipofilina diminuiu ao longo deste processo, sugerindo que sua expressão não

esteja relacionada com o desenvolvimento da neoplasia (como para tumores hepatocelulares) e

sim com à expressão de perilipina. Porém, estudos avaliando a expressão de perilipina nestes

tumores, bem como em um número maior amostras, são necessários para confirmar esta

hipótese.

Além disso, nossos resultados talvez reflitam a biologia tumoral inerente aos

tumores de glândula salivar, que possuem crescimento lento (Wijffels et al., 2008; Wijffels et

al., 2009). Com isso, as células tumorais do AP e do CXAP não demandariam tantas GL quanto

as neoplasias de crescimento mais rápido. Em nossa série, a título de exemplo, para todos os

tumores, o tempo de evolução foi maior do que 3 anos. De outra maneira, estes dados sugerem

que como visto para os carcinomas de células renais, a alta expressão de adipofilina nos CXAP

pode estar associada com bom prognóstico. O fato de que nossos CXAP, embora de crescimento

lento, tenham apresentado curso clínico agressivo e mau prognóstico (50% de nossos pacientes

morreram em decorrência da doença) corrobora com a expressão reduzida de adipofilina em

nossos tumores. No entanto, esta hipótese vai contra outro resultado interessante de nosso

estudo. A única amostra de CXAP cuja expressão relativa foi discrepante das demais era

proveniente do único paciente em estádio IVc, que conhecidamente possui pior prognóstico.

Além disso, esta amostra era a única que possuía necrose tumoral no fragmento utilizado para

extração de RNA. Diante disso, pensamos que o aumento na expressão de adipofilina pode não

estar necessariamente relacionado à agressividade tumoral, mas sim à regulação de adipofilina

sob condições hipóxicas.

Zoula e colabadores (2003) demonstraram por imunoistoquímica que GL se

acumulam em células hipóxicas (Zoula et al., 2003). Bensaad e colaboradores (2014), uma

década depois, mostraram que a hipóxia induz o acúmulo de GL dependentes de HIF-1α nas

linhas celulares tumorais (Bensaad et al., 2014). Conforme para HIF-1α, os resultados obtidos

para adipofilina podem estar relacionados com as taxas de oxigenação dos tumores de glândula

salivar. Considerando que estes tumores tendem a não ser hipóxicos (Wijffels et al., 2008;

Wijffels et al., 2009) e que a única amostra com alta quantidade relativa de adipofilina possua

alto índice de necrose, a expressão de adipofilina na carcinogênese do AP pode estar regulada

pela diminuição da resposta hipóxica.

81

Por outro lado, em relação aos resultados da expressão imunoistoquímica, notamos

que, ao contrário, a expressão da proteína adipofilina aumentou ao longo da carcinogênese.

Embora isso seja inesperado, estes resultados podem refletir uma limitação do nosso estudo.

Na avaliação imunoistoquímica estamos avaliando a peça cirúrgica como um todo e

percebemos que a expressão de adipofilina era (mesmo quando difusa) limitada a algumas

áreas. Como na expressão gênica estamos avaliando um fragmento tumoral de uma região

específica, e não um condensado de várias regiões, a discrepância entre estes dados poderia ser

explicada.

Por fim, durante a análise do fragmento tumoral, percebemos que quatro amostras

até então consideradas CXAP, apresentavam microscopicamente apenas áreas de AP residual.

Como tecidos congelados de AP residual são ainda mais raros, decidimos mesmo com um baixo

número de casos, considerá-los para uma análise comparativa com o AP convencional e o

CXAP. Quando correlacionamos o AP residual e o AP convencional, bem como o AP residual

e o CXAP, não podemos mensurar diferenças entre a expressão destes genes entre os grupos.

Provavelmente nossos resultados não mostrem diferença significativa entre as expressões pelo

pequeno número de amostras avaliados no grupo de AP residual. Mais estudos, porém,

considerando um número maior de amostras são necessários para investigar o papel destes

genes entre estes grupos.

Em resumo, nossos resultados sugerem que não existem diferenças entre a

expressão gênica de HIF-1α, GLUT-1, FASN e adipofilina entre as amostras de AP e CXAP

estudadas. Entretanto, quando comparamos apenas o tecido tumoral (seja benigno ou maligno),

notamos que as células tumorais destas neoplasias expressam mais GLUT-1 e menos

adipofilina do que as células normais. Ao contrário, os resultados da imunoistoquímica, mesmo

que categóricos, mostram que o aumento da expressão de FASN e adipofilina ao longo da

carcinogênese do AP, bem como a ausência de expressão da proteína GLUT-1 no AP, possam

refletir o papel dos controles regulatórios transcricionais e pós-traducionais que atuam na

expressão destes genes. Um número maior de amostras, com perfis mais homogêneos, bem

como uma investigação mais detalhada destas vias regulatórias, é necessário para definir o papel

destes genes ao longo deste processo. De todo modo, este estudo é o primeiro passo de muitos

outros que deverão vir para o melhor entendimento do metabolismo tumoral no

desenvolvimento do CXAP.

82

7 CONCLUSÂO

EXPRESSÃO GÊNICA

• Os resultados da expressão de HIF-1α nos tecidos tumorais podem indicar que as células

do AP e do CXAP possuam bom estado de oxigenação por conta da taxa de crescimento

relativamente lenta que é característica destes tumores.

• A expressão gênica de GLUT-1 está significativamente aumentada nos tecidos tumorais

em relação a GSN.

• Mesmo que a expressão gênica não mostre resultados estatisticamente significantes

entre os grupos, FASN parece ser, dentre todos os genes estudados neste trabalho,

àquele que melhor denota a heterogeneidade entre nossas amostras.

• A expressão gênica de adipofilina está significativamente reduzida nos tecidos tumorais

em relação a GSN, indicando que sua expressão não esteja necessariamente relacionada

à agressividade tumoral, mas sim com à regulação positiva de adipofilina sob condições

hipóxicas.

• Em nossa série, não houve diferença significativa na expressão de HIF-1α, GLUT-1,

FASN e adipofilina entre AP convencionais e AP residuais, bem como entre CXAP e

AP residuais, provavelmente pelo pequeno número de amostras de AP residual

analisadas.

EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA

• Os resultados da expressão da proteína HIF-1α ao longo do desenvolvimento do CXAP

indicam que não há diferença da resposta hipóxica nos diferentes grupos estudados.

• Os resultados da imunoistoquímica sugerem que a proteína GLUT-1 esteja associada

com a transformação maligna do AP enquanto a expressão das proteínas FASN e

adipofilina aumente para suportar a proliferação das células tumorais.

83

CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA

• A ausência de diferença na expressão gênica e imunoistoquímica de HIF-1α entre as

amostras estudadas reforça que tanto o AP quanto o CXAP são tumores com bom estado

de oxigenação.

• O aumento na expressão gênica e imunoistoquímica de GLUT-1 confirma nossa

hipótese de que a captação de glicose e a expressão de seus transportadores em células

transformadas é importante para o desenvolvimento do CXAP.

• O aumento na expressão das proteínas FASN e adipofilina ao longo da carcinogênese

do AP e a ausência da expressão da proteína GLUT-1 no AP pode refletir o papel dos

controles regulatórios transcricionais e pós-traducionais que atuam na expressão destes

genes.

84

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108

APÊNDICES

APÊNDICE 1 – Fichas de avaliação utilizadas para análise neste estudo

Número do caso: _________________________________

Características microscópicas

AP residual

Presente (___)

Ausente (___)

Não pode ser avaliado (___)

Invasão capsular

Precoce (___)

Intracapsular (___)

Minimamente invasivo (___)

Francamente invasiva (___)


Subtipo histológico

Luminal (___)

(_________________________________________)

Mioepitelial (___)

(_________________________________________)


Grau histológico

Baixo grau (___)

Alto grau (___)


Margens cirúrgicas

Livres (___)

Comprometidas (___)

Comprometimento de linfonodos

Presente (___)

Ausente (___)

Invasão perineural

Presente (___)

Ausente (___)

Invasão vascular

Presente (___)

Ausente (___)

Invasão linfática

Presente (___)

Ausente (___)

Necrose

Presente (___)

Ausente (___)

FICHA DE AVALIAÇÃO UTILIZADA PARA ANÁLISE

MORFOLÓGICA DA PEÇA CIRÚRGICA DO CXAP

109

Número do caso: _________________________________


Tecido glandular

<80% (___)

80-90% (___)

>90% (___)

Gordura

Presente (___)

<10% (___)

10-20% (___)

>20% (___)

Ausente (___)

Tecido conjuntivo e estruturas adjacentes

Presente (___)

<5% (___)

5-10% (___)

Ausente (___)

FICHA DE AVALIAÇÃO UTILIZADA PARA ANÁLISE MORFOLÓGICA

DO FRAGMENTO DE GSN UTILIZADO PARA EXTRAÇÃO DE RNA

110

Número do caso: _________________________________


Parênquima neoplásico

Tumor

<50% (___)

50-70% (___)

>70% (___)

Padrão de crescimento

Frouxo (___)

Sólido (___)

Mixoide (___)

Cordões (___)

Trabecular (___)

Formação ductal

Presente (___)

<20% (___)

20-50% (___)

>50% (___)

Ausente (___)

Diferenciação

Presente (___)

Ausente (___)

Necrose

Presente (___)

Ausente (___)

AP residual

Presente (___)

≤50% (___)

Ausente (___)

Estroma


Presente (___)

<10% (___)

10-30% (___)

31-50% (___)

>50% (___)

Ausente (___)

Gordura

Presente (___)

<5% (___)

Ausente (___)

FICHA DE AVALIAÇÃO UTILIZADA PARA ANÁLISE MORFOLÓGICA DO

FRAGMENTO DE AP, CXAP E AP RESIDUAL UTILIZADO PARA

EXTRAÇÃO DE RNA

111

APÊNDICE 2 – Análise microscópica dos fragmentos de tecido utilizados neste estudo

Apêndice 2a – Características microscópicas da análise do fragmento de tecido utilizado na extração de RNA de

9 amostras de GSN utilizadas neste estudo

Características microscópicas N (%)

Tecido glandular

<80% 1 (11,1%)

80-90% 7 (77,8%)

>90% 1 (11,1%)

Gordura

Presente

<10% 5 (55,6%)

10-20% 3 (33,3%)

>20% 1 (11,1%)

Ausente 0


Presente

<5% 2 (22,2%)

5-10% 5 (55,6%)

Ausente 2 (22,2%)

N: número de casos;

112

Apêndice 2b – Características microscópicas da análise do fragmento de tecido utilizado na extração de RNA de

13 espécimes provenientes de pacientes acometidos por AP, 11 acometidos por CXAP e 4

acometidos por CXAP onde apenas a contraparte benigna (AP residual) foi avaliada

Características microscópicas AP

N (%)

CXAP

N (%)

AP residual

N (%)

Parênquima neoplásico

Tumor

<50% 2 (15,4%) 1 (10%) 0

50-70% 10 (76,9%) 3 (30%) 0

>70% 1 (7,7%) 6 (60%) 4 (100%)

Padrão de crescimento

Frouxo 3 (23,1%) 0 0

Sólido 7 (53,8%) 10 (100%) 3 (75%)

Mixoide 2 (15,4%) 0 0

Cordões 1 (7,7%) 0 0

Trabecular 0 0 1 (25%)

Formação ductal

Presente

<20% 10 (76,9%) 1 (10%) 1 (25%)

20-50% 1 (7,7%) 3 (30%) 2 (50%)

>50% 0 5 (50%) 1 (25%)

Ausente 2 (15,4%) 1 (10%) 0

Diferenciação

Presente 0 1 (10%) 0

Ausente 13 (100%) 9 (90%) 4 (100%)

Necrose

Presente 0 1 (10%) 0

Ausente 13 (100%) 9 (90%) 4 (100%)

AP residual

Presente

≤50% * 2 (20%) *

Ausente * 8 (70%) *

Estroma


Presente

<10% 1 (7,7%) 4 (40%) 1 (25%)

10-30% 2 (15,4%) 4 (40%) 2 (50%)

31-50% 8 (61,5%) 1 (10%) 1 (25%)

>50% 2 (15,4%) 1 (10%) 0

Gordura

Presente

<5% 0 3 (30%) 1 (25%)

Ausente 13 (100%) 7 (70%) 3 (75%) N: número de casos; * - Parâmetro não aplicável ao grupo analisado

113

APÊNDICE 3 – Análise da integridade de amostras de GSN e AP utilizadas neste estudo

Apêndice 3 – Análise da integridade de quatro amostras de GSN (C6c, C7, C8, C9) e de cinco pacientes com AP

(AP6b, AP7, AP13, AP14, AP18). O resultado do gel de qualidade das amostras mostra RNA dentro

dos padrões de qualidade com aparecimento das subunidades 28S e 18S, com bandas uniformes e

poucos artefatos durante a corrida (no mRNA). O resultado da amostra AP13 pode ter sido

influenciado por bolhas no gel de agarose.

114

APÊNDICE 4 – Análise das expressões gênicas alteradas (outliers) neste estudo

Amostra 8 do CXAP – Única amostra que exibiu necrose no espécime utilizado

para expressão gênica (mais especificamente no centro do ducto – comedonecrose). Além disso,

esta amostra foi proveniente do único paciente que cursou com metástase em pulmão (estágio

IVc).

Amostra 4 do AP – Não foram encontradas diferenças clínicas, epidemiológicas,

histológicas ou imunoistoquímicas que diferenciassem esta das demais amostras analisadas.

Amostra 1 da GSN – GSN adjacente a amostra 7 do AP. Nenhuma outra

característica clínica, epidemiológica, histológica ou imunoistoquímica justificaram os níveis

alterados desta amostra.

Amostra 7 do AP – AP adjacente a amostra 1 da GSN. Nenhuma outra

característica clínica, epidemiológica, histológica ou imunoistoquímica justificaram os níveis

alterados desta amostra.

Amostra 9 do AP – Dentre todas que foram submetidas à expressão gênica, esta

amostra tinha maior formação ductal (40% do parênquima neoplásico apresentava esboços de

ductos), além do que 30% de sua composição foi de matriz condromixoide.

OUTLIERS

HIF-1α

GLUT-1

FASN

115

Amostra 7 do CXAP – CXAP de alto grau histológico, francamente invasivo, com

presença de comedonecrose na peça cirúrgica. Embora a amostra 8 dos CXAP na FASN não

tenha sido considerada um outlier, sua expressão foi a segunda maior neste grupo. Tanto a

amostra 7 quanto a 8 referem-se aos únicos carcinomas do ducto salivar ex-adenoma pleomorfo

com arquitetura morfológica em estágio avançado de diferenciação.

Amostra 7 do AP – Não foram encontradas diferenças clínicas, epidemiológicas,

histológicas ou imunoistoquímicas que diferenciassem esta das demais amostras analisadas.

Amostra 8 do CXAP – Única que exibiu necrose no espécime utilizado para

expressão gênica (mais especificamente no centro do ducto – comedonecrose). Além disso, esta

amostra foi proveniente do único paciente que cursou com metástase em pulmão (estágio IVc).

Adipofilina

116

ANEXOS

ANEXO 1 – Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa FOP/UNICAMP

117

ANEXO 2 – Verificação de originalidade e prevenção de plágio

EXPRESSÃO GÊNICA E IMUNOISTOQUÍMICA DE HIF-1α, GLUT-1, FASN E ADIPOFILINA

NO DESENVOLVIMENTO DO CARCINOMA EX-ADENOMA PLEOMORFO

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