UNIVERSIDADE DE SO PAULO

INSTITUTO DE QUMICA

Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas

(Bioqumica)

GUSTAVO CARVALHO DIAS

Gerao de linhagens celulares HEK293 knockdown

para as protenas p53, ATM, mTOR e PGC1 e estudo

do papel de p53 na resposta ao estresse oxidativo

provocado por azul de metileno

Verso original da dissertao defendida

So Paulo

Data do Depsito na SPG:

06/12/2013

GUSTAVO CARVALHO DIAS

Gerao de linhagens celulares HEK293 knockdown para as

protenas p53, ATM, mTOR e PGC1 e estudo do papel de p53 na

resposta ao estresse oxidativo provocado por azul de metileno

Dissertao apresentada ao Instituto de Qumica da

Universidade de So Paulo para obteno do ttulo

de Mestre em Cincias Biolgicas (Bioqumica).

Orientadora: Profa. Dra. Nadja C. de Souza Pinto

So Paulo

2013

Aos meus pais, Altomir e Consuelo,

e aos meus irmos, Isabel e Humberto.

Agradecimentos

Agradeo a minha orientadora, profa. Nadja C. de Souza Pinto, pela orientao, dedicao e

pela oportunidade de me juntar ao seu grupo para desenvolver meu trabalho. Agradeo tambm

pela oportunidade de conhecer outros pesquisadores, com os quais mantm contato, e por estimular

e apoiar a participao em congressos e, em especial ao 11th ICEM, do qual fez parte da comisso

organizadora.

A minha co-orientadora, Daniela T. Soltys, por todo o apoio que me deu ao longo do

mestrado, pelo incentivo a buscar novas abordagens para o desenvolvimento do meu trabalho e

tambm pelo carinho e amizade.

A profa. Alicia J. Kowaltowski, por permitir o uso irrestrito do seu laboratrio e por reforar

meu interesse por mitocndrias. Agradeo tambm a todos os integrantes do seu grupo de pesquisa,

pelas valiosas discusses, auxlio tcnico e pela amizade.

Ao prof. Carlos F. Menck, pelo uso de equipamentos e materiais necessrios para

desenvolver parte dos meus experimentos. Aos integrantes do seu laboratrio, pela disposio em

ajudar.

A Andressa Costa e Adriana Wendel, pela excelente organizao do laboratrio e pela

dedicao.

A todos os membros do Laboratrio de Gentica Mitocondrial, antigos e atuais, pelos

trabalhos desenvolvidos, pelo companheirismo e bom humor. Sobretudo, agradeo a amizade de

cada um de vocs.

A minha famlia e aos meus amigos, pelo imenso apoio e incentivo.

Ao Instituto de Qumica e Universidade de So Paulo, por sempre prezarem pela excelncia

no ensino e na pesquisa.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), a Coordenao

de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e a Fundao de Amparo Pesquisa do

Estado de So Paulo (FAPESP), pelo auxlio financeiro: Redoxoma (08/57721-3) e projeto temtico

(10/51906-1). Novamente, ao CNPq pela bolsa de mestrado (processo 13326/2010-2).

Resumo

Dias, G.C. Gerao de linhagens celulares HEK293 knockdown para as protenas p53, ATM, mTOR e

PGC1 e estudo do papel de p53 na resposta ao estresse oxidativo provocado por azul de metileno.

2013. (66p). Dissertao Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Bioqumica). Instituto

de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.

O DNA um alvo constante de modificaes qumicas, as quais resultam na ativao dos programas

de reparo de danos no DNA. O DNA mitocondrial (DNAmt), uma molcula circular contendo

aproximadamente 16,6 kb de extenso, constantemente exposto s espcies reativas de oxignio

(EROs) devido a sua proximidade da cadeia transportadora de eltrons, presente na membrana

mitocondrial interna. Quase todas as vias de reparo de DNA presentes no ncleo atuam tambm na

mitocndria, entretanto, a regulao das vias mitocondriais no bem compreendida. As protenas

p53, ATM, mTOR e PGC1 participam, dentre outros papis, do controle do metabolismo energtico

e das respostas a leses no DNA nuclear. Dessa forma, decidimos gerar linhagens celulares com

nveis reduzidos dessas protenas como uma ferramenta para o estudo dos seus papis na

manuteno do DNAmt. Para isso, foram geradas linhagens celulares de HEK293 expressando

constitutivamente shRNAs alvo-especficos, cuja diminuio da expresso das protenas alvo foi

confirmada atravs de western blotting. Neste trabalho, tambm foi estudado o papel de p53 na

resposta ao estresse oxidativo mitocondrial provocado por azul de metileno (AM). O AM um

corante fotoativo capaz de atravessar membranas biolgicas e, em clulas de mamferos, se acumula

em organelas, tais como a mitocndria. Uma vez que p53 participa de diversas funes celulares e

transloca para a mitocndria sob condies de estresse, onde pode induzir apoptose ou modular o

reparo de DNAmt, ns investigamos se p53 est envolvido na induo de morte celular aps

tratamento com AM fotoativado. Para isso, foram utilizados 2 clones com nveis reduzidos de p53

obtidos na primeira etapa deste trabalho. Sob condies normais, foi demonstrado que o

silenciamento de p53 induziu uma forte reduo do nmero de cpias de DNAmt e estimulou a

proliferao celular quando fornecemos glicose ou galactose como substratos energticos. A

depleo de p53, ou a sua inibio farmacolgica, resultaram em uma ligeira proteo quando as

clulas foram submetidas ao tratamento com AM. Tambm foi demonstrado que AM provoca morte

celular apopttica de uma maneira dependente de p53, uma vez que a depleo dessa protena

protegeu a populao do acmulo de clulas em sub-G1. Portanto, nossos resultados sugerem que

AM induz morte celular apopttica em clulas HEK293, de uma maneira dependente de p53. Esse

efeito pode ser mediado diretamente por p53, ou ainda, pelo seu papel na manuteno do nmero

de cpias do DNAmt.

Palavras-chave: mitocndria, DNAmt, p53, azul de metileno, estresse oxidativo

Abstract

Dias, G.C. Generation of HEK293 knockdown cell lines to the proteins p53, ATM, mTOR and PGC1

and study of the role of p53 during response to methylene blue-induced oxidative stress. 2013. (66p).

Dissertao Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Bioqumica). Instituto de Qumica,

Universidade de So Paulo, So Paulo.

DNA is constantly being chemically modified, which results in activation of the DNA damage response

program. The mitochondrial DNA (mtDNA), a circular molecule of 16.6 kb in length, is primary target

of reactive oxygen species (ROS) due its proximity to the electron transport chain, in the

mitochondrial inner membrane. Almost all known DNA damage repair pathways operating in the

nucleus were also found in the mitochondrion; however, their regulation remains not well

understood. The proteins p53, ATM, mTOR e PGC1 have many cellular functions, including control

of energy metabolism and cell fate after stress. Thus, we hypothesized that those proteins could

participate in maintaining of mtDNA, through direct or indirect roles. To test this hypothesis, we

generated isogenic knockdown cell lines to further use them to study their role in the mtDNA

damage response. For that, were generated HEK293 knockdown cell lines that stably express target-

specific shRNAs. Efficient knockdown was checked using western blotting. Here, we also studied the

role of p53 in the cellular response to mitochondrial oxidative stress induced by methylene blue

(MB). MB is a photoactive dye that crosses biological membranes due to its lypophylic character and,

in mammalian cells, accumulates in organelles such as mitochondria; however, its cytotoxic

mechanism is not well understood. As the p53 protein participates in several cellular functions and

translocates to mitochondria under stress conditions, where it can induce apoptosis or modulate

mtDNA repair, we investigated whether p53 was involved in MB + light-induced cell death using p53

knockdown clones selected from the cell lines generated in the first phase of this work. Under

normal conditions, p53 knockdown caused a decrease in mtDNA copy number and stimulated

cellular growth supported by either glucose or galactose. After MB treatment, p53-kd cells showed a

slight decrease in cell death compared to scrambled shRNA controls. Evaluation of cell death after

MB treatment, using flow cytometry analysis, indicated that MB was able to induce significant levels

of apoptotic cell death, which was dependent on p53 levels. Taken together, our results suggest that

MB induces cell death, probably via apoptosis, in a p53 dependent manner. This effect may be

mediated by p53 directly or by its role in mtDNA copy number maintenance.

Keywords: mitochondria, mtDNA, p53, methylene blue, oxidative stress

Lista de abreviaturas e siglas

AM = azul de metileno.

BER = reparo por exciso de base (do ingls base excision repair).

DNA = cido desoxirribonucleico (do ingls deoxyribonucleic acid).

DNAc = DNA complementar.

DNAmt = DNA mitocondrial.

DNAn = DNA nuclear.

ERO = espcie reativa de oxignio.

NER = reparo por exciso de nucleotdeo (do ingls nucleotide excision repair).

8-oxodG = 8-desoxiguanina.

pb = pares de bases.

PCR = reao da polimerase em cadeia (do ingls polymerase chain reaction).

PI = iodeto de propdeo (do ingls propidium iodide).

RNA = cido ribonucleico (do ingls ribonucleic acid).

RNAm = RNA mensageiro.

RNAr = RNA ribossomal.

RNAt = RNA de transferncia ou RNA transportador.

RT-PCR = transcrio reversa por reao da polimerase em cadeia (do ingls reverse transcription

followed by the polymerase chain reaction).

shRNA = sem traduo para o portugus (do ingls short hairpin RNA).

Sumrio

1. Introduo 12

1.1. Mitocndria: Uma organela com mltiplas funes 13

1.2. DNA mitocondrial: Um genoma reducionista 13

1.3. Principais causas de danos ao DNA mitocondrial 14

1.3.1. Gerao de EROs mitocondrial 15

1.4. Reparo de danos no DNA mitocondrial 16

1.5. ATM: estresse oxidativo e homeostase mitocondrial 17

1.6. mTOR: metabolismo energtico e mitofagia 17

1.7. PGC1 : metabolismo e biognese mitocondrial 18

1.8. p53: O guardio do genoma mitocondrial? 18

1.8.1. O papel de p53 dentro da mitocndria 19

1.9. Azul de metileno 20

2. Objetivos 22

3. Materiais e mtodos 23

3.1. Cultivo celular 23

3.2. Silenciamento gnico 23

3.3. Seleo de linhagens knockdown 25

3.4. Avaliao da porcentagem de silenciamento 26

3.4.1. Extrao de protenas 26

3.4.2. Preparo das amostras e SDS-PAGE 26

3.4.3. Transferncia e revelao 27

3.4.4. Extrao de RNA total 27

3.4.5. Reaes de Transcrio Reversa e amplificao quantitativa do DNAc (qRT-PCR) 28

3.4.6. Validao dos primers 28

3.5. Seleo clonal 29

3.6. Curva de crescimento utilizando o sistema xCELLigence 29

3.7. Medida do consumo de oxignio por clulas em cultura 30

3.8. Proliferao celular aps o tratamento com o corante azul de metileno fotossensibilizado 30

3.9. Quantificao do nmero relativo de cpias de DNAmt 31

3.10. Identificao da populao sub-G1 por citometria de fluxo 32

4. Resultados 33

4.1. Gerao de linhagens celulares HEK293 knockdown para ATM, mTOR, p53 e PGC1 33

4.1.1. Expresso de ATM em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene 34

4.1.2. Expresso de mTOR em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene 35

4.1.3. Expresso de PGC1 em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene 37

4.1.4. Expresso de p53 em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene 38

4.1.5. Seleo clonal de HEK293 silenciada para p53 38

4.2. Estudo do papel de p53 em clulas HEK293 submetidas ao estresse oxidativo mitocondrial

induzido pelo corante Azul de Metileno 41

4.2.1. Cintica de proliferao celular em meio de cultura contendo glicose ou galactose 41

4.2.2. Parmetros bioenergticos em HEK293 p53-KD 44

4.2.3. Efeito do nvel de p53 na susceptibilidade de HEK293 ao estresse oxidativo gerado por

azul de metileno fotoativado 48

4.2.4. Quantificao relativa do nmero de cpias de DNAmt em dois clones p53 knockdown 49

4.2.5. Caracterizao do tipo de morte celular induzida por estresse oxidativo mitocondrial 50

5. Discusso 52

6. Concluso 57

7. Referncias Bibliogrficas 58

12

1. Introduo

Diversos eventos celulares ou ambientais, como a produo de espcies reativas de oxignio

(EROs) ou a incidncia de radiao ultravioleta (UV), acarretam em danos para os componentes

celulares, incluindo os cidos nucleicos. A ao desses agentes, quando reconhecida com sucesso,

gera uma resposta coordenada na qual a clula poder decidir entre reparar o dano ou recorrer a um

dos seus programas de morte celular. Atravs da ativao diferencial de diversas vias de reparo de

DNA (Figura 1.1), as clulas evitam o acmulo de mutaes decorrentes de leses no seu material

gentico ou de erros replicativos, garantindo assim a proteo da informao gentica atravs das

geraes (Harper e Elledge, 2007).

Figura 1.1. Esquema simplificado das diferentes fontes de dano no DNA e seus respectivos

processos de reparo. Abreviaes: (6-4)PP, fotoproduto pirimidina (6-4) pirimidona; CPD, dmero de

pirimidina cis-syn-ciclobutano; Cis-Pt, cisplatina; MMC, mitomicina C; BER, do ingls base excision

repair; NER, do ingls nucleotide excision repair (Traduzido de (de Boer e Hoeijmakers, 2000).

13

Os mecanismos de reparo de leso no DNA apresentados na Figura 1.1 acima foram

inicialmente identificados e caracterizados atuando em reposta a leses encontradas no genoma

nuclear. Alm do ncleo, a mitocndria outra organela celular que contm material gentico

prprio e que est sujeito aos mesmos agentes causadores de danos no DNA e, em especial, a EROs

(Alexeyev et al., 2013). Dessa forma, esperado que existam mecanismos de manuteno do

genoma mitocondrial semelhantes aos nucleares. De fato, a maioria das vias de reparo de DNA

nuclear (DNAn) atua tambm na mitocndria contribuindo para a manuteno da integridade do

DNA mitocondrial (DNAmt).

1.1. Mitocndria: Uma organela com mltiplas funes

As mitocndrias so, principalmente, conhecidas como os stios celulares de gerao de

energia para as clulas eucariotas, principalmente no que diz respeito produo de ATP pela

fosforilao oxidativa. De fato, essas organelas so essenciais para a homeostasia celular e possuem

diversas funes. Para citar alguns dos processos executados pela mitocndria, podemos listar o

metabolismo de biomolculas atravs do ciclo de Krebs, parte do ciclo da ureia (metabolismo de

aminocidos e balano de nitrognio), metabolismo de cidos graxos, biossntese de cardiolipina

(componente da membrana interna mitocondrial), biossntese do grupo heme (componente da

hemoglobina, citocromos e clorofila em plantas) e do ubiquinol (coenzima Q) (Scheffler, 2008). Alm

de possuir um papel central no metabolismo energtico, mitocndrias tambm participam do

destino celular aps situaes de estresse, participando dos programas de morte celular

programada, tais como apoptose e necrose (Kroemer et al., 2009; Scheffler, 2008), e tambm so

importantes stios de gerao de EROs endgenos (Kowaltowski et al., 2009).

1.2. DNA mitocondrial: Um genoma reducionista

O genoma mitocondrial humano consiste de uma molcula de DNA circular altamente

conservado formado por 16.569 pares de bases (pb) e codifica para 13 cadeias polipeptdicas, todas

componentes da cadeia transportadora de eltrons, alm de 22 RNAts e 2 RNArs (Figura 1.2)

(Anderson et al., 1981; Andrews et al., 1999). De sua totalidade, apenas cerca de 1.122 pb do DNAmt

no codificam para algum produto gnico, entretanto, essa regio desempenha um papel crucial

para a atividade do DNAmt uma vez que contm a origem de replicao da fita pesada OH (do ingls

Heavy, em oposio a OL que se refere a origem de replicao da fita leve, do ingls Light) e os

promotores para transcrio das fitas leve e pesada (Bonawitz et al., 2006). Essa sequncia no-

codificadora denominada ala de deslocamento (ou D-loop, do ingls displacement loop) e, apesar

da sua importncia funcional, possui somente pequenos segmentos conservados enquanto o

restante da sequncia varivel entre as espcies e apresenta polimorfismos, mesmo dentro de uma

mesma espcie (Scheffler, 2008). A consequncia direta da alta densidade de informao no genoma

mitocondrial que, mesmo pequenas alteraes na sua sequncia, ou acmulo de leses, tero um

grande impacto na expresso gnica e integridade da molcula.

14

Figura 1.2. Mapa do genoma mitocondrial humano. OH e OL, origens de replicao das fitas pesada

(do ingls Heavy) e leve (do ingls Light) do DNAmt, respectivamente; ND1ND6, subunidades da

NADH desidrogenase (complexo I) subunidades 16; Cyt b, citocromo b (complex III); COX1COX3,

subunidades da citocromo oxidase (complexo IV) subunidades 13; ATP6 e ATP8, subunidades 6 e 8

da ATP sintase (complexo V) (Alexeyev et al., 2013).

1.3. Principais causas de danos ao DNA mitocondrial

O genoma mitocondrial est constantemente exposto a agentes causadores de danos

endgenos e exgenos. Em uma recente reviso, Alexeyev e colaboradores (2013) listaram 5 fontes

relevantes de leso ao DNAmt, e esto transcritos logo abaixo:

i) Alquilao: um dano causado por agentes exgenos (agentes quimioterpicos, por exemplo) e

endgenos (S-adenosilmetionina, o qual pode metilar o DNA de forma no-enzimtica). Com

efeito, a mitocndria contm cerca de 30% do contedo celular de S-adenosilmetionina. Danos

alquilantes endgenos foram demonstrados experimentalmente.

ii) Danos hidrolticos: podem ocorrer de duas maneiras: formao de stios absicos (como

resultado da hidrlise espontnea da ligao glicosdica) e desaminao de bases, com

predominncia de citosina.

15

iii) Formao de adutos: pode ter fontes endgenas (por exemplo, estrognios) e exgenas (como

cigarro, entre outros agentes qumicos). Em alguns casos, a exposio a esses agentes, pode

danificar o DNAmt preferencialmente.

iv) Mal-pareamento de bases: devido a erros durante a replicao (como a incorporao de bases

erradas ou modificadas quimicamente) ou modificao qumica de bases nitrogenadas aps a

incorporao no DNA.

v) Quebras de fita do DNA: pode haver quebra da ligao fosfodister em apenas uma ou em

ambas as fitas do DNA. Os dois tipos de quebra podem ser gerados direta ou indiretamente

(induzidos pela ao de agentes txicos, ou como resultado de falhas no processo de reparo de

outras leses no DNA).

vi) Danos oxidativos: este tipo de dano o mais estudado e tambm o mais prevalente no DNAmt,

principalmente porque as mitocndrias so a principal fonte celular de EROs.

EROs gerados pela mitocndria podem provocar danos em protenas mitocondriais, lipdeos

e no DNAmt. Acredita-se que o DNAmt particularmente sensvel aos agentes oxidantes devido

sua proximidade da membrana interna mitocondrial, onde formada a maioria das EROs

intracelulares, e tambm devido a falta de histonas protegendo o genoma mitocondrial (Ames et al.,

1993). Embora ainda controverso na literatura, diversos autores acreditam que o ambiente

mitocondrial contribua para um nmero elevado de 8-oxodesoxiguanina (8-oxodG) encontrados no

DNAmt em relao ao DNAn, um parmetro anteriormente utilizado como marcador de estresse

oxidativo mitocondrial (Anson et al., 2000; Herrero e Barja, 1999; Lim et al., 2005; Mecocci et al.,

1993). A consequncia direta da presena de 8-oxodG no DNA que essa base oxidada pode gerar

um pareamento de bases no usual com uma adenina, provocando uma transverso G:C para A:T

aps um ciclo de replicao. Os produtos de oxidao de 8-oxodG, como os cidos oxalrico e

cianrico, por exemplo, podem ser ainda mais mutagnicos do que o prprio 8-oxodG (Halliwell e

Gutteridge, 2007). Apesar da controvrsia em relao aos nveis mitocondriais de 8-oxodG e dos

protocolos utilizados, possvel acessar os danos oxidativos no DNAmt atravs de outros

parmetros, tais como: modificao qumica de bases alm da prpria 8-oxodG , stios absicos,

entre outros tipos de leso (Cooke et al., 2003). Utilizando outra metodologia, baseada na

amplificao por PCR de quase toda a extenso do DNAmt, foi demonstrado que o dano no DNAmt

mais extenso e persistente do que no DNAn em clulas humanas aps sofrer estresse oxidativo

(Yakes e Van Houten, 1997), confirmando novamente a maior susceptibilidade a danos ao qual essa

molcula est exposta.

1.3.1. Gerao de EROs mitocondrial

A primeira espcie reativa de oxignio gerada na mitocndria o radical nion superxido

(O2 ), pelos complexos I e III da cadeia transportadora de eltrons, resultante da reduo

monoeletrnica do oxignio molecular, O2 (Kowaltowski et al., 2009). Estima-se que a produo de

O2 varie de cerca de 0,1 % a 4 % do consumo total de oxignio, dependendo de suas concentraes

locais (Nicholls e Ferguson, 2002). O O2 convertido ao perxido de hidrognio, H2O2, pelas enzimas

superxido dismutase Mn-SOD e Cu,Zn-SOD presentes, respectivamente, na matriz mitocondrial e no

espao intermembranas (Kowaltowski et al., 2009; Nicholls e Ferguson, 2002). O H2O2 pode ser

removido pela catalase, em mitocndrias de fgado (Salvi et al., 2007) e corao (Radi et al., 1991), ou

pelos trs pares redox quantitativamente mais importantes na matriz mitocondrial: GSSG/GSH,

16

NADP+/NADPH e NAD+/NADH (Nicholls e Ferguson, 2002). Entretanto, se no degradado, pode

ocorrer formao do radical hidroxila (HO) atravs de reaes no enzimticas: da reao de ons

metlicos, como Cu+ e Fe2+ (Reao de Fenton), com o H2O2; pela fisso homoltica da ligao

covalente entre os tomos de oxignio do H2O2, induzida por radiao UV; por ao da radiao a

partir de gua; ou por ao das quinonas e semi-quinonas, a partir de H2O2,com participao de ferro

(Halliwell e Gutteridge, 2007). Devido sua curta meia-vida, o HO s pode ser removido

indiretamente, ou seja, apenas os produtos da sua reao com outras biomolculas podem ser

reparados enzimaticamente (Halliwell e Gutteridge, 2007). Desta forma, como o radical hidroxila

reage com biomolculas com uma constante de reao de cerca de 109 M-1x s-1 (Augusto, 2006), os

alvos preferenciais so aqueles que esto mais prximos de seus stios de produo, o que torna o

DNAmt um alvo preferencial.

1.4. Reparo de danos no DNA mitocondrial

Para lidar com os danos causados no seu genoma, a mitocndria conta com quase todas vias

de reparo de DNA presentes tambm no ncleo, sendo a via de reparo por exciso de bases (ou BER,

do ingls base excision repair) a melhor caracterizada at o momento e tambm a mais ativa nessa

organela. A mitocndria conta tambm com a via de reparo de bases mal-pareadas, reverso direta

de guanina metilada provavelmente pela protena suicida MGMT (do ingls, O6-methyl-guanine DNA

methyl transferase), h tambm evidncias da atividade de recombinao homloga e de juno de

pontas no homlogas de DNA em mitocndrias (revisto por (Alexeyev et al., 2013; Gredilla et al.,

2010; Kazak et al., 2012; Sykora et al., 2012)). H um consenso na literatura sobre a ausncia de via

de reparo por exciso de nucleotdeos (ou NER, do ingls nucleotide excision repair) na mitocndria e

os autores concordam que danos tais como aqueles reparados pela via NER, bem como excesso de

danos ou ocorrncia de quebra de fita dupla de DNA, resultam em degradao de DNAmt

(Shokolenko et al., 2013). importante ressaltar que a degradao de DNAmt consiste em uma

resposta celular possvel somente pelo fato de que h muitas cpias desse genoma em cada

mitocndria.

A eficincia das vias de reparo de DNA e as respostas celulares a leses no DNA podem ser

controladas em vrios nveis. Enquanto a atividade de reparo depende primariamente do nvel de

expresso dos seus componentes enzimticos, muitas dessas enzimas so sujeitas a modulaes por

modificaes ps-traducionais e por interaes com outras protenas sem atividade enzimtica.

Dados recentes da literatura indicam que as protenas p53, PGC1, ATM e mTOR podem estar

envolvidas no controle das respostas celulares a leses no DNA, como ser discutido abaixo. Essas

protenas participam de diversas vias celulares, incluindo vias centrais para o controle do

metabolismo energtico celular e da funo mitocondrial. Entretanto, seus papis diretos em vias de

reparo de DNA, especialmente em mitocndrias, ainda no esto bem estabelecidos.

17

1.5. ATM: estresse oxidativo e homeostase mitocondrial

A protena mutada em Ataxia telangectasia (ATM) pertence famlia de fosfatidilinositol

cinases (PI3/PI4-cinases), relacionadas com a manuteno da estabilidade do genoma e controle do

ciclo celular. Essa protena rapidamente ativada em resposta s leses no DNA, especialmente

quebras de fita dupla (Banin et al., 1998). ATM sofre auto-fosforilao, alm de fosforilar outros alvos

subsequentes como p53 em seu resduo Ser15, o que leva ao aumento da atividade desse fator de

transcrio, reforando seu papel no reparo de DNA e controle do ciclo celular (Banin et al., 1998;

Canman et al., 1998). Mutaes em ATM causam Ataxia Telangiectasia, uma rara doena autossomal

recessiva associada com degenerao prematura do sistema nervoso central e a um contnuo estado

de estresse oxidativo com elevada produo de EROs (Ito et al., 2004; Lavin e Shiloh, 1997). ATM

essencial para a manuteno do nmero de cpias do DNAmt e para a homeostase bioenergtica

mitocondrial (Eaton et al., 2007). A deficincia em ATM resulta em disfuno mitocondrial,

provocando reduo no potencial de membrana mitocondrial, aumento da expresso de genes

responsivos ao estresse oxidativo, diminuio das taxas respiratrias (Ambrose et al., 2007),

diminuio da atividade de citocromo c oxidase (Patel et al., 2011) e provavelmente reduo do

processo de mitofagia (Valentin-Vega et al., 2012). Em resposta ao estresse oxidativo, ATM ativa a

protena de sinalizao intracelular TSC2, inibindo ento o complexo mTORC1, o que permite a

induo de autofagia (Alexander et al., 2010). Por outro lado, um papel direto de ATM no reparo de

DNAmt, e sua ativao em resposta a leses no DNAmt ainda no foram demonstrados.

1.6. mTOR: metabolismo energtico e mitofagia

A protena mTOR (mechanistic target of rapamycin) uma serina/treonina cinase que regula o

crescimento, tamanho e sobrevivncia celular em resposta aos estmulos metablicos extracelulares,

como insulina e aminocidos. A inibio por rapamicina do complexo mTORC1, do qual mTOR um

constituinte, diminui os nveis de respirao mitocondrial e da respirao completamente

desacoplada, induzindo um estado de dependncia aumentada da gliclise aerbica (Schieke et al.,

2006). A inibio de mTORC1 tambm reduz a expresso de reguladores da transcrio mitocondrial,

como PGC1 e NRF-1, e o consumo de oxignio estando, portando, relacionado com o controle do

metabolismo mitocondrial (Cunningham et al., 2007). mTORC1 controla a atividade e a biognese

mitocondrial ao promover seletivamente a traduo dos mRNA codificadores de protenas

mitocondriais (Morita et al., 2013) estabelecendo, portanto, a ligao entre a sntese proteica e o

metabolismo energtico. Alm disso, mTOR pode ser encontrado na membrana externa mitocondrial

em um complexo com VDAC1 e Bcl-xl, que so protenas envolvidas no controle da apoptose pela via

mitocondrial (Ramanathan e Schreiber, 2009). E essa observao sugere que mTOR pode estar

associado ao controle da apoptose em condies de estresse. Adicionalmente, mTOR tambm

participa da regulao negativa do processo de autofagia e sua atividade est sob a influncia de p53

(Feng e Levine, 2010). Alm disso, a produo aumentada de EROs durante dficit nutricional ou

dano mitocondrial desencadeia a autofagia atravs da inibio de mTOR (Essick e Sam, 2010). Em um

modelo celular contendo DNAmt hetereplsmico carregando uma mutao patognica, a

administrao de rapamicina estimulou a mitofagia e, consequentemente, resultou na reduo dos

nveis de DNAmt mutado alm de restaurar parcialmente os nveis de ATP (Dai et al., 2013). A

inibio do mTORC1 por rapamicina em modelo murino para a sndrome de Leigh, caracterizada pela

18

deficincia da protena Ndufs4 do complexo I mitocondrial, retardou os sintomas neurolgicos dessa

doena mitocondrial (Johnson et al., 2013). Juntos, esses dados mostram que a protena mTOR

possui um importante papel no que diz respeito ao metabolismo do DNAmt e funo mitocondrial.

1.7. PGC1 : metabolismo e biognese mitocondrial

PGC1 um co-ativador transcricional, membro de uma famlia de co-ativadores que atuam

em conjunto com as protenas proliferadoras de peroxissoma, como PPAR. Wu et al. (1999)

demonstraram que PGC1 estimula a biognese mitocondrial e aumenta a respirao em clulas

musculares atravs da induo da protena desacopladora 2 (UCP-2) e da regulao de fatores

respiratrios nucleares (NRFs). Segundo os mesmos autores, a ativao de PGC1 tambm controla o

metabolismo de DNAmt indiretamente, pois ele aumenta a expresso do fator de transcrio A

mitocondrial (TFAM), um regulador da replicao e transcrio do DNAmt. Como descreveram Uldry

et al. (2006), a ausncia de PGC1 reduz severamente a induo de genes termognicos em tecido

adiposo marrom de camundongos. Ainda segundo esses autores, a deficincia de PGC1 ou de

PGC1 provoca uma significante reduo da expresso gnica mitocondrial, e a ausncia

concomitante das duas formas causa perda total da biognese mitocondrial ligada diferenciao do

tecido marrom e da respirao. PGC1 exerce um efeito protetor em clulas neuronais em cultura

diante da ao de oxidantes, ativando diretamente um programa transcricional antioxidante (St-

Pierre et al., 2006). Em clulas endoteliais vasculares, PGC1 age em parceria com Foxo3a em

resposta ao estresse oxidativo regulando a expresso de SOD2 e catalase (Olmos et al., 2009). O

aumento da expresso de PGC1 em certos tipos de melanoma resulta em diminuio da gliclise e

aumento de metabolismo mitocondrial bem como da resistncia ao estresse oxidativo (Haq et al.,

2013; Vazquez et al., 2013). Entretanto, um papel para PGC1 em controle de reparo de DNA ainda

no foi demonstrado.

1.8. p53: O guardio do genoma mitocondrial?

Os primeiros registros da protena p53 foram publicados em 1979, quando trs grupos a

identificaram em clulas transformadas por agentes qumicos, irradiao ou vrus, bem como em

clulas transformadas espontaneamente (DeLeo et al., 1979; Lane e Crawford, 1979; Linzer e Levine,

1979). Nos anos seguintes, p53 rapidamente tornou-se um grande objeto de estudo devido ao seu

importante papel na resposta a danos celulares e agentes mutagnicos, contribuindo, dessa forma,

para a manuteno da estabilidade genmica. Pelo seu papel na proteo do genoma nuclear, como

parada do ciclo celular ou induo de morte programada, p53 recebeu o ttulo de o guardio do

genoma (Lane, 1992). Os estudos que se seguiram contriburam para o acmulo de um enorme

volume de informaes a respeito dessa protena supressora de tumor, e ser brevemente resumido

a seguir.

A protena p53 um fator de transcrio sequncia-especfico responsvel pelo controle de

uma srie de eventos celulares que incluem regulao do ciclo celular, induo de apoptose, reparo e

replicao de DNA, proliferao celular, resposta a estresse e regulao negativa do prprio p53

(Holley e St Clair, 2009). Em condies fisiolgicas normais p53 est inativa e em baixas

19

concentraes devido presena de protenas repressoras MDM2 e MDMX. Sua ativao, sob

condies de estresse, dependente de modificaes ps-traducionais tais como fosforilao,

acetilao ou ubiquitinao, para citar algumas (Kruse e Gu, 2009). Mutaes em p53 que causam a

perda de sua atividade so associadas com diversos tipos de cnceres e vrios grupos tm proposto

que mutaes nesse gene so eventos iniciais no processo de transformao tumorignica, uma vez

que p53 necessrio para a manuteno da estabilidade genmica da clula (Garritano et al., 2013;

Greenblatt et al., 1994). A protena p53 ativada em resposta a uma gama variada de estresses, que

incluem choque trmico, estresse metablico, hipxia e danos no DNA (radiao UV e ionizante,

depurinao e alquilao de bases e danos induzidos por EROs, entre outros) (Harris e Levine, 2005).

No que diz respeito ao papel dessa protena no reparo de dano no DNA, a p53 facilita o

recrutamento de fatores da via NER para stios danificados no DNA aps irradiao com luz UVB,

sendo que esses fatores so protenas envolvidas nos estgios iniciais de NER: XPD (componente do

fator de transcrio TFIIH) XPC e CSB; por outro lado, a ausncia de p53 torna mais lenta a resposta

apopttica induzida por UVB (Ikehata et al., 2010; Wang et al., 2003). Foi demonstrado que p53

estimula a via BER, independente de sua atividade transcricional, e exibe um pico de atividade entre

as fazes G0 e G1 do ciclo celular aps estresse genotxico (Offer et al., 2001a; Offer et al., 1999; Offer

et al., 2001b). A protena p53 interage com enzimas do eixo central de BER, AP endonuclease e DNA

Polimerase , estabilizando a interao desta ltima com stios absicos no DNA, alm de estar

aparentemente envolvida no controle da expresso da Pol (Seo et al., 2002; Zhou et al., 2001).

1.8.1. O papel de p53 dentro da mitocndria

Mudanas na funo mitocondrial, com consequente alterao na produo de EROs, podem

afetar a atividade de p53 e sua localizao subcelular e, de fato, p53 relocaliza para a mitocndria em

resposta a estmulos que induzem apoptose (Holley et al., 2010; Marchenko et al., 2000). Por sua vez,

a protena p53 pode afetar a produo de EROs mitocondrial regulando a expresso e interagindo

diretamente com Mn-SOD, aps translocar-se para a mitocndria sob condies de estresse (Zhao et

al., 2005). A protena p53 regula ainda a transio entre a respirao aerbica e a gliclise

controlando a expresso de SCO2, PGM e TIGAR (Feng e Levine, 2010).

Sob condies de estresse oxidativo, p53 provoca abertura do poro de transio de

permeabilidade de membrana mitocondrial atravs da interao com a protena ciclofilina D

provocando morte celular por necrose (Vaseva et al., 2012). A localizao mitocondrial de p53

espao intermembrana e matriz na ausncia de estresse estimula o consumo de oxignio e diminui

a produo de superxido (Bergeaud et al., 2013), provavelmente por estimular a enzima Mn-SOD

(Zhao et al., 2005). A protena p53 interage com a protena sensvel oligomicina OSCP, uma

subunidade do complexo FoF1 da ATP sintase, e est aparentemente envolvida com a montagem

desse complexo (Bergeaud et al., 2013). Dessa forma, a protena p53 desempenha, dentre tantos

papis, a comunicao entre ncleo e mitocndria, contribuindo para o controle do estado redox e

metablico celular.

No que diz respeito manuteno do genoma mitocondrial, estudos in vitro mostraram que

p53 promove a estabilidade do DNAmt atravs de uma interao funcional com a DNA polimerase

(pol ), alm de estimular a remoo de uracila e 8-oxoguanina pelas glicosilases da via BER (Achanta

20

et al., 2005; Chen et al., 2006; de Souza-Pinto et al., 2004). Dentro da mitocndria, p53 tambm

aumenta a acurcia da sntese de DNAmt atravs de sua atividade 3-5 exonuclesica, dessa forma,

atua como revisora da atividade de pol (Bakhanashvili et al., 2008). A ligao de mtSSB p53

aumenta sua atividade 3-5 exonuclesica, particularmente na hidrlise de 8-oxoguanina (Wong et

al., 2009) reforando ainda mais o papel de p53 mitocondrial para a sntese e reparo de DNAmt. De e

colaboradores (2012) revelaram que p53 e a DNA helicase dependente de ATP RECQL4 colocalizam

com os nucleoides mitocondriais na ausncia de danos ao DNA, sugerindo que RECQL4 pode

contribuir para o recrutamento de p53 durante a replicao do genoma mitocondrial.

Alm disso, Canugovi e colaboradores (2010) demonstraram que a protena TFAM,

componente essencial do nucleoide mitocondrial, pode impedir o acesso de protenas da via BER ao

DNAmt, inibindo a atividade dessa via. In vitro, p53 promove a remoo de TFAM do DNA, facilitando

o acesso das protenas de reparo. Desta forma, p53 pode tambm contribuir para a manuteno da

integridade do DNAmt atravs de sua interao funcional com TFAM.

1.9. Azul de metileno

O azul de metileno (AM) um composto fenotiaznico de estrutura tricclica, encontrando-se

normalmente na forma catinica quando em soluo. Caracterizado como fotossensibilizador,

apresenta o mximo de absoro em 656 nm (Calzavara-Pinton et al., 2012) e, como a maioria dos

fotossensibilizadores, gera oxignio singlete de forma eficiente por reaes fotoqumicas do tipo II

(Oleinick et al., 2002). Em clulas tratadas com o AM, esse possui localizao lisossomal e colocaliza

com o ncleo aps fotoativao (Mellish et al., 2002; Walker et al., 2004). Suspenses de

mitocndrias tambm so capazes de acumular AM eficientemente, de maneira dependente do

potencial de membrana mitocondrial (Gabrielli et al., 2004).

Diversos trabalhos demonstraram a ao antimicrobiana do azul de metileno e seus

derivados em terapia fotodinmica (TFD) contra bactrias gram positivas e negativas, Candida

albicans (Paz-Cristobal et al., 2013; Souza et al., 2010), entre outros fungos patognicos (Calzavara-

Pinton et al., 2012), e se mostrou vantajosa por ser um mtodo no invasivo, de baixo custo, alm de

representar uma alternativa promissora contra a resistncia dos microrganismos aos antibiticos. O

uso de azul de metileno no tratamento de dermatites, parasitoses cutneas e inativao de agentes

infecciosos em bancos de sangue tm sido extensivamente descrito e recomendado (Wainwright e

Baptista, 2011).

O AM fotoativado induz apoptose em clulas de cncer de pulmo (Lim et al., 2013) e em

melanomas (Chen et al., 2008) a partir de uma srie de reaes desencadeadas pela gerao de

EROs, resultando em reduo do potencial de membrana mitocondrial, comprometimento da cadeia

transportadora de eltrons e ativao da apoptose pela via intrnseca dependente de caspase-3. Em

modelos de camundongos para a doena de Alzheimer, a administrao de AM protegeu os animais

contra o dficit cognitivo, deposio de placa beta-amilide no hipocampo e crtex adjacente, alm

de restaurar os nveis de metablitos relacionados com o metabolismo mitocondrial (Paban et al.,

2014). Em suma, h diversas aplicaes do uso do AM.

21

Neste trabalho, o AM fotoativado foi empregado como agente indutor de estresse oxidativo

em clulas HEK293, como descrito em maiores detalhes em Materiais e Mtodos.

22

2. Objetivos

Dentro do contexto apresentado na Introduo, nosso objetivo entender as interaes

funcionais que contribuem para a estabilidade genmica e funcional da mitocndria em clulas

humanas. Para isso, propomos os seguintes objetivos especficos:

2.1. Estabelecer linhagens celulares de HEK293 knockdown para as protenas p53, ATM, mTOR e

PGC1.

2.2. Estudar o papel de p53 para a toxicidade do azul de metileno usando linhagens celulares de

HEK293 p53 knockdown.

23

3. Materiais e mtodos

3.1. Cultivo celular

Clulas humanas HEK293 (Human Embrionic Kidney 293), obtidas atravs de uma doao do

Laboratory of Molecular Gerontology, NIA, NIH, EUA, foram rotineiramente cultivadas em meio de

cultura Dulbecos Modified Eagle Medium - DMEM contendo 25 mM de glicose (LGC Biotecnologia),

10% de soro fetal bovino (GIBCO), 100 U/mL de penicilina e 100 g/mL de streptomicina. O meio de

cultura contendo todos esses aditivos passa a ser denominado meio completo a partir de agora. As

culturas foram mantidas em incubadora a 37 C e a 5% de CO2, em uma atmosfera mida.

A manuteno da cultura era realizada sempre que a mesma atingia 80 a 90% de confluncia.

Para isso, o meio era removido por suco, utilizando pipetas Pasteur acopladas em bomba a vcuo,

e a cultura lavada com Phosphate Buffered Saline - PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM,

KH2PO4 1,5 mM pH 7,6) estril a 37 C. Em seguida, as clulas eram dissociadas pela adio de 300 L

de tripsina 0,25 % (m/v) a 37 C por cerca de 2 minutos ou at se desprenderem do substrato onde

estavam sendo cultivadas. Aps essa etapa, as clulas eram ressuspendidas em meio completo,

diludas de 5 a 10 vezes e novamente plaqueadas e mantidas em incubadora. A esse procedimento

padro denominamos repicagem.

3.2. Silenciamento gnico

O silenciamento da expresso dos genes escolhidos foi obtido pela transfeco de clulas

HEK293 com vetores plasmidiais expressando short hairpin RNAs (shRNAs) especficos para cada

gene (Hush shRNA plasmid 29-mer, OriGene Technologies, EUA). Este sistema de silenciamento

gnico consiste de um conjunto de 1 vetor controle vazio (sem a sequncia codificadora do shRNA), 1

vetor controle com a sequncia codificadora embaralhada e 4 vetores com diferentes sequncias

codificadoras de shRNA contra o alvo especfico. Dessa forma, foram gerados inicialmente seis

linhagens transfectadas para cada protena cuja expresso desejamos diminuir (ATM, mTOR, PGC1

e p53), resultando num total de 24 linhagens. Os mapas dos vetores plasmidiais utilizados neste

trabalho esto representados na Figura 3.1, identificando o stio de insero do shRNA especfico,

quando for o caso, e a sequncia codificadora dos shRNAs est apresentada na Tabela 3.1.

Para a gerao das linhagens celulares silenciadas, clulas HEK293 mantidas em cultura com

meio completo tiveram o meio removido e, ento, foram lavadas com PBS estril. Em seguida, a

cultura foi tratada por 2 minutos com tripsina pr-aquecida a 37 C em banho-maria at as clulas se

desprenderem. As clulas foram ressuspendidas em meio completo, contadas em cmara de

Neubauer, semeadas (3,0 x 105 clulas/poo) em placas de 6 poos, em um volume de 2 mL de meio

completo e mantidas em incubadora por 24 horas (ou at atingir 50% de confluncia).

24

Figura 3.1. Mapa dos vetores pGFP-V-RS e pRFP-C-RS. Abreviaes: U6 Pr, promotor do pequeno RNA nuclear U6; SV40 Pr, promotor de SV40; Puror, gene de resistncia a puromicina N-acetil transferase; LTR, repetio terminal longa retroviral; TGFP, protena fluorescente verde turbo; RFP, protena fluorescente vermelha; CMV Pr, promotor de citomegalovrus; MCS, stio mltiplo de clonagem; Kanr, gene de resistncia a kanamicina; Camr, gene de resistncia ao cloranfenicol. (Traduzido de Hush shRNA plasmid 29-mer Application Guide, OriGene Technologies, EUA)

Tabela 3.1. Linhagens obtidas expressando shRNA. Sequncia codificadora dos shRNAs utilizados precedida pelo nome das linhagens geradas a partir da transfeco com os respectivos vetores plasmidiais.

Nome da linhagem Sequncia codificadora de shRNA

ATM KD1 GAA GTA GAA GGA ACC AGT TAC CAT GAA TC

ATM KD2 CTG GAG TTT CTG AAG TCA ATG GCA TGA TG

ATM KD3 AGT TTA CCT AAC TGT GAG CTG TCT CCA TT

ATM KD4 TGA TGA GGT GAA GTC CAT TGC TAA TCA GA

mTOR KD1 TAC GAC CTG AGC CGT CAG ATT CCA CAG CT

mTOR KD2 GCA GGT GGA TGC CAC AGT CTT CAC TTG CA

mTOR KD3 GCC GCA TTG TCT CTA TCA AGT TAC TGG CT

mTOR KD4 GTG GCT CTG AAT GAC CAG GTG TTT GAG AT

p53 KD1 CAG CCA AGT CTG TGA CTT GCA CGT ACT CC

p53 KD2 CCG GAC GAT ATT GAA CAA TGG TTC ACT GA

p53 KD3 CTC CTC AGC ATC TTA TCC GAG TGG AAG GA

p53 KD4 CTC AGA CTG ACA TTC TCC ACT TCT TGT TC

PGC1- KD1 TGC TTC CAC CAA GAG CAA GTA TGA CTC TC

PGC1- KD2 GAT AGA TGA AGA GAA TGA GGC AAA CTT GC

PGC1- KD3 CTC TTA CTG GCA CCA GCC AAC ACT CAG CT

PGC1- KD4 CAG GAG GCA GAA GAG CCG TCT CTA CTT AA

25

A preparao do vetor plasmidial e o procedimento para a transfeco foram realizados 24

horas aps o plaqueamento das clulas, seguindo as recomendaes do fabricante. Os diferentes

vetores foram inseridos nas clulas selvagens atravs do uso do reagente lipoflico Lipofectamina

2000 (Invitrogen). Durante o procedimento de transfeco, para cada vetor utilizado foram

preparados dois tubos de reao, como descrito na Tabela 3.2.

As solues dos tubos 1 e 2 foram combinadas, misturadas gentilmente e incubadas por 20

minutos em temperatura ambiente. O meio de cultura das clulas plaqueadas foi trocado por meio

DMEM sem soro e antibiticos, e a soluo resultante da mistura dos dois tubos foi adicionada a

cada poo correspondente. Em seguida, as placas com as culturas recm-transfectadas foram

transferidas para a incubadora, nas condies padro. Doze a dezoito horas aps a adio dos

vetores, o meio de incubao foi suplementado com a adio de soro fetal bovino e antibitico

suficiente para atingir a mesma concentrao do meio completo. Quando atingiram a confluncia, as

clulas foram repicadas e transferidas para garrafas de cultura contendo meio completo e 0,5 g/mL

do antibitico de seleo, a puromicina. A partir deste ponto, as culturas transfectadas foram

mantidas nessas condies.

Tabela 3.2. Reao de transfeco. Os reagentes foram adicionados aos tubos 1 e 2 nos volumes indicados, segundo instrues do fabricante (OriGene Technologies, EUA).

DMEM Vetor (100 ng/l) Lipofectamina Total

Tubo 1 40 L 10 L - 50 L

Tubo 2 47,5 L - 2,5 L 50 L

Uma vez que os vetores plasmidiais utilizados codificam as protenas fluorescentes verde

(GFP) e vermelha (RFP), a eficincia das transfeces foi estimada pela visualizao das culturas em

microscpio de fluorescncia Nikon Eclipse TE300 Inverted Fluorescence Microscope (Japo). Apenas

culturas que apresentavam mais de 50% das clulas expressando as protenas fluorescentes foram

mantidas.

3.3. Seleo de linhagens knockdown

Os vetores plasmidiais usados para a transfeco contm uma sequncia que codifica para a

enzima puromicina-N-acetil transferase (como mostrado na Figura 3.1), a qual confere resistncia ao

antibitico puromicina e est sob o controle de um promotor forte, o SV40 early promoter. Dessa

maneira, ao adicionarmos puromicina ao meio de cultura apenas as clulas que incorporaram o

plasmdeo e expressam seus genes sobrevivero. Este procedimento garante a seleo de clulas nas

quais a integrao e expresso dos genes de interesse ocorre de forma eficiente, nesse caso o shRNA

alvo-especfico. Para selecionarmos clulas com expresso estvel do shRNA por tempo prolongado

foi feito uso contnuo do antibitico, cujas concentraes variaram gradualmente de 0,5 g/mL (em

passagens iniciais) at 2,0 g/mL aps um nmero maior de repicagens da cultura, mantendo a

presso seletiva.

26

3.4. Avaliao da porcentagem de silenciamento

Com o objetivo de avaliar a eficincia do silenciamento gnico obtido pelo uso dos vetores

expressando os shRNAs especficos, ns quantificamos as protenas p53, ATM e mTOR pela

metodologia de western blotting. Uma vez que os anticorpos comerciais disponveis para a protena

PGC1 humana no so sensveis o suficiente para a deteco da protena endgena (Marcus

Cooper, Boston University, EUA, comunicao pessoal), o silenciamento da expresso deste gene foi

feito verificando os nveis de mRNA de PGC1 atravs de PCR quantitativo utilizando DNAc. As

metodologias aplicadas esto descritas logo abaixo.

3.4.1. Extrao de protenas

Clulas em cultura tiveram seus meios de cultura removidos, foram lavadas com PBS e

tripsinizadas em seguida. As clulas foram, ento, coletadas e ressuspendidas em tampo de

extrao RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; SDS 0,05%; desoxicolato de sdio 0,5%; NP40

0,5%) acrescido de inibidor de proteases Protease inhibitor cocktail tablets (Roche), na diluio final

de 1X. Este material recebeu trs pulsos de ultrassom de 100 W (Vibra-Cell VC 505, EUA) com 15

segundos de durao e intervalos intercalados de 15 segundos, em banho de gelo. Aps esse

procedimento as amostras foram centrifugadas a 15.000 g durante 20 minutos e o sobrenadante

contendo as protenas foi coletado. As protenas foram quantificadas utilizando reagente de Bradford

(Quick Start Bradford 1x Dye Reagent, Bio-Rad) segundo recomendaes do fabricante. Para essa

finalidade foi utilizada microplaca transparente de 96 poos (Greiner Bio-one, Brasil) e a leitura da

absorvncia a 595 nm foi realizada em espectrofotmetro SpectraMax M3 (Molecular Devices). A

curva-padro para a quantificao de protenas foi construda utilizando gamma globulina bovina

(Bio-Rad).

3.4.2. Preparo das amostras e SDS-PAGE

As protenas foram separadas por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-

PAGE). O gel para empacotamento continha acrilamida: bis-acrilamida (37,5:1) 6%, Tris-HCl 300 mM

pH 6,8; SDS 0,1%; persulfato de amnio 0,1%; 1 L\mL de TEMED. O gel de separao continha

acrilamida: bis-acrilamida (37,5:1) 8% (mTOR e ATM) ou 15% (p53); Tris-HCl 380 mM pH 8,8; SDS

0,1%; persulfato de amnio 0,1%; 0,4 L\mL de TEMED. Os extratos proteicos foram acrescidos de

tampo de amostra (Tris-HCl 40 mM pH 6,8; glicerol 8%; SDS 2%; DTT 100 mM; azul de bromofenol

0,1%), contendo 10% (V/V) do agente redutor -mercaptoetanol, aquecidos a 95 C por 10 minutos e

aplicados no gel. As amostras foram separadas em tampo de corrida (Novex Tris-Glycine SDS

Running Buffer, Invitrogen) pela aplicao de uma voltagem de 110 V por cerca de 2 horas, ou at

que a frente de corrida atingisse o final do gel.

27

3.4.3. Transferncia e revelao

Aps a separao das protenas por SDS-PAGE, as mesmas foram transferidas para

membrana de PVDF (polivinidileno difluoreto, GE Healthcare) em tampo de transferncia (Novex

Tris-Glycine Transfer Buffer, Invitrogen) a uma voltagem constante de 90 V, durante 90 minutos, em

banho de gelo. Ao final da transferncia a membrana foi bloqueada, durante 2 horas, por incubao

em 10 mL de soluo tampo TBS-T (Tris-HCl 10 mM pH 7,6; NaCl 150 mM; Tween 0,05%) contendo

5% (m/V) de leite desnatado, sob condies de leve agitao a 25 C.

A membrana bloqueada foi incubada com o anticorpo primrio por 12 horas em soluo de

TBS-T contendo 0,1% (m/V) de leite desnatado e sob leve agitao, a 4C. Nesse trabalho, foram

usados os anticorpos primrios anti-p53 (clone DO-7, Dako, diluio 1:5000 ou clone B20.1, Santa

Cruz, diluio 1:500), anti-ATM (clone 1B10, Santa Cruz, diluio 1:500), anti-mTOR (lote 4, Cell

Signaling, diluio 1:500), anti-PCNA (clone F-2, Santa Cruz, diluio 1:500). Aps a incubao com o

anticorpo primrio a membrana foi submetida a 3 lavagens de 15 minutos em TBS-T, sendo em

seguida transferida para uma soluo contendo o anticorpo secundrio diludo 1:5000 em soluo de

TBS-T contendo 0,1% (m/V) de leite desnatado por 2 horas com agitao leve. Os anticorpos

secundrios conjugados com Horse Radish Peroxidase (HRP) foram: anti-mouse (sc 2047, Santa Cruz),

anti-rabbit (sc 2034, Santa Cruz). O excesso de anticorpo secundrio foi removido atravs de 3

lavagens da membrana com TBS-T.

Para a revelao do western blot foi usado o reagente ECL Western Blotting Detection System

(GE Healthcare), o qual se baseia no princpio da quimioluminescncia produzida pela reao de

oxidao de um composto derivado do luminol pela enzima HRP conjugada ao anticorpo

secundrio na presena de perxido, em meio alcalino. O sinal produzido foi capturado pela

exposio das membranas ao filme radiogrfico Amershan Hyperphilm ECL (GE Healthcare), e as

imagens obtidas foram escaneadas e analisadas com o programa ImageQuant (Amershan

Biosciences).

3.4.4. Extrao de RNA total

A extrao de RNA total foi realizada utilizando o reagente TRIzol LS (Invitrogen), segundo

as instrues do fabricante, com pequenas modificaes. As culturas celulares foram crescidas em

placas de 100 cm2 at atingirem a confluncia. Aps o meio ter sido removido, foram adicionados 5

mL de TRIzol LS diretamente sobre a cultura. A mistura foi homogeneizada por 15 minutos

temperatura ambiente e o lisado resultante transferido para tubos de 15 mL. Foi acrescentado 1 mL

de salina 0,9% m/V (NaCl em gua tratada com dietilpirocarbonato DEPC) e 1 mL de clorofrmio. O

tubo foi agitado com vigor por 15 segundos e as amostras incubadas por 2 a 3 minutos em

temperatura ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12.000 g durante 15 minutos em

centrfuga refrigerada e, ao final, os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos. Para a

precipitao do RNA foram adicionados 5 mL de isopropanol e as amostras incubadas overnight em

freezer a -20 C. Posteriormente, seguiu-se outro passo idntico de centrifugao, aps o qual o

sobrenadante foi descartado. O precipitado resultante foi lavado duas vezes com etanol 75% em

gua tratada com DEPC e centrifugado por 5 minutos a 8.000 g, sob refrigerao. O precipitado

28

contendo RNA foi suspendido em gua tratada com DEPC, aliquotado e armazenado em freezer a -80

C.

A integridade do RNA foi verificada submetendo as amostras eletroforese em gel de

agarose 2% (m/V) em tampo TAE (Tris base 40 mM, EDTA 1 mM, cido actico para pH 8,0).

Posteriormente, o gel foi incubado em soluo contendo brometo de etdeo (2 g/mL) e, ento,

analizado no equipamento Typhoon Trio (GE Healthcare), utilizando os filtros de 526 nm e 610 nm

para excitao e emisso, respectivamente.

3.4.5. Reaes de Transcrio Reversa e amplificao quantitativa do DNAc (qRT-PCR)

As amostras de RNA total foram tratadas com RQ1 RNase-Free DNase (Promega, EUA),

segundo as instrues do fabricante, com o objetivo de eliminar qualquer contaminao com DNA

genmico antes da sntese do DNA complementar (DNAc) de fita simples. A sntese de DNAc foi

realizada com a utilizao do kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems,

EUA), tambm seguindo as especificaes do fabricante. As reaes foram realizadas em volumes de

20 l utilizando cerca de 2 g de RNA total.

A anlise da expresso do mRNA do gene PGC1 foi realizada pela execuo do PCR

quantitativo em tempo real (qRT-PCR), utilizando 100 ng de amostras de DNAc das culturas controle

e transfectadas com shRNA contra o alvo PGC1 . Para esse experimento foram montadas reaes de

20 l utilizando Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, EUA) e as amplificaes

foram realizadas no equipamento 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, EUA), ambas

seguindo especificaes do fabricante. Durante a reao de quantificao relativa utilizamos como

controle endgeno a amplificao de mRNA para -actina e fosfoglicerato cinase 1 (PGK1). A

sequncia dos primers utilizados para as reaes de amplificao est descrita na Tabela 3.3. A

anlise dos dados seguiu a equao proposta por Pfaffl (Pfaffl, 2001).

3.4.6. Validao dos primers

Anteriormente s reaes de qRT-PCR dos transcritos do gene PGC1 foi realizada a

validao dos primers utilizados para a determinao da eficincia e especificidade de amplificao.

Para tal anlise, foi utilizada uma amostra de DNAc da linhagem controle para PGC1 . A partir de

diluies seriadas, foram preparadas reaes de PCR na qual foram utilizados 1, 10 e 100 ng de

DNAc, em triplicata. Todas as reaes foram montadas utilizando os mesmos reagentes e

equipamentos descritos acima.

29

Tabela 3.3. Primers utilizados no qRT-PCR. As sequncias dos pares de primers utilizados na quantificao relativa dos transcritos do gene PGC1 esto descritas abaixo.

Nome do primer Sequncia de nucleotdeos

PGC1 Forward AGA CAC CGC ACG CAC CGA AAT

PGC1 Reverse AGC TGT CAT ACC TGG GCC GAC G

PGK1 Forward GAA GCG GGT CGT TAT GAG AG

PGK1 Reverse AAT TTG ATG CTT GGG ACA GC

-Actina Forward CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT

-Actina Reverse AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG

3.5. Seleo clonal

Aps as avaliaes do grau de silenciamento por shRNA, descritas nos tpicos anteriores,

foram selecionadas linhagens clonais para cada produto gnico em estudo. A seleo clonal

necessria para obteno de uma populao geneticamente homognea, uma vez que o plasmdeo

de silenciamento integra no genoma nuclear das clulas transfectadas de forma aleatria. Isso reduz

derivaes genticas na populao e, portanto, contribui para diminuir as variaes experimentais. O

tcnica utilizada neste trabalho para a gerao dos clones consiste em semear as clulas em uma

densidade de 1 clula/poo em placa de 96 poos e cultiv-las em meio completo seguindo o

procedimento padro. Dessa maneira, espera-se que alguns poos recebam somente uma nica

clula capaz de se multiplicar e gerar uma colnia.

As linhagens celulares que apresentaram maiores ndices de silenciamento gnico foram

selecionadas, juntamente com seu par controle, e submetidas ao procedimento de seleo clonal,

como descrito acima. As placas de 96 poos contendo as clulas foram mantidas em incubadora por

cerca de 10 dias. Ao final desse perodo as culturas foram observadas ao microscpio tico, e os

poos que apresentaram colnias individualizadas foram expandidos. Os clones obtidos foram

cultivados e, novamente, avaliados quanto ao silenciamento gnico atravs de western blotting,

como j descrito anteriormente.

3.6. Curva de crescimento utilizando o sistema xCELLigence

A cintica de crescimento celular para dois clones p53 knockdown e seu respectivo controle

foi obtida utilizando o equipamento xCELLigence (Roche, EUA), seguindo as recomendaes

indicadas pelo fabricante. Nessa metodologia possvel verificar a quantidade de clulas em tempo

real com medidas de impedncia celular, monitoradas pelo equipamento, atravs da interface com a

placa eletrnica. Em uma placa eletrnica (E-plate, Roche) de 96 poos foram semeadas 6 x 103

clulas/poo em meio completo contendo 25 mM de glicose ou 25 mM de galactose. O meio foi

tambm suplementado com piruvato e uridina na concentrao final de 0,1 g/l. As culturas foram

mantidas at a saturao das curvas de crescimento e medidas da impedncia celular, apresentadas

como cell index, foram realizadas em tempo real. Foi realizado um experimento contendo quatro

repeties tcnicas seguidos de anlise por teste t para as mdias obtidas.

30

3.7. Medida do consumo de oxignio por clulas em cultura

As medidas das taxas de consumo de oxignio e a acidificao do meio de cultura em clulas

aderidas foram realizadas utilizando o equipamento Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer

(Seahorse Bioscience, EUA). O aparato contm dois eletrodos, um sensvel a mudanas no pH e outro

sensvel a mudanas na concentrao de oxignio. A taxa de acidificao do meio extracelular

proporcional taxa de produo de lactato pela gliclise funcionando, portanto, como uma medida

desta via. O eletrodo de oxignio mede a concentrao de oxignio dissolvido no meio extracelular,

que diretamente proporcional ao consumo de oxignio pelas clulas, e permite inferir a taxa de

fosforilao oxidativa.

As clulas foram semeadas em XF24-well cell culture microplates (Seahorse) numa densidade

de 3 x 104 clulas/poo e incubadas por 24 horas a 37 C. Foi utilizado meio de cultura DMEM

completo contendo 10 mM de glicose ou galactose, ambos suplementados com piruvato e uridina na

concentrao final de 0,1 g/l. Antes do ensaio no Seahorse, as clulas foram incubadas por 1 hora

sem CO2 em meio completo sem bicarbonato de sdio. Uma vez dentro do equipamento, todo o

processo automatizado, iniciando-se na ausncia de inibidores da respirao mitocondrial para

estabelecer a linha de base. Medidas adicionais foram realizadas aps a injeo de quatro compostos

que afetam a capacidade bioenergtica: oligomicina (1 M) na porta A, CCCP (1 M) na porta B, e

uma mistura de antimicina e rotenona na porta C, ambas na concentrao de 1 M. Os

experimentos foram realizados medindo-se simultaneamente as taxas de consumo de O2 e a

acidificao do meio em tempo real atravs da mdia de 5 a 7 replicatas tcnicas para cada

tratamento, em dois ensaios independentes. Os dados so apresentados como porcentagem em

relao linha de base. Foi realizado teste t para comparar a funo mitocondrial na linhagem

controle Ctrl1 clone na presena de glicose ou galactose.

3.8. Proliferao celular aps o tratamento com o corante azul de metileno fotossensibilizado

Para avaliar o efeito citosttico e citotxico do tratamento com azul de metileno (AM)

fotossensibilizado utilizamos a medida da proliferao celular em 24 horas aps o tratamento. Para

isso, 1,5 x 105 clulas/poo foram semeadas em placa de 24 poos, em meio completo. No dia

seguinte, as solues de AM, em meio DMEM High Glucose sem soro ou antibiticos, foram

preparadas nas concentraes de 50, 25, 10, 5, 1 e 0,5 M a partir de diluies seriadas.

Imediatamente antes do tratamento, o meio completo das culturas foi removido e cada poo lavado

com tampo PBS estril. Deste passo adiante, todo o procedimento realizado no escuro, utilizando

apenas luz azul indireta. Neste ponto, foram fixados trs poos com soluo de cido tricloroactico

(TCA) 10%, para a determinao da populao inicial no momento do tratamento. Os outros poos

receberam somente DMEM (controle) ou DMEM + AM, em triplicata. As placas foram mantidas em

incubadora durante 30 minutos para haver a incorporao do corante. Em seguida, o meio contendo

AM foi removido e as culturas lavadas duas vezes com PBS estril, sendo que na segunda lavagem

manteve-se o PBS. As placas foram ento irradiadas com LED vermelho ( 700 nm) por 30 minutos,

a 12 centmetros de distncia das clulas, que corresponde a uma energia de 4,24 J cm-2 min-1.

31

Aps a fotossensibilizao do AM, o PBS foi substitudo por meio completo e as placas

mantidas em incubadora por 24 horas. Ao final desse tempo o meio de cultura foi removido, as

culturas lavadas com PBS e fixadas com TCA 10%.

A proliferao celular aps o tratamento com AM foi verificada atravs da quantificao do

contedo de cidos nucleicos em espectrofotmetro Spectra Max M3 (Molecular Devices, EUA), pela

leitura da absorbncia a 260 nm. Para essa finalidade, as clulas fixadas foram lisadas com soluo de

hidrxido de sdio 1 M e homogeneizadas para a liberao do contedo celular antes das respectivas

quantificaes. A medida da proliferao celular foi calculada da seguinte forma:

absorbncia das culturas tratadas com AM menos

absorbncia da cultura fixada antes do tratamento

absorbncia da cultura no tratada com AM fixada 24 h aps a irradiao menos

absorbncia da cultura fixada antes do tratamento

Foi realizado outro experimento para avaliar o efeito sobre a proliferao celular da induo

de estresse oxidativo utilizando AM, entretanto, desta vez foi usada a linhagem HEK293 selvagem, na

presena de pifitrina-. Foram plaqueadas 105 clulas/poo em trs placas de 24 poos em meio de

cultura completo. Aps 12 horas de incubao uma das placas foi tratada com pifitrina- a uma

concentrao de 10 M, permanecendo por 24 horas nessa condio at momento do tratamento

com AM. Passadas 36 horas do plaqueamento, as trs placas foram tratadas com azul de metileno

nas concentraes de 50, 25, 10, 5, 1 e 0,5 M de forma semelhante ao tratamento citado

anteriormente. Ao final do tratamento com AM, a placa que havia recebido pifitrina- foi preenchida

com meio completo apenas. Uma segunda placa recebeu agora o mesmo tratamento com pifitrina-

a 10 M e a terceira placa foi utilizada como controle, sem pifitrina-. Aps 24 horas do tratamento

com azul de metileno, as clulas foram fixadas com TCA 10%, lisadas com soluo de NaOH 1 M,

homogeneizadas e o contedo de cidos nucleicos foi quantificado e analisado como descrito

anteriormente.

3.9. Quantificao do nmero relativo de cpias de DNAmt

Para a quantificao do nmero de cpias de DNAmt, o DNA total das clulas em cultura foi

extrado com o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Alemanha), segundo as recomendaes do

fabricante. O DNA, ao final da extrao, foi suspenso em 100 l de tampo AE, fornecido juntamente

com o kit utilizado, e quantificado em espectrofotmetro NanoDrop 1000 Spectrophotometer

(Thermo Scientific) a 260 nm. As reaes de PCR (volume final de 25 l) foram montadas utilizando,

cada uma, 20 ng de DNA total e a mistura de reao provida pelo Power SYBR Green PCR Master

Mix (Applied Biosystems, EUA), seguindo instrues do fabricante. Os experimentos foram realizados

no equipamento 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, EUA). Foram utilizados primers

que amplificam um pequeno fragmento no interior do gene mitocondrial NADH desidrogenase

subunidade 1 (ND1) e do gene nuclear hipoxantina fosforibosiltransferase 1 (HPRT1), cujas

sequncias esto descritas na Tabela 3.4. A determinao do nmero de cpias de DNAmt foi obtida

32

pela quantificao relativa entre os fragmentos amplificados mitocondrial e nuclear. A anlise dos

dados seguiu a equao proposta por Pfaffl (Pfaffl, 2001). Aps a realizao de 3 experimentos

independentes, foi realizado teste t para comparar as mdias obtidas.

Tabela 3.4. Primers utilizados para a quantificao do DNAmt. As sequncias dos pares de primers utilizados na obteno de nmero relativo de cpias de DNAmt esto descritas abaixo.

Nome do primer Sequncia de nucleotdeos

ND1 Forward ACT ACG CAA AGG CCC CAA CG

ND1 Reverse GAG CTA AGG TCG GGG CGG TG

HPRT1 Forward TGA CAT GTG CCG CCT GCG AG

HPRT1 Reverse GTG GTC GCT TTC CGT GCC GA

3.10. Identificao da populao sub-G1 por citometria de fluxo

A determinao da induo de apoptose foi feita pela medida da populao sub-G1 em

clulas tratadas com AM, atravs de anlises em citmetro de fluxo utilizando o agente intercalante

de DNA iodeto de propdeo (Sigma). Para esses experimentos, foram utilizados dois clones p53

knockdown e um clone controle. As clulas foram plaqueadas numa densidade de 3 x 105

clulas/poo em placa de 6 poos, em meio completo. As placas utilizadas ao longo do experimento

foram previamente tratadas com polilisina para melhorar a adeso celular, evitando perda de clulas

durante as trocas de meio e lavagens com PBS. Aps 48 horas em cultura, as clulas foram tratadas

com AM e irradiadas, como descrito anteriormente. Neste experimento foram utilizadas trs

concentraes do corante: 1, 5 e 25 M.

Ao final de 24 horas aps o tratamento com AM, o meio de cultura foi transferido para tubos

de 15 mL e as clulas foram lavadas duas vezes com tampo PBS, sendo que o PBS tambm foi

recolhido. As clulas que estavam aderidas foram desprendidas com o uso de tripsina e transferidas

para os respectivos tubos contendo o meio de cultura e PBS previamente recolhidos. Os tubos foram

centrifugados a 1.000 g por 10 minutos, o precipitado celular resultante foi suspenso em 1 mL de PBS

e, ento, transferido para microtubos. Esses foram submetidos a uma nova centrifugao (1000 g, 10

minutos) e os precipitados foram suspensos em etanol 70% gelado e armazenados a -20 C at o dia

da anlise no citmetro.

No dia da anlise de citometria, amostras foram centrifugadas a 3.200 g por 15 min a 4 C, e

o precipitado foi suspenso em 1 mL de PBS. A amostra foi novamente centrifugada a 3.200 g por 15

min a 4 C, e o precipitado suspenso em 300 L de soluo contendo PI (RNAse A 200 g/mL, PI 20

g/mL, Triton-X 100 0,1 % em PBS). As amostras foram mantidas por 1 hora a temperatura ambiente

e protegidas da luz. O material foi ento analisado no citmetro de fluxo Guava PCA-96 System

(Millipore, EUA). Os resultados foram analisados com o software CytoSoft 5.1 (Millipore, EUA). Foram

realizados trs experimentos independentes, em triplicata. Os resultados obtidos foram analisados

pela ANOVA.

33

4. Resultados

4.1. Gerao de linhagens celulares HEK293 knockdown para ATM, mTOR, p53 e PGC1

O objetivo inicial deste estudo foi gerar linhagens de clulas humanas que apresentem uma

diminuio constitutiva na expresso de quatro protenas que podem estar envolvidas na modulao

de atividades de reparo de DNA, e nas respostas a leses no DNA mitocondrial em clulas humanas.

Para isso, propusemos utilizar RNAs inibidores especficos para cada protena de interesse,

constitutivamente expressos na forma de shRNAs codificados em plasmdeos selecionveis atravs

de resistncia a antibiticos. Para cada gene de interesse foram realizadas seis transfeces

independentes: dois controles negativos, o plasmdeo vazio e o plasmdeo codificando um shRNA de

sequncia embaralhada, que no reconhece nenhum alvo no transcriptoma humano; e 4 plasmdeos

com sequncias distintas especficas para os mRNA das protenas ATM, mTOR, p53 e PGC1 . Os

plasmdeos foram obtidos da OriGene Technologies, EUA, e foram descritos na seo de Materiais e

Mtodos.

Os procedimentos de transfeco e seleo das culturas foram realizados como descrito em

Materiais e Mtodos, e a eficincia das transfeces foi verificada por microscopia de fluorescncia

de cada cultura, uma vez que os plasmdeos utilizados tambm expressam as protenas fluorescentes

green fluorescent protein (GFP) ou red fluorescent protein (RFP), como indicado. Imagens

representativas de uma dessas anlises esto apresentadas na Figura 4.1. Aps seleo com

puromicina por 3-5 passagens, os nveis de inibio da expresso dos alvos foram verificados em

extratos celulares totais, como descrito a seguir.

Figura 4.1. Eficincia de transfeco em clulas HEK293. Culturas de clulas HEK293 transfectadas

com plasmdeos de silenciamento gnico e que expressam a protena GFP foram observadas em

microscpio de fluorescncia. As imagens das clulas com aumento de 200 X foram adquiridas em (a)

fase clara, (b) sob luz fluorescente para evidenciar a protena GFP e, ento, (c) foram sobrepostas

para analisar a eficincia de transfeco.

34

4.1.1. Expresso de ATM em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene

Os nveis da protena ATM nas linhagens controle e knockdown foram quantificados por

western blotting, e os resultados esto mostrados na Figura 4.2. Comparadas ao controle ATM Ctrl1

(plasmdeo vazio), todas as sequncias de shRNA induziram a diminuio na expresso de ATM. No

entanto, a eficincia de reduo da expresso de ATM variou significativamente entre as 4

sequncias especficas utilizadas, de cerca de 20% de silenciamento para a sequncia KD2 at mais

de 90% em clulas transfectadas com a sequncia KD4. Esta ltima foi a mais efetiva no

silenciamento da expresso de ATM e foi, portanto, escolhida para experimentos posteriores.

Figura 4.2. Eficincia de silenciamento da expresso de ATM por shRNA. Os nveis proteicos de ATM em clulas HEK293 expressando constitutivamente shRNA contra o mRNA que codifica para essa protena foram verificados por western blotting. A intensidade da banda referente a ATM na linhagem ATM Ctrl1, expressando o plasmdeo vazio, foi considerada 100% de expresso. ATM Ctrl2 expressa a sequncia do shRNA embaralhada. ATM KD1 a KD4 so as linhagens celulares knockdown (KD) para ATM e expressam, cada uma, uma sequncia diferente de shRNA. Neste experimento, 50 g de extrato proteico foram utilizados. A intensidade das bandas foi quantificada usando o programa ImageJ; os dados apresentados no grfico representam a quantificao de 1 experimento.

Aps a identificao da linhagem com a maior reduo na expresso de ATM (KD4), medimos

o efeito dessa reduo na proliferao celular. Para isso, realizamos curvas de crescimento das

linhagens ATM Ctrl1 e ATM KD4. Os resultados esto apresentados na Figura 4.3. As curvas obtidas

indicam que a reduo nos nveis de ATM causou uma diminuio significativa na taxa de

crescimento celular, o que se reflete nos tempos de duplicao da populao (population doubling

35

time, PDL) obtidos a partir das curvas: 18,72 horas ( 1,77) para ATM Ctrl1 e 20,86 horas ( 1,56) para

ATM KD4.

Figura 4.3. Curvas de crescimento das linhagens ATM Ctrl1 e ATM KD4. 1,0 x 104 clulas de cada linhagem foram semeadas no tempo 0, e a densidade da populao foi acompanhada por 5 dias, monitorando-se o nmero de clulas a cada 24 h por contagem direta em cmara de Neubauer. Os resultados so de um experimento em triplicata e cada ponto representa as mdias erro. (*) e (**) indicam, respectivamente, valores de p < 0,05 e p < 0,01.

4.1.2. Expresso de mTOR em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene

Os nveis da protena mTOR nas linhagens controle e knockdown so mostrados na Figura

4.4. Similarmente ao que foi observado para as linhagens silenciadas para ATM, comparadas ao

controle mTOR Ctrl2 (sequncia embaralhada do shRNA), os 4 diferentes shRNAs para mTOR

apresentaram eficincias distintas de silenciamento, variando de cerca de 30% para o shRNA mTOR

KD4 at cerca de 70% para o mTOR KD2. Esta linhagem apresentou 73% de silenciamento comparado

ao mTOR Ctrl2 e 67% quando comparado ao mTOR Ctrl1. A sequncia KD2 foi a mais efetiva no

silenciamento da expresso de mTOR e foi, portanto, escolhida para os experimentos subsequentes.

Depois da seleo da linhagem com maior reduo da expresso de mTOR, foram realizadas

curvas de crescimento para mTOR Ctrl1 e mTOR KD2, a fim de verificar o efeito da diminuio dessa

protena sobre a proliferao celular. Os resultados esto apresentados na Figura 4.5. As curvas

obtidas demonstram que no houve nenhuma alterao nas taxas de crescimento em clulas com

expresso de mTOR reduzida, visto que os PDLs obtidos foram 17,38 horas (1,44) para mTOR Ctrl1 e

16,38 horas (0,91) para mTOR KD2.

36

Figura 4.4. Eficincia de silenciamento da expresso de mTOR por shRNA. Os nveis proteicos de mTOR em clulas HEK293 expressando constitutivamente shRNA contra o mRNA de mTOR foram verificados por western blotting. mTOR Ctrl1 e mTOR Ctrl2 indicam as linhagens celulares controle contendo o plasmdeo vazio e a sequncia do shRNA embaralhada, respectivamente. A intensidade da banda correspondente a mTOR na linhagem expressando o plasmdeo vazio foi considerada 100% de expresso. mTOR KD1 a KD4 so as linhagens celulares knockdown (KD) para mTOR e expressam, cada uma, uma sequncia diferente de shRNA. Neste experimento, foram utilizados 50 g de extrato proteico. A intensidade das bandas foi quantificada usando o programa ImageJ; os dados apresentados no grfico representam a quantificao de 1 experimento.

Figura 4.5. Curva de crescimento das linhagens mTOR Ctrl1 e mTOR KD2. 1,0 x 104 clulas de cada linhagem foram semeadas no tempo 0, e a densidade da populao foi acompanhada por 5 dias,

37

monitorando-se o nmero de clulas a cada 24 h por contagem direta em cmara de Neubauer. Os resultados apresentados so a mdia desvio de um experimento em triplicata.

4.1.3. Expresso de PGC1 em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene

A deteco da expresso do co-ativador transcricional PGC1 atravs de western blot

pouco confivel, uma vez que os anticorpos disponveis comercialmente apresentam sensibilidade

baixa para os nveis endgenos da protena em clulas humanas (Marcus Cooper, Boston University,

EUA, comunicao pessoal). Desta forma, a expresso de PGC1 nas linhagens knockdown foi

verificada atravs da quantificao relativa dos seus mRNAs atravs de qRT-PCR. Os nveis relativos

de mRNA de PGC1 nas linhagens controle e knockdown foram normalizados pela expresso de dois

mRNAs expressos constitutivamente, -actina e PGK1, e esto apresentados na Figura 4.6. Os

resultados obtidos mostram que, comparados com o controle PGC1 Ctrl1, expressando shRNA de

sequncia embraralhada, todos os 4 shRNAs reduziram a expresso de PGC1 em mais do que 50%.

A sequncia PCG-1 KD3 induziu o maior nvel de reduo na expresso de PGC1 , de 77%,

independente do mRNA utilizado como normalizador.

Figura 4.6. Eficincia de silenciamento da expresso de PGC1 via shRNA. A expresso relativa de PGC1 em clulas HEK293 expressando constitutivamente shRNA contra o mRNA de PGC1 foi verificada por qRT-PCR, utilizando como normalizadores os mRNAs das protenas constitutivas -Actina e PGK1. PGC1 Ctrl1 representa a linhagem celular transfectada com plasmdeo contendo a sequncia de shRNA embaralhada, e foi considerada 100% de expresso de PGC1 . PGC1 KD1 a KD4 so as linhagens celulares knockdown (KD) para PGC1 e expressam, cada uma, uma sequncia diferente de shRNA. Os resultados so a mdia de um experimento em triplicata.

38

4.1.4. Expresso de p53 em linhagens HEK293 silenciadas para esse gene

A ultima srie de shRNAs utilizada foi contra o mRNA da protena p53. Os nveis da protena

p53 nas linhagens controle e knockdown so apresentados na Figura 4.7. Comparadas linhagem

controle p53 Ctrl1 (sequncia embaralhada do shRNA), as 4 sequncias de shRNA apresentaram

eficincias de silenciamento distintas. A linhagem p53 KD1 apresentou, em mdia, reduo de cerca

de 80% de expresso de p53 sendo, portanto, a mais eficaz. As sequncias KD2, 3 e 4 induziram

pouca inibio da expresso de p53, menos de 50%.

Figura 4.7. Eficincia de silenciamento da expresso de p53 via shRNA. Os nveis proteicos de p53 em clulas HEK293 expressando constitutivamente shRNA contra o mRNA de p53 foram verificados por western blotting. A intensidade da banda correspondente a p53 na linhagem p53 Ctrl1, transfectada com a sequncia embaralhada, foi considerada 100% de expresso. p53 KD1 a KD4 expressam, cada uma, uma sequncia diferente de shRNA contra p53. Neste ensaio, foram usados 10 g de extrato proteico. A intensidade das bandas de p53 foi quantificada usando o programa ImageJ; os dados apresentados no grfico representam a mdia erro da quantificao de 2 experimentos.

4.1.5. Seleo clonal de HEK293 silenciada para p53

A criao de linhagens celulares de HEK293 expressando constitutivamente shRNAs contra

p53 produziu diferentes nveis de silenciamento entre as quatro sequncias utilizadas. A sequncia

expressa na linhagem p53 KD1 induziu o maior nvel de silenciamento dentre as quatro utilizadas, de

cerca de 80% de diminuio. Entretanto, importante ressaltar que o nvel de expresso medido no

experimento apresentado na Figura 4.7 representa a mdia da expresso de p53 em uma populao

heterognea expressando, individualmente, diferentes nveis do shRNA alvo-especfico. Esse efeito

bastante conhecido quando da transfeco de clulas de mamferos, uma vez que em cada clula o

39

plasmdeo pode se integrar em stios diferentes do genoma e o nmero de plasmdeos integrados

por clula (aps a transfeco) tambm pode variar. Por isso, dentro da populao pode existir uma

grande variao entre os nveis de expresso do shRNA, uma vez que no um fenmeno controlado

pelo mtodo de transfeco empregado. Dessa maneira, o contedo de shRNA presente em uma

clula ser uma consequncia do nmero de plasmdeos incorporados e do local onde foi integrado

no genoma.

Para eliminar o efeito de variabilidade dentro da populao, como discutido acima,

recomendado realizar a seleo de clones, derivados de uma nica clula. Desta forma, cada clone

geneticamente homogneo e, portanto, mais adequado realizao de experimentos que

pretendem comparar os efeitos da diminuio dos nveis proteicos de p53 em condies

verdadeiramente isognicas. Desta forma, realizamos a seleo de clones, como descrito na seo

3.5 de Materiais e Mtodos, a partir das linhagens p53 Crtl1 e p53 KD1, que apresentou o melhor

silenciamento entre as quatro sequncias testadas. De cada linhagem foram recuperados entre 10-

14 clones, que foram testados para o nvel de expresso de p53. Os resultados de western blotting

para quatro clones knockdown e um clone controle esto mostrados na Figura 4.8.

Figura 4.8. Seleo de clones com alto silenciamento de p53. Quantificao da expresso de p53 em clones de HEK293 derivados de seleo clonal das linhagens p53 Ctrl1 e p53 KD1. Ctrl1 clone representa um clone obtido da linhagem transfectada com plasmdeo contendo a sequncia codificadora do shRNA embaralhada. KD1 clones 1 a 4 so derivadas de seleo clonal da linhagem p53 KD1. Os nveis de p53 foram normalizados pelo contedo de PCNA. Para cada amostra, foram utilizados 10 g de extrato proteico. Os resultados apresentados representam a mdia erro de dois experimentos independentes.

Dos quatro clones analisados, os clones 1, 2 e 4 apresentaram cerca de 50% de

silenciamento, enquanto que o clone 3 apresentou um silenciamento de cerca de 90% da expresso

40

de p53. Aps a caracterizao de clones p53 knockdown mostrados acima, foram selecionados os

clones 1 e 3 para serem utilizados nos experimentos posteriores.

Neste trabalho foram geradas 22 linhagens celulares transfectadas e selecionadas, das quais

16 foram knockdown para as protenas ATM, mTOR, PGC1 e p53 (4 linhagens para cada gene) e 6

linhagens controle, uma vez que alguns controles eram comuns a mais de um conjunto de vetores.

Para a protena p53, foram gerados tambm 33 clones estveis. A reduo da expresso gnica foi

verificada atravs da anlise do contedo de mRNA, para PGC1 , e protena para ATM, mTOR e p53,

atravs das tcnicas de qRT-PCR e western blotting. Os resultados obtidos mostraram uma grande

variao na eficincia de silenciamento de cada gene para os quatro shRNAs utilizados. Esses

resultados indicam que a eficincia do sistema de RNA de interferncia dependente da regio

sobre a qual o shRNA pareia com o seu mRNA alvo. No entanto, em todos os casos obtivemos pelo

menos uma linhagem com reduo da expresso da protena de interesse maior do que 70%, que

podem ser utilizadas em experimentos funcionais.

41

4.2. Estudo do papel de p53 em clulas HEK293 submetidas ao estresse oxidativo mitocondrial

induzido pelo corante Azul de Metileno

A protena p53 controla as respostas celulares a vrios tipos de estresse, incluindo o estresse

oxidativo. Uma dessas possveis respostas inclui a translocao de p53 para a mitocndria

(Marchenko et al., 2000), aonde pode controlar a induo de apoptose ou participar do reparo de

leses oxidadas no DNAmt atravs do estmulo da atividade de DNA polimerase gama (de Souza-

Pinto et al., 2004). Entretanto, a maioria dos estudos j publicados na literatura sobre o papel de p53

em resposta ao estresse oxidativo utilizam linhagens celulares no-isognicas, como linhagens

obtidas de pacientes, o que pode dificultar a interpretao dos resultados devido a variaes

interindividuais comuns. Nesse contexto, as linhagens isognicas com expresso diminuda de p53

geradas neste trabalho constituem excelentes modelos para estudarmos o papel de p53 em resposta

ao estresse oxidativo mitocondrial.

Para esse fim, propomos utilizar o corante fenotiaznico azul de metileno (AM), que quando

fotoativado gera oxignio singlete e radical nion superxido atravs de reaes fotoqumicas do

tipo I e II (Wainwright e Crossley, 2002). Ns demonstramos recentemente (Romagna, 2012) que a

toxicidade de AM est diretamente relacionada ao seu acmulo nas mitocndrias, e depende da

presena de DNA mitocondrial, uma vez que clulas rho-, com diminuio do contedo de DNA

mitocondrial, so menos sensveis aos efeitos citotxicos de AM.

4.2.1. Cintica de proliferao celular em meio de cultura contendo glicose ou galactose

A diminuio da expresso de p53, uma protena que possui papel ativo no controle do ciclo

celular e da morte celular, pode resultar em alteraes na cintica de proliferao. Para verificarmos

essa hiptese, foram realizadas curvas de crescimento com o auxlio do equipamento xCELLigence

(ACEA Biosciences, USA). Atravs dessa metodologia possvel acompanhar o crescimento e

proliferao celular em tempo real, baseado em medidas de impedncia eltrica provocada pelo

contato que as clulas fazem com a superfcie da placa de cultivo.

Utilizando um clone controle e dois clones knockdown, medimos a velocidade de proliferao

celular em meio de cultura contendo glicose ou galactose, como substratos energticos. Este

enfoque experimental foi escolhido para diferenciar os efeitos de p53 sobre a proliferao de clulas

crescendo em condies glicolticas, ou seja, em meio com alta concentrao de glicose, dos efeitos

observados em clulas crescendo apenas com galactose, uma condio na qual o metabolismo

energtico primariamente oxidativo (Aguer et al., 2011). A curva de crescimento, nessas condies,

apresentada na Figura 4.9, revela que clulas HEK293 apresentam velocidades de crescimento

similares quando cultivadas com glicose ou galactose como substratos energticos. No entanto, o

ndice de proliferao das clulas crescendo em galactose foi cerca de 40% menor do que clulas

utilizando glicose.

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Figura 4.9. Proliferao celular da linhagem HEK293 controle em meio contendo glicose ou galactose. (a) As curvas mostram a proliferao celular do clone controle Ctrl1 em meio contendo 25 mM de glicose (em vermelho) ou galactose (em rosa), como substratos energticos. (b) O grfico de barras mostra que no h diferena significativa no crescimento celular 184 horas aps o plaqueamento.

Quando os clones p53 KD so comparados ao clone controle, mostrado na Figura 4.10, uma

diferena significativa entre a velocidade de crescimento, para ambos os substratos energticos

fornecidos, observada. Tanto em meio de cultura contendo glicose como contendo galactose, os

clones com os nveis diminudos da protena p53 apresentaram maior proliferao celular. Aps 184

horas do incio da curva de crescimento, a diferena observada foi de cerca de 4,5 vezes para as

culturas mantidas em glicose e de aproximadamente 3 vezes para as culturas mantidas em galactose,

o que evidencia o p