UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Milica J. Petković

Određivanje stepena autolize bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka

MASTER RAD

Niš, β015.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Određivanje stepena autolize bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Milica Petković 104 prof. dr Nataša Joković

Niš, β015.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Determination of autolysis degree of the lactic acid bacteria isolated

from kajmak

MASTER THESIS

Candidate: Mentor:

Milica Petković 104 PhD Nataša Joković

Niš, β015.

Zahvalnica

Najsrdačnije se zahvaljujem profesorki Nataši Joković uz čiju sam pomoć i podršku naučila dosta, a čije je veliko znanje i profesionalnost stalna inspirazija za dalje unapređivanje.

Zavalna sam i Nikoli Stankoviću, uz kog sam razvila veštine rada u laboratoriji i čiji su me trud i saveti sprečavali da klonem duhom.

Za sve godine ljubavi, podrške i razumevanja izuzetnu zahvalnost dugujem svojoj porodici. Dum

spiro, spero!

Hvala vam!

Biografija kandidata

Ime i prezime: Milica Petković

Mesto i datum rođenja: Niš, 25. oktobar 1991. godine

Osnovna škola: "Vožd Karađorđe" u Nišu, 1998-2006. godine, dobitnik Vukove diplome

Srednja škola: prirodno-matematički smer, gimnazija "Bora Stanković" u Nišu, β006-2010.

godine, dobitnik Vukove diplome

Fakultet: Prirodno-matematički fakultet u Nišu, departman za biologiju i ekologiju

osnovne studije: 2010-2013. godine

master studije: 2013-2015. godine

SAŽETAK

U prvom delu ovog rada utvrđivana je optimalna tehnika zasejavanja bakterija prilikom

određivanja broja ćelija u suspenzijama metodom razblaživanja. Rezultati su pokazali da je

tehnikom nalivanja dobijen najveći broj ćelija iz suspenzija BMK pri čemu su standardne

devijacije manje u odnosu na druge tehnike, kao i da zapremine suspenzija korišćenih za

pravljenje serija razblaženja i zasejavanje nisu uticale značajno na određivanje ukupnog broja

ćelija u suspenziji.

U drugom delu rada je ispitivan uticaj pH i NaCl na stepen autolize Lc. lactis ssp. lactis,

St. thermophilus, En. faecalis, En. faecium, Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. plantarum

i Lb. paracasei. Stopa autolize je praćena određivanjem broja baktrijskih ćelija zasejanih na

odgovarajuće čvrste podloge nakon inkubacije suspenzije 180 minuta na 30oC u 4 različita

puferska sistema( K-fosfatni i citratni pufer, i ovi puferi sa dodatkom 3% NaCl). Ispitivani sojevi

BMK pokazuju veliku varijabilnost u okviru vrste u stepenu autolize. Niska pH vrednost pufera

povećava stepen autolize laktokoka i leukonostoka. Dodavanje NaCl povećava stepen autolize

laktokoka, dok na ostale vrste BMK ne deluje značajno, ili dovodi do smanjenja stepena autolize.

Nekoliko sojeva vrste Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides pokazuju visok stepen

autolize, te se mogu koristiti kao starter kulture za ubrzano dobijanje kajmaka ili sireva.

Ključne reči: bakterije mlečne kiseline, BMK, pH, NaCl, autoliza

ABSTRACT

In the first part of this paper, the optimal technique of bacteria growth was being

determined. The results have shown that the greatest number of cells from LAB suspension was

obtained by using the technique of pouring. In addition, the volume of the suspensions which

were used for making the dilute series and growth did not have a significant influence on

determining the total number of cells in the suspension.

In the second part, the influence of pH and NaCl to the degree of autolysis of Lc. lactis

ssp. lactis, St. thermophilus, En. faecalis, En. faecium, Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb.

plantarum i Lb. paracasei, was examined. The degree of autolysis was observed by the

determination of number of cells grown on a matching solid surface after incubation of

suspension for 180 minutes at 30oC in 4 different buffer systems (K- phosphate and citrate

buffer, and this buffers with addition of 3% NaCl). The examined strains of LAB have shown a

big variability in autolysis degree within one species.The low pH level of a buffer increases the

degree of autolysis in Lactococcus and Leuconostoc. The addition of NaCl increases the degree

of autolysis in Lactococcus, while it does not have a significant impact on other LAB species, or

it inhibits the autolysis. A few strains of Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides have

shown a high level of autolysis, which makes them suitable for a starter culture for acceleration

for producing kajmak or cheese.

Key words: lactic acid bacteria, LAB, pH, NaCl, autolysis

SADRŽAJ

1. UVOD .................................................................................................................... 1

1.1. BAKTERIJE MLEČNE KISELINE ............................................................................................................................. 1

1.2. AUTOLIZA BAKTERIJA ......................................................................................................................................... 5

1.3. AUTOLIZA BAKTERIJA MLEČNE KISELINE (BMK) ................................................................................................ 6

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA .............................................................................. 10

3.1. BAKTERIJSKI SOJEVI .......................................................................................................................................... 11

3.2. PUFERSKI SISTEMI ............................................................................................................................................. 11

3.3. BAKTERIJSKE SUSPENZIJE.................................................................................................................................. 11

3.4. ODREĐIVANJE BROJA BAKTERIJSKIH ĆELIJA ...................................................................................................... 12

3.5 ODREĐIVANJE STEPENA AUTOLIZE ..................................................................................................................... 12

4. REZULTATI I DISKUSIJA .............................................................................. 13

4.1. STANDARDIZACIJA METODE ODREĐIVANJA BROJA ĆELIJA .................................................................................... 13

4.2. ODREĐIVANJE STEPENA AUTOLIZE BMK .......................................................................................................... 16

5. ZAKLJUČCI ....................................................................................................... 21

6. LITERATURA ................................................................................................... 22

1

1. UVOD

Bakterije mlečne kiseline (BMK) predstvljaju veliku i heterogenu grupu bakterija, koje su

značajne u mnogim prehrambenim proizvodima. Koriste se u vidu starter kultura za dobijanje

velikog broja proizvoda, za koje ispoljavaju mnogobraojna blagotvorna dejstva na zdravlje ljudi,

tako da se koriste za dobijanje funkcionalne hrane. Aktivnost intracelularnih enzima BMK koji

se oslobađaju u sredinu zbog procesa autolize, imaju uticaja na brzinu zrenja sireva, kao i na

brzinu kvaranja vina, piva i mesa. Takođe, produkti aktivnosti ovih enzima imaju uticaja na

miris, ukus i teksturu proizvoda. Zbog toga je od velikog značaja istražiti brzinu procesa autolize

kultura BMK, kao i uticaj različitih aspekata sredine u kojoj se kultura razvija na intenzitet

autolize.

1.1. Bakterije mlečne kiseline

Bakterije mlečne kiseline (BMK) su predstavljene heterogenom grupom bakterija, koju

povezuju morfološke, metaboličke, fiziološke i genske katakteristike, a koje u metaboličkim

procesima proizvode mlečnu kiselinu. Sadrže nizak procenat guanin-citozin (GC) parova u

genomu i kao grupa, obuhvataju isključivo Gram pozitivne bakterije.

Sve BMK su anaerobi, ali su sposobne da rastu i u prisustvu kiseonika, što ih svrstava

među fakultativne aerobe. Fermentacija je favorizovani proces, usled nemogućnosti BMK da

sintetišu citohrom i katalazu. Katalaza je enzim koji vrši funkciju antioksidativne zaštite

organizma. Uloga katalaze je da razlaže vodonik-peroksid, koji je toksičan za ćeliju na vodu i

kiseonik. Neke BMK poseduju superoksid dismutazu, koji na alternativni način razlaže vodonik

peroksid. Takođe, superoksid dismutaza efikasno modifikuje superoksidne jone u molekul

kiseonika. BMK nisu sposobne za sintezu prostetičnih grupa. Uobičajena sredina u kojoj se

razvijaju BMK ne sadrži hem i onemogućena je sinteza citohroma. Nedostatak citohroma

onemogućava elektronski transportni lanac, pa nakon glikolize piruvat ulazi u proces mlečne

fermentacije. Dokazano je da u laboratorijskim uslovima, kulture BMK gajene na suptratu u koji

je dodat hem, sintetišu citohroma i katalaze (Hutkins, β006.).

Podela BMK je izvršena na osnovu katabolizma glukoze, koja je u osnovi izvor energije

za rast bakterija. Razlikujemo 2 grupe: homofermentativne i heterofermentativne. Kod

homofermentativnih bakterija glukoza se kataboliše glikolitičkim putem i mlečnom fermentacijom.

2

Kod heterofermentativih bakterija glukoza se razlaže 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim (6-PG/PK)

putem, dajući CO2, etanol i sirćetnu kiselinu.

Osnovni izvor energije ovih bakterija potiče od metabolizma šećera, te je njihov limitirajući

faktor podloga u kojoj su prisutni šećeri. Odnosno, bakterije ne rastu, ukoliko nema šećera u

njihovim podlogama. Tokom evolutivne istorije BMK su se razvijale na podlogama koje su bogato

sadržale aminokiseline, vitamine, purine i pirimidine, odnosno prilagodile su se na sredine bogate

hranljivim materijama. Ovo je uslovilo ograničenu mogućnost biosinteze, te predstavlja drugi

limitirajući faktor. Dakle, kako bi se kultura BMK gajila u laboratorijskim uslovima potrebno je

obezbediti joj podlogu bogatu šećerima, vitaminima (riboflavin, pantotenska i folna kiselina, biotin i

tiamin), amino kiselinama i azotnim bazama. U prirodi se mogu naći u mleku i mlečnim

proizvodima, kao i na lišću u procesu raspadanja, a čine i deo normalne flore ljudske usne duplje,

gastrointestinalnog trakta i vagine sisara.

BMK se smatraju generalno bezbednim mikroorganizmima, ali postoje i vrste koje su

patogene za životinje. Najpoznatiji patogeni među BMK potiču iz roda Streptococcus. Vrste

ovog roda su izazivači bolesti poput upale pluća, skarletne groznive, upale srednjeg uha,

edokarditisa, meningitisa i drugih. Međutim, mnogobrojni sojevi BMK se već dugi niz godina

koriste u industriji hrane, što je svrstalo BMK u grupu mikroorganizama koje imaju GRAS status

(Generaly Recognized As Safe) dodeljen od strane FDA(Food and Drug Administration)

Sjedinjenih Američkih Država. Ovaj status je deklaracija o bezbednosti upotrebe BMK.

Bakterije mlečne kiseline imaju dugu istoriju upotrebe u industriji hrane. One doprinose

razvoju ukusa i teksture proizvoda fermentacije, ali se koriste i u prezervaciji hrane. BMK

proizvode supstance koje inhibiraju rast mikroorganizama, a i visoke koncentracije mlečne

kiseline. Mlečna kiselina značajno menja pH vrednost okoline, čineći je nepovoljnom za rast

mnogih patogenih mikroorganizama i mikroorganizama koji izazivaju kvarenje hrane. U

industriji hrane BMK se koriste u proizvodnji jogurta, sireva, butera, pavlake, kiselih krastavaca,

konzervaciji maslina. Dokazano je da pojedine vrste mogu uticati na kvarenje piva, vina i

prerađenog mesa.

Iako veliki broj rodova bakterija proizvodi mlečnu kiselinu u procesu fementacije,

izrazom "bakterije mlečne kiseline" podrazumevamo vrste reda Lactobacialles. Ovaj red

uključuje mnoge rodove, poput: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus,

Leuconostoc.

3

Lactobacillus

Ovaj rod obuhvata najveći broj rodova sa 135 vrsta i 27

podvrsta, i vrlo je heterogen. Vrste koje pripadaju ovom rodu

međusobno se razlikuju po fenotipskim, biohemijskim i

fiziološkim karakteristikama. Oblik varira od izuzetno dugih,

a tankih štapića do kokoidnih. Oni su acidofilni ili

acidotolerantni i svojim rastom snižavaju vrednosti pH

supstrata u kome se nalaze. Široko su rasprostranjeni i mogu

se naći u usnoj duplji, gastrointestinalnom traktu ljudi i

životinja, vagini sisara. Kao što je već spomenuto, generalno

su bezbedni, mada imaju tendenciju da budu oportunistički

patogeni. U neki slučajevima su uzvrok kvarenja piva, vina,

mesa životinja i riba, mleka i fermentisanih proizvoda.

Predstavnici roda Lactobacillus su raznovrsni, ali ih možemo podliti u tri grupe:

1. Obligatni homofermentativni laktobacili koji vrše fermentaciju ugljenih hidrata sa 6 C atoma do

mlečne kiseline. Ne vrše fermentaciju ugljenih hidrata sa 5 C atoma i glukonata;

2. Fakultativni heterofermentativni laktobacili vrše fermentaciju ugljenih hidrata sa 6 C atoma do

mlečne kiseline. Sposobni su za produkciju gasa iz glukonata, ali ne i iz glukoze. Vrše fermentaciju

ugljenih hidrata sa 5 C atoma induktivnim fosfoketolazama do mlečne ili sirćetne kiseline;

3. Obligatni heterofermentativni laktobacili vrše fermentaciju ugljenih hidrata sa 6C atoma do mlečne

kiseline, sirćetne kiseline i/ili etanola i CO2.

Lactococcus

Lactococcus je rod koji obuhvata 9 vrsta. Laktokoke

su homofermentorne, mezofilne bakterije kokoidnog oblika,

koje se mogu naći na biljkama i koži životinja, ali i u različtim

fermentisanim proizvodima. U studija o mikroorganizmima iz

γ5 različitih zanatlijskih mlečnih proizvoda, čak γ8%

izolovanih bakterija bile su laktokoke. Lactococcus se može

smatrati najčešćim rodom BMK (Cogan et al., 1997.).

Slika 2. Lactococcus lactis

Slika 1. Lactobacillus

delbruekii subsp. bulgaricum

4

Laktokoke su široko rasprostranjene i koriste se kao starter kulture u proizvodnji mlečnih

proizvoda. Tokom proizvodnje, njihova glavna uloga je u acidifikaciji, sintezom mlečne kiseline

(Corroler et al., 1999; Casalta, β00γ). Najčešće korišćena vrsta u industrijskoj proizvodnji

mlečnih proizvoda, ovog roda je Lactococcus lactis.

Enterococcus

Ovom rodu pripadaju koke koje formiraju

parove(diplokoke) ili kratke lance. Najčešće se mogu

naći u crevnom traktu životinja i ljudi. Enterokoke

imaju široku toleranciju za temperaturu (10-45o) i pH

vrednost (2.5-10) (Shi et al., 2015.). Ovaj rod

obuhvata 54 vrste, a najčešći su komensali čoveka

Enterococcus faecalis i En. faecium. Neki sojevi En.

faecalis se koriste u proizvodnji sireva kao starter

kulture.

Rod Enterococcus obuhvata veliki broj vrsta, a neke mogu biti i izazivači bolesti, jer se

ponašaju kao oportunistički patogeni. Dokazana je i visoka rezistencija na antibiotike vrsta En.

faecalis i En. faecium (Holdberg, A., Rasmussen, M., 2015).

Streptococcus

Streptokoke predstavljaju široko rasprostranjen rod, koji obuhvata preko 50 vrsta. Upravo

su streptokoke rod BMK sa najvećim brojem izazivača bolesti, od upale grla i pluća, do

endokarditisa, meningitisa i skarletne groznice.

Podela streptokoka se može izvršiti na osnovu stepena hemolize podloge krvnog agra:

1. α hemoliza - sintetiše se vodonik peroksid (H2O2), koji oksiduje hemoglobin u

methemoglobin, što rezultuje zelenkastom zonom na podlozi;

2. hemoliza - svi eritrociti, kao i sav hemoglobin su razgrađeni i na podlozi se formira

žuta zona. Ova grupa se može dalje podeliti na osnovu sastava ugljenih hidrata prisutnih

u ćelijskom zidu;

3. hemoliza - nema vidljive hemolize.

Bakterije hemolize se dalje mogu podeliti na osnovu sastava ugljenih hidrata prisutnih

u ćelijskom zidu. Formirano je β0 grupa pod nazivom Lansfildove grupacije, koje se označavaju

abecednim slovima A-V(bez I i J).

Slika 3. Enterococcus faecalis

5

Streptococcus thermophilus je 1991. bila

klasifikovana kao S. salivarius subsp.

thermophilus, ali je nakon renaturacionih DNK-

DNK proba dokazano da je u pitanju posebna

vrsta (Schleifer et al., 1991.). Specifično je da

ova vrsta raste vrlo dobro na 45oC. Koristi se kao

starter kultura u proizvodnji sireva i jogurta. Ova

bakterijska vrsta sintetiše male proteine sa

baktericidnim dejstvom (Mathot et al., 2003.).

Leuconostoc

Ovaj rod obuhvata heterofermentativne kokoidne BMK,

koje se nalaze u parovima ili formiraju lance. One fermentišu

šećere do mlečne ili sirćetne kiseline i CO2. Neke vrste ovog

roda se koriste kao starteri u industriji hrane. Takav je, na primer

Leuconostoc mesenteroides ssp.cremoris koji je starter za

proizvodnju maslaca i sireva. Karakteristika ove vrste je da

sintetiše diacetil na pH=5.5 i da toleriše veću koncentraciju

soli (Kuda et al. 2014.).

1.2. Autoliza bakterija

Autoliza je proces samorazgradnje ćelija. Kod bakterija autolizu izazivaju enzimi

peptidoglikan hidrolaze (PGH), koji se nazivaju autolizini. Oni deluju endogeno, odnosno na

peptidoglikane bakterije koja ih proizvodi. Gram pozitivne bakterije poseduju snažnu

trodimenizionalu mrežu sačinjenu od peptidoglikana, a koja oblaže ćeliju i formira njen zid.

Peptidoglikani predstavljaju polimere sastavljene od glikanskih lanaca vezanih za kratke

peptidne lance. Glikanski lanci su izmenjeni N-acetil-glukozoaminski (Glc-NAc) ostaci i N-

acelitl muraminska kiselina (Mur-NAc). Peptidoglikanske hidrolaze razlikujemo na osnovu veze

koje razgrađuju. Postoje i enzimski kompleksi koji se sastoje od nekoliko tipova PGH

istovremeno prisutnih u ćeliji, a mogu imati identične ili različite karakteristike.

Slika 4. Streptococcus thermophilus

Slika 5. Leuconostoc mesenteriodes

6

Autolizini imaju ulogu u rastu i umnožavanju čelija, jer utiču višestrko na modifikaciju

rigidne peptidoglukanske mreže ćelijskog zida (Smith, Foster, 2000). U situacijama kada ćelija

gladuje ili se nalazi u generalno nepovoljnim uslovima sredine, dolazi do prekida sinteze

peptidoglikana, što je signal za aktivaciju autolizina kao odgovora na nekontrolisanu aktivnost

ćelije. Obzirom da peptidoglikani imaju važnu ulogu u integritetu ćelije, njegovom razgradnjom

dolazi do oslobađanja intracelularnog sadržaja ćelija u spoljašnju sredinu. Ekspresija ili aktivnost

autolizina je vrlo dobro regulisana.

1.3. Autoliza bakterija mlečne kiseline (BMK) Značaj autolize BMK je u njihovoj primeni kao starter kultura u fermentaciji mlečnih

proizvoda. Kontrola i povećanje lize BMK u starter kulturama se koristi kao krucijalni element

kontrole i ubrzavanja zrenja tvrdih sireva tipa emental, čedar i slično. Osim toga, starter kulture

proizvode i mnogobrojne intracelularne enzime tipa peptidaza, lipaza i enzima koji učestvuju u

razvoju ukusa sira tokom zrenja. Zbog toga je autoliza BMK i njen uticaja na proces

proizvodnje sira, predmet mnogih istraživanja tokom poslednjih nekoliko decenija (Gobbetti at

al., 2015.; Mathur, Singh, 2005.).

Mnoge vrste BMK su lizogenične i u svom genomu nose sekvencu za jedan ili nekoliko

profaga1 koji kodiraju endolizine sa PGH aktivnošću. Profagi se mogu aktivirati kao rezultat

1 Bakterija u čijem se naslednom materijalu nalaze sekvence koje potiču iz faga

Slika 5. Građa ćelijskog zida Gram pozitivnih bakterija

7

mutacija (mitomicin C) ili pak, sredinskim stresom (temperaturni šok). Na kraju ciklusa faga,

proizvedeni su litički proteini (enfolizin i najčešće mali protein, holin). Dolaskom u kontak

endolizina i peptidoglikana dolazi do njegove razgradnje i početka ćelijske autolize (Zambonelli

et al. 2002.).

Kod Gram pozitivnih bakterija je otkriveno 5 tipova enzima koji izazivaju hidrolizu

peptidoglikana. Kod Lactococcus lactis je detektovan samo jedan autolizin, endo- -N-

acetilmuramidaza (AcmA) (Mou, Sullivan, Jago, 1976). Godine 1995. je gen koji kodira AcmA

kloniran i izvršeno je njegovo sekvenciranje. Dokazano je da se jedino ovaj tip autolizina

eksprimira u soju Lc. lactis ssp. cremoris MG1363, koji ne poseduje plazmide (Buist et al.,

1995.). AcmA protein odmah nakon sinteze ima molekularnu masu od 46564 Da, a da bi se

dobio zreli, funkcionalni AcmA, potrebno je da se veže N-terminalna sekvenca. Molekulska

masa tada iznosi 40264 Da. AcmA poseduje katalitički domen i domen koji se vezuje za

peptidoglikane. Ova sekvenca se sastoji od semi-konzervativnih ponovaka 44 aminokiseline,

koje su razdvojene nehomologim regionima (Buist et al., 1995.). Katalitički domen se sastoji od

rezidua glutaminske i asparaginske kiseline, koji su međusobno udaljeni i smatra se da kod

mnogih Gram pozitivnih bakterija imaju ulogu u hidrolizi peptidoglikana (Joris et al, 1992). N-

acetil-muramidaza je enzim koji učestvuje u inserciji polisaharida u mrežu koja formira ćelijski

zid. Izuzetno je aktivna u toku procesa multiplikacije bakterijske ćelije, ali nastavlja svoju

aktivnost i nakon njene podele. Na signale stresnih situacija ili zbog akumuliranih mutacija,

enzimi počinju da se ponašaju nekontrolisano, što umesto učvršćavanja ćelijskog zida bakterije,

dovodi do njegovog razaranja. Rupe koje se formiraju na ovaj način, ne utiču na promenu

strukture ćelije, ali se mogu primetiti i posmatrati pod mikroskopom. Lokalizovane, sitne rupture

se tokom vremena proširuju i formiraju prostrane frakture. N-acetil-muramidaza deluje

isključivo na ćelijski zid, što sve ostale komponente ćelije ostavlja netaknutim. Međutim,

razaranje ćelijskog zida oslobađa još uvek aktivne ćelijske supstance u medijum, gde one mogu

nastaviti svoje funkcionisanje još neko vreme.

Specifičnosti hidrolitičke aktivnosti PGH kod bakterijskih vrsta možemo utvrditi

inkubacijom bakterijskog ćelijskog zida pod uslovima koji omogućavaju hidrolizu i

analiziranjem veza koje se cepaju. Na primer, povećanje nivoa redukcionih grupa je indikator

aktivnosti muramidaze ili glukozoaminidaze, a povećanje nivoa amino grupa je indikator

aktivnosti amidaza ili peptidaza (Shockman, Holtje, 1994.). Renaturacija SDS-PAGE je efikasna

8

tehnika za detekciju peptidoglikanske hidrolazne aktivnosti. U poliakrilamidni gel mogu biti

unošeni različiti supstrati: cele ćelije, ćelijski zidovi ili prečišćene peptidoglikane. Aktivnost

peptidoglikanskih hidrolaza se detektovatuje kao providna trake na tamnoj pozadini i može se

proceniti molekulska masa PGH. Rezultati dobijeni na ovaj način predstavljeni su u Tabeli 1.

Ova tehnika dozvoljava detekciju samo enzima koji su sposobni da se renaturišu nakon SDS-

PAGE, te se heteromerni proteini ne mogu detektovati. Nekoliko vrsta BMK je ispitivano ovom

metodom i generalno, nekoliko litičkih traka je detektovano prilikom SDS-PAGE. Ovaj profil je

stabilan u okviru vrste, a karakteristične glavne trake su konzervativne za sojeve u okviru jedne

vrste (Chapot-Chartier et al., 2004).

Tabela 1. Enzimska aktivnost detektovana u in vitro uslovima, koja prikazuje hidrolizu ćelijskog zida i glavne

peptidoglikanske hidrolaze, detektovane renaturacijom na SDS-PAGE kod različitih vrsta BMK (Lortal, S., Chapot-

Chartier, M.-P., 2004).

Vrsta bakterije Aktivan enzim

detektovan in vitro

Renaturacija elektroforezom substrat broj traka masa - Mr (kDa)

Lactococcus lactis

N-acetil-

muramidaza,

glikopeptidaza i

(amidaza ili

endopeptidaza)

M. lysodeikticus L. lactis

2 18/45 Buist et al. (1995a)

1 ili 2 45 ili 45/46

Østlie et al. (1995) Riepe et al. (1997) Lepeuple et al. (1998a) Mou, Sullivant, & Jago (1976)

Streptococcus

thermophilus nije determinisan

M. lysodeikticus S. thermophilus

0 Husson-Kao et al. (2000a, b)

1 ili 2 51 ili 31/51

actobacillus

helveticus N-acetil-muramidaza

M. lysodeikticus

Lb. helveticus 4 30/42

Lortal et al. (1997a)

Valence & Lortal

(1995) ćelije 2 30/42

SDS ćelijski zid 3 30/37/42

Lactobacillus

delbrueckii

subsp. lactis

nije definisano M. lysodeikticus 2 31/44 Lortal et al. (1997b)

Lactobacillus

acidophilus

N-acetil-

muramidaza,

glikopeptidaza i

(amidaza ili

endopeptidaza)

M. lysodeikticus 4 27/28/30/41 Lortal et al. (1997b)

Leuconostoc citreum M. lysodeikticus 2 41/52

Cibik & Chapot-Chartier (2000)

Lactobacillus casei

subsp.

casei

Glukozidaza Lb. casei 2 49/55

Cappa & Bottazzi

(1996)

9

Industrijska proizvodnja podrazumeva procese koji višestruko izlažu starter kulture bakterija

stresnim uslovima. Nekoliko proteina stresa starter kultura BMK je identifikovano u procesu

sazrevanja Emental sira (Gagnaire et al. 2004). Ispitivanjem proteaza koje se oslobađaju iz

bakterijske ćelije prilikom autolize, u in vitro uslovima dokazano je da zadržavaju sposobnost

razgradnje kazeina, proteina mleka, zbog čega ima ulogu u procesima fermentacije, nakon

autolize ćelije. Još uvek aktivne enzimske supstance koje su oslobođene, pridružuju svoju

funkciju kompleksu koji se već nalaze u sirovom materijalu, čime potpomažu sazrevanje sira,

vina ili salama, doprinoseći ukusu i teksturi istih (Laskowska et al. 1996),. Međutim, istraživanja

koja obuhvataju ovu temu su u vrlo ranim fazama i znanje koje posedujemo o ovim procesima je

ograničeno. Dokazano je i da postoji variranje u brzini autolize nakon multiplikacije kod

različitih vrsta i sojeva BMK. Uzevši u obzir ovu karakteristiku vrsta i sojeva, potrebno je

obratiti pažnju pri odabiru startera za fermentaciju (Zambonelli et al. β00β.).

10

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Uzimajući u obzir značaj BMK kultura kao startera u industriji hrane, kao i njihov uticaj

na kvalitet proizvoda, ciljevi ovog istraživanja su:

1. Utvrđivanje optimalne tehnike zasejavanja bakterija primenom određivanja ćelija u

suspenziji, metodom sukcesivnog razblaživanja.

2. Određivanje stope autolize kod različitih vrsta bakterija mlečne kiseline.

11

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Bakterijski sojevi

U radu su korišćeni sojevi BMK izolovani iz kajmaka i identifikovani do nivoa vrsta Lc.

lactis ssp. lactis (10), St. thermophilus (4), En. faecalis (8), En. faecium (12), Ln. mesenteroides

ssp. mesenteroides (20), Lb. plantarum (10) i Lb. paracasei (6) (Joković, β010). Sojevi su

aktivirani iz stokova čuvanih na -20C trostrukim presejavanjem na odgovarajuću podlogu.

Kao radne kulture sojeva korišćene su prekonoćne kulture zasejane na odgovarajuću

podlogu i inkubirane na određenoj temperaturi. Koke su gajene na M17 čvrstoj podlozi (Merck,

Nemačka) sa dodatkom 5% glukoze. Petri ploče sa sojevima laktokoka inkubirane su na

temperaturi od 30C, dok su ploče sa enterokokama i streptokokama inkubirane na γ7C.

Leukonostoci i laktobacili zasejavani su na MRS čvrstu podlogu (Torlak, Srbija) i Petri ploče su

inkubirane na 30C.

3.2. Puferski sistemi

Autolitička svojstva sojeva BMK određivana su u 4 puferska sistema:

1. K-fosfatni pufer pH 6.5,

2. K-fosfatni pufer sa 3% NaCl,

3. citratni pufer pH 5.00,

4. citratni pufer sa 3% NaCl

Puferski sistemi sa pH vrednošću 6,5 i 5 su izabrani kako bi se imitirali uslovi koji vladaju

tokom proizvodnje kajmaka i ostalih fermentisanih proizvoda od mleka (Fortina, 2008). U puferske

sisteme dodat je i NaCl koji se inače dodaje u većoj količini pri proizvodnji kajmaka i sireva.

3.3. Bakterijske suspenzije

Za standardizaciju metode brojanja ćelija pravljene su suspenzije gustine 0.3, 0.4 i 0.5

McF od prekonoćnih kultura sojeva En. faecalis MK3-12 i Lb. paracasei Dk2-5a. Suspenzije su

pravljene u fiziološkom rastvoru (0,85% NaCl), dok je merenje gustina suspenzija rađeno na

denzitometru (D-1, Biosan).

Autoliza BMK sojeva, rađena je sa prekonoćnim kulturama sojeva. Za ispitivanje

autolitičke sposobnosti sojeva BMK, suspenzije gustine 0.5McF su pravljene u 4 različita pufera.

12

3.4. Određivanje broja bakterijskih ćelija

Određivanje broja bakterijskih ćelija u suspenzijama rađeno je metodom sukcesivnog

razblaživanja, pravljenjem serije razblaženja u fiziološkom rastvoru. Za standardizaciju metode

brojanja, razblaženja su pravljena sukcesivno u 900l i 9ml fiziološkog rastvora.

Zasejavanje podloga rađeno je iz većih razblaženja suspenzija kako bi se dobilo γ0 do

γ00 kolonija na zasejanim Petri pločama. Korišćena su 4 različite tehnike zasejavanja podloga:

1. Tehnika razmazivanja (R): Po 100 µl suspenzija razblaženja 10-4, 10-5 i 10-6 naneto je na

sterilnu, čvrstu podlogu u Petri ploči i zasejano po čitavoj površini podloge staklenim

štapićem.

2. Tehnika nalivanja iz ependorfe (N): Po 100 µl suspenzija razblaženja 10-4, 10-5 i 10-6

naneto je na praznu, sterilnu Petri ploču , na koju je potom naliveno 15 ml prohlađene

podloge.

3. Tehnika nalivanja iz epruvete (NE): Po 1 ml suspenzija razblaženja 10-4, 10-5 i 10-6 naneto

je na praznu, sterilnu Petri ploču , na koju je potom naliveno 15 ml prohlađene podloge.

4. Tehnika kapljica (D): 3 puta po 20 µl suspenzija razblaženja 10-4, 10-5 i 10-6 naneto je na

γ tačke na četvrtinu čvrste sterilne podloge. Na ovaj način je moguće smesti γ i više

različitih uzoraka na istu podlogu.

Zasejane Petri ploče inkubirane su β4 sata na određenoj temperaturi, nakon čega je

rađeno brojanje kolonija. Ukupan broj bakterija u početnoj suspenziji dobijen je množenjem

broja kolonija sa razblaženjem. Svi eksperimenti rađeni su u tri ponavljanja.

3.5 Određivanje stepena autolize

Stepen autolize rađen je određivanjem broja ćelija u 4 različita pufera. Broj ćelija je

meren odmah nakon pravljenja suspenzija (Ao) i posle inkubacije suspenzije 180 min na 30C

(A180). Stepen autolize je određivan na osnovu formule (A0-A180)/A0 x100. Svi eksperimenti rađeni

su u tri ponavljanja.

13

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Standardizacija zasejavanja

Broj ćelija u različitim vrstama bakterijskih suspenzija, najčešće se određuje metodom

razblaženja. U ovoj metodi se od početnog uzorka pravi serija razblaženja u fiziološkom rastvoru

kao bi se smanjio broj bakterijskih ćelija u suspenziji a zatim se iz razblaženih suspenzija vrši

zasejavanje odgovarajućih podloga. Zasejavanje podloga može se raditi direktno na Petri ploču u

kojoj se nalazi odgovarajuća steriilna podloga pri čemu se ćelije odvajaju razmazivanjem štapićem

po Drigalskom. Druga tehnika zasejavana podrazumeva prebacivanje bakterijske suspenzije u

prazne Petri ploče, a zatim nalivanje prohlađene podloge preko suspenzije ćelije. U poslednje vreme

često se koristi tehnika zasejavanja kapljicama gde se iz razblaženja prebacuje manja količina

suspenzije (20 l) na čvrstu podlogu. Nakon inkubacije zasejanih Petri ploča, broje se bakterijske

kolonije i broj kolonija se množi sa stepenom razblaženja. Na ovaj način dobija se broj bakterijskih

ćelija u 1 ml suspenzije. Iako se metoda široko koristi u mikrobiologiji, mnogi faktori mogu da utiču

na ispravnost dobijenih rezultata (Davis, 2014.). Tako tehnike zasejavanja podloga mogu značajno

uticati na dobijeni ukupan broj ćelija u suspenziji. Na ovaj način se štedi podloga koja se koristi za

rast bakterija i tehnika je lakša i brža za izvođenje od prethodno opisanih tehnika (Herigstad,

Hamilton, Heersink, 2001.).

Kako bi se utvrdilo koja tehnika zasejavanja je najbolja za određivanje broja BMK u

suspenziji, rađene su tri tehnike zasejavanja: razmazivanje po površini Petri ploče (R), nalivanje

podloge na bakterijsku suspenziju koja je prenešena u Petri ploču (N) i tehnika kapljica (D). U svim

ovim tehnikama, razblaženje početnog uzorka pravljeno je u 900 l fiziološkog rastvora, dok je 100

l suspenzije korišćeno za zasejavanje. Na tačnost metode razređenja pri brojanju ćelija mogu da

utiču i različiti postupci prilikom izvođenja metode. Zato je dodatno rađeno pravljenje razblaženja u

9 ml fiziološkog rastvora i zasejavanje 1 ml razblažene suspenzije tehnikom nalivanja (NE).

Ukupan broje ćelija u suspenzijama gustine 0.γ, 0.4 i 0.5 McF određivan je za dve vrste

BMK , En. faecalis MK3-12 i Lb. paracasei DK2-5a (Slika 1 i β). Najveći broj ćelija enterokoka

dobijen je tehnikom nalivanja sa 100 l i 1 ml zasejane suspenzije, dok je tehnikom razmazivanja

dobijen najmanji broj ćelija u suspenzijama različitih gustina (Slika 1). Tehnikom kapljica broj

ćelija enetorokok je bio nešto veći u odnosu na broj određen tehnikom razmazivanja. S obzirom da

sve BMK pripadaju mikroaerofilnim bakterijama, anaerobni uslovi koji nastaju prilikom direktnog

14

zasejavanja bakterija u podlogu metodom nalivanja, favorizuju rast ovakvih bakterija. Tehnike

zasejavanja u kojima se bakteriske kolonije razvijaju na površini Petri ploča pogodnija je za rast

aerobnih bakterija (Reasoner, 2004).

Slika 6. Ukupan broj ćelija vrste En. faecalis MK3-1β u suspenzijama različite gustine sa primenjenim

tehnikama zasejavanja bela-0,3 McF; siva-0,4 McF; crna-0,5 McF; R-tehnika razmazivanja; N-tehnika nalivanja; NE-

tehnika nalivanja sa 1 ml suspenzije; D-tehnika kapljica

Vrednosti standardnih devijacija podataka pokazuju odstupanje od srednje vrednosti u tri

ponovljena eksperimenta tako da direktno ukazuju na ponovljivost i pouzdanost metoda. Standardne

devijacije za određivanje broja enterokoka u suspenzijama različitih gustina, takođe, su prikazane na

slici 6. Najveće vrednosti za standardne devijacije dobijene su za tehniku kapljica, dok su

standardne devijacije za tehnike nalivanja varirale u zavisnosti od gustine suspenzija. Sa druge

strane, standardne devijacije za podatke dobijene tehnikom razmazivanja su bile nezavisne od

gustine suspenzije.

Promena broja ćelija enterokoka u zavisnosti od gustine suspenzija je bila različita u svim

korišćenim tehnikama (Slika 6). U tehnici razmazivanja je broj ćelija u suspenzijama 0.4 i 0.5 McF

bio skoro isti, dok se u svim ostalim tehnikama broj ćelija enterokoka povećava sa gustinom

suspenzije. Merenjem gustine bakterijskih ćelija vrste Escherichia coli, utvrđeno je da jedinica od

0.5 McF odgovara gustini ćelija od 1,5 x 108 po ml suspenzije (Forbes et al., 2002.). U ovom radu je

najveći broj ćelija enterokoka dobijen iz suspenzije 0.5 McF tehnikom nalivanja i bio je 5,8 x 106.

Broj ćelija u suspenziji koji se dobija turbidimetrijskim metodama merenja zavisi od vrste bakterija

0.00E+00

1.00E+06

2.00E+06

3.00E+06

4.00E+06

5.00E+06

6.00E+06

7.00E+06

R N NE D

Broj

ćel

ija/m

l

15

koja se koristi za pravljenje suspenzija pre svega od oblika i veličine bakterijske ćelije. Zbog toga

vrednosti dobijene turbidimetrijskim merenjma nisu uvek u korelaciji sa brojem ćelija određenih

brojanjem na hranljivim podlogama (Lortal, Chapot-Chartier, 2005.).

Najveći broj ćelija bakterije Lb. paracasei DK2-5a u suspenzijama različitih gustina dobijen

je kao i kod enterokoka metodom nalivanja (Slika 7.). Laktobacili su u odnosu na ostale BMK

izrazito mikroaerofilni tako da neki od njih ne mogu da rastu na površinama podloga. S obzirom da

vrsta Lb. paracasei raste jako sporo pod aerobnim uslovima, tehnika nalivanja omogućava njegov

bolji rast direktno u podlozi.

Slika 7. Ukupan broj ćelija vrste Lb. paracasei DK2-5a u suspenzijama različite gustine sa primenjenim

tehnikama zasejavanja bela-0,3 McF; siva-0,4 McF; crna-0,5 McF; R-tehnika razmazivanja; N-tehnika nalivanja; NE-

tehnika nalivanja sa 1 ml suspenzije; D-tehnika kapljica

Standardne devijacije dobijene za podatke brojanja ćelija laktobacila su značajno manje u

odnosu na standardne devijacije dobijene prilikom određivanja brojnosti enterokoka (Slika 7).

Najmanje standardne devijacije dobijene su za tehniku nalivanja u kojoj je korišćeno 9 ml

fiziološkog rastvora za pravljenje razblaženje.

Broj ćelija laktobacila u odnosu na gustinu napravljenih suspenzija od 0.3, 0.4 i 0.5 McF,

konstanto raste sa gustinom ćelija pri svim korišćenim tehnikama zasejavanja Najveći broj ćelija

laktobacila detektovan je metodom nalivanja u suspenziji gustine 0.5 McF ( 4.9x106) ali je,

generalno, broj ćelija laktobacila sličan broju ćelija enterokoka u odnosu na gustinu suspenzije.

0.00E+00

1.00E+06

2.00E+06

3.00E+06

4.00E+06

5.00E+06

6.00E+06

R N NE D

Bro

j ćel

ija/m

l

16

Na osnovu dobijenih podataka, pre svega većeg broja ćelija ali i manjih standardnih

devijacija, za dalji rad izabrana je tehnika nalivanja. S obzirom da su rezultati pokazali da

zapremine korišćenih suspenzija za pravljenje razblaženja i zasejavanje ne utiču značajno na

određivanje ukupnog broja ćelija u suspenzijama, izabrana je tehnika u kojoj je korišćeno 100 l

suspenzije. Ova tehnika je izabrana zbog bržeg i jednostavnijeg rada, kao i zbog korišćenja

manje količine fiziološkog rastvora.

4.2. Određivanje stepena autolize BMK

Autoliza bakterijskih ćelija predstavlja razgradnju peptidoglikana u ćelijskom zidu

bakterija što dovodi do pucanja ćelija i izlivanja intracelularnog sadržaja u spoljašnju sredinu.

Nastaje delovanjem unutrašnjih peptidoglikan hidrolaza ili može biti indukovana aktivacijom

profaga (Joković, β010). Autolizom bakterija koje se nalaze u hrani, njihovi intracelularni enzimi

(lipaze, peptidaze, esteraze i ostali enzim koji učestvuju u katabolizmu amino kiselina i masnih

kiselina) dospevaju direktno u hranu i utiču na organoleptička svojstva proizvoda. Tako se

autolizom BMK koje se nalaze u sirevima ubrzava proces zrenja i dolazi do povećane hidrolize

gorkih peptida (Lortal, Chapot-Chartier, 2005.). Zato se sojevi BMK koji imaju dobru autolitičku

aktivnost koriste kao pomoćne starter kulture u prehrambenoj industriji (Ayad et al., 2004.).

Autoliza bakterijskih ćelija može nastati iz različitih razloga ali je uvek povećana kada su

ćelije izložene sredinskom stresu odnosno uslovima koji sprečavaju rast bakterijskih ćelija. U

procesima proizvodnje fermentisanih proizvoda, bakterije se nalaze u promenljivim uslovima

zbog stalne izmene sredine u kojoj se nalaze. Zato su u ovom radu izabrana 4 puferska sistema za

praćenje stepena autolize BMK koje su izolovane iz kajmaka. K-fosfatni pufer (pH 6.5) izabran je

kako bi se imitirali uslovi na početku fermentacije, dok je citratni pufer (pH 5) izabran zbog snižene

pH vrednosti supstrata tokom fermentacija. Dodatno su korišćeni i puferi sa γ% NaCl kako bi se

ispitalo da li NaCl povećava autolitička svojstva sojeva BMK. Stepen autoliza određivan je na

osnovu broja ćelija BMK sojeva nakon pravljenja ćelijske suspenzije u određenom puferu i posle

180 minuta inkubacije puferskih sistema na sobnoj temperaturi.

Srednja vrednost stepena autolze 10 sojeva vrste Lc. lactis ssp. lactis prikazan je na Slici 8.

Prosečna vrednost stepena autolize kod laktokoka je 1γ% u K-fosfatnom puferu pH vrednost 6. U

kiselijem citratnom puferu stepen autolize laktokoka se povećava do β5,5% što ukazuje da kiselija

sredina inhibitorno deluje na laktokoke i dovodi do njihove autolize. Dodatak γ% NaCl povećava

17

stepen autolize u oba puferska sistema. Varijabilnost stepena autolize sojeva može se videti na

osnovu standardne devijacije (Slika 8.). S obzirom da su sojevi laktokoka izolovani iz različitih

vrsta kajmaka (Joković, β010) u kojma je procenat soli bio drugačiji, kao i sam proces fermentacije,

velika varijabilnost je očekivana. Visoku varijabilnost u stepenu autolize kod BMK sojeva

izolovanih iz autohtonih mlečnih proizvoda navodi veći broj drugih autora (Aquilanti et al.,

2007; Piraino et al., 2008; Franciosi et al., 2009; Mohammed et al., 2009). Dva soja laktokoka,

DK1-12 i MK1-8, imaju najveću vrednost stepena autolize u citratu od svih ispitivanih sojeva u

ovom radu.

Slika 8. Stepen autolize sojeva vrste Lc. lactis ssp. lactis

Stepen autolize 4 soja vrste St. thermophilus je manji u sva četiri puferska sistema u odnosu

na stepen autolize laktokoka (Slika 9.). Promena pH vrednosti ne utiče mnogo na stepen autolize,

kao ni dodavanje NaCl. Dodati NaCl povećava stepen autolize za β% samo u citratnom puferu. Veći

stepen autolize streptokoka u odnosu na rezultate dobijene u ovom radu prikazali su Franciosi i

saradnici (2008). Varijabilnost stepena autolize streptokokalnih izolata je mala jer su izolovani iz

istog uzorka kajmaka (Joković, β010) tako da predstavljaju isti soj.

0

5

10

15

20

25

30

35

K-fosfatni pufer K-fosfatni pufer sa

3% NaCl

Citratni pufer Citratni pufer sa

3% NCl

Ste

pe

n a

uto

lize

(%

)

18

Slika 9. Stepen autolize sojeva vrste St. thermophilus

Enterokoke sa visokim stepenom autolize se koriste kao pomoćni starteri u proizvodnji

sireva zbog visoke aktivnosti njihovih esterolitičkih i proteolitičkih intracelularnih enzima (Ogier,

Serror, 2008.). Enterokoke sa visokim stpenom autolize su, naročito, značajne zbog prisustva

intracelularnih lipaza koje mogu da ubrzaju proces zrenja mlečnih proizvoda sa visokim procentom

masti (Medina et al., 2004) Stepen autolize sojeva En. faecalis (8), En. faecium (12) i En. durans

(8) dobijeni u ovom radu prikazani su na slici 10. En. durans sojevi imaju najveći stepen autolize u

svim korišćenim puferskim sistemima osim u K-fosfatnom puferu sa dodatkom NaCl u kojem veći

stepen autolize imaju En. faecalis sojevi. Promena pH vrednosti pufera ne menja znatno stepen

autolize kao ni dodavanje NaCl. NaCl ima veći efekat samo na povećavanje stepena autolize kod

En. durans sojeva u citratnom puferu. Kod En. faecium sojeva, dodavanje NaCl smanjuje prosečan

stepen autolize u K-fosfatnom puferu kao i kod En. faecalis sojeva u citratnom puferu. Enterokoke

su bakterije koje su veoma otporne na delovanje spoljašnjih faktora što omogućava njihovu veliku

rasprostranjenost (Ogier and Serror, 2008). Varijabilnost u stepenu autolize ispitivanih

enterokokalnih izolata je veoma velika (Slika 10.).

0

5

10

15

20

25

30

35

K-fosfatni pufer K-fosfatni pufer sa

3% NaCl

Citratni pufer Citratni pufer sa

3% NCl

Ste

pe

n a

uto

lize

(%

)

19

Slika 10. Stepen autolize sojeva vrsta iz roda Enterococcus

Prosečan stepen autolize za β0 sojeva vrste Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides varira

malo u odnosu na pH vrednost pufera kao i na dodatak NaCl. Smanjenje pH vrednosti pufera

malo povećava stepen autolize. NaCl ne utiče na stepen autolize u K-fosfatnom puferu, a

smanjuje stepen autolize u citratnom puferu. Iako je srednja vrednost stepena autolize

leukonostoka relativno mala, nekoliko sojeva je pokazalo dobar stepen autolize, iznad 20%, u

svim ispitivanim puferskim sistemima. Ovi sojevi se mogu iskoristiti za pravljenje pomoćnih

starter kultura za ubrzano dobijanje kajmaka ili sireva jer leukonostoci, takođe, utiču na aromu

mlečnih poizvoda (Ogier et al., 2008).

0

5

10

15

20

25

30

35

K-fosfatni puferK-fosfatni pufer

sa 3% NaCl

Citratni pufer Citratni pufer

sa 3% NCl

Ste

pe

n a

uto

lize

(%

)

En. faecalis

En. faecium

En. durans

20

Slika 11. Stepen autolize sojeva vrste Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides

Laktobacili sa dobrim stepenom autolize se najčešće od svih BMK koriste u pomoćnim

starter kulturama zbog njihove proteolitičke i dipeptidazne aktivnosti zasnovane na intracelularnim

enzimima (Hammes and Hertel, β006). U ovom radu određivan je stepen autolize 6 Lb. paracasei

sojeva i 10 Lb. plantarum sojeva (Slika 12.). Prosečan stepen autolize je veći za Lb. plantarum

sojeve u K-fosfatnom i citratnom puferu. Dodatak NaCl uglavnom smanjuje stepen autolize

laktobacila. S obzirom da se laktobacili izoluju iz kasnijih faza zrenja kajmaka i sireva, verovatno su

razvili odbrambene mehnizme na delovanje promenjenih uslova u spoljašnjoj sredini. Stepen

autolize laktobacila izolovanih iz sireva dobijen u radu Nieto-Arribas i saradnika (β009) je veći u

odnosu na rezultate iz ovog rada.

Slika 12. Stepen autolize sojeva vrsta iz roda Lactobacillus

0

5

10

15

20

25

30

35

K-fosfatni pufer K-fosfatni pufer

sa 3% NaCl

Citratni pufer Citratni pufer sa

3% NCl

Ste

pe

n a

uto

lize

(%

)

0

5

10

15

20

25

30

35

K-fosfatni

pufer

K-fosfatni

pufer sa 3%

NaCl

Citratni

pufer

Citratni

pufer sa 3%

NCl

Ste

pe

n a

uto

lize

(%

)

Lb. plantarum

Lb. paracasei

21

5. ZAKLJUČCI

Rezultati analiza rađenih sa različitim vrstama BMK u ovom istraživanju pokazali su sledeće:

Tehnikom nalivanja dobijen je najveći broj ćelija iz suspenzija BMK pri čemu su

standardne devijacije manje u odnosu na druge tehnike.

Zapremine suspenzija korišćenih za pravljenje serija razblaženja i zasejavanje nisu uticale

značajno na određivanje ukupnog broja ćelija u suspenziji.

Ispitivani sojevi BMK pokazuju veliku varijabilnost u okviru vrste u stepenu autolize.

Niska pH vrednost pufera povećava stepen autolize laktokoka i lekonostoka.

Dodavanje NaCl povećava stepen autolize laktokoka, dok na ostale sojeve BMK ne

deluje značajno, ili dovodi do smanjenja stepena autolize.

Nekoliko sojeva vrste Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides pokazuju visok

stepen autolize, te se mogu koristiti kao starter kulture za ubrzano dobijanje kajmaka ili

sireva.

22

6. LITERATURA

Ammor, S., Tauveron, G., Dufour, E., Chevallier, I., 2006. Antibacterial activity of lactic acid

bacteria against spoilage and pathogenic bacteria isolated from the same meat small scale

facility: screening and characterization of the antibacterial compounds. - Food Control

17: 454–461.

Aquilanti, L., Silvestri, G., Zannini, E., Osimani, A., Santarelli, S. and Clementi, F. 2007.

Phenotypic, genotypic and technological characterization of prediminant lactic acid

bacteria in Pecorino cheese from central Italy. - Journal of Applied Microbiology 103:

948-960.

Ayad, E.H.E., Nashat, S., El-Sadek, N., Metwaly, H. and El-Soda, M. 2004. Selection of wild

lactic acid bacteria isolated from traditional Egyptian dairy products according to

production and technological criteria. - Food Microbiology 21: 715-725.

Bernardeau, M., Vernoux, J.P., Henri-Dubernet, S., Guéguen, M., 2008: Safety assessment of

dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. - International Journal of Food

Microbiology 126: 278–285.

Bozoudi, D., Kotzamanidis, C., Hatzikamari, M., Tzanetakis, N., Menexes, G., Litopoulou-

Tzanetaki, E., 2015. A comparison for acid production, proteolysis, autolysis and

inhibitory properties of lactic acid bacteria from fresh and mature Feta PDO Greek

cheese, made at three different mountainous areas. - International Journal of Food

Microbiology 200: 8-96.

Buist, G. (1997). AcmA of Lactococcus lactis, a cell-binding major autolysin. Ph.D. thesis,

University of Groningen, Haren, The Netherlands.

Buist, G., Karsens, H., Nauta, A., van Sinderen, D., Venema, G., Kok, J., 1997. Autolysis of

Lactococcus lactis caused by induced overproduction of its major autolysin, AcmA. -

Applied and Environmental Microbiology 63: 2722–2728.

Buist, G., Kok, J., Leenhout, K. J., Dabrowsk, M., Venema, G., Haandrikman, A. J., 1995.

Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the major peptidoglycan

hydrolase of Lactococcus lactis, a muramidase needed for cell separation. -Journal of

Bacteriology 177: 1554–1563.

23

Callewaert, L., Walmagh, M., Michiels, C. W., Lavigne, R., 2011: Food applications of bacterial

cell wall hydrolases. - Current Opinion in Biotechnology 22:164–171.

Casalta, E., Montel, M.-C., 2008. Safety assessment of dairy microorganisms: The Lactococcus

genus. - International Journal of Food Microbiology 126: 271–273.

Chapot-Chartier, M.-P., Deniel, C., Rousseau, M., Vassel, L., Gripon, J.-C., 1994. Autolysis of

two strains of Lactococcus lactis during cheese ripening. - International Dairy Journal 4:

251–269.

Christensen, J.E., Dudley, E.G., Pederson, J.A., Steele, J.L., 1999. Peptidases and amino acid

catabolism in lactic acid bacteria. - Antonie Van Leeuwenhoek 76, 217–246.

Cogan, T.M., Barbosa, M., Beuvieur, E., Bianchi-Salvadori, B., Cocconcelli, P.S., Fernandes, I.,

Gomez, J., Gomez, R., Kalantzopoulos, G., Ledda, A., Medina, M., Rea, M.C.,

Rodriguez, E., 1997. Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy

products. - Journal of Dairy Research 64, 409–421.

Davis, C., 2014: Enumeration of probiotic strains: Review of culture-dependent and alternative

techniques to quantify viable bacteria. - Journal of Microbiological Methods 103: 9–17.

Delcour, J., Ferain, T., Deghorain, M., Palumbo, E., Hols, P., 1999. The biosynthesis and

functionally of the cellwall of lactic acid bacteria. - Antonie van Leeuwenhoek 76: 159–

184.

Delorme, C., 2008. Safety assessment of dairy microorganisms: Streptococcus thermophilus. -

International Journal of Food Microbiology 126: 274–277.

Donald J. Reasoner, D.J., 2004: Heterotrophic plate count methodology in the United States. -

International Journal of Food Microbiology 92: 307– 315.

Fortina, M.G., Ricci, G., Borgo, F., Manachini, P.L., Arends, K., Schiwon, K., Abajy, M.Y. and

Grohmann, E. 2008. A survey on biotechnological potential and safety of the novel

Enterococcus species of dairy origin, E. italicus. Int. J. Food Microbiol. 123: 204-211.

Forbes, B.A., Sahm, D.F., Weissfeld, A.S., 2002. Laboratory methods for detection of

antibacterial resistance. - Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology 11: 230–231.

Franciosi, E., Settanni, L., Cavazza, A. and Poznanski, E. 2009. Biodiversity and technological

potential of wild lactic acid bacteria from raw cows' milk. - International Dairy Journal

19: 3-11.

24

Gagnair V., Piot, M., Camier, B., Visseris, J.P.V., Jan, G., Leonil, J., 2004. Survey of bacterial

proteins released in cheese: a proteomic approach. - International Journal of Food

Microbiology 94: 185-201.

Gálvez, A., Abriouel, H., López, R.L., Omar, N.B., 2007. Bacteriocin-based strategies for food

biopreservation.- International Journal of Food Microbiology 120: 51–70.

Gobbetti, M., De Angelis, M., Di Cagno, R., Mancini, L., Fox, P.F., 2015. Pros and cons for

using non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) as secondary/adjunct starters for cheese

ripening. - Trends in Food Science and Technology 45: 167-178.

Hammes, W.P., Hertel, C., 2006. The Genera Lactobacillus and Carnobacterium. In The

Procaryotes. Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria- Springer, New York 4: 320-403.

Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J., 2001: How to optimize the drop plate method for

enumerating bacteria. - Journal of Microbiology Methods 144: 121-129.

Joković, N., 2010. Diverzitet mlečno kiselinskih bakterija izolovanih iz kajmaka. PhD thesis -

Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Joris, B., Englebert, S., Chu, C-P., Kariyama, R., Daneo-Moore, L., Shockman, G.D., Ghuysen,

J.-M., 1992. Modular design of the Enterococcus hirae muramidase-2 and Streptococcus

faecalis autolysin. - FEMS Microbiology Letters 91(3): 257-264.

Khalid, K., 2011. An overview of lactic acid bacteria. - International Journal of Biosciences 3:

1-13.

Kuda, T., Noguchi, Y., Ono, M., Takahashi, H., Kimura, B., Kamita, R., Eto, T., Kato, M.,

Kawahara, M., 2014. In vitro evaluation of the fermentative, antioxidant, and anti-

inflammation properties of Lactococcus lactis subsp. lactis BF3 and Leuconostoc

mesenteroides subsp. mesenteroides BF7 isolated from Oncorhynchus keta intestines in

Rausu, Japan. - Journal of Functional Food 11: 269-277.

Kunji, E.R.S., Mierau, I., Hagfing, A., Poolman, B., Konings, W.N., 1996. The proteolytic

systems of lactic acid bacteria. - Antonie Van Leeuwenhoek 70: 187–221.

Laskowska, e., Wawrzynow, A., Taylor, A., 1996. IbpA and IbpB, the new heat-shock proteins,

bind to endogenous Escherichia coli proteins aggregated intracellularly by heat shock. -

Biochimie 78: 117-122.

Lortal, S., Chapot-Chartier, M-P., 2005. Role, mechanisms and control of lactic acid bacteria

lysis in cheese. - International Dairy Journal 15: 857-871.

25

Mangiapane, E., Mazzoli, R., Pessione, A., Svensson, B., Riedel, K., Pessione, E., 2015. Ten

years of subproteome investigations in lactic acid bacteria: A key for food starter and

probiotic typing. - Journal of Proteomics

Mathot, A.G., Beliard, E., Thuault, D., 2003. Streptococcus thermophilus 580 produces a

bacteriocin potentially suitable for inhibition of Clostridium tyrobutyricum in hard

cheese. - Journal of Dairy Science 86: 3068–3074.

Mathur, S., Singh, R., 2005: Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria - a review. -

International Journal of Food Microbiology 105: 281-295.

Medina, R.B., Katz, M.B., Gonzalez, S. and Oliver, G. 2004. Determination of esterolytic and

lipolytic activities of lactic acid bacteria. - Methods in Molecular Biology 268: 465-470.

Mohammed, M., El-Aziz, A.H., Omran, N., Anwar, S., Awad, S. and El-Soda, M. 2009. Rep-

PCR characterization and biochemical selection of lactic acid bacteria isolated from the

Delta area of Egypt. - International Journal of Food Microbiology 128: 417-423.

Mou, L., Sullivan, J.J., Jago, G.R., 1976. Autolysis of Streptococcus cremoris. - Journal of Diary

Research 43: 275-282.

Nieto-Arribas, P., Poveda, J.M., Sesena, S., Palop, L. and Cabezas, L. 2009. Technological

characterization of Lactobacillus isolates from traditional Manchego cheese for potential

use as adjunct starter cultures. - Food Control 20: 1092-1098.

Ogier, J.-C., Casalta, E., Farrokh, C., Saïhi, A., 2008. Safety assessment of dairy

microorganisms: The Leuconostoc genus. - International Journal of Food Microbiology

126: 286–290.

Ogier, J.-C., Serror, P., 2008. Safety assessment of dairy microorganisms: The Enterococcus

genus. - International Journal of Food Microbiology 126: 291–301.

Pillidge, C., Rallabhand., P., Tong., X.-Z., Gopal, P., Farley, P., Sullivan., P., 2002. Autolysis of

Lactococcus lactis. - International Dairy Journal 12: 133-140.

Piraino, P., Zotta, T., Ricciardia, A., McSweeney, P.L.H., Parente, E., 2008. Acid production,

proteolysis, autolytic and inhibitory properties of lactic acid bacteria isolated from pasta filata

cheeses: a multivariate screening study. - International Dairy Journal 18, 81–92.

Pore, R.S., 1994. Antibiotic susceptibility testing by flow cytometry J. Antimicrob. - Chemother

34 (5): 613-627.

26

Savijoki, K., Ingmer, H., Varmanen, P., 2006. Proteolytic systems of lactic acid bacteria. -

Applied Microbiology and Biotechnology 71: 394-406.

Schleifer, K.H., Ehrmann, M., Krusch, U., Neve, H., 1991. Revival of the species Streptococcus

thermophilus, ex Orla-Jensen, 1919. nom. rev. Systematic and Applied Microbiology 14:

386–388.

Shockman, G. D., 1965. Unbalanced Cell-Wall Synthesis: Autolysis and Cell-Wall Thickening. -

Bacteriological Reviews 29(3): 345-358.

Shockman, G. D., Holtje, J.-V., 1994. Microbial peptidoglycan (murein) hydrolases. In J.-M.

Ghuysen, R. Hakenbeck (Eds.), Bacterial cell wall—new comprehensive biochemistry:

131–166.

Smith, T. J., Foster, S. J., 2000. Autolysins during sporulation of Bacillus subtilis 168. - FEMS

Microbiology Letter 157: 141-147.

Tripathi, M.K., Giri, S.K., 2014. Probiotic functional foods: Survival of probiotics during

processing and storage. - Journal of functional foods 9: 225–241.

Zambonelli, C., Chiavari, C., Benevelli, M., Coloretti, F., 2002. Effects of Lactic Acid Bacteria

Autolysis on Sensorial Characteristics of Fermented Foods. - Food Technology and

Biotechnology 40: 347-351.

рилог 5/1

O - M

, :

, :

, :

, : /

, :

, :

, : Ј

, : ђ

Ј , :

Ј , :

, : .

, : .

, : 2015.

, :

, : , 33.

, : ( / / / / / / )

26 . ; 1 , 12

, :

, :

/К , : , К, , pH, NaCl

579.2: 547.472.3+

637.1

, :

, :

, : ђ , К 4 (К-

, , 3% NaCl). ,

. pH NaCl К ђ . pH ,

NaCl Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.

, : 07. 10.2015.

, : 28.10.2015.

, : : -К

: -

, : Ј

Q4.09.13 - 1

рилог 5/2

И - А А И И А

И

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: university degree thesis

Author, AU: Milica Petković

Mentor, MN: Nataša Joković

Title, TI: Determination of autolysis degree of the lactic acid bacteria isolated from kajmak

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2015

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

26 p. ; 12 pictures, 1 table

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: food microbiology

Subject/Key words, S/KW: lactic acid bacteria, LAB, pH, NaCl, autolysis

UC 579.2: 547.472.3+

637.1

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The optimal technique of bacteria growth was being determined. The greatest number of cells from LAB

suspension was obtained by using the technique of pouring. In addition, the volume of the suspensions

which were used for making the dilute series and growth did not have a significant influence on

determining the total number of cells in the suspension. In the second part, the influence of pH and NaCl

to the degree of autolysis of different LAB species was examined. The degree of autolysis was observed

by the determination of number of cells growth after incubation of suspension for 180 minutes at 30oC in 4

different buffer systems (K- phosphate and citrate buffer, and with addition of 3% NaCl). The examined

strains of LAB have shown a big variability in autolysis degree within one species. In some species of LAB

different level of pH and NaCl increases level of autolysis, which makes them suitable as starter cultures.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

07.10.2015.

Defended on, DE: 28.10.2015.

Defended Board, DB:

President: PhD Tatjana Mihailov-Krstev

Member: PhD Zorica Stojanović-Radić

Member, Mentor:

PhD Nataša Joković

О р з ц Q4.09.13 - Из њ 1