Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Batisttini”

Dpto. de Ciencias Fisiológicas: Bioquímica

Profesora: Zulay Castillo Pérez

Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.

Unidades del Metabolismo

Regulan la velocidad de las reacciones químicas espontáneas

(ΔG-).

No promueven reacciones no-espontáneas (Δ G +).

Incrementan la velocidad de reacción 103 a 1012 veces sin afectar

el sentido de la reacción.

No forman parte del producto de la reacción.

Catalizador de origen biológico y naturaleza proteica, de alto peso

molecular y conformación tridimensional característica, acelera la

reacción al disminuir la energía de activación.

Contiene un centro activo, generalmente situado en un entorno

apolar. La actividad catalítica requiere que dicho centro adopte una

conformación determinada, mantenida por el resto de la molécula

proteica.

No hacen factibles las reacciones imposibles

Son sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan

notablemente su velocidad.

Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar

reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de

presión, temperatura o pH.

Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en

los seres vivos están catalizadas por enzimas.

* En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)

Aumentan la velocidad de reacción

De 106 a 1012 veces vs sin enzima.

Aún más rápido que los catalizadores químicos.

Condiciones de reacción

Temperatura 25-40 o C (algunas hasta 75 o C)

pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5

Presión atmosférica normal

Capacidad de regulación

Por concentración de sustrato

Por concentración de enzima

Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)

Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)

Por regulación alostérica

Alta especificidad de reacción

Interacción estereoespecífica con el sustrato

No hay productos colaterales.

Las enzimas simples están constituidas por proteína sin

requerir de la unión de otra molécula o grupo químico para

realizar su actividad catalítica.

Las enzimas conjugadas poseen en su estructura una parte

no protéica esencial para su funcionamiento que según su

naturaleza puede llamarse cofactor o coenzima.

Apoenzima: fracción protéica

Cofactor: grupo que se une a la fracción protéica para

permitir el correcto funcionamiento de la enzima.

Holoenzima: fracción protéica + cofactor o coenzima

Átomo, ion o molécula que participa en el proceso catalítico

sin ser enzima ni sustrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salen sin

ser modificados del sitio catalítico.

Como un segundo substrato; salen modificados del sitio

catalítico y por lo general requieren otra enzima para volver al

estado original.

En función de su naturaleza los cofactores se denominan:

Grupos prostéticos: se trata de iones o moléculas inorgánicas.

Coenzima: es una molécula orgánica. Aquí se puede señalar, que

muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las

deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde más bien

a que no se origina la coenzima, para una determinada enzima.

Tiamina B1 Tiamina pirofosfato

RiboflavinaFAD (Flavín adenín dinucleótido), FMN

(Flavín mononucleótido)

Piridoxina PLP (Piridoxal fosfato)

Cobalamina Metilcobalamina, cobamida

Ácido pantoténico Coenzima A (CoA)

NicotinamidaNAD+ (Nicotín adenín dinucleótido) Y NADP+

(Nicotín adenín dinucleótido fosfato)

Ácido lipoico Lipoamida

Ácido fólico THF (Tetrahidrofolato)

Hemo Hemoenzimas , citocromos

Complejos Fe-S Ferredoxinas

Quinonas Transporte electrónico mitocondrial y

fotosintético

Glutatión Redox, transporte de aminoácidos

ATP Transferencia de fosfato y/o energía

UTP Transferencia de grupos glucosídicos

Carnitina Transportador de grupos acilo

Región de la enzima donde se une la molécula de sustrato de

forma específica, suele ser un bolsillo o una hendidura que se

forma entre las cadenas laterales de los aminoácidos.

Estas cadenas:

• Facilitan la unión del sustrato (especificidad de sustrato)

• Intervienen en la catálisis (centro catalítico)

Supone una porción relativamente

pequeña del volumen total de la

enzima

Es una entidad tridimensional

Se unen a los sustratos por fuerzas

relativamente débiles

Son hoyos o hendiduras de las que

suele quedar excluida el agua, salvo

que sea un componente de la

reacción

La especificidad del enlace depende

de la disposición de los átomos

del centro activo

Lugar de la enzima en el que ocurre la catálisis y puede

incluir también:

• Coenzimas

• Cofactores

Puede coincidir o no con el centro activo

En 1894, Emil Fischer propuso la hipótesis de la llave-cerradura

Sitio activo

En 1958, Koshland propuso el modelo del ajuste inducido

Conformación del estado de transición

Sitio activo

Estereoespecificidad

Centros activos asimétricos: sólo L-aminoácidos

Capacidad de distinguir entre estereoisómeros

Especificidad geométrica

Grupos químicos que interactúan con el sitio activo

Más limitante que la estereoespecificidad

Enzimás digestivas: más “preferencia” que “especificidad”

Antiguamente, las enzimas recibían nombres particulares, asignados

por su descubridor.

Ejemplo:

amilasa (hidroliza el almidón)

Glc + ATP Glc-6P + ADP

Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo necesaria

una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción

específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.

Consta actualmente de 3 partes:

el sustrato preferente

el tipo de reacción realizado

terminación "asa"

Ejemplo: la glucoquinasa

ATP-glucosa-fosfo-transferasa

Glc + ATP Glc-6P + ADP

El nombre es identificado por un código numérico:

Encabezado por las letras EC (enzyme commission), seguidas de

cuatro números separados por puntos:

el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la

enzima,

el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada

grupo,

el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos

específicos que intervienen en la reacción.

Ej.: ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa)

Glc + ATP Glc-6P + ADP

EC 2.7.1.2.

2: transferasa

7: fosfotransferasa

1: el aceptor es un grupo OH

2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo

fosfato.

Clases

1. Óxido-reductasas

2. Transferasas

3. Hidrolasas

4. Liasas

5. Isomerasas

6. Ligasas

Catalizan reacciones de transferencia de hidrógeno (H) o

electrones (e-) de un sustrato a otro

AH2 + B ⇄ A + BH2

Ared + Box ⇄ Aox + Bred

Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto

del hidrógeno) de un sustrato a otro

A-B + C ⇄ A + C-B

Catalizan las reacciones de hidrólisis

A-B + H2O ⇄ AH + B-OH

Catalizan reacciones de ruptura o unión de sustratos

A-B ⇄ A + B

Catalizan la interconversión de isómeros

AB BA

Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un

nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.)

A + B + XTP A-B + XDP + Pi

Perfil energético de una

reacción espontánea

Perfil energético de una

reacción catalizada

La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de

activación.

Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que

disminuyen la energía de activación, aún más que los catalizadores

inorgánicos.

Por ejemplo, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede ocurrir:

sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol

con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol

con una enzima específico (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol

Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000

veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000 veces.

Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes

deben chocar con una energía y una orientación adecuadas.

La enzima :

Aumenta la concentración efectiva de los sustratos (aumenta la

probabilidad de choque)

Permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con

una orientación óptima para que la reacción se produzca y

Modifica las propiedades químicas del sustrato unido a su centro

activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de

otros nuevos

Estudio cuantitativo de la catálisis enzimática que proporciona

información sobre las velocidades de reacción, afinidad de las

enzimas por su sustrato, mecanismos de reacción y los

inhibidores

Aplicación:

- Mejor comprensión de las rutas metabólicas

- Diseño de tratamientos más adecuados

Velocidad de una reacción bioquímica: Cambio de la

concentración de un reactante o un producto por unidad de

tiempo

1. Concentración de sustrato

2. Concentración de enzima

3. pH

4. Temperatura

5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

La velocidad inicial Vo de la reacción A → P , donde A= Sustrato y P=Producto, es:

Es proporcional a la frecuencia con que las moléculas reactantesforman el producto, la velocidad de reacción es

- Δ[A] Δ[P]Vo=

ΔtΔt=

Donde

[A]= concentración de sustrato

[P]= concentración del producto

T= tiempo

Vo= K [A]x Donde

Vo= velocidad

K= constante de velocidad (temp, pH, fuerza iónica)

X= orden de reacción

Reacción de Primer Orden:

La velocidad es proporcional a la

concentración de sustrato

Reacción de Orden Cero:

Independientemente de la

concentración de sustrato, la

velocidad es constante

Orden de Reacción: Suma de los componentes de los

términos de concentración en la expresión de velocidad

Modelo propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en

1913

Hipótesis del Estado Estacionario: establece que [ES] se

mantiene casi constante durante gran parte de la reacción

E + S ES E + P

k1

K-1

k2

Donde:

K1= constante de velocidad de la

formación de ES

K-1= constante de velocidad de la

disociación de ES

K2= constante de velocidad de la

formación y liberación del

producto del lugar catalítico

K1 [E][S]=K-1 [ES] + K2 [ES]

Inducen una nueva constante: Km (Constante de Michaelis)

Ecuación de Michaelis-Menten:

vV s

K sm

max

Donde

Vmax= velocidad máxima

Km= constante de Michaelis

[S]= concentración del

sustrato

Km=K-1 + K2

K1

Representa la Ecuación de Michaelis-Menten

Km (Constante de Michaelis): mide laconcentración del sustrato a la que laenzima tiene la mitad de la velocidadmáxima (Vmáx/2)

Vmáx: Se alcanza cuando todos los centroscatalíticos de la enzima se encuentranocupados por sustrato

Km y Vmax se determina midiendo las velocidades iniciales de reacción a varias [S]

No todas las enzimas cumplen las condiciones

(Enzimas alostéricas)

Difícilmente aplicable a reacciones con dos

sustratos

No se puede determinar con exactitud Vmax ni

Km (Hipérbola rectangular, nunca llega a Vmax)

Unidades Internacionales (UI): Cantidad de enzima

necesaria para producir 1 μmol de producto/minuto

Nueva Unidad: Katal

Cantidad de enzima que transforma 1 mol de

sustrato/segundo (6 x 107 UI)

Grado de Pureza: Actividad Específica. Número de UI

en 1 mg de proteína

Consiste en representar la recíproca de la ecuación de

Michaelis-Menten

Resultado: línea recta

Pendiente: Km/Vmax

Corte en ordenada: 1/Vmax

Corte en Abscisa (extrapolado): -1/Km

1

v0

KM

Vmax

1

S

1

Vmax

Donde:

y = 1/Vo

x = 1/[S]

m = Km/Vmáx

b = 1/VmáxY = mx + b

Inhibidores: moléculas que reducen la actividad de una enzima

(fármacos, antibióticos, conservantes alimentarios, venenos)

- Importante para regular las rutas metabólicas

- Tratamiento clínico

Tipos de Inhibición Enzimatica:

Isostérica: Reversible (competitiva, acompetitiva y no

competitiva) e Irreversible

Alostérica

El inhibidor competitivo es muy similar al sustrato normal

de la enzima. Dada esa similitud estructural, este tipo de

inhibidor se une reversiblemente al sitio activo de la

enzima.

Varia el Km, en presencia del inhibidor Vmáx, no es alcanzada. Puede ser superada al aumentar la [S]

El inhibidor se combina sólo con ES, por lo que el inhibidor ejerce su efecto sólo a altas concentraciones de sustrato en las que hay gran cantidad de

complejo enzima-sustrato (ES).

Aumenta el Km, disminuye Vmáx y mantiene Km/Vmáx

El inhibidor se combina con la enzima en un lugar distinto al

sitio activo.

Tanto EI como EIS se forman:

Mantiene el Km disminuye Vmáx y

aumenta Km/Vmáx

Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima,

modificándola covalentemente, su acción no se describe por una constante

de equilibrio, sino por una constante de velocidad:

E + I E’

A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores

irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.

Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Sustratos suicidas:

(Inhibidores activados enzimáticamente)

E + I EI EI* E’ + I*1 2 3

1. El inhibidor se unen al centro activo de la enzima, de manera específica, igualque el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especiealtamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva aligual que un inhibidor irreversible.

Tienen por tanto:

(a) la especificidad del inhibidor competitivo y

(b) la potencia de los inhibidores irreversibles

Ejemplo: Sistema de la b-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos(penicilinas, sus derivados semisintéticos ycefalosporinas) ha conducido a la aparición deresistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estosantibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibióticos b-lactámicos.

R CO NHS

N

O

CH3

CH3

COO-

R CO NHS

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

-Lactamasa

Penicilina (activa)

Ác.peniciloico (inactivo)

[E] Temperatura

pH

Características:

También llamadas regulables, la actividad de la enzima seafecta por moléculas efectores que se unen en otros lugares;sitios alostéricos o regulables

Catalizan pasos reguladores claves de las rutas bioquímicas

La regulación puede ser:

Activación alostérica: enzima aumenta afinidad por elsustrato (disminuye su Km), así como su velocidad de catalisis

Inhibición alosterica: efectores negativos.

Características:

Cinéticamente no sigue el

comportamiento catalítico de MM

- Gráfica: curva sigmoidea o

hiperbólica

La presencia de una sigmoide

implica la existencia de

cooperatividad en la fijación del

substrato

Vo

[S]

La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de unamolécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así hastaocuparse toda la molécula

s s s ss s

s

s

s s

+ + +

1 2 3

En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3

Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación deuna molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.

Enzimas Alostéricas

1. Monad, Wyman y Chanqeux (MWC)

1. Kosland, Nemethy y Filmes (KNF)

2. Eigen (Eig)

s

s s s s s

ss s

s

ii i i i i

i i i

i

Forma R

Forma T

Los inhibidores alostéricos aumentan

el grado de cooperatividad

Los activadores alostéricos

disminuyen el grado de

cooperatividad; a concentraciones

elevadas de activador, la cinética

pasa a ser michaeliana, y deja de ser

sigmoide.

Inhibidores y activadoresalostéricos

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Activador

Inhibidor

Sin

Inhibición

Control Homoalostérico

Control Heteroalostérico

s si

Centro

activoCentro

alostérico

Centro

alostérico

Centro

activo

En ausencia de inhibidor, el sustratose fija normalmente al centro activo

Cuando el inhibidor ocupa el centroalostérico, tiene lugar un cambioconformacional en el centro activo queimpide la fijación del sustrato

La mayoría de las enzimas catalizan reacciones con dos

o más sustratos

Varios mecanismos posibles

- Orden de unión de los sustratos

- Orden de liberación de los productos

Determinación más compleja que en las enzimas

monosustrato

- Para cada sustrato hay Km, Kcat y Vmax

Secuencial Ordenado

Secuencial Aleatorio

Mecanismo secuencial

o de desplazamiento

simple:

adición de todos los

sustratos para poder

obtener los productos

Mecanismo de doble desplazamiento o ping pong:

No se han unidos todos los sustratos cuando ya hay

salida de productos

Catálisis Covalente

- Grupo reactivo que se une transitoriamente mediante enlace

covalente

Catálisis Ácido-Base

- Molécula diferente de H2O acepta o cede protón

Catálisis por Iones Metálicos

- Varias funciones, dependiendo de la reacción

Catálisis por Aproximación

Catálisis por unión del Estado de Transición

Quimotripsina: proteasa que rompe enlaces

peptídicos adyacentes a los aminoácidos aromáticos

Catálisis Covalente

- Unión irreversible con el diisopropilfluorofosfato

(DFP)

- Actividad de residuo clave, Ser 195

Catálisis Ácido-Base

- Otros dos elementos de “triada catalítica”

- Asp 102 e His 57

Aprox. 30% de las enzimas usan iones metálicos:

- Metaloenzimas unidas fuertemente a metales de

transición: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+

- Metaloenzimas unidad débilmente a metales en

solución: Na+, K+, Mg2+ o Ca2+

Mecanismos:

- Enlace con el sustrato para permitir su adecuada

orientación

- Participación del metal en mecanismos de

oxidorreducción

- Estabilizador de la reacción al atraer cargas negativas

del sustrato

Observada en reacciones con varios sustratos

- Reactantes se encuentran en relación espacial

óptima

Proximidad: acercamiento simple de las moléculas

- Aumentos de velocidad de hasta 5x

Orientación: acercamiento de los grupos

Uno de los mecanismos más importantes

- Enzima tiene mayor afinidad por el estado

de transición que por los sustratos o

productos

Conjuntamente con los demás, es

responsable de los grandes aumentos de

velocidad

Las rutas bioquímicas están organizadas en reacciones químicas

catalizadas por enzimas, donde la regulación se hace más compleja

Razones de la regulación:

- Mantenimiento de un estado ordenado

- Conservación de la energía

- Respuestas a las variaciones ambientales

Se realiza:

- Regulación de la concentración enzimática

- Regulación de la actividad intrínseca de la enzima

1. Regulación alostérica

2. Regulación por modificación covalente

Regulación alostérica

Procesos a nivel celular; regulación de ajuste fino de la actividadenzimática, a través de efectos de retroalimentación (negativao positiva)

Regulación por modificación covalente

Procesos a nivel supracelular (orgánico); regulación a gran escalade actividades enzimáticas, a través de modificación covalentede enzimas, provocadas por señales (transducción de señales)

Retroalimentación Negativa en Vías Metabólicas

Thr a-cetobutirato IleTreonina

desaminasa

Síntesis de Isoleucina

El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primeraenzima de la misma, Treonina desaminasa

Regulación alostérica

Suele haber fenómenos de modificación covalente deenzimas en la respuesta celular a señales químicas:

1. Neurotransmisores

2. Hormonas

3. Factores de crecimiento

4. Estímulos morfogenéticos y de diferenciación

5. Muerte celular programada (apoptosis)

6. Estímulos antigénicos

7. Luz y otros agentes físico-químicos

Fosforilación: Protein kinasas

Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr

Ser

ATP ADP

Ser

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2OH

O

H

R

H

O

R'

H

H

H

H

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2O

O

H

R

H

O

R'

H

P O-

O

O-

H

H

H

Defosforilación: Protein fosfatasas

Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P

Adenilación.Sistema de la Glutamina sintetasa

Tyr

O

OH OH

N

N N

N

H2NC

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R

H

O

R'

H

CH2 O P

O

O-

O CH2

H

H

H

ADP-ribosilación. Actúa NAD+ como donador del grupo ADP-ribosa

H

H

H

O

OH OH

N

N N

N

H2N

+

C

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R

H

O

R'

H

NHC

NH2

N

O

OH OH

CH2 O P O P O CH2

O O

O-O-H

Son variantes de una misma enzima. Formas

físicamente distintas de una enzima pero que catalizan

una misma reacción

Enzimas multiméricas con varios tipos de subunidades

- LDH: cuatro cadenas, tipos M y H

- 5 isoenzimas diferentes

- Preferencia por reacciones diferentes

Permite ajustes sutiles en función catalítica, una enzima

simple puede tener isoenzimas, ej: anhidrasa carbónica

Niveles enzimáticos como índices de enfermedad

Enzimas Funcionales: Actúan normalmente enlas reacciones del metabolismo

Enzimas No Funcionales: Aumentan sus nivelescuando hay daño tisular o orgánico

Enzima no Funcional Daño ocasionado

a-amilasa Daño pancreático

Fosfatasa AlcalinaObstrucción biliar,

cáncer de huesos

Fosfataa Ácida Cáncer de Próstata

Creatinfosfoquinasa (CKmb), Lactato

Deshidrogenasa (LDH-H4), a-hidroxibutirato

DH

Infarto al miocardio

Trasaminasa Glutámica Oxaloacético

(TGO)Evalúa infarto

Trasaminasa Glutámica Pirúvica (TGP) Evalúa la Hepatitis