AMINOCIDOS PPTIDOS Y PROTEINAS

M. EN C. ISRAEL VELZQUEZ MARTNEZ 1

AMINOCIDOS, PPTIDOS Y PROTENAS. Los aminocidos, como su nombre lo indica, son bifuncionales. Contienen un grupo amino bsico y un grupo carboxlico cido.NH2 O R OH N H O H OH

Un -aminocido primario

L-Prolina Un -aminocido secundario

Con fines de clasificacin, las cadenas con menos de 50 aminocidos se llaman polipptidos, mientras que el trmino protena se reserva a cadenas mas largas.O H3C OH NH2 O O O H3C OH NH2 NH OH

+

H2N

Alanina

Glicina

un dipptido (un enlace amida)

Un polipptido (muchos enlaces amida). Estructura de los aminocidos.

Como los aminocidos contienen un grupo cido y un grupo bsico, experimentan una reaccin cidobase intramolecular y se encuentran principalmente en la forma de un in dipolar, o Zwitterion (del alemn zwitter, hbrido):O H3C OH H2N H H3N+

O H3C O H

-

Alanina (sin carga)

(zwitterion) 2

Los iones dipolo (zwitterions) de los aminocidos son sales internas y por ello tienen muchas de las propiedades fsicas asociadas con las sales. Poseen momentos dipolares grandes, son solubles en agua e insolubles en hidrocarburos, y son sustancias cristalinas con puntos de fusin altos. Adems los aminocidos son Anfteros: pueden reaccionar como cidos o como bases, dependiendo de las circunstancias.

En solucin cida

En solucin bsica

En la siguiente tabla se representan las estructuras de los 20 aminocidos que se que encuentran en las protenas. Todos son -aminocidos. Diecinueve de los 20 aminocidos son aminas primarias, RNH2, y slo difieren en la naturaleza del sustityete unido al carbono , llamado Cadena lateral. Cadena lateral

Un -aminocido primario

Prolina, Un -aminocido secundario

Adems de los 20 aminocidos que se encuentran en las protenas, hay otros aminocidos que no son protenas y que tienen importancia biolgica.O I O H3N+ -

O

-

O

HO O-

I

HS+

NH3 I O I

+

O

NH3

cido -aminobutrico

Homocsteina

Tiroxina

3

ESTRUCTURA DE LOS AMINOCIDOS. Nombre Abreviaturas PM Estructura pKa pKa pKa PI Sol. P.f. COOH NH3+ cad. lat. H2O, g/dL a 25C

Aminocidos Neutros.O H3C OH

Alanina

Ala (A)

89

NH2

2.34O

9.69

---

6.01

17

297 d

H2N OH

Asparagina

Asn (N)

132

O

NH2

2.02

8.80

---

5.41

2.4

236

O

HS

OH NH2

Cistena

Cys (C)

121NH2

1.96O

10.28 8.18

5.07

Muy --Soluble

O

OH NH2

Glutamina

Gln (Q)

146O H2N

2.17

9.13

---

5.65

3.6

186

Glicina

Gly (G)

75

OH

2.34O

9.60

---

5.97

25

233 d

CH3 H3C

OH

Isoleucina

Ile (I)

131

NH2

2.36O

9.60

---

6.02

4

284

H3C OH CH3

Leucina

Leu (L)

131

NH2

2.36O

9.60

---

5.98

2

337

S H3C OH NH2

Metionina

Met (M)

149

2.28

9.21

---

5.74

3

283

4

Nombre

Abreviaturas PM

Estructura

pKa pKa pKa PI Sol. P.f. COOH NH3+ cad. lat. H2O, g/dL a 25C

Aminocidos Neutros contO

OH NH2

Fenilalanina

Phe (F)

165O H N

1.83

9.13

---

5.48

3

283

OH

Prolina

Pro (P)

115O

1.99

10.60 ---

6.30

162

220

HO

OH NH2

Serina

Ser (S)

105CH3

2.21O

9.15

---

5.88

5

228

HO

OH NH2

Treonina

Thr (T)

119

2.09O

9.10

---

5.60

Muy 257 Soluble

OH

Triptofano

Trp (W)

204

NH2 NH

2.83O

9.39

---

5.89

1

289

OH

Tirosina

Tyr (Y)

181

NH2 HO

2.20

9.11

10.07 5.66

0.04

344

CH3

O

H3C

OH NH2

Valina

Val (V)

117

2.32

9.62

---

5.96

9

315

5

Nombre

Abreviaturas PM

Estructura

pKa pKa pKa PI Sol. P.f. + COOH NH3 cad. lat. H2O, g/dL a 25C

Aminocidos cidos.O

cido asprtico

HO

Asp (D)

133O NH2

OH

1.88

9.60

3.65

2.77

0.4

269

O

O

cido glutmico

Glu (E)

147

HO NH2

OH

2.19

9.67

4.25

3.22

0.7

247

NH2

O

Aminocidos bsicos.HN NH NH2 OH

Arginina

Arg (R)

174H N

2.17

9.04

12.48 10.76 15

230 d

O

OH NH2

Histidina

His (H)

155

N

1.82O

9.17

6.00

7.59

0.4

287

H2N OH

Lisina

Lis (K)

146

NH2

2.18

8.95

10.53 9.74

Muy 255 Soluble

Problema 1. Cuntos de los aminocidos que se muestran en la tabla contienen anillos aromticos? Cuntos contienen azufre? Cuntos contienen alcoholes? Cuntos contienen cadenas laterales hidrocarbonadas? Con excepcin de la glicina, los carbonos de los -aminocidos son centros quirales. Por lo tanto, son posibles dos formas enantiomricas, pero la naturaleza slo utiliza una para la construccin de las protenas. En las proyecciones de Fischer, los aminocidos que se encuentran en forma natural se representan colocando el grupo COOH en la parte superior y la cadena lateral abajo, como se dibuja un carbohidrato, y luego se coloca el grupo NH2 a la izquierda. Debido a la similitud estereoqumica con los azcares L, llamamos a los -aminocidos que se encuentran en forma natural como aminocidos L.

6

CHO H OH CH2OH H

COOH NH2 R HO

CHO H CH2OH H2N

COOH H R

D-gliceraldehdo

D-aminocido

L-gliceraldehdo

L-aminocido

Problema 2. Dieciocho de los 19 L-aminocidos tienen configuracin S en el carbono . La csteina es el nico L-aminocido con una configuracin R. Explique la razn. Problema 3. El aminocido Treonina, cido (2S, 3R)-2-amino-3-hidroxibutanoico tiene dos centros quirales. Dibuje una proyeccin de Fischer para la Treonina. Cuntos estereoismeros podran existir? Dibuje las proyecciones de Fischer e identifique los centros quirales como R o S. Problema 4. Dibuje formulas con enlaces de cua (tetradricas) y proyecciones de fischer que representen la configuracin de los tomos de carbono de la L-valina, L-leucina y L-isoleucina.

Aminocidos esenciales. Son aminocidos que el organismo no puede sintetizar. Reaccin de transaminacin.COOH H2N R H COOH COOH COOH

Enzimas transaminasas

+R1

O

(muchos pasos)R

O

+

H2N R1

H

Aminocido Antiguo

cetocido antiguo

cetocido nuevo

aminocido nuevo

Fenilcetonuria.O

O

OH NH2

EnzimasNH2 HO

OH

7

REACCIN DE TRANSAMINACIN. Un interesante el papel de las iminas como intermediarios es el de la reaccin de transaminacin, de importancia biolgica. La transaminacin es un proceso por el cual se transfiere un grupo amino de una molcula a otra. En los sistemas biolgicos el grupo amino de un aminocido se transfiere al grupo carbonilo de otra molcula. La secuencia, es promovida por una enzima, la transaminasa, es un mtodo de formacin de nuevos aminocidos.NH2 O H3C OH O O

+

HO O

OH

glutamato transaminasa

AlaninaO H3C O HO

cido--cetoglutrico.O O

+

HO NH2

OH

cido pirvico

cido glutmico

Todas las transaminasas importantes parecen compartir la misma coenzima, el fosfato de piridoxal. Las coenzimas son pequeos constituyentes no protenicos de las enzimas, con frecuencia indispensables para la actividad enzimtica.O H OH O HO HO N CH3 P O

Fosfato de piridoxal. La transaminacin biolgica no es la simple transferencia de un grupo amino de una molcula a otra. El grupo carbonilo de la coenzima piridoxal forma primero una imina con el grupo amino del aminocido donador. La reaccin subsiguiente de este aducto con el compuesto carbonlico receptor conduce a la formacin de un nuevo aminocido, regenerndose el fragmento de piridoxal. El piridoxal es el transportador del grupo amino de un reactivo a otro. La secuencia, de numerosos pasos, supone una serie de adiciones e isomerizaciones reversibles.

8

Mecanismo general de una reaccin de transaminacin.O R OH PRP N R

PRP

H

+H2N O

H O OH

+

H2O

PRP PRP N R H H O OH H O OH N R

O PRP H N R PRP NH2 R

+H O OH

H2O

H H

+

O OH

O PRP H H NH2

PRP R1

N

R1

+

O OH

H H O OH

+

H2O

PRP

N

R1

PRP

N

R1

H H O OH

H O OH

PRP

N

R1

PRP

O

H2N

R1

H O OH

+

H2O H

+O OH

PRP = fosfato de piridoxal.

9

Reaccin de transaminacin catalizada por la Aspartato aminotransferasa.H3C N O P O-

CH3

H3C B: O H O-

CH3

O

-

OH O+

O

-

H O-

O-

O O O P O-

paso lento

N H

CH3

O

NH2 O-

NH

+

OH O+

N H H3C B+

CH3

CH3 O-

O-

aldiminaO O O-

O O O NH+ -

H O O P O-

O

-

NH

+

O O OH O

-

O

-

OH O

O P O-

O

-

H2O-

O+

NH3

+

N H

CH3

N H

CH3

O P O-

O

OH O+

quinoideH3C NH3+

CH3 B:

N H

CH3

O P O-

O

-

O

OH OH3C+

HO-

O-

H3C+

OO

N H

CH3

NH O P O-

O

-

OH O+

H3C B+

CH3 O H3C+ -

N H O O NH H3C+

CH3 O-

H

H3C+

O NH

O CH3 NH2 NH3

-

O P O-

O

-

OH O

O P O-

O

-

H3C OH

H3C NH+

CH3

O+

N H

CH3

N H

CH3

O P O-

O

-

OH O+

N H

CH3

10

ACIDEZ, BASICIDAD Y pKa. Lewis. cido: acepta electrones. Base: cede electrones. Brosnted-Lowry. cido: cede protones Base: recibe protones. H-A cido + H2O Base H3O+ + Acido base conjugado conjugada

Keq = [H3O+][A-] [HA][H2O] La concentracin del agua permanece casi constante. [H2O]= 55.6 M a 25C. Ka = Keq [H2O] = [H3O+][A-] [HA] log Ka = log [H3O+][A-] [HA] log Ka = log [H3O+] + log [A-] [HA] - log Ka = - log [H3O+] - log [A-] [HA] pKa = pH log [A-] [HA] pH pKa = log [A-] [HA] pH = pKa + log [A-] [HA] Ecuacin de Henderson Hasselbalch.

11

Un cido ms fuerte (de mayor Ka) tiene pKa menor. Un cido ms dbil (de menor Ka) tiene mayor pKa. Compuesto en una solucin de pH por debajo del pKa se encuentra protonado (ionizado). Compuesto en una solucin de pH por encima del pKa se encuentre no protonado (no ionizado). Factores que afectan el pKa: Efecto resonante. Efecto inductivo y electrosttico. Efecto estrico. Puentes de hidrgeno intramoleculares. Hibridacin.

Efecto inductivo.O O 2N H3C OH OH Cl O O Cl OH Cl OH Cl Cl O O Cl OH F 3C OH O

pKa:

4.5

1.68

2.8

1.3

0.9

0

Efecto resonanteO O H3C H3C OH OH R1 R O R NO2 O+

NH3 R1 O

+

NH3

+

NH3

+

O

O

N

O

pKa: 4.5

16

11

19.20

1.11

2.5

4.60

Efecto estricoO CH3 H3C O

H3C OH H3C

H3C

OH CH3 H3C CH3

pKa:

4.5

7.0

12

Puentes de hidrgeno.O O OH

OH

HO

OH

pKa: 4.5 pKa: 9.3 Hibridacin.H3C

3.0 13.4

HN H3C

+

H3C CH3 N H+

C

NH

+

pKa:

9.8

5.2

- 10

AMINOCIDOS. INFLUENCIA DE LA CADENA LATERAL.O H N OH NH2 NH N O H N NH2 O OH

OH

pKa: 1.99 pKa: 10.60

pKa: 2.83 pKa: 9.39 pKa: - - -

pKa: 1.82 pKa: 9.17 pKa: 6.00

O HO OH O NH2

NH2

O

HN

NH NH2

OH

pKa: 1.88 pKa: 9.60 pKa: 3.65

pKa: 2.17 pKa: 9.04 pKa: 12.48 13

Problema 5. Pronostique los productos de reaccin de: (a) prolina, (b) tirosina, (c) arginina y (d) triptofano con un exceso de HCl; y con un exceso de NaOH.

Problema 6. Escriba las formulas estructurales para las siguientes ecuaciones: (a) fenilalanina con un equivalente de NaOH. (b) Producto de (a) con un equivalente de HCl. (c) Producto de (a) con dos equivalentes de HCl.

PUNTO ISOELCTRICO.

pH bajo (protonado)Punto Isoelctrico PI = pKa1 + pKa2 2 Zwitterion neutro.

pH alto (desprotonado)

El punto isoelctrico (PI) de un aminocido depende de su estructura; y es el promedio de las dos constantes de disociacin cida que incluyen el zwitterion neutro. En cuanto a los aminocidos con una cadena lateral que sea un cido fuerte o un cido dbil, el PI es el promedio de los dos valores de pKa ms bajos. En el caso de los aminocidos con una cadena lateral bsica, el PI es el promedio de los dos valores de pKa ms altos.

Aminocido cido cido asprtico.

Aminocido neutro Alanina

Aminocido bsico Lisina 14

As como los aminocidos tienen sus PI, las protenas tambin tienen un PI global debido a los numerosos residuos cidos o bsicos que pueden contener. Aprovechamos la ventaja de las diferencias de puntos isoelctricos para separar una mezcla de aminocidos (o una mezcla de protenas) en sus constituyentes puros mediante la tcnica de la Electroforesis. Tira de papel a pH = 6.02

Cuando se aplica un potencial elctrico, los aminocidos con cargas negativas (los que se han desprotonado a causa de que el pH del buffer es ms alto que sus PI) migra lentamente hacia el electrodo positivo. Al mismo tiempo que los aminocidos con cagas positivas (los que se han protonado porque el pH del buffer es menor que su PI) migran hacia el electrodo negativo. Los diferentes aminocidos migran a diferentes velocidades, lo que depende de sus puntos isoelctricos y del pH del buffer acuoso. As es posible separar una mezcla de diversos aminocidos. Problema 7. Para las siguientes mezclas de aminocidos, prediga usted la direccin y la velocidad relativa de migracin de cada componente:

(a) (b) (c) (d)

valina, cido glutmico e histidina a pH= 7.6 glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.7 glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.5 glicina, fenilalanina y serina a pH= 6.0

Problema 8. La glicina, al igual que la alanina tiene un punto isoelctrico de 6.0. Trace estructuras de las formas predominantes de la glicina a pH= 2.0, 6.0 y 10.0.

Problema 9. Cmo podra explicar el hecho de que el triptofano tenga menor punto isoelctrico que la histidina, pese a que ambos tienen tomos de nitrgeno en el anillo de cinco miembros? Cual nitrgeno del anillo de cinco miembros de la histidina es ms bsico?

15

Un aminocido reacciona con dos equivalentes del hidrato de ninhidrina, para dar el prpura de Ruhemann, un producto azul-violeta. Esta reaccin se emplea como ensayo para detectar la presencia de aminocidos en una muestra desconocida.O OH O OH O O O

R

O

-

+H3N+

O

ninhidrinaO O-

H2O

N

H

+O O

R O

+

CO 2

+

H2O

prpura de Ruhemann.

Si se conocen los valores exactos de pKa para los sitios cidos de un aminocido, se puede calcular los porcentajes de las formas protonadas, neutra y desprotonadas en una solucin a un pH dado utilizando la estuacin de Henderson-Hasselbalch:

pH pKa = log [A-] [HA] pH = pKa + log [A-] [HA]

Para ver como se utiliza la ecuacin de Henderson-Hasselbalch, encontremos las especies que estn presentes en una solucin 1M de alanina a pH= 9.00. de acuerdo a los valores antes mencionados, la alanina protonada tiene un pKa1 de 2.34, y la alanina neutra tiene un pKa2 de 9.69:H3C OH H3C O-

+ H2OH3N+

+H3N+

H3O

+

O

O

pKa1= 2.34

H3C

O

-

H3C

O

-

+H3N+

H2O H2N O

+

H3O

+

pKa2= 9.69 16

O

Como el pH de nuestra solucin est mucho ms cerca del pKa2 que del pKa1, necesitamos usar pKa2 para nuestros clculos. De acuerdo a la ecuacin de Henderson-Hasselbalch, tenemos: log [A-] = pH pKa = 9.0 9.69 = - 0.69 [HA] De tal modo que [A-] = antilog (-0.69) = 0.20 [HA] [A-] + [HA] = 100% (1.0 M)

Adems, sabemos que: [HA]= 83% y [A-] = 17%

Se pueden efectuar clculos similares a otro pH, con lo que se llega a la curva de titulacin siguiente:

Problema 10. La Treonina tiene un pKa1 = 2.1 y un pKa2 = 9.1. Utilice la ecuacin de HendersonHasselbalch para calcular la proporcin de formas protonadas y desprotonadas a pH= 1.5 y pH = 10.0.

17

SNTESIS DE AMINOCIDOS. 1. Sntesis de Strecker.

aldehdo

-aminonitrilo

-aminocidoO

O NH4Cl / KCN H H2O NH2

C

N H3O+

OH NH2

Fenilacetaldehdo

-aminonitrilo

(R,S)-fenilalanina (53%)

Problema 11. El aminocido poco comn conocido como L-Dopa (3,4-dihidroxifenilalanina) es un frmaco til contra el mal de Parkinson. Indique cmo podra sintetizarse a partir de 3,4dihidroxifenilacetaldehdo. 2. Aminacin de cidos -halogenados. Uno de los mtodos ms antiguos comienza con la -bromacin de un cido carboxlico por tratamiento con Br2 y PBr3 (La reaccin de Hell-Volhard-Zelinsky). La sustitucin del -bromo cido con amoniaco produce un -aminocido.

cido 4-metilpentanico cido 2-bromo-4metilpentanico (R,S)-leucina 45%

Problema 12. Indique como podran obtenerse los siguientes aminocidos a partir de los cidos carboxlicos apropiados: (a) Valina (b) Fenilalanina (c) Alanina (d) Serina

18

3. Sntesis de Gabriel. Glicina

Ftalimida potsica

Cloroacetato de etilo

Glicina (85%) Fenilalanina

cido ftlico

O CH3 CH3 N O O Br O O malonato de dietilo O CO2C2H5 N CH CO2C2H5 O 1) NaOEt / EtOH 2) C6H5CH2Cl O N C (CO2C2H5) 2 H3O calor O+ -

K

+

O Br O CCl4 Br

O O DMF

CH3

O

CH3

O

O

N CH O O HO

KOH / H2O o NH2NH2 NH2 Fenilalanina

OH

cido Glutmico

19

O CO2C2H5 N CH CO2C2H5 O 1) NaOEt / EtOH 2) CH2=CHCO2C2H5

O CH2CH2CO2C2H5 N C (CO2C2H5)2 O+

H3 O

calor

O CH2CH2CO2C2H5 N CH O O HO o NH2NH2 KOH / H2O O NH2 O OH OH

4. Sntesis del amidomalonato

cido (R,S)-asprtico (55%) Acetamidomalonato de dietilo 3 EtOH + CO2 + CH3COOH

Problema 13. Indique los halogenuros de alquilo necesarios para producir los siguientes aminocidos por el mtodo de sntesis amidomalnica. (a) leucina (b) Histidina (c) Triptofano (d) Metionina Problema 14. La serina puede sintetizarse por una simple variacin del mtodo amidomalnico utilizando formaldehdo en vez de halogenuro de alquilo. Cmo podra lograrse esto?

5. Aminacin reductiva de -cetocidos: Biosntesis.O O

O

O

HO O

OH

+

NH3

L-glutamato deshidrogenasa NADH

HO NH2

OH

cido--cetoglutrico.

cido glutmico

O

O NH3

H3C

O

H3C

OH

NaBH4

H2N

OH

20

cido pirvico

(R,S)-Alanina

Problema 15. Proponga una sntesis para cada uno de los siguientes aminocidos partiendo del malonato de dietilo: Valina, Metionina y cido asprtico. Problema 16. La prolina puede prepararse por una secuencia que utiliza ftalimida, malonato de dietilo y 1,3-dibromopropano. Indique los pasos de esta sntesis.

Sntesis Enantioselectiva de aminocidos. La sntesis de -aminocidos a partir de un precursor aquiral por cualquiera de los mtodos descritos produce una mezcla racmica (una mezcla racmica en partes iguales de enantimeros R y S). Existen dos mtodos para obtener aminocidos enantomricamente puros. Una manera consiste en resolver la mezcla racmica en sus enantimeros puros. Sin embargo un mtodo mejor consiste en usar una sntesis enantioselectiva para preparar directamente slo el enantimero S deseado. Resolucin de aminocidos R, S. La resolucin puede hacerse al convertir el aminocido en su amida y permitiendo que el aminocido racmico intervenga en una reaccin cido-base con un solo enantimero de una amina quiral. Se forman dos sales diasteromricas que luego se separan y se vuelven a convertir en el aminocido por hidrlisis del grupo amida.

Mezcla de enantimeros de aminocidos

Mezcla de enantimeros de aminocidos

Mezcla de sales diasteromricas

Las enzimas catalizan selectivamente la hidrlisis de amidas formadas de L-aminocidos (S).

Mezcla de enantimeros de aminocidos

Mezcla de enantimeros de aminocidos

Aminocido S

Aminocido R 21

Se utiliza una aminoacilasa obtenida de rion de cerdo.

Sntesis enantioselectiva de aminocidos.

Se utiliza un catalizador en una reaccin quiral que contenga temporalmente una molcula de sustrato en un ambiente asimtrico. Mientras se encuentra en este ambiente, el sustrato puede estar ms abierto a reaccionar de un lado que en el otro, lo que lleva a un exceso del producto enantiomrico sobre el otro.

William Knowles descubri hace algunos aos que los -aminocidos pueden prepararse enantioselectivamente mediante la hidrogenacin de un cido Z enamido con un catalizador de hidrogenacin quiral.

cido Z enamido

S-fenilalanina 98.7%

El catalizador ms efectivo para la sntesis enantioselectiva son los complejos de coordinacin de Rodio (I) con ciclooctadieno (COD) y una difosfina quiral como el (R,R)-1,2-bis(oanisilfenilfosfonio)etano, el llamado ligando DiPAMP.

22

PPTIDOS Y PROTENAS. Las protenas y los pptidos son polmeros de aminocidos en los cuales las unidades individuales de aminocidos, llamados residuos, estn unidas mediante enlaces amida, o uniones peptdicas.

Alanina (Ala)

Alanilserina (Ala-Ser)

Serina (Ser)

Aminocido N terminal

Aminocido C terminal

La larga secuencia repetida de enlaces peptdicos forman una cadena, la estructura primaria o esqueleto de las protenas. Por convencion siempre se escriben los pptidos con el aminocido Nterminal a la izquierda y el aminocido C-terminal a la derecha. El nombre del pptido se indica utilizando las abreviaturas para cada aminocido.

23

Bradiquinina H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH R-P-P-G-F-S-P-F-R

Problema 17. Nombre los seis posibles tripptidos isomricos con valina, tirosina y glicina. Utilice la notacin corta de tres letras para cada aminocido. Problema 18. Trace la estructura completa de H-Met-Pro-Val-Gli-His-OH

ENLACE COVALENTE EN LOS PPTIDOS.

Consecuencias de la resonancia: Estabilidad del enlace Menor basicidad del tomo de nitrgeno Rotacin restringida del enlace C-N (carcter de doble enlace)

Configuracin Trans.

24

En los pptidos se encuentra un segundo tipo de uniones covalentes cuando se forma un enlace disulfuro RS-SR entre dos redisuos de Cisterna. El enlace disulfuro se forma con facilidad por medio de la oxidacin suave de los tioles RSH y se rompen con facilidad mediante una reduccin suave.

Oxidacin moderada Cistina

Csteina Oxidacin moderada de tioles con Bromo.-

HO R SH

R H2O

S

-

Br

Br R S Br

S

R S R S R

Los enlaces disulfuro contribuyen a la forma (estructura) de un polipptido.

Oxitocina

25

DETERMINACIN DE LA ESTRUCTURA DE LOS PPTIDO: ANLISIS DE LOS AMINOCIDOS

Cules aminocidos estn presentes? Cuntos hay de cada uno? Cul es la secuencia de aminocidos de la cadena peptdica? Las respuestas a las dos primeras preguntas se obtienen con un Analizador de aminocidos. William Stein y Standford Moore.

Mezcla Estndar

equimolecular de 17 aminocidos.

26

DETERMINACIN DE LA SECUENCIA DE UN PPTIDO.

1.- Hidrlisis de los enlaces disulfuro RS-SR con cido perfrmico. 2.- Hidrlisis del pptido con HCl 6M por 24 horas. 3.- Analizador de aminocidos.

2-mercaptoetanol

cido iodoactico

27

cido cisteico

cido cisteico

DETERMINACIN DE LA SECUENCIA DE AMINOCIDOS EN PPTIDOS: DETERMINACIN DE RESIDUOS N-TERMINALES. DEGRADACIN DE EDMAN.

Isocianato de fenilo Reactivo de Edman

derivado de tiazolinona

pptido sin el amino cido N-terminal original 28

La transposicin de la anilinotiazolinona en medio cido acuoso produce el derivado final N-feniltiohidantoina (PTH).

PTH se identifica por cromatografa Los pptidos de cadena acortada se vuelven a someter en forma automtica a otro ciclo de la Degradacin de Edman. La determinacin de la secuencia completa de protenas por este mtodo es poco prctica a causa de la formacin de subproductos indeseables que limita el mtodo a un mximo de 50 ciclos.

MTODO DE SANGER N-aminocidos

2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB)

polipptido

Polipptido marcado

Aminocido N-terminal marcado. Separado e identificado

Mezcla de resto de aminocidos

29

El mtodo de Sanger no es tan utilizado como el de Edman. Dadas las limitaciones de los mtodos de Edman y Sanger; primero se rompe una cadena peptdica larga por medio de una hidrlisis parcial en varios fragmentos ms pequeos, se determina la secuencia de cada fragmento y stos se ajustan haciendo coincidir los extremos que se traslapan. HIDRLISIS ENZIMTICAS. Enzima Tripsina Quimiotripsina Elastasa Carboxipeptidasa A Carboxipeptidasa B Especificidad hidrlisis carboxilo de aminocidos bsicos: Arginina y Lisina. hidrlisis carboxilo de aminocidos arilo: Fenilalanina, Tirosina y Triptofano. hidrlisis carboxilo de aminocidos pequeos: Glicina y alanina. Remueve el aminocido C-terminal Remueve los aminocidos C-terminal Arginina y Lisina solamente.

Val Phe Leu Met Tyr Pro Gly Trp Cys Glu Asp Ile Lys Ser Arg His

Quimiotripsina rompe estos enlaces

Tripsina rompe estos enlaces.

HIDRLISIS PARCIAL

1. Un anlisis de los aminocidos de la angiotensina II revelara la presencia de ocho aminocidos diferentes: Arg, Asp, His, Ile, Fen, Pro, Tir y Val en cantidades equimoleculares. 2. Un anlisis de extremos N-terminales por el mtodo de Edman indicara que la angiotensina II tiene un residuo de cido asprtico en el extremo N-terminal. 3. La hidrlisis parcial de la angiotensina II con cido clorhdrico diluido producira los siguientes fragmentos, cuya secuencia puede ser determinada por Degradacin de Edman: a. b. c. d. e. H-Asp-Arg-Val-OH H-Ile-His-Pro-OH H-Arg-Val-Tir-OH H-Pro-Fen-OH H-Val-Tir-Ile-OH 30

4. Traslapando las regiones que se superponen de los fragmentos se obtiene la secuencia completa de aminocidos en la angiotensina II: a. c. e. b. d. H-Asp-Arg-Val-OH H-Arg-Val-Tir-OH H-Val-Tir-Ile-OH H-Ile-His-Pro-OH H-Pro-Fen-OH H-Asp-Arg-Val-Tir-Ile-His-Pro-Fen-OH

Problema 19. Cual es la estructura de un pentapptido que da los siguientes tripptidos cuando se hidroliza parcialmente? Gli-glu-arg, glu-arg-gli, arg-gli-fen

Problema 20. Qu fragmentos resultaran si se rompiera la Angiotensina II con tripsina en un caso, y con quimiotripsina en otro?.

Problema 21. Dibuje la estructura del derivado PTH que se puede formar por la degradacin de Edman de la Angiotensina II.

Problema 22. Indique la secuencia de los hexapptidos que producen los siguientes fragmentos por hidrlisis parcial con cido: (a) Arg,Gli,Ile,Leu,Pro,Val forman H-Pro-Leu-Gli-OH, H-Arg-Pro-OH, H-Gli-Ile-Val-OH (b) Asp,Leu,Met,Trp, Val2 forman H-Val-Leu-OH, H-Val-Met-Trp-OH, H-Trp-Asp-Val-OH

DETERMINACIN DE RESIDUOS C-TERMINALES.

carboxipeptidasa

31

Problema 23. Se encuentra que un hexapptido con la composicin Arg, Gli, Leu, Pro tiene prolina en los extremos C y N. La hidrlisis parcial produce los siguientes fragmentos: H-Gli-Pro-Arg-OH Cul es la estructura del hexapptido? H-Arg-Pro-OH H-Pro-Leu-Gli-OH

Problema 24. Proponga dos estructuras para un tripptido que por hidrlisis se descompone en Leu, Ala, y Fen pero que no reacciona con carboxipeptidasa ni con fenilisotiocianato.

El bromuro de ciangeno hidroliza el enlace peptdico de la Metionina. H Ala Lys Phe Asp Met Val Arg Trp OH

BrCN rompe este enlace.

Mecanismo de la hidrlisis del enlace peptdico por bromuro de ciangeno.

32

SNTESIS DE PPTIDOS.

Aunque las amidas simples suelen formarse por la reaccin entre aminas y cloruros de cidos, la sntesis de los pptidos es ms difcil porque se deben de formar muchos enlaces amida diferentes en orden especfico y no aleatoriamente. 2 sitios de unin + 2 sitios de unin = 4 productos distintos.

La solucin al problema de la especificidad es la proteccin.

33

Proteccin NH2

Alanina

1. Formacin de la amida 2. Desproteccin Proteccin COOH

Leucina

GRUPOS PROTECTORES EN LA SNTESIS DE PPTIDOS.

Nombre

Estructura

Abreviatura Reactivo

Eliminacin

Grupos Protectores de aminas.O

O

Benciloxicarbonilo

R

O

Z- , CBZ-

Cl

O

H2 / Pd-C HBr, HF, HCl

H3CO H3C O CH3

CH3 O O

tert-Butoxicarbonilo

R

BocCH3

H3C O O

H3C O

CH3 CH3

CF3COOH HCl gas BF3 / Et2O / THF

O

H3C CN O

O

H3C CN O

Ciano-t-butoxicarbonilo

R

CH3

Cyoc-

Cl

CH3

NaOH / THF

34OO

9-Fluorenilmetoxicarbonil

Fmoc-

Piperidina

O

O CH3

p-Toluensulfonilo

R

S O

Tos-

Cl

S O

CH3

Na / NH3

Grupos protectores de cidos carboxlicos.

Ester

RO-

ROH / H+ R3O+X-

H2O / NaOH H3O+

Preparacin de Carbamatos para proteccin del grupo amino. carbamatoO OH OH

Cl

O

+

H2N O

- HClO NH O O

del Cl2C=O y C6H5CH2OHO ZBC NH OH

Glicina

Glicina-CBZO

+O

- HClCl O CH3

ZBC

NH

O O O CH3

Glicina protegida

Cloroformiato de etiloO O O NH O O O CH3

grupo ster activado

O

+NH2

OH

35O

fenilalanina

Gly-Phe con el grupo amino protegido

Eliminacin del grupo protector carbamato

O HN H2, Pd / C O NH O O OH CH3 CO2 H2N O HN OH

O

ter-butoxicarbonilamida (BOC)

Alanina

dicarbonato de di-ter-butilo

BOC-Ala

Fluorenilmetoxcarbonilamida

cloroformiato de 9-fluorenilmetilo

aminocido. (cadena lateral protegida si es necesario)

aminocido- FMoc protegido (estable en cidos) 36

(Grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo) Desproteccin. (ruptura del grupo FMoc)

piperidina

aminocido libre

producto secundario

Proteccin del grupo carboxilo de un aminocido por formacin de un ster.

Leucinato de metilo

Leucina

Leucina

Leucinato de bencilo FORMACIN DEL ENLAC PEPTDICO.

Cloroformiato de bencilo

37

Anhdrido mixto de Ala-CBZ

EL USO DE AGENTES ACOPLANTES (ACTIVANTES DEL COOH). a) Carbonildiimidazol (CDI)O O R OH NH-protegido O O R1 O R NH N N NH2 calor CH3 CH3 NH-protegido O N R1 O CO2

+

N

N

+NH

b) Diciclohexilcarbodiimida (DCC)O O R OH R1 O R NH N C N O R1 O

+NH-protegido

NH2

CH3 calor

+NH-protegido H3C O

HN C O

NH

38

c) N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida. (EDCI EDAC)H3C N R OH NH-protegido H3C R1 O NH2 CH3 calor CH3 R NH NH-protegido H3C H3C N CH3 CH3 NH O O C NH O R1 O O

O

+

N

C

N

+

d) Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-oxi)tripirrolidinfosfonio. (PyBOP)O R F O R+

O O H2N calor CH3 R NH HN

R O

N OH N

F PN F F

F F

O protegido CH3

HN protegido N O P N+

N

Resumen de 5 pasos para la sntesis de H-Ala-Leu-OH 1. Proteger el grupo amino de la leucina como su derivado BOC H-Ala-OH + bicarbonato de di-tert-butilo BOC-Ala-OH

2. Proteger el grupo carbonilo de la leucina como su ster metlico 39

H-Leu-OH

+

CH3OH

H-Leu-OCH3

3. Acoplar los dos aminocidos protegidos usando DCC BOC-Ala-OH + H-Leu-OCH3 BOC-Ala-Leu-OCH3

4. Retirar el grupo protector BOC por tratamiento cido BOC-Ala-Leu-OCH3 + CF3COOH H-Ala-Leu-OCH3

5. Retirar el ster metlico por hidrlisis bsica: H-Ala-Leu-OCH3 + NaOH / H2O H-Ala-Leu-OH

Problema 25. Indique el mecanismo de la formacin de un derivado BOC para la reaccin de Tirosina con bicarbonato de di-ter-butilo. Problema 26. Escriba los cinco pasos que se requieren para la sntesis de H-Leu-Ala-OH a partir de alanina y leucina.

Problema 27. Cmo podran prepararse los siguientes tripptidos? (a) (b) (c) H-Leu-Ala-Gli-OH H-Gli-Leu-Ala-OH H-Ala-Gli-Leu-OH

cadena A 21 aminocidos

cadena B 30 aminocidos

insulina 40

La insulina esta compuesta por dos cadenas que suman un total de 51 aminocidos unidos pos dos puentes disulfuro. Frederick Sanger determin su estructura y recibi el premio Nobel en Qumica en 1958 por su trabajo.

SNTESIS DE PPTIDOS AUTOMATIZADA: TCNICA DE FASE SLIDA DE MERREFIELD.

La sntesis de pptidos se efecta sobre esferas slidas de poliestireno, preparado de un modo tal que por cada 100 anillos de benceno uno lleve un grupo clorometilo:CH3 CH CH3 CH2 HC CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH3

H3C

Cl

Cl

Sntesis de un tripptido utilizando la Fase slida de Merrifield.

Aminocido N-protegido

41

2 Aminocido N-protegido

2 Aminocido N-protegido y COOH activado

Dipptido protegido

Dipptido-Resina

3 Aminocido N-protegido y COOH activado 3 Aminocido N-protegido

Tripptido protegido

42

Tripptido-Resina

polmero Tripptido libre

Problema 28. La importancia del rendimiento en cada paso de la sntesis de un pptido es muy grande. La preparacin de un decapptido puede implicar de 30 a 40 reacciones qumicas. Suponiendo que cada paso pueda realizarse con un rendimiento del 90%, calcule el rendimiento global de una secuencia de 40 pasos.

PROTENAS. Estructura primaria y secundaria Estructura terciaria y cuaternaria Clasificacin y funciones de protenas Enzimas Desnaturalizacin de protenas

ESTRUCTURA PRIMARIA. Se refiere a la secuencia en la que estn unidos los aminocidos.

43

Estructura primaria de la bradiquinina:

H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH

OXITOCINA

VASOPRESINA

44

ESTRUCTRURA SECUNDARIA. Es la orientacin relativa de los tomos del esqueleto (backbone): tomos que forman en enlace peptdico. Depende de: La regin planar en cada enlace peptdico. La formacin de puentes de hidrgeno. Separacin adecuada de grupos R (cadenas laterales de los aminocidos) HELICE ALFA Cada oxgeno est unido con un puente de hidrgeno al amino cido del siguiente giro de la hlice. (Prolina rompe las hlices alfa)

45

Vista lateral

vista superior

HOJA PLEGADA (LMINA) BETA Cada carbonilo en un enlace peptdico est unido con un puente de hidrgeno al grupo H-N de un amino cido de una cadena adyacente.

46

Dos o ms cadenas peptdicas pueden alinearse formando la lmina

Orientacin de los puentes de hidrgeno en las lminas Beta

47

Tipos de Laminas Beta

ESTRUCTURA TERCIARIA. 48

Describe el enrollamiento de toda la protena en una forma tridimensional (3D).

Factores que determinan la estructura terciaria: Interacciones hidrfobos de las cadenas laterales. Puentes disulfuro. Puentes de hidrgeno. Grupos prostticos. Puede haber combinaciones de Hlices y lminas .

ESTRUCTURA CUATERNARIA. 49

Describe como se unen las molculas de protenas diferentes en grandes estructuras agregadas.

CLASIFICACIN DE LAS PROTENAS (COMPOSICIN)

Protenas simples Constituidas nicamente por amino cidos Protenas conjugadas Constituidas por amino cidos y otros compuestos. Glicoprotenas (carbohidratos) Lipopoprotenas (grasas) Nucleoprotenas (cido ribonucleico) Fosfoprotenas (steres de fosfato) Metaloprotenas (hierro)

PROTENAS CONJUGADAS: Globulina (glicoprotena) Interfern (glicoprotena) Casena (fosfoprotena) Ferritina (metaloprotena) Hemoglobina (metaloprotena)

CLASES CONFORMACIONALES DE PROTINAS. 50

Protenas fibrosas (insolubles) Colgeno: tejido conectivo, tendones Queratina: cabello, uas, piel Elastina: tejido conectivo elstico Protenas globulares (solubles) Insulina: hormona reguladora del metabolismo de la glucosa Mioglobina: transporte de oxgeno Ribonucleasa: controla la sntesis del RNA ALGUNAS FUNCIONES BIOLGICAS DE LAS PROTENAS.

Enzimas (catalizadores biolgicos) Hormonas (insulina) Protenas protectoras (anticuerpos) Protenas de almacenamiento (casena) Protenas estructurales (queratina, elastina) Protenas de transporte (hemoglobina) ENZIMAS.

Casi todas son globulares Algunas son conjugadas: La parte no proteica se llama cofactor La parte proteica se llama apoenzima Cofactor + apoenzima = holoenzima Son especficas

Posible mecanismo de accin de la quimiotripsina. 51

Posible mecanismo de accin de la tripsina.

52

DESNATURALIZACIN DE LAS PROTENAS. 53

Es la alteracin de la estructura terciaria. La estructura primaria no se altera.

ESTRUCTURAS DE PROTENAS EN INTERNET. Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/

54

Problema 29. se cree que la descarboxilacin de los -cetocidos catalizada por tiamina se inicia con la eliminacin de un tomo de hidrgeno cido del anillo de tiazol de la tiamina.H3C H3C+

H3C CH3 S H3C+ -

CH3

N

N

+S

H

+

C

H

a. Por qu es cido este hidrgeno? b. Proponga un mecanismo para la descarboxilacin del cido pirvico (CH3COCO2H) mediante tiamina. Se sabe que el intermedio final es la especie A.H3C+

A=

H3C

CH3 S

N

H3C C OH H

La vitamina cido lipoico es una coenzima en la conversin de A y CoA en acetil coenzima A. indique de que manera el intermedio A puede justificar la formacin de acetil coenzima A a partir del piruvato inicial.S S (CH2)4 CO 2H

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