BIOTEKNOLOGI

“DNA VECTOR”

DISUSUN OLEH :

Tiara Indah Pratiwi 260110120132

Gabriella Rosalina 260110120157

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2014

I. Vektor Kosmid (Cosmids)

Kosmid adalah kombinasi dari plasmid vektor dan situs COS yang memungkinkan target

DNA untuk dimasukkan ke dalam kepala λ-fage. Sebuah kosmid dapat berukuran 8 kb atau

kurang, jadi hingga ukuran 44 kb DNA baru dapat disisipkan sebelum pengepakan Phaga λ

selesai. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb

menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid. Concatamers dari

molekul kosmid dihubungkan oleh masing-masing cos site, betindaksebagai substrat untuk

pengepakan in vitro karena cos site hanya urutan molekul DNA yang dibutuhkan untuk

dikenal sebagai genom protein. Partikel phaga yang mengandung DNA kosmid  adalah sama

seperti phaga yang lainya, tetapi didalam sel DNA kosmid tidak dapat disintesis menjadi

partikel phaga baru, bahkan bereplikasi sebagai plasmid. DNA rekombinan didapatkan lebih

banyak dari koloni dibandingkan plak. Seperti pada vektor tipe lainya batas dari panjang

DNA yang diklon ditentukan oleh jarak yang tersedia pada partikel λ phaga.

Kosmid yang merupakan modifikasi plasmid pembawa kopi sekuen DNA (cos sequence)

diperlukan untuk pengepakan DNA ke dalam bakteriofage Ã. Untuk mengklon ke dalam

kosmid, fragmen DNA (sekitar 30-45 kpb) diisolasi dan diligasikan dengan vektor kosmid

yang berbentuk linear secara in vitro dalam kondisi yang mendukung pembentukan struktur

yang dinamakan concatemer, yaitu fragmen DNA yang diapit oleh kosmid dan dua cos site

yang teratur dalam orientasi yang sama. Concatemer ini akan menjadi substrat dalam

pengepakan secara in vitro ke dalam bakteriofage à dan cos site akan dipotong oleh fungsi

ter dari bakteriofage à dan DNA antara dua kosmid akan dipak didalam bakteriofage Ã. Dua

sekuen cos site yang dipotong oleh fungsi ter dari bakteriofage à berperan untuk

menghasilkan molekul linear dengan bagian akhir ujungnya komplemen satu dengan yang

lain. Setelah penginjeksian ke dalam sel bakteri, bagian ujung yang komplemen tadi akan

Selain AMPr, ORI, dan polylinker seperti vektor plasmid, vektor kosmid juga berisi situs COS.

dapat bersambung dan direkatkan oleh DNA ligase dari inangnya sehingga akan

menghasilkan molekul DNA rekombinan berbentuk sirkuler. DNA rekombinan pembawa

kopi yang lengkap dari vektor kosmid akan bereplikasi di dalam sel seperti halnya plasmid

dan pembawa sifat resistensi terhadap antibiotik yang dibawa oleh kosmid tersebut.

Dengandemikian bakteri yang membawa kosmid rekombinan dapat diseleksi dengan

menggunakan media yang mengandung antibiotik yang sesuai. Kapasitas pengklonan pada

kosmid merupakan fungsi dari ukuran DNA yang dapat dipak di dalam kepala bakteriofage Ã

dan ukuran dari vektoritu sendiri. Banyak kosmid dapat digunakan sebagai vektor,misalnya

kosmid pLAFR1, pJRD215, pWE15, SuperCos-l dan pJBS. Pemilihan kosmid sebagai vektor

bergantung pada keperluan atau tujuan dan juga stabilitasnya di dalam inang baru, misal

selain E. coli sebagai inangnya. Hal ini penting untuk telaah komplementasi gen yang telah

diklon ke dalam vektor.

Sebagai contoh, plasmid ColE1 mengandung sebuah gen bagi resistensi terhadap rifampisisn

(rif-r) dan situs cos fag lambda, yang bisa dikenali oleh sistem pemotongan situs cos (Ter)

E.Coli. Kosmid semacam itu bisa berfungsi dengan benar, asalkan ada dua situs cos dan

situs-situs tersebut terpisahkan oleh tidak kurang dari 38 kb namun tidak lebih dari 5 kb.

Pemotongan ColE1 dan DNA asing oleh enzim restriksi HindIII bisa digunakan untuk

menghasilkan molekul-molekul rekombinan linier. Partikel-partikel fag pentransduksi bisa

terbentuk jika hasil insersi di antara kedua situs cos memiliki panjang 38-54 kn. Tidak ada

partikel yang dihasilkan jika tidak terjadi insersi atau jika DNA yang diinsersikan panjangnya

melebihi atau kurang dari kisaran tersebut. Pengemasan (penambahan kepala dan ekor) in

vitro membentuk partikel-partikel pentransduksi yang mengandung kosmid-kosmid dengan

ujung kohesif . Saat sebuah sel yang sensitif terhdapa rifampisin (Rif-s) diinfeksi dengan

partikel fag pentransduksi, kimera linier membentuk molekul sirkular dan bereplikasi

menggunakan sistem replikasi ColE1. Menyebabkan sel-sel itu pada medium yang

mengandung rifampisin akan menyeleksi sel-sel yang mengandung gen rif-r, daerah ColE1,

dan sebuah DNA asing hasil insersi.

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47

kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Pengerjaan seperti plasmid

Kelemahan:

Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar

(~ 50 kbp)

II. Vector BCAs (Bacterial Artificial Chromosome)

Merupakan konstruksi DNA yang berdasarkan pada plasmid-F (fertility-plasmid) fungsional

bakteri. Digunakan untuk transformasi dan cloning pada bakteri. Ukuran DNA insertnya

berkisar antara 150-350 kb atau lebih besar dari itu yakni 700 kb.

Adapun tahapan cloning BAC adalah :

1. Amplifikasi fragmen sel target

PCR merupakan teknik amplifikasi sequen DNA spesifik secara in vitro dengan proses

pemanjangan primer pada untai DNA komplementer. Reaksi PCR terdidi atas sejumlah

komponen essensial antara lain enzim DNA polymerase yang termostabil, deoksinukleotida

trifostaf (dNTP) .

2. Penyisipan fragmen ke dalam BAC

Penyisipan fragmen ke dalam BAC untuk membentuk DNA rekombinan meliputi 2 tahap

yaitu digesti serta ligasi DNA vector dan gen target sisipan. BAC dan sisipan didigesti

dengan enzim restriksi yang sama sehingga keduanya memiliki potongan kohesif serupa yang

saling berdekatan

3. Transformasi kedalam sel inang

sel dibuat “kompeten” dengan merendamnya dalam  CaCl2 dingin

Komponen yang terdapat pada vektor BACs adalah :repE : berperan dalam replikasi plasmid dan regulasi jumlah penggandaan.parA dan parB : berperan dalam pemisahan DNA plasmid F dengan sel anak selama proses pembelahan dan memastikan kestabilan dari BACA selectable marker : berperan dalam resistensi terhadap antibiotik, beberapa BACs juga memiliki lacZ pada tempat kloning.T7 & Sp6 : promotor faga untuk transkripsi pemasukan gen.

sel bakteri “kompeten” mengambil molekul DNA

sel dihadapkan dengan kejutan panas (heat-shock)

efisiensi transformasi mencapai 107 – 108 koloni transforman/ μg DNA

frekuensi  transformasi maksimum 103

Para peneliti telah memodifikasi

vektor BAC menjadi lebih baik

untuk digunakan dan lebih berguna

dalam situasi tertentu. Selain gen

resistensi antibiotik yang ditambahkan

untuk mengidentifikasi

bakteri transfected, sebuah gen telah

ditambahkan  yang memungkinkan

bakteri untuk mengaktifkan

substansi berwarna biru X-gal/IPTG.

Zat ini ditemukan pada chiken soup

yaitu media dimana bakteri dapat

berkolonisasi. Perubahan warna gen ini, disebut lacZ, yang terpecah ketika DNA clone

tersebut dimasukkan ke dalam vektor, sehingga memungkinkan tidak hanya bakteri yang

telah transfected (artinya dimasukkan ke dalam sel), tetapi juga jika bakteri itu transfected

dengan DNA vektor yang mengandung sisipan atau hanya vektor saja (mengingat bahwa jika

vektor telah benar memasukkan DNA clone, ia akan kehilangan kemampuannya untuk

mengubah X-gal/IPTG biru).

Human Artificial

Chromosome (HAC)

Human artificial chromosome merupakan mikrokromoson yang dapat berperan sebagai

kromosom baru dalam populasi sel manusia. Artinya, jumlah kromosom pada tubuh manusia

tidak lagi hanya 46 kromosom, tetapi dapat berjumlah 47, dimana kromosom ke 47 ini

berukuran sangat kecil, kira-kira 6-10 megabases (Mb), sedangkan ukuran kromosom alami

dapat sebesar 50-250 Mb.

HAC dapat berperilaku sebagai kromosom stabil yang independen dari kromosom sel inang,

yang artinya ia dapat mereplikasikan diri dan memisahkan sistem sendiri. Unsur-unsur

penting yang harus diperhatikan untuk pemeliharaan dan transmisi kromosom meliputi tiga

daerah berikut :

(1) “Replikasi asal”, dari mana duplikasi DNA dimulai

(2) “Sentromer”, yang berfungsi dalam segregasi kromosom yang tepat selama pembelahan

sel

(3) “Telomer”, yang melindungi ujung kromosom linear.

Sampai saat ini penggunaan HAC dalam dunia medik adalah :

(1) Dapat digunakan dalam pengobatan sel tumor

(2) Pada 2011, para peneliti membuat HAC dengan menggunakan sistem rekombinasi Cre-

Lox. Studi ini difokuskan pada perubahan tingkat ekspresi dengan meninggalkan bagian-

bagian dari DNA genom yang ada. Dengan meninggalkan telomeric yang ada dan urutan sub

telomeric, paara peneliti tersebut mampu memperkuat tingkat ekspresi gen yang mengkode

produksi eritropoietin lebih dari 1000 kali lipat.

(3) HACs telah digunakan untuk menciptakan hewan transgenik yang digunakan sebagai

model hewan yang terkena penyakit manusia serta digunakan juga untuk memproduksi

produk-produk terapi.

Vektor untuk melakukan kloning pada sel-sel mamalia juga dikonstruksi atas dasar genom

virus. Salah satu di antaranya yang telah cukup lama dikenal adalah SV40, yang menginfeksi

berbagai spesies mamalia. Genom SV40 panjangnya hanya 5,2 kb. Genom ini mengalami

kesulitan dalam pengepakan (packaging) sehingga pemanfaatan SV40 untuk mentransfer

fragmen–fragmen berukuran besar menjadi terbatas. Retrovirus mempunyai genom berupa

RNA untai tunggal yang ditranskripsi balik menjadi DNA untai ganda setelah terjadi infeksi.

DNA ini kemudian terintegrasi dengan stabil ke dalam genom sel mamalia inang sehingga

retrovirus telah digunakan sebagai vektor dalam terapi gen. Retrovirus mempunyai beberapa

promoter yang kuat.

IV. Vektor Bakteriofag

Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya

yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel

inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor

kloning. Dua di antaranya akan dijelaskan berikut ini :

Bakteriofag λ

Bakteriofag atau fag λ merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. coli.

Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya sebagai

vektor kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa genetika.

DNA λ yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda

dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal

sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA λ untuk

berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua

untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.

Seluruh urutan basa DNA λ telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu

tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh karena

itu, DNA λ tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, saat

ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA λ yang memenuhi syarat sebagai vektor

kloning.

Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA λ, yaitu vektor insersional,

yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asin dan vektor substitusi yang untuk

membawa fragmen DNA asing harus membuang sebagian atau seluruh urutan basanya yang

terdapat di daerah nonesensial dan menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing

tersebut. Di antara kedua macam vektor λ tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan

karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb. Salah satu

contohnya adalah vektor WES, yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial, yaitu gen W,

E, dan S. Vektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapat menekan mutasi

tersebut.

Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua

tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restrisksi

memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA λ di antara kedua

tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNA asing. Jika

pembuangan segmen DNA λ tidak diikuti oleh substitusi fragmen DNA asing, maka akan

terjadi religasi vektor DNA λ yang kehilangan sebagian segmen pada daerah nonesensial.

Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan

demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatis yang dapat membedakan antara sel inang

dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.

Bakteriofag λ mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik.

Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah transformasi untuk DNA fag) dimulai dengan

masuknya DNA λ yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalami replikasi

secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah replikasi

menghasilkan sejumlah salinan DNA λ sirkuler, masing-masing DNA ini akan melakukan

transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan

dikemas (packaged) dalam kapsid sehingga dihasilkan partikel λ baru yang akan keluar dari

sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA λ

akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada

kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang.

Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak

(plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh karena

itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut.

Bakteriofag M13

Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli. Berbeda dengan λ yang

mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur berupa

filamen. Contoh yang paling penting adalah M13, yang mempunyai genom berupa untai

tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa. Infeksinya pada sel inang berlangsung melalui

pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma.

Ketika berada di dalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda sirkuler

yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 salinan. Salinan-salinan ini

membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke permukaan sel inang.

Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang

menjadi partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis. Oleh karena fag M13

terselubungi dengan cara pembentukan kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada

batas ukuran DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. Inilah salah satu keuntungan

penggunaan M13 sebagai vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan l.

Keuntungan lainnya adalah bahwa M13 dapat digunakan untuk sekuensing (penentuan urutan

basa) DNA dan mutagenesis tapak terarah (site directed mutagenesis) karena untai tunggal

DNA M13 dapat dijadikan cetakan (templat) di dalam kedua proses tersebut.

Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNAnya yang

dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan restriksinya pun sangat

sedikit. Namun, sejumlah derivat M13 telah dikonstruksi untuk mengatasi masalah tersebut.

V. Vektor YACs

Seperti halnya kosmid, YACs (yeast artifisial chromosomes atau kromosom buatan

dari khamir) dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid dan segmen tertentu

DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang digunakan terdiri atas sekuens

telomir, sentromir, dan titik awal replikasi. YACs dapat membawa fragmen DNA genomik

sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh karena itu, YACs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh

manusia, misalnya gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan

kemampuannya itu YACs sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang

dilakukan pada Proyek Genom Manusia.

Proses :

a YAC can be considered as a functional artificial chromosome (self replicating element),

since it includes three specific DNA sequences that enable it to propagate from one cell to its

offspring:

TEL: The telomere which is located at each chromosome end, protects the linear

DNA from degradation by nucleases.

CEN: The centromere which is the attachment site for mitotic spindle fibers, "pulls"

one copy of each duplicated chromosome into each new daughter cell.

ORI: Replication origin sequences which are specific DNA sequences that allow the

DNA replication machinery to assemble on the DNA and move at the replication

forks.

It also contains few other specific sequences like:

A and B: selectable markers that allow the easy isolation of yeast cells that have

taken up the artificial chromosome.

Recognition site for the two restriction enzymes EcoRI and BamHI.

While DNA cloning into a plasmid allows the insertion of DNA fragment of about 10,000

nucleotide base pairs, DNA cloning into a YAC allows the insertion of DNA fragments up to

1,000,000 nucleotide base pairs

Why is it so important to be able to clone such large sequences? To map the entire human

genome (3x1,000,000,000 nucleotide base pairs) it would require more than 100,000 plasmid

clones. In principle, the human genome could be represented in about 10,000 YAC clones.

Techniques for cloning genomic DNA into yeast artificial chromosomes (YAC) make it

possible to analyze very long DNA sequences like human genes.

Process cloning human genomic DNA into a YAC:

1. Genomic DNA is partially digested by the restriction enzyme EcoRI. Very large DNA

fragments are obtained.

2. The YAC is digested by the two restriction enzymes EcoRI and BamHI.

3. Those two elements recombine at the EcoRI sites and are covalently linked by the

DNA ligase.

4. A recombinant YAC vector, a yeast artificial chromosome with genomic DNA

inserted, is produced. This vector can be used to infect yeast cells and generated an

unlimited number of copies.

VI. Vektor Plasmid Ti

Agrobacterium adalah genus dari bakteri gram negatif yang ditemukan oleh H.J.Conn

yang digunakan untuk transfer gen secara horizontal yang menyebabkan

tumor. Agrobacterium tumefaciens adalahbakteri patogen pada tanaman yang banyak

digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan

suatu tanaman transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman

dikotil melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan crown gall tumor.

Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar (lebih dari

200 kb) yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi

bakteri ini pada tanaman.

Untuk memulai pembentukan tumor,  A. tumefaciens harus menempel terlebih dahulu

pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan

untuk melakukan kolonisasi padasel tanaman. Selain tanaman dikotil, tanaman monokotil

seperti  jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam

genom tanaman.

Tumor yang disebabkan oleh Agrobacterium

Plasmid Ti adalah vektor alami yang digunakan untuk mentransfer DNA ke

dalam sel tanaman. Pada sebagian besar plasmid Ti, terdapat empat  kompleks gen, yaitu :

1. T-DNA (bagian yang ditransfer dan menyatu dengan genom tanaman,  gen virulen

(vir) yang terdiri dari 50 kilo-basa untuk mengatur proses transfer T-DNA ke dalam

DNA tanaman.

2. Gen tra/trb yang mengatur perpindahan plasmid Ti antarbakteri (conjugative

transfer)

3. Bagian yang mengatur sistem replikasi plasmid (ORI)

4. Bagian gen yang menyandikan katabolisme opine.  Molekul opin ini akan dihasilkan

oleh jaringan tanaman yang terinfeksi bakteri pembawa plasmid Ti dapat berupa

octopine, nopaline, succinamopine, dan leucinopine.

Plasmid Ti ini memiliki 196 gen yang dikode oleh 195 protein, memiliki panjang

206,479 nukleotida, kandungan GC 56% dan 81% material yang dikode oleh gen.

Peta Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens

Daerah virulensi (virulence region) terdiri gen virABCDEFG yang mengkode suatu

enzim yang bertanggung jawab untuk mentransfer T-DNA ke dalam sel tumbuhan, yaitu :

      virA mengkode reseptor (transmembrane dimeric sensor protein) yang beraksi ketika adanya

senyawa phenolic berupa acetosyringone,  syringealdehyde, atau acetovanillone yang

dikeluarkan dari kerusakan jaringan tumbuhan.

         virB mengkode protein yang menghasilkan struktur seperti pilus

         virC berikatan dengan enhancer pada T-region

         virD1 dan virD2 mengenali T-DNA border dan menghasilkan endonuklease yang memotong

(nicking) ujung kiri dan ujung kanan dari T-DNA yang dimulai dari ujung kanan

         virG adalah faktor transkripsi (trancriptional factor) yang mengaktifkan ekspresi gen Vir

setelah berikatan dengan sekuens yang cocok.

Di alam, Agrobacterium tertarik pada tumbuhan yang memiliki luka kecil yang

mengeluarkan senyawa phenolik seperti acetosyringone dan gula. Senyawa ini menginduksi

bakteri untuk berpindah dan melekat pada tumbuhan melalui berbagai macam receptor

permukaan sel. Induser yang sama mengaktifkan ekpresi gen vir yang terdapat pada Ti

plasmid yang bertanggung jawab untuk transfer ss- DNA menuju sel tumbuhan.  Ini di bawah

kendali dua komponen sistem regulasi yaitu virA protein yang mengenali acetosyringone

yang dikode oleh gen virA di dalam Ti-plasmid dan chvE protein yang mengenali gula yang

dikode di dalam kromosom bakteri . Senyawa-senyawa tersebut mengeluarkan signal yang

dikenali oleh reseptor dimeric transmembran kompleks virA chvE. Pada permukaan sel,

sensor melakukan aktivasi Vir A dengan cara autophosphorilasi ketika mendeteksi senyawa

phenolic tumbuhan. Selanjutnya Vir A akan mengirimkan phosfat untuk pengikatan DNA

oleh protein Vir G sebagai faktor transkripsi yang mengaktifkan proses transkripsi

gen vir pada plasmid Ti yang akan mengekpresikan virC, virD, virE, virB, virF dan virH.

Dua gen yang dihasilkan  VirD1 dan VirD2 yang mengenali 25 pb pada kedua ujung T-DNA 

yang kemudian memotongnya (nicking)  membentuk kompleks untai tunggal T yang belum

matang (immmature) yang disebut kompleks ssT-DNA-VirD2 . secara in vitro membuktikan

bahwa kehadiran dari virD1 sangat dibutuhkan untuk memotong ssT-DNAoleh virD2. VirD2

pada saat itu melekat pada ujung 5’ akhir dari T-DNA dan memotongnya secara

endonukleolitik sehingga akan membentuk gap (celah), dan helikase bakteri melepaskan T-

DNA dari plasmid. Celah (gap)  untai tunggal pada plasmid tersebut akan segera diperbaiki.

Kemudian  T-DNA  akan ditempatkan pada suatu cekungan yang diselubungi  dengan protein

VirE2 yang disebut dengan hollow cylindrical filament dengan struktur yang bergulung. Ini

adalah bentuk matang (mature) dari T-DNA yang siap masuk ke dalam sel tumbuhan.

            Sebenarnya ada dua model teori pengiriman kompleks ssT-DNA-VirD2  yang telah

dikemukakan. Tetapi, yang banyak diterima adalah model penyelubungan untai tunggal oleh

protein VirE2 (single strand binding protein virE2) dan mesin transfer (virB) kemungkinan

tidak berinteraksi secara langsung dengan T-DNA. Pada alternatif model yang kedua, 

kompleks ssT-DNA-VirD2  nampak telanjang  karena tidak diselubungi oleh virE2 sehingga

terjadi interaksi langsung antara mesin transfer (virB) dengan kompleks ssT-DNA-VirD2,

sedangkan virE2 ditansfer secara independent oleh mesin transfer ke dalam sel tumbuhan.

Telah diketahui bahwa virE1 sangat dieprlukan untuk ekspor virE2 kedalam sel tumbuhan.

Strain bakteri yang telah dimutasi virE1 nya tidak dapat mengekspor virE2 sehingga

terakumulasi di dalam sel bakteri tersebut. T-DNA ditansfer ke tumbuhan sama halnya

dengan konjugasi bakteri. Pertama-tama Agrobacterium membentuk suatu pilus yang

merupakan ekpresi dari gen virB. Pilus ini menyerupai batang yang menghubungan dengan

sel tumbuhan dan membuka saluran yang siap ditansferkan secara aktif T-DNA ke dalam

sitoplasma tumbuhan. Pilus dan kompleks transport terdiri dari protein yang dihasilkan oleh

gen vir.

            Kemudian, reseptor sitoplasma (plant cytosolic protein) tumbuhan mengenali signal

lokasi inti pada virE2 dan vir D2 yang akan membentuk suatu kompleks dan membawanya

menuju suatu lubang pada nukleus yang disebut nuclear uptake / nuclear pore dan

mentransfer kompleks ssT-DNA-VirD2 kedalam genom tumbuhan. T-DNA akan terintegrasi

kedalam genom tumbuhan secara illegitimate recombination (rekombinasi yang tidak ketahui

mekanismenya) dan berubah bentuk menjadi untai ganda (double-stranded).  Integrasi ini

membutuhkan DNA ligase, polymerase, dan protein yang mengubahnya menjadi kromatin

(chromatin remodeling proteins) yang semuanya disediakan oleh tumbuhan.  VirD2 sangat

diperlukan dalam ketepatan intergrasi ssT-DNA kedalam genom tumbuhan. Ekspresi dari

integrasi gen T-DNA ini adalah produksi dari auksin, sitokinin dan opine. Opine adalah

sekret yang dikeluarkan oleh sel tumbuhan dan dikonsumsi oleh Agrobacterium sebagai

nutrisinya.

Gen pada T-DNA akan diekspresikan sama halnya pada eukaryot yang memiliki promoters,

enhancer dan bagian poly (A). Oleh sebab itu, ekspresi  dalam nukleus tumbuhan lebih baik

dibandingkan pada Agrobacterium. Protein ini akan menyandi sintesis dua hormon

pertumbuhan yang auksin dan sitokinin. Auksin membuat sel tumbuhan menjadi lebih besar

dan sitokinin berperan dalam pembelahan sel. Sel tumbuhan yang diinfeksikan ini akan

memulai tumbuh cepat dan tanpa kontrol sehingga menghasilkan tumor.

            T-DNA juga membawa gen untuk mensintesis opine yang mana merupakan variasi

yang berbeda dari asam amino dan derivat gula fosfat. Opine dihasilkan oleh sel tumbuhan

yang dikandung T-DNA tetapi digunakan oleh bakteri sebagai sumber carbon, nitorgen dan

energi.  Ini adalah cara bagaimana bakteri menggunakan tumbuhan untuk menghasilkan

sumber makanan bagi bacteri. Plasmid Ti selalu berada dalam Agrobacterium, membawa gen

yang menyediakan bakteri untuk mendapatkan opin.

            Dalam prakteknya, Agrobacterium digunakan untuk mentransfer gen dari suatu

kepentingan kedalam tumbuhan menggunakan kultur jaringan. Tiap pemisahan sel tumbuhan

disebut protoplas  atau sebuah bagian dari kalus yang di kultur

dengan Agrobacterium mengandung sebuah plasmid Ti yang dimodifikasi  T-DNA nya.

Setelah kokultur, sel  tumbuhan dipanen dan di inkubasi dengan herbisida dan antibiotik yang

digunakan sebagai marker selektif. Ini akan membunuh semua sel yang tidak

ditransformasikan T-DNA atau gagal untuk mengekspresikan gen pada T-DNA. Sel yang

telah ditransformasikan dapat di induksi untuk menghasilkan tunas dan jaringan akar dengan

mengubah kondisi hormon pada medium mudah diuraikan. Tumbuhan transgenik yang masih

kecil dapat dilindungi untuk level ekspresi transgen berikutnya.

Daerah T-DNA dari Ti plasmid dapat direkayasa genetika dengan menambah gen

resisten antibiotik (antiobiotic resistance gene (kanR)) dan DNA asing yang diinginkan.

Integrasi DNA asing kedalam sel tumbuhan mengganggu pembentukan tumor dan hanya sel

tumbuhan dengan genkanR yang dapat tumbuh pada kultur yang mengandung antibiotik.

Tumbuhan sangat mudah beregenerasi dari kultur sel (kalus) dan tumbuhan transgenik yang

telah dewasa mengekspresikan gen asing.

 Agrobacterium merupakan sistem transformasi gen yang menguntungkan karena

efisiensinya tinggi dan integrasinya stabil.  Agrobacterium tumefaciens dinyatakan dapat

membawa setiap gen yang diinginkan di dalam T-kompleks dan memasukkannya ke dalam

DNA target pada tanaman dengan tingkat keberhasilan yang tinggi.  Hal tersebut dikarenakan

untai T-DNA Agrobacterium tumefaciens tidak seperti komponen genetik mobile pada

transposon dan retrovirus yang menyandikan fungsi bagi pergerakan dan integrasi DNA. 

Transformasi dengan Agrobacterium juga memiliki beberapa keuntungan lain,

diantaranya bersifat dapat diulang (reproducible), relatif lebih murah, memberikan pola

integrasi yang tegas, jumlah salinan dalam genom sedikit (1-3 salinan) sehingga

memudahkan untuk membedakan sifat ekspresi tanaman transgenik itu sendiri. Pada awalnya

teknik transformasi dengan Agrobacterium hanya berhasil pada tanaman dikotil ketika

tanaman ini menghasilkan senyawa induser untuk menginduksi genvir ketika tanaman luka

dan mengeluarkan getah. Tanaman tembakau dan solanaceae adalah contoh pertama tanaman

dikotil yang berhasil ditransformasi.

Selain menyisipkan gen target untuk perubahan sifat tanaman tertentu yang

dikehandaki, transformasi genetik dengan Agrobacterium pada tanaman juga bermanfaat

untuk membuat populasi tanaman mutan. Dengan

menggunakan Agrobacterium memungkinkan diperoleh mutan dalam jumlah banyak dalam

suatu periode yang relatif singkat. Pembuatan mutan dilakukan dengan menggunakan elemen

loncat (transposon) misalnya transposon Ac/Ds. Transposon Ds akan berpindah posisi dalam

genom pada tempat berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional.  Sedangkan

elemen Ac menyandikan suatu enzim yang mengaktifkan elemen Ds untuk bertransposisi.

Adanya penyisipan Ds ini memungkinan fenotipe tanaman menjadi beragam. Keragaman

mutan ini dapat dijadikan sebagai sumber plasma nutfah baru untuk selanjutnya dapat

dilakukan isolasi gennya.

Proses transformasi gen via Agrobacterium juga dapat dilakukan dengan sistem

vektor biner. Sistem vektor biner yang diterapkan dalam proses transformasi gen

via Agrobacterium dapat meningkatkan efisiensi transformasi. Sistem binary vector

merupakan penggunaan dua plasmid Ti secara bersama dan saling berhubungan untuk proses

tranfer gen. Kedua plasmid Ti tersebut terdiri dari satu plasmid pembawa range replikon yg

luas (ORI dari E.coli dan Agrobacterium tumefaciens, T-DNA yang mengandung multiple

cloning site, gen resistan antibiotik) sedangkan plasmid pasangannya mengandung gen

virulence (vir-region) tanpa T-DNA.

Umumnya Agrobacterium tumefaciens sebagai media transformasi gen relatif efisien

diterapkan pada spesies tumbuhan. Dilain pihak, ada beberapa spesies tanaman yang tingkat

keberhasilan transformasinya rendah, sebagian besar adalah  jenis tanaman monokotil.

DAFTAR PUSTAKA

Access Excellence Resource Center. 2005. Cloning into a Yeast Artificial Chromosome

(YAC). Available online at http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php,

access at 30th of September 2014.

EJB Electronic Journal of Biotechnology. 1998. Plant Biotechnology. Available online at

http://www.ejbiotechnology.info/content/vol1/issue3/full/1/, accsess at 30th of

September 2014.

Kevinshe. 2004. The Big Bad BAC: Bacterial Artificial Chromosomes. Available online at

http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-chromosomes/ (diakses

tanggal 29 September 2014)

Mc Clean. 1998. Cloning and Cloning Vectors. Available online at

http://www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/plsc731/cloning/cloning3.html, access at 30th

of September 2014.

Susan and William D. 2002. Schaum’s Genetika Edisi IV. Erlangga:Jakarta

Wahyudi, Aris Tri. 2001. Perpustakaan Gen : Bagaimana Mengonstruksinya. Hayati, Volume

8 No.1, halaman 27-30