Título do projeto: “DESENVOLVIMENTO DE UM CURATIVO DERMO-

EPODÉRMICO BIOATIVO ATRAVÉS DA COMPLEXAÇÃO DOS BIOPOLÍMEROS

QUITOSANA, XANTANA E β-GLICANA CONTENDO AGENTE BACTERICIDA”

Palavras-chaves: curativo bioativo, biopolímeros, engenharia de tecidos, quitosana,

xantana, β-glicana

“DEVELOPMENT OF A BIOACTIVE DRESSING FOR DERMO-EPIDERMAL

WOUNDS COMBINING THE BIOPOLYMERS CHITOSAN, XANTHAN AND β-

GLUCAN CONTAINING BACTERICIDE AGENT”

Keyword: bioactive dressing, biopolymers, tissue engineering, chitosan, xanthan, β-

glucana

Proponente: Dra. Márcia Zilioli Bellini

Instituição Sede: Faculdades Adamantinenses Integradas - FAI

1. Identificação da proposta

Sistemas à base de polissacarídeos representam uma alternativa promissora para a

produção de curativos dérmicos bioativos. Membranas obtidas através da complexação dos

polímeros quitosana e xantana, mostraram ótimo desempenho quando aplicadas como

curativos dérmicos, apresentando características físico-químicas e biológicas adequadas

para este fim. No entanto, idealmente, um curativo deve não apenas proteger a lesão, mas

também promover o processo de cicatrização. Diante disto, diferentes compostos têm sido

incorporados aos curativos visando à prevenção e ao controle de infecções bacterianas,

promovendo assim, a aceleração do processo de cura. Uma vez que estudos comprovam a

atividade biológica da β-glicana, destacando-se sua ação anti-inflamatória, antitumoral e

antimutagênica, além de seu efeito protetor contra infecções, neste projeto propõe-se o

desenvolvimento de curativos dérmicos bioativos de quitosana-xantana-β-glicana contendo

o antibiótico bacitracina, empregando estratégias passíveis de escalonamento. Os curativos

produzidos serão caracterizados quanto a aspectos físico-químicos e biológicos. Espera-se

obter, ao final deste projeto, um biocurativo com características adequadas ao tratamento de

lesões de pele.

1

2. Qualificação do principal problema a ser abordado

A pele, maior órgão do corpo humano, constitui a primeira barreira de defesa do

organismo, desempenhando importantes funções na homeostasia, como a regulação da

temperatura corporal e a proteção contra a desidratação, além de proporcionar apoio aos

vasos sanguíneos e nervos (Rodrigues et al., 2008; Ratner et al., 2004).

Diversos tipos de lesões podem acometer esse tecido, sendo grande parte de tais

lesões reparadas espontaneamente pela proliferação das células remanescentes da derme e

da epiderme. No entanto, em queimaduras graves (como as de segundo grau profundo e as

de terceiro grau) e úlceras crônicas de várias etiologias, esse processo de regeneração

espontânea é gravemente comprometido, havendo frequentemente a necessidade de

intervenções terapêuticas.

Lesões graves da pele são de difícil tratamento, requerem cuidados especiais, com

longos períodos de internação, podendo ainda, levar o paciente ao óbito. Feridas profundas

na pele acarretam prejuízos ao organismo como um todo, em especial aos mecanismos de

defesa. A perda da integridade da pele normalmente está associada à perda de fluidos,

proteínas e eletrólitos e ao aumento da susceptibilidade do indivíduo a infecções.

O rápido recobrimento da área de pele perdida ou danificada representa uma melhora

do prognóstico do indivíduo sendo que uma solução corrente para esse tipo de trauma

consiste em enxertos de pele humana, autólogos ou não, que hospedam o tecido conjuntivo

e estimulam o desenvolvimento de vasos sanguíneos (Souto et al., 2006). No entanto, esta

solução é limitada pela extensão da área doadora, pela condição clínica dos pacientes e pela

escassez de doadores, além do que os enxertos podem ser rejeitados ou então degradados

precocemente, garantindo apenas uma cobertura temporária da lesão (Souto et al., 2009)

Nos últimos anos a medicina, em conjunto com engenharia de tecidos, tem

apresentado grandes avanços, em especial na área da dermatologia, com o desenvolvimento

de novos materiais destinados a cobertura e tratamento de lesões de pele. Diversos tipos de

curativos são conhecidos, desde os tradicionais como gaze, pomadas e ataduras, até os

curativos bioativos, que liberam substâncias ativas durante a cicatrização da ferida e agem

diretamente nas camadas da pele, acelerando o processo de recuperação do tecido.

Curativos convencionais atuam apenas como cobertura passiva da ferida, mantendo-a

protegida do ambiente. Entretanto, idealmente um curativo deve não apenas proteger a

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lesão, mas também promover o processo de cicatrização, proporcionando um

microambiente adequado, hidratado e com isolamento térmico, removendo o excesso de

exsudato e promovendo as trocas gasosas (Jayakumar et al., 2011, Wittaya-Areekul e

Prahsarn, 2006). Neste contexto, propostas de terapias alternativas que busquem o

restabelecimento mais rápido e efetivo da pele lesada, em especial utilizando matrizes

poliméricas produzidas em laboratórios utilizando materiais com atividade biológica

comprovada, são de grande relevância.

2.1.Seleção dos biopopolímeros constituintes de um curativo

A seleção do material a ser usado na preparação de um curativo dérmico é um dos

primeiros passos para se atingir uma favorável reconstituição da pele lesada. O uso de

polissacarídeos naturais, isolados ou combinados entre si, como matéria-prima de curativos

dérmicos tem sido uma escolha bastante comum nos últimos anos, uma vez que estes

materiais apresentam numerosas variações em sua estrutura, composição e função, além de

exibirem elevada biocompatibilidade, biodegradabilidade e frequentemente, atividade

fisiológica (Bueno et al., 2015; Burd e Huang, 2008). Vários destes compostos estão

disponíveis na natureza em grandes quantidades, podendo ser obtidos com pureza adequada

a custos relativamente reduzidos, sendo possível em vários casos realizar nos mesmos

modificações químicas que tornam suas propriedades mais apropriadas para aplicações

específicas.

Como exemplo de compostos pertencentes a esse grupo de biopolímeros pode-se citar

a quitina, a quitosana, o alginato, a pectina, a xantana, a celulose e seus derivados

(metilcelulose, carboximetilcelulose) usados separadamente ou combinados (Bellini et al.,

2015a; Bellini et al., 2015b; Fan et al., 2013; Bellini et al., 2012; Murakami et al., 2010;

Yang et al., 2010; Muzzarelli, 2009).

A quitosana (Q) é um polissacarídeo derivado da quitina, formado por dois

monômeros, a D-glicosamina e a N-acetil-D-glicosamina (Meng et al., 2010).

Características como elevada biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades de

absorção e adsorção, aliados à sua capacidade de acelerar a cicatrização e à sua atividade

antimicrobiana (Bueno e Moraes 2011; Campos et al., 2009; Rodrigues et al., 2008; Mi et

al., 2001), possibilitam sua utilização na produção de curativos dérmicos e de suportes para

o crescimento celular, os chamados scaffolds, muito utilizados na engenharia de tecidos

3

(Bellini et al., 2015a).

A natureza policatiônica da quitosana possibilita seu uso na preparação de complexos

polieletrólitos (PECs) com espécies aniônicas (Meng et al., 2010; Rodrigues et al., 2008;

George e Abraham, 2006). Sendo a xantana (X) um poliânion, sua interação com a

quitosana, em condições apropriadas, possibilita a formação de um complexo iônico com

características interessantes para o uso como curativos e scaffolds (Bellini et al., 2012;

Veiga e Moraes, 2012).

Assim como a quitosana, a xantana (X) é um polissacarídeo atóxico, sendo obtido por

fermentação pela bactéria Xanthomonas campestris, podendo apresentar atividade

emulsificante, estabilizante e floculante, formando géis, filmes e membranas (Bejenariu et

al., 2008). Sua complexação com quitosana, através de interações entre os grupos amino da

quitosana e carboxil da xantana, possibilita a obtenção de matrizes que apresentam elevada

absorção de soluções aquosas e com estabilidade comprovada em fluidos biológicos

(Bellini et al., 2012). Tais características são fundamentais na aplicação como curativos

dérmicos bioativos.

As β-glicanas são polissacarídeos constituintes estruturais da parede celular de

leveduras, fungos e alguns cereais (Miura et al., 2003). Uma importante fonte de β-glicana

é a parede celular de Saccharomyces cerevisiae. A β-glicana é constituída por um esqueleto

linear central de unidades de glicose ligadas na posição β(1-3), com cadeias laterais de

glicose unidas em β (1-6), que ocorrem em diferentes intervalos e têm tamanhos variados

(Manners et al., 1973; Di Luzio et al., 1979). De acordo com o número de ramificações β

(1-6), as β-glicanas podem ser solúveis em água ou em soluções básicas. Na parede celular

de S. cerevisiae, a porção solúvel em água apresenta grande número de ramificações unidas

na posição β(1-6), enquanto que a porção insolúvel, o maior componente da parede,

apresenta apenas de 3 a 6% de ramificações (Kwiatkowski e Kwiatkowski, 2012;

Shahinian, 2000).

Diversos efeitos benéficos têm sido relacionados à β-glicana. Dentre eles podem-se

citar sua atividade imunomodulatória, anti-inflamatória, antitumoral e antimutagênica,

sendo este composto considerado hipocolesterolêmico e hipoglicêmico, além de exercer

efeito protetor contra infecções (Magnani et al., 2011; Magnani e Castro-Gómez, 2008;

Luhm et al., 2006; Khalikova et al., 2005).

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2.2.Incorporação de agentes biologicamente ativos em curativos

Nos últimos anos, uma estratégia que tem ganhado atenção na produção de curativos

dérmicos e sido fundamental na prevenção e terapia de infecções é a incorporação de

agentes bioativos diversos nos biomateriais destinados para este fim. Diferentes estudos

relatam a incorporação de vários tipos de fármacos com aplicações distintas em matrizes

poliméricas a base de quitosana destinadas ao uso no tratamento de lesões da pele. Dentre

muitos, pode-se citar a incorporação de agentes microbianos como a prata (Girata, 2011;

Meng et al., 2010) e a bacitracina (Rodrigues, 2008), de analgésicos e antipiréticos como o

paracetamol (Fernández-Hervás e Fell, 1998), e de agentes anti-inflamatórios como o

diclofenato de sódio (González-Rodrígues et al., 2001).

A inclusão de antibióticos em curativos tem grande relevância para o tratamento de

lesões de pele, de modo a promover o controle dos processos infecciosos no local da lesão

A bacitracina é um antibiótico com intenso efeito sobre bactérias Gram positivas,

possuindo mecanismo de ação inibitório sobre a síntese da parede celular dos

microrganismos (Farzana et al., 2004). Este fármaco tem sido amplamente utilizado pela

indústria farmacêutica como princípio ativo em pomadas, associados ou não a outros

antibióticos (Vaucher e Schapoval, 2003). A elevada solubilidade deste antibiótico em

meios aquosos possibilita sua incorporação em dispositivos à base de quitosana, através do

intumescimento destas matrizes em soluções aquosas contendo o fármaco (Rodrigues,

2008).

Desta forma, a inclusão de medicamentos como antibióticos às membranas de

quitosana/xantana/β-glicana é bastante relevante, pois permitiria não só a recuperação dos

tecidos lesados pela ação dos biopolímeros, mas também o controle do crescimento de

microrganismos indesejáveis.

3. Objetivos e metas a serem alcançados

Este projeto de pesquisa tem com principal objetivo contribuir para os estudos no

ramo de obtenção de materiais com potencial para utilização na regeneração de lesões de

pele.

Como objetivos específicos, neste trabalho propõem-se:

Padronização da metodologia de produção de membranas poliméricas de quitosana,

5

xantana e β-glicana, com vistas à obtenção dos materiais em, pelo menos, média

escala;

Avaliação das características físico-químicas e biológicas das membranas

produzidas;

Otimização da formulação polimérica através de um modelo estatístico de superfície

de resposta;

Determinação da eficiência de incorporação, da cinética de liberação e da eficácia

antimicrobiana do fármaco bacitracina incorporado nas membranas que se

mostrarem mais favoráveis ao uso;

Avaliação da recuperação da pele através da realização de testes in vivo.

4. Indicadores de acompanhamento

Dentre as estratégias adotadas para a disseminação e avaliação dos resultados obtidos

neste projeto de pesquisa pode-se citar: publicação de artigos científicos completos em

revistas e periódicos internacionais de grande impacto, contribuindo significativamente

para a divulgação dos resultados alcançados neste estudo; participação em congressos

científicos de destaque, nacionais e internacionais, com o objetivo de apresentar trabalhos

derivados do presente projeto de pesquisa, além de fortalecer o relacionamento com

profissionais da área; apresentação de palestras e realização de cursos em reuniões e

encontros científicos, favorecendo a transmissão do conhecimento adquirido durante o

andamento deste projeto.

5. Metodologia a ser empregada;

A análise das propriedades intrínsecas do curativo bioativo, de sua arquitetura, assim

como das consequências biológicas decorrentes de sua utilização é de extrema importância

para melhor embasar sua aplicabilidade. Diferentes técnicas de caracterização devem ser

avaliadas tanto in vitro quanto in vivo. Os ensaios de caracterização físico-química de

membranas com potencial aplicação em processos de reparo tecidual são: determinação da

espessura; determinação do grau de hidratação ou intumescimento quando da imersão em

água e soluções fisiológicas; avaliação da permeabilidade ao vapor d’água e ao oxigênio;

análise da morfologia da superfície e da secção transversal; determinação da resistência à

6

tração e do alongamento na ruptura; estabilidade física e mecânica, dentre outros (Li et al.,

2010; Chesnutt et al., 2009; Wang et al., 2009). Quando os curativos são formulados com

agentes ativos incorporados, faz-se também necessária a determinação da eficiência de

incorporação e do perfil cinético de sua liberação (Mi et al., 2003).

Desta forma, visando alcançar o objetivo deste projeto, propõe-se preparar

membranas poliméricas através da complexação dos polissacarídeos naturais, quitosana,

xantana e β-glicana, com base nos procedimentos descritos por Bellini et al. (2012), mas

com vistas à análise de condições que possibilitem a ampliação da escala produtiva.

Propõe-se ainda a realização de diferentes ensaios de caracterização físico-química e

biológica com testes de efetividade in vitro utilizando células animais, buscando melhor

embasar a aplicabilidade do material visando o uso proposto.

5.1. Formulação das membranas

A complexação polimérica será testada em diferentes concentrações poliméricas,

variando-se a razão volumétrica de soluções aquosas de quitosana, de xantana e de β-

glicana. Os complexos poliméricos serão preparados com volume final de mistura de

200 mL contendo 1g ou 0,75g de quitosana.

Os efeitos das diferentes concentrações poliméricas das membranas serão

comparados através de um planejamento experimental fatorial, especificando-se as

proporções poliméricas dos polissacarídeos xantana e β-glicana como níveis de entrada,

conforme mostrado na Tabela 1, de forma a verificar quais condições melhorariam as

características das membranas. A faixa de concentração polimérica a ser testada foi

estabelecida com base em experimentos anteriores de Bellini et al. (2012), que utilizaram a

concentração de 1 g de cada polissacarídeo por unidade de membranas de quitosana-

xantana.

5.2. Preparo das membranas

Para a obtenção das membranas a solução de quitosana será adicionada através de

bomba peristática a uma vazão de 10 mL/min à solução de xantana e/ou de β-glicana, sob

constante agitação de 1000 rpm através de agitador mecânico de alto torque. Nas

formulações que contiverem tanto o polissacarídeo xantana quanto β-glicana, estes serão

previamente misturados sob constante agitação de 1000 rpm por 2 minutos antes da adição

da quitosana. Durante o preparo do complexo polimérico a temperatura será mantida a 25ºC

7

em um reator de vidro encamisado com diâmetro interno de 11 cm e externo de 12 cm, de

capacidade total igual a 7,5 L.

Tabela 1. Planejamento experimental fatorial empregado para avaliação de membranas com

diferentes proporções de xantana e β-glicana.

Experimento Xantana β-glicana

Nível Concentração (g/unid) Nível Concentração (g/unid)

1 -1 0,22 -1 0,22

2 1 1,00 -1 0,22

3 -1 0,22 1 1,00

4 1 1,00 1 1,00

5 0 0,75 0 0,75

6 0 0,75 0 0,75

7 0 0,75 0 0,75

8 -1,41 0,00 0 0,75

9 1,41 1,50 0 0,75

10 0 0,75 -1,41 0,00

11 0 0,75 1,41 1,50

5.3. Preparo das membranas

Para a obtenção das membranas a solução de quitosana será adicionada através de

bomba peristática a uma vazão de 10 mL/min à solução de xantana e/ou de β-glicana, sob

constante agitação de 1000 rpm através de agitador mecânico de alto torque. Nas

formulações que contiverem tanto o polissacarídeo xantana quanto β-glicana, estes serão

previamente misturados sob constante agitação de 1000 rpm por 2 minutos antes da adição

da quitosana. Durante o preparo do complexo polimérico a temperatura será mantida a 25ºC

em um reator de vidro encamisado com diâmetro interno de 11 cm e externo de 12 cm, de

capacidade total igual a 7,5 L.

Após a complexação polimérica, a suspensão de coacervados será desaerada em

bomba de vácuo por 2 horas, transferida para uma placa de poliestireno de 15 cm de

diâmetro e seca em estufa com circulação de ar a 37ºC até a formação de uma membrana

seca. Ao término da secagem, para a neutralização do pH das membranas, as mesmas serão

submetidas a sucessivas lavagens com água destilada e deionizada e com tampão Hepes a

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10 mM e novamente secas em estufa de circulação de ar a 37ºC.

Os estudos de ampliação de escala serão realizados utilizando-se um reator de vidro

encamisado de capacidade igual a 7,5 L. Serão testados diferentes volumes finais da

mistura polimérica, variando-se entre 0,2 e 5 L. A solução de quitosana em ácido acético

será misturada, com o auxílio de uma bomba peristáltica, à solução de xantana e/ou de β-

glicana em vazões volumétricas variando de 10 e 300 mL/min, com alimentação em

múltiplos pontos, conforme demonstrado na Figura 1. O efeito da agitação do sistema por

agitador mecânico de alto torque também será avaliado, empregando-se valores entre 500 e

1500 rpm. A mistura resultante será transferida para moldes de poliestireno de tamanhos

variáveis e seca em estufa com circulação de ar, avaliando-se diferentes temperaturas, entre

37 e 70ºC, até a formação de uma membrana seca.

Figura 1. Alimentação dos reatores: (A) em dois pontos; (B) em quatro pontos.

Quando requerido, as membranas serão esterilizadas por exposição a Oxyfume 30

(30% óxido de etileno e 70% CO2) na empresa Acecil Central de Esterilização Comércio e

Indústria Ltda (Campinas, SP) e então caracterizadas físico-química e biologicamente,

conforme descrito a seguir.

5.4. Caracterização físico-química dos dispositivos

As membranas de diferentes composições poliméricas serão avaliadas quanto ao

aspecto e morfologia da superfície e da secção transversal, à espessura, à capacidade de

absorção, a estabilidade durante exposição a soluções aquosas diversas, à resistência

mecânica, à eficiência de incorporação e à cinética de liberação do fármaco conforme

descrito a seguir.

(A) (B)

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As membranas serão analisadas quanto ao seu aspecto e morfologia da superfície a

olho nu e o seu aspecto será registrado por fotografia digital. A espessura média dos

suportes será obtida utilizando um micrômetro, realizando-se pelo menos sete medidas ao

longo da membrana e em ângulos de 90º. Os resultados serão expressos como médias.

A capacidade das membranas absorverem água e fluido corpóreo simulado será

determinada após exposição das amostras secas e de massas conhecidas às soluções por

24 h a 37ºC. Ao final desse período, as massas serão novamente avaliadas para possibilitar

o cálculo da quantidade de solução absorvida.

A estabilidade das amostras nestas soluções também será avaliada. Após a

exposição às soluções, as amostras serão lavadas com água destilada para a remoção de

material fracamente aderido e secas à 37ºC até que atinjam massa constante. A variação de

massa após a exposição a cada solução será, então, determinada.

As propriedades mecânicas das membranas serão avaliadas com base no método

ASTM D-882 (1995), calculando-se os valores de tensão e alongamento na ruptura e do

módulo de Young.

5.5. Análise da citotoxicidade in vitro

A citotoxicidade das membranas a culturas celulares será avaliada in vitro, utilizando

células L929, uma linhagem fibroblastóide de ratos estabelecida em cultura contínua e

amplamente utilizada em ensaios de citotoxicidade (Liu et al., 2010; Mortazavi et al.,

2010). As células L929 serão mantidas e propagadas em meio de cultura RPMI-1640

suplementado (assim definido deste ponto em diante) com 0,3g/L de L-glutamina, 2,0g/L

de D-glicose, 2,0g/L de NaHCO3, 10.000 UI/L de penicilina, 0,05g/L de estreptomicina,

5,958g/L de Hepes e 10% (v/v) de soro fetal bovino, em estufa a 37ºC e 5% de CO2.

A citotoxicidade do material será avaliada indiretamente, através do método de

redução do MTT (3-(4,5-dimeteiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium brometo), que se baseia

na análise da atividade mitocondrial das células expostas aos extratos das amostras. Os

extratos serão obtidos incubando-se as amostras em meio de cultivo PRMI-1640

suplementado a uma concentração de 0,05 g de material seco por mililitro de meio por 48

horas a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2, conforme descrito por Bellini et al. (2012).

5.6. Análise dos resultados da etapa de obtenção das membranas

Os resultados numéricos referentes às caracterizações físico-química e biológica das

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diferentes formulações serão analisados empregando-se o teste de comparação de médias

de Tukey com nível de significância de 5%. Todos os resultados serão expressos como a

média das medidas experimentais, calculadas com, no mínimo, três amostras

independentes. Cada valor médio será acompanhado de seu respectivo erro padrão, o que é

indicado para realizar comparações entre médias de diferentes populações.

O planejamento experimental fatorial será elaborado especificando-se os níveis das

variáveis de entrada em dois, os quais serão, a concentração (g/unidade de membrana) dos

polissacarídeos xantana e β-glicana, realizando-se 11 experimentos, sendo 8 experimentos

distintos e 3 no ponto central. As variáveis respostas serão absorção de água e fluido

corpóreo sumulado, perda de massa, tensão e alongamento na ruptura e citotoxicidade.

As análises estatísticas dos resultados serão realizadas utilizando o software Statistica

7®

. As melhores formulações apontadas pelo planejamento experimental, considerando-se

também a integridade e o aspecto das amostras, serão utilizadas nos estudos de ampliação

de escala de produção e, posteriormente, na realização dos ensaios de incorporação do

agente bioativo bacitracina.

5.7. Incorporação e cinética de liberação de bacitracina nas membranas

A incorporação da bacitracina se dará por difusão do fármaco nas membranas. As

membranas serão cortadas em corpos de prova circulares de 2 cm de diâmetro, colocados

em frascos âmbar e, hidratados em solução de bacitracina por 24 h a 37°C. Duas diferentes

concentrações de bacitracina serão avaliadas, sendo elas 1,5 e 3,5 mg de bacitracina/mL de

solvente.

A quantidade de bacitracina incorporada na membrana será determinada através da

diferença entre a quantidade de fármaco inicial e a quantidade de fármaco na solução de

equilíbrio (após a retirada da membrana). As concentrações do fármaco nas soluções serão

avaliadas em espectrofotômetro UV-visível a 253 nm.

Para a determinação da cinética de liberação da bacitracina, os corpos de prova

contendo o fármaco serão imersos em 10 mL de solução tampão PBS (pH 7,4) por até 96

horas a 37ºC. A cada 12 horas as amostras serão centrifugadas a 10.000 rpm por 10

minutos, sendo o fármaco liberado no sobrenadante determinado em espectrofotômetro

UV-visível a 253 nm.

11

5.8. Inibição do crescimento de patógenos

A eficácia de inibição in vitro do crescimento de contaminantes comuns em lesões de

pele será analisada. Amostras estéreis de membranas, contendo ou não bacitracina, serão

hidratadas por 1 minuto em água estéril e colocadas na superfície de placas de Petri

contendo meio de cultura TSA previamente inoculadas com 0,1% (v/v) de Pseudomonas

aeruginosa contendo 5,0x108 ufc/mL ou com 0,1% (v/v) de Staphylococcus aureus

apresentando 4,3x108 ufc/mL. Em seguida, as placas serão incubadas a 35ºC em estufa de

cultura por 48 h, e será observada a formação de um halo mais claro na área circundando a

membrana, indicando inibição do crescimento celular. Destaca-se que a bacitracina é

conhecidamente efetiva contra bactérias Gram-positivas como a Staphylococcus aureus,

mas como tem-se outros componentes na formulação das membranas que podem exercer

efeito também sobre micro-organimos Gram-negativos, seu comportamento frente a células

de Pseudomonas aeruginosa será também avaliado.

5.9. Testes de cicatrização in vivo

Visando a comprovação da aplicabilidade do curativo e almejando atingir o objetivo

da Medicina Translacional, que busca transformar descobertas apropriadas em

medicamentos e dispositivos médicos que podem ser utilizados no tratamento de pacientes,

será proposta a realização de testes in vivo utilizando as formulações tidas como mais

promissoras no processo de cicatrização de lesões de pele de acordo com os métodos de

caracterização das amostras descritos anteriormente.

Ratos wistar pesando em torno de 250 g serão anestesiados, por via intraperitoneal,

com 400 μL de solução na concentração de 1:1 (v/v) de quetamina a 10% e xilazina

20mg/mL. Após a anestesia, os animais serão tricotomizados e efetuada a retirada cirúrgica

da derme e epiderme mediante lesões circulares de 1,5 cm de diâmetro na região dorsal de

cada animal. Os animais serão então submetidos ao tratamento conforme descrito na Tabela

2.

Tabela 2. Distribuição dos animais utilizados no experimento

Grupo animais n (lesões) Tratamento

GR01 5 10 Controle

(sem membrana)

GR02 5 10 Membrana sem bacitracina

GR03 5 10 Membrana com bacitracina

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Os ratos serão acompanhados diariamente e o processo de cicatrização será

avaliado. Serão observadas características como: alterações da massa corporal, exsudação

através da ferida, presença de infecção e inflamação, formação de neo-vasos, formação de

tecido de granulação e cicatricial. Essas análises serão realizadas imediatamente após a

queimadura e transcorridos 7, 15, 30, 45 e 60 dias do procedimento experimental.

A avaliação clínico-fotográfica das lesões será realizada por método não invasivo,

pela determinação da porcentagem de cicatrização das ulcerações, observada a partir da

captura e análise de imagens pelo programa Image J® (versão 1.40g para Windows

TM), um

programa de análise de imagem de domínio público desenvolvido por Wayne Rasband do

National Institutes of Health (NIH). É um sucessor do NIH Image, possuindo a vantagem

de ter aplicação multidisciplinar, na pesquisa e na prática clínica.

A captura de imagens será realizada imediatamente após a queimadura experimental

(0d) e nos períodos de 7, 15, 30, 45 e 60 dias após o início do experimento. As imagens

serão capturadas por uma câmera fotográfica digital e analisadas pelo software Image J®

(versão 1.40g para WindowsTM

). No momento da captura da imagem uma régua será

posicionada ao lado de cada animal fotografado o que permitirá a calibração do software e

posterior análise computacional.

6. Principais contribuições científicas, tecnológicas ou de inovação da proposta

Nas últimas décadas, a proposição e análise de tecnologias associadas ao

desenvolvimento de materiais aumentou significativamente, possibilitado a obtenção de

novos produtos tecnológicos para aplicação nas áreas médicas e farmacêuticas. Atualmente,

os biomateriais são utilizados em aplicações complexas, como a engenharia de tecidos, a

terapia celular e a liberação controlada de fármacos e genes (Williams, 2009). O

desenvolvimento e aplicação de um biomaterial envolvem várias áreas do conhecimento,

sendo necessário que haja colaboração entre profissionais de diferentes especialidades,

como a engenharia, a química, a biologia e as ciências clínicas.

Neste contexto, uma vez que a busca contínua por biomateriais alternativos para a

composição de dispositivos médicos se faz necessária e com base nos resultados obtidos em

pesquisas anteriores que apontam que membranas de quitosana complexada com xantana

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são bastante promissoras para a aplicação como curativos dérmicos (Bellini et al., 2015a,b;

Bellini et al., 2012) e que dados da literatura consultada apontam para a eficaz ação

biológica da β-glicana como agente anti-inflamatório, antitumoral e antimutagênico, além

de exercer efeito protetor contra infecções, espera-se, ao final deste projeto, o

desenvolvimento de um curativo bioativo à base de quitosana, xantana e β-glicana com

características físico-químicas e biológicas relevantes para o tratamento de lesões dermo-

epidérmicas, contribuindo, assim, para setor de desenvolvimento de materiais para este tipo

de aplicação.

Destaca-se ainda que não foram localizados na literatura trabalhos referentes à

incorporação da β-glicana em dispositivos médicos destinados ao tratamento de pele, o que

evidencia caráter de ineditismo a esta proposta.

Os resultados deste projeto serão publicados em revistas e periódicos de grande

impacto da área, com ótimo potencial de contribuição para a literatura e para a comunidade

científica que atua no segmento de pesquisa e desenvolvimento neste campo. Além disto,

este projeto contribuirá com a formação de recursos humanos voltados para a área de

Bioengenharia e de Biomateriais e para o desenvolvimento de novos produtos a partir do

uso de biomoléculas.

7. Orçamento detalhado

A implantação deste projeto de pesquisa depende, dentre vários quesitos, de recursos

financeiros, sejam eles de capital (equipamentos), de custeio (materiais de consumo,

passagens e diárias) e de bolsas. Desta forma, faz-se necessário a solicitação de auxílio

financeiro junto a esta agência de fomento, visando fundamentalmente prover material de

consumo para sua realização, custeio de passagens e diárias, além de melhor equipar o

laboratório no qual será desenvolvido o trabalho, conforme indicado na Tabela 3.

Destaca-se que a instituição de ensino a qual este projeto pretende ser implantado,

conta com a maior parte dos equipamentos necessários, os quais poderão ser utilizados e

que, junto com as instituições parceiras, viabilizam o desenvolvimento do projeto de

pesquisa.

14

Tabela 3. Itens solicitados para a realização do projeto.

Material Detalhamento Valor previsto

Estufa Estufa de secagem com circulação e renovação de

ar Tecnal TE-394/2 R$ 8.000,00

Material de

consumo

Reagentes, vidraria e material descartável, como:

quitosana, xantana, β-glicana, ácido acético, filtros

para esterilização de soluções, embalagens para

esterilização, tubos de centrífuga, tubos de ensaio

estéreis e frascos com tampa, cartuchos contendo

resinas para purificação de água de sistema da

Millipore.

R$ 10.000,00

Despesas de

transporte

Despesas com deslocamento nos trechos

Adamantina-Assis R$ 2.000,00

Congressos

Participação em 2 (dois) Congressos para

apresentação de trabalhos 2 x R$ 350,00

Viagens 2 x R$ 1.100,00

Diárias com pernoite 2 x 5 x R$ 195,00

Total R$ 24.850,00

8. Cronograma de execução

Tendo em vista os objetivos mencionados e considerando-se os aspectos enfocados

na revisão da literatura efetuada, tem-se por meta desenvolver o plano de estudos em etapas

sequenciais ou paralelas, conforme indicado na Figura 2 e na Tabela 3, destacando-se que a

previsão de duração do projeto é de 36 meses.

15

Figura 2. Plano de desenvolvimento de trabalho

Aumento da escala de produção das membranas de quitosana-xantana- β-glicana

Análise do efeito de diferentes vazões, temperaturas e nível de agitação

Caracterização Físico-Química e Biológica dos materiais

Testes de incorporação, de liberação e de ação do fármaco

com as melhores formulações

Análise estatística do

planejamento fatorial

Obtenção do curativo bioativo

Produção das membranas de quitosana-xantana- β-glicana

Análise de diferentes proporções poliméricas

Caracterização Físico-Química e Biológica dos materiais

Ensaios in vivo

16

Tabela 3. Cronograma de desenvolvimento das atividades

Atividades 2º Semestre

2016

1º Semestre

2017

2º Semestre

2017

1º Semestre

2018

2º Semestre

2018

1º Semestre

2019

Revisão da literatura

pertinente X X X X X X

Produção das membranas

(estudo de diferentes

formulações e ampliação de

escala)

X X X

Caracterização físico-química X X

Caracterização biológica X X

Análise estatística X X

Testes de incorporação,

liberação e ação do fármaco

na membrana

X X

Testes in vivo de cicatrização X X

Redação de relatórios

técnicos X X

X

Redação e submissão de

artigos científicos X X X X

Apresentação de trabalhos em

congressos X

X

9. Identificação de todos os participantes do projeto;

O desenvolvimento deste projeto de pesquisa terá a participação efetiva do

pesquisador proponente deste financiamento e de um aluno regularmente matriculado no

curso de Medicina, Enfermagem ou Farmácia, além da participação de profissionais da

instituição de ensino que darão apoio técnico e acadêmico.

É importe destacar que a proponente tem experiência acumulada na área de

desenvolvimento de biomateriais poliméricos destinados a aplicação na regeneração de

lesões de pele, indicando que as chances de sucesso no desenvolvimento da presente

proposta são bastante elevadas.

Abaixo estão relacionados os nomes e a titulação dos pesquisadores que efetivamente

participarão do projeto. Destaca-se que o aluno que irá receber a bolsa de IC será indicado

após a confirmação da aprovação da proposta, mediante um processo seletivo interno.

17

Márcia Zilioli Bellini (proponente)

Graduação: Ciências Biológicas – Faculdade de Ciências e Letras de Assis -

UNESP;

Pós-Graduação: Mestrado em Ciências de Alimentos – Faculdade de

Engenharia de Alimentos - UNICAMP;

Doutorado em Engenharia Química – Área de

Desenvolvimento de Bioprocessos e Biomaterias – Faculdade de Engenharia

Química - UNICAMP;

Pós-Doutorado em Engenharia Química - Universidade de

Coimbra, Portugal.

Liliana Martos Nicoletti (colaborador)

Graduação: Biomedicina - Organização Educacional Barão de Mauá;

Pós-Grtaduação: Mestrado em Biologia Celular e Molecular - Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto - USP.

Doutorado em Clínica Médica - Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto - USP.

Valter Dias da Silva (colaborador)

Graduação: Farmácia – Faculdades Adamantinenses Integradas – FAI;

Pós Graduação: Mestrado em Ciência Animal – Área: Fisiopatologia Animal

– Universidade do Oeste Paulista - UNOEST

10. Indicação de colaborações ou parcerias já estabelecidas com outros centros

de pesquisa na área;

Destaca-se que o desenvolvimento deste projeto contará com o apoio do Prof. Dr.

Pedro Oliva Neto, do Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências e

Letras de Assis - UNESP, que trabalha com o desenvolvimento de tecnologias para a

produção em escala piloto de biopolímeros, dentre eles a goma xantana e a β-glicana. O

Prof. Pedro Oliva fornecerá a xantana e a β-glicana a serem utilizadas neste estudo, bem

como disponibilizará o uso das instalações do Laboratório de Biotecnologia Industrial, o

qual coordena, quando necessário.

18

11. Disponibilidade efetiva de infraestrutura e de apoio técnico para o

desenvolvimento do projeto;

A instituição de ensino Faculdades Adamantinenses Integradas – FAI, a qual este

projeto pretende ser implantado, conta com uma infraestrutura de laboratórios e

equipamentos, os quais poderão ser utilizados e que viabilizam o desenvolvimento do

projeto de pesquisa.

Dentre os laboratórios da instituição de ensino e que estarão disponíveis para o

desenvolvimento deste projeto de pesquisa podemos citar: Laboratórios de Microbiologia;

Laboratórios de Bioquímica; Laboratórios de Química; Laboratórios de Microscopia;

Laboratórios de Histopatologia; Laboratórios de Análise.

Os equipamentos necessários para o andamento da pesquisa e que estarão

disponíveis são: Balança Analítica; Bomba peristáltica; Agitador mecânico de alto torque;

Bomba de vácuo; Medidor de pH; Lupas; Microscópios Ópticos; Materiais cirúrgicos.

Destaca-se ainda que a FAI dispõe de Biotério e que todos os protocolos dos

experimentos envolvendo animais deverão ser analisados e aprovados pela Comissão de

Ética no Uso de Animais das Faculdades Adamantinenses Integradas, Adamantina, SP,

local onde serão manipulados os animais e realizados os ensaios de cicatrização in vivo.

12. Plano das atividades a serem desenvolvidas pelo bolsista.

Uns dos principais mecanismos institucionais para a inserção do aluno de

graduação em projetos de pesquisa é a iniciação científica. A participação precoce do aluno

em atividades de pesquisa torna-se um instrumento valioso para aprimorar qualidades

desejadas em um profissional de nível superior, bem como para estimular e iniciar a

formação daqueles mais vocacionados para a pesquisa.

Com o intuito de atingir estes objetivos este projeto de pesquisa pleiteia uma

bolsa de estudos de iniciação científica, IC. As atividades específicas a serem

desenvolvidas pelo bolsista serão as seguintes:

Aplicação da metodologia prevista pelo orientador para o desenvolvimento

do curativo;

Elaboração dos testes de caracterização e de aplicação do biomaterial

desenvolvido;

19

Realizar a interface entre os membros da equipe de pesquisa através de

participação em reuniões, seminários e discussões gerais sobre o projeto;

Atualização do status do projeto e apresentação dos resultados obtidos

através de relatórios periódicos.

No decorrer do desenvolvimento deste projeto de pesquisa o bolsista será treinado

através do contato direto com o orientador e também com os pesquisadores colaboradores

do projeto. Espera-se ainda que o aluno desenvolva suas atividades de forma ética, com

criatividade e inovação, buscando sempre a constante ampliação do conhecimento.

13. Bibliografia

American Society for Testing and Materials ASTM D882–95a: Standard test methods for

tensile properties of thin plastic sheeting, 1995.

BEJENARIU, A.; POPA, M.; CERF, D. L.; PICTON, L. Stiffness xanthan hydrogels:

synthesis, swelling characteristics and controlled release properties. Polymer Bulletin,

v. 61, p. 631–641, 2008.

BELLINI, M.Z.; PIRES, A.L.R.; VASCONSELOS, M.O.; MORAES A.M. Comparison of

the Properties of Compacted and Porous Lamellar Chitosan–Xanthan Membranes as

Dressings and Scaffolds for the Treatment of Skin Lesions. Journal of Applied Polymer

Science, v. 125, p.421-431, 2012.

BELLINI, M.Z.; CALIARI-OLIVEIRA, C.; MAZUKAMI, A.; SWIECH, K.; COVAS, D.

T.; DONATI, E. A.; OLIVA-NETO, P.; MORAES, A. M. Combining xanthan and

chitosan membranes to multipotent mesenchymal stromal cells as bioactive dressings

for dermo-epidermal wounds. Journal of Biomaterials Applications, v. 29(8), p. 1155-

1166, 2015a.

BELLINI, M.Z.; OLIVA-NETO, P.; MORAES, A.M. Properties of Films Obtained from

Biopolymers of Different Origins for Skin Lesions Therapy. Brazilian Archives of

Biology and Technology, v. 58(2), p. 289-299, 2015b.

BUENO, C. and MORAES, A.M. Development of porous lamellar chitosan-alginate

membranes: effect of different surfactants on biomaterial properties. Journal of Applied

Polymer Science, v.122, p. 624–631, 2011.

BUENO, C.Z.; VEIGA, I.G.; SACCHETIN, P.S.C.; BELLINI, M.Z.; MORAES, A.M.

20

Aplicação de polissssacarídeos para a produção de curativos e outros Biomateriais. In

Sousa, H.C.; Braga, M.E.M.; Sosnik, A. (Eds), Biomateriais Aplicados ao

Desenvolvimento de Sistemas Terapêuticos Avançados. Imprensa da Universidade de

Coimbra, Portugal, 2015.

BURD, A.; HUANG, L. Carbohydrates and Cutaneous Wound Healing. In: GARG, H. G.;

COWMAN, M. K., HALES, C. A. Carbohydrate Chemistry, Biology and Medical

Applications. Elsevier Ltd., Amsterdam, 2008.

CAMPOS, M. G. N.; RAWLS, H. R.; INNOCENTINI-MEI, L. H.; SATSANGI, N. In

vitro gentamicin sustained and controlled release from chitosan cross-linked films.

Journal of Materials Science: Materials in Medicine, v.20, p.537–542, 2009.

CHESNUTT, B. M.; VIANO, A.M.; YUAN, Y.; YANG, Y.; GUDA, T.; APPLEFORD,

M. R.; ONG, J. L.; HAGGARD, W. O.; BUMGARDNER, J. D. Design and

characterization of a novel chitosan/nanocrystalline calcium phosphate composite

scaffold for bone regeneration. Journal of Biomedical Materials Research - Part A,

v.88, p.491-502, 2009.

CHORVATOVICOVÁ, D.; MACHOVÁ, E.; SANDULA, J. Effect of ultrasonicated

carboxymethylglucan on cyclophosphamide induced mutagenicity. Mutation Research,

v. 371, n. 1-2, p. 115-120, 1996.

Di LUZIO, N. R.; WILLIAMS, D. L.; McNAMEE, R. B.; EDWARDS, B. F.;

KITAHAMA, A. Compartive tumor-inhibitory and anti-bacterial activity of soluble

and particulate glucan. International Journal of Cancer, v. 24, n. 6, p. 773-779, 1979.

FARZANA, K.; SHAH, S. N. H.; BUTT, F. B.; BUKHSH, S. Biosynthesis of bacitracin in

stirred fermenter by Bacillus licheniformis using defatted oil seed cakes as csbstrate.

Journal of Research (Science), v. 15, p. 285-290, 2004.

FAN, L.; TAN, C.; WANG, L.; PAN, X.; CAO, M.; WEN, F.; XIE, W.; NIE, M.

Preparation, characterization and the effect of carboxymethylated chitosan–cellulose

derivatives hydrogels on wound healing. Journal of Applied Polymer Science, v.128,

p.2789–2796, 2013.

FERNÁNDEZ-HERVÁS, M. J.; FELL, J. T. “Pectin/chitosan mixtures as coatings for

colon-specific drug delivery: an in vitro evaluation”. International Journal of

Pharmaceutics. v. 169, p. 115-119, 1998.

21

GEORGE M.; ABRAHAM T. E. Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of

protein drugs: Alginate and chitosan - a review. Journal of Controlled Release, v. 114,

p. 1-14, 2006.

GIRATA, A.K. Desenvolvimento de curativos de quitosana e alginato contendo fosfato

hidrogenado de zircônio, sódio e prata. Dissertação (Mestrado em Engenharia

Química). Faculdade de Engenharia Química – Universidade Estadual de Campinas,

2011.

GONZÁLES-RODRÍGUEZ, M. L.; HOLGADO, M. A.; SÁNCHEZ-LAFUENTE, C.;

RABASCO, A. M.; FINI, A. “Alginate/chitosan particulate systems for sodium

diclofenac release”. International Journal of Pharmaceutics. v.232, p. 225-234, 2002.

JAYAKUMAR, R; PRABAHARAN, M; SUDHEESH KUMAR, PT, NAIR, SV;

TAMURA, H; Biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing

applications. Biotechnology Advances, v.29, p.322-337, 2011.

KHALIKOVA, T. A.; ZHANAEVA, S. YA.; KOROLENKO, T. A.; KALEDIN, V. I.;

KOGAN, G. Regulation of activity of cathepsins B, L, and D in murine

lymphosarcoma model at a combined treatment with cyclophosphamide and yeast

polysaccharide. Cancer Letters, v. 223, p. 77-83, 2005.

KWIATKOWSKI, S., KWIATKOWSKI, S.E. Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Glucan

Polysaccharides – Occurrence, Separation and Application in Food, Feed and Health

Industries. In: The Complex World of Polysaccharides, 2012.

http://dx.doi.org/10.5772/48100.

LEE, D.-Y.; JI, I.-H.; CHANG, H.-I.; KIM, C. H. High-level TNF-α on secretion and

macrophage activity with soluble β-glucans from Saccharomyces cerevisiae.

Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, v. 66, n. 2, p. 233-238, 2002.

LI, L. H.; DENG, J. C.; DENG, H. R.; LIU, Z. L.; XIN, L. Synthesis and characterization

of chitosan/ZnO particle composite membranes. Carbohydrate Research, v.345, p.

994-998, 2010.

LIU, T. L.; MIAO, J. C.; SHENG, W. H.; XIE, Y. F.; HUANG, Q.; SHAN, Y. B.; YANG,

J. C. Cytocompatibility of regenerated silk fibroin film: a medical biomaterial

applicable to wound healing. Journal of Zhejiang University Science B, v.11, p.10-16,

2010.

22

LUHM, J.; LANGENKAMP, U.; HENSEL, J.; FROHN, C.; BRAND, J. M.; HENNIG, H.;

RINK, L.; KORITKE, P.; WITTKOPF, N.; WILLIAMS, D. L.; MUELLER, A. β-

(1→3)-D-glucan modulates DNA binding of nuclear factors κB,AT and IL-6 leading to

an anti- inflammatory shift of the IL-1β/IL-1 receptor antagonist ratio. BMC

Immunology, v. 7, p. 5, 2006.

MACHADO, J. L. M.; BENDEROVICS, G.; SANTOS, L. A. Obtenção de suporte para

engenharia de tecidos utilizando-se cimento de α-trifosfato de cálcio (α-TCP). 17º

CBECIMat - Congresso Brasileiro de Engenharia e Ciência dos Materiais, Foz do

Iguaçu, PR, Brasil, 2006.

MAGNANI, M.; CASTRO-GÓMEZ, R.J.H. β-glucana from Saccharomyces cerevisiae:

constitution, bioactivity and obtaining. Semina: Ciências Agrárias, v. 29, n.3, p. 631-

650, 2008.

MAGNANI, M.; CASTRO-GOMEZ, R. J. H.; MORI, M.P.; KUASNE H.; GREGÓRIO,

E.P.; LIBOS JR., F. CÓLUS, I.M.S. Protective effect of carboxymethyl-glucan (CM-

G) against DNA damage in patients with advanced prostate cancer. Genetics and

Molecular Biology, v. 34, p.131-135, 2011.

MANNERS, D. J.; MASSON, A. J.; PATTERSON, J. A.; BJORNDAL, H.; LINDBERG,

B. The structure of a β(1-6)-D-glucan from yeast cell walls. Biochemistry Journal,

v.135, n. 1, p.31-36, 1973.

MENG, X.; TIAN, F.; YANG, J.; CHUN-NIAN, H.; XING, N.; LI, F. Chitosan and

alginate polyelectrolyte complex membranes and their properties for wound dressing

application. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, v. 21, n. 5, p. 1751-

1759, 2010.

MI, F. L; SHYU, S. S.; WU, Y. B.; LEE, S. T.; SHYONG, J. Y.; HUANG, R. N.

Fabrication and characterization of sponge-like asymmetric chitosan membrane as a

wound dressing. Biomaterials, v. 22, p. 165-173, 2001.

MI, F. L.; WU, Y. B.; SHYU, S. S.; CHAO, A. C.; LAI, J. Y.; SU, C. C. Asymmetric

chitosan membranes prepared by dry/wet phase separation: a new type of wound

dressing for controlled antibacterial release. Journal of Membrane Science, v. 212,

p.237-254, 2003.

MIADOKOVÁ, E.; SVIDOVÁ, S.; VLCKOVÁ, V.; DÚHOVÁ, V.; PRAZMÁRIOVÁ,

23

E.; TOTHOVÁ, K.; NAĎOVÁ, S.; KOGAN, G.; RAUKO, P. The role of natural

biopolymers in genotoxicity of mutagens/carcinogens elimination. Biomedical Papers

of the Medical Faculty of the University Palacky, v. 149, n, p. 493-496, 2005.

MIURA, N. N.; ADACHI, Y.; YADOMAE, T.; TAMURA, H.; TANAKA, S.; OHNO, N.

Structure and biological activies of β-glucans from yeast and mycelial forms of

Candida albicans. Microbiology and Immunology, v. 47, n. 3, p. 173-182, 2003.

MORTAZAVI, V.; NAHRKHALAJI, M. M.; FATHI, M. H.; MOUSAVI, S. B.;

ESFAHANI, B. N. Antibacterial effects of sol-gel-derived bioactive glass nanoparticle

on aerobic bacteria. Journal of Biomedical Materials Research Part A, v.94,p.160-168,

2010.

MURAKAMI, K.; AOKI, H.; NAKAMURA, S.; TAKIKAWA, M.; HANZAWA, M.;

KISHIMOTO, S.; HATTORI, H.; TANAKA, Y.; KIYOSAWA, T.; SATO, Y.;

ISHIHARA, M. Hydrogel blends of chitin/chitosan, fucoidan and alginate ashealing

impaired wound dressings. Biomaterials, v. 31, p. 83-90, 2010.

MUZZARELLI, R.A.A. Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve,

cartilage and bone. Carbohydrate Polymers, v. 76, p. 167-182, 2009.

RATNER, B.D.; HOFFMAN, A.S.; SCHOEN, F.J.; LEMONS, J.E. Biomaterials science,

an introduction to materials in medicine. Segunda Edição. San Diego, Estados Unidos.

Elsevier Academic Press, p.80-707, 2004.

RODRIGUES, A. P.; SANCHEZ, E. M. S.; COSTA, A. C.; MORAES, A. M. The

influence of preparation conditions on the characteristics of chitosan-alginate dressings

for skin lesions. Journal of Applied Polymer Science, v.109, p. 2703-2710, 2008.

RODRIGUES, A. P. “Preparação e caracterização de membranas de quitosana e alginato

para aplicação na terapia de lesões”; Tese de doutorado; Faculdade de Engenharia

Química; Universidade Estadual de Campinas; Campinas, 2008.

SHAHINIAN, S.; BUSSEY, H. β-1,6-Glucan synthesis in Saccharomyces cerevisiae.

Molecular Microbiology, Salem, v. 35, n. 3, p. 477-489, 2000.

SLAMENOVÁ, D.; LÁAJ, J.; KRIZKOVÁ, L.; KOGAN, G.; SANDULA, J.; BRESGEN,

N.; ECKL, P. Protective effects of fungal (1 - 3)-β-D-glucan derivatives against

oxidative DNA lesions in V79 hamster lung cells. Cancer Letters, v. 198, n. 2, p. 153-

160, 2003.

24

SOUTO, L. R. M.; VASSALLO, J.; REHDER, J.; PINTO, G. A.; PUZZI, M. B.

Immunoarchitectural characterization of a human skin model reconstructed in vitro.

Sao Paulo Medical Journal, v.127, p.28-33, 2009.

SOUTO, L. R. M.; REHDER, J.; VASSALO, J.; CINTRA, M. L.; KRAEMER, M. H. S.;

PUZZI, M. B. Model for human skin reconstructed in vitro composed of associated

dermis and epidermis. São Paulo Medical Journal, v.124, p.71-76, 2006.

VAUCHER L.C., SCHAPOVAL E.E.S. Método físico-químico para doseamento de

bacitracina. Revista Brasileira de Farmácia, v.84, 43-45, 2003.

VEIGA, I. G. e MORAES A.M. Study of the swelling and stability properties of chitosan-

xanthan membranes. Journal of Applied Polymer Science, v.124, p. 154-160, 2012.

WANG, Y.; YIN, S.; REN, L.; ZHAO, L. Surface characterization of the chitosan

membrane after oxygen plasma treatment and its aging effect. Biomedical Materials,

v.4, p.1-7, 2009.

WILLIAMS, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials, v. 30, p. 5897-5909, 2009.

WITTAYA-AREEKUL, S.; PRAHSARN, C. Development and in vitro evaluation of

chitosan-polysaccharides composite wound dressings. International Journal of

Pharmaceutics, v. 313, p. 123-128, 2006.

YANG, B.; YIN, Z.; CAO, J.; SHI, Z.; ZHANG, Z.; SONG, H.; LIU, F.; CATERSON, B.

In vitro cartilage tissue engineering using cancellous bone matrix gelatin as a

biodegradable scaffold. Biomedical Materials, v. 5, p. 1-8, 2010.