Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàuthuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/14569/1/Nuoi cay nam men...

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

TàuTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

KHOA HOÁ HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐINH THỊ BÍCH PHƯỢNG

THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTORULA SP. TRONG

MÔI TRƯỜNG LỎNG, TRÍCH LY β-CAROTENOID TỪ SINH KHỐI

NẤM MEN RHODOTORULA SP. BẰNG DẦU THỰC VẬT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC

Ngành CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Người hướng dẫn

CN. PHẠM THỊ HỮU HẠNH

Vũng Tàu, Năm 2012

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

TàuLỜI MỞ ĐẦU

Để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng ngày càng cao của xã hội, ngành Công nghệ thực

phẩm luôn nổ lực tìm ra những nguồn dưỡng chất mới có lợi với cơ thể con người. Do đó,

Công nghệ thực phẩm đã trở thành một ngành quan trọng bởi tính thiết thực mà nó đem

lại. Sự phát triển ngành Công nghệ thực phẩm cũng kéo theo sự phát triển của ngành sinh

học, môi trường, y dược...

Carotenoid là tiền sắc tố của Vitamin A, Vitamin A có vai trò quan trọng đối với

sức khỏe của con người và vật nuôi. Nhưng khác với thực vật, con người và vật nuôi

không thể tự tổng hợp được nguồn sắc tố này mà phải được đưa vào bằng con đường

thức ăn. Do đó việc bổ sung carotenoid từ thiên nhiên là rất cần thiết.

Trong các nguồn carotenoid được sản xuất hiện nay, carotenoid có nguồn gốc từ vi

sinh vật được quan tâm hàng đầu bởi hiệu quả kinh tế mà nó đem lại. Trong số đó, các

nhà khoa học đã chứng minh sinh khối nấm men Rhodotorula sp. có chứa carotenoid khá

cao, ngoài ra còn có thể thu nhận được thêm protein, lipid đáng kể.

Nhằm mục đích khảo sát, đánh giá khả năng thích nghi của nấm men Rhodotorula

sp. trong môi trường lỏng, khả năng thu nhận β-carotenoid từ sinh khối nấm men

Rhodotorula sp. nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm nuôi cấy nấm

men Rhodotorula sp. trong môi trường lỏng, trích ly β-carotenoid từ sinh khối nấm

men Rhodotorula sp. bằng dầu thực vât” được đặt ra các nhiệm vụ cụ thể sau:

- Nghiên cứu môi trường thích hợp để nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp. đạt

được hiệu suất cao.

- Nghiên cứu dung môi để trích ly β-carotenoid từ nấm men Rhodotorula sp.

đạt hiệu suất cao mà không ảnh hưởng đến tính chất của β-carotenoid.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

TàuLỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, em xin chân thành cảm ơn sự hổ trợ

kinh phí của Ban giám hiệu trường đại học Bà Rịa-Vũng Tàu giúp em có điều kiện nghiên

cứu và phát triển đề tài.

Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa, quý Thầy, Cô giảng dạy đã quan tâm, giúp

đỡ, cố vấn cho em những kiến thức chuyên môn.

Em xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Hữu Hạnh đã tạo điều kiện giúp đỡ và định

hướng cho em trong quá trình tìm hiểu tài liệu và hoàn thành bài báo cáo này.

Em cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Minh Nhựt quản lí phòng

thí nghiệm của khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm đã hỗ trợ, giúp đỡ em rất nhiều

trong quá trình thực hiện đề tài.

Tuy nhiên, trong quá trình làm đề tài và hoàn thành báo cáo em không tránh khỏi

những sai sót và khuyết điểm, kính mong sự góp ý của quý thầy cô để em hoàn thiện

mình hơn.

Em xin chân thành cảm ơn.

……………., ngày …..tháng ….. năm 2012

Sinh viên thực hiện

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

TRƯỜNG ĐH BÀ RỊA VŨNG TÀU CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA HÓA HỌC & CNTP Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

------o0o------

NHIỆM VỤ ĐỀ TÀI KHOA HỌC

Họ và tên sinh viên: Đinh Thị Bích Phượng MSSV: 0852020075

Ngày, tháng, năm sinh: 02/07/1987 Nơi sinh: Đồng Tháp

Ngành: Công nghệ thực phẩm

1. TÊN ĐỀ TÀI: Thử nghiệm nuôi cấy nấm men Rhodotorola sp. trong môi trường

lỏng, trích ly β-carotenoid từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp. bằng dầu thực vật.

2. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nghiên cứu môi trường thích hợp để nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp. đạt được

hiệu suất cao.

Nghiên cứu dung môi để trích ly β-carotenoid từ nấm men Rhodotorula sp. đạt

hiệu suất cao mà không ảnh hưởng đến tính chất của β-carotenoid.

3. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN: 30/02/2012

4. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/05/2012

5. HỌ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: CN. Phạm Thị Hữu Hạnh

Bà Rịa – Vũng Tàu, Ngày.....tháng.....năm2012

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

TRƯỞNG BỘ MÔN TRƯỞNG KHOA

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

MỤC LỤC

Nhiệm vụ đồ án Lời mở đầu Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng Danh mục sơ đồ và hình Danh mục các chữ viết tắt CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................1 1.1 ........................................................................................................................ Nấ

m men Rhodotorula sp .......................................................................................... 1 1.1.1...................................................................................................................... Ph

ân loại ............................................................................................................... 1 1.1.2...................................................................................................................... Đặ

c điểm hình thái.................................................................................................1 1.1.3...................................................................................................................... Đặ

c diểm sinh lý....................................................................................................1 1.1.4...................................................................................................................... Đặ

c điểm sinh hóa .................................................................................................3 1.1.5...................................................................................................................... Kh

ả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula sp.........................................4 1.2 ........................................................................................................................ Đặ

c tính carotenoid ...................................................................................................7 1.3 ........................................................................................................................ Cá

c lý thuyết cơ bản ..................................................................................................8 1.3.1...................................................................................................................... Trí

ch ly.................................................................................................................. 8 1.3.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly....................................................... 8 1.3.1.2 Điều kiện chọn dung môi ................................................................................. 9 1.3.2...................................................................................................................... Sấ

y........................................................................................................................ 9 1.3.3...................................................................................................................... Ly

tâm.................................................................................................................... 9 1.4 ........................................................................................................................ Cá

c yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp .................. 10 1.4.1...................................................................................................................... Ản

h hưởng của nguồn giống .................................................................................. 10

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

1.4.2...................................................................................................................... Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy....................................................................... 10

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 12 2.1.2 Dụng cụ và hóa chất.......................................................................................... 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 13 2.2.1 Sơ đồ nuôi cấy nấm men ở môi trường lỏng...................................................... 13 2.2.2 Thuyết minh quy trình....................................................................................... 13 2.2.2.1 Nấm men Rhodotorula sp............................................................................... 13 2.2.2.2 Tăng sinh ....................................................................................................... 14 2.2.2.3 Chuẩn bị môi trường ...................................................................................... 14 2.2.2.4 Hấp ................................................................................................................ 14 2.2.2.5 Cấy giống....................................................................................................... 14 2.2.2.6 Sục Khí .......................................................................................................... 14 2.2.2.7 Ly tâm............................................................................................................ 14 2.2.2.8 Thu sinh khối nấm men Rhodotorula sp ......................................................... 14 2.3 Nội dung thí nghiệm ............................................................................................ 14 2.3.1 Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT1........................................................................................ 15 2.3.2 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT2........................................................................................ 15 2.3.3 Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT3........................................................................................ 16 2.3.4 Thí nghiệm 4. Khảo sát lượng sinh khối thu được của nấm men Rhodotorula sp. ở cả 3 môi trường.......................................................................................................... 17 2.4 Sơ đồ quy trình trích ly β-carotenoid.................................................................... 17 2.5 Thuyết minh quy tình........................................................................................... 18 2.5.1 Nguyên liệu....................................................................................................... 18 2.5.2. Sấy................................................................................................................... 18 2.5.3. Trích ly ............................................................................................................ 18 2.5.4. Dịch trích ......................................................................................................... 18 2.5.5. Ly tâm.............................................................................................................. 18 2.6. Nội dung thí nghiệm ........................................................................................... 18 2.6.1. Thí nghiệm 5. Khảo sát tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến quá trình trích ly của dung môi dầu đậu nành tinh luyện ............................................ 18 2.6.2. Thí nghiệm 6. Khảo sát tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến quá trình trích ly của dung môi dầu hướng dương tinh luyện ..................................... 19 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 21

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

3.1.Xác định tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT1...... 21 3.2. Xác định tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT2..... 22 3.3. Xác định tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT3..... 23 3.4. Thu nhận sinh khối nấm men trên các môi trường lỏng ....................................... 25 3.5. Xác định tỉ lệ dung môi: mẫu thích hợp cho quá tình trích ly β-carotenoid ......... 27 3.6. Xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly β-carotenoid ...... 29 3.6.1. Dung môi dầu nành .......................................................................................... 29 3.6.2. Dung môi dầu hướng dương............................................................................. 30 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 31 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 31 4.2. Đề nghị ............................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

TÓM LƯỢC

Đề tài “ Thử nghiệm nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp. trong môi trường lỏng,

trích ly β-carotenoid từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp. bằng dầu thực vật. ” được

tiến hành và thu thập số liệu tại phòng thí nghiệm khoa Hóa học và Công nghệ thực

phẩm, trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu. Với mục đích là khảo sát các vấn đề sau:

Quá trình nuôi:

Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống: 10%,15%, 20% và thời gian nuôi 24 giờ, 36

giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 78 giờ, 84 giờ đến lượng tế bào của nấm men ở MT1, MT2,

MT3.

Kết quả cho lượng tế bào tốt nhất ở tỉ lệ giống 15%, thời gian nuôi 72 giờ với cả

MT1, MT2, MT3.

Quá trình trích ly:

Khảo sát quá trình trích ly bằng dung môi dầu nành và dầu hướng dương tinh luyện:

- Tỉ lệ dung môi: mẫu là: 9:1, 10:1, 11:1.

- Khảo sát Nhiệt độ là 70°C, 80°C, 90°C.

- Thời gian trích ly 90 phút, 120 phút 150 phút, 180 phút.

Kết quả thu hồi β-carotenoid tốt nhất ở cả 2 loại dung môi là tỉ lệ 10:1, nhiệt độ

80°C với thời gian là 120 phút.

Từ những yếu tố trên mục đích cuối cùng là nghiên cứu môi trường thích hợp để

nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp., nghiên cứu dung môi để trích ly β-carotenoid từ nấm

men Rhodotorula sp. đạt hiệu suất cao mà không ảnh hưởng đến tính chất của β-

carotenoid.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Giới hạn nhiệt độ của một số loài Rhodotorula sp. .......................................2

Bảng 1.2. Khả năng đồng hóa carbon của Rhodotorula sp ...........................................4

Bảng 1.3. Các nghiên cứu về khả năng tổng hợp carotenoid và βCR của nấm men

Rhodotorula sp. theo phương pháp nuôi cấy chìm ....................................................... 6

Bảng 1.4. Sắc tố carotenoid do Rho. glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau 120 giờ

trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau ............................................. 10

Bảng 3.1. Số lượng tế bào Rhodotorula sp. thu được ở các thời gian khác nhau của MT1

.................................................................................................................................. 21


.................................................................................................................................. 22


.................................................................................................................................. 23

Bảng 3.4. Lượng sinh khối nấm men Rhodotorula sp. trên các môi trường lỏng ........ 26

Bảng 3.5. Hàm lượng βCR thu được của dầu nành..................................................... 27

Bảng 3.6. Hàm lượng βCR thu được của dầu hướng dương ...................................... 27

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Sơ đồ

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nuôi cấy nấm men ở môi trường lỏng.............................................. 13

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ trích ly βCR .................................................................................... 17

Sơ đồ 4.1. Sơ đồ nuôi cấy chính của nấm men ở môi trường lỏng.............................. 32

Sơ đồ 4.2. Sơ đồ chính của quá trình trích ly βCR..................................................... 33

Biểu đồ

Biểu đồ 1. Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp. ở MT1................ 21



Biểu đồ 4. So sánh 3 đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp. ở cả 3 môi

trường đối với điều kiện tốt nhất ................................................................................ 25

Biểu đồ 5. Lượng sinh khối Rhodotorula sp. trên các môi trường lỏng ...................... 26

Biểu đồ 6. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: mẫu đến hiệu suất thu hồi

βCR bang dầu nành và dầu hướng dương .................................................................. 28

Biểu đồ 7.Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi

βCR của dung môi dầu đậu nành ............................................................................... 29

Biểu đồ 8. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi

βCR của dung môi dầu hướng dương......................................................................... 30

Hình

Hình 1.1. quá trình tổng hợp βCR, torulene và torularhodin từ acety CoA của

Rhodotorula sp ............................................................................................................ 5

Hình i.1. Máy lắc ngang

Hình i.2. Máy ly tâm

Hình i.3. Bể điều nhiệt

Hình i.4. Máy đo quang

Hỉnh i.5. Nuôi nấm men Rhodotorula sp. trong các môi trường lỏng

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

Hình i.6. Môi trường lỏng chứa nấm men sau thời gian nuôi 72 giờ

Hình i.7. Sinh khối sau khi ly tâm

Hình i.8. Sinh khối sau khi sấy

Hình i.9. : Mẫu dầu hướng dương chứa βCR sau khi trích ly

Hình i.10 : Mẫu dầu hướng dương chứa βCR sau khi trích ly

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

TàuDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU : đơn vị hình thành khuẩn lạc

DM : dung môi

Dầu HD : dầu hướng dương

Dầu ĐN : dầu đậu nành

NĐT : nhiệt độ thường

MT : môi trường

OD : mật độ quang

βCR : β-carotenoid

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

TàuTÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Phan Tú Anh (2003) – “Sinh tổng hợp sinh khối Rhodotorula giàu protein

– carotenoid” – Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài chương trình vườn ươm

sáng tạo khoa học kỹ thuật trẻ - Sở khoa học công nghệ .

[2]. Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự (1998) – “ Công nghệ enzyme”. NXB Nông

Nghiệp TP.HCM

[3]. Phạm Xuân Hưng (2003) – “Khảo sát các thành phần sinh hóa trong sinh

khối nấm men Rhodotorula sp., và thử nghiệm bổ sung bột dinh dưỡng trẻ em”-

Đại học khoa học Tự Nhiên.

[4]. Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự (2010). “Công nghệ chế biến thực phẩm”.

NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM.

[5]. Huỳnh Thị Nga (2011) – “Nghiên cứu quá trình chiết rút astaxanthin từ

phế liệu tôm bằng dầu thực vật” Đồ án tốt nghiệp – Trường Đại Học Bà Rịa -

Vũng Tàu.

[6]. Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2001) – “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả

năng tạo sinh khối từ rỉ đường của chủng nấm men phân lập trên bề mặt lá dăm

bụt tại Việt Nam” Luận văn Thạc Sỹ – Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM.

[7]. Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2011) – “Nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula

có khả năng sinh tổng hợp β-carotenoid trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ

sung cho gà đẻ trứng ” Luận văn Tiến Sỹ – Trường Đại Học Bách Khoa

TP.HCM.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu[8]. Hoàng Thị Thảo Nhi (2009) – “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

Carotenoid của nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 trên lõi bắp theo kỹ thuật

nuôi cấy bán rắn”. Luận văn tốt nghiệp - Đại học Tôn Đức Thắng.

[9]. Nguyễn Thị Việt Oanh (2008) – “Nghiên cứu nuôi cấy phối hợp nấm mốc

Monascus với nấm men Rhodotorula theo phương pháp lên men bề mặt”– Luận

văn tốt nghiệp - Đại học mở TP.HCM.

[10]. Lương Đức Phẩm (2006) – “ Nấm men công nghiệp” – Nhà xuất bản khoa

học và kỹ thuật.

[11]. Lê Ngọc Quang (2001) – “Nghiên cứu khả năng tạo sinh khối của nấm

men Rhodotorula sp.” – Luận văn tốt nghiệp - Đại Học Kỹ Thuật TP.HCM.

[12]. Giáo trình thực hành vi sinh vật học (2010), Trường Đại Học Bà Rịa –

Vũng Tàu, Khoa CN Thực phẩm.

[13]. Trương Vĩnh (2010) - “Lý thuyết và thực hành thống kê”, Vũng Tàu.

[14]. Kelly C.E. and Harmon A.W., 1972 : Fish. Bull, page 111-113.

[15]. Meyers. P. and Thibodeaux P., 1983 J Aquaricultule & Aquatic Sceinces,

III (4), page 64-70.

[16]. Yuan, J.P and Chen,” Purification of trans – astaxanthin from a high –

yielding astaxanthin ester product strain of the microalga Haematococcus

pluvilis”, J. Agric. Food, 2000, page 443-448.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

PHỤ LỤC 1

1. Các môi trường lỏng nghiên cứu: [3]

Nấm men Rhodotorula sp. được nhân giống trong 3 môi trường lỏng

Môi trường 1:

Saccharose 30g

Cao nấm men 1g

Urea 0,1g

(NH4)2SO4 0,5g

KH2PO4 2g

MgSO4.7H2O 0,2g

MnSO4 0,02g

CuSO4.5H2O 0,01g

- Thêm nước dừa cho đủ 1 lít, chỉnh pH 5,0.

- Thêm vài giọt dầu chống bọt.

- Hấp khử trùng ở 121°C trong 20-30 phút.

Môi trường 2:

Glucose 45g

Cao nấm men 1,5g

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

NH4NO3 0,286g

KH2PO4 0,75g

MgSO4 0,4g

CaCl2 0,4g

- Thêm nước dừa cho đủ một lít, chỉnh pH 5,0.


Môi trường 3:

Saccharose 30g

Cao nấm men 1g

Urea 0,1g

(NH4)2SO4 0,5g

KH2PO4 2,0g

MgSO4.7H2O 0,1g

MnSO4 0.02g

CuSO4.5H2O 0,01g

CH3COOH 0,4g

- Thêm nước dừa cho đủ 1 lít, chỉnh pH 5,0.


Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

Các môi trường sẽ được tiến hành trong phòng thí nghiệm phải đảm bảo điều

kiện thuận lợi và tránh sự lây nhiễm từ bên ngoài. Để làm được điều đó thì trước khi

nuôi cấy cần khử trùng dụng cụ và hấp khử trùng môi trường.

2. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu: [12]

2.1. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:

Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm

phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 400 hình vuông nhỏ có diện tích tổng cộng là 1mm2.

Ô trung tâm được khoanh tròn và có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông

nhỏ. Vì thế diện tích 1 ô vuông nhỏ là 1/400 mm2 và một ô vuông lớn là 1/25 mm2.

2.2. Cách tiến hành:

Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên bề mặt buồng đếm kề với cạnh lame

nhờ một pipep Pasteur. Dịch huyền phù sẽ đi thẳng vào buồng đếm nhờ cơ chế mao

dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lame và

buồng đếm được điền bởi dịch huyền phù tế bào. Còn các rãnh xung quanh thì không bị

dính ướt.

Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó dịch

nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1mm.

Đặc buồng đếm lên bàn kính hiển vi.

Điều chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ.

Tùy thuộc vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô

trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số các ô vuông lớn đại diện.

Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt từ 3-5 phút, phải đếm các tế bào nằm trên đường

kẻ nhưng không được lặp lại khi chuyển qua đếm tế bào trên một ô kế cận.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

2.2.3. Cách tính:

Thể tích dịch chứa trong ô trung tâm (gồm 25 ô vuông lớn hay 400 ô vuông nhỏ) là

1x0,1 = 0,1 mm2 (vì diện tích tổng cộng của ô trung tâm là 1mm2).

Tuy nhiên, chỉ cần đếm số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện (các ô có đánh dấu X

chẳng hạn) cho 25 ô vuông lớn trên ô trung tâm. Khi đó, số lượng tế bào trong 1ml mẫu

nghiên cứu được tính bằng công thức sau:

N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10n

Trong đó:

- N: số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu (CFU/ml)

- a: số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ)

- b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16 x 5 = 80 ô vuông nhỏ)

- 400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm

- 0,1: thể tích dịch tế bào

- 103: số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml)

- 10n: độ pha loãng mẫu

3. Phương pháp xác định hàm lượng β-carotene: [5 ,14, 15, 16]

Cân chính xác 1g sinh khối nấm men Rhodotorula sp. sau khi đã sấy khô (độ ẩm

5,998%) vào erlen 250ml, cho dầu vào theo tỉ lệ thí nghiệm 3. Hỗn hợp trên được cho

vào bể điều nhiệt ở thời gian và nhiệt độ yêu cầu thí nghiêm 4 (lưu ý: là bể điều nhiệt

đã được đưa đến nhiệt độ như yêu cầu rồi). Sau khi trích ly ta tiến hành ly tâm ở 3000

vòng/phút để lấy được dịch trích không bị cặn. Xác định thể tích dung dịch dầu chứa

βCR, hút 3ml đem đi đo quang (tùy thuộc mức độ đậm đặc của dịch trích mà pha loãng

cho phù hợp). Dung dịch sau khi pha loãng được đem đi đo độ hấp thụ màu trên máy đo

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

quang phổ ở bước sóng 487nm (cuvet thạch anh 1cm) để xác định hàm lượng βCR

(dung dịch so sánh là 2 loại dung môi tương ứng: dầu đậu nành và dầu hướng dương).

Hàm lượng βCR được tính theo công thức của Chen và Meyer:

Y =

Trong đó:

Y là hàm lượng βCR thu được (μg/g)

A là độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 487nm

D là hệ số pha loãng

V là thể tích dung dịch dầu chứa βCR thu được

W là khối lượng mẫu ban đầu đem đi chiết

E là hệ số tắt quang của các loại dầu ở bước sóng 487nm

+ Dung môi dầu đậu nành ở bước sóng 487nm là 2145

+ Dung môi dầu hướng dương ở bước song 487nm là 2290

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

PHỤ LỤC 2

Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm:

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

Hình i.1:Máy lắc ngang Hình i.2: Máy ly tâm

Hình i.3: Bể điều nhiệt Hình i.4: Máy đo quang

Thành phẩm:

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

Hình i.5: Nuôi nấm men Rhodotorula sp. Hình i.6: Môi trường lỏng chứa nấm men

trong môi trường lỏng sau thời gian nuôi 72h

Hình i.7: Sinh khối sau khi ly tâm Hình i.8: Sinh khối sau khi sấy

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

Hình i.9: Mẫu dầu hướng dương chứa Hình i.10 : Mẫu dầu hướng dương chứa

βCR sau khi trích ly βCR sau khi trích ly

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu

Đề tài nghiên cứu khoa học Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 1 Khoa Hóa học – Công Nghệ thực phẩm

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nấm men Rhodotorula sp.: [3, 6, 7]

1.1.1. Phân loại :

Theo Harrison, nấm men Rhodotorula sp. có phân loại như sau:

Giới Fungi

Ngành Basidiomycota

Lớp Urediniomycetes

Bộ Sporidiales

Họ Sporidiobolaceae

Giống Rhodotorula

1.1.2. Đặc điểm hình thái:

Tế bào nấm men Rhodotorula sp. có nhiều hình dạng khác nhau tùy loài và tùy

điều kiện nuôi cấy. Dạng thường gặp là dạng tròn, dạng trứng, elip, hình dài hoặc hình

gậy.

Khuẩn lạc phát triển nhanh, láng, mềm, nhẵn bóng có ánh kim hay không ánh kim,

đôi khi xù xì, ướt và nhầy nhớt. Chúng có màu kem tới hồng, đỏ tươi, cam hoặc vàng.

Mép khuẩn lạc không có răng cưa.

Thành tế bào nấm men có nhiều lớp. Theo Marquardt (1962), thành tế bào nấm

men Rhodotorula sp. có 3 lớp. Lớp trong cùng và ngoài cùng mỏng lớp giữa dày 130-

1000 A°. Thành tế bào cấu tạo từ các polysaccharide bền với sự thủy phân bởi dung dịch

KOH.

Kích thước tế bào Rhodotorula sp. dao động trong khoảng 2-5 μm chiều rộng và

khoảng 5-10μm chiều dài. Kích thước này cũng thay đổi ở các loài khác nhau, ở các giai

đoạn khác nhau và cả ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau.

1.1.3. Đặc điểm sinh lý:

Quá trình sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp. chịu ảnh hưởng của rất nhiều

yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitrogen, pH, nhiệt độ, hàm lượng oxy, khoáng....

Các yếu tố vật lý:

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Đối với phương pháp lên men chìm thì nhiệt độ là yếu tố cần chú ý nhất vì hầu hết

nấm men đều rất mẫn cảm với nhiệt độ. Ngoài ra nhiệt độ cao còn làm vô hoạt rRNA và

phá hủy tế bào. Với nấm men Rhodotorula sp. thì nhiệt độ nuôi cấy phải từ 4-35°C

bảng1.1.

Bảng 1.1. Giới hạn nhiệt độ của một số loài Rhodotorula sp.[3]

STT Loài tmax(°C) Tmin(°C) Top(°C)

1 R.glutinis

Giống 59

Giống 60

29

33

31

7

11

9

26

33

29

2 R.graminis1410 29 4 28

3 R.minuta

Giống 62

Giống 539

33

30

17

18

28

28

4 R.mucilaginosa

Giống 63

Giống 65

Giống 75

34

34

34

10

7

10

34

32

32

5 R.pilimanae 32 8 32

Ngoài ra các yếu tố khác cũng ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình sinh trưởng và

phát triển của nấm men Rhodotorula sp. như độ ẩm, áp lực, sức căng bề mặt, tia bức xạ,

ánh sáng mặt trời…

Các yếu tố hóa học:

Các yếu tố hóa học bao gồm pH môi trường, thế oxy hóa khử, các hợp chất diệt

khuẩn,… trong đó pH được quan tâm nhiều nhất. Nấm men Rhodotorula sp. phát triển tốt

nhất trong khoảng pH 3,5-6,0.

Nguồn cacbon (C) đóng vai trò quan trọng trong việc tạo năng lượng cho tế bào

đồng thời còn cung cấp hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp các chất xây dựng tế

bào. Nồng độ C quá cao cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Các chất khoáng: nấm men rất cần các chất khoáng vì chất khoáng tham gia xúc

tác cho các phản ứng sinh học xảy ra trong tế bào. Ngoài nguồn phospho, nấm men còn

cần các loại khoáng như Mg2+

, Mn2+

, Na+,….

Vitamin: một số loài vi sinh vật cần được bổ sung các vitamin, cung cấp coenzyme

cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào. Thường vitamin được đưa vào môi trường nuôi

cấy dưới dạng cao nấm men hoặc nấm men tự phân. Do đó, nếu ta chọn cao nấm men là

nguồn N thì không cần bổ sung các vitamin.

1.1.4. Đặc điểm sinh hóa:[3,11]

Nấm men Rhodotorula sp. có một số đặc tính sinh hóa như sau:

- Không lên men các loại đường như: D-galactose, mantose, α-trehalose và nhiều

loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon

cho việc xây dựng tế bào.

- Tạo ra enzyme urease.

- Đồng hóa DBB (Diazonium Blue B).

- Không tạo thành hợp chất loại tinh bột.

- Không tạo ra acid acetic.

- Không đồng hóa được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula

sp. khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida.

- Khả năng sinh tổng hợp sắc tố β-carotenoid.

- Có khả năng tích lũy lipid từ 40-80% sinh khối khô.

Giống nấm men Rhodotorula sp. còn được gọi là vi sinh vật sắc tố carotenoid

(carotengensis). Các sắc tố carotenoid chính trong nấm men Rhodotorula sp. là: β-

carotene, torulahodin và torulene. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh

tổng hợp sắc tố carotenoid trên từ nhiều các nguồn cơ chất khác nhau với các phương

pháp nuôi cấy khác nhau như: nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch thể, lên men

bán rắn,…..chỉ từ giống Rhodotorula sp. hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật

khác như: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn.

Khả năng đồng hóa các hợp chất carbon của Rhodotorula sp. được trình bày trong

bảng 1.2

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Bảng 1.2. Khả năng đồng hóa carbon của Rhodotorula sp.

STT Loại hợp chất carbon Khả năng đồng hóa

1 Inositol -

2 Galactose +

3 Xylose +

4 Arabinose +

5 Rhamnose +

6 Saccharose +

7 Salicin +

8 Tinh bột +

9 maltose +

10 Lactose -

11 Rafinnose +

12 Methanol -

13 Ethanol +

1.1.5. Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula sp.:[6,7]

Khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý quan trọng dùng để

phân loại giống Rhodotorula sp.. Carotenoid hình thành được kết hợp với màng tế bào và

chỉ tồn tại bên trong tế bào. Các sắc tố carotenoid ở Rhodotorula sp. có khả năng hấp thu

ánh sáng ở bước sóng rộng từ 450÷550 nm. Cường độ màu của nấm men sinh sắc tố tăng

lên rất nhiều so với giống men trắng khi chúng sống ở các vùng địa lý có tia cực tím

mạnh. Tuy nhiên, khi cường độ phóng xạ quá cao, các carotenoid không còn khả năng che

chở tế bào.

Perrier V. và cộng sự (1995) khi khảo sát thành phần các sắc tố có trong 13 chủng

Rhodotorula sp. đã tìm thấy từ 1 đến 10 sắc tố thuộc nhóm carotenoid. Kết quả của

nghiên cứu này cho thấy sắc tố β-carotene luôn hiện diện trong các chủng Rhodotorula sp.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



khảo sát và tác giả cũng đưa ra đã kết luận rằng β-carotene là sắc tố chính của

Rhodotorula sp.

Trên cơ sở thành quả nghiên cứu của Simpson và Goodwin, Frengova G.I. và

Beshkova D.M. (2009) đã khái quát được toàn bộ con đường sinh tổng hợp carotenoid ở

một số giống nấm men trong đó có giống Rhodotorula sp. đi từ acetyl-CoA. Theo đề nghị

này, toàn bộ quá trình sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men Rhodotorula sp.diễn ra theo 3

giai đoạn như hình 1.1. Đây là giai đoạn tổng hợp carotenoid từ phytoene, phytoene được

chuyển thành lycopene. Lycopene được xem là tiền chất để tổng hợp nên -carotene và

torulene, sau đó torulene sẽ tham gia quá trình khử và oxi hoá nhờ sự xúc tác của enzyme

oxidase để hình thành nên torularhodin.

Hình 1.1. Quá trình tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin từ acetyl CoA của Rhodoturula

sp.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Frengova%20GI%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Beshkova%20DM%22%5BAuthor%5D

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Bảng 1.3. Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và βCR của nấm men

Rhodotorula sp. theo phương pháp nuôi cấy chìm [7]

STT Tên nấm men Carotenoid

tổng

β-carotenoid Tài liệu tham

khảo

mg/l mg/g % carotenoid

1 Rho. glutinis

var glutinis 7,37 0,63 100

Costa và cộng

sự, 1987

2 Rho. lactose

28 2,66 - Martelli và cộng

sự, 1992

3 Rho. rubra

6,03 1,26 - Martin và cộng

sự, 1993

4 Rho. aurantiaca CBS

317 - 0,10 60

Perrier và cộng

sự, 1995

5 Rho. glutinis 22.P

8,4 0,27 16 Frengova và

cộng sự, 1994

6 Rho. rubra NRRL. Y

15596 1,91 0,13 -

Shih và Hang,

1996

7 Rho. gracilis ATCC

90950 - 0,54

Govindaswamy

và cộng sự, 1999

8

Rho. glutinis

DBVPG 3853 4,99 0,83 16

Buzzini và cộng

sự, 2000 (trên

môi trường

CGM ở 25oC)

9

Rho. glutinis

DBVPG 3853 6,9 - 12

Buzzini và cộng

sự, 2001 (nuôi

gián đoạn)

10 Rho. glutinis

DBVPG 3853 8,2 - 14

Buzzini và cộng

sự, 2001

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



(nuôi bán liên

tục)

11 Rho. rubra GED2

12,1 - 46,6 Frengova và

cộng sự, 2003

12 Rho. rubra GED5

19,2 - 31,67 Frengova và

cộng sự, 2004

13 Rho. glutinis K 50T

- - 35 Bong K. Kim và

cộng sự, 2004

14 Rho. rubra GED 8

13,37 0,498 51,1 Frengova và

cộng sự, 2006

1.2. Đặc tính carotenoid: [4,7]

Carotenoid có thể kết tinh ở dạng tinh thể. Tinh thể carotenoid có hình dạng, kích

thước khác nhau như hình kim dài, hình khối lăng trụ đa diện, dạng lá hình thoi, hay dạng

kết tinh vô định hình…. Nhiệt độ nóng chảy cao 130-220°C.

Độ hòa tan tùy thuộc vào loại dung môi. Chúng không tan trong nước, tan trong

dầu thực vật, tan trong các dung môi chứa Chlor như chloroform, dichlormethan…. Hầu

như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo ngoại trừ: bixin tan trong nước nhờ có nhóm

carboxyl, astaxanthin tan trong nước nhờ nhóm ketoenol, crocine thì được ester hóa bởi

các chất đường.

Ổn định trong môi trường kiềm nhạy cảm trong môi trường acid.

Ngày nay, số lượng carotenoid tìm thấy trong thiên nhiên lên đến 700 loại với

những màu sắc khác nhau như kem, vàng, đỏ. Carotenoid được tổng hợp từ các tiền chất

isoprenoid (C5), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Sau đó,

chuỗi phân tử 20 nguyên tử carbon này liên kết đuôi – đuôi để tạo thành chuỗi C40. Do

đó các carotenoid còn được gọi là tetraterpenoid.

Do có hệ thống nối đôi liên hợp, carotenoid rất dễ bị oxi hóa, hydro hóa làm màu

sắc thay đổi. Carotenoid tinh khiết rất bền khi ở dạng huyền phù hoặc dung dịch với dầu

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



thực vật, đặc biệt khi trong dung dịch có sự hiện diện của α-tocoferol. Phản ứng tạo

peroxyd của chất béo cũng làm tăng cường phản ứng phân hủy carotenoid.

Ngoài ra, màu của carotenoid còn bị thay đổi bởi các tác nhân khác như: không

khí, nhiệt độ, ion kim loại, ánh sáng, tác dụng của enzyme…. Vì vậy, carotenoid cần bảo

quản trong khí trơ hoặc trong chân không ở nhiệt độ thấp, bao bì nên kín đồng thời tránh

ánh sáng.

1.3. Các lý thuyết cơ bản: [5,9]

1.3.1. Trích ly:

Trích ly là quá trình hòa tan chọn lọc một hay nhiều cấu tử có trong mẫu nguyên

liệu bằng cách cho nguyên liệu tiếp xúc với dung môi. Động lực của quá trình trích ly là

sự chênh lệch nồng độ của cấu tử ở trong dung môi. Đây là quá trình truyền khối.

Quá trình trích ly β-carotenoid từ nấm men Rhodotorula sp.sẽ được sử dụng dung

môi là dầu thực vật không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của β-carotenoid sau trích ly.

1.3.1.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly:

Kích thước của nguyên liệu:

Kích thước nguyên liệu càng nhỏ thì diện tích bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và

dung môi sẽ càng lớn. Do đó việc trích ly các cấu tử từ nguyên liệu vào dung môi sẽ trở

nên dễ dàng hơn. Tuy nhiên, nếu kích thước nguyên liệu quá nhỏ thì chi phí cho quá trình

nghiền xé nguyên liệu sẽ gia tăng.

Tỉ lệ khối lượng giữa nguyên liệu và dung môi:

Với cùng một lượng nguyên liệu, nếu ta tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất

trích ly sẽ tăng cao. Đó là do sự chênh lệch nồng độ của cấu tử cần trích ly trong nguyên

liệu và trong dung môi sẽ càng tăng. Tuy nhiên, nếu lượng dung môi sử dụng quá lớn thì

sẽ làm loãng dịch trích. Như vậy, ta cần xác định tỉ lệ phù hợp giữa khối lượng nguyên

liệu và dung môi.

Nhiệt độ trích ly:

Khi tăng nhiệt độ, các cấu tử sẽ chuyển động nhanh hơn, do đó sự hòa tan và

khuyếch tán của cấu tử từ nguyên liệu vào dung môi sẽ được tăng cường. Ngoài ra, khi

nhiệt độ tăng, độ nhớt của dung môi sẽ giảm, dung môi sẽ dễ dàng xuyên qua lớp nguyên

liệu và làm cho diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi sẽ tăng lớn. Tuy

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



nhiên, việc tăng nhiệt độ trích ly sẽ làm tăng chi phí năng lượng cho quá trình, đồng thời

có thể xảy ra một số phản ứng hóa học không mong muốn trong dịch trích.

Thời gian trích ly:

Khi tăng thời gian trích ly thì hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ gia tăng. Tuy nhiên,

nếu thời gian trích ly quá dài thì hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ không tăng thêm đáng kể.

1.3.1.2. Điều kiện chọn dung môi:

Dung môi sử dụng phải thỏa mãn các điều kiện sau:

- Phải có tính hòa tan chọn lọc tức là hòa tan tốt trong chất cần tách mà không hòa

tan hoặc hòa tan rất ít trong các chất khác. Đây là tính chất cơ bản không thể thiếu của

dung môi.

- Không có tác dụng hóa học với các cấu tử của dung dịch.

- Không phá hủy thiết bị.

- Không biến đổi thành phần khi bảo quản.

- Không độc hại khi thao tác, không tạo hỗn hợp nổ với không khí và khó cháy.

- Rẻ tiền, dễ kiếm có thể sử dụng ở quy mô công nghiệp.

- Dung môi phải được tách ra sau quá trình chiết bằng phương pháp chưng cất hoặc

sấy, sau khi tách không để lại mùi và gây độc cho sản phẩm.

Hiện tại chưa có dung môi nào thỏa mãn tất cả các yêu cầu trên tùy theo điều kiện

mà ta chọn dung môi thích hợp.

1.3.2. Sấy:

Bản chất: là quá trình sử dụng nhiệt độ để tách nước ra khỏi mẫu nguyên liệu.

Trong quá trình sấy, nước được tách ra khỏi nguyên liệu theo nguyên tắc bốc hơi

(evaporation) hoặc thăng hoa (sublimation). Trong quá trình sấy, mẫu nguyên liệu thường

ở dạng rắn, tuy nhiên mẫu nguyên liệu cần sấy cũng có thể ở dạng lỏng hoặc huyền phù.

Sản phẩm thu được sau quá trình sấy luôn ở dạng rắn hoặc dạng bột.

1.3.3. Ly tâm:

Bản chất: là quá trình sử dụng lực ly tâm để phân riêng các cấu tử có khối lượng

riêng khác nhau, thường là tách pha rắn ra khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm.

Sau quá trình ly tâm ta thu được hai pha là pha lỏng (có thể là dung môi hoặc dung

dịch) và pha rắn là các tinh thể được tách ra.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Sau quá trình ly tâm hỗn hợp được tách riêng biệt chủ yếu thay đổi trạng thái,

không biến đổi hóa học, hóa lý và hóa sinh đáng kể tuy nhiên chất lượng sản phẩm sau

quá trình ly tâm được tăng lên do tách được tạp chất hòa tan không phải dạng tinh thể.

1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp.: [2,7]

1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn giống:

Trong công nghệ lên men, chủng giống vi sinh vật là vấn đề rất quan trọng. Đặc

biệt với nấm men Rhodotorula sp. là giống có khả năng sinh tổng hợp carotenoid không

giống nhau giữa các chủng giống (xem bảng 1.3). Khả năng này phụ thuộc rất nhiều vào

đặc tính di truyền của chủng giống dùng trong nghiên cứu.

Ngoài đặc tính di truyền của chủng giống, quá trình nuôi cấy vi sinh vật còn phụ

thuộc nhiều vào các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy.

1.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy:

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nấm men Rhodotorula sp. thường phát triển ở nhiệt độ 25 ÷ 30oC và khoảng nhiệt

độ thích hợp là 27 ÷ 28oC. Ở nhiệt độ 30

oC, nếu có chiếu sáng vào cuối giai đoạn tăng

trưởng của pha log sẽ làm tăng lượng β-carotenoid đồng thời giảm lượng torulene và

torularhodin. Khi hạ nhiệt độ từ 30oC xuống 25

oC hàm lượng βCR thu được tăng cao. Ở

nhiệt độ 40oC, nấm men Rhodotorula sp. hầu như không phát triển. Sau đây là một kết

quả minh hoạ:

Bảng 1.4. Sắc tố carotenoid do Rho. glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau 120 giờ trên môi

trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau [7]

Nhiệt

độ

(oC)

Carotenoid tổng

(mg/l )

Carotenoid tổng

(g/g tế bào khô)

Các sắc tố carotenoid

(% carotenoid tổng)

-

carotene

Torulene Torularhodin

25 4,99 831,7 16,0 18,0 60,1

30 5,95 915,4 9,3 9,4 78,9

35 5,08 736,2 5,9 9,8 78,7

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



- Ảnh hưởng của pH

Giống như các vi sinh vật khác pH thích hợp cho sự phát triển của nấm men

Rhodotorula sp. khác nhau tùy từng loài, chủng. Giá trị pH thích hợp cho Rhodotorula sp.

thông thường ở khoảng pH hơi acid từ pH 5 đến 6. Tuy nhiên, giá trị pH này còn phụ

thuộc vào thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy.

- Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng hình thành β-carotenoid cũng như

thành phần β-carotenoid của nấm men. Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố β-

carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối

thiểu 12 giờ), giai đoạn tổng hợp các enzyme (giai đoạn này xảy ra trong tối) và giai đoạn

tổng hợp β-carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng.

- Ảnh hưởng của oxi

Quá trình tổng hợp β-carotenoid rất cần đến sự tạo thành của các hợp chất có tính

oxi hóa cao do đó rất cần oxi. Không khí đóng vai trò rất quan trọng, có liên quan đến sự

hình thành sắc tố ở nấm men và các vi sinh vật khác. Không khí còn có vai trò trong việc

phân chia thành từng vùng của sắc tố trong quá trình sinh tổng hợp β-carotenoid của tế

bào sinh vật. Như vậy, quá trình sinh trưởng của Rhodotorula sp. rất cần đến không khí,

vì ngoài việc cung cấp oxi giúp tế bào hô hấp nó còn giữ vai trò quan trọng trong quá

trình sinh tổng hợp β-carotenoid của nấm men.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu:

2.1.1. Đối tượng:

- Giống nấm men nghiên cứu: nấm men Rhodotorula sp..

- Nguồn giống từ giống chuẩn phòng thí nghiệm vi sinh của Khoa Hóa & CNTP của

trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu. Sau đó, được chúng tôi nuôi cấy trên đĩa petri và ống

nghiệm, cấy giữ giống định kì 2 tuần/lần.

2.1.2. Dụng cụ và hóa chất:

Dụng cụ:

- Đĩa petri, ống nghiệm

- Tủ cấy

- Máy lắc ngang

- Nồi hấp

- Máy đo pH

- Máy ly tâm

- Tủ sấy

- Bể ổn nhiệt

- Máy đo quang phổ

Hóa chất:

- Các hóa chất sử dụng trong 3 môi trường nuôi cấy nấm men mua tại cửa hàng hóa

chất và thiết bị PTN Hóa Nam.

- Dừa được mua tại vựa dừa ở chợ Vũng Tàu.

- Dung môi dầu hướng dương và dung môi dầu nành mua tại siêu thị Co.opmart.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



2.2. Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1. Sơ đồ nuôi cấy nấm men ở môi trường lỏng:

Nấm men Rhodotorula sp. Môi trường

Tăng sinh Hấp

Cấy giống

D1 D2 D3

T1,2,3,4,5,6,7 T1,2,3,4,5,6,7 T1,2,3,4,5,6,7

Sục khí

Ly tâm 3000 vòng/phút (15÷20 phút)

Thu sinh khối nấm men Rhodotorula sp.

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nuôi cấy nấm men ở môi trường lỏng

2.2.2. Thuyết minh quy trình:

2.2.2.1. Nấm men Rhodotorula sp.:

Nguồn giống sử dụng phải là loại nấm men Rhodotorula sp. thuần, đã được cấy giữ

giống sau một 2 tháng.

Giống phải được bảo quản ở điều kiện thích hợp như tủ cấy hoặc bảo quản mát để

đảm bảo không ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



2.2.2.2. Tăng sinh:

Giống được tăng sinh trong môi trường lỏng trên máy lắc 120 vòng/phút, nhiệt độ

30±2°C trong 24 giờ.

Trong thời gian tăng sinh cũng cần sục khí liên tục.

2.2.2.3. Chuẩn bị môi trường:

Môi trường phải đảm bảo dưỡng chất để cho nấm men có thể phát triển được tốt

nhất.

2.2.2.4. Hấp:

Hấp để tạo môi trường có tính đồng nhất và có thể tiêu diệt được những vi sinh vật

tồn tại trong môi trường gây ảnh hưởng xấu đến quá trình nuôi cấy nấm men sau này.

Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C và khoảng thời gian là 20-30 phút.

2.2.2.5. Cấy giống:

Giống sau khi hoạt hóa thì được hút vào môi trường đã được chuẩn bị trước.

Lưu ý: quá trình cấy giống được tiến hành nhanh và trong phòng cấy nhằm hạn chế

sự lây nhiễm.

2.2.2.6. Sục khí:

Sục khí nhằm cung cấp một lượng O2 cần thiết cho quá trình hô hấp của nấm men.

Phải khử trùng các vòi sục khí bằng cồn, lắp các vòi sục khí vào các erlen có chứa

500ml môi trường lỏng, điều chỉnh tốc độ sục khí cho đều nhau ở các bình. Sục khí liên

tục trong thời gian nuôi.

2.2.2.7. Ly tâm:

Sau khi nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp., đạt hiệu suất cao nhất thì tất cả canh

trường lỏng được đem đi ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong khoảng 15-20 phút.

Quá trình ly tâm nhằm giúp cho việc tách sinh khối nấm men Rhodotorula sp. ra

khỏi môi trường còn thừa và để thu sinh khối dễ dàng hơn.

2.2.2.8. Thu sinh khối nấm men Rhodotorula sp.:

Sau quá trình này ta sẽ thu được một lượng đáng kể sinh khối nấm men

Rhodotorula sp. Thu sinh khối dạng sệt. Và cần bảo quản ở điều kiện vô trùng tránh bị

nhiễm (có thể bảo quản lạnh).

2.3. Nội dung thí nghiệm:

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



2.3.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến số lượng

tế bào của nấm men ở MT1.

Mục đích: nhằm xác định tỉ lệ giống cần thiết để tiến hành cấy và thời gian nuôi cụ

thể để thu được lượng sinh khối cao.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với sự thay đổi của

hai nhân tố D và T của nấm men Rhodotorula sp. và 3 lần lập lại. [4]

Với D: tỉ lệ cấy giống ở 3 mức độ khác nhau (%).

D1 = 10%, D2 = 15%, D3 = 20%.

Với T: thời gian nuôi cấy ở 7 mức độ khác nhau (giờ).

T1 = 24 giờ, T2 = 36 giờ, T3 = 48 giờ, T4 = 60 giờ,

T5 = 72 giờ, T6 = 78 giờ, T7 = 84 giờ.

Số đơn vị thí nghiệm: 3 × 3 × 7 = 63

Cách tiến hành: sau khi tăng sinh và chuẩn bị xong môi trường thì tiến hành cấy

giống. Giai đoạn cấy giống được tiến hành trong tủ cấy của phòng thí nghiệm vi sinh để

tránh sự lây nhiễm. Giống sẽ được hút theo từng tỉ lệ ở trên và cho vào môi trường lỏng

đã chuẩn bị. Sau đó, khi nuôi được 24 giờ thì tiến hành đếm và cứ cách 12 giờ đếm lại

một lần bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu.

Ghi nhận kết quả:

Ghi nhận kết quả và tính lượng nấm men được tạo thành bằng phương pháp đếm

trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (phần 2 phụ lục 1).




thể để thu được lượng sinh khối cao.



Với D’: tỉ lệ cấy giống ở 3 mức độ khác nhau (%).

D’1 = 10%, D’2 = 15%, D’3 = 20%.

Với T’: thời gian nuôi cấy ở 7 mức độ khác nhau (giờ).

T’1 = 24 giờ, T’2 = 36 giờ, T’3 = 48 giờ, T’4 = 60 giờ,

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



T’5 = 72 giờ, T’6 = 78 giờ, T’7 = 84 giờ.









trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (phần 2 phụ lục 1).




thể để thu được lượng sinh khồi cao.



Với D”: tỉ lệ cấy giống ở 3 mức độ khác nhau (%).

D”1 = 10%, D”2 = 15%, D”3 = 20%.

Với T”: thời gian nuôi cấy ở 7 mức độ khác nhau (giờ).

T”1 = 24 giờ, T”2 = 36 giờ, T”3 = 48 giờ, T”4 = 60 giờ,

T”5 = 72 giờ, T”6 = 78 giờ, T”7 = 84 giờ.









trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu(phần 2 phụ lục 1) .

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



2.3.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát lượng sinh khối thu được của nấm men Rhodotoru sp.

ở cả 3 môi trường.

Mục đích: nhằm xác định lượng sinh khối thu được của cả 3 môi trường để biết

được môi trường nào cho sinh khối cao nhất trong 3 môi trường.


một nhân tố A của nấm men Rhodotorula sp. và 3 lần lập lại. [4]

Với A: môi trường nuôi nấm men Rhodotorula sp.

A1 = MT1, A2 = MT2, A3 = MT3.

Số đơn vị thí nghiệm: 3 ×3 = 9

Cách tiến hành: sau khi đã xác định được tỉ lệ giống 15% và thời gian nuôi 72 giờ,

ta sẽ tiến hành nuôi ở 3 môi trường xem môi trường nào cho sinh khối nhiều nhất và chọn

ra môi trường cho sinh khối cao nhất tiến hành nuôi chính thức để thu sinh khối.

2.4. Sơ đồ trích ly β-carotenoid.

Nguyên liệu

Sấy

Trích ly

K1 K2 K3

M1,2,3 M1,2,3 M1,2,3

N1,2,3,4 N1,2,3,4 N1,2,3,4

Dịch trích

Ly tâm

β-carotenoid trong dầu

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ trích ly β-carotenoid

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



2.5. Thuyết minh quy trình.

2.5.1. Nguyên liệu:

Nguyên liệu lúc này là lượng sinh khối nấm men Rhodotorula sp. sau khi nuôi và

ly tâm.

Nguyên liệu phải được bảo quản ở môi trường tiệt trùng để tránh những vi sinh vật

gây hại phát triển làm giảm chất lượng của carotenoid khi trích ly.

2.5.2. Sấy:

Mục đích của sấy là giúp cho việc trích ly được dễ dàng hơn.

Carotenoid được bảo quản tốt trong cấu trúc và được cố định hàm lượng.

2.5.3. Trích ly:

Mục đích của việc trích ly là tách β-carotenoid ra khỏi sinh khối nấm men

Rhodotorula sp..

Trong giai đoạn này ta sử dụng dung môi là dầu thực vật để giúp cho quá trình tách

chiết được dễ dàng hơn mà không làm mất đi hoạt tính ban đầu của βCR.

2.5.4. Dịch trích:

Sau quá trình trích ly ta sẽ thu được một lượng β-carotenoid tan trong dầu.

Dịch trích lúc này sẽ có màu đỏ cam đậm và dung dịch sệt hơn so với dầu trước

trích ly.

2.5.5. Ly tâm:

Mẫu sau khi trích ly được đem đi ly tâm để tách lượng sinh khối còn sót lại sau khi

trích ly dễ làm ảnh hưởng đến chất lượng và hàm lượng βCR trong dầu.

2.6. Nội dung thí nghiệm:

2.6.1. Thí nghiệm 5. Khảo sát tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng

đến quá trình trích ly của dung môi dầu nành tinh luyện.

- Mục đích: tìm ra tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian trích ly để đạt hiệu suất

thu hồi cao.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba nhân tố, 3

lần lập lại và được khảo sát ở mức độ như sau. [4]

Với K: là tỉ lệ dung môi: mẫu.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



K1 = 9:1, K2 = 10:1, K3 = 11:1.

Với M: nhiệt độ trích ly ở 3 mức độ khác nhau (°C).

M1 = 70°C, M2 = 80°C, M3 = 90°C.

Với N: thời gian trích ly ở 4 mức độ khác nhau (phút).

N1 = 90 phút, N2 = 120 phút, N3 = 150 phút, N4 = 180 phút .

Số đơn vị thí nghiệm: 4×3 ×3 × 3 = 108

Cách tiến hành:

Ta tiến hành làm từng thí nghiệm một ở các tỉ lệ của dung môi: mẫu, các khoảng

nhiệt độ và các khoảng thời gian như đang khảo sát.

Dung dịch sau khi trích ly sẽ được tiến hành đo OD.

Và được tính theo công thức của phương pháp đo quang để có được kết quả sau

cùng (phần 3 phụ lục 1).

Lưu ý: ta tiến hành trích ly ở bể điều nhiệt.


2.6.2. Thí nghiệm 6. Khảo sát tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng

đến quá trình trích ly của dung môi dầu hướng dương tinh luyện.

- Mục đích: tìm ra tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian trích ly để đạt hiệu suất

thu hồi cao.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba nhân tố, 3

lần lập lại và được khảo sát ở mức độ như sau. [4]

Với K: là tỉ lệ dung môi: mẫu.

K’1 = 9:1, K’2 = 10:1, K’3 = 11:1.

Với M: nhiệt độ trích ly ở 3 mức độ khác nhau (°C).

M’1 = 70°C, M’2 = 80°C, M’3 = 90°C.

Với N: thời gian trích ly ở 4 mức độ khác nhau (phút).

N’1 = 90 phút, N’2 = 120 phút, N’3 = 150 phút, N’4 = 180 phút .

Số đơn vị thí nghiệm: 4×3 ×3 × 3 = 108

Cách tiến hành:

Ta tiến hành làm từng thí nghiệm một ở các tỉ lệ của dung môi: mẫu, các khoảng

nhiệt độ và các khoảng thời gian như đang khảo sát.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Dung dịch sau khi trích ly sẽ được tiến hành đo OD.

Và được tính theo công thức của phương pháp đo quang để có được kết quả sau

cùng (phần 3 phụ lục 1).

Lưu ý: ta tiến hành trích ly ở bể điều nhiệt.


Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến lượng tế bào của nấm men ở MT1.

Bảng 3.1. Số lượng tế bào Rhodotorula sp.thu được ở các thời gian khác nhau của MT1

(CFU/ml)

Thời

gian

Tỉ lệ giống đối với môi trường nuôi cấy

10% 15% 20%

24h 0,0044.1015

0,0862.1015

0,059.1015

36h 0,08225.1015

0,1727.1015

0,118.1015

48h 9,98.1015

17,6.1015

13,4.1015

60h 19,97.1015

35,2.1015

26,73.1015

72h 69,3.1015

162,5.1015

82,4.1015

78h 34,7.1015

81,25.1015

41,2.1015

84h 0,0376.1015

0,09.1015

0,0455.1015

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 20 40 60 80 100

Số l

ượ

ng

tế b

ào n

ấm

men

(×

10

5C

FU

/ml)

Thời gian (giờ)

Môi trường 1

10%

15%

20%

Biểu đồ 1. Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp. ở môi trường 1

Dựa vào bảng 3.1 và biểu đồ 1, chúng tôi nhận thấy rằng MT1 ở tỉ lệ 10% số lượng

tế bào cao nhất là 72 giờ (69,3.1015

CFU/ml), 15% số lượng tế bào cao nhất là 72 giờ

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



(162,5.1015

CFU/ml) và 20% tế bào cao nhất ở 72 giờ (82,4.1015

CFU/ml). Số lượng tế

bào nấm men thấp nhất của cả 3 tỉ lệ là 24h.

Khi tỉ lệ nấm men 10% thì thời gian để nấm men phát triển cực đại sẽ dài hơn so

với tỉ lệ giống cao. Nhưng do lượng nấm men thấp nên khi kết thúc quá trình nuôi thì

lượng dinh dưỡng trong môi trường vẫn còn chưa được tận thu triệt để. Còn khi chọn tỉ lệ

20% thì do tỉ lệ quá cao làm cho quá trình sinh trưởng của nấm men trong môi trường sẽ

rất mạnh nên thời gian sinh trưởng của nấm men sẽ bị rút ngắn lại (tức là rút ngắn pha

log), điều này có ảnh hưởng không tốt đến quá trình hình thành sắc tố βCR. Chính vì vậy

mà ta thấy với tỉ lệ 15% là tỉ lệ vừa đủ để nấm men hấp thu hết dưỡng chất trong môi

trường mà thời gian hình thành βCR cũng vừa đủ.



(CFU/ml)

Thờigian Tỉ lệ giống đối với môi trường nuôi cấy

10% 15% 20%

24h 0,00567.1015

0,0532.1015

0,0169.1015

36h 0,1135.1015

0.106.1015

0,0339.1015

48h 9,9.1015

12,6.1015

11,8.1015

60h 19,8.1015

75,3.1015

23,5.1015

72h 16,8.1015

107.1015

76.1015

78h 8,42.1015

53,5.1015

34,8.1015

84h 0,00925.1015

0,0593.1015

0,0384.1015

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

Số l

ượ

ng

tế b

ào n

ấm

men

(×

10

5

CF

U/m

l)

Thời gian (giờ)

Môi trường 2

10%

15%

20%


Dựa vào bảng 3.2 và biểu đồ 2, chúng tôi nhận thấy rằng MT2 có số lượng tế bào

nấm men cao nhất là 60h đối với tỉ lệ giống 10% (19,8.1015

CFU/ml), còn 72 giờ 15%

(107.1015

CFU/ml) và 20% (76.1015

CFU/ml).

Ở MT2 sự phát triển của nấm men ở 3 tỉ lệ không đồng đều. Tỉ lệ 10 % không ổn

định tỉ lệ này phát triển nhanh ở 60 giờ nhưng lại giảm nhanh yếu tố này có thể là do

thành phần môi trường, trong môi trường có đường glucose mà đường glucose được nấm

men hấp thụ trực tiếp nên thời gian phát triển sẽ nhanh hơn.


Bảng 3.3. Số lượng tế bào Rhodotorula sp.thu được ở các thời gian khác nhau của MT3

(CFU/ml)

Thời

gian

Tỉ lệ giống đối với môi trường nuôi cấy

10% 15% 20%

24h 0,0227.1015

0,0268.1015

0,0214.1015

36h 0,045.1015

0,0536.1015

0,0428.1015

48h 9,67.1015

22,5.1015

7,5.1015

60h 37,7.1015

78,3.1015

29,6.1015

72h 51,1.1015

104.1015

59,3.1015

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



78h 11,7.1015

47,7.1015

31,3.1015

84h 0,0272.1015

0,0449.1015

0,0239.1015

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

Số

lư

ợn

g t

ế b

ào

nấ

m m

en

(×

10

5

CF

U/m

l)

Thời gian (giờ)

Môi trường 3

10%

15%

20%


Dựa vào bảng 3.3 và biểu đồ 3, chúng tôi nhận thấy rằng MT3 có số lượng tế bào

nấm men cao nhất là 72h với tỉ lệ giống 10% (51,1.1015

CFU/ml), 15% (104.1015

CFU/ml)

và 20% (59,3.1015

CFU/ml).

Trong 3 tỉ lệ giống thì tỉ lệ 15% là cho lượng tế bào nấm men cao nhất. Tuy ở cùng

điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường và thời gian nuôi nhưng ở tỉ lệ 15% thì giai

đoạn phát triển diễn ra từ từ không nhanh nhưng cũng không quá chậm chính điều này rất

có lợi cho quá trình sinh tổng hợp sắc tố βCR.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Biểu đồ 4. So sánh 3 đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp. ở 3 môi trường

với điều kiện tốt nhất

Dựa vào bảng 3.1, 3.2, 3.3 và biểu đồ 4, cả 3 môi trường đều ở tỉ lệ 15% thì

khoảng thời gian thu được lượng tế bào nấm men là 72 giờ MT1 là 1,625.1017

CFU/ml,

MT2 là 1,07.1017

, MT3 là 1,04.1017

. Môi trường 1 cho lượng tế bào cao nhất.

So sánh giữa MT1 và MT2 ta thấy rằng MT1 lượng nấm men nhiều hơn vì cơ chất

chính trong MT1 là saccharose mà nấm men phải qua quá trình thủy phân saccharose mới

sử dụng được lúc này nấm men sẽ hấp thụ từ từ dẫn đến quá tình phát triển chậm sẽ kéo

dài pha log giúp lượng sinh khối sẽ tăng lên. Trong khi cơ chất MT2 là glucose sẽ được

hấp thụ trực tiếp nó sẽ giúp nấm men phát triển tốt nhưng chính vì phát triển tốt nó sẽ rút

ngắn pha log mà điều này lại không tốt cho quá trình hình thành sắc tố βCR vì chính tế

bào nấm men sẽ ức chế lẫn nhau khi trong môi trường không còn chất dinh dưỡng.

Còn giữa MT1 và MT3 mặt dù giống nhau về thành phần và cơ chất chính là

saccharose nhưng chỉ có điều MT3 lại thiếu vi khoáng hơn MT1. Mà cụ thể là thiếu

MgSO4.7H2O khoáng chất này tham gia vào các phản ứng sinh hóa trong tế bào nấm men.

3.4. Thu nhận sinh khối Rhodotorula sp. trên các môi trường lỏng.

Kết quả được ghi nhận ở trong bảng 3.4

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Bảng 3.4. Lượng sinh khối Rhodotorula sp. trên các môi trường lỏng

Môi trường lỏng Lượng sinh khối

Rhodotorula sp. (g/l)

MT1 19,56

MT2 17,85

MT3 14,17

Từ bảng 3.4 ta có được biểu đồ 5 biểu diễn lượng sinh khối Rhodotorula sp. trên

các môi trường lỏng

Biểu đồ 5. Lượng sinh khối Rhodotorula sp. trên các môi trường lỏng

Qua bảng 3.4 và biểu đồ 5, chúng tôi nhận thấy 3 môi trường lỏng cho lượng sinh

khối tốt: MT1 thu được 19,56 g/lít, MT2 thu được 17,85 g/lít, MT3 thu được 14,17 g/lít.

Dựa vào kết quả bảng 3.4 chứng tỏ cả 3 môi trường đều có thể làm môi trường để

nhân sinh khối Rhodotorula sp. Tuy nhiên, môi trường 1 cho lượng sinh khối lớn nhất

(19,56 g/l), điều này do các thành phần trong môi trường đầy đủ dưỡng chất cần thiết và

điều cơ bản là do cơ chất Saccharose dễ dàng đồng hóa, tạo điều kiện cho nấm men

Rhodotorula sp. sinh trưởng và phát triển nhanh chóng.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



3.5. Xác định tỉ lệ dung môi: mẫu thích hợp cho quá trình trích ly β-carotene.

Kết quả trích ly βCR bằng dầu nành được thể hiện trong bảng 3.5 và dầu hướng

dương bảng 3.6.

Bảng 3.5. Hàm lượng βCR thu được của dầu đậu nành (µg/g)

Nhiệt

độ (°C)

Tỉ lệ

DM:Mẫu

Thời gian (phút)

90 phút 120 phút 150 phút 180 phút

70°C

9:1 97,7 ± 0,1 101,73 ± 0,34 94,45 ± 0,71 93,15 ± 0,34

10:1 98,1 ± 0,1 103,47 ± 0,61 100,73 ± 0,06 96,65 ± 0,02

11:1 96,35 ± 0,3 101,1 ± 0,36 96,51 ± 0,26 92,71 ± 0,06

80°C

9:1 97,09 ± 0,12 109,43 ± 0,29 99,83 ± 0,3 96,37 ± 0,33

10:1 105,13 ± 0,4 119,6 ± 1,2 105,17 ± 0,39 98,9± 0,35

11:1 100,1 ± 0,11 106,71 ± 0,3 98, 78 ± 0,16 94, 53 ± 0,36

90°C

9:1 101,7 ± 0,6 101,49 ± 0,4 96,26 ± 0,23 92,87 ± 0,37

10:1 110,27 ± 0,23 103,05 ± 0,17 97,71 ± 0,31 94,09 ± 0,8

11:1 106,01 ± 0,5 103,82 ± 0,19 95,28 ± 0,44 92,41 ± 0,63

Bảng 3.6. Hàm lượng βCR thu được của dầu hướng dương (µg/g)

Nhiệt

độ

Tỉ lệ

DM:Mẫu

Thời gian

90 phút 120 phút 150 phút 180 phút

70°C

9:1 104,19 ± 0,01 107,25 ± 0,06 104,54 ± 0,6 97,5 ± 0,45

10:1 107,34 ± 0,07 109,28 ± 0,1 115,98 ± 0,25 100,78 ± 0,51

11:1 101,88 ± 0,01 105,97 ± 0,03 101,86 ± 0,4 96,46 ± 0,8

80°C

9:1 104,15 ± 0,5 110,44 ± 0,02 107,5 ± 0,21 98,5 4± 0,05

10:1 108,2 ± 0.05 123,54 ± 0,01 115,2 ± 0,1 108,23 ± 0,18

11:1 106,9 ± 0,05 111,94 ± 0,5 107,89 ± 0,6 101,19 ± 0,65

90°C

9:1 106,07 ± 0,02 110,38 ± 0,4 102,13 ± 0,49 97,02 ± 0,24

10:1 109,08 ± 0,01 113,96 ± 0,5 106,88 ± 0,7 99,57 ± 0,96

11:1 107,65 ± 0,1 109,19 ± 0,08 101,66 ± 0,01 96,17 ± 0,3

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



95

100

105

110

115

120

125

9:01 10:01 11:01

Hàm

lư

ợn

g β

CR

(μ

g/g

)

Tỉ lệ dung môi:mẫu

Dầu ĐN

Dầu HD

Biểu đồ 6. Biều đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: mẫu đến hiệu suất thu hồi βCR

bằng dầu nành và dầu hướng dương

Dựa vào bảng 3.5, bảng 3.6 và biểu đồ 6 cho thấy: dầu đậu nành thu hồi βCR cao

nhất ở tỉ lệ 10:1 (119,6µg/g), kế đến là tỉ lệ 9:1 (109,43 µg/g) và cuối cùng là tỉ lệ 11:1

(106,71 µg/g). Còn đối với dầu hướng dương thì tỉ lệ cao nhất là 10:1 (123,54 µg/g), tiếp

theo là tỉ lệ 11:1 (111,94 µg/g) và cuối cùng là 9:1 (110,44 µg/g).

Ta thấy rằng khi tỉ lệ dung môi: mẫu tăng từ 9:1 đến 10:1 thì hiệu suất thu hồi βCR

tăng. Do ở tỉ lệ dung môi thấp thì lượng dung môi không đủ ngập để hòa tan hoàn toàn β-

carotenoid trong nguyên liệu nên hiệu số trích ly thấp. Nhưng khi lượng dung môi vừa đủ

để trích ly thì sẽ thu được toàn bộ βCR trong sinh khối nấm men. Tiếp tục tăng tỉ lệ dung

môi: mẫu thì hiệu suất thu hồi β-carotenoid giảm xuống do lượng dung môi nhiều sẽ làm

cho dịch trích loãng nên hiệu suất thu hồi thấp.

Mẫu tốt nhất của dầu đậu nành và dầu hướng dương được chọn gửi đi phân tích tại

trung tâm phân tích Hóa sinh Case. (phần 4 mục lục 1)

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



3.6. Xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly βCR.

3.6.1. Dung môi dầu nành.

Biểu đồ 7. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi βCR

của dung môi dầu đậu nành

Dựa vào bảng 3.5 và biểu đồ 7 cho ta thấy hiệu suất thu hồi cao nhất ở 70°C với

120 phút (103,47 µg/g), ở 80°C với 120 phút (119,6 µg/g), ở 90°C với 90 phút

(110,27µg/g).

Khi tỉ lệ dung môi: mẫu là 10:1 thì ở nhiệt độ khác nhau, thời gian khác nhau sẽ

cho hiệu suất thu hồi βCR cũng khác nhau. Khi nhiệt độ tăng từ 70°C đến 80°C thì nồng

độ và hiệu suất βCR tăng do nhiệt độ cao làm tăng độ hòa tan β-carotenoid từ nguyên liệu

vào dung môi, làm giảm độ nhớt nên tăng hệ số khuyết tán và tăng tốc độ quá trình trích

ly. Tuy nhiên, với sản phẩm có nhiều nối đôi như β-carotenoid thì khi nhiệt độ tăng lên

90°C thì hiệu suất thu hồi β-carotenoid giảm nhanh vì nhiệt độ cộng thêm sự kéo dài của

thời gian là tác nhân thúc đẩy quá trình oxy hóa hợp chất β-carotenoid, do đó làm giảm

hiệu suất thu hồi β-carotenoid.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



3.6.2. Dung môi dầu hướng dương.

90

95

100

105

110

115

120

125

130

Hà

m lư

ợn

g β

CR

(μ

g/g

)

90 120 150 180

Thời gian (phút)

Dầu Hướng Dương

70°C

80°C

90°C

Biểu đồ 8. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi βCR

của dung môi dầu hướng dương

Dựa vào bảng 3.6 và biểu đồ 8 cho ta thấy hiệu suất thu hồi cao nhất ở 70°C với

150 phút (115,98 µg/g), ở 80°C với 120 phút (123,54 µg/g), ở 90°C với 120 phút (113,96

µg/g).

Khi tỉ lệ dung môi: mẫu là 10:1 thì ở nhiệt độ khác nhau, thời gian khác nhau sẽ

cho hiệu suất thu hồi βCR cũng khác nhau. Khi nhiệt độ tăng từ 70°C đến 80°C thì nồng

độ và hiệu suất βCR tăng do nhiệt độ cao làm tăng độ hòa tan β-carotenoid từ nguyên liệu

vào dung môi, làm giảm độ nhớt nên tăng hệ số khuyết tán và tăng tốc độ quá trình trích

ly. Khi nhiệt độ càng thấp thì thời gian trích ly càng dài. Nhiệt độ cao thì thời gian trích ly

sẽ rút ngắn lại.

Tuy nhiên, với sản phẩm có nhiều nối đôi như β-carotenoid thì khi nhiệt độ tăng

lên 90°C thì hiệu suất thu hồi β-carotenoid giảm nhanh vì nhiệt độ cộng thêm sự kéo dài

của thời gian là tác nhân thúc đẩy quá trình oxy hóa hợp chất β-carotenoid, do đó làm

giảm hiệu suất thu hồi β-carotenoid.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận.

Từ kết quả nghiên cứu thực tế, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

Giai đoạn nuôi cấy:

MT 1:

+ Lượng sinh khối khô: 19,56 g/l

+ Số lượng tế bào ở 72h: 1,625 × 1017

CFU/ml

MT 2:


+ Số lượng tế bào ở 72h: 1,07 × 1017

CFU/ml

MT 3:


+ Số lượng tế bào ở 72h: 1,04 × 1017

CFU/ml

Cả 3 môi trường cùng có tỉ lệ giống đạt mật độ tế bào cao nhất là 15% vì với lượng

giống phù hợp giúp cho tế bào trong môi trường phát triển tốt mà không sợ lượng giống

quá nhiều hoặc quá ít đảm bảo với lượng dưỡng chất trong môi trường.

Trong cùng điều kiện nuôi cấy thì môi trường 1 cho tế bào nấm men cao nhất

(162,5.1015

CFU/ml) so với môi trường 2 và 3.

Thời gian nuôi để số lượng tế bào đạt giá trị cực đại là 72h.

Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi thì lượng tế bào tăng nhanh. Nhưng khi

nuôi được 72h thì lượng tế bào lại giảm xuống.

Hàm lượng dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của nấm men.

Trong quá trình nuôi phải đảm bảo các điều kiện cần thiết và cần tránh sự lây

nhiễm các vi sinh vật từ bên ngoài.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



Sơ đồ nuôi cấy chính thức của nấm men Rhodotorula sp. ở môi trường lỏng là:

Nấm men Rhodotorula sp. Môi trường

Nhân giống Hấp

Cấy giống (15%)

Sục khí (72h)

Ly tâm 3000vòng/phút(15÷20phút)

Thu sinh khối nấm men Rhodotorula sp.

Sơ đồ 4.1: Sơ đồ nuôi cấy chính của nấm men ở môi trường lỏng.

Giai đoạn trích ly:

- Khi trích ly βCR bằng các loại dung môi khác nhau thì thông số cho quá trình trích

ly là khác nhau.

- Đối với dung môi là dầu đậu nành thông số thích hợp cho quá trình trích ly βCR

như sau: tỉ lệ dung môi: mẫu là 10:1, ở nhiệt độ 80°C và thời gian 120 phút (119,6 μg/g)

hoặc tỉ lệ 10:1 ở nhiệt độ 90°C trong vòng 90 phút (110,27 μg/g).

- Đối với dung môi là dầu hướng dương thông số thích hợp cho quá trình trích ly

βCR như sau: tỉ lệ dung môi: mẫu là 10:1, ở nhiệt độ 80°C và thời gian 120 phút (123,54

μg/g) hoặc tỉ lệ 9:1 ở nhiệt độ 70°C trong vòng 150 phút (115,98μg/g).

- Dựa vào biểu đồ 6 ta thấy rằng hiệu suất trích ly của dầu hướng dương cao hơn dầu

nành ở các tỉ lệ dung môi: mẫu 9:1, 10:1, 11:1 điều này chứng tỏ rằng dung môi dầu

hướng dương tốt hơn dung môi dầu nành đối với quá trình trích ly βCR từ nấm men

Rhodotorula sp.

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



- Hiệu suất thu hồi βCR không những phụ thuộc vào tỉ lệ dung môi: mẫu mà còn

phụ thuộc vào thời gian và nhiệt độ trích ly. Khi tăng nhiệt độ và thời gian chiết thì hiệu

suất thu hồi tăng tuy nhiên khi tăng nhiệt độ quá cao thì hàm lượng βCR giảm vì βCR bị

phân hủy nhanh ở nhiệt độ cao.

- Hiệu suất của quá trình trích ly βCR từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp. bằng

dung môi dầu thực vật có sự tương tác qua lại giữa tỉ lệ dung môi: mẫu, thời gian và nhiệt

độ trích ly.

- Khi thời gian trích ly càng tăng thì các phân tử βCR khuyết tán càng nhiều vì thế

hiệu suất trích ly sẽ tăng.

- Khi nhiệt độ và thời gian tăng đến một giá trị nhất định thì sau đó nếu tiếp tục tăng

thì hàm lượng βCR sẽ giảm do chúng bị phá hủy ở nhiệt độ cao.

- Ngoài những yếu tố trên, hiệu suất của quá trình chiết βCR còn phụ thuộc vào bản

chất của dung môi trích ly.

Quy trình trích ly đề xuất như sau:

Sơ đồ 4.2: Sơ đồ chính của quá trình trích ly β-carotenoid

Β-Carotenoid

trong dầu β-Carotenoid

trong dầu

Nguyên liệu

Tỉ lệ DM: Mẫu là 10:1

Thời gian: 120 phút

Sấy (độ ẩm 5 – 6%)

Ly tâm

Trích ly

Dịch trích

Trườ

ng Đ

H B

à Rịa

- V

ũng

Tàu



4.2. Đề nghị:

Thông qua kết quả nghiên cứu thực tế của đề tài bước đầu đã thu được những kết

quả tốt. Đây có thể là một tiền đề nghiên cứu có ích cho các bạn sinh viên khóa sau có

nhu cầu tìm hiểu, nghiên cứu để đề tài ngày một sâu rộng hơn. Dưới đây, là một số hướng

có thể nghiên cứu và phát triển của đề tài:

- Nghiên cứu sử dụng Rhodotorula sp. làm chất màu bổ sung trực tiếp hay gián tiếp

vào thực phẩm và dược phẩm cho người.

- Khảo sát ảnh hưởng các loại dung môi khác nhau đến hiệu suất trích ly carotenoid

từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp.

- So sánh hiệu suất khác (trích ly carotenoid bằng cách sử dụng enzyme thủy phân

hoặc phương pháp HPLC).

- Cần nghiên cứu tối ưu hóa các thông số cho quá trình trích ly β-carotenoid để tìm

ra thông số tối ưu cho quá trình này.

- Nghiên cứu các thông số kỹ thuật cần thiết và thiết bị sản xuất theo quy mô lớn để

đưa sản phẩm từ phòng thí nghiệm vào sản xuất công nghiệp.

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàuthuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/14569/1/Nuoi cay nam men...

Documents

Transcript of Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàuthuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/14569/1/Nuoi cay nam men...