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Transaminase-vermittelte Synthese
β-chiraler Amine
Inauguraldissertation zur
Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Universität Greifswald
Vorgelegt von Miriam Anne Sowa
geb. 22.02.1991 in Hoyerswerda
Greifswald, den 02.11.2018
Dekan: Prof. Dr. Werner Weitschies 1. Gutachter: Dr. Matthias Höhne 2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Gröger
Tag der Promotion: 08.03.2019
“It's the questions we can't answer that teach us the most. They teach us how to think. If you
give a man an answer, all he gains is a little fact. But give him a question and he'll look for his
own answers.”
- Patrick Rothfuss, The Wise Man's Fear -
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen .........................................................................................................................III
1. Einleitung .......................................................................................................................... 1
1.1 Enzyme und Biokatalyse .............................................................................................. 1
1.2 Chiralität und optische Reinheit .................................................................................... 3
1.3 Chirale Amine .............................................................................................................. 4
1.4 Chemische Aminsynthese ............................................................................................ 5
1.5 Enzymatische Aminsynthese ....................................................................................... 6
1.6 Transaminasen ............................................................................................................ 7
1.6.1 Mechanismus der Transaminierung ....................................................................... 7
1.6.2 Einteilung von Transaminasen ............................................................................... 8
1.6.3 Anwendung ........................................................................................................... 9
1.7 Amindehydrogenasen .................................................................................................11
1.8 β-chirale Amine ...........................................................................................................12
1.8.1 Pregabalin ............................................................................................................12
1.8.2 Baclofen ...............................................................................................................13
2. Ziel ...................................................................................................................................17
3. Ergebnisse .......................................................................................................................19
3.1 Pregabalin ...................................................................................................................19
3.1.1 Substratsynthese ..................................................................................................19
3.1.2 Analytik von Pregabalin ........................................................................................20
3.1.3 Screening der Amintransaminasen .......................................................................22
3.2 Revision der Modell-Verbindung .................................................................................24
3.3 Baclofen ......................................................................................................................24
3.3.1 Analytik .................................................................................................................24
3.3.2 Enzymscreening ...................................................................................................28
3.3.3 Biokatalytische Herstellung von Baclofen durch 3FCR_5M ..................................33
3.3.4 Up-Scaling ............................................................................................................42
4. Diskussion ........................................................................................................................47
4.1 Synthese der Substrate ...............................................................................................47
4.2 Analytik .......................................................................................................................47
4.3 Screening....................................................................................................................48
4.3.1 Amindehydrogenasen ...........................................................................................48
4.3.2 Transaminasen .....................................................................................................49
4.4 3FCR_5M ...................................................................................................................52
4.4.1 Optimierung der Reaktion mit gereinigtem Enzym ................................................52
4.4.2 Optimierung der Reaktion mit Zellextrakt ..............................................................53
Inhaltsverzeichnis
II
4.5 Up-Scaling ..................................................................................................................56
5. Zusammenfassung ...........................................................................................................59
6. Material und Methoden .....................................................................................................61
6.1 Geräte .........................................................................................................................61
6.2 Chemikalien und Verbrauchsmittel ..............................................................................62
6.3 Bakterienstämme ........................................................................................................63
6.4 Primer .........................................................................................................................63
6.5 Plasmide .....................................................................................................................63
6.6 Enzyme .......................................................................................................................63
6.7 Medien und Zusätze ...................................................................................................65
6.7.1 Antibiotika und Induktoren ....................................................................................65
6.7.2 Wachstumsmedien und Zusätze ...........................................................................65
6.8 Puffer ..........................................................................................................................66
6.8.1 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................................66
6.8.2 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen[115] ............................................66
6.8.3 Zell- und Protein-Puffer.........................................................................................67
6.8.4 Proteinreinigung ...................................................................................................67
6.8.5 SDS-PAGE-Lösungen und -Puffer[116] ...................................................................68
6.8.6 Assay Lösungen ...................................................................................................69
6.9 Software .....................................................................................................................70
6.10 Methoden ..................................................................................................................70
6.10.1 Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden .......................................70
6.10.2 Biochemische Methoden ....................................................................................73
6.10.4 Immobilisierung an EziG™-Trägermaterialien[103] ...............................................81
6.10.6 Chemische Methoden .........................................................................................81
7. Literatur ............................................................................................................................83
Eigenständigkeitserklärung ..................................................................................................89
Danksagung .........................................................................................................................91
Abkürzungen
III
Abkürzungen
% v/v Volumenprozent IPA Isopropylamin % w/v °C
Gewichtsprozent Grad Celsius
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
α-MBA α-Methylbenzylamin IRED Iminreduktase α-EBA α-Ethylbenzylamin Kan Kanamycin Abs Absorption kDa Kilodalton ACN Acetonitril LB Luria Bertani A. dest Destilliertes Wasser LDH Lactatdehydrogenase AmDH Amindehydrogenase min Minute Amp Ampicillin M Mol pro Liter APS Ammoniumpersulfat MAO Monoaminoxidase ArR ATA aus Arthrobacter sp. KNK168
(V306I) MOPS 3-(N-Morpholino)-
propansulfonsäure ATA Amintransaminase MTBE Methyl-tert-butylether BSA CE
Rinderserumalbumin Kapillarelektrophorese
NAD Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
CHES 2-(Cyclohexylamino)-ethansulfonsäure
NaPP NMR
Natriumphosphatpuffer Kernspinresonanzspektroskopie
Cvi ATA aus Chromobacterium violaceum
OD600
OPA Optische Dichte bei 600 nm o-Phthalaldehyd
D DC
Tag Dünnschichtchromatographie
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
DCM Dichlormethan PCR Polymerasekettenreaktion DMSO Dimethylsulfoxid PDB Proteindatenbank DNA dNTP
Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonukleosidtriphosphat
Pfu Polymerase aus Pyrococcus furiosus
ee Enantiomerenüberschuss PLP Pyridoxalphosphat E. coli Escherichia coli PMP Pyridoxaminphosphat EC Enzyme Commission Number rpm Umdrehungen pro Minute ECF Ethylchloroformiat rv reversed FID Flammenionisationsdetektor s Sekunde fw forward SDS Natriumdodecylsulfat g GABA
Gravitationskonstante γ-Aminobuttersäure
Taq Polymerase aus Thermus aquaticus
GC-MS GDH
Gaschromatographie-Massenspektrometrie Glucosedehydrogenase
TB TEMED
Terrific broth N,N,N',N'‐Tetramethylethylendiamin
h Stunde TFA Trifluoressigsäure HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-
piperazinyl)-ethansulfonsäure Tris Tris(hydroxymethyl)-
aminomethan HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromato-
graphie U UV
Units [µmol min-1] Ultraviolett
Vfl ATA aus Vibrio fluvialis Außerdem wurden SI-Präfixe und die übliche Codierung für Aminosäuren, Nucleotide und SI-Einheiten verwendet.
IV
1. Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Enzyme und Biokatalyse
In der Natur werden Enzyme für die Katalyse einer Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen
benötigt. Ein geregelter Stoffwechsel wäre ohne die hohe Spezifität und Effizienz dieser
Biokatalysatoren gar nicht möglich. Enzyme können Reaktionen um Größenordnungen von
103 bis 1017 im Vergleich zur nicht-katalysierten Reaktion beschleunigen, beeinflussen dabei
jedoch nicht das Gleichgewicht der Reaktion[1], da sie lediglich die Aktivierungsenthalpie
herabsetzen. Zudem vereinigen Enzyme als Katalysatoren die meisten Kriterien „Grüner
Chemie“ und erlauben so die Entwicklung nachhaltigerer Syntheseprozesse. Bereits 2000
wurden von Anastas und Warner zwölf Prinzipien der grünen Chemie formuliert, an denen sich
die Industrie auch heute noch zur Vermeidung von Umweltbelastungen orientieren sollte[2].
Daher stellt die Biokatalyse häufig eine zu bevorzugende Alternative gegenüber chemischen
Katalyse-Verfahren dar.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Prinzipien der grünen Chemie und ihrer Verbindung zu den Vorteilen der Biokatalyse.[3,4]
Wie aus Abbildung 1 ersichtlich wird, erlaubt die Verwendung von Biokatalysatoren in der
Synthese die Etablierung effizienterer und umweltfreundlicherer Prozesse. Enzyme sind
beinahe nie toxisch und bilden weniger unerwünschte Nebenprodukte, da sie eine hohe
Chemo-, Regio- und Stereoselektivität aufweisen können, sodass weniger Abfall entsteht. Es
können zudem auch Substanzen produziert werden, die über chemische Synthesen nur
schwer zugänglich sind[5]. Biokatalysatoren ermöglichen Reaktionen bei deutlich milderen
Bedingungen als chemische Verfahren, zum Beispiel bei neutralem pH-Wert, in wässrigen
Lösungen und bei moderaten Temperaturen und Drücken. Die beiden letzteren Parameter
können zudem die Energieeffizienz eines Verfahrens verbessern[6]. Doch auch biokatalytische
1. Einleitung
2
Verfahren unterliegen einigen Beschränkungen. Viele Enzyme sind nur in einem limitierten
Temperatur- und pH-Bereich stabil und tolerieren nur geringe Mengen bestimmter organischer
Lösungsmittel als Co-Solvenzien oder Alternativen zu Wasser. Zudem tritt häufig eine
Inhibierung durch Substrate oder Produkte auf. Des Weiteren werden für viele Reaktionen
teure Cofaktoren benötigt, die wiederum für eine effiziente Anwendung wiederaufbereitet
werden müssen[6]. Eine der häufigsten Einschränkungen ist die gegenüber dem chemischen
Verfahren vergleichsweise geringe katalytische Aktivität. Zur gezielten Optimierung von
Enzymen für eine bestimmte Anwendung können die Methoden des Protein-Engineerings
eingesetzt werden[7]. Diese werden nach gerichteter Evolution und rationalem Design
eingeteilt. Die gerichtete Evolution basiert auf der Kombination zufälliger Mutagenese und
anschließender Selektion auf eine bestimmte Eigenschaft und kann angewendet werden,
wenn wenig Informationen über die Struktur und den Reaktionsmechanismus des jeweiligen
Enzyms bekannt sind. Allerding ist ein hoher Screening-Aufwand erforderlich[8]. Sind genug
strukturelle und mechanistische Informationen verfügbar, so kann das Protein-Engineering
auch über rationales Design erfolgen, bei dem durch den gezielten Aminosäureaustausch an
bestimmten Positionen im Enzym die gewünschte Eigenschaft beeinflusst werden kann. Die
Vorhersage und Auswahl der entsprechenden Positionen erfolgt mit Hilfe des Molecular
Modellings, bei dem zunächst in silico Veränderungen der Enzymeigenschaften (zum Beispiel
die Akzeptanz eines bestimmten Substrats) durch den Austausch bestimmter Aminosäuren
berechnet werden. Anschließend können vielversprechende Varianten in vivo erzeugt und
durchmustert werden. Folglich ist der Screening-Aufwand beim rationalen Design im Vergleich
zur gerichteten Evolution deutlich verringert. In der Praxis werden häufig semi-rationale
Ansätze verfolgt. Dabei werden katalytisch relevante Reste basierend auf strukturellen
Informationen (wie Struktur- oder Sequenzhomologien) ausgewählt und es werden mittels
Zufallsmutagenese Bibliotheken erstellt, die anschließend zu durchmustern sind. Der
Screening-Aufwand ist in diesem Fall auch deutlich geringer als bei der gerichteten Evolution.
Zur Kategorisierung von Enzymen wird die Nomenklatur durch die Enzyme commission (EC)
verwendet. Dabei werden Enzyme entsprechend der jeweils katalysierten Reaktionsart durch
eine vierstellige EC-Nummer klassifiziert. Die sechs Haupt-Enzymklassen, in die
unterschieden wird, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Enzymklassifikation:[9,10]
EC-
Nummer
Enzymklasse Reaktionsart Beispiel
1 Oxidoreduktasen Oxidation und Reduktion Amindehydrogenasen
2 Transferasen Übertragung funktioneller
Gruppen
Transaminasen
3 Hydrolasen Hydrolyse Lipasen
4 Lyasen Eliminierung und Addition Aldolasen
5 Isomerasen Isomerisierung Triosephosphat-Isomerase
6 Ligasen Bildung kovalenter
Verknüpfungen unter ATP-
Spaltung
Pyruvat-Carboxylase
1. Einleitung
3
1.2 Chiralität und optische Reinheit
Chiralität, zu Deutsch „Händigkeit“, beschreibt in der Stereochemie eine Anordnung von
Atomen im Molekül, bei der keine interne Symmetrieebene vorliegt, also keine Deckung bei
Spiegelung möglich ist (Abb. 2). Es handelt sich um Verbindungen, bei denen ein zentrales
Kohlenstoffatom (Chiralitätszentrum) von vier verschiedenen Substituenten umgeben ist. Die
beiden möglichen Stereoisomere (Enantiomere) unterschieden sich lediglich durch ihre
räumliche Anordnung und weisen in achiraler Umgebung identische physikalische und
chemische Eigenschaften auf. Die Nomenklatur der Enantiomere erfolgt nach der
sogenannten CIP-Regel[11]. Dabei werden den Substituenten Prioritäten basierend auf deren
Ordnungszahl, bzw. Ordnungszahl und Bindungsordnung der nachfolgenden Atome
zugeordnet, sodass eine Reihenfolge festgelegt werden kann. Sind die Substituenten mit
sinkender Priorität im Uhrzeigersinn um das chirale Zentrum angeordnet, spricht man vom (R)-
Enantiomer, gegen den Uhrzeigersinn vom (S)-Enantiomer.[11,12]
Abbildung 2: Schematische Darstellung zweier Enantiomere. Angenommen wird, dass D die geringste Priorität hat.
Das Konzept der Chiralität ist in allen Bereichen des Lebens sowie den Bereichen der
organischen Synthese, Pharmakologie, Lebens- und Genussmittelindustrie und in der
Ökologie allgegenwärtig[13]. Pharmakokinetische, metabolische, toxikologische und physio-
logische Einflüsse einzelner Enantiomere auf den Organismus sind in vielen Fällen gut
untersucht und spiegeln sich in der hohen Nachfrage optisch reiner Wirkstoffe wider[14]. Da
auch Bioakkumulation und biologische Abbaubarkeit enantioselektive Prozesse sind, wird das
Augenmerk der Industrie in den letzten Jahren auch vermehrt auf die Bedeutung chiraler
Kontaminanten in Nebenprodukten und Abfall gelenkt[15].
Ein Maß für die optische Reinheit einer Substanz ist der Enantiomerenüberschuss (%ee),
dessen Berechnung in Abbildung 3 dargestellt ist.
Abbildung 3: Formel zur Berechnung des Enantiomerenüberschusses. R,S: Konzentrationen/Peak-flächen des (R)- bzw. (S)-Enantiomers.[16]
Wie aus der Formel ersichtlich wird, beträgt der Enantiomerenüberschuss für eine optisch
reine Substanz 100%ee. Bei 0%ee liegen beide Enantiomere zu gleichen Anteilen vor und
man spricht von einem Racemat. Zur Bestimmung des Enantiomerenüberschuss werden
hauptsächlich chromatographische Methoden mit chiralen stationären Phasen verwendet,
aber auch NMR, Massenspektrometrie, Infrarotspektroskopie und Kapillarelektrophorese.[17]
1. Einleitung
4
1.3 Chirale Amine
Neben Aminosäuren erfüllen chirale Amine als Strukturbestandteile von Neurotransmittern,
Hormonen und Enzyminhibitoren der Zell-Zell-Kommunikation wichtige Funktionen in der
Natur. Chirale Amine machen außerdem ca. 40% aller optisch reinen aktiven pharma-
zeutischen Ingredienzien (APIs) aus[18]. Auch in der agrochemischen Industrie finden sie als
Herbizide und Insektizide breite Anwendung und werden in der Feinchemie als chirale
Auxiliare und für Deracemisierungen benötigt[19].
Abbildung 4: Beispiele für Medikamente, die Amine als chirale Bausteine enthalten (blau hervor-gehoben).[19,20]
Wie aus Abbildung 4 ersichtlich wird, werden APIs häufig in enantiomerenreiner Form benötigt,
da beide Enantiomere eine unterschiedliche Wirkung im Organismus erzielen können. Oftmals
entfaltet nur eines der Enantiomere die physiologische Wirksamkeit, aber es sind auch Fälle
bekannt, in denen das andere Enantiomer eine schädliche Wirkung auf den Organismus
haben kann. Während der erste Fall als lediglich ineffizient, aber harmlos betrachtet werden
kann, kann Letzteres schwerwiegende Folgen haben. Ein prominentes historisches Beispiel
aus den 1950er Jahren ist Thalidomid, welches unter den Markennamen Contergan® und
Softenon® unter anderem als Beruhigungs- und Schlafmittel, aber auch zur Behandlung der
morgendlichen Übelkeit von Schwangeren verschrieben wurde. Verabreicht wurde das
racemische Gemisch, wobei jedoch später festgestellt wurde, dass die sedative Wirkung von
(R)-Thalidomid ausgeht, wohingegen das (S)-Enantiomer zu Fruchtschädigungen führt. Dies
hatte einen deutlichen Anstieg an Fehlbildungen bei Neugeborenen zur Folge.[21] Dieser
extreme Fall zeigt, wie wichtig die Synthese enantiomerenreiner Präparate insbesondere für
deren medizinische Anwendung ist.
1. Einleitung
5
1.4 Chemische Aminsynthese
Chemisch werden chirale Amine klassisch mittels einer Racematspaltung durch die
fraktionierte Kristallisation mit enantiomerenreinen Carbonsäuren hergestellt. Da in diesem
Falle eines der Aminenantiomere mit der Carbonsäure auskristallisiert und das andere in
Lösung verbleibt, kann die Ausbeute bei diesem Verfahren maximal 50% betragen[22]. Eine
höhere Ausbeute kann theoretisch durch eine asymmetrische Synthese erzielt werden. Für
chirale Amine stellen die asymmetrische Hydrierung von Iminen (Abb. 5 a und b) und die
asymmetrische Addition von Carbanionen (Abb. 5 c) die bedeutendsten Methoden dar. Bei der
asymmetrischen Hydrierung wird ausgehend von einem prochiralen Keton mit Hilfe eines
chiralen Auxiliars über ein Oxim das Enamid bzw. direkt das Ketimin gebildet. Anschließend
erfolgt eine stereoselektive Reduktion, die zum geschützten Amin führt[23,24]. Dies geschieht
mit Hilfe molekularen Wasserstoffs und eines entsprechenden Katalysators, der in der Regel
Platin, Palladium, Rhodium oder Nickel enthält. Die asymmetrische Addition geht
üblicherweise von Aldehyden aus, die zuerst in Imine überführt werden. Durch die Addition
eines Carbanions oder eines Radikals wird dann das geschützte Amin gebildet.
Abbildung 5: Mögliche chemische Verfahren zur Herstellung chiraler Amine durch asymmetrische Synthese[25].
Beide Methoden führen die Chiralität mit Hilfe chiraler Auxiliare oder Liganden ein, die die
Bildung eines Produktenantiomers gegenüber dem anderen begünstigen. Dabei ist die
Enantioselektivität der Prozesse oftmals nicht hoch genug, sodass weitere Reinigungsschritte
benötigt werden, insbesondere für pharmazeutisch relevante Produkte. Außerdem können die
gängigen chemischen Methoden nicht als besonders umweltfreundlich angesehen werden, da
organische Lösungsmittel, metall-organische Verbindungen und Schwermetalle benötigt
werden. Diese Substanzen sind nicht nur per se umweltgefährdend, ihr Einsatz erfordert
oftmals auch harsche Reaktionsbedingungen (Druck und Temperatur).[22] Daher werden
dringend nachhaltigere Methoden benötigt. Wie bereits in Abschnitt 1.1 erwähnt, können
Enzym-katalysierte Prozesse eine effiziente und umweltfreundliche Alternative darstellen.
1. Einleitung
6
1.5 Enzymatische Aminsynthese
Für die biokatalytische Synthese optisch aktiver Amine kann ein breites Spektrum
verschiedener Enzymklassen genutzt werden (Abb. 6).
Abbildung 6: Beispiele für die enzymatische Synthese chiraler Amine.[26,27]
Je nach Ausgangsverbindung und gewünschter Produktstruktur kommen bestimmte Enzyme
nur für bestimmte Reaktionen in Frage.
Um ein chirales Amin durch Deracemisierung zu gewinnen, werden häufig Monoaminoxidasen
(MAOs) und Hydrolasen (Lipasen) verwendet. MAOs oxidieren selektiv eines der Enantiomere
aus dem racemischen Gemisch zum Imin, sodass das verbleibende Enantiomer in hoher
Reinheit gewonnen werden kann. Das Imin kann wiederum chemisch oder enzymatisch in situ
zum racemischen Amin reduziert werden, sodass eine höhere Ausbeute, theoretisch bis zu
100%, erzielt werden kann. Je nach MAO-Variante können primäre, sekundäre und tertiäre
optisch reine Amine gewonnen werden.[28,29] Die Racematspaltung mit Hilfe von Lipasen kann
prinzipiell durch eine Amidhydrolyse oder Acylierung von Aminen erfolgen. Letzteres wird
beispielsweise mit Hilfe der Lipase aus Burkholderia plantarii[30] industriell im großtechnischen
Maßstab in der BASF angewendet[31].
Ammoniak-Lyasen katalysieren die reversible Addition von Ammoniak und Aminen an die
Doppelbindung α,β-ungesättigter Carbonsäuren und werden daher zur Synthese optisch
reiner natürlicher und unnatürlicher Aminosäuren, auch β-Aminosäuren, verwendet[32].
Beispielsweise wird eine Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) aus Rhodotorula glutinis zur
Synthese eines Intermediats bei der Herstellung von (S)-2-Indol-carbonsäure, einem ACE-
Hemmer, eingesetzt[33].
Bei Imin-Reduktasen (IREDs) und reduktiven Aminasen handelt es sich um NADPH-
abhängige Oxidoreduktasen, die in erster Linie zur Herstellung chiraler sekundärer Amine
verwendet werden können, allerdings sind auch Varianten für die Synthese primärer und
tertiärer Amine bekannt. IREDs katalysieren die Reduktion eines Imins zum Amin, wobei das
Imin unter den entsprechenden Reaktionsbedingungen (in Abhängigkeit vom pH-Wert) durch
Kondensation aus Ketonen und Aldehyden gebildet werden kann[34]. Dabei liegt das
Gleichgewicht jedoch stark auf Seiten der Carbonylverbindung. Kürzlich wurde ein IRED-
1. Einleitung
7
analoges Enzym, eine reduktive Aminase aus Aspergillus oryzae beschrieben, das für die
reduktive Aminierung von Ketonen keine spontane Imin-Bildung benötigt, da das Imin-
Intermediat als Teil des katalytischen Zyklus im aktiven Zentrum des Enzyms gebildet
wird[27,35].
Da in der vorliegenden Arbeit Transaminasen und Amindehydrogenasen für die zu
untersuchende Synthese untersucht wurden, werden diese im Folgenden detaillierter
vorgestellt.
1.6 Transaminasen
Transaminasen (TAs) gehören zu den Pyridoxal-5'-phosphat (PLP)-abhängigen Enzymen. Sie
katalysieren die Übertragung einer Aminogruppe von einem Aminodonor auf einen Amino-
akzeptor.
1.6.1 Mechanismus der Transaminierung
Der katalytische Zyklus einer Transaminase folgt einem Ping-Pong-Bi-Bi-Mechanismus und
kann in zwei Halbreaktionen unterteilt werden. Während der ersten Halbreaktion erfolgt die
Übertragung der Aminogruppe von einem Aminodonor auf den Cofaktor PLP, wobei
Pyridoxaminphosphat (PMP) und ein Ketoprodukt entstehen. Die zweite Halbreaktion umfasst
den Transfer der Aminogruppe von PMP auf einen Aminoakzeptor, sodass das Aminprodukt
und PLP entstehen. [36,37]
Im Detail liegt zu Beginn der ersten Halbreaktion PLP in Form eines internen Aldimins vor:
Durch die Aminogruppe eines hochkonservierten Lysinrestes der Transaminase und die
Aldehydfunktion von PLP wird eine Schiff-Base gebildet, sodass der Cofaktor kovalent an das
Enzym gebunden ist. Im nächsten Schritt (Abb. 7 I) erfolgt eine nucleophile Substitution, wobei
das Aminodonor-Substrat den enzymatischen Lysinrest in der Schiff-Base ersetzt. Dieser
Zustand wird folglich als externes Aldimin bezeichnet. Der nun freie Lysinrest abstrahiert als
nächstes das Proton am α-Kohlenstoffatom des gebundenen Substrats, was die Bildung des
Chinoidintermediats zur Folge hat (Abb. 7 II). Durch die Umlagerung der Doppelbindungen
wird das entstehend Carbanion stabilisiert. Das delokalisierte Elektronensystem erlaubt
wiederum die Bindung des zuvor abstrahierten Protons an die C4'-Position des PLP, sodass
ein Ketimin entsteht (Abb. 7 III). Der Cofaktor PLP fungiert während der Katalyse also in erster
Linie als Elektronensenke[38]. Durch den nucleophilen Angriff eines Wassermoleküls auf das
α-Kohlenstoffatom des Ketimins entstehen PMP und ein Ketoprodukt, womit die erste
Halbreaktion beendet ist (Abb. 7 IV).
Zu Beginn der zweiten Halbreaktion bindet der Aminoakzeptor an PMP, wodurch wiederum
ein Ketimin entsteht (Abb. 7 V). Der weitere Zyklus verläuft quasi symmetrisch zur ersten
Halbreaktion. Durch die Freisetzung des Aminoprodukts wird aus dem externen Aldimin wieder
das interne Aldimin zurückgebildete, sodass ein neuer Zyklus beginnen kann.
1. Einleitung
8
Abbildung 7: Mechanismus der Transaminierung.[37]
1.6.2 Einteilung von Transaminasen
Die Klassifizierung von Transaminasen kann sowohl basierend auf ihrer Substratspezifizität
als auch entsprechend ihrer dreidimensionalen Struktur erfolgen[39]. Reaktionsbasiert erfolgt
die Unterteilung in α-, ω- und Amintransaminasen (ATAs) (Abb. 8). Substrate mit einer
Carboxylfunktion in α-Position zur Aminogruppe werden von α-Transaminasen akzeptiert.
Dagegen setzen ω-Transaminasen Substrate um, bei denen mindestens ein Kohlenstoffatom
zwischen der Aminogruppe und der Carboxylfunktion steht. Amintransaminasen sind als
Untergruppe der ω-Transaminasen zu verstehen und benötigen keine Carboxylgruppe im
Substratmolekül, wodurch sie besonders interessant für die Synthese optisch reiner Amine
ausgehend von prochiralen Ketonen sind.
Des Weiteren ist eine Einteilung aufgrund von Strukturähnlichkeiten möglich. Die PLP-
abhängigen Enzyme werden zunächst in sieben Faltungsklassen unterteilt: I) Aspartat-
1. Einleitung
9
Aminotransferasen, II) Tryptophan-Synthasen, III) Alanin-Racemasen, IV) die D-Aminosäure-
Familie, V) Glycogen-Phosphorylasen, VI) D-Lysin 5,6-Aminomutasen und VII) Lysin 2,3-
Aminomutasen[40]. Transaminasen findet man in den Faltungsklassen I und IV. Zusätzlich dazu
werden auch die Transaminasen untereinander aufgrund struktureller Eigenschaften und
Sequenzhomologien in weitere sechs Klassen eingeteilt[41].
Abbildung 8: Klassifizierung der Transaminasen basierend auf der Distanz zwischen der transferierten Aminogruppe und der Carboxylfunktion.[42]
1.6.3 Anwendung
Im Allgemeinen werden bei der Synthese optisch reiner Amine mit Transaminasen zwei
Reaktionstypen unterschieden: Die kinetische Racematspaltung (Abb. 9 A) und die asym-
metrische Synthese (Abb. 9 B). Bei einer Racematspaltung liegt der Aminodonor als
racemisches Gemisch vor. Durch die Transaminase wird bevorzugt eines der Enantiomere
umgesetzt, sodass im Idealfall das verbleibende Amin optisch rein vorliegt. Dabei kann die
Ausbeute maximal 50% betragen. Allerding ist es möglich, das entstandene Keton wieder in
situ chemisch oder enzymatisch zum racemischen Amin umzusetzen, wodurch theoretisch
auch Ausbeuten von 100% zugänglich werden. In diesem Fall spräche man von einer
dynamisch kinetischen Racematspaltung. In der asymmetrischen Synthese kann ein optisch
reines Amin mit bis zu 100% Ausbeute ausgehend von einem prochiralen Keton gebildet
werden.
Abbildung 9: Reaktionstypen der Transaminasen.
1. Einleitung
10
Da die Transaminase-katalysierte Reaktion reversibel ist, wird für eine höhere Ausbeute eine
Möglichkeit zur Verschiebung des Gleichgewichts benötigt. Dafür kann bereits ein Überschuss
des Aminodonors ausreichend sein. Es ist jedoch zu beachten, dass es je nach Donor und
Enzym schon bei vermeintlich geringen Konzentrationen zur Substratinhibierung des Enzyms
kommen kann. Abhängig von der Art des Donors stehen noch weitere Optionen zur Verfügung:
Wird Alanin als Donor verwendet, so kann das entstehende Co-Produkt Pyruvat durch den
Einsatz einer Alanindehydrogenase[43], einer Pyruvatdecarboxylase[44] oder einer Lactat-
dehydrogenase[45] aus der Reaktion entfernt werden. Dadurch verschiebt sich das
Gleichgewicht in Richtung des Aminprodukts. Akzeptiert die verwendete Transaminase auch
Isopropylamin als Donor, so kann das Gleichgewicht noch leichter verschoben werden, da das
entstehende Aceton bereits aufgrund seiner Flüchtigkeit aus dem Reaktionsgemisch entfernt
wird[46]. Auch die Entfernung des Aminprodukts während der Reaktion würde das
Gleichgewicht in die gewünschte Richtung verschieben, sodass der Aminodonor nicht in
großem Überschuss benötigt wird und durch ihn keine Substratinhibierung auftritt. Eine
Möglichkeit dafür wäre in situ Produkt-Kristallisation[47].
Der Einsatz von Transaminasen in der asymmetrischen Synthese wird limitiert durch sterisch
anspruchsvolle Substituenten[48], die grundsätzlich eher geringe Reaktivität vieler Ketone[49]
und besonders durch das eingeschränkte Substratspektrum vieler Wildtypenzyme[50]. Bei der
Überwindung dieser Schwierigkeiten konnten die Methoden des Proteins-Engineerings (s. 1.1
Enzyme und Biokatalyse) einen erheblichen Beitrag leisten. Das wohl bekannteste Beispiel für
den erfolgreichen Einsatz einer ATA ist die Synthese von Sitagliptin®, einem Antidiabetikum.
Dabei wird die Reaktion von Prositagliptin zu Sitagliptin® durch eine Variante der (R)-selektiven
ATA-117 aus Arthrobacter sp. katalysiert (Abb. 10).[48] Durch gerichtete Evolution der
Transaminase sowie den Einsatz von Isopropylamin als Aminodonor können mit diesem
Verfahren 92% Ausbeute bei >99,95%ee an Sitagliptin® erzielt werden, was ausreichend war,
um den zuvor genutzten Rhodium-katalysierten Prozess ersetzen zu können.
Abbildung 10: Transaminase-katalysierte Reaktion zur Herstellung von Sitagliptin®.[48]
1. Einleitung
11
1.7 Amindehydrogenasen
Amindehydrogenasen haben gegenüber anderen Biokatalysatoren, die zur Aminsynthese
verwendet werden können einen entscheidenden Vorteil: Sie erlauben die Verwendung der
günstigsten Stickstoffquelle, Ammoniak. Als Cofaktor benötigen sie NADH, wobei
Ameisensäure als Substrat für eine Formiatdehydrogenase zum Recycling eingesetzt werden
kann[18]. In der Natur vorkommende Amindehydrogenasen weisen jedoch oft eine viel zu
geringe Selektivität und Reaktivität für die reduktive Aminierung von industriell relevanten
Ketonen bzw. Aldehyden auf[51].
Das Reaktionsspektrum von Aminosäuredehydrogenasen ist normalerweise limitiert auf die
Reaktion von Ketosäuren zu Aminosäuren, jedoch konnten einige von ihnen in den letzten
Jahren durch Protein-Engineering zu Amindehydrogenasen für die Synthese chiraler Amine
weiterentwickelt werden[52–54]. In Abbildung 11 ist der vorgeschlagene Mechanismus für eine
Aminosäuredehydrogenase dargestellt. Essentiell sind dafür die Reste Lysin 68 und Lysin 80,
wobei Lysin 68 speziell für die elektrostatische Interaktion mit der Carboxylfunktion der
Aminosäure benötigt wird. Beim semi-rationalen Design der Leucindehydrogenase aus
Bacillus stearothermophilus zur Etablierung der Amindehydrogenase-Aktivität wurde daher
Lysin 80 unangetastet belassen, um die grundlegende katalytische Aktivität zu erhalten,
jedoch wurde Lysin 68 als Start für die Mutation des Enzyms gewählt. Tatsächlich enthielt die
finale Variante (LeuDH, K68S/E114V/N261L/V291C) nach mehreren Runden der Mutation an
dieser Position ein Serin.[52] Analog zur LeuDH wurde ebenfalls eine Phenylalanin-
dehydrogenase weiterentwickelt und durch Domain Shuffling konnten daraus noch zwei
weitere chimäre Amindehydrogenasen designt werden. Mittlerweile wurden weitere Enzyme
nach diesem Schema entwickelt und es wird versucht, das Substratspektrum durch Protein-
Engineering der bereits etablierten Enzyme noch zu erweitern[55].
Abbildung 11: Vorgeschlagener Mechanismus zur Desaminerung von L-Leucin durch eine Leucindehydrogenase. Farblich hervorgehoben sind die katalytisch relevanten Reste (Blau) und der Cofaktor NAD (Rot). I = L-Leucin; II = Iminiumion; III = Halbaminal; IV = Oxyanion; V = α-Ketoisocaproat. Modifiziert nach Sekimoto et al.[56]
1. Einleitung
12
1.8 β-chirale Amine
In der Gruppe der β-chiralen primären Amine finden sich viele Stoffe mit physiologischer
Wirksamkeit oder deren Bausteine. Diese werden hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, zur
Behandlung neurologischer Krankheitsbilder eingesetzt. Einige Beispiele für pharmazeutisch
relevante β-chirale Amine sind in Abbildung 12 dargestellt. Weitere Substanzen mit hohem
Marktwert sind die γ-Aminobuttersäure (GABA)-Derivate Pregabalin und Baclofen, die im
Folgenden noch im Detail vorgestellt werden (1.7.1 und 1.7.2).
Abbildung 12: Beispiele für pharmazeutisch relevante β-chirale Amine.
Bisher wurden nur sehr wenige Studien zur Herstellung β-chiraler Amine durch
Transaminierung publiziert. Ein Beispiel für den erfolgreichen Einsatz einer Transaminase in
einem solchen Prozess ist die Synthese von Niraparib, einem Anti-Tumor-Wirkstoff, der zur
Behandlung von Ovarialkarzinomen eingesetzt wird[57]. Dabei wurde ATA-301 aus dem
kommerziell erhältlichen Kit der Firma Codexis zur enantioselektiven (99%ee, 82% Ausbeute)
Bildung eines Intermediats verwendet (Abb. 13).
Abbildung 13: Transaminase-vermittelte Synthese von Niraparib.[57]
1.8.1 Pregabalin
Abbildung 14: (S)-Pregabalin.
Pregabalin (3-(Aminomethyl)-5-methylhexansäure) ist ein β-chirales Amin, welches seit 2004
als Lyrica® in den USA und der EU als Medikament zur Behandlung epileptischer Anfälle,
neuropathischer Schmerzen und generalisierter Angststörungen zugelassen ist[58]. Das von γ-
Aminobuttersäure (GABA) abgeleitete Molekül interagiert mit der α2δ-Untereinheit spannungs-
abhängiger Calcium-Kanäle, was zur reduzierten Freisetzung von Neurotransmittern und zu
1. Einleitung
13
einer verlangsamten postsynaptischen Erregbarkeit führt[59]. Dies entspricht einer Rückkehr
zum „normalen“ physiologischen Zustand der Synapsen. Die alleinige pharmakologische
Wirkung wird dabei dem (S)-Enantiomer von Pregabalin zugesprochen[60]. Seit 2006 wird ein
durch das Unternehmen Pfizer entwickeltes, chemoenzymatisches Verfahren mit einer Lipase
aus Thermomyces lanuginosus zur Herstellung von (S)-Pregabalin in kommerziellem Maßstab
eingesetzt[61].
Abbildung 15: Von Pfizer etabliertes Verfahren zur Synthese von (S)-Pregabalin.[61]
Bei der in Abbildung 15 dargestellten Syntheseroute handelt es sich bereits um eine
Verbesserung des ursprünglichen Verfahrens bezüglich dessen Umweltfreundlichkeit durch
eine höhere Ausbeute bei geringerem Abfallaufkommen[62]. Die erste industriell angewandte
Synthese wurde durch die Firma Parke-Davis entwickelt. Dabei wurde der Cyanodiester zuerst
decarboxyliert, allerdings chemisch statt thermisch, und hydrolysiert, woraufhin ebenfalls eine
Reduktion mit Raney-Nickel erfolgte, die jedoch zu racemischem Pregabalin führte, welches
durch diastereomeres Umkristallisieren mit (S)-Mandelsäure aufgelöst werden konnte[63].
Durch die Etablierung einer effizienten Synthese, bei der Pregabalin ausgehend von einem
Aldehyd durch eine Transaminase oder Amindehydrogenase gebildet würde, könnte die
Route, die das Pfizer-Verfahren vorgibt, allerdings verkürzt und optimiert werden.
1.8.2 Baclofen
Abbildung 16: (R)-Baclofen.
Baclofen (4-Amino-3-p-Chlorophenylbuttersäure) wurde erstmals 1962 als Medikament zur
Behandlung von Epilepsie eingesetzt[64], wobei es jedoch aufgrund der geringen Wirksamkeit
zunächst wenig Beachtung fand. Erst 1992 wurde es erfolgreich unter dem Namen Lioresal®
für die Behandlung von Parkinson, Chorea Huntington, multipler Sklerose und spastischer
1. Einleitung
14
Lähmungen, die zum Beispiel durch Verletzungen des Rückenmarks verursacht werden,
verabreicht. Außerdem verringert es den anregenden Effekt von Benzodiazepinen,
Barbituraten und ähnlichen neurologisch aktiven Substanzen[65]. Des Weiteren wird derzeit
eine Erweiterung der Indikation zur Behandlung von Alkoholismus diskutiert[66]. Wie auch bei
Pregabalin handelt es sich um ein GABA-Analogon, welches als selektiver GABAB-Rezeptor-
Agonist wirkt[67]. Baclofen wird bisher immer noch als racemisches Gemisch eingesetzt,
obwohl bereits bekannt ist, dass das (R)-Enantiomer eine ca. 100-fach höhere biologische
Aktivität aufweist als das (S)-Enantiomer[68,69]. Zudem beeinträchtigt (S)-Baclofen die Bindung
des (R)-Enantiomers[70]. Die bisher gängig in industriellem Maßstab eingesetzten Routen (s.
Abb. 17) führen zu racemischem Baclofen.
Abbildung 17: Zwei klassische chemische Syntheserouten für racemisches Baclofen nach A) Mann et al.[71] und B) Uchimaru et al.[72]
Durch die Alkylierung von 4-Chlorophenylacetonitril mit t-Butylbromoacetat und anschließende
Nitrilreduktion sowie saure Hydrolyse des t-Butylesters kann im ersten Syntheseweg Baclofen
dargestellt werden (Abb. 17 A). Ein zweiter Weg beginnt mit der Michael-Addition von
Nitromethan an 4-Chloro-Zimtsäureethylester. Anschließend erfolgt eine durch Raney-Nickel
katalysierte Reduktion zum korrespondierenden γ-Butyrolactam, welches daraufhin zu
Baclofen verseift werden kann (Abb. 17 B). Aufgrund der unterschiedlichen Wirksamkeit der
Enantiomere und des breiten Anwendungsspektrums ist die Etablierung einer enantio-
selektiven Synthese von großem wirtschaftlichem Interesse. Dementsprechend sind bereits
diverse chemische und einige biotechnologische Methoden zur Desymmetrisierung
racemischen Baclofens bzw. asymmetrischen Synthese von (R)-Baclofen untersucht
worden[65]. Eine chemische asymmetrische Synthese kann beispielsweise durch Ruthenium-
katalysierte Reduktion von Ethyl-4-chlorophenyl-benzoylacetat erfolgen, womit 26% isolierte
Ausbeute bei 90%ee erhalten werden konnten (Abb. 18A)[73]. Biotechnologisch kann eine
Racematspaltung durch eine Fermentation mit Streptomyces halstedii Nr. 39 ATCC erreicht
werden, da dieser Stamm das (S)-Enantiomer von Baclofen verstoffwechselt (Abb. 18 B)[74].
So kann die Ausbeute jedoch maximal 50% betragen. Ein biologischer Ansatz, welcher zum
enantiomerenreinen korrespondierenden Nitril von Baclofen führt, verwendet eine Old Yellow
Enzyme Variante (W116L, aus Saccharomyces cerivisiae). Anschließend erfolgt eine
Reduktion unter Anwesenheit von Nickel und Natriumborhydrid (Abb. 18 C)[75].
1. Einleitung
15
Abbildung 18: Weitere Herstellungsverfahren für (R)-Baclofen.
Die in Abbildung 18 dargestellten Syntheserouten führen alle zu verbesserungswürdigen
Umsätzen und Enantiomerenüberschüssen. Bisher wurde kein biotechnologisches Verfahren
zur asymmetrischen Synthese von Baclofen mit Hilfe von Transaminasen oder durch reduktive
Aminierung mit Amindehydrogenasen entwickelt, sodass diese Optionen in der vorliegenden
Arbeit untersucht werden sollten, um dadurch höhere optische Reinheiten und im Idealfall auch
bessere Umsätze zu erzielen.
1. Einleitung
16
2. Ziel
17
2. Ziel
Abbildung 19: Schema der angestrebten Synthese β-chiraler Amine.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines biokatalytischen Prozesses zur
Synthese β-chiraler Amine ausgehend von einem Aldehyd-Precursor durch asymmetrische,
reduktive Aminierung (Abb. 19). Als Modellverbindungen wurden Pregabalin und Baclofen
untersucht, die beide von hoher pharmazeutischer Relevanz sind. Jeweils eines der
Enantiomere – (S)-Pregabalin und (R)-Baclofen – weist nachweislich die höhere biologische
Aktivität auf, sodass der Bedarf für eine asymmetrische Syntheseroute besteht. In der
vorliegenden Arbeit sollte eine Synthese ausgehend von den freien Säuren sowie deren Ethyl-
und tert-Butylester berücksichtigt werden, da die Verwendung der Derivate die spätere
Aufarbeitung der Produkte aus dem Reaktionsgemisch deutlich erleichtern könnte.
Abbildung 20: Geplante Arbeitsschritte.
Eine kurze Übersicht der geplanten Arbeitsschritte ist in Abbildung 20 dargestellt. Für beide
Modellverbindungen war zunächst eine geeignete Methode für ein möglichst schnelles und
einfaches Hochdurchsatz-Screening der potenziellen Biokatalysatoren zu entwickeln. Dabei
sollte auch eine chirale Analytik etabliert werden, die im besten Fall zur Quantifizierung des
Umsatzes, der näheren Charakterisierung der gefundenen Enzyme und einer Optimierung der
Reaktionsbedingungen dienen sollte.
Ein Screening der verfügbaren Amintransaminase- und Amindehydrogenase-Varianten sollte
durchgeführt werden, um Enzyme zu identifizieren, die das jeweils gewünschte Produkt-
18
Enantiomer selektiv und mit möglichst hohem Umsatz bilden. Dafür sollten dann die besten
Reaktionsbedingungen ermittelt werden, inklusive eines geeigneten Aminodonors und – falls
nötig – eines Systems zur Gleichgewichtsverschiebung in Richtung der Produkte. Da von einer
racemischen Aldehyd-Vorstufe ausgegangen werden sollte, wurden zur Steigerung des
Umsatzes ebenfalls Bedingungen benötigt, unter denen das verbleibende Enantiomer des
Substrats racemisiert, um so eine dynamisch kinetische Racematspaltung zu ermöglichen.
Da die zu untersuchende Reaktion langfristig als industrieller Prozess etabliert werden sollte,
wäre es wünschenswert, die Reaktion möglichst kosteneffizient zu ermöglichen, zum Beispiel
durch den Einsatz von Zellextrakt anstelle gereinigten Enzyms, da die gängigen
Reinigungsmethoden oft hohen Zeit- und apparativen Aufwand bedeuten, insbesondere im
präparativen Maßstab. In Hinblick auf eine Anwendung im industriellen Maßstab sollten im
Rahmen dieser Arbeit auch erste Experimente zur Steigerung der Enzymproduktion und
Produktkonzentration durchgeführt werden.
3. Ergebnisse
19
3. Ergebnisse
3.1 Pregabalin
Da Pregabalin gegenüber Baclofen den höheren Marktwert besitzt und das bestehende Patent
von Pfizer für die Pregabalin-Synthese zu Projektbeginn auslief, wurde die Untersuchung
dieser Substanz als Modell für β-chirale Amine priorisiert.
3.1.1 Substratsynthese
Für das initiale Screening der Enzyme konnte zunächst kommerziell erhältliches Pregabalin
verwendet werden. Da jedoch für die eigentlich angestrebte biokatalytische Aminierung zur
Synthese von Pregabalin 3-Formyl-5-methylhexansäure bzw. deren Ethyl- und tert-Butylester
als Substrate benötigt wurden, wurden zu Projektbeginn Experimente zu deren Synthese
unternommen. Als Ausgangsmaterial für diese Stoffe sollte 4-Methyl-1-pentanal dienen,
welches wiederum ausgehend von kommerziell erhältlichem 4-Methyl-1-pentanol durch
Oxidation mit Pyridiniumchlorochromat synthetisiert werden kann[76] (s. Abb. 21).
Abbildung 21: Schematische Darstellung der Synthese von 4-Methyl-1-pentanal.
Die Reaktion wurde in Dichlormethan bei 0°C unter Stickstoffatmosphäre für 3 h durchgeführt.
Anschließend wurde das Reaktionsprodukt nach Filtration mittels Dünnschichtchroma-
tographie (DC) und Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC-MS) untersucht.
Abbildung 22: A) DC-Karte von 4-Methyl-1-pentanol (1) und Syntheseprodukt (2) gefärbt mit Vanillin. B) DC-Karte gefärbt mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin. C) GC-Chromatogramm des Syntheseprodukts, die Identifikation der gekennzeichneten Peaks erfolgte mittels MS.
Zur Färbung der Dünnschichtkarten wurde Vanillin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNP)
verwendet. Während Vanillin mit einer Vielzahl von Analyten reagiert, wird DNP für den
spezifischen Nachweis der Carbonylgruppen von Aldehyden und Ketonen verwendet. Daher
kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei dem Stoff mit dem höchsten
3. Ergebnisse
20
Retentionsfaktor (Rf=0,87) um 4-Methyl-1-pentanal handelt, da dieser mit beiden
Färbereagenzien detektiert wurde. Wie sowohl durch die mit Vanillin gefärbte DC- als auch die
GC-MS-Analytik ersichtlich wurde, enthielt das Rohprodukt noch starke Verunreinigungen von
mindestens zwei anderen Stoffen, die als nicht reagiertes Edukt bzw. weiter oxidiertes Produkt
(4-Methyl-1-pentansäure) identifiziert werden konnten (Abb. 22). Letzteres konnte durch einen
veränderten Versuchsaufbau zum Erhalt der Stickstoffatmosphäre mit Hilfe einer Schlenk-
Apparatur[77] im Gegensatz zu der Verwendung eines mit Stickstoff gefüllten Luftballons
deutlich verringert werden. Durch eine Verlängerung der Reaktionszeit um 2 h wurden
ebenfalls die Anteile des nicht-oxidierten Edukts verringert. Dennoch sollte das Produkt weiter
gereinigt werden, um störende Einflüsse bei nachfolgenden Synthesen zu minimieren. Eine
gängige Methode zur Reinigung von Aldehyden stellt die Fällung als Sulfit-Addukt dar (s. Abb.
23).
Abbildung 23: Bildung und Regeneration eines Aldehyd-Sulfit-Addukts.
4-Methyl-1-pentanal ließ sich mit Hilfe von Natriumhydrogensulfit als Sulfit-Addukt ausfällen.
Dabei entstand 1 g des kristallinen Addukts, was bezogen auf den reinen synthetisierten
Aldehyd ca. 15% Ausbeute entsprochen hätte. Allerdings konnten nach der Regeneration im
größeren Maßstab keine Spuren des Aldehyds mehr detektiert werden, sodass diese Methode
verworfen wurde. Da sich bereits die Synthese des Ausgangsstoffes für die eigentlich
benötigten Substrate als wenig effektiv und vor allem als sehr zeitaufwändig erwies, wurden
im Folgenden sämtliche Synthesen durch den Projektpartner als externe Aufträge vergeben,
sodass die Fokussierung auf die Etablierung analytischer Methoden und des Screenings
erfolgen konnte.
3.1.2 Analytik von Pregabalin
Um zukünftige Screening-Ergebnisse möglichst schnell qualitativ und quantitativ auswerten zu
können, wurde zunächst die Analytik des Reaktionsprodukts Pregabalin priorisiert. Zudem war
dieses auch leichter verfügbar als die später zu verwendenden Substrate, sodass für das
initiale Screening die Desaminierung von Pregabalin gewählt wurde. Wünschenswert war eine
Methode, die parallel die Bestimmung der Enantiopräferenz des jeweiligen Enzyms sowie die
Quantifizierung des Umsatzes erlauben würde. Die meisten in der Literatur beschriebenen
Ansätze betreffen die Quantifizierung aus therapeutischen Formulierungen[78] und waren
daher oder aus anderen Gründen (benötigte Geräte, hoher Aufwand[79]) für die Aufarbeitung
aus Biokatalysen größtenteils ungeeignet. Es wurde daher beschlossen, eine andere Methode
zu etablieren. Als mögliche Alternative wurde die Derivatisierung mit Hilfe von
Ethylchloroformiat und anschließender chiraler GC-Analytik untersucht (Abb. 24)[80].
3. Ergebnisse
21
Abbildung 24: Derivatisierung von Pregabalin mit Ethylchloroformiat (ECF).
Die in der Literatur beschriebene Methode zur Derivatisierung konnte nach geringfügigen
Modifikationen, wie zum Beispiel vorangegangenem Ansäuern der Probe und einer größeren
Menge Ethylchloroformiat, auf Pregabalin angewandt werden. Ohne diese Anpassungen
wurden ein bzw. zwei weitere Peaks (bei racemischem Pregabalin) festgestellt; dies ließ auf
eine unvollständige Derivatisierung schließen und konnte durch sukzessive Erhöhung der
Säuremenge und des Gehalts an Ethylchloroformiat während der Reaktion behoben werden.
Durch die Verwendung von Chloroform als Lösungsmittel und die Tatsache, dass das Derivat
kaum wasserlöslich war, konnte das Produkt direkt extrahiert und für die GC-Analytik
verwendet werden. Dazu wurden verschiedene chirale Säulen (CP-Chirasil-Dex DB, Hydrodex
β-TbdAc und Hydrodex β-3P) mit verschiedenen Temperaturprogrammen getestet. Eine
zufriedenstellende Trennung der Enantiomere bis auf Basislinien-Niveau konnte auf der Säule
Hydrodex β-3P erzielt werden (Methode s. 6.10.3.6). Da sowohl racemisches als auch (S)-
Pregabalin verfügbar waren, konnten die Peaks auch ohne großen Aufwand dem
entsprechenden Enantiomer zugeordnet werden (Abb. 25 A). Eine vermessene Kalibrierreihe
zeigte, dass die Methode sich auch zur Quantifizierung und damit zur späteren Bestimmung
des Umsatzes in Biokatalysen eignete (Abbildung 25 B). Die Methode sollte zudem auch
analog auf die Ester anwendbar sein, wobei eventuell die GC-Analytik hinsichtlich der Heizrate
hätte angepasst werden müssen. Dies wurde jedoch nicht weiter untersucht, da zu diesem
Zeitpunkt die entsprechenden Substanzen noch nicht verfügbar waren.
Abbildung 25: A) GC-Chromatogramm von ECF-derivatisiertem Pregabalin. Schwarz: rac-Pregabalin, blau: (S)-Pregabalin. B) Kalibrierkurve für ECF-derivatisiertes rac-Pregabalin.
3. Ergebnisse
22
3.1.3 Screening der Amintransaminasen
Aufgrund der zu Projektbeginn eingeschränkten Verfügbarkeit der Substrate, wurde zunächst
ein Screening in der Richtung der Desaminierung des gewünschten Produkts durchgeführt.
Dafür konnte günstiges, kommerziell erhältliches rac-Pregabalin verwendet werden. Für die
Untersuchung der internen Transaminase-Toolbox, welche hunderte Enzyme und daraus
erstellte Varianten umfasst, sollte zudem ein möglichst einfaches Screening-Verfahren
verwendet werden.
Als besonders effizient für das Screening wurde die Durchführung von Biokatalysen in kleinem
Maßstab (200 µL in 96-Well-Platten) mit Pregabalin und Pyruvat erachtet. Parallel zu diesen
Reaktionen konnten verbrauchtes Pregabalin und gebildetes Alanin leicht mittels Dünnschicht-
chromatographie und Ninhydrin-Färbung qualitativ analysiert werden, weil beide Stoffe mit der
gewählten Methode sehr unterschiedliche Retentionsfaktoren aufwiesen (Rf Alanin = 0,22 und
Rf Pregabalin = 0,74). Es wurde festgestellt, dass bei der Verwendung von Zellextrakt die
enthaltenen Aminosäuren die Farbreaktion als spezifischen Nachweis für Amine stören
(Abb. 26), daher musste eine Reinigung der Enzyme erfolgen, die ebenfalls möglichst effizient
im 96-Well Maßstab durchführbar sein sollte, sodass auch geringe Mengen gebildeten Alanins
detektierbar sein würden.
Abbildung 26: Dünnschichtkarte mit 1) 10 mg/mL Pregabalin in A. dest, 2) 10 mg/mL Pregabalin in ATA-Zellextrakt aus einer 1 mL-Kultivierung, 3) ATA-Zellextrakt aus einer 1 mL-Kultivierung. Als Laufmittel diente n-Butanol, Wasser und Eisesseig im Verhältnis 4:1:1, gefärbt wurde mit Ninhydrin.
Da alle zu screenenden Enzyme über einen His6-Tag verfügten, konnte dies mittels
immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) erfolgen. Dafür wurden
kommerziell erhältliche His-Select®-Filterplatten (Sigma) verwendet. Damit konnten für alle
Enzyme zufriedenstellende Reinheiten erzielt werden, wie in Abbildung 27 exemplarisch in
einem SDS-PAGE-Gel für das Enzym 3HMU dargestellt ist. Trotz einiger Verluste in den
Durchflussfraktionen wurden auch annehmbare Ausbeuten von durchschnittlich 1 mg/mL
Proteingehalt erreicht.
3. Ergebnisse
23
Abbildung 27: SDS-PAGE-Gel der Reinigung der ATA 3HMU (Wildtyp) mit Hilfe von His-Select®-Filterplatten nach Expression im 1 mL-Maßstab. 1) Durchfluss, 2) Waschfraktion, 3) Eluat, M = Roti-Mark Standard.
Nach der erfolgreichen Reinigung wurden über 100 Transaminasen und deren vorhandene
Varianten in 24-stündigen Biokatalysen mit Pregabalin und Pyruvat eingesetzt. Bei der
anschließenden Analyse der Proben mittels DC wurden insgesamt sechs Enzyme identifiziert
(Tab. 2), bei denen die Bildung von Alanin festgestellt werden konnte (s. Abb. 28, beispielhaft
für 3HMU-Varianten).
Abbildung 28: Dünnschichtkarte mit Biokatalysen von 3HMU-Varianten nach 24 h. Biokatalyse-bedingungen s. 6.10.2.7. Als Positivkontrolle wurden Pregabalin und Alanin verwendet (Pgb Ala K). Als Laufmittel diente n-Butanol, Wasser und Eisesseig im Verhältnis 4:1:1, gefärbt wurde mit Ninhydrin.
Tabelle 2: Im Screening auf Umsatz von Pregabalin gefundene Transaminasen:
Enzym Ursprung Mutation
3HMU Ruegeria pomeroyi F92Y
Vfl Vibrio fluvialis L56A
V153G
A228C
A228G
F85L/V153A
Zunächst wurde das Enzym 3HMU F92Y näher charakterisiert. Dazu erfolgten Expression im
400 mL-Maßstab, Reinigung und Biokatalysen im 700 µL-Maßstab. Aufgrund der Substrat-
verfügbarkeit wurde weiterhin die Desaminierung untersucht. Dabei konnte festgestellt
werden, dass diese ATA-Variante scheinbar das unerwünschte (R)-Enantiomer von
Pregabalin bevorzugt (s. Abb. 29), sodass von weiteren Experimenten abgesehen wurde.
3. Ergebnisse
24
Abbildung 29: GC-Chromatogramm ECF-derivatisierter Proben von Biokatalysen mit 3HMU F92Y nach 2 h (schwarz) und 24 h (blau) Reaktionszeit.
3.2 Revision der Modell-Verbindung
Im Laufe der experimentellen Arbeiten wurde ein neues von der Firma Pfizer eingereichtes
Patent publiziert[81]. In diesem wird unter anderem die Synthese von Pregabalin durch
Transaminase-vermittelte asymmetrische Aminierung beansprucht. Auch Syntheserouten für
die Aldehyd-Substrate sowie die mögliche Verwendung von Amindehydrogenasen fanden
Erwähnung, sodass von dem hier ursprünglich vorgesehenen Projekt abgewichen werden
musste. Letztendlich wurde eine ausschließliche Fokussierung des Projekts auf die alternative
Modellverbindung für β-chirale Amine, Baclofen, beschlossen, für die noch keine
entsprechende enzymatische Synthese gezeigt werden konnte. Dabei blieb die geplante
Vorgehensweise dieselbe wie zuvor. Alle weiteren Arbeiten an der Synthese von Pregabalin
wurden jedoch an diesem Punkt eingestellt.
3.3 Baclofen
Als weitere Modellverbindung für das Enzymscreening wurde Baclofen (4-Amino-3-(4-
chlorphenyl)buttersäure) verwendet. Wie im Fall von Pregabalin stand zunächst die
Etablierung einer geeigneten Analytik im Vordergrund, insbesondere für das zu bildende
Produkt. Des Weiteren wurden Amindehydrogenasen als mögliche Biokatalysatoren für die
gewünschte Reaktion untersucht, welche freundlicherweise von Prof. Bommarius (Georgia
Institute of Technology, USA) bereitgestellt wurden. Auch die zu durchmusternden
Transaminasen wurden um einige Varianten aus der Arbeitsgruppe von Prof. Bornscheuer
(Universität Greifswald) erweitert.
3.3.1 Analytik
3.3.1.1 Produkt
Um parallel mit dem Screening der Enzyme beginnen zu können, wurde zunächst untersucht,
ob sich die bereits für Pregabalin bewährte Dünnschichtchromatografie ebenfalls auf Baclofen
anwenden ließ. Auch in diesem Fall konnte unter identischen Bedingungen eine sehr gute
Trennung von Baclofen und Alanin erzielt werden (Rf Alanin = 0,32 und Rf Baclofen = 0,74).
3. Ergebnisse
25
Diese Methode wurde wiederum verwendet, um Transaminasen in Richtung der
Desaminierung von Baclofen zu screenen.
Weiterhin wurde eine Methode zur chiralen Analytik von in Biokatalysen gebildetem Baclofen
benötigt. Auch dabei wurden zuerst Experimente zur Übertragung der Analytik für Pregabalin
durchgeführt. Eine Detektion mittels Gaschromatographie war nach der Derivatisierung mit
Ethylchloroformiat möglich. Allerdings konnten weder mit der für Pregabalin entwickelten
Methode noch mit allen anderen verfügbaren chiralen Säulen und verschiedenen
Temperaturprogrammen eine Trennung der Enantiomere erzielt werden. Daher wurde die
Gaschromatographie als Methode verworfen und weitere Untersuchungen zur möglichen
Trennung mittels Kapillarelektrophorese (CE) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) vorgenommen. Dabei konnte mit Hilfe der CE relativ schnell eine einfache Methode
für reines Baclofen entwickelt werden, welche durch den Zusatz von hochsulfatierten
Cyclodextrinen (HS-CD) als chirale Selektoren auch eine Trennung der Enantiomere
ermöglichte. Untersucht wurden HS-α-CD und HS-β-CD, wobei 5% (w/v) dem Trennpuffer
zugesetzt wurden.
Abbildung 30: A) Überlagerte Elektropherogramme von Baclofen mit hochsulfatierten Cyclodextrinen: 1) HS-α-CD, 2) HS-β-CD. B) Elektropherogramm von rac-Baclofen versetzt mit 1 µL 10 mM (R)-Baclofen und HS-β-CD. Bedingungen: 10 mM rac-Baclofen; fused silica Kapillare, 30 cm (20 cm effektive Länge) x 50 µm ID; 25 mM TEA-Phosphat-Puffer (pH 3,0) mit 5% w/v HS-CD; UV-Detektion bei 200 nm; reverse Polarität; kathodische Injektion: 0,5 psi für 3 s; Trennung bei 10 kV für 15 min.
Wie in Abbildung 30 ersichtlich wird, konnte nur eine Antrennung mit HS-α-CD erreicht werden.
Jedoch ermöglichte die Verwendung von HS-β-CD eine hervorragende Auflösung der
Enantiomere. Durch Zusatz von reinem (R)-Baclofen konnte außerdem das erste der beiden
Signale dem gewünschten Enantiomer zugeordnet werden. Da hochsulfatierte Cyclodextrine
relativ kostenintensiv sind, wurden weitere Versuche zur benötigten Cyclodextrin-
Konzentration unter Berücksichtigung von Selektivität und Auflösung vorgenommen. Dabei
wurde festgestellt, dass bereits mit 2% HS-β-CD eine zufriedenstellende Trennung erzielt
werden konnte. Obwohl die entwickelte CE-Methode zuerst sehr vielversprechend erschien,
wurde festgestellt, dass die Methode für einen hohen Probendurchsatz nicht robust genug war.
3. Ergebnisse
26
Daher wurden daraufhin weitere Experimente zu einer alternativen Analytik mittels HPLC
unternommen.
Wie bereits im Fall von Pregabalin, sind auch für Baclofen zahlreiche Methoden zur
Untersuchung pharmazeutischer Formulierungen publiziert, die keine Aufarbeitung aus
biologischem Material erfordern, oder aber mit den verfügbaren Instrumenten nicht realisierbar
waren. Daher wurden mehrere potenzielle Methoden getestet. Mit underivatisiertem Baclofen
konnte an keiner der getesteten chiralen Säulen eine Antrennung erzielt werden. Auch eine
publizierte Methode zum Vorsäulen-Ligandenaustausch mit anschließender Analytik über eine
achirale Säule führte nicht zum gewünschten Ergebnis[82]. Daraufhin wurden die Reaktionen
von Baclofen mit o-Phthalaldehyd (OPA) und Dansylchlorid, beides etablierte Methoden zur
Derivatisierung von primären Aminen (Abb. 31)[83], untersucht. Die OPA-Derivate erwiesen
sich dabei als sehr instabil, was bei einem hohen Probendurchsatz unvorteilhaft wäre.
Außerdem konnte auch hier keine gute Trennung der Enantiomere erreicht werden. Die
Derivatisierung mit Dansylchlorid erschien als vielversprechende Alternative, da damit eine
Trennung auf Basislinien-Niveau erzielt wurde (Abb. 31). Allerdings galt dies nur für reine
Baclofen-Proben. Bei der Vermessung von Proben mit simulierten, in Biokatalysen zu
erwartenden Umsätzen traten Überlagerungen mit den als Aminodonor geplanten Substanzen
(Alanin, Isopropylamin, α-Methylbenzylamin) auf, die nicht aufgelöst werden konnten.
Abbildung 31: A) Derivatisierung von Aminen mit Dansylchlorid (oben) und o-Phthalaldehyd (unten). B) Ausschnitt aus einem HPLC-Chromatogramm von Dansylchlorid-derivatisiertem rac-Baclofen. Bedingungen: ACN:H2O (mit 0,1% TFA) 30:70; 0,4 mL/min; Detektion bei 254 nm; Säule CHIRACEL OD-RH.
Eine erfolgreiche Methode konnte letztendlich mit Hilfe der für chirale Aminosäure-Analytik
konzipierten Säule Chirex 3126 (Phenomenex) erzielt werden (Abb. 32). Die vom Hersteller
vorgeschlagene Applikation konnte nach geringen Modifikationen an Baclofen angepasst
werden. Auch mit Biokatalyseproben, die lediglich durch Proteinpräzipitation (sauer oder mit
eiskaltem Acetonitril) aufbereitet wurden, konnte das Reaktionsprodukt qualitativ und
quantitativ ohne störende Einflüsse bestimmt werden. Nach einer sauren Hydrolyse, die
gleichzeitig die in der Probe enthaltenen Proteine ausfällt, konnten außerdem auch die Ethyl-
und t-Butyl-Derivate von Baclofen getrennt und quantifiziert werden, sodass diese Methode im
weiteren Projektverlauf zur näheren Charakterisierung der aus dem Screening erhaltenen
Enzyme und zur Untersuchung und Optimierung der Reaktionsbedingungen verwendet wurde.
3. Ergebnisse
27
Abbildung 32: Ausschnitt aus einem HPLC-Chromatogramm einer simulierten Biokatalyse-Probe mit 10 mM rac-Baclofen, zusätzlichen 5 mM (R)-Baclofen und 100 mM Alanin. Bedingungen: Phenomenex Chirex 3126, mobile Phase: 2 mM CuSO4 in A. dest:Isopropanol 85:15, 1 mL/min Fluss, Detektion bei 225 nm.
In Tabelle 3 sind die untersuchten analytischen Methoden und die damit jeweils erhaltenen
Ergebnisse zusammengefasst.
Tabelle 3: Zusammenfassung der untersuchten Methoden zur chiralen Analytik von Baclofen:
Methode Ergebnis
GC Derivatisierung mit Ethylchloroformiat (4
chirale Säulen, variierte
Temperaturprogramme)
Schwache Antrennung
CE HS-CD als chirale Selektoren Gute Trennung, Methode
unzuverlässig für hohen
Durchsatz
HPLC Ohne Derivatisierung (3 chirale Säulen,
reversed phase)
Keine Trennung
Vorsäulen-Ligandenaustausch und achirale
Säule
Schwache Antrennung, nicht
quantitativ
OPA-Derivatisierung Unvollständige Derivatisierung
mit instabilen Derivaten, keine
gute Trennung
Dansylchlorid-Derivatisierung Stabile Derivate und sehr gute
Trennung, Überlagerung mit
Reaktionskomponenten
Chirex 3126 ohne Derivatisierung Gute Trennung, quantitativ,
auch bei hohem Durchsatz
zuverlässig
3.3.1.2 Substrat
Zur Steigerung des Umsatzes der Zielreaktion wurde eine in situ Racemisierung des
verbleibenden Substrat-Enantiomers angestrebt. Um dies überprüfen und optimieren zu
können, wurde ebenfalls eine chirale Analytik für das Substrat benötigt. Aus Gründen der
einfacheren Aufarbeitung von Substrat und Produkt aus der Reaktion wurde das tert-Butyl-
genauer untersucht. Dieses ließ sich mit Chloroform leicht aus der Biokatalyse extrahieren und
3. Ergebnisse
28
konnte direkt ohne vorherige Modifikation in die GC injiziert werden. Nach Experimenten mit
den vorhandenen chiralen Säulen konnte eine Antrennung mit Hilfe der Säule Chirasil-Dex CB
(Agilent) erzielt werden, die als ausreichend erachtet wurde, um einzuschätzen, ob ein
racemisches Gemisch vorliegt (Abb. 33). Die Methode eignete sich außerdem zur
quantitativen Bestimmung des Substrat-Verbrauchs.
Abbildung 33: GC-Chromatogramm einer Biokatalyse-Probe mit 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester.
Da keine enantiomerenreinen Proben des Substrats zur Verfügung standen, konnten die im
GC-Chromatogramm aufgezeichneten Peaks nicht zweifelsfrei den Enantiomeren zugeordnet
werden. Da die in Abbildung 33 dargestellte Probe jedoch aus einer Reaktion unter nicht-
racemisierenden Bedingungen mit einem Enzym stammte, welches bevorzugt (R)-Baclofen
bildet, konnte angenommen werden, dass es sich beim ersten und kleineren der beiden
Signale um den (R)-Aldehyd handelte.
3.3.2 Enzymscreening
3.3.2.1 Amindehydrogenasen
Wie bereits erwähnt, wurden für die Synthese β-chiraler Amine neben Amintransaminasen
auch Amindehydrogenasen als Biokatalysatoren in Erwägung gezogen. Drei durch Protein
Engineering entwickelte Enzyme wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Andreas Bommarius
zur Verfügung gestellt: LeuDH, welche basierend auf einer Leucindehydrogenase (Bacillus
stearothermophilus) entwickelt wurde[52], PheDH, bei der von einer Phenylalanin-
dehydrogenase (Bacillus badius) ausgegangen wurde[53] und CFL1, ein aus den beiden
ersteren erstelltes chimäres Enzym[54]. Da sich CFL1 nur durch eine veränderte
Aminosäureposition (Asn271Leu) von einer weiteren Chimäre, CFL2, unterscheidet, wurde
diese vierte Amindehydrogenase mit Hilfe einer QuikChange™ erstellt. Nach Bestätigung der
Sequenz von CFL2 wurden alle vier Enzyme in Anlehnung an die publizierten Methoden[52,54]
exprimiert und gereinigt. Als Expressionsstamm wurde, wie beschrieben, E. coli BL21 (DE3)
verwendet, allerdings wurde die Expression in TB-Medium anstatt MagicMedia™ (Invitrogen)
durchgeführt, sodass manuell mit IPTG induziert werden musste. Außerdem erfolgte die
Inkubation nicht bei 37°C für 24 h, sondern bei 37°C bis zur Induktion mit 0,1 mM IPTG nach
etwa 2 h bis zum Erreichen von OD600~0,8 und anschließend für ca. 20 h bei 20°C. Die
nachfolgende Reinigung konnte mittels immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie
(IMAC) erfolgen, da die Enzyme bereits mit einem C-terminalen His6-Tag modifiziert waren.
Dafür wurde zunächst ein Cobalt-haltiges Säulenmaterial (TALON®, Clontech, USA) in
Handsäulen verwendet. Dabei fielen jedoch Proteine aus dem Zellextrakt aus und verstopften
3. Ergebnisse
29
die Säule, ein Problem, das bei der Reinigung anderer Enzyme mit dieser Methode in den
meisten Fällen nicht auftritt. Deshalb wurde die Reinigung im weiteren Verlauf automatisiert
mittels Ni-NTA-Säulen an der Äkta durchgeführt, wobei keine störenden Präzipitate
entstanden. Auch die Reinigungspuffer wurden im Vergleich zur Literatur leicht modifiziert (s.
6.10.2.2).
Abbildung 34: SDS-PAGE-Gel der mittels Äkta gereinigten Amindehydrogenasen. M = Roti-Mark Standard.
Das in Abbildung 34 dargestellte SDS-PAGE-Gel nach der Reinigung der Enzyme zeigt, dass
für alle vier Amindehydrogenasen eine moderate Reinheit erzielt werden konnte. Auch die
Ausbeuten waren zufriedenstellend, insbesondere für CFL1. Allerdings konnte nur eine
äußerst geringe Menge der CFL2 hergestellt werden, weshalb im SDS-PAGE-Gel nur eine
sehr schwache Bande bei ca. 40 kDa zu erkennen ist.
In einem photometrischen NADH-Assay wurde untersucht, ob die gereinigten Amin-
dehydrogenasen Aktivität gegenüber den drei Aldehyd-Vorläufern von Baclofen zeigten. Dabei
wurde davon ausgegangen, dass die Abnahme von NADH äquivalent der Bildung der
Aminprodukte ist.
Tabelle 4: Volumetrische Aktivitäten der gereinigten Amindehydrogenasen gegenüber den Modellsubstraten. Die Aktivitäten wurden mit Hilfe eines photometrischen NADH-Assays bestimmt (s. 6.10.3.2):
Aktivität [mU/mL]
Enzym Säure Ethylester t-Butylester
PheDH 5,2 2,1 -
LeuDH - 2,5 5,4
CFL1 - - -
CFL2 - 3,3 0,9
Bei der photometrischen Aktivitätsbestimmung der Amindehydrogenasen konnten zwar für
jedes der Modellsubstrate niedrige Aktivitäten festgestellt werden (s. Tab. 4). Da NADH jedoch
auch in Nebenreaktionen von Verunreinigungen durch andere Enzyme verbraucht werden
kann und die gemessenen Aktivitäten ausgesprochen gering waren, sollte die Produktbildung
ebenfalls untersucht werden. In den anschließend durchgeführten Biokatalysen konnte jedoch
3. Ergebnisse
30
kein Produkt detektiert werden, selbst mit einem zusätzlichen System zur
Gleichgewichtsverschiebung mittels Formiatdehydrogenase in Ammoniumformiatpuffer[84]. Da
die Aktivität scheinbar unter der Nachweisgrenze des Produkts lag, wurden die
Amindehydrogenasen für die angestrebte Synthese als ungeeignet betrachtet, sodass in allen
weiteren Experimenten die Verwendung von Amintransaminasen vorgezogen wurde.
3.3.2.2 Amintransaminasen
Für das Screening der Amintransaminasen auf den Umsatz von Baclofen wurde zunächst
dieselbe Methode verwendet, wie bereits für Pregabalin: Expression im 1 mL-Maßstab,
anschließende Reinigung mittels IMAC im 96-Well-Format und Biokatalysen im 200 µL-
Maßstab mit paralleler Analytik durch Dünnschichtchromatographie. Dadurch konnten erste
aktive Enzyme detektiert werden. Abbildung 35 zeigt beispielhaft die Screening-Ergebnisse
einiger 3HMU-, 3FCR- und 3I5T-Varianten, bei denen für vier 3HMU-Varianten durch die
Desaminierung von Baclofen gebildetes Alanin detektiert wurde.
Abbildung 35: Dünnschichtkarten mit Biokatalysen von 3HMU-, 3FCR- und 3I5T-Varianten nach 24 h. Biokatalysebedingungen s. 6.10.2.7. Als Positivkontrolle wurde Alanin verwendet (Ala K). Als Laufmittel diente n-Butanol, Wasser und Eisesseig im Verhältnis 4:1:1, gefärbt wurde mit Ninhydrin.
Sobald die Aldehyd-Precursor zur Verfügung standen, konnte das Screening zudem auch in
Richtung der gewünschten Aminierungsreaktion erfolgen. Dafür wurden die gereinigten
Amintransaminasen in einem photometrischen Acetophenon-Assay[85] eingesetzt, bei dem als
Aminodonor je nach Präferenz der Enzyme α-Methylbenzylamin (α-MBA), α-Ethylbenzylamin
(α-EBA) oder α-Isopropylbenzylamin verwendet wurden. Dadurch konnte die Aktivität der im
DC-Screening aufgefundenen Enzyme bis auf 3HMU F92Y bestätigt werden. Auch einige
weitere Varianten, die erst im späteren Projektverlauf zur Verfügung standen, wurden mit Hilfe
des Acetophenon-Assays untersucht.
Insgesamt wurden bei dem Screening der Amintransaminasen 15 potenzielle Biokatalysatoren
für die Zielreaktion gefunden. Die aktiven Varianten waren auf fünf ATAs bzw. deren Varianten
begrenzt: Die Enzyme aus Chromobacterium violaceum (Cvi), Silicibacter pomeroyi (3HMU),
3. Ergebnisse
31
Ruegeria sp. TM1040 (3FCR) und Vibrio fluvialis (Vfl), die alle für α-chirale Amine als (S)-
selektiv annotiert sind sowie aus Arthobacter sp. KNK168 (V306I) ((R)-selektiv). Zur
Untersuchung der Enantiopräferenz und des Umsatzes der Aminierungsreaktion wurden die
aktiven Enzyme im 400 mL-Maßstab exprimiert, mittels Äkta gereinigt und in Biokatalysen im
700 µL-Maßstab eingesetzt. Dabei wurden als Substrate 250 mM L-Alanin und 20 mM des
jeweiligen Aldehyds bei pH 8 verwendet. Zur Analyse wurde die in 3.3.1.1 beschriebene HPLC-
Methode verwendet, mit der sowohl die Produktbildung als auch der Enantiomerenüberschuss
des Produkts bestimmt werden konnten (s. Tab. 5).
Tabelle 5: Charakterisierung der aus dem photometrischen bzw. DC-Screening erhaltenen ATA-Varianten bezüglich des Umsatzes (Produktbildung) und des Enantiomerenüberschusses für die Modellsubstrate:
Enzym Säure Ethylester t-Butylester
Umsatz
[%]
%ee Umsatz
[%]
%ee Umsatz
[%]
%ee
Cvi WT 19,5 70,4 (S) - - - -
Cvi 88V 27,7 77,3 (R) 8,2 64,2 (R) - -
Cvi 88L 28,1 73,1 (R) 6,6 69,3 (R) 7,9 11,1 (S)
Cvi 88L 418L 18,5 91 (R) 5,6 86,3 (R) 5,1 34,1 (S)
Cvi 88L 418G 21,8 66,3 (R) 11,1 1,1 (R) 13,7 58,4 (S)
3HMU WT 26,3 42,7 (S) - - - -
3HMU 91 A 34,9 20,4 (S) - - - -
3HMU 233S 36,6 60,7 (R) - - - -
3HMU 419M 24,7 83,8 (S) - - - -
3FCR 59W 231A - - 8,1 72,6 (R) - -
3FCR 59W 87F
152F 231A
- - 5,9 55,3 (R) - -
3FCR 59W 87L
231A 382M 429A
- - 4,7 58,9 (R) 48,5 99 (R)
Vfl 56V 57C 153A
415F 417A*
62,5 97,6 (R) 35,3 64,6 (R) 21,4 85,3 (R)
Vfl 56V 57C 85V* 9,3 99 (R) 18,5 93,6 (R) 24,3 75,6 (R)
ArRmut11 117F
279A*
55,5 99 (R) - - - -
Die mit * gekennzeichneten Varianten wurden im Zellextrakt eingesetzt, alle anderen wurden
zuvor mittels Äkta gereinigt.
Unter den Varianten der Cvi konnten zwar Umsätze für alle drei der eingesetzten Substrate
gefunden werden, diese waren jedoch vergleichsweise gering und es wurde teilweise das
unerwünschte (S)-Enantiomer im Überschuss gebildet, weshalb keine weiteren Arbeiten mit
dieser Amintransaminase durchgeführt wurden. Für die ATA 3HMU wurde, wie bereits nach
dem Screening vermutet, festgestellt, dass ausschließlich die freie Säure umgesetzt wurde.
Des Weiteren wurde auch hierbei (S)-Baclofen bevorzugt gebildet. Hervorzuheben ist die
Variante 3HMU A233S, welche die gewünschte Enantiopräferenz aufwies und daher für
weitere Untersuchungen in Betracht gezogen wurde.
3. Ergebnisse
32
Bis auf eine Fünffach-Variante (3FCR 59W 87L 231A 382M 429A; im Folgenden 3FCR_5M),
zeigten auch die 3FCR-Varianten nicht die erhofften Eigenschaften. 3FCR_5M hingegen wies
einen zufriedenstellenden Umsatz und einen hervorragenden Enantiomerenüberschuss für die
Bildung des tert-Butylester-Derivats auf. Da dieser Ester insbesondere in Hinblick auf die
Produktaufarbeitung aus einer wässrigen Reaktion durch Extraktion mit organischem
Lösungsmittel interessant ist, wurde dieses Enzym für weitere Experimente gegenüber allen
anderen bevorzugt. Die Vfl- und ArR-Varianten wurden später als die übrigen Enzyme zur
Verfügung gestellt, sodass nicht weiter mit ihnen gearbeitet wurde. Zwei von ihnen zeigten
jedoch vielversprechende Ergebnisse insbesondere für die Synthese der freien Säure.
Untersuchungen zur biokatalytischen Herstellung der freien Säure wurden ausschließlich mit
3HMU A233S durchgeführt. Getestet wurden unter anderem α-MBA und Isopropylamin (IPA)
als alternative Aminodonoren, um dadurch möglicherweise einen höheren Umsatz erzielen zu
können. Die dabei verwendeten Konzentrationen der Aminodonoren (100, 200 und 500 mM)
führten jedoch zu keiner Produktbildung. Des Weiteren wurde die Reaktion mit Alanin bei
verschiedenen pH-Werten untersucht, da einerseits die meisten Transaminasen ein pH-
Optimum im basischeren Bereich (pH 9-10) aufweisen und andererseits das verbleibendes
Aldehyd-Enantiomer bei höheren pH-Werten durch Keto-Enol-Tautomerie racemisieren
könnte, was sich auch positiv auf den Umsatz und den Enantiomerenüberschuss auswirken
würde.
Abbildung 36: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen mit gereinigter 3HMU A233S, die bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt wurden. Die Reaktionszeit betrug 20 h, es wurden 250 mM Aminodonor und 20 mM Aminoakzeptor eingesetzt (Bedingungen s. 6.10.2.7).
Wie aus Abbildung 36 ersichtlich wird, konnte der Umsatz nicht signifikant verbessert werden,
auch der Enantiomerenüberschuss nahm mit steigendem pH-Wert ab. 3HMU A233S bildet
das gewünschte (R)-Enantiomer von Baclofen zwar bevorzugt, aber nicht mit ausreichender
Selektivität oder die gewählten Bedingungen ermöglichten keine Racemisierung des
Substrats.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
pH 8 pH 9 pH 10
%
Umsatz Enantiomerenüberschuss
3. Ergebnisse
33
3.3.3 Biokatalytische Herstellung von Baclofen durch 3FCR_5M
Da die ATA 3FCR_5M aus dem initialen Screening als vielversprechendste Variante
hervorging, wurden im Nachfolgenden die Untersuchungen zu geeigneten Reaktions-
bedingungen für die Herstellung von Baclofen auf diese Variante mit dem Aminoakzeptor 3-
(4-Chlorophenyl)-4-oxo-buttersäure-tert-butylester begrenzt.
3.3.3.1 Biokatalysen mit gereinigtem Enzym
Um die Ergebnisse aus dem Screening zu verifizieren und möglicherweise störende Einflüsse
bei der Suche nach den optimalen Reaktionsbedingungen zu vermeiden, wurden die ersten
Experimente zur näheren Charakterisierung der durch 3FCR_5M katalysierten Reaktion mit
gereinigtem Enzym durchgeführt. Die Reinigung erfolgte wie zuvor über IMAC unter
Verwendung des Äkta-Purifiers. Dabei wurde die Wahl des Aminodonors – im Screening
wurde L-Alanin verwendet – überprüft sowie der optimale pH-Wert für die Reaktion. Da eine
Racemisierung des verbleibenden Substrat-Enantiomers erreicht werden sollte und das pH-
Optimum der Amintransaminasen in der Regel im basischen Bereich liegt, wurden dabei pH
8, 9, 10 und 11 untersucht, wobei pH 8 ebenfalls bei der Durchmusterung der Enzym-Kollektion
verwendet wurde (s. 3.3.2.2). Als Aminodonoren wurden L-Alanin (Ala; 100 mM, 250 mM und
500 mM) sowie (S)-α-Methylbenzylamin (MBA; 100, 200 und 500 mM) und Isopropylamin (IPA;
50 mM, 100, 200, 500 mM und 1 M) eingesetzt. Des Weiteren wurde die Verwendung eines
Systems zur Gleichgewichtsverschiebung über Lactatdehydrogenase und Glucose-
dehydrogenase (LDH/GDH) in Kombination mit 250 mM L-Alanin und pH 8 getestet. Nach 20 h
Reaktionszeit wurden die Proben mittels HPLC analysiert, um den Umsatz (Produktbildung)
und Enantiomerenüberschuss bestimmen zu können (s. Abbildung 37 37).
Abbildung 37: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen, die bei unterschiedlichen pH-Werten (pH 8: 50 mM HEPES-Puffer, pH 9,10 und 11 100 mM CHES-Puffer) und Aminodonor-Konzentrationen (Ala = L-Alanin, IPA = Isopropylamin, MBA = (S)-α-Methylbenzylamin) durchgeführt wurden. Die Reaktionszeit betrug 20 h und es wurden 20 mM Aminoakzeptor eingesetzt (Bedingungen s. 6.10.2.7).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
Umsatz Enantiomerenüberschuss
3. Ergebnisse
34
Die dabei erhaltenen Daten vermitteln ein eindeutiges Ergebnis für die Wahl des optimalen
Aminodonors und pH-Werts. Mit MBA konnte bei keiner der eingesetzten Konzentrationen das
Produkt detektiert werden, sodass auch keine weiteren Untersuchungen zum optimalen pH-
Wert für diese Reaktion durchgeführt wurden. Während des Screenings wurde bei der
Verwendung des Acetophenon-Assays MBA zwar als Substrat von 3FCR_5M akzeptiert, da
das entstehende Acetophenon eindeutig photometrisch detektiert werden konnte, jedoch
wurden dabei deutlich geringere Konzentrationen sowohl des Aminodonors als
auch -akzeptors eingesetzt. Mit IPA als Aminodonor konnten nur für 50 und 100 mM sehr
geringe Umsätze von jeweils 1,8% beziehungsweise 10% detektiert werden. Bei der
Untersuchung verschiedener pH-Werte konnte der Umsatz mit 100 mM IPA bei pH 10 auf ca.
40% gesteigert werden. Der Einsatz verschiedener L-Alanin-Konzentrationen zeigte, dass
bereits mit 250 mM ein Umsatz von 45% erzielt werden kann. Da dies durch die erhöhte
Konzentration von 500 mM nur unwesentlich auf etwa 48% gesteigert werden konnte, wurden
für die weiteren zu untersuchenden Bedingungen 250 mM L-Alanin verwendet. Auch unter
Einsatz des LDH/GDH-Systems konnte der Umsatz nicht verbessert werden. Allerdings konnte
durch die Erhöhung des pH-Werts auf pH 10 ein Umsatz von 90,5% ohne zusätzliche
Verschiebung des Gleichgewichts erzielt werden. Dabei konnte ebenfalls ein hoher
Enantiomerenüberschuss (99%ee) festgestellt werden. Generell ist zu beachten, dass bei dem
Einsatz eines racemischen Substrats derartige Enantiomerenüberschüsse bei Umsätzen unter
50% nicht bemerkenswert sind, wenn das Enzym eines der Substrat-Enantiomere spezifisch
oder auch nur bevorzugt umsetzt. Dass bei pH 9 ein Umsatz von ca. 55% aber nur 95%ee
detektiert wurden, spricht einerseits dafür, dass 3FCR_5M auch in der Lage ist, das
unerwünschte (S)-Enantiomer zu bilden, andererseits impliziert dies in Kombination mit dem
hohen Umsatz und Enantiomerenüberschuss bei pH 10, dass tatsächlich die gewünschte
Substrat-Racemisierung durch die Erhöhung des pH-Werts eintritt. Basierend auf diesen
Ergebnissen wurde die Reaktion mit 250 mM L-Alanin und 20 mM 3-(4-Chlorophenyl)-4-oxo-
buttersäure-tert-butylester bei pH 10 als Standard-Bedingung zum Vergleich für alle folgenden
veränderten Reaktionsbedingungen verwendet.
3.3.3.2 Biokatalysen mit Zellextrakt
Da die untersuchte Reaktion langfristig als industrieller Prozess etabliert werden sollte, wurde
untersucht, ob die Variante 3FCR_5M auch im Zellextrakt zur Synthese von Baclofen
eingesetzt werden kann. Im großen Maßstab wäre eine Reinigung über IMAC sowohl
apparativ als auch finanziell sehr aufwendig. Deshalb wurden die Expression und Reaktion
zunächst analog zum bisherigen Vorgehen durchgeführt, abgesehen davon, dass der
Zellaufschluss bereits im Reaktionspuffer erfolgte und bis auf einmaliges Filtrieren der Probe
keine weiteren Reinigungsschritte vor dem Starten der Biokatalyse unternommen wurden.
Dabei wurde festgestellt, dass der hohe Umsatz nicht direkt reproduziert werden konnte. Dies
war zu erwarten, da die Probe im Laufe der Reinigung im Vergleich zum Enzym im Zellextrakt
konzentriert wird. Dies spiegelte sich auch in der photometrisch bestimmten Aktivität wider.
Allerdings wurde auch ein deutlich geringerer Enantiomerenüberschuss unter den für
gereinigtes Enzym als optimal bestimmten Bedingungen festgestellt. Dies trat auch beim
Wiederholen des Experiments auf. Um Fehler in den vorherigen Versuchen auszuschließen
und einen direkten Vergleich zu unternehmen, wurde das Zellpellet einer Kultivierung aufgeteilt
und 3FCR_5M aus derselben Charge einmal mittels Äkta gereinigt und als Zellextrakt
3. Ergebnisse
35
vorbereitet. Die gereinigte Probe wurde nach der photometrischen Aktivitätsbestimmung
mittels Acetophenon-Assay durch Verdünnung mit dem Reaktionspuffer an die niedrigere
Aktivität des Zellextrakts (0,31 U/mL) angeglichen, um so in den Biokatalysen möglichst
vergleichbare Umsätze erzielen zu können. Abgesehen von Reaktionen mit gereinigtem
Enzym und Zellextrakt wurden ebenfalls gemischte Proben in den Verhältnissen 2:1 und 1:2
eingesetzt. Anschließend wurden Produktbildung und Enantiomerenüberschuss mittels HPLC
analysiert (s. Abbildung 38 38)
Abbildung 38: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen, die gereinigtem Enzym (Äkta) und Zellextrakt (ZE) und beiden in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt durchgeführt wurden. Die Reaktionszeit betrug 20 h und es wurden 20 mM Substrat eingesetzt (Bedingungen s. 6.10.2.7).
Nach Analyse der Proben wurde festgestellt, dass in allen Reaktionen ein Umsatz von ca. 62%
erzielt wurde, wodurch die Enantiomerenüberschüsse ebenfalls direkt miteinander verglichen
werden konnten. Wie erwartet, betrug der Enantiomerenüberschuss mit dem gereinigten
Enzym (Äkta) 99%ee (R). Mit dem Zellextrakt konnten wie in den zuvor damit durchgeführten
Experimenten jedoch nur 74%ee (R) erreicht werden. Auffällig war des Weiteren, dass in den
gemischten Proben der Enantiomerenüberschuss sukzessiv mit der Erhöhung des Anteils des
Zellextrakts abnahm.
Auf der Suche nach der Ursache dieses Problems wurde ein zweites vergleichendes
Experiment mit gereinigter 3FCR_5M und Zellextrakt durchgeführt. Dabei wurde insbesondere
innerhalb der ersten zwei Stunden der Reaktion eine sehr engmaschige Beprobung in 15-
Minuten-Intervallen durchgeführt. Es wurde außerdem nicht nur die Produktbildung mittels
HPLC analysiert, sondern ebenfalls die zu diesem Zeitpunkt neu etablierte chirale GC-
Methode zur Untersuchung des Substratverbrauchs und dessen Enantiomerenüberschuss
angewendet. Dadurch sollte unter anderem festgestellt werden, ob die Racemisierung des
verbleibenden Substrat-Enantiomers tatsächlich stattfindet und ob dies auch im Zellextrakt der
Fall wäre. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Abbildung 39 dargestellt.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Äkta Äkta:ZE 2:1 Äkta: ZE 1:2 ZE
%
Umsatz Enantiomerenüberschuss
3. Ergebnisse
36
Abbildung 39: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen mit gereinigtem Enzym (Äkta) und Zellextrakt (ZE). Untersucht wurden der Substratverbrauch (A, analysiert mittels GC) und die Produktbildung (B, analysiert mittels HPLC). Die Gesamtreaktionszeit betrug 24 h und es wurden 20 mM Substrat eingesetzt (Bedingungen s. 6.10.2.7).
Bei der Betrachtung des Substrats (Abb. 39 A) wurde über den gesamten Reaktionsverlauf
sowohl mit gereinigter 3FCR_5M als auch mit dem Zellextrakt ein Enantiomerenüberschuss
von 10-15%ee festgestellt. Bei einem echten Racemat sollte der Enantiomerenüberschuss
theoretisch 0%ee entsprechen. Diese Abweichung könnte dabei der GC-Methode geschuldet
gewesen sein, da eine Trennung der Signale bis auf Basislinien-Niveau nicht möglich war.
Jedoch konnte, basierend auf diesen Daten angenommen werden, dass die Racemisierung
des unerwünschten Substrat-Enantiomers unter den gewählten Reaktionsbedingungen
möglich ist, da der Enantiomerenüberschuss auch bei höheren Umsätzen, wie zum Beispiel in
der 24-Stunden-Probe des gereinigten Enzyms bei etwa 70%, noch sehr niedrig war. Auch bei
der Untersuchung der Produktbildung (Abb. 39 B) ergab sich das erwartete Muster. Die
Enantiomerenüberschüsse sind dabei zu Beginn der Reaktion ähnlich hoch, allerdings lag der
Umsatz zu diesem Zeitpunkt auch vorerst nur bei 50%. Generell schien die Reaktion schneller
abzulaufen als zunächst angenommen wurde, da dieser Umsatz bereits nach 15 min erreicht
war. Wirklich auffällig sind die 24-Stunden-Proben, sowohl den Substratverbrauch als auch die
Produktbildung betreffend: Mit dem gereinigten Enzym wurde wie erwartet ein Umsatz um die
3. Ergebnisse
37
70% mit hohem Enantiomerenüberschuss des Produkts erzielt, wobei der Substratverbrauch
mit diesem Ergebnis übereinstimmt. Jedoch wurde für den Zellextrakt nicht nur der bereits
zuvor festgestellte niedrige Produkt-Enantiomerenüberschuss ermittelt, zudem war das
Substrat komplett verbraucht, obwohl wie mit dem gereinigten Enzym ein Umsatz um 70%
bezogen auf das gebildete Produkt erreicht wurde. Dies sprach dafür, dass im Zellextrakt
möglicherweise Nebenreaktionen auftraten, die einerseits das Substrat verbrauchten,
andererseits auch in Zusammenhang mit dem niedrigen Produkt-Enantiomerenüberschuss
gestanden haben könnten. Auch eine Produkt-Racemisierung war zu diesem Zeitpunkt nicht
auszuschließen. Weitere Experimente, die zur Untersuchung dieser Problematik durchgeführt
wurden, sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6: Untersuchungen zum niedrigen Enantiomerenüberschuss und hohen Substratverbrauch in Reaktionen mit Zellextrakt:
Experiment Ergebnis
Reaktion nur mit Puffer unter
Biokatalysebedingungen
• Keine Veränderung des Substrats
über die Dauer der Reaktion
Biokatalyse mit dialysiertem Zellextrakt
1) dreimal 1:1000 dialysiert gegen 100 mM
CHES-Puffer, pH 10, 0,1 mM PLP
2) dreimal 1:1000 dialysiert gegen 50 mM
HEPES-Puffer, pH 8, 0,1 mM PLP
1) Kein Produkt, Enzym vermutlich
inaktiv
2) Niedrige Produktbildung und
Enantiomerenüberschuss,
Substratverbrauch höher als Pro-
duktbildung
Inkubation des Produkts (nur (R)-Enantiomer)
mit konzentriertem Dialysepuffer unter
Biokatalysebedingungen
• Keine Veränderung des Produkts
über den Reaktionsverlauf
Biokatalyse mit Zellextrakt des Leervektors
(pET22b(+)) unter Biokatalysebedingungen
• Kein Produkt detektiert
• Nach ca. 20 h Reaktion nur noch
70% des Substrats vorhanden
Inkubation des Produkts (nur (R)-Enantiomer)
mit Zellextrakt des Leervektors unter
Biokatalysebedingungen
• Keine Veränderung des Produkts
über den Reaktionsverlauf
Die in Tabelle 6 zusammengefassten Ergebnisse lassen darauf schließen, dass im Zellextrakt
eine oder mehrere Nebenreaktionen ablaufen, durch die das Substrat verbraucht wird, da auch
im Reaktionsansatz mit dem Zellextrakt des Leervektors ein Anteil des Substrats verbraucht
wurde. Dass die Substratkonzentration in der Probe, der ausschließlich weiterer
Reaktionspuffer zugesetzt wurde, nicht abnahm, deutete darauf hin, dass es sich um keinen
rein chemischen Effekt bzw. geringe Stabilität des Substrats handelte. Durch die Experimente
mit dialysiertem Zellextrakt, bzw. dem konzentrierten Dialysepuffer konnte ebenfalls eine
Reaktion mit niedermolekularen Substanzen des Extrakts ausgeschlossen werden, sowohl
den Substratverbrauch, als auch ein potenzielle Produkt-Racemisierung betreffend. Die
Biokatalysen, die mit dem Zellextrakt des Leervektors angesetzt wurden, wiesen darauf hin,
dass das Substrat möglicherweise durch andere enzymatische Bestandteile des Zellextrakts
umgesetzt wurde. Eine Erklärung für den niedrigeren Enantiomerenüberschuss konnte bisher
nicht gefunden werden. Scheinbar kam es im Zellextrakt jedoch nicht zur Racemisierung des
3. Ergebnisse
38
Produkts, da dies nach Inkubation mit dem Zellextrakt des Leervektors weiterhin unverändert
enantiomerenrein vorlag.
3.3.3.3 Alternative Reaktionsbedingungen und Reinigungsmethoden
Da die Ursachen für die im Zellextrakt schlechter ablaufende Reaktion nicht zweifelsfrei geklärt
werden konnten, wurden verschiedene alternative Reaktionsbedingungen untersucht, in der
Hoffnung, dadurch Nebenreaktionen unterdrücken, die Zielreaktion begünstigen und den
Enantiomerenüberschuss erhöhen zu können. Des Weiteren sollte überprüft werden, ob eine
im Vergleich zur IMAC-Methode günstigere Reinigung erfolgreich auf 3FCR_5M angewendet
werden kann.
Im Rahmen der Bachelorarbeit von Iris Totkas wurde unter Anderem der Zusatz von
Ionenaustauschern untersucht, da Probleme mit der Substrat-Racemisierung nicht in Gänze
ausgeschlossen werden konnten und diese dadurch theoretisch positiv beeinflusst werden
könnten. Einige der dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 40 dargestellt, eine
vollständige Liste der getesteten Materialien ist in 6.10.2.7 aufgeführt.
Abbildung 40: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen mit zugesetzten Ionenaustauschern nach 20 h (Bedingungen s. 6.10.2.7). 1 = Ohne Ionenaustauscher, 2 = Amberlyst 15 (sauer), 3 = Dowex Anion (basisch), 4 = Lewatit MP 62 (basisch).
Im Allgemeinen konnte keine Verbesserung der Reaktion durch den Zusatz von
Ionenaustauschern erreicht werden. Jedoch konnten in diesen Experimenten zwei Dinge
festgestellt werden: I) Da in der verwendeten Charge eine geringere Enzym-Aktivität
gemessen wurde, waren auch die Umsätze in den folgenden Reaktionen deutlich niedriger als
sonst. Überraschend war, dass auch bei Umsätzen unter 50% der Enantiomerenüberschuss
deutlich geringer war als mit gereinigtem Enzym (s. 3.3.3.1), bei dem auch in Biokatalysen mit
Umsätzen <50% jedes Mal 99%ee ermittelt wurden. II) Außerdem fiel auf, dass bei der
Inkubation mit sauren Ionenaustauschern (Amberlyst 15) anscheinend eine Produkt-
Racemisierung stattfand. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte überprüft werden, ob ein
Zusammenhang zwischen Enantiomerenüberschuss und dem pH-Wert der Reaktion bestehen
konnte. Dazu wurden Biokatalysen mit gereinigter 3FCR_5M und Zellextrakt mit Hilfe des pH-
Stat durchgeführt, da einerseits der pH-Wert so permanent überwacht werden konnte und
andererseits durch Titration mit Natronlauge wieder angeglichen werden könnte. In beiden
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
%
Umsatz Enantiomerenüberschuss
3. Ergebnisse
39
Fällen sank der pH-Wert zu Beginn der Reaktion leicht, jedoch maximal um 0,2 pH-Einheiten,
sodass davon ausgegangen wurde, dass keine pH-induzierte Racemisierung des Produkts
ablief. Auch Biokatalysen mit Zellextrakt bei höheren pH-Werten führten lediglich zu
niedrigeren (pH 11, 38%) bzw. keinen Umsätzen (pH 12) im Vergleich zur Standardbedingung
(pH 10, 63%).
Da die Enantioselektivität durchaus auch durch andere Rahmenbedingungen der Reaktion
beeinflusst werden kann, wurden auch Biokatalysen bei unterschiedlichen Temperaturen und
mit verschiedenen Anteilen von Co-Solvenzien durchgeführt. Untersucht wurden 15°C, 20°C,
30°C und 37°C sowie DMSO und DMF als Co-Solvenzien in den Anteilen 10%, 30% und
50% (v/v). Auch die möglichen Kombinationen aus Temperatur und Lösungsmitteln wurden
überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass bei 15°C, 37°C sowie in den Reaktionen mit DMF
und 50% DMSO kein Produkt gebildet wurde. Weitere Ergebnisse sind in Abbildung 41
dargestellt.
Abbildung 41: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen, die bei unterschiedlichen Temperaturen und DMSO-Anteilen (v/v) durchgeführt wurden. Die Reaktionszeit betrug 20 h und es wurden 20 mM Substrat eingesetzt (Bedingungen s. 6.10.2.7).
In den Proben mit etwas höherem DMSO-Gehalt (30%) konnte jeweils eine Verbesserung des
Enantiomerenüberschuss gegenüber den Proben mit 10% festgestellt werden, wobei
gleichzeitig auch der Umsatz leicht erhöht werden konnte. Des Weiteren konnte durch die
Verringerung der Reaktionstemperatur auf 20°C der Umsatz deutlich erhöht werden, was
vermutlich auf eine bessere Enzymstabilität bei niedrigeren Temperaturen zurückzuführen ist.
Daher wurden alle folgenden Reaktionen bei 20°C und mit 30% DMSO durchgeführt.
Da die Ursache für den schlechteren Enantiomerenüberschuss im Zellextrakt jedoch weiterhin
unklar blieb und mit einfachen Änderungen der Reaktionsbedingungen keine Verbesserung
erzielt werden konnte, wurden im Folgenden alternative Reinigungsmethoden untersucht.
Neben Hitzefällung und Reinigung durch kommerziell erhältliche Proteasen, mit denen
3FCR_5M jedoch nicht gereinigt werden konnte bzw. die eventuell störenden Proteine nicht
durch Proteolyse abgebaut wurden, stellt die Ammoniumsulfat-Präzipitation eine einfache und
vergleichsweise günstige Alternative dar. Um herauszufinden, bei welcher Ammoniumsulfat-
Konzentration 3FCR_5M gefällt wird und ob die Aktivität regeneriert werden kann, wurde
zunächst ein Vorversuch im 1 mL-Maßstab durchgeführt. Dabei wurden dem gekühlten Zell-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
30 °C 10% 30°C 30% 20°C 10% 20°C 30%
%
Umsatz Enantiomerenüberschuss
3. Ergebnisse
40
extrakt verschiedene Ammoniumsulfat-Mengen hinzugefügt, die einer prozentualen Sättigung
von 30-100% entsprachen. Anschließend wurden die Aktivitäten der dabei entstandenen
Überstände und wieder in Puffer aufgenommenen Pellets mittels Acetophenon-Assay
hinsichtlich der verbleibenden bzw. wiederhergestellten Enzymaktivität untersucht (Abb. 42).
Abbildung 42: Volumetrische Aktivität der Überstände und Pellets nach einer Fällung von 1 mL Zellextrakt bei unterschiedlichen Ammoniumsulfat-Konzentrationen.
Bei der Bestimmung der Aktivität wurde festgestellt, dass eine Verschiebung der Aktivität vom
Überstand zum wieder aufgenommenen Pellet zwischen 50% und 60% Ammoniumsulfat-
Sättigung stattfand. Dies impliziert, dass 3FCR_5M in diesem Bereich gefällt und die Aktivität
regeneriert werden kann. Im Anschluss wurde die Fällung in größerem Maßstab (10 mL)
wiederholt. Zudem wurde eine fraktionierende Fällung bei 40% und 60% vorgenommen, um
so möglichst viele Proteine des Zellextrakts abzutrennen und dadurch eine bessere Reinigung
erzielen zu können. Der Aktivitätsverlust im Vergleich zum Zellextrakt konnte bei dieser
Methode dadurch ausgeglichen werden, dass das Pellet in einem geringeren Puffer-Volumen
wieder aufgenommen und das Enzym somit konzentriert wurde. Zur Vergleichbarkeit mit zuvor
erfolgten Experimenten wurde der aus mehreren parallel durchgeführten Kultivierungen
gewonnene Zellextrakt zusammengeführt und anschließend gedrittelt, um über
Ammoniumsulfat-Fällung gereinigte 3FCR_5M, mittels Äkta gereinigtes Enzym und
unbehandelten Zellextrakt zur Verfügung zu haben. Von diesen Proben wurde unter anderem
eine SDS-PAGE durchgeführt (Abb. 43). Dabei zeigte sich, dass die Ammoniumsulfat-
Präzipitation nur eine leichte Vorreinigung im Gegensatz zur sehr reinen Äkta-gereinigten
Probe darstellte. Im Vergleich zum Zellextrakt war zu erkennen, dies die Konzentration der E.
coli eigenen Proteine zwar geringer schien, jedoch konnten kaum spezifische fehlende Banden
festgestellt werden. Lediglich eine Bande bei ca. 25 kDa schien bei der Ammoniumsulfat-
Fällung eindeutig zu fehlen.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
Aktivität
[U/m
L]
prozentuale (NH₄)₂SO₄-Sättigung
Überstand Pellet
3. Ergebnisse
41
Abbildung 43: SDS-PAGE-Gel mit 3FCR_5M-Zellextrakt (1), mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation vorgereinigtem Zellextrakt (2) und mit Hilfe der Äkta gereinigtem Enzym (3). Die Proben wurden vor dem Auftragen zusätzlich 1:10 mit SDS-Probenpuffer verdünnt. M = Roti-Mark Standard.
Tabelle 7: Aktivitäten, Ausbeute und Reinigungsfaktoren der verschiedenen 3FCR_5M-Präparationen. Zur Aktivitätsbestimmung wurde ein Acetophenonassay (s. 6.10.3.1) verwendet:
Enzympräparation Gesamtaktivität [U]
Spezifische Aktivität [U/mg]
Ausbeute [%]
Reinigungsfaktor
Zellextrakt 11,2 0,09 100 1
Ammoniumsulfat-Präzipitation
7,5 0,35 67 3,9
Äkta 10,5 1,4 94 15,5
Nach der Bestimmung der Transaminase-Aktivität, konnten Ausbeuten und Reinigungs-
faktoren berechnet werden, die in Tabelle 7 dargestellt sind. Dabei konnte, wie zu erwarten
war, festgestellt werden, dass die Ammoniumsulfat-Präzipitation zu höheren Verlusten der
Enzymaktivität und einer deutlich schlechteren Reinigung als die Verwendung der Äkta führt.
Trotz der scheinbar optisch geringen Unterschiede im SDS-PAGE-Gel und dem geringen
Reinigungsfaktor wurden in den anschließend durchgeführten Reaktionen mit dem gefällten
Enzym annähernd die gleichen Umsätze und Enantiomerenüberschüsse wie mit der mittels
Äkta gereinigten Probe erzielt (Abb. 44), wodurch sich die Ammoniumsulfat-Präzipitation als
günstige Reinigungsalternative qualifizierte.
Abbildung 44: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen, die mit Zellextrakt (ZE), Ammoniumsulfat-präzipitiertem Enzym ((NH4)2SO4) und IMAC-gereinigtem Enzym (Äkta) durchgeführt wurden. Die Enzymlösungen wurden auf die Aktivität des Zellextrakts normiert. Die Reaktionszeit betrug 20 h und es wurden 20 mM Substrat eingesetzt (Bedingungen s. 6.10.2.7).
0
20
40
60
80
100
ZE (NH₄)₂SO₄ Äkta
%
Umsatz Enantiomerenüberschuss
3. Ergebnisse
42
Der Erfolg der Reaktion mit gereinigtem Enzym ließ vermuten, dass die Störungen im
Zellextrakt durch enzymatische Nebenreaktionen verursacht worden sein könnten. Daher
wurde auch ein Experiment zur Expression von 3FCR_5M in E. coli K12 MG1655 RARE
(reduced aromatic aldehyde reduction) durchgeführt. Dieser Stamm wurde so konstruiert, dass
sechs Gene, welche für Aldo-Ketoreduktasen und Alkoholdehydrogenasen codieren, deletiert
wurden. Dadurch konnten erfolgreich Nebenreaktion bei der biokatalytischen Synthese von
Aldehyden unterdrückt werden.[86] Allerdings konnten bei der hier untersuchten Reaktion keine
Unterschiede zur Reaktion mit Zellextrakt von E. coli BL21 festgestellt werden, sodass die
Ammoniumsulfat-Präzipitation weiterhin die beste Alternative zur Reinigung mittels IMAC
darstellte.
3.3.4 Up-Scaling
3.3.4.1 Vorversuche zur Erhöhung der Ausbeute
In Hinblick auf die Anwendung der biokatalytischen Synthese von Baclofen im industriellen
Maßstab, stellte sich die Frage, wie die Ausbeute der Reaktion erhöht werden könnte. Dazu
wurde zuerst eine Erhöhung der Substratkonzentration, also folglich der theoretisch möglichen
Produktkonzentration, bei gleicher Enzymmenge untersucht. Dazu wurde Ammoniumsulfat-
präzipitiertes Enzym verwendet und es wurden die Substrate L-Alanin und 3-(4-Chlorophenyl)-
4-oxo-buttersäure-tert-butylester in den Verhältnissen 250:20 mM, 500:40 mM und 750:60 mM
eingesetzt.
Abbildung 45: Umsatz, Enantiomerenüberschuss (R) und absolute Produktkonzentration von Biokatalysen mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen bei gleicher Enzymmenge und Reaktionszeit. Als Biokatalysator wurde Ammoniumsulfat-präzipitierte 3FCR_5M eingesetzt. Die Reaktionszeit betrug 20 h (Bedingungen s. 6.10.2.7).
Wie in Abbildung 45 ersichtlich wird, konnte bei steigenden Substratkonzentration zwar eine
jeweils höhere absolute Produktkonzentration ermittelt werden, jedoch waren die prozentualen
Umsätze geringer. Auch der Enantiomerenüberschuss sank mit steigenden Substrat-
0
5
10
15
20
25
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
250:20 500:40 750:60
Pro
duktk
onzentr
ation [
mM
]
Um
satz
, E
nantiom
ere
nübers
chuss[%
]
Substratkonzentration (Alanin:Aldehyd) [mM]
Umsatz Enantiomerenüberschuss Produktkonzentration
3. Ergebnisse
43
konzentrationen. Anscheinend ist die pH-induzierte Racemisierung des Substrats also durch
dessen Konzentration limitiert.
Des Weiteren sollte untersucht werden, ob niedrigere Umsätze, die im Projektverlauf des
Öfteren aufgrund expressionsbedingt schwankender Aktivitäten der Enzympräparationen
festgestellt wurden, der Gleichgewichtslage oder der Stabilität des Enzyms geschuldet waren
und wie sie behoben werden könnten. Dazu wurden jeweils Biokatalysen mit den drei bisher
verwendeten Präparationen (IMAC-gereinigt, Ammoniumsulfat-präzipitiert und Zellextrakt)
angefertigt, bei denen zum Vergleich die Standard-Bedingungen, Reaktionen mit doppelter
Enzymkonzentration und Reaktionen, bei der die Enzymkonzentration erst nach 2 h verdoppelt
wurde, durchgeführt wurden. Interessant dabei war, dass im Vergleich der Standardbedingung
mit der direkt verdoppelten Enzymmenge kein Unterschied in der Produktbildung festgestellt
werden konnte, was möglicherweise durch die geringe Stabilität des Enzyms bedingt war.
Jedoch konnte durch die versetzte Zugabe von 3FCR_5M der Umsatz mit allen Präparationen
entsprechend gesteigert werden (Abb. 46). Dies impliziert, dass die Produktausbeute in einem
Prozess durch kontinuierlichen Zusatz des Katalysators die Ausbeute gesteigert werden
könnte, wodurch ebenfalls expressionsbedingte Schwankungen der Enzymaktivität
ausgeglichen werden könnten.
Abbildung 46: Umsatz und Enantiomerenüberschuss (R) von Biokatalysen mit unterschiedlich
vorbereiteter Enzymlösung. Bei den mit „versetzt“ bezeichneten Proben wurden nach 2 h weitere 200 µL
der jeweiligen Enzymlösung hinzugefügt. Die Gesamtreaktionszeit betrug 20 h und es wurden 250 mM
L-Alanin und 20 mM Aldehyd eingesetzt (Bedingungen s. 6.10.2.7).
3.3.4.2 Expression
Um ausreichend Enzym für spätere präparative Biokatalysen produzieren zu können, musste
die Expression in einem größeren Maßstab etabliert werden. Dazu wurde die Expression von
400 mL im Schüttelkolben zunächst auf 1 L im Fermenter übertragen. Durch die Möglichkeit
pH-Wert, Sauerstoffgehalt und Temperatur im Gegensatz zum Schüttelkolben dabei
permanent messen und regulieren zu können, könnte die Ausbeute unter Umständen schon
durch die Kontrolle dieser Parameter optimiert werden. In einem initialen Experiment wurden
die Expressionsbedingungen im Schüttelkolben (Inkubation bei 37°C, Induktion bei
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Äkta Äkta versetzt (NH₄)₂SO₄ (NH₄)₂SO₄versetzt
ZE ZE versetzt
%
Umsatz Enantiomerenüberschuss
3. Ergebnisse
44
OD600~0,8, dann Inkubation bei 20°C) einmal direkt übertragen, wobei parallel dazu
untersucht wurde, wie sich eine konstante Temperatur von 30°C auf die Expression auswirken
würde (Tabelle ).
Tabelle 8: Vergleich der Expression der 3FCR_5M bei unterschiedlichen Bedingungen. Die optische Dichte und volumetrische Aktivität wurden nach 20 h Expression in TB-Medium bei einer Induktion bei OD600~0,8 mit 0,5 mM IPTG bestimmt. Zur Ermittlung der Aktivität wurde ein photometrischer Acetophenon-Assay (s. 6.10.3.1) verwendet:
Expressionsbedingung OD600 Aktivität [U/L]
Schüttelkolben 20°C 16,8 31
Fermenter 20°C 17,4 20,1
Fermenter 30°C 25,8 162,8
Dabei wurde festgestellt, dass durch die Expression bei konstant 30°C eine deutlich höhere
Aktivität erzielt werden konnte, sodass alle weiteren Experimente zur Expression unter diesen
Bedingungen durchgeführt wurden. Als nächstes wurde die optimale Dauer der Expression
untersucht. Beim Erreichen hoher Zelldichten ist es möglich, dass die volumetrische Aktivität
des Zielenzyms abnimmt, da die Medienbestandteile als Nährstoffquelle nicht mehr
ausreichen sind und es zur Zelllyse kommen kann, sodass auch im Verlauf der Fermentation
produzierte Enzyme wieder abgebaut werden können[87].
Abbildung 47: Optische Dichte und Aktivität der Verlaufsproben (bestimmt mittels Acetophenon-Assay) bei der Expression der 3FCR_5M im Fermenter. Die Verlaufsproben wurden vor der Aktivitätsbestimmung auf 7/OD600 normiert.
Wie aus Abbildung 47 ersichtlich wird, wäre eine Expressionsdauer von sechs bis sieben
Stunden vorteilhaft. In diesem Zeitraum betrug die Gesamtaktivität ca. 300 U/L, wohingegen
nach 10 h nur noch ca. 41 U/L vorhanden waren. Des Weiteren war zu überprüfen, ob eine
spätere Induktion bei einer höheren optischen Dichte (OD600~3) zu einer zusätzlichen
Verbesserung der Expression führen könnte (s. Abb. 48).
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Aktivität
[U/m
L]
OD
₆₀₀
t [h]OD₆₀₀ Aktivität
3. Ergebnisse
45
Abbildung 48: A) Optische Dichte und Aktivität der Verlaufsproben (bestimmt mittels Acetophenon-Assay) bei der Expression der 3FCR_5M im Fermenter nach Induktion bei OD600~3. B) SDS-PAGE-Gel der Verlaufsproben. M = Roti-Mark Standard. 0 h und T0 bezeichnen den Zeitpunkt der Induktion. Die Verlaufsproben wurden vor der Aktivitätsbestimmung und der SDS-Gelelektrophorese auf 7/OD600 normiert.
Durch diese Optimierungen konnten insgesamt 629 U/L 3FCR_5M nach nur 7 h Expression
produziert werden. Das von den Verlaufsproben angefertigte SDS-PAGE-Gel weist ebenfalls
die intensivste 3FCR_5M-Bande (ca. 45 kDa) nach 7 h auf. Die unter diesen Bedingungen aus
1 L Medium gewonnene Aktivität der 3FCR_5M würde, bezogen auf die besten
Reaktionsbedingungen im kleinen Maßstab (700 µL mit Vorreinigung durch Ammoniumsulfat-
Präzipitation, 20°C und 30% (v/v) DMSO), theoretisch die Herstellung von ungefähr 2,8 g (R)-
Baclofen (>95%ee) ermöglichen.
3. Ergebnisse
46
4. Diskussion
47
4. Diskussion
4.1 Synthese der Substrate
In Hinblick auf die Beschaffung der für das Projekt benötigten Substrate wurden mehrere
Versuche unternommen, das als Vorstufe für 3-Formyl-5-methylhexansäure und deren Ester
benötigte 4-Methyl-1-pentanal zu synthetisieren. Ausgehend von kommerziell erhältlichem 4-
Methyl-1-pentanol konnte über eine Oxidation mit Pyridiniumchlorochromat tatsächlich das
gewünschte Produkt gebildet werden. Allerdings legten durchgeführte DC-, GC-MS- und NMR-
Analysen nahe, dass Teile des Aldehyds weiter zur Carbonsäure oxidiert wurden, während
auch noch Überreste des Ausgangsstoffs sowie weitere, nicht identifizierbare Verun-
reinigungen vorhanden waren. Diese könnten durch eine weiter Anpassung der Reaktionszeit
und des Aufbaus vermutlich noch optimiert werden. Möglicherweise hätten die
Verunreinigungen durch eine alternative Reaktionsroute vermieden werden können.
Die Aufarbeitung von Aldehyden als Sulfit-Addukt hat sich in der Vergangenheit als einfache
und effektive Methode bewährt[88]. Wie in 3.1.1 erwähnt, hätte die theoretische Ausbeute nach
der Präzipitation als Bisulfit ca. 15% betragen. Dies ist einerseits durch den relativ hohen Anteil
an weiteren Verbindungen im Reaktionsgemisch zu begründen. Andererseits ist auch ein
Verlust durch die zwischengeschaltete Filtration durch Celite® nicht auszuschließen. Dieser
Schritt ist jedoch zur Entfernung des Katalysators unerlässlich[76].
Da bereits die Synthese von 4-Methyl-1-Pentanal eine zeitaufwendige Herausforderung
darstellte und noch weitere Synthesen für die gewünschten Ester und sämtliche Produkt-
standards benötigt worden wären, wurde die weitere Herstellung der benötigten Substanzen
an einen externen Partner vergeben. Dieser Schritt war unerlässlich für das weitere
Vorankommen des Projekts, dessen Fokus die biokatalytische Reaktion sein sollte.
4.2 Analytik
Die Etablierung einer geeigneten chiralen Analytik für die β-chiralen Amine stellte eine gewisse
Herausforderung dar, da keine der bisher publizierten Methoden ohne Weiteres auf die
gewünschten Substanzen angewandt werden konnte. Allgemein ist zu vermerken, dass chirale
stationäre Phasen relativ einzigartig bezüglich des Bindungspotentials für chirale Moleküle
sind. Auch die mobilen Phasen können die Bindung der Enantiomere stark beeinflussen. In
beiden Fällen lassen sich die zu erwartenden Effekte jedoch kaum vorhersagen. Daher ist es
unerlässlich mit verschiedenen stationären und mobilen Phasen zu experimentieren.[89]
Für Pregabalin konnte durch die Derivatisierung mit ECF eine stabile und äußerst effiziente
Methode entwickelt werden. Die zur Trennung der Enantiomere benötigte GC-Methode war
zwar mit 75 min relativ lang, dafür erfolgte aber eine sehr saubere Trennung bis auf
Basislinien-Niveau und die ausgesprochen kurze Vorbereitungszeit der Proben (ca. 15 min,
bis zu 20 Proben parallel möglich) sprachen eindeutig für den Einsatz dieser Methode. Die
Derivatisierung mit ECF wird schon relativ lange erfolgreich für die Analytik von Aminosäuren
eingesetzt, jedoch war die Anwendung auf Pregabalin während der Methodenentwicklung im
Rahmen der vorliegenden Arbeit bisher nicht bekannt. Für die Ester-Derivate sowie die
entsprechenden Aldehyd-Vorläufer wurden keine Untersuchungen bezüglich deren Analytik
4. Diskussion
48
unternommen, da durch das veröffentlichte Patent von Pfizer zu diesem Zeitpunkt die
vollständige Fokussierung auf Baclofen als Modellverbindung erfolgte.
Leider konnte die für Pregabalin erfolgreiche Methode nicht auf Baclofen angewendet werden.
Es wurde zwar eine Detektion mittels GC ermöglicht, was für eine erfolgreiche Derivati-
sierungsreaktion sprach, allerdings konnte auch nach zahlreichen Variationen der chiralen
stationären Phasen sowie des Temperaturprogramms keine ausreichende Trennung der
Enantiomere erzielt werden. Für einen der Aldehyd-Vorläufer der Baclofensynthese, 3-(4-
Chlorophenyl)-4-oxo-buttersäure-tert-butylester, konnte jedoch sogar ohne Derivatisierung
eine chirale GC-Methode etabliert werden, bei der die Enantiomere zwar nicht vollständig
getrennt waren, die aber dennoch Aufschluss darüber gab, ob ein Racemat vorlag oder nicht
und zudem eine Quantifizierung der Aldehyd-Konzentration ermöglichte.
Alternativ zur Gaschromatographie konnte mit Hilfe der Kapillarelektrophorese eine einfache
und schnelle Methode zur chiralen Analytik von Baclofen entwickelt werden. Diese erwies sich
jedoch als ungeeignet für einen hohen Probendurchsatz, da sie sich als nicht robust genug
erwies und damit keine Reproduzierbarkeit erlaubte, ohne jede einzelne Probe drei- bis
fünfmal zu vermessen. Bei der Kapillarelektrophorese handelt es sich um eine vergleichsweise
sehr sensible Methode, insbesondere Veränderungen des pH-Werts, der Temperatur und
Schwankungen der Elektrolyt-Konzentration, wie sie bei Biokatalyseproben durchaus
auftreten, können zu starken Abweichungen führen. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie
zum Beispiel der HPLC, kann die Reproduzierbarkeit der Peakflächen auch aufgrund des
kleinen Injektionsvolumens (wenige Nanoliter) beeinträchtigt sein.[90] Auch erste Experimente
zur Analyse mit Hilfe der HPLC scheiterten. Derivatisierungen mit OPA und Dansylchlorid sind
gängige Methoden für die Untersuchung von primären Aminen[83], allerdings wurde deren
Einsatz in der vorliegenden Arbeit durch mangelnde Stabilität der Derivate sowie
Überlagerungen mit anderen Probenbestandteilen limitiert. Letztendlich wurde eine geeignete
HPLC Methode mit einer speziell für die chirale Analytik von Aminosäuren entwickelten Säule
etabliert[91].
4.3 Screening
4.3.1 Amindehydrogenasen
Die vier zu untersuchenden Amindehydrogenasen konnten erfolgreich exprimiert und gereinigt
werden sowie im Fall von CFL2 zuvor mit Hilfe der QuikChange™-Methode aus CFL1 erzeugt
werden. Insbesondere im Falle der CFL1 und LeuDH gelang eine deutliche Überexpression,
wohingegen CFL2 nur in sehr geringen Mengen produziert werden konnte. Dies kann auf das
gegenüber der ursprünglich publizierten Methode veränderte Expressionsprotokoll
zurückzuführen sein[52,53]. Allerdings sind dort auch keine Angaben zur erhaltenen Ausbeute
zu finden. Grundsätzlich wäre die Expression der CFL2 optimierungsbedürftig, wobei
verschiedenste Parameter variiert werden könnten, beispielsweise die Induktorkonzentration,
Expressionstemperatur und -dauer sowie der Expressionsstamm. Durch eine Auftrennung der
Probe nach dem Zellaufschluss in lösliche und unlösliche Proteinfraktion könnte zudem
ermittelt werden, ob dieses Enzym in Form von unlöslichen inclusion bodies vorliegt. Das Gen
unterscheidet sich zwar nur durch eine Punktmutation von der leicht exprimierbaren CFL1,
dies kann jedoch bereits ausschlaggebend für die Stärke der Expression oder die Löslichkeit
4. Diskussion
49
des Enzyms sein[92]. Im Falle einer unlöslichen Expression könnten diverse Gegen-
maßnahmen, wie zum Beispiel die Co-Expression von Chaperonen untersucht werden[93].
Durch die Reinigung der Amindehydrogenasen über Ni-NTA-Säulen mit Hilfe der Äkta konnte
eine moderate Reinheit erzielt werden, jedoch enthielten alle vier Proben noch einige deutlich
erkennbare Verunreinigungen. Darin könnte die scheinbare Aktivität der Enzyme gegenüber
den gewünschten Substraten im NADH-Assay begründet werden. Da hier lediglich
angenommen wird, dass die Abnahme an NADH der Bildung der Amine äquivalent ist, diese
jedoch nicht explizit nachgewiesen werden, kann dieser Assay leicht zu falsch-positiven
Ergebnissen führen. NADH ist ein physiologisch bedeutsamer Cofaktor, der auch von
zahlreichen anderen Oxidoreduktasen in der Zelle benötigt wird, sodass die ermittelten
Aktivitäten, die zudem ausgesprochen niedrig waren (unterer mU-Bereich), durch
Verunreinigungen durch andere Enzyme entstanden sein könnten. Dies erklärt auch, wieso in
den anschließend durchgeführten Biokatalysen kein Produkt detektiert werden konnte. Hierbei
muss jedoch auch erwähnt sein, dass nur zwei verschiedene Reaktionsansätze (mit und ohne
Gleichgewichtsverschiebungssystem durch eine Formiatdehydrogenase) untersucht wurden.
Diese waren zwar in der Literatur für diese Enzyme beschrieben, jedoch ist es auch möglich,
dass damit nicht die optimalen Bedingungen für die hier erwünschte Reaktion getroffen
wurden. Es ist auch möglich, dass die Amindehydrogenasen die gewünschten Substrate
grundsätzlich nicht akzeptieren und daher nicht für die Synthese von Baclofen geeignet sind.
Der Einsatz von aus Aminosäuredehydrogenasen evolvierten Amindehydrogenasen ist bisher
noch wenig untersucht, es ist jedoch bekannt, dass auch relativ große Substrate wie
Acetophenon- und Phenylacetonderivate umgesetzt werden können[94]. Da parallel zu den
Arbeiten mit den Amindehydrogenasen vielversprechendere Ergebnisse mit Amin-
transaminasen erzielt wurden, wurde die Biokatalyse mit AmDHs nicht weiter im Detail
untersucht und optimiert. Dennoch könnten an dieser Stelle weitere Experimente durchgeführt
werden. Weil die Amindehydrogenasen erst nach der Refokussierung auf Baclofen als
Modellverbindung zur Verfügung standen, könnten in Zukunft noch Experimente zur Synthese
von Pregabalin durchgeführt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass diese Enzyme
eine interessante Alternative zu anderen Enzymen für Aminierungsreaktionen darstellen, da
sie lediglich Ammoniak als Aminodonor benötigen.
4.3.2 Transaminasen
Im Verlauf der hier vorgestellten Arbeit wurden insgesamt ca. 150 Amintransaminasen und
deren Varianten hinsichtlich der Bildung von Pregabalin und Baclofen gescreent. Um das
Screening so schnell und effizient wie möglich abzuschließen, wurde eine Methode zur IMAC-
reinigung im 96-Well-Maßstab etabliert. Die so präparierten Enzyme wurden für beide
Modellverbindungen zunächst in Richtung der Desaminierung mit anschließender DC-Analytik
untersucht und sobald die Aldehyd-Substrate zur Verfügung standen ebenfalls in der
gewünschten Reaktionsrichtung in einem photometrischen Acetophenon-Assay eingesetzt.
Dabei konnten für Pregabalin sechs und für Baclofen 15 potenzielle Kandidaten identifiziert
werden.
Für Pregabalin wurde davon lediglich die Variante 3HMU F92Y untersucht, die allerdings eine
Präferenz für das unerwünschte (R)-Enantiomer aufwies, und erst nach fortgeschrittener
Reaktionszeit auch das (S)-Enantiomer bildete. Es gibt Studien zur erfolgreichen Umkehrung
4. Diskussion
50
der Enantioselektivität von Enzymen, auch Amintransaminasen. Beispielsweise wurde durch
Skalden et al. gezeigt, dass die Variante 56V der Transaminase aus Vibrio fluvialis bevorzugt
das (R)-Enantiomer von 1-Amino-3-Methyl-Cyclohexan bildet, wohin gegen 56I eine
umgekehrte Präferenz für das (S)-Enantiomer aufwies[95]. Da zu diesem Zeitpunkt des
Projektverlaufs der Fokus auf Baclofen verschoben wurde, wurden keine weiteren
Experimente mit Pregabalin und 3HMU F92Y vorgenommen. Außerdem war das Neu-Design
eines geeigneten Biokatalysators zwar nicht ausgeschlossen, aber auch nicht das erklärte Ziel
der Arbeit. Aufgrund der relativ großen zur Verfügung stehenden Transaminase-Bibliothek
wurde davon ausgegangen, dass ausschließlich durch Screening ein geeigneter Kandidat
gefunden werden könne. Zu erwähnen ist im Fall von Pregabalin noch, dass die weiteren durch
das Screening identifizierten Treffer alle Varianten der ATA aus Vibrio fluvialis waren. Dieses
Enzym wurde ebenfalls in dem durch Pfizer veröffentlichten Patent verwendet, wobei die
letztendlich besten Varianten nach mehreren Mutagenese-Runden zehn bis zwölf Mutationen
aufwiesen. Daher ist anzunehmen, dass die in der vorliegenden Arbeit gefunden Vfl-Varianten
zwar ein guter Ausgangspunkt für die Synthese von Pregabalin gewesen wären, allerdings
nicht optimal dafür geeignet.
Für Baclofen wurden deutlich mehr potenzielle Biokatalysatoren ermittelt. In der vorliegenden
Arbeit wurden dabei fast ausschließlich nur Varianten von als (S)-selektiv annotierten ATAs
(Cvi, Vfl, 3HMU und 3FCR) aufgefunden, lediglich eine im späteren Verlauf erhaltene Variante
der ATA aus Arthrobacter sp. KNK168 (ArRmu11 117F 279A bezeichnet), die von der
Arbeitsgruppe von Professor Kroutil (Universität Graz) erstellt wurde[96], ist als (R)-selektiv
annotiert. Sowohl in der dazu veröffentlichten als auch in der hier vorgestellten Arbeit zeigte
sich, dass die für α-chirale Amine scheinbar so eindeutig definierte Enantiopräferenz von ATAs
sich nicht ohne Weiteres auf β-chirale Verbindungen anwenden lässt. Die Enantio-
selektivitäten sind in diesem Fall so schwer vorhersagbar und verhältnismäßig niedrig, da α-
chirale Aldehyde deutlich mehr strukturelle Flexibilität aufweisen als prochirale Ketone und so
wiederum andere Anforderungen an die Architektur des aktiven Zentrums bestehen. Nicht die
eindeutig definierte Anordnung großer und kleiner Substituenten bestimmt dabei die
Enantioselektivität, sondern nur allgemein die bessere Passform jeweils eines der bereits
vorhandenen Enantiomere (s. Abb. 49).
Abbildung 49: Schema des aktiven Zentrums einer (S)-selektiven ATA mit einer kleinen (schwarz) und einer großen Bindetasche (weiß). A) Bei der Bildung des Chinoidintermediats eines α-chiralen Amins wird der kleine (R1) bzw. große Substituent (R2) des Substratamins in der kleinen bzw. großen Bindetasche positioniert. B) Chinoidintermediat eines β-chiralen Amins mit zwei großen Substituenten. Durch das zusätzliche Kohlenstoffatom zwischen Aminogruppe und Chiralitätszentrum des Substrat-amins müssen beide Substituenten des Substrats in der großen Bindetasche platziert werden.
4. Diskussion
51
Für eine enantioselektive Racematspaltung muss im aktiven Zentrum eine deutliche
Unterscheidung der beiden möglichen räumlichen Positionierung der Substituenten möglich
sein. Aufgrund der weniger eindeutigen geometrischen Anordnung, die bei α-chiralen
Aldehyden bzw. β-chiralen Aminen durch das zusätzliche Kohlenstoffatom nur in der großen
Bindetasche stattfinden kann (Abb. 49), ist es wenig überraschend, dass die für Baclofen
erhaltenen Treffer sich so stark in den Enantioselektivitäten unterscheiden, sodass teilweise
schon eine Mutation (z.B. 3HMU 233S) eine umgekehrte Selektivität im Vergleich zum Wildtyp
bedeuten kann. Zu beobachten war auch, dass sich die Präferenz je nach Substrat
unterscheiden kann, obwohl die Substrate eine relativ hohe strukturelle Ähnlichkeit aufweisen.
Beispielsweise bildet Cvi 88L 418L bevorzugt das (R)-Enantiomer der freien Säure und des
Ethylesters, jedoch entsteht für den t-Butylester hauptsächlich das (S)-Enantiomer.
Der erste vielversprechende Treffer aus dem Screening der ATAs auf die Synthese von
Baclofen war 3HMU 233S, welches das (R)-Enantiomer der freien Säure bevorzugt bildete.
Da der Enantiomerenüberschuss mit ca. 60%ee jedoch nicht ausreichend war, nicht ohne
Weiteres verbessert werden konnte und im parallel fortgesetzten Screening weitere
interessante Varianten auftraten, wurde diese ATA als Biokatalysator zur Baclofen-Synthese
verworfen. Im späteren Projektverlauf wurden insbesondere für die freie Säure noch zwei
weitere Varianten der ATAs aus Vibrio fluvialis und Arthrobacter sp. KNK168 gefunden, die
aus zeitlichen Gründen nicht detaillierter untersucht wurden. Da diese selbst im Zellextrakt
sehr gute Enantiomerenüberschüsse und moderate Umsätze erlaubten, sollten diese jedoch
in zukünftigen Experimenten nicht außer Acht gelassen werden.
Für den Ethylester konnten generell nur sehr niedrige Umsätze festgestellt werden. Dies kann
durch die verhältnismäßig niedrige Stabilität dieser Verbindung begründet sein. Sowohl das
Substrat als auch das Produkt können sich pH- und Temperatur-abhängig zum Lacton bzw.
Lactam umlagern. Das Lacton wäre für die meisten Transaminasen als Substrat vermutlich
unzugänglich, sodass dies eine mögliche Erklärung für die niedrigen Umsätze und Aktivitäten
wäre. Außerdem ist es auch möglich, dass der Ethylester einen höheren Dampfdruck als der
t-Butylester aufweist und dadurch flüchtiger ist[97]. Rein strukturell ist nicht klar, weshalb einige
ATAs sowohl die Säure als auch den t-Butylester akzeptieren, jedoch nicht den Ethylester.
Besondere Beachtung fanden Varianten, die in der Lage waren, den t-Butylester umzusetzen.
Dieser sollte theoretisch stabiler sein als der Ethylester und des Weiteren relativ einfach mit
Hilfe organischer Lösungsmittel aus einer wässrigen Reaktion aufzuarbeiten sein. Im Zuge
dieser Arbeit wurden dabei Chloroform, Ethylacetat und MTBE als potenzielle Extraktionsmittel
festgestellt. Die Aufarbeitung der freien Säure wäre deutlich komplizierter, zumal im
Reaktionsgemisch abgesehen von Bestandteilen des Zellextrakts auch noch Reste des im
Überschuss eingesetzten Co-Substrats Alanin vorhanden wären. Für den Umsatz des t-
Butylester fiel im initialen Screening insbesondere eine Fünffach-Variante der ATA 3FCR (59W
87L 231A 382M 429M, im Folgenden 3FCR_5M) ins Auge, da sie als einzige Variante einen
moderaten Umsatz von annähernd 50% mit einem sehr guten Enantiomerenüberschuss von
99%ee (R) erlaubte. Die damit erzielten Ergebnisse werden nachfolgend im Detail diskutiert.
4. Diskussion
52
4.4 3FCR_5M
4.4.1 Optimierung der Reaktion mit gereinigtem Enzym
Mit gereinigter 3FCR_5M wurden Experimente zur Optimierung der Reaktion (Umsatz und
Enantiomerenüberschuss) durchgeführt. Einerseits sollte untersucht werden, welcher Amino-
donor in welcher Konzentration am besten geeignet wäre. Andererseits sollten Bedingungen
gefunden werden, bei der das verbleibende Substrat-Enantiomer racemisiert, sodass
bestenfalls enantiomerenreines (R)-Baclofen in hohen Ausbeuten hergestellt werden kann.
Also potenzielle Aminodonoren wurden L-Alanin, (S)-α-Methylbenzylamin (MBA) und
Isopropylamin (IPA) verwendet. Alanin und MBA fanden davor bereits im Screening
Anwendung, letzteres bei der photometrischen Aktivitätsbestimmung der ATAs. Obwohl dabei
festgestellt wurde, dass 3FCR_5M MBA als Aminodonor akzeptieren kann, konnte keine
Produktbildung mit MBA-Konzentrationen zwischen 100 mM und 500 mM detektiert werden.
Zu beachten ist dabei allerdings, dass das Verhältnis Aminodonor zu Enzymlösung im
photometrischen Assay deutlich geringer war als in der anschließend angesetzten Biokatalyse.
Selbst bei der geringsten MBA-Konzentration wurde im Vergleich zum Assay die 140-fache
Menge MBA auf nur das 10-fache der Enzymlösung eingesetzt, wohingegen nur etwa die
sechsfache Menge Aminoakzeptor eingesetzt wurde. Es ist also möglich, dass das Enzym
zwar die Kombination aus MBA als Donor und dem gewünschten Aldehyd akzeptiert, jedoch
eine Substrat-Inhibition durch den MBA-Überschuss auftritt. Über 3FCR_5M wurde zudem
berichtet, dass IPA sehr gut als Aminodonor in Konzentrationen um 200 mM akzeptiert wird[98].
Dies konnte in der hier vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Nur mit 100 mM IPA
konnten moderate Umsätze erzielt werden, diese waren jedoch gegenüber den mit Alanin
erzielten Resultaten nicht konkurrenzfähig. Dies bedeutet allerdings nicht, dass die in
vorherigen Studien gewonnen Erkenntnisse über die IPA-Akzeptanz falsch sind, auch wenn
nahezu identische Reaktionsbedingungen untersucht wurden. Aufgrund der Erfahrung aus
dieser und anderen Arbeiten ist anzunehmen, dass nicht nur die Wahl des Aminodonors,
sondern auch die exakte Kombination aus Donor und Akzeptor eine Rolle für die Katalyse
spielt. Rückblickend müsste man diese Umstände auch für das Screening von Enzymen
berücksichtigen. Um keine positiven Ergebnisse zu übersehen, müsste man theoretisch alle
verfügbaren Aminodonor-Substrate mit dem gewünschten Akzeptor kombinieren und im
Prinzip auch alle möglichen begleitenden Paramater (Temperatur, pH-Wert, Puffer, Cofaktor-
Konzentration,…) in diversen Kombinationen variieren.
Unter den getesteten Aminodonoren scheint Alanin der geeignetste für die gewünschte
Reaktion zu sein, da bereits bei einem 12,5-fachen molaren Überschuss gegenüber dem
Akzeptor gute Umsätze um 50% erzielt werden konnten. Da der Enantiomerenüberschuss bis
dahin um 99%ee (R) betrug und darüber abnahm, ist davon auszugehen, dass 3FCR_5M zwar
hauptsächlich das (R)-Enantiomer bildet, aber auch in der Lage ist, (S)-Baclofen zu bilden,
sobald das (R)-Enantiomer verbraucht ist. Um dem entgegenzuwirken und parallel auch den
Umsatz zu erhöhen wurden Bedingungen zur in situ Racemisierung des (S)-Aldehyds gesucht.
Eine relativ unkomplizierte Option dafür wäre eine pH-vermittelte Racemisierung, bei der die
basisch katalysierte Keto-Enol-Tautomerie von Aldehyden ausgenutzt wird. Ein erhöhter pH-
Wert kann auch für die Aktivität des Enzyms förderlich sein, da viele Amintransaminasen ihre
pH-Optima um pH 9-11 aufweisen.
4. Diskussion
53
Abbildung 50: Basisch katalysierte Keto-Enol-Tautomerie am Beispiel von 3-(4-Chlorophenyl)-4-amino-Buttersäure-Derivaten.[12]
Wie aus Abbildung 50 ersichtlich wird, kann aus dem (S)-Aldehyd unter basischen
Bedingungen ein achirales Enol werden. Da beide Isomere in einem dynamischen
Gleichgewicht stehen, können aus dem Enol wieder beide Enantiomere des Aldehyds gebildet
werden. Da nun in der Reaktion mit Alanin bei pH 10 ein Umsatz von ca. 90% festgestellt
wurde, der Enantiomerenüberschuss jedoch mit ca. 99%ee (R) gleichbleibend hoch war, kann
davon ausgegangen werden, dass die Racemisierung durch Keto-Enol-Tautomerie unter
diesen Bedingungen abläuft.
4.4.2 Optimierung der Reaktion mit Zellextrakt
Da die Reinigung von Enzymen mittels IMAC-Methode im industriellen Maßstab einen hohen
apparativen Aufwand sowie deutlich höhere Kosten bedeutet, sollte die Reaktion auch mit dem
3FCR_5M-enthaltenden E. coli Zellextrakt durchgeführt und wenn nötig optimiert werden.
Dabei wurde ein deutlich schlechterer Enantiomerenüberschuss, selbst bei Umsätzen unter
50% festgestellt. Im Folgenden soll nun diskutiert werden, welche Ursachen basierend auf den
erfolgten Untersuchungen ausgeschlossen werden konnten und welche Faktoren
hypothetisch zu diesem Ergebnis geführt haben könnten. Zunächst wurde festgestellt, dass
die mit Äkta-gereinigter 3FCR_5M erzielten Ergebnisse (in Abhängigkeit vom Proteingehalt
bzw. der Aktivität) stabil reproduzierbar waren. Dass das Phänomen tatsächlich durch die
Verwendung des Zellextrakts auftritt, wurde durch parallel unter ansonsten gleichen
Bedingungen durchgeführten Reaktionen überprüft, wobei auch beobachtet werden konnte,
dass sich bei sukzessiver Erhöhung des Zellextrakts in der Reaktion auch der
Enantiomerenüberschuss verschlechterte, wobei durch vorherige Normierung der
photometrisch bestimmten Aktivität jedoch annähernd gleiche Umsätze erzielt wurden.
Wodurch unterscheiden sich nun das gereinigte Enzym und der Zellextrakt? Einerseits
natürlich dadurch, dass kaum Verunreinigungen durch andere Proteine und verbleibende
Zelltrümmer vorliegen. Andererseits ist auch die Umgebung - niedermolekulare Substanzen
betreffend - völlig anders, da das gereinigte Enzym theoretisch ausschließlich vom späteren
Reaktionspuffer umgeben ist.
Die erste Annahme war, dass durch die veränderte Umgebung die Racemisierung gestört
werden könnte. Eine einfache Ursache dafür wäre ein Absinken des pH-Werts. Diese
Annahme wurde durch die Experimente mit Ionenaustauschern verstärkt, bei denen
beobachtet wurde, dass im Laufe der Zeit mit dem sauren Ionenaustauscher Amberlyst 15
eine Verringerung des Produkt-Enantiomerenüberschusses auftrat. Aufgrund dessen wurden
Reaktionen im pH-Stat durchgeführt, wobei der pH-Wert nicht nur kontinuierlich überwacht,
4. Diskussion
54
sondern auch durch Titration mit Natronlauge konstant gehalten werden kann. Dabei wurde
jedoch festgestellt, dass es hinsichtlich des pH-Werts keine bedeutenden Unterschiede
zwischen Biokatalysen mit gereinigtem Enzym und Zellextrakt gab.
Ebenfalls wurden die Enantiomerenüberschüsse von Substrat und Produkt im Verlauf der
Reaktion mit beiden Enzympräparationen verglichen, um zu überprüfen, ob die Racemisierung
dennoch gestört werden könnte. Allerdings waren die Substrat-Enantiomerenüberschüsse mit
gereinigter 3FCR_5M und Zellextrakt über den Reaktionsverlauf ungefähr gleich (um 15%ee).
Dementsprechend müsste die Racemisierung auch im Zellextrakt wie gewünscht ablaufen.
Auffällig war jedoch, dass im Zellextrakt das Substrat nach 24 h Reaktion komplett verbraucht
war, wohingegen nur ca. 70% Produkt gebildet wurden. Bei der gereinigten 3FCR_5M
korrelierten die Werte allerdings. Außerdem wurde eine deutliche Abnahme des Produkt-
Enantiomerenüberschusses mit Zellextrakt erst im Verlauf der Reaktion zwischen zwei und 24
Stunden festgestellt, wobei der Umsatz nur noch leicht anstieg und die Werte bis zu zwei
Stunden Reaktionszeit noch annähernde denen mit gereinigtem Enzym entsprachen.
Diese Tatsachen warfen die Frage auf, auf welche Weise das restliche Substrat verloren geht
und ob das Produkt im Zellextrakt eventuell auch racemisiert. Letzterer Fall wurde durch eine
Reaktion des enantiomerenreinen Produkts unter Biokatalysebedingungen mit konzentriertem
Puffer, der zuvor für die Dialyse des Zellextrakts verwendet wurde, und durch Inkubation mit
dem Zellextrakt des Leervektors (pET22b) ausgeschlossen. Weder eine niedermolekulare
Verbindung, noch proteinogene Anteile des Zellextrakts scheinen eine Racemisierung des
Produkts zu bewirken. Umgekehrt wurde keine Produktbildung mit dem Zellextrakt des
Leervektors detektiert, sodass die Unterschiede auch nicht durch eine E. coli eigene ATA
ausgelöst werden können, allerdings wurde auch hier eine Substratabnahme verzeichnet.
Auch durch den dialysierten Zellextrakt wurde der Enantiomerenüberschuss nicht verbessert,
sodass auch das Substrat vermutlich nicht durch eine niedermolekulare Substanz beeinflusst
wird. Der Verlust des Substrats durch Instabilität wurde ebenfalls durch eine Reaktion ohne
Enzym, nur mit dem entsprechenden Reaktionspuffer ausgeschlossen.
Die wahrscheinlichste Option ist, dass das Substrat durch ein E. coli eigenes Enzym oxidiert
oder reduziert wird und daher nicht mehr für die Transaminase verfügbar ist. Möglicherweise
wird dabei sogar bevorzugt das (R)-Enantiomer der Zielreaktion entzogen, sodass ein
niedriger Produkt-Enantiomerenüberschuss zustande kommt. Leider konnten weder der
korrespondierende Alkohol noch die Carbonsäure bis zum Verfassen dieser Arbeit
nachgewiesen werden. Da keine Standards für diese Substanzen zur Verfügung standen bzw.
kommerziell erhältlich sind, konnten auch keine Experimente zur Etablierung einer
entsprechenden Analytik unternommen werden. Nebenreaktionen mit den Enzymen des
Wirtsstamms sind ein häufiges Problem bei der Verwendung von Zellextrakt bzw. ganzer
Zellen als Biokatalysator. Dies wurde unter anderem von Kunjapur et al. für die Synthese
aromatischer Aldehyde beobachtet, sodass sie einen E. coli Stamm entwickelten, in dem
jeweils drei Gene, die für Aldo-Keto-Reduktasen bzw. Alkoholdehydrogenasen codieren,
deletiert wurden. Dadurch konnte eine Akkumulation von Vanillin in Ganzzellbiokatalysen um
das 55-Fache gegenüber E. coli K12 MG1655, welcher als Wildtyp-Stamm für die Deletionen
verwendet wurde, gesteigert werden, ohne dass große Mengen des Produkts weiter zu
Vanillyl-Alkohol umgesetzt wurden.[86] Mit diesem Stamm, E. coli RARE (reduced aromatic
aldehyde reduction), wurden in der vorliegenden Arbeit jedoch lediglich dieselben Ergebnisse
erzielt wie mit dem Zellextrakt von E. coli BL21. Dadurch kann der Umsatz des Substrats durch
4. Diskussion
55
ein anderes Enzym jedoch immer noch nicht ganz ausgeschlossen werden. Die in E. coli
RARE deletierten Gene wurden basierend auf dem Umsatz von Benzaldehyd ausgewählt,
allerdings können noch weitere Aldehyd-Reduktasen bzw. Alkoholdehydrogenasen in E. coli
K12 gefunden werden[99]. Auch der Umsatz zur Carbonsäure durch eine E. coli eigene
Aldehyd-dehydrogenase ist mit dem aktuellen Kenntnisstand nicht auszuschließen[100].
In weiteren Experimenten wurde festgestellt, dass auch die Reaktionsbedingungen, die zu
sehr guten Ergebnissen mit dem gereinigten Enzym führten, nicht optimal für den Zellextrakt
zu sein schienen. Eine Verringerung der Reaktionstemperatur auf 20°C und Erhöhung des
DMSO-Anteils auf 30% konnten den Umsatz und geringerem Maße auch den
Enantiomerenüberschuss signifikant erhöhen. Der Einfluss der Reaktionstemperatur auf den
Umsatz beruht auf der höheren Stabilität der 3FCR_5M bei niedrigeren Temperaturen. Dass
das Enzym selbst bei 37°C nicht lange stabil ist (vollständiger Aktivitätsverlust nach zwei
Stunden) wurde durch Experimente zu einer möglichen Hitzefällung zur Reinigung beobachtet.
Daher lag eine Verringerung der Reaktionstemperatur nahe. Durch den erhöhten DMSO-
Gehalt konnte der Enantiomerenüberschuss leicht verbessert werden. Bereits in früheren
Studien konnte gezeigt werden, dass auch die Co-Solvenz-Konzentration einen maßgeblichen
Einfluss auf die Enantioselektivität des Enzyms haben kann. Zum Beispiel konnten Skalden et
al. in einer Enzymkaskade aus einer Enoatreduktase und Transaminase den Diastereomeren-
überschuss des Produkts von 66%de auf 89%de durch die Erhöhung der DMSO-
Konzentration von 1% auf 30% (v/v) steigern[95].
Da festgestellt wurde, dass mit gereinigtem Enzym zufriedenstellende Ergebnisse erzielt
werden konnten und die Hypothese aufgestellt wurde, dass eine enzymatische Nebenreaktion
die Synthese im Zellextrakt stört, wurde nach Alternativen zur Reinigung der 3FCR_5M
gesucht. Dafür wurden Experimente zur Hitzefällung[101], zu Protease-vermittelter
Reinigung[102], zur Immobilisierung an EziG-Beads[103] und zur fraktionierenden Ammonium-
sulfat-Fällung[104] vorgenommen. Aktive 3FCR_5M konnte jedoch lediglich mit Hilfe der
Ammoniumsulfat-Fällung gewonnen werden. Mit Hilfe des so vorgereinigten Enzyms konnten
annähernd dieselben Ergebnisse wie mit der Äkta-gereinigten 3FCR_5M erzielt werden, wobei
es sich um eine kostengünstige und einfach durchführbare Alternative handelt.
Interessanterweise konnte mit einer SDS-PAGE festgestellt werden, dass sich das
Bandenmuster nach der Ammoniumsulfatfällung kaum vom Zellextrakt unterscheidet und das
Enzym bei weitem nicht so rein vorliegt wie nach der Äkta. Deutlich erkennbare Unterschiede
waren ein verringerter Hintergrund sowie eine Bande bei ca. 25 kDa, die in der Spur mit dem
gefällten Enzym fehlt. Greift man nun die zuvor aufgestellte Hypothese einer enzymatischen
Nebenreaktion auf, so gäbe es tatsächlich zwei putative Oxidoreduktasen aus E. coli K12 mit
nachgewiesener Aldehydreduktase-Aktivität, YkgE und YgfF[105,106]. Rodriquez et al. unter-
suchten 2014 44 potenzielle endogene Aldehydreduktasen aus E. coli K12 auf den Umsatz
von Isobutyraldehyd zu Isobutanol vor dem Hintergrund, durch Deletionen die Synthese von
Aldehyden verbessern zu wollen, wobei auch die beiden genannten Enzyme die
entsprechende Aktivität aufwiesen[106]. Selbstverständlich kann durch diese Vermutung ein
Umsatz des hier verwendeten Substrats durch diese Enzyme noch nicht bewiesen werden,
jedoch könnte man mit diesem Wissen die beiden Enzyme gezielt exprimieren und reinigen,
um dann zu testen ob sie den verwendeten Aldehyd umsetzen können.
Zusammenfassend muss an dieser Stelle gesagt werden, dass der Auslöser für die veränderte
Enantioselektivität im Zellextrakt nach wie vor unklar ist. Möglicherweise handelt es sich auch
4. Diskussion
56
um eine Kombination verschiedener Ursachen, zum Beispiel einer enzymatischen
Nebenreaktion und einer Beeinflussung der Enantioselektivität der 3FCR_5M selbst durch die
veränderte chemische Umgebung.
4.5 Up-Scaling
In einem Vorversuch zur Erhöhung der Ausbeute der Reaktion wurde untersucht, ob die
Substratkonzentration weiter erhöht werden kann. Dafür wurden Aminodonor- und Akzeptor-
Konzentration gleichzeitig verdoppelt bzw. verdreifacht. Dabei wurde allerdings festgestellt,
dass die erhaltene Produktkonzentration bei gleicher Enzymkonzentration und Reaktionszeit
nicht proportional dazu anstieg. Bei derartig hohen Substratkonzentrationen ist es möglich,
dass es zu einer Substratinhibierung des Enzyms kommt. Während des katalytischen Zyklus
der Transaminase kann ein Substrat an zwei Stellen an das Enzym binden (Mechanismus
s.1.6.1). Kommt es nun nicht am richtigen Punkt des Mechanismus zu einer Interaktion mit
einem der Substrate, kann die Reaktion nicht fortgesetzt werden, da ein sogenannter dead-
end Komplex entsteht. Im Falle der hier durchgeführten Reaktion würde dieser Fall eintreten,
wenn das Aldehyd-Substrat an das interne Aldimin (PLP-Form, E-PLP) bzw. Alanin an die
PMP-Form des Enzyms (E-PMP) bindet. Außerdem kann die Inhibierung auch in Abhängigkeit
vom jeweiligen Substrat-Enantiomer auf unterschiedliche Weise verlaufen. So wurde zum
Beispiel für die (S)-selektive Transaminase aus Vibrio fluvialis gezeigt, dass die Inhibierung
durch das (S)-Amin auftritt, da dieses an E-PMP bindet. Bindet das (R)-Amin jedoch an E-
PLP, kann das Proton am α-Kohlenstoffatom des Cofaktors aufgrund der Entfernung zum
enzymatischen Lysinrest nicht mehr abstrahiert werden, wodurch der katalytische Zyklus ab
diesem Punkt nicht mehr fortgesetzt werden kann[107]. In der vorliegenden Arbeit konnte der
Umsatz einer höheren Substratkonzentration auch nicht durch die Verwendung einer größeren
Menge Enzym verbessert werden, lediglich bei einer zeitlich versetzten Zugabe des
Biokatalysators konnte ein entsprechend höherer Umsatz erzielt werden. Durch zeitlich
versetzte Zugabe der Substrate konnte jedoch kein höherer Umsatz erzielt werden. In einem
zukünftigen industriellen Prozess wäre jedoch die kontinuierliche Zugabe von Substrat deutlich
praktikabler als die permanente Verfügbarkeit einer frischen Enzympräparation, die
kontinuierlich zugesetzt werden müsste. Der limitierende Faktor ist hier vermutlich die
Enzymstabilität, deren Optimierung ein notwendiger Schritt für die zukünftige Anwendung
wäre. Mit den Methoden des Protein-Engineerings könnte sowohl die Einschränkung durch die
Enzymstabilität als auch durch die eventuell auftretende Substratinhibierung beseitigt werden.
Die Transaminase-Variante 3FCR_5M wurde in einer Studie zur Entwicklung einer
Transaminase für die asymmetrische Synthese sterisch anspruchsvoller chiraler Amine
hergestellt. Während des rationalen Designs wurde unter anderem die Position Y152 als
relevant für die Katalyse ausgewählt, da dieser Rest im Wildtyp-Enzym an der Koordination
des Cofaktors beteiligt ist. Nach einem Austausch zu Phenylalanin wurde festgestellt, dass
diese 3FCR-Variante eine höhere Stabilität aufwies.[98] Das Erstellen einer Variante mit Y152F
könnte also durchaus auch die Stabilität der hier verwendeten 3FCR_5M verbessern.
Auch eine Produktinhibierung ist nicht auszuschließen. Sollte es ab einer bestimmten
Konzentration dazu kommen, bieten sich insbesondere Prozessoptimierungen als Lösung an.
ISPR- Methoden (in situ product removal) können dabei gleichzeitig auch zur Aufarbeitung der
Produkte dienen. Grundsätzlich wäre es vorteilhaft, eine derartige Technik für die hier
4. Diskussion
57
durchgeführte Reaktion zu entwickeln, da bisher nur die Extraktion des Produkts mit
organischen Lösungsmitteln untersucht wurde. Zu diesen Techniken zählen Beispielsweise
Zweiphasensysteme, membranvermittelte Produktentfernung oder die Entfernung des
Produkts durch selektive Kristallisation[47,108,109]. Auch eine enzymatische Entfernung des Co-
Produkts Pyruvat wäre denkbar, zum Beispiel durch eine Kombination als einer Lactat- und
einer Glukose-Dehydrogenase[45] oder durch eine Pyruvat-Decarboxylase[44]. Vorteilhaft wäre
daran außerdem, dass das Reaktionsgleichgewicht noch weiter in die gewünschte Richtung
verschoben werden würde. Dabei ist jedoch fraglich, ob alle beteiligten Enzyme unter den
bisher verwendeten Bedingungen (pH 10) stabil und aktiv wären, sodass nochmals die
optimalen Reaktionsbedingungen bestimmt werden müssten.
Um die Synthese in großem Maßstab durchführen zu können, muss ebenfalls die Expression
der 3FCR_5M optimiert und hochskaliert werden. Daher wurden Experimente zur Batch-
Fermentation im 1L-Maßstab vorgenommen. Durch verschiedene Optimierungen (konstante
Temperatur, spätere Induktion) konnte damit die ca. 20-Fache volumetrische 3FCR_5M-
Aktivität gegenüber der Expression im Schüttelkolben (400 mL-Maßstab) produziert werden.
Bei der Kultivierung im Bioreaktor können die für das Zellwachstum und die Expression
relevanten Bedingungen im Gegensatz zum Schüttelkolben-Experiment im Detail überwacht
und gesteuert werden. So können zum Beispiel durch die Kontrolle des pH-Werts und Titration
mit Natronlauge höhere Zelldichten erzielt werden, da während des aeroben Wachstums
gebildete saure Sekundärmetabolite neutralisiert werden, sodass sie das Wachstum nicht
inhibieren. Auch die Überwachung der Sauerstoffsättigung und deren Regulierung durch
Rühren und gezielte Zufuhr von synthetischer Luft begünstigen das Erreichen hoher
Zelldichten.[110]
Mit der im Bioreaktor hergestellten 3FCR_5M wurden erste Experimente zum Up-Scaling der
Biokatalyse vorgenommen. Unter anderem wurde die Ammoniumsulfat-Fällung in größerem
Maßstab (30 mL) durchgeführt. Dabei wurde allerdings festgestellt, dass mit der im kleineren
Maßstab erfolgreichen fraktionierenden Fällung mit 40 und 60% Ammoniumsulfatsättigung
ähnliche Enantiomerenüberschüsse wie mit dem Zellextrakt erzielt wurden. Die Fraktionierung
musste auf 50 und 70% korrigiert werden. Dies zeigte einen möglichen Nachteil dieser
Reinigungsmethode, deren Erfolg von der Zusammensetzung des Zellextrakts abhängig
ist[104]. Da diese durch die veränderten Kultivierungsbedingungen und Regulierungen im
Fermenter ebenfalls variieren kann, wäre zu überprüfen, ob die Reinigungsmethode auch bei
einer Enzymproduktion im industriellen Maßstab noch reproduzierbar angewendet werden
kann. Mit dem im Fermenter produzierten Enzym, welches fraktionierend mit Ammoniumsulfat
gefällt wurde, wurden auch Experimente zur Skalierung der Reaktion vom 0,7 mL in den 10 mL
Maßstab unternommen. Dabei wurden zwei Varianten untersucht, nämlich die Durchführung
im pH-Stat und im 500 mL-Schüttelkolben. Die daraus erhaltenen Daten sind nicht gezeigt
worden, da aus der Reaktion im pH-Stat kein Produkt detektiert werden konnte und im
Schüttelkolben nur 30% Umsatz mit 60%ee (R) erzielt wurden. Eine naheliegende Vermutung
ist, dass die Durchmischung im Vergleich zum kleinen Maßstab nicht ausreichend war. Im
Vergleich zum pH-Stat bot der Schüttelkolben eine größere Oberfläche, was die
Durchmischung verbessert haben müsste, jedoch auch nicht das hohe Schütteltempo der
Reaktionen im kleinen Maßstab ermöglichte. Optimal wäre sicherlich eine Reaktion im
Bioreaktor, da alle Parameter ganz gezielt eingestellt werden könnten und eine
gleichmäßigere Durchmischung gewährleistet wäre. Dafür wäre jedoch eine recht große
4. Diskussion
58
Menge Material für mehrere Versuche nötig gewesen und zum Ende des Projekts konnten
keine größeren Mengen des Aldehyd-Substrats mehr bereitgestellt werden. Dennoch wurde
in der vorliegenden Arbeit eine solide Grundlage für die weitere Optimierung und das Up-
Scaling der Reaktion geschaffen.
5. Zusammenfassung
59
5. Zusammenfassung
β-chirale Amine, wie zum Beispiel Pregabalin und Baclofen, sind Verbindungen von großem
Interesse insbesondere für die pharmazeutische Industrie. Biokatalytische Herstellungs-
verfahren, vor allem Aminierungsreaktionen, sind bisher nur geringfügig untersucht worden
und werden nach aktuellem Wissenstand bis auf die Synthese von Niraparib[57] noch nicht in
großtechnischem Maßstab eingesetzt. Wünschenswert ist die Etablierung einer Synthese,
welche (S)-Pregabalin bzw. (R)-Baclofen in hohen Ausbeuten liefert, da diese beiden
Enantiomere jeweils die höhere biologische Wirksamkeit aufweisen.
Ziel dieser Arbeit war die Synthese von Pregabalin und Baclofen als Modellverbindungen für
β-chirale Amine mit Hilfe einer selektiven Amintransaminase oder Amindehydrogenase.
Zunächst wurde erfolgreich mit Hilfe der Gaschromatographie bzw. HPLC jeweils eine chirale
Analytik für die beiden Reaktionsprodukte sowie die Baclofen-Derivate etabliert, die stabil
reproduzierbar und auch zur Quantifizierung geeignet war. Auch für 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-
buttersäure-t-butylester konnte eine GC-Methode entwickelt werden, die Aufschluss über die
Konzentration und den Enantiomerenüberschuss gab.
Die vier zur Verfügung gestellten Amindehydrogenasen konnten erfolgreich exprimiert und
mittels IMAC-Methode gereinigt werden. Trotz geringer Aktivitäten in einem photometrischen
NADH-Assay konnte jedoch keine Produktbildung nachgewiesen werden. Eine Kollektion von
ca. 150 Amintransaminasen wurde bezüglich der Desaminierung von Pregabalin und Baclofen
mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. In Richtung der Aminierung wurde ein
photometrischer Acetophenon-Assay verwendet. Dabei wurden für Pregabalin sechs und für
Baclofen 17 potenzielle Kandidaten ermittelt. Besonders vielversprechend war die Variante
3FCR 59W 87L 231A 382M 429A (3FCR_5M), welche 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-
butylester als Substrat akzeptierte. Nach der Ermittlung eines geeigneten Aminodonors und
Optimierung der Reaktionsbedingungen konnten Umsätze bis zu 90% bei 99%ee (R) mit
IMAC-gereinigter 3FCR_5M erzielt werden.
Um Kosten für ein späteres großtechnisches Verfahren einzusparen, sollte die Reaktion
ebenfalls für den Einsatz von Zellextrakt optimiert werden. Dabei wurde beobachtet, dass
geringere Enantiomerenüberschüsse erzielt wurden als mit dem gereinigten Enzym und der
Substratverbrauch höher als die Produktbildung war. Als mögliche Ursachen wurden der
Umsatz des Substrats durch ein E. coli eigenes Enzym, beispielsweise eine Aldehydreduktase
oder Aldehyddehydrogenase, sowie eine Beeinflussung der Enantioselektivität durch die
veränderte chemische Umgebung oder den selektiven Entzug des gewünschten Substrat-
Enantiomers durch eine selektive Nebenreaktion hypothetisiert. Dieses Phänomen konnte
durch eine vorgeschaltete Reinigung mittels fraktionierender Ammoniumsulfat-Fällung jedoch
erfolgreich umgangen werden. Mit dieser Methode konnten vergleichbar hohe Umsätze und
Enantiomerenüberschüsse wie mit dem IMAC-gereinigten Enzym erreicht werden.
Bei ersten Vorversuchen zum Up-Scaling der Reaktion wurde festgestellt, dass eine höhere
Substratkonzentration nicht einen proportional höheren Umsatz zur Folge hatte, jedoch konnte
der Umsatz durch eine versetzte Zugabe der Enzymlösung gesteigert werden, sodass ein
Prozess mit diesem Biokatalysator in seiner aktuellen Form eine kontinuierliche Zugabe
erfordern würde. Praktikabel wäre einer Verminderung der Substrat-Inhibierung und Erhöhung
der Enzymstabilität durch weiteres Protein-Engineering. Auch zur Produktion von 3FCR_5M
5. Zusammenfassung
60
im größeren Maßstab wurden Experimente vorgenommen. Dabei konnte gezeigt werden, dass
eine vielversprechende Expression im Bioreaktor bei einer kontinuierlichen Temperatur von
30°C und einer Expressionsdauer von sieben Stunden. Nach einigen Optimierungsschritten
konnte im Bioreaktor die zwanzigfache volumetrische Aktivität im Vergleich zur Expression im
Schüttelkolben erzeugt werden.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit, trotz weiterem
Optimierungsbedarf, eine sehr gute Grundlage für die Transaminase-vermittelte Synthese von
(R)-Baclofen geschaffen wurde. In zukünftigen Arbeiten sollte die Optimierung der Reaktion in
großem Maßstab im Fokus stehen.
6. Material und Methoden
61
6. Material und Methoden
6.1 Geräte
Gerät Bezeichnung Hersteller
Autoklav V-120 Systec, Wettenberg
Affinitätschromatographie-
Säule
5 mL His Trap HP GE Healthcare, Freiburg
Bioreaktor BioFlo 110 2 Liter New Brunswick Scientific
Co., Edison (USA)
Brutschrank Friocell
Incucell
MMM Medcenter-
Einrichtungen GmbH,
Planegg/München
DNA Elektrophorese Sub Cell G
Mini-Sub Cell GT
Biorad, München
Dampfkochtopf Varioklav® Medizintechnik GmbH,
Oberschließheim
Entsalzungssäule PD-10 GE Healthcare, Freiburg
Feinwaagen AC120S
BP110S
Ohaus Explorer
Sartorius AG, Göttingen
Ohaus Corp., Pine Brook
(USA)
Flourimeter Infinite® M200PRO Tecan Deutschland GmbH,
Crailsheim
GC GC-14A 5890 Series II Shimadzu, Duisburg
GC-MS GCMS-QP2010 Shimadzu, Duisburg
GC-Trennsäulen BPX-5
CP-Chirasil-Dex CB
Hydrodex β-3P
Macherey Nagel, Düren
Agilent, Santa Clara (USA)
Macherey Nagel, Düren
Homogenisator FastPrep®-24 MP Biomedicals, Solon
(USA)
HPLC Elite LaChrom
Column oven L-2300
Organizer
Autosampler L-2200
UV-Detektor L-2400
Pumpe L-2130
Hitachi High-technologies
Europe GmbH, Mannheim
HPLC-Säule Chirex 3126 D-Penicillamin
150 x 4,6 mm
Phenomenex Inc., Torrance
(USA)
Kapillarelektrophorese P/ACE™ MDQ Capillary
Electrophoresis System
Beckman Coulter (Krefeld)
Magnetrührer RCT Basic IKA® Werke GmbH & Co.
KG, Filderstadt
Netzgeräte Standard Power Pack P25 Biometra, Göttingen
Orbitalschüttler Polymax 1040 Heidolph Instruments GmbH
& co. KG, Schwabach
PCR-Geräte FlexCycler Analytik Jena, Jena
6. Material und Methoden
62
Thermocycler Progene
Touchgene Gradient
Techne, Cambridge (UK)
pH-Meter Microprocessor HI 9321 HANNA Instruments GmbH
& Co KG, Kehl
pH-Stat Titrino Plus 877
Haake Fisons D8 mit Haake
Fisons G Wasserbad
Methorhm GmbH & Co. KG,
Filderstadt
Therme Haake GmbH,
Karlsruhe
Proteinreinigung ÄKTATM Purifier
UV-900
pH/C-900
Frac-95
GE Healthcare Europe,
München
Proteinelektrophorese Mini-PROTEAN 3
Minigel-Twin
BioRad, München
Biometra, Göttingen
Schüttelinkubatoren Unitron
Infors HT Minitron
Infors AG, Bottmingen-Basel
(Schweiz)
Sicherheitswerkbank HeraSafe KS15 Thermo Fisher Scientific,
Waltham (USA)
Thermomixer Thermomixer Comfort Eppendorf, Wessling-
Berzdorf
Ultraschallbad Sonorex Super RK512H BANDELIN electronic GmbH
& Co. KG, Berlin
Ultraschallgerät Sonoplus HD2070 UW 2070 BANDELIN electronic GmbH
& Co. KG, Berlin
Vortexer Vortex genie 2 Scientific Industries, Inc.
Bohemia (USA)
Zentrifugen Heraeus Labofuge 400R
Heraeus Multifuge 3S-R
Heraeus Biofuge pico
Heraeus Fresco 17
Thermo Fisher Scientific,
waltham (USA)
6.2 Chemikalien und Verbrauchsmittel
Sofern nicht anders aufgeführt, wurden Chemikalien und Verbrauchsmaterialien von Sigma
(Steinheim, Deutschland, mittlerweile Merck), EuRx (Danzig, Polen), Carl Roth (Karlsruhe,
Deutschland), Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz, mittlerweile
Merck), Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA), Merck (Darmstadt, Deutschland),
ChiroBlock GmbH (Wolfen, Deutschland), New England Biolabs (Frankfurt am Main,
Deutschland) und EnginZyme (Stockholm, Schweden) bezogen.
6. Material und Methoden
63
6.3 Bakterienstämme
Stamm Genotyp
E. coli TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74
nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16
rpsL(StrR) endA1 λ-
E. coli BL21 (DE3) fhuA2 (lon) ompT gal (dcm) ΔhsdS λ (DE3)
E. coli K-12 MG1655 RARE
(AMK018)
F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1 (DE3) ΔdkgB ΔyeaE Δ(yqhC-dkgA)
ΔyahK ΔyjgB
6.4 Primer
Die Primer wurden bei Invitrogen (Darmstadt, Deutschland) bestellt. Alle Primer lagen als
Lyophilisat vor und wurden in MilliQ-Wasser gelöst und bis zu einer Konzentration von
100 pmol verdünnt. Jede Primerlösung wurde vor dem Gebrauch nochmals 1:10 verdünnt.
Name Sequenz 5‘-3‘ Verwendung
CLF2_fw gtgatcgccggctcggcgttgttgcag QuikChange™
CFL2_rv catggcgcggctctttcagctgcaacaac QuikChange™
pET_fw taatacgactcact Sequenzierung
pET_rv gggttatgcttattgcrcag Sequenzierung
6.5 Plasmide
Plasmid Resistenzmarker Induktor Einklonierte Gene codieren für
pET22b Ampicillin IPTG ATAs: AspFum, GibZea, NeoFis,
JanSp, MesLoti, RosSp, ArR, 3GJU,
3FCR, 3HMU, 3I5T
pET24b Kanamycin IPTG ATA: Vfl, Cvi
pET28a Kanamycin IPTG AmDHs: LeuDH, PheDH, CFL1, CFL2
pET28b Kanamycin IPTG ATA: 2YKY
pGASTON Ampicillin Rhamnose ATAs: AspOry, AspTer, MycVan,
PenChr, BurSp, RhiEtli, HypNep,
GamPro, LabAle, MarSp, MesLot,
RhoFer
6.6 Enzyme
Enzym Spezies GeneID/PDB Varianten
AmDHs[52–
54]
LeuDH Bacillus
stearothermophilus
PheDH Bacillus badius
CFL1
CFL2
6. Material und Methoden
64
TAs
AspFum Aspergillus
fumigatus
70986662 WT
AspOry Aspergillus oryzae 169768191 WT
AspTer Aspergillus terreus 115385557 WT
GibZea Gibberella zeae 46109768 WT
MycVan Mycobacterium
vanbaalenii
120405468 WT
NeoFis Neosartorya fisheri 119483224 WT
PenChr Penicillium
chysogenium
211591081 WT
BurSp Burkholderia sp. 78059900 WT
RhiEtli Rhizobium etli 190895112 WT
HypNep Hyphomonas
neptunium
114797240 WT
GamPro Gamma
proteobacterium
219677744 WT
LabAle Labrenzia
alexandrii
EEE43073 WT
JanSp Jannashia sp. 89053613 WT
MarSp Marimonas sp. 87122653 WT
MesLoti Mesorhizobium loti
(13)
13471580 WT
MesLot Mesorhizobium loti
(14)
20804076 WT
RosSp Roseobacter sp. 86137542 WT
RhoFer Rhodoferax
ferrireducens
89899273 WT
ArR[48,96,111] Arthobacter sp.
KNK168 (V306I)
3WWJ ATA 117;
ArRmut 11 279A; ArRmut11 117f
279A;
ArRmut11 60V 117F 279A
3GJU Mesorhizobium loti
maff303099
3GJU WT
3FCR Ruegeria sp.
TM1040
3FCR WT; 19F; 59W; 59W 231A; 59W 420A;
59F 420A; 59W 87F 152F 231A; 59W
87L 231A 382M 249A (3FCR_5M);
59F; 87F; 88F; 231A; 231A 420A;
231A 422V; 420A; 422V
3HMU Ruegeria pomeroyi 3HMU WT; 25S; 63Y; 63Y 233S; 91Y; 91A;
92Y; 92V; 233S; 233T; 419M
3I5T Rhofobacter
sphaeroides
3I5T WT; 60L; 89F; 90F; 418A; 418M
3N5M Bacillus anthracis 3N5M WT; R162A; I315G; R410A
2YKY Mesorhizobium sp.
Strain LUK
2YKY WT
Vfl Vibrio fluvialis 4E3Q WT; 19A; 19A 56V 57F 85V 86S; 19C;
19V; 19Y
6. Material und Methoden
65
56V 57C 85V; 56A; 56A 57L 86A
415C 417V; 56A 57F 86S 415C 417A;
56F; 56I; 56M; 56S; 56 V; 56V 57C;
56C 57F; 56V 57C 417V; 56V 57C
153A 415F 417A; 56V 415C; 56W;
56Y; 57C; 57F; 57F 153A 415L; 57F
415L; 57F 415L 417V; 57F 417V; 63Y;
85A; 85L; 85L 150F; 85L 150M; 85L
150M 153A; 85L 153A; 85V; 86A; 86S;
86V; 91Q; 91Q 85A; 91Q 85L;130Y;
150F; 150M; 150M 153A; 153A; 153I;
163S; 177L; 179T; 228C; 228G; 228I;
228S; 228T; 228V; 232V; 239W;
255A; 284F; 415L; 415F 417A
Cvi Chromobacterium
violaceum
4A6T WT; 71L; 71L 133H; 71L 133H 181V;
88V; 88L; 88L 418L; 88L 418G; 133H;
181V
PigE Serratia sp. FS14 4PPM WT
Kat Cloacimonas
acidaminovorans
B0VH76 WT
Kommerzielle Enzyme Hersteller
T4-DNA-Ligase Thermo Fisher Scientific
OptiTaq-DNA-Polymerase EuRx
Pfu+-DNA-Polymerase Thermo Fisher Scientific
DNaseI Sigma
Lysozym Sigma
Proteinase K Sigma
Trypsin Sigma
6.7 Medien und Zusätze
6.7.1 Antibiotika und Induktoren
Ampicillin 100 mg/mL Stammlösung in A. dest
Kanamycin 50 mg/mL Stammlösung in A. dest
IPTG 1 M Stammlösung in A. dest
Rhamnose 20% (w/v) Stammlösung in A. dest
6.7.2 Wachstumsmedien und Zusätze
LB-Medium[112]/LB-
Agar
Hefeextrakt
Trypton
NaCl
Agar
5 g
10 g
10 g
15 g
6. Material und Methoden
66
A. dest Auf 1 L auffüllen
Autoklavieren
10 x SOC[113] KCl
MgCl2
MgSO4
Glucosemonohydrat
A. dest
Steril filtrieren
100 mg
1 g
1 g
2 g
Auf 50 mL auffüllen
TB-Medium[114] Hefeextrakt
Pepton/Trypton
Glycerol
A. dest
24 g
12 g
5 mL
Auf 900 mL auffüllen
Autoklavieren und 100 mL 10 x TB-Salze
hinzufügen
10 x TB-Salze[114] KH2PO4
K2HPO4 x 3 H2O
A. dest
Autoklavieren
23,2 g
164,4 g
Auf 1 L auffüllen
6.8 Puffer
6.8.1 Agarose-Gelelektrophorese
50 x TAE-Puffer,
pH 8,0
Tris
Essigsäure
0,5 M EDTA
A. dest
242 g
57,1 mL
100 mL
Auf 1 L auffüllen
pH mit Essigsäure oder NaOH einstellen
6x DNA-Auftrage-
Puffer
Bromphenolblau
Glycerol
10 x TAE-Puffer
250 mg
300 µL
Auf 1 mL auffüllen
6.8.2 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen[115]
TfB1-Puffer CH3COOK
KCl
CaCl2
Glycerol
A. dest
Autoklavieren
1,47 g
3,73 g
0,55 g
65 mL
Auf 500 mL auffüllen
TfB2-Puffer KCl
CaCl2
3-(N-Morpholino)-
propansulfonsäure (MOPS)
Glycerol
A. dest
Autoklavieren
0,37 g
5,55 g
1,05 g
65 mL
Auf 500 mL auffüllen
6. Material und Methoden
67
1 M MgCl2-
Lösung
MgCl2 x 4 H2O
A. dest
Steril filtrieren
4,76 g
Auf 50 mL auffüllen
6.8.3 Zell- und Protein-Puffer
50 mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 7,5
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
A. dest
14,49 g
1,31 g
Auf 1 L auffüllen
(NaPP) pH mit HCl oder NaOH einstellen
50 mM HEPES-
Puffer, pH 8
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-
piperazinyl)ethansulfonsäure
(HEPES)
A. dest
pH mit HCl oder NaOH einstellen
11,9 g
Auf 1 L auffüllen
100 mM CHES-
Puffer, pH 10
2-
(Cyclohexylamino)ethansulfonsäure
(CHES)
A. dest
pH mit HCl oder NaOH einstellen
10,36 g
Auf 1 L auffüllen
1 M
Ammoniumformiat-
Puffer, pH 8,5
NH4(HCOO)
A. dest
pH mit NH3 einstellen
63 g
Auf 1 L auffüllen
6.8.4 Proteinreinigung
6.8.4.1 HisSelect®-Filter-Platten
Equilibrierungspuffer:
50 mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 8, 0,3 M
NaCl
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
NaCl
A. dest
14,49 g
1,31 g
17,52 g
Auf 1 L auffüllen
Waschpuffer: 50 mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 8, 0,3 M
NaCl, 5 mM Imidazol
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
NaCl
Imidazol
A. dest
14,49 g
1,31 g
17,52 g
0,34 g
Auf 1 L auffüllen
Elutionspuffer: 50
mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 8, 0,3 M
NaCl, 250 mM
Imidazol
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
NaCl
Imidazol
A. dest
14,49 g
1,31 g
17,52 g
17 g
Auf 1 L auffüllen
pH jeweils mit HCl oder NaOH einstellen
6. Material und Methoden
68
6.8.4.2 ÄKTA
ATAs
Waschpuffer: 100 mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 7,4, 0,3 M
NaCl, 15 mM Imidazol
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
NaCl
Imidazol
A. dest
23,5 g
4,75 g
17,52 g
1,02 g
Auf 1 L auffüllen
Elutionspuffer:
100 mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 7,4, 0,3 M
NaCl, 0,3 M Imidazol
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
NaCl
Imidazol
A. dest
23,5 g
4,75 g
17,52 g
20,4 g
Auf 1 L auffüllen
AmDHs
Waschpuffer: 20 mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 7,4, 0,3 M
NaCl, 15 mM Imidazol
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
NaCl
Imidazol
A. dest
11,75 g
0,95 g
17,52 g
1,02 g
Auf 1 L auffüllen
Elutionspuffer: 20 mM
Natriumphosphat-
Puffer, pH 7,4, 0,3 M
NaCl, 0,3 M Imidazol
Na2HPO4 x 12 H2O
NaH2PO4 x H2O
NaCl
Imidazol
A. dest
11,75 g
0,95 g
17,52 g
20,4 g
Auf 1 L auffüllen
pH jeweils mit HCl oder NaOH einstellen
6.8.5 SDS-PAGE-Lösungen und -Puffer[116]
10 x SDS-
Laufpuffer
Tris
Glycin
SDS
A. dest
30,3 g
144 g
10 g
Auf 1 L auffüllen
Probenpuffer 0,5 M upper Tris
10% SDS
0,5 % Bromphenolblau
β-Mercaptoethanol
Glycerol
A. dest
1,25 mL
2 mL
0,2 mL
0,5 mL
2,5 mL
3,35 mL
Upper Tris (0,5 M
Tris-HCl, pH 6,8)
Tris
SDS
A. dest
6 g
0,1 g
Auf 100 mL auffüllen
pH mit HCl oder NaOH einstellen
Lower Tris (1,5 M
Tris-HCl, pH 8,8)
Tris
SDS
A. dest
18,2 g
0,1 g
Auf 100 mL auffüllen
pH mit HCl oder NaOH einstellen
APS-Lösung Ammoniumpersulfat 10% (w/v) in A. dest
6. Material und Methoden
69
Acrylamid-Lösung
(Roth)
Acrylamid
Bisacrylamid
A. dest
30%
0,8%
Coomassie brilliant
blue
Coomassie Brilliant Blue R250
Eisessig
Ethanol
A. dest
1 g
100 mL
300 mL
600 mL
Entfärber Eisessig
Ethanol
A. dest
100 mL
300 mL
600 mL
6.8.6 Assay Lösungen
Acetophenon-Assay Aminodonor (α-MBA/α-EBA)
Aminoakzeptor (Na-
Pyruvat/Aldehydsubstrat 1-3)
DMSO
In 50 mM HEPES, pH 8
2,5 mM
1 mM
1,9% (v/v)
Biokatalysen in 96-
Well-Platten,
Desaminierungs-
reaktion
Aminodonor (rac-
Pregabalin/rac-Baclofen)
Aminoakzeptor (Pyruvat)
Gereinigtes Enzym
4 mM
2 mM
100 µL, 0,05-0,2 mg
Enzym
In 50 mM HEPES, pH 8, 0,1 mM PLP; Gesamt-
volumen 200 µL
Biokatalysen in Glas-
Vials,
Aminierungsreaktion
Aminodonor (L-Alanin)
Aminoakzeptor
(Aldehydsubstrat 1-3)
Gereinigtes Enzym/Zelllysat
250 mM
20 mM
200 µL, ca. 0,8 mg
Enzym
In 50 mM HEPES, pH 8, 0,1 mM PLP oder 100 mM
CHES, pH 9-11, 0,1 mM PLP; Gesamtvolumen 700 µL
Biokatalysen AmDHs Aldehydsubstrat 1-3
DMSO
NAD+
Formiatdehydrogenase
Gereinigte AmDH
20 mM
10% (v/v)
1 mM
1, 25 U
200 µL, ca.
0,2-0,6 mg Enzym
In 1M Ammoniumformiatpuffer, pH 8,5, Gesamt-
volumen 700 µL
6. Material und Methoden
70
6.9 Software
Zur Betrachtung von Gensequenzen und die Bearbeitung von Primern wurde das Programm
GeneiousPro verwendet (Biomatters Ltd., Auckland, Neuseeland). Für Docking- und
Modelling-Experimente wurde YASARA (YASARA Biosciences GmbH, Wien, Österreich)
verwendet, zum Betrachten und Vergleichen der damit erstellten Strukturen wurde zusätzlich
PyMol (DeLano Scientific LLC Schrödinger, New York, USA) verwendet. Mit Hilfe des
ACD/NMR Processor (Advanced Chemistry Development Inc., Ontario, Knanada) wurden
NMR-Spektren bearbeitet und ausgewertet.
6.10 Methoden
6.10.1 Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden
6.10.1.1 Stammhaltung
Zur längeren Aufbewahrung der E. coli-Stämme wurden Glycerinkulturen angefertigt. Dazu
wurden Übernachtkulturen mit sterilem Glycerin (80% v/v in A. dest, Endkonzentration in der
Glycerinkultur 36% v/v) vermischt und bei -80°C gelagert. Alle Stämme wurden außerdem auf
entsprechenden LB-Agarplatten (Kanamycin 50 mg/L bzw. Ampicillin 100 mg/L)
ausgestrichen, bei 4°C aufbewahrt und alle 6-8 Wochen auf frische Platten überimpft.
6.10.1.2 Herstellung chemisch kompetenter Zellen
Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgte nach der TfB-Methode[117]. Dafür
wurden 100 mL LB-Medium mit E. coli Zellen aus einer Übernachtkultur (5 mL) inokuliert. Die
Zellen wurden bei 37°C und 200 rpm inkubiert bis eine OD600 von 0,4 - 0,5 erreicht war. Die
Kultur wurde dann 15 min, bei 4000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen,
das Pellet wurde in 30 mL Tfb1 und 3,2 mL 1 M MgCl2 resuspendiert und für 15 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurde für 10 min, bei 4°C und 4000 g zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen, das Pellet wurde mit 4 mL Tfb2 resuspendiert und für 15 min auf Eis
inkubiert. Die Lösung wurde zu je 50 µL aliquotiert und mit Flüssigstickstoff schockgefroren.
Die kompetenten Zellen wurden bis zur Verwendung bei - 80°C gelagert.
6.10.1.3 Transformation
Zu 50 µL chemisch kompetenten Zellen wurde 2 µL Plasmid-DNA-Lösung gegeben und 30 min
auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 45 s bei 42°C wurden die Zellen erneut für 2 min
auf Eis gekühlt und mit 250 µL LB-SOC (hergestellt aus LB-Medium und 10 x SOC-Lösung)
versetzt. Anschließend wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und jeweils 100 µL des Trans-
formationsansatzes wurden zur Selektion auf LB-Agarplatten mit einem entsprechenden
Antibiotikum ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
6. Material und Methoden
71
6.10.1.4 Plasmidisolation
Für die Plasmidisolationen wurde das innuPREP Plasmid Mini Kit von Analytik Jena
verwendet, wobei der Anleitung des Herstellers gefolgt wurde. Die Plasmide wurden
anschließend bei -20°C gelagert.
6.10.1.5 Positionsgerichtete Mutagenese
Für die positionsgerichtete Mutagenese zur Herstellung der Amindehydrogenase CFL2
ausgehend von CFL1 wurde die QuikChange™-Methode verwendet. Dabei wurden Primer,
die den gewünschten Nukleotidaustausch trugen, in einer PCR eingesetzt. Der Ansatz setzte
sich wie folgt zusammen:
Komponente Volumen [µL]
DNA-Matrize 1
Primer fw/rv 1/1
dNTPs 1
Pfu+-DNA-Polymerase
(1:5 vorverdünnt)
0,5
Pfu+-Puffer (10x) 5
A. dest 40
Gesamtvolumen 50
Anschließend wurde das im Folgenden beschriebene Programm durchgeführt:
Schritt Zeit [min:s] Temperatur [°C]
Initiale Denaturierung 01:00 95
Schmelzen 00:45 95
Primer-Anlagerung 00:45 55
Verlängerung 06:25 72
Finale Verlängerung 10:00 72
Die Schritte zwei bis vier wurden in 25 Zyklen wiederholt
Im Anschluss erfolgte ein Verdau durch DpnI, um die methylierte DNA-Matrize zu entfernen.
Dazu wurde 1 µL DpnI zu dem PCR-Ansatz gegeben, dieser für 2 h bei 37°C inkubiert,
anschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung für 20 min bei 80°C. Schließlich erfolgte die
Transformation in chemokompetente E. coli TOP10-Zellen.
6.10.1.6 Agarose-Gelelektrophorese
Für die Agarose-Gelelektrophorese wurde zunächst 1%ige Agarose in TAE-Puffer erhitzt. Zu
30 mL dieser Lösung wurden nun 1,5 µL Roti®-Gelstain von Roth (Karlsruhe, Deutschland)
hinzugefügt und dieses in eine Form gegeben. Nach der Polymerisation wurde das Gel in eine
Elektrophoresekammer mit TAE-Puffer gegeben. Es wurden 3 µL des 1 kbp DNA Ladder von
New England Biolabs (Ipswich, England) aufgetragen. Je 5 µL Probe wurde mit 2 µL Proben-
puffer versetzt und aufgetragen. Anschließend erfolgte die Elektrophorese bei 90 V, 400 mA
und 150 W für 40-50 min. Die DNA wurde mit UV-Licht sichtbar gemacht.
6. Material und Methoden
72
6.10.1.7 Sequenzierung
Alle Sequenzierungen wurden durch Eurofins MWG Operon (Ebersberg) und GATC Biotech
AG (Konstanz) durchgeführt.
6.10.1.8 Expression von ATAs im 96-Well-Maßstab
Zur Vorbereitung einer Übernachtkultur wurde eine Mikrotiterplatte mit 200 µL LB-Medium pro
Vertiefung und einem entsprechenden Antibiotikum zur Selektion mit Hilfe eines 96-Spitzen-
Replikators aus einer Glycerinkultur beimpft. Diese Vorkultur wurde für ca. 18 h bei 30°C und
600 rpm inkubiert. Für die Expression wurde eine Deep Well Block mit jeweils 1 mL TB-Medium
(mit Antibiotikum versetzt) pro Vertiefung vorbereitet, die anschließen mit jeweils 100 µL aus
der Übernachtkultur inokuliert wurde. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 30°C und
600 rpm wurde entweder mit 0,2% Rhamnose (w/v) oder 0,1 mM IPTG induziert. Die
Expression erfolgte für etwa 18 h bei 20°C und 600 rpm. Die Zellen wurden anschließend
mittels Zentrifugation bei 4369 g und 4°C für 40 min geerntet. Die so erhaltenen Pellets
konnten bei Bedarf mit einer semi-permeablen Membran (Thermo Fisher Scientific) versiegelt
und bei -20°C gelagert werden.
6.10.1.9 Expression im 400 mL-Maßstab
Die Expression der im Screening gefundenen ATAs und der zu untersuchenden AmDHs
erfolgte im 400 mL-Maßstab in 2 L-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Dazu wurden 400 mL
LB- (AmDHs) oder TB-Medium (ATAs), die das jeweils zur Selektion benötigte Antibiotikum
enthielten, mit einer Übernachtkultur (5 mL) inokuliert und anschließend für etwa 2,5 h bis zu
einer OD600 ~ 0,8 bei 37°C und 160 rpm inkubiert. Die Induktion der Expression erfolgte mit
einer Endkonzentration von 0,5 mM IPTG, woraufhin die Kulturen für weitere 20 h bei 20°C
und 160 rpm inkubiert wurden. Zur Zellernte wurden die Kulturen für 30 min bei 4°C und 4369 g
zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets wurden in je 20 mL 50 mM NaPP pH 7,5 (AmDHs) oder
50 mM HEPES, pH 8, resuspendiert und erneut unter den oben genannten Bedingungen
zentrifugiert.
6.10.1.10 Expression der ATA 3FCR_5M im 1 L- Maßstab (Bioreaktor)
Für Fermentationsexperimente wurden zunächst zwei 5 mL Übernachtkulturen in LB-Medium
(versetzt mit Ampicillin, 100 µg/mL) aus einer Glycerinkultur inokuliert und bei 37°C und
180 rpm inkubiert. Diese wurden dann in zwei 50 mL Vorkulturen in TB-Medium (Amp) in
250 mL Schikanekolben überimpft und bei 30°C bis zu einer optischen Dichte von OD600 ~1
bei 160 rpm geschüttelt. Ein 2 L Bioreaktor wurde bereits tags zuvor mit 900 mL TB-Medium
befüllt, autoklaviert und nach dem Abkühlen mit Ampicillin (100 µg/mL) versetzt. Nach
Erreichen der gewünschten optischen Dichte, wurde die Vorkultur dem vorbereiteten
Bioreaktor zugesetzt. Während des gesamten Experiments, vor und nach der Inokulation und
Induktion wurden folgende Parameter automatisch durch die Fermenter-Software reguliert:
pH 7,5; O2 30%; 30°C; 300-800 rpm. Der Sauerstoffgehalt wurde zuerst über die Rühr-
geschwindigkeit, dann durch die Zufuhr synthetischer Luft gewährleistet. Zur Einstellung des
pH-Wertes wurden 15% Natronlauge (w/v) und 15% Phosphorsäure (v/v) verwendet. Um die
Schaumbildung zu unterdrücken, wurden zu Beginn des Experiments (später nach Bedarf) je
6. Material und Methoden
73
2 Tropfen Antifoam A Konzentrat (Sigma) zugesetzt. Verlaufsproben konnten durch eine
Probenschleife in zuvor ebenfalls autoklavierte Glasgefäße entnommen werden. Bei einer
OD600 ~ 3 wurde die Expression mit IPTG (0,5 mM) induziert. Als optimale Expressionszeit für
3FCR_5M konnten ca. sieben Stunden festgestellt werden. Die Ernte erfolgte in
Zentrifugenbechern für 1 h bei 4°C und 4369 g. Die Pellets wurden anschließend nochmals
mit 50 mM HEPES, pH 8,0, 0,1 mM PLP gewaschen. Zur weiteren Verwendung wurden die
Pellets in 5 mL Reaktionspuffer (z.B. 100 mM CHES, pH 10, 0,1 mM PLP für Biokatalysen)
pro Gramm Biofeuchtmasse resuspendiert und mittels Ultraschall aufgeschlossen (zweimal
10 min bei 30% Pulsrate und 50% Leistung auf Eis). Verlaufsproben wurden auf 7/OD600
normiert und mittels Fastprep®-Homogenisator aufgeschlossen.
6.10.2 Biochemische Methoden
6.10.2.1 Zellaufschluss
Lysozym
Zum Aufschluss der in Deep-Well-Blöcken kultivierten Zellen wurde jedes Mal ein Lysepuffer
frisch hergestellt. Dafür wurde 50 mM HEPES, pH 8, mit 0,1 mM PLP, 1 mg/mL Lysozym und
1µg/mL DNaseI versetzt. Pro Vertiefung wurden die Pellets in 300 µL Lysepuffer resuspendiert
und anschließend für 1 h bei 30°C und 800 rpm inkubiert. Nach einer 40-minütigen
Zentrifugation bei 4°C und 4369 g wurden jeweils 200 µL des erhaltenen Überstandes zur
weiteren Verwendung in eine frische Mikrotiterplatte transferiert, welche bis zur
Weiterverarbeitung der Lysate bei 4°C gelagert wurde.
FastPrep®-Homogenisator
Der Zellaufschluss im Homogenisator erfolgte in einem Volumen von 0,5 mL des Zielpuffers.
Zu den suspendierten Zellen wurden etwa 200 µL Glaskugeln (0,2 mm Durchmesser)
gegeben. Die Zellen wurden im Homogenisator mit 4 m/s für 30 s homogenisiert und im
Anschluss für 5 min auf Eis gekühlt. Für jede Probe wurde dabei eine Wiederholung
durchgeführt. Nach einer Zentrifugation für 20 min bei 10000 g und 4°C wurde der Überstand
bis auf Weiteres auf Eis gelagert.
Ultraschall
Die Zellpellets wurden in einem auf der Biofeuchtmasse basierten Volumen 100 mM CHES-
Puffer pH 10 bzw. Waschpuffer (zur späteren Reinigung mittels Äkta) resuspendiert
(2-5 mL/g WCW). Anschließend wurde zweimal für 5 min bei 30% Pulsrate und 50% Leistung
auf Eis aufgeschlossen. Zwischen den Wiederholungen ruhten die Proben für mindestens
5 min auf Eis. Anschließend wurde bei 10000 g und 4°C zentrifugiert. Der verbleibende
Überstand wurde filtriert (Filter mit 0,45 μm Porengröße) und auf Eis gelagert.
6.10.2.2 Proteinreinigung
IMAC mit Handsäulen
Nach dem Zellaufschluss durch Ultraschall wurden die Überstände der Zelllysate aus 200 bzw.
400 mL Kultivierungen durch 0,4 µm Sterilfilter filtriert. Pro Säule wurden 4 mL Roti®garose-
His/Co-Beads (Roth) verwendet, die mit jeweils 30 mL Waschpuffer equilibriert wurden. Jede
Säule wurde mit 8-10 mL filtriertem Zellextrakt beladen und für eine Stunde unter leichtem
6. Material und Methoden
74
Schwenken bei 4°C inkubiert. Nach Ablaufen des Durchflusses wurde die Säule nochmals mit
30 mL Waschpuffer gewaschen. Dann wurde mit insgesamt 12 mL Elutionspuffer eluiert, wobei
jeweils 1 mL-Fraktionen gesammelt wurden, die direkt in einem BCA-Assay verwendet
wurden, um festzustellen, welche Fraktionen den höchsten Proteingehalt und folglich das
gewünschte Protein enthielten. Diese Fraktionen wurden dann zusammengeführt und über
eine PD10-Säule (GE Healthcare) mit Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) entsalzt.
IMAC an der Äkta
Nach dem Zellaufschluss durch Ultraschall wurden die Überstände der Zelllysate aus 400 mL
Kultivierungen zur Vorbereitung der Injektion in den Äkta-Purifier durch 0,4 µm Steril-Filter
filtriert. Vor dem Auftragen der Probe wurde die 5 mL Ni-NTA Histrap HP-Säule (GE
Healthcare) mit 30 mL Waschpuffer equilibriert. Daraufhin wurden je 8-12 mL des filtrierten
Lysats injiziert. Zunächst wurde die nun beladene Säule mit 20 mL Waschpuffer gewaschen,
woraufhin die Elution mit 20 mL Elutionspuffer erfolgte. Die Flussrate betrug während des
gesamten Programms 3 mL/min. Das Eluat wurde in 1 mL Aliquote fraktioniert. Die Fraktionen,
welche das Zielprotein enthielten, wurden zusammengeführt und anschließend noch zur
Entfernung des Imidazols über PD10-Säulen (GE Healthcare) entsprechend der
Herstellerangaben entsalzt. Zur Equilibrierung und Elution wurde jeweils der für die spätere
Verwendung benötigte Puffer verwendet (50 mM HEPES, pH 8, 0,1 mM PLP oder 100 mM
CHES, pH 10, 0,1 mM PLP).
Proteasen[102]
Für den Verdau durch Proteasen erfolgte der Zellaufschluss mittels Ultraschall in 50 mM Tris-
HCl-Puffer, pH 8, 10 mM CaCl2. Zu 500 μL Zellextrakt wurden 50 μL Tris-HCl-Puffer, 50 μL
Trypsin-Lösung (Endaktivität 147 U/mL laut Herstellerangaben) oder 50 μL Proteinase K-
Lösung (Endaktivität 2 U/mL laut Herstellerangaben) gegeben. Die Proben wurden jeweils für
1 h, 2 h oder 3 h bei 750 rpm und 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Abbruch der
Proteolyse durch Zugabe von Phenylmethansulfonylfluoridlösung, bis zu einer
Endkonzentration von 5 mM. Alle Ansätze wurden für 10 min bei 16000 g zentrifugiert, die
Überstande abpipettiert und bis zur Aktivitätsmessung mittels Acetophenon-Assay auf Eis
gelagert.
Hitzefällung
Der Aufschluss durch Ultraschall fand in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5 statt. 2 mL
Zellextrakt wurden für 10 min bei 600 rpm und 50°C, 60°C, 70°C bzw. 80°C inkubiert sowie
anschließend für 20 min bei 16000 g und 4°C zentrifugiert. Es wurden die Überstände
abpipettiert, deren Aktivitäten mittels Acetophenon-Assay bestimmt.
Ammoniumsulfatfällung
Um die benötigte Ammoniumsulfat-Sättigung für eine Fällung des Zielproteins (3FCR_5M) zu
ermitteln, wurde zunächst ein Vorversuch im 1 mL Maßstab durchgeführt. Dafür wurde jeweils
die entsprechende Menge Ammoniumsulfat-Salz vorgelegt, um 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder
90% Sättigung zu erreichen. Dem Salz wurde je 1 mL Zelllysat bei 4°C hinzugefügt. Zum Lösen
des Salzes und Fällen der Proteine wurden die Ansätze für 45 min bei 1200 rpm und 4°C
inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 13300 g und 4°C für 5 min. Die Pellets
wurden daraufhin in 1 mL Puffer (100 mM CHES, 0,1 mM PLP, pH 10) resuspendiert. Um
6. Material und Methoden
75
festzustellen, welche Fraktion das Zielenzym enthielt, wurde eine photometrische
Aktivitätsbestimmung mittels Acetophenon-Assay durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass
das Enzym bei 50%iger Sättigung gefällt wird, sodass eine fraktionierende Fällung bei 40 und
60% durchgeführt wurde.
Für die fraktionierende Fällung im 10 mL-Maßstab wurden die Pellets wie bereits beschrieben
mittels Ultraschall aufgeschlossen und anschließend filtriert. Dann wurden 10 mL davon bei
4°C unter langsamem Rühren in einem Becherglas im Verlauf von 10 min mit 2,29 g
Ammoniumsulfat (entspricht 40% Sättigung). Das Gemisch wurde weitere 20 min gerührt,
bevor Überstand und Pellte durch Zentrifugation für 30 min bei 8000 g getrennt wurden. Den
10 mL Überstand wurden anschließend wie im ersten Schritt weitere 1,37 g Ammoniumsulfat
hinzugefügt (Erhöhung auf 60% Sättigung), wobei die Lösung anschließend wieder für weitere
20 min unter Rühren inkubiert wurde. Das Pellet wurde durch Zentrifugation für 30 min bei
8000 g abgetrennt und nach Verwerfen des Überstandes langsam in 2,5 mL NaPP
resuspendiert. Dadurch wurde die Lösung konzentriert, um so einen eventuellen
Aktivitätsverlust direkt kompensieren zu können.
6.10.2.3 Dialyse
Zelllysate, hergestellt wie in 6.10.2.1 (Ultraschall) beschrieben, wurden gegen 50 mM HEPES
pH 8 (0,1 mM PLP) dialysiert. Für die Dialyse wurde ein Zellulose-Schlauch (12 kDa MWCO,
Medicell Membranes Ltd) genutzt, der kurz vor dem Befüllen für ca. 10 s in A. dest gekocht
und anschließend im Dialysepuffer gelagert wurde. Die Dialyse wurde 9 h durchgeführt, wobei
der Puffer zweimal erneuert wurde. 1 mL Enzymlösung wurde dabei jeweils gegen 1 L Puffer
dialysiert.
6.10.2.4 Proteingehaltsbestimmung
Der Proteingehalt wurde mit dem BCA-Assay-Kit (Uptima/Interchim, Montluçon, Frankreich)
nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Als Standard wurde in HEPES-Puffer gelöstes
BSA verwendet.
6.10.2.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)[116]
Zur Überprüfung von Reinigungsschritten und zur besseren Bewertung der Expression wurden
Polyacrylamid-Gelelektrophoresen durchgeführt. Wie in der Literatur beschrieben erfolgte die
SDS-Page in einem diskontinuierlichen System. Es wurden 12,5%ige Trenngele und 4%ige
Sammelgele verwendet.
Lösung Trenngel 12,5% Sammelgel 4%
Lower Tris, pH 8,8 2 mL /
Upper Tris, pH 6,8 / 1 mL
Acrylamid-Lösung 3,33 mL 0,53 mL
A. dest 2,67 mL 2,47 mL
APS 40 µL 40 µL
TEMED 4 µL 4 µL
TCE[118] 80 µL 7
6. Material und Methoden
76
Es wurden jeweils 20 μL Probe mit 10 μL Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 95°C
denaturiert. 20 μL Probenmischung und 10 μL des Proteinstandards wurden auf das Gel
aufgetragen. Die Elektrophorese fand bei 200 V und 25-40 mA je Gel für ca. 1 h in einer mit
1x SDS-Laufpuffer gefüllten Elektrophoresekammer statt. Zur Auswertung der Gele wurden
sie zunächst mit Hilfe eines UV-Transilluminators betrachtet, um die TCE-Färbung sichtbar zu
machen[118], und dann über Nacht unter leichtem Schütteln mit Coomassie-Brilliantblau-
Lösung gefärbt: Daraufhin wurden sie mit Entfärber behandelt, bis der Hintergrund wieder
nahezu farblos war und nur noch die Proteinbanden deutlich zu erkennen waren.
6.10.2.6 Biokatalysen mit AmDHs[94]
Zur Charakterisierung der Umsätze und Enantiomerenüberschüsse wurden nach der
photometrischen Aktivitätsbestimmung Biokatalysen im 700 µL-Maßstab durchgeführt. Die
Zusammensetzung der Biokatalysen ist Abschnitt 6.8.6 zu entnehmen. Auch wenn
photometrisch keine Aktivität detektiert werden konnte, wurden alle AmDHs mittels Äkta
gereinigt und in Reaktionen mit jeweils jedem der Aldehydsubstrate eingesetzt. Die
Biokatalysen wurden für 20 h bei 30°C und 600 rpm inkubiert.
6.10.2.7 Biokatalysen mit ATAs
Qualitatives Hochdurchsatz-Screening – 96-Well-Maßstab
Für das Hochdurchsatz-Screening der Amintransaminasen in Richtung der
Desaminierungsreaktion, wurden die Enzyme im 96-Well-Maßstab exprimiert und
anschließend mittles HisSelect®-Filterplatten gereinigt. Die so hergestellten Enzyme wurden
dann in Biokatalysen in Mikrotiterplatten eingesetzt, wobei die Reaktionen jeweils in Duplikaten
durchgeführt wurden. Für beide Modellverbindungen wurde dabei die racemische freie Säure
eingesetzt (rac-Baclofen und rac-Pregabalin). Ein Ansatz für das Screening nach Umsatz von
Baclofen setzte sich aus 100 µL gereinigtem Enzym, 2 mM Natriumpyruvat und 4 mM rac-
Baclofen in 100 µL 50 mM HEPES, pH 8,0, 0,1 mM PLP zusammen. Für Pregabalin wurden
20 µL gereinigtes Enzym mit 4 mM Natriumpyruvat und 4 mM rac-Pregabalin in 180 µL HEPES
verwendet. Die Ansätze wurden bei 30°C und 600 rpm für 24 h inkubiert. Die qualitative
Analyse erfolgte anschließend mit Hilfe einer Dünnschichtchromatographie.
Quantifizierung von Umsatz und Enantiomerenüberschuss – 700 µL-Maßstab
Zur weiteren Charakterisierung der im Screening gefundenen ATAs wurden Biokatalysen im
größeren Maßstab durchgeführt. Dafür wurden folgende Ansätze verwendet:
Komponente Konzentration
L-Alanin 100-500 mM
Aminoakzeptor 10-60 mM
DMSO 10-30% (v/v)
ATA 0,8 mg bzw. 62 mU (s. 6.10.3.1)
gereinigtes Enzym oder 200 µL Zelllysat
Gesamtvolumen 700 µL
6. Material und Methoden
77
Je nach den zu untersuchenden Reaktionsbedingungen wurden die Substratkonzentration
und der DMSO-Gehalt variiert. Zur Bestimmung des pH-Werts wurden verschiedene
Reaktionspuffer getestet: 50 mM HEPES, 0,1 mM PLP (pH 7-8) und 100 mM CHES, 0,1 mM
PLP (pH 9-11). Als Aminodonoren wurden zudem Isopropylamin (0,1-1 M) und α-(S)-
Phenylethylamin (100-500 mM) untersucht. Außerdem wurden Reaktionstemperaturen
zwischen 20-37°C analysiert. Für eine mögliche Gleichgewichtsverschiebung wurde das
LDH/GDH-System in Betracht gezogen. Dafür wurden einer Reaktion in 50 mM HEPES,
0,1 mM PLP, pH 8, noch zusätzlich 150 mM D-Glucose, 1 mM NADH sowie 90 U/mL LDH und
15 U/mL GDH hinzugefügt. Die Biokatalyse wurde dann bei 30°C durchgeführt.
Alle Reaktionen wurden in Glassvials durchgeführt und für 20 h bei 900 rpm inkubiert.
6.10.3 Analytische Methoden
6.10.3.1 Acetophenon-Assay[85]
Zur photometrischen Bestimmung der Enzymaktivität der Amintransaminasen wurde ein
Acetophenon-Assay durchgeführt. Dafür wurde eine Lösung wie in 6.8.6 beschrieben
hergestellt. In UV-durchlässigen Mikrotiterplatten wurden pro Vertiefung 190 µL dieser Lösung
mit 10 µL Enzym (gereinigt und entsalzt oder Zelllysat, bei Bedarf entsprechend im
Reaktionspuffer verdünnt) vermischt. Die Messung wurde bei 245 nm, 30°C über 8 min in
Triplikaten durchgeführt. Als Kontrollen wurden Ansätze mit Reaktionspuffer statt
Enzymlösung mitgeführt. Die Berechnung der Aktivität pro mL Enzymlösung erfolgte nach
folgender Formel:
0,2 mL × Absorptionsänderung [ΔAbsmin
]
Ɛ [ΔAbs × mL
µmol] × Probenvolumen [mL]
Als Extinktionskoeffizienten Ɛ wurden für α-MBA 3,6 ΔAbs*mL*min-1 und für α-EBA
4,25 ΔAbs*mL*µmol-1 verwendet.
6.10.3.2 NADH-Assay
Da die Reaktion der Amindehydrogenasen NADH-abhängig ist, konnte deren Aktivität
photometrisch indirekt über den NADH-Verbrauch festgestellt werden. Dabei wurde
angenommen, dass der NADH-Verbrauch äquimolar zur Produktbildung ist. Folgende
Reaktionsansätze wurden verwendet:
Komponente Konzentration/Volumen
NADH 0,25 mM
Aminoakzeptor 1-3 5 mM
NH4Cl 5 mM
Gereinigte AmDH 20 µL
Puffer Auf 200 µL aufgefüllt
Die Messung erfolgte in Mikrotiterplatten bei 340 nm und 30°C. Es wurden jeweils Triplikate
vermessen. Als Kontrollen wurden Ansätze mit Reaktionspuffer statt Enzymlösung mitgeführt.
6. Material und Methoden
78
Die Berechnung der Aktivität pro mL Enzymlösung erfolgte entsprechend der in 6.10.3.1
dargestellten Formel. Als Exktinktionskoeffizient wurde 3,32 ΔAbs*mL*µmol-1verwendet.
6.10.3.3 Dünnschichtchromatographie
Um die Biokatalysen im 96-Well-Maßstab (Desaminierung) schnell und effizient qualitativ
analysieren zu können, wurde davon eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Als
mobile Phase wurden n-Butanol, Wasser und Eisessig im Verhältnis 4:1:1 verwendet. Die
Proben konnten direkt und ohne weitere Vorbereitung aus dem Reaktionsansatz entnommen
und mit Hilfe einer Kapillare aufgetragen werden (ca. 0,5 µL). Als Kontrolle wurde auf jeder
Dünnschichtkarte eine Probe mit Alanin und eine mit Pregabalin bzw. Baclofen mitgeführt.
Anschließend wurde mit Ninhydrinlösung gefärbt, wodurch nach Erhitzen Amine, wie
Pregabalin bzw. Baclofen und Alanin detektiert werden konnten.
Für die DC-Analyse der Ausgangsstoffe und Produkte aus der Synthese von 4-Methyl-1-
pentanal wurden Hexan und Dichlormethan im Verhältnis 1:1 als Laufmittel verwendet. Gefärbt
wurde mit Vanillin- oder DNP-Färbelösung (2,4-Dinitrophenylhydrazin), anschließend wurden
die Platten erhitzt.
Nachfolgend sind die Zusammensetzungen für alle verwendeten Färbelösungen aufgeführt:
Ninhydrin-
Färbelösung
Ninhydrin
Eisessig
n-Butanol
1,5 g
0,3 mL
100 mL
Vanillin-
Färbelösung
Vanillin
Ethanol
Konz. H2SO4
6 g
100 mL
1 mL
DNP-Färbelösung
DNP
H2O
Ethanol (95% v/v)
Konz. H2SO4
6 g
40 mL
100 mL
30 mL
6.10.3.4 Kapillarelektrophorese
Biokatalysen, die mit Hilfe der Kapillarelektrophorese analysiert werden sollen, wurden
zunächst 1:1 (v/v) mit eiskaltem Acetonitril (bei -20°C gelagert) versetzt, um die enthaltenen
Proteine zu fällen. Als Elektrolytpuffer wurde 25 mM Triethylammoniumphosphatpuffer
(pH 3,0) versetzt mit 5% (w/v) hochsulfatiertem β-Cyclodextrin, welches zur chiralen
Erkennung und folglich Trennung von Enantiomeren diente, verwendet. Zur Trennung wurde
eine 30 cm lange fused silica Kapillare bei 20 cm effektiver Länge verwendet. Die Analyse
wurde bei reverser Polarität durchgeführt, detektiert wurde mit Hilfe eines UV-Detektors bei
200 nm. Nach der kathodischen Injektion bei 0,5 psi für 3 s, erfolgte die Trennung bei 10 kV
für 15 min.
6. Material und Methoden
79
6.10.3.5 HPLC
Für die HPLC-Messung zur Analyse von Baclofen wurden 150 μL der Biokatalyse-Ansätze 1:1
mit 5 M HCl versetzt, um sowohl die enthaltenen Proteine zu denaturieren als auch die
Estergruppen durch saure Esterhydrolyse zu entfernen. Die Proben wurden dann für 1,5 h bei
70°C und 900 rpm inkubiert. Nachdem Abkühlen erfolgte eine zehnminütige Zentrifugation bei
13300 g. 150 µL des Überstandes wurden vor der Injektion in die HPLC durch Filterspitzen
filtriert. Injiziert wurden jeweils 10 µL Probe. Als mobile Phase wurde ein Gemisch aus
Isopropanol (HPLC-rein) und 2 mM wässriger CuSO4-Lösung (in MilliQ-Wasser gelöst, filtriert
und 15 min im Ultraschallbad entgast) im Verhältnis 15:85 bei 1 mL/min Flussrate verwendet.
Die Trennung erfolge an einer Chirex 3126 D-Penicillamin- Säule (150 x 4,6 mm,
Phenomenex) für 50 min. Zur Erfassung der Analyten wurde ein UV-Detektor bei 210 nm
verwendet. Alle Proben, auch zur Erfassung einer Kalibrierkurve, wurden auf dieselbe Weise
vorbereitet und jeder Ansatz wurde in Triplikaten untersucht.
Vor der Etablierung der genannten Methode, wurden Experimente zur Derivatisierung mit OPA
und Dansylchlorid durchgeführt. Die verwendeten Protokolle werden im Folgenden
beschrieben.
OPA-Derivatisierung
Zur Derivatisierung wurden die zu untersuchende Lösung mit Natronlauge auf einen pH-Wert
von 10 eingestellt und 1:1 mit dem OPA-Reagenz versetzt (16 mg OPA, 4 µL β-
Mercaptoethanol, 1 mL Methanol). Die Derivatisierung erfolgte bei 30°C für 30 min und
700 rpm. Die Trennung erfolgte an der Säule Chiracel OD-RH mit einem Fluss von 0,8 mL/min
bei 30°C mit einer Mischung von Acetonitril (0,01% TFA) und saurem Wasser (0,01% TFA) im
Verhältnis 25:75 als Laufmittel bei einer Wellenlänge von 338 nm.
Dansylchlorid-Derivatisierung
Der pH der Proben wurde mit Natronlauge auf 9 eingestellt und 1:3 mit der Dansylchloridlosung
(1,5 mg/mL in Acetonitril) versetzt. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln über 45 min bei 22°C
und 800 rpm. Die Trennung an der HPLC wurde bei einem Fluss von 0,4 mL/min in einem
Laufmittel aus ACN:H2O(mit 0,1% TFA) im Verhältnis 30:70 an der Säule Chiracel OD-RH
durchgeführt. Die Detektion erfolgte bei 254 nm.
6. Material und Methoden
80
6.10.3.6 GC/GC-MS
Es wurde jeweils 1 μL Probe in die GC injiziert. Als Trägergas diente Stickstoff (GC) bzw.
Helium (GC-MS).
Analyt ECF-Derivat von
Pregabalin
3-(4-Chlorophenyl)-4-oxo-buttersäure-tert-
butylester
4-Methyl-1- pentanal
Gerät GC GC GC-MS
Säule Hydrodex β-3P CP-Chirasil-Dex CB BPX-5
Methode T [°C]
Rate [°C/min]
t [min] T
[°C] Rate
[°C/min] t [min]
T [°C]
Rate [°C/min]
t [min]
120 - 30 120 - 10 65 - 10
160 1 - 140 10 2 300 10 15
200 10 3 200 2 5
Pressure 86,6 kPa 61,5 kPa 38,3 kPa
Total Flow 39,8 mL/min 26,8 mL/min 13, 2 mL/min
Column Flow
2 mL/min 1,3 mL/min 0,93 mL/min
Linear Velocity
61,1 cm/s 43,9 cm/s 38,5 cm/s
Purge Flow 3 mL/min 3 mL/min 3 mL/min
Split ratio
17,4 17,4 10
Ion source Temp.
250°C
Interface Temp.
310°C
Solvent cut 3 min
Scan 33-600 m/z
Scan speed 1250
Probenvorbereitung Pregabalin[80]
Um das in den Biokatalysen entstandene Pregabalin extrahieren und mittels GC analysieren
zu können, wurde eine Derivatisierung mit Ethylchloroformiat (ECF) durchgeführt (s. Abb. 24).
Dafür wurden 100 µL Probe mit 30 µL 0,1 M HCl gemischt. Dazu wurden 40 µL eines Ethanol-
Pyridin-Gemisches (Verhältnis Ethanol:Pyridin 4:1) und 10 µL ECF gegeben und die Lösung
wurde 30 s gevortext. Daraufhin wurden 100 µL mit 1% ECF (v/v) versetztes Chloroform
hinzugefügt und wiederum 30 s gevortext. Nach einer Zentrifugation für 1 min bei 13300 g
wurde die wässrige Phase verworfen und das Lösungsmittel der organischen Phase mit
Stickstoff evaporiert. Die Probe wurde wieder in 200 µL Chloroform aufgenommen und konnte
dann in die GC injiziert werden.
Probenvorbereitung 3-(4-Chlorophenyl)-4-oxo-buttersäure-tert-butylester
100 µL Probe wurden zweimal mit 100 µL Chloroform extrahiert (30 s vortexen, 1 min
Zentrifugation bei 13300 g). Die organische Phase wurde anschließend mit wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet. Nachdem dieses Gemisch für 1 min bei 13300 g zentrifugiert wurde,
konnte der Überstand für die GC-Analytik verwendet werden.
6. Material und Methoden
81
6.10.4 Immobilisierung an EziG™-Trägermaterialien[103]
250 mg der Trägermaterialien EziG 1™ (LCAA CPG), EziG 2™ (HybCPG VBC) und EziG 3™
(HybCPG copo) wurden mit 5 mL 50 mM HEPES pH 8 (0,1 mM PLP) fünfmal gewaschen.
Nach dem Ultraschall-Aufschluss in 50 mM HEPES-Puffer pH 8 (0,1 mM PLP) wurden je 5 mL
Zelllysat 20 h bei 4°C unter Verwendung eines Orbitalschüttlers mit den Trägermaterialien
inkubiert. Anschließend wurde für 10 min bei 4500 rpm und 4°C zentrifugiert und die Aktivität
der Überstände mit Hilfe des Acetophenon-Assays bestimmt. Nach dem Verwerfen der
Überstände wurden die Trägermaterialien dreimal mit 50 mM HEPES pH 8 (0,1 mM PLP)
gewaschen und direkt in Biokatalysen eingesetzt.
6.10.6 Chemische Methoden
6.10.6.1 Synthese von 4-Methyl-1-pentanal[76]
4-Methyl-1-pentanal sollte ausgehend von 4-Methyl-1-pentanol synthetisiert werden. Der
entstehende Aldehyd wurde als Ausgangsstoff für weitere Synthesen benötigt. Dafür wurden
unter Stickstoff-Atmosphäre, die mit Hilfe einer Schlenk-Apparatur erzeugt wurde, 6,1 mL 4-
Methylpentanol in 150 mL wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Bei 0°C wurden 15,8 g
Pyridiniumchlorochromat (PCC) langsam hinzugefügt. Die Reaktion wurde für ca. 2 Stunden
bei 0°C gerührt. Das entstandene Rohprodukt, welches eine zähflüssige Konsistenz und
schwarze Farbe aufwies, wurde anschließend durch Celite® filtriert, um den Katalysator zu
entfernen. Gewaschen wurde mit wasserfreiem Dichlormethan. Nach der Filtration lag eine
schwach gelbe Flüssigkeit vor. Das Lösungsmittel wurde abrotiert. Anschließend erfolgte die
Analytik des Gemisches mittels 1H-NMR, GC-MS und DC. Zur Reinigung des Produkts wurde
eine Fällung mit Natriumhydrogensulfit (ca. 39 % in H2O) vorgenommen.
Dabei entsteht mit den meisten Aldehyden ein Sulfit-Addukt, welches zwar in Wasser, aber
nicht in unpolaren Lösungsmitteln löslich ist. Zuerst wurde in kleinem Maßstab untersucht, ob
sich ein festes Addukt bildet. Nachdem dies verifiziert war, wurde das Sulfit vom übrigen
Reaktionsgemisch über Filtration getrennt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Es
wurde etwa 1 g des Sulfit-Addukts erhalten, was ca. 15% Ausbeute (bezogen auf den reinen
Aldehyd) entsprechen würde. Dieses wurde mit Hilfe von verdünnter Schwefelsäure wieder in
den Aldehyd überführt.
6. Material und Methoden
82
7. Literatur
83
7. Literatur
[1] A. Radzicka, R. Wolfenden, Science 1995, 267, 90–3.
[2] P. T. Anastas, J. C. Warner, Green Chemistry: Theory and Practice, Oxford University Press Oxford, 2000.
[3] P. Anastas, N. Eghbali, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 301–312.
[4] S. L. Y. Tang, R. L. Smith, M. Poliakoff, Green Chem. 2005, 7, 761.
[5] K. Faber, K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer, 1992.
[6] K. Buchholz, V. Kasche, U. T. Bornscheuer, Biocatalysis and Enzyme Technology, Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2005.
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7. Literatur
88
Eigenständigkeitserklärung
89
Eigenständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Greifswald noch einer anderen
wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre
ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen
Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne Kennzeichnung
übernommen habe.
Eigenständigkeitserklärung
90
Danksagung
91
Danksagung
Mein größter Dank gilt Dr. Matthias Höhne, der mir dieses spannende und herausfordernde
Thema zur Verfügung gestellt hat und mir somit eine tolle Möglichkeit geboten hat, mich
sowohl fachlich als auch persönlich weiterzuentwickeln. Ich möchte dir nicht nur für deinen
wissenschaftlichen Rat, sondern auch die persönliche Betreuung sowie für deine unermüdlich
positive und motivierende Art danken.
Bei der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) bedanke ich mich für die Finanzierung des
Projekts, die mir diese Doktorarbeit erst ermöglicht hat.
Großer Dank geht auch an unsere Kooperationspartner von der Herbrand PharmaChemicals
GmbH, Dr. Martin Erhardt und Dr. Torsten Sehl sowie Dr. Ulf Menyes und Philipp Süss von
der Enzymicals AG. Ohne die zahlreichen konstruktiven Besprechungen und unterhaltsamen
Projekttreffen wäre die Arbeit nicht dieselbe gewesen. Prof. Dr. Andreas Bommarius danke ich
für die Bereitstellung der Amindehydrogenasen.
Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer möchte für die Möglichkeit, die Laborräume und -geräte mit zu
nutzen danken sowie für das hilfreiche Feedback im Rahmen der Gruppenseminare.
Ganz allgemein möchte ich den Arbeitskreisen Höhne und Bornscheuer für die angenehme
Arbeitsatmosphäre, die gegenseitige Unterstützung und die schöne Zeit auch außerhalb des
Labors danken (Ja, liebe Freunde aus der Kaffeeküche, ihr dürft euch angesprochen fühlen).
Dominique, Frau Großmann und Angelika: Danke, dass ihr für einen reibungslosen Ablauf im
Labor sorgt. Meinen Bachelorstudenten Stefan, Iris und meinem Hiwi Basti möchte ich für die
Unterstützung während meiner Arbeit danken. Ich konnte durch die Betreuung eurer Arbeiten
viele Erfahrungen sammeln und hoffe, dass ihr noch mehr dabei gelernt habt als ich. Dr. Maika
Genz, Dr. Lilly Skalden, Dr. Ioannis Pavlidis, Dr. Alberto Nobili, Dr. Hannes Kohls und Dr.
Martin Weiß möchte ich besonders für ihre Hilfe bei meinem Einstieg in die Welt der
Transaminasen danken. Nicht vergessen möchte Nina und Nettie, die mir während meiner
Bachelor- und Mastarbeit alle nötigen Grundlagen an die Hand gegeben haben. Vielen Dank
dafür!
Vishnu, I want to thank you for plenty of funny moments in our office as well as for your patience
and support when helping me to operate the fermenter.
Liebe Ina, gefühlt die Hälfte meiner Doktorarbeit habe ich in deinem Labor zugebracht und
ohne deine Hilfe wäre es sicher noch viel länger gewesen. Vielen Dank auch für die moralische
Unterstützung und die vielen persönlichen Gespräche.
Isabel, thank you for your friendship, support and advice in and outside of the lab. Thanks for
being the wonderful nerdy person you are.
Thomas, ohne dich und unsere legendären Ausflüge ins Küstenkind und zu Edeka wäre ich
vermutlich komplett an meinem Schreibtisch versumpft. Vielen Dank für das Korrekturlesen,
für all die lustigen Momente und dein offenes Ohr für mich bei leckerem Kuchen.
Dir, Ayad, möchte ich für all die tiefgründig durchgequatschen Nächte, die horizonterweiternde
Filmauswahl, guten Schuhgeschmack und die lustigen SMS danken. Außerdem bin und bleibe
ich die Nummer Eins. Und das ist alles, was ich darüber sagen kann.
Danksagung
92
Liebe Katja, wir haben schon das ganze Studium zusammengehalten und nun auch diesen
Schritt beide so gut wie geschafft. Ich danke dir für deine Freundschaft, tolle Büro-
Nachbarschaft, therapeutisches Flummi-Spielen, Fasching, Feiern, Filmabende und den
unermüdlichen Enthusiasmus, wenn es darum ging, mich unter Menschen zu bringen.
Lisa, was bin ich froh, dass du mich damals zum Sport geschleppt hat und uns das so
zusammengeschweißt hat. Das gibt bestimmt Karma-Pluspunkte für dich. Was hätte ich nur
gemacht, wenn du nicht immer ein paar motivierende Worte und genug Geduld für meine
Sorgen aufgebracht hättest? Vielen Dank für deine Freundschaft.
Natürlich möchte ich auch die ehemaligen Gruppenmitglieder, meine Kommilitonen und
Freunde nicht vergessen. Martin und Claudi, Sten und Christin, liebe Vivien, liebe Mini: ich bin
wirklich froh, dass ich euch meine Freunde nennen darf, selbst nachdem ihr mich auch in
schwierigen Phasen ertragen musstet. Ihr konntet mich immer zum Lachen bringen und mir
helfen, neue Kraft zu schöpfen. Noch ein extra Dankeschön geht an Mini für ihre Korrekturen
und Verbesserungsvorschläge.
Von ganzem Herzen möchte ich mich bei meiner Familie, besonders meinen Eltern und
Großeltern bedanken, die mich immer ermutigt und in allen erdenklichen Arten und Weisen
unterstützt haben. Vielen Dank, dass ich mich immer auf euch verlassen kann!
