HPLC LACTEA

RESUMENEl suero de queso es un post-producto de la industria lechera, contiene aproximadamente 20% de la proteína total de la leche y tienen la ventaja de ser un una fuente de proteína de bajo costo (McIntosh et al., 1998). Las proteínas presentes en mayor cantidad en suero de queso se α-lactoalbúmina (α-la) y β-lactoglobulina (β-LG), con concentraciones de 1 a 1,5 g / litro y de 2 a 4 g / litro, respectivamente. El alto valor agregado de proteínas de suero de queso y su amplia aplicabilidad en la industria alimentaria y farmacéutica justifica el desarrollo de los procesos de separación y purificación de estas proteínas. Este estudio describe y compara tres métodos cromatográficos para el análisis y la cuantificación de las proteínas más abundantes en el suero de queso, lactoglobulina y lactoalbúmina. Los métodos fueron los siguientes: cromatografía líquida de alta eficacia en fase reversa, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de exclusión molecular. La cromatografía líquida en fase reversa condujo a una mejor separación de las proteínas de suero de leche que la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de intercambio aniónico, este método ofrece una excelente separación de las proteínas de suero de leche, y presentó un breve tiempo de análisis (33 min).

Palabras clave: RP-HPLC, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de exclusión molecular, lactoglobulina, lactoalbúmina.

METODOLOGÍA

Químicos y reactivos

α-la y β-lg fueron adquiridas de Sigma Chemicals (St. Louis, EE.UU.) y el suero de leche de la planta de lácteos FUNARBE (Viçosa, Brasil). Todos los demás reactivos fueron de grado analítico. Agua ultrapura para todos los experimentos se obtuvo de un sistema Milli-Q (Millipore Inc., MA, EE.UU.).

Materiales de cromatografía

Superdex 75 HR 10/30 (30 x 1 cm ID) intervalo de fraccionamiento (Sr. 3.000-70.000) y Mono Q HR 5/5 (5X0.5 cm ID) las columnas se adquirieron de Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). Shim-pack CLC-ODS (M) ® columna de fase inversa C18 (250 mm × 4,6 mm, diámetro de partícula 5_m y diámetro de poro 100 Å, Shimadzu, Tokio, Japón) precedido por una precolumna del mismo material (10 mm × 3,2 mm) . Se utilizaron dos cromatógrafos. SEC y AEC se realizaron con el sistema purificador ÄKTA (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). El eluyente se controló mediante absorción de UV UV-900 a 280 nm. Cromatografía RP-HPLC se realizó utilizando un sistema de HPLC Shimadzu (LC-10VP, Japón) con una bomba LC-10ADvp, un muestreador automático SIL-10ADvp (Shimadzu, Japón) y un detector de arreglo de diodos SPD-M10AVP (Shimadzu, Japón) fijado en 210 nm. Los datos se analizaron utilizando los programas informáticos como VP5.02 (Shimadzu, Japón).

Cromatografía en fase inversa (RP-HPLC)

En la Figura 5, se muestra un cromatograma de las proteínas de muestras puras utilizadas para construir la curva de calibración, en el que se obtuvieron dos picos de alfa–lg. Esto se debe a que LG es un dímero formado por A lg y B lg (Cayot y Lorient, 1997). Se encontró que las condiciones de cromatografía usadas permiten una buena resolución y en un corto período de tiempo de análisis (33 min), para separar A lg y B-LG. La técnica también es adecuada para la cuantificación de suero de mozzarella fresco (Figura 6). RP-HPLC es una técnica cromatográfica sensible a las diferencias en hidrofobicidad y ha sido ampliamente aplicada para el análisis de proteínas y péptidos (Harrison, 1994).

Las fuerzas iónicas bajas se pueden utilizar a valores de pH bajos, lo que facilita la recuperación más fácil, mejor forma de pico, y la retención más reproducible (Janson y Ryden, 1998). Recientemente se desarrolló un método de RP-HPLC de

perfusión a la soja simultáneamente por separado, proteínas de suero de leche bovina y caprina, los autores (Ferreira y Cacote, 2003; Elgar et al, 2000;.. García et al, 1998) obtenido las condiciones óptimas para la separación utilizando un gradiente binario de agua-ácido trifluoroacético-acetonitrilo y una columna de fase inversa que contiene un copolímero de embalaje basado en poliestireno-divinilbenceno. En este trabajo el pH empleado (2,5) bajo y la fuerza iónica (NaCl 0,15 M) utilizada en el gradiente de la elución de A-la y B-lg produciendo una resolución óptima en la separación de estas proteínas. Para la cromatografía de tres técnicas descritas en este trabajo, no había precisión intermedia de los tiempos de retención de los picos de la cromatografía, la técnica de RP-HPLC mostró mejores resultados en relación con la repetibilidad, con una variación de aproximadamente 2%.

Conclusiones

Las proteínas α-la y β-lg, fueron bien separados y cuantificados mediante la aplicación de tres métodos cromatográficos diferentes. La técnica de RP-HPLC mostró mejores resultados con una precisión de 2%, presentando una alta eficiencia en la separación de los picos, así como un tiempo relativamente corto de análisis (33 min).

HPLC PANIFICACION

RESUMEN

Los carbohidratos denominados también azúcares, son las moléculas orgánicas más abundantes en la biosfera. Son uno de los tres macronutrientes (además de las proteínas y las grasas) que suministran energía al organismo. Para que el cuerpo humano pueda usar esta energía, captada y almacenada básicamente en el proceso de fotosíntesis, los carbohidratos se deben metabolizar. Los polisacáridos complejos son elementos estructurales en las paredes de las células de plantas y bacterias, almacenados para alimento y función de soporte estructural. Entre las técnicas mas utilizadas para determinación de carbohidratos, encontramos métodos espectrométricos que necesitan instrumentos costosos y personal altamente especializado, las técnicas de cromatografía de gases que exigen derivatizaciones que requieren mucho tiempo. Debido a estos inconvenientes, el uso de la cromatografía de intercambio de aniones de alta eficacia es cada vez más utilizada para la determinación de carbohidratos. En fases móviles fuertemente alcalinas, los aniones de azúcar se separan en una resina de intercambio aniónico de carga positiva. Por ello en este estudio se describe un método directo de cromatografía iónica utilizando elución isocrática y detección amperométrica pulsada (PAD = pulsed amperometric detection) para la determinación altamente sensible de polioles hidrosolubles y alcoholes de azúcar así como de monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos en alimentos esenciales y no esenciales. Mientras que la determinación de carbohidratos en la mayoría de los alimentos exige sólo una preparación mínima de las muestras como dilución y filtración, las muestras con matrices complicadas como las de productos lácteos que contienen proteínas deben someterse a una diálisis antes de la inyección.

METODOLOGIA

a) InstrumentosLa columna de separación empleada y los parámetros mas importantes están indicados en los cromatogramas correspondientes. Se usaron los aparatos siguientes:

• 850 Professional IC con IC Amperometric Detector

• 858 Professional Sample Processor

• El control de los instrumentos, la recopilación y el procesamiento de los datos se realizaron con el software MagIC Net (Metrohm AG).

b) Reactivos y eluyentesLos carbohidratos fueron de grado analitico, adquiridos de Fluka (Sigma Aldrich, Buchs, Suiza). Todas las soluciones patron y eluyentes se prepararon con agua desionizada con una resistencia especifica superior a 18 MΩ・cm.

Ejemplo 1 – Determinación de carbohidratos en extractos de maltaLos extractos de malta viscosos o secos se obtienen de cebada germinada y contienen enzimas naturales, en particular amilasas, que convierten el almidon en azucares hidrosolubles. Los extractos de malta se destacan por sus altos valores nutricionales y fisiológicos. La malta se agrega como suplemento nutricional a las dietas de niños y personas mayores. Además, es un ingrediente intermedio muy empleado en alimentos para niños y mascotas, en variedades de pan, café instantáneo, bebidas, helados, productos farmacéuticos, etc.

Información experimentalLa preparación de muestras de extractos de malta es directa y consiste solamente en una dilución 1:100, tras la cual la muestra se puede inyectar directamente.

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de tres bacterias lácticas bioprotectoras (BAL) y del ácido láctico sobre la concentración de aminas biogénicas en carne empacada al vacío y almacenada bajo refrigeración y condiciones de abuso de temperaturas. Las muestras de carne molida fueron inoculadas con BAL (Lactobacillus carnis, Lactobacillus pentosus y Staphylococcus carnosus) o mezcladas con ácido láctico, y almacenadas a 4 y20ºC durante 12 y 6 días, respectivamente. Las concentraciones de aminas biogénicas (histamina, cadaverina, putrescina y tiramina) fueron analizadas mediante HPLC. El ácido láctico y las tres BAL redujeron la concentración de histamina en la carne almacenada a 20ºC a menos de 0.25 mg/kg; en comparación con el grupo control que mostró una concentración de aminas biogénicas de 4.91 mg/kg. Sin embargo, las BAL no fueron eficaces en la reducción de cadaverina, putrescina y tiramina, independientemente de la temperatura de almacenamiento. La carne tratada con ácido láctico mostró las menores concentraciones de putrescina y tiramina, lo que permitió concluir que fue efectivo en el control de la producción de aminas biogénicas en carne empacada al vacío, mientras que las BAL no pudieron prevenir su formación. La inoculación con BAL no controla el crecimiento de algunos microorganismos alterantes y, en consecuencia, son incapaces de reducir los niveles de aminas biogénicas. Lo anterior permite concluir que la calidad microbiológica inicial de la carne es un

factor determinante en el control de la concentración de aminas biogénicas durante el almacenamiento.

Palabras clave: aminas biogénicas, ácido láctico, bacterias lácticas, carne.

Materiales y métodos

Muestras de carneEstas fueron obtenidas a partir del músculo Psoas major de bovino después de 6 a 7 horas post mortem. No se registraron datos sobre la raza, sexo y edad de los animales o condiciones previas. Con el objeto de minimizar la población microbiana inicial, la superficie cárnica fue flameada y tratada bajo estrictas condiciones de esterilidad. La carne fue molida en una moledora doméstica (Moulinex, México) previa sanitización de las superficies de contacto con la muestra por medio de alcohol etílico y flameado de la cuchilla. Finalmente se dividió la carne en porciones de 50 g e inoculadas con las cepas de BAL bajo estudio y la adición de ácido láctico.

Preparación de los inóculos

Las BAL empleadas fueron: Lactobacillus carnis MXVK76 (Queen’s University of Belfast, Belfast, Northern Ireland, U.K.), Lactobacillus pentosus (Christian Hansen, LP1-31035) y Staphylococcus carnosus (Christian Hansen, MC1-02055). Las cuales fueron seleccionadas debido a su limitada actividad proteolítica, lipolítica y aminodescarboxilante (Signorini y col., 2003). Las cepas fueron reactivadas en caldo APT (Becton Dickinson) por 24 h a 30ºC. La suspensión celular fue centrifugada a 4000xg por 10 min a 4ºC y las muestras de carne inoculadas con 105 UFC/g. El ácido láctico (200 mg/100 g de carne) fue aplicado como tratamiento químico de acuerdo a lo reportado por Nassos y col. (1983). La carne tratada y el control fueron colocadas en bolsas Cryovac LB-50 (Cryovac, México) y sometidas a vacío empleando City) a -700 mBar. Las muestras fueron almacenadas a 4oC y, simulando la temperatura ambiente promedio del centro de México, a 20ºC por 12 y 6 días respectivamente. Para la realización de los análisis, se tomaron muestras los días 0, 4, 8 y 12 (para la carne almacenada bajo refrigeración) y los días 0, 2, 4 y 6 (para la carne almacenada a 20ºC).

pHEl pH de cada muestra se determinó por triplicado, empleando un potenciómetro Beckman (Beckman, Fullerton), previa homogeneización de 10 g de carne con 90 mL de agua destilada estéril en una licuadora doméstica a máxima velocidad durante 30 seg.

Recuento de bacterias lácticas y Enterobacteriaceae spp.Se mezclaron 10 g de carne con 90 mL de agua destilada estéril y se homogeneizaron (Oster, Bartelesville). A partir de esta pasta se realizaron diluciones seriadas empleando agua destilada como diluyente. La población de bacterias lácticas fuedeterminada mediante la inoculación en agar MRS (Merck, Darmstadt, Alemania). Para el recuento de Enterobacteriaceae spp., las diluciones fueron inoculadas en agar VRBG (Merck). Las cajas se incubaron a 30ºC durante 2 días.

Determinación de aminas biogénicas por HPLCLa determinación de aminas biogénicas presentes en la carne se realizó de acuerdo al método reportado por Hwang y col. (1997). Se homogeneizaron en unalicuadora doméstica (Oster) 5 g de carne con 20 mL de ácido tricloroacético (Baker) al 6%, durante 1 min. El homogeneizado se centrifugó a 8000xg durante 10 min a 4ºC y el sobrenadante se filtró a través de un papel de filtro Whatman No 2. El filtrado se transfirió a un matraz y se aforó a 25 mL con ácido tricloroacético al 6%. Dos mililitros del filtrado se homogeneizaron con 10 l de cloruro de benzoilo y 1 mL de hidróxido de sodio 2 M, incubándose durante 40 min a 30ºC. La derivatización se detuvo con 2 mL de una solución de NaCI 5 M y las amidas resultantes fueron extraídas con 3 mL de éter etílico. La fase orgánica fue evaporada hasta sequedad en un rotavapor Büchi O11 (Büchi, Flawil, Suiza) y el residuo fue disuelto en 500 l de metanol grado HPLC. Se tomaron alícuotas de 50 l, previamente filtradas a través de acrodiscos de 0.45 m, las cuales fueron inyectadas en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC) Waters (Waters, Milford) equipado con una bomba 626 y un detector de arreglo de diodos UVVIS 994 integrados a un software Millenium versión 2.1 (Waters). Se empleó una columna de fase inversa Symmetry C18 (Waters) de 150 mm de longitud, 3.9 mm de diámetro y un tamaño de partícula de 5 m. El flujo de la fase móvil empleado fue de 0.5 mL / min, siguiendo un programa de elusión con metanol al 100% y 55%. El cromatograma se obtuvo a una longitud de onda de 254 nm. Cada muestra fue analizada por triplicado.

Diseño experimental y análisis estadístico de los datosLas muestras de carne fueron asignadas al azar a los diferentes tratamientos (control, adicionada con ácido láctico, inoculación con L. carnis, L. pentosus y S. carnosus), realizando 12 repeticiones del experimento. El efecto de la inoculación con BAL y la adición de ácido láctico fué analizada en un diseño factorial 5x4; los datos fueron sujetos a un análisis de la varianza y comparación múltiple de medias de Duncan. Adicionalmente, se realizaron análisis de correlación para determinar la posible asociación existente entre las variables relacionadas con la producción de aminas biogénicas. Los análisis fueron realizados usando el paquete estadístico SAS (SAS Institute, 1998).

RESUMEN

Las antocianinas son los principales pigmentos hidrosolubles responsables de los colores rojo, azul y púrpura colores de las plantas terrestres. Las antocianinas se encuentran en toda nuestra dieta basada en vegetales, tienen poca o ninguna toxicidad conocida, que los hace particularmente atractivos como sustitutos naturales de pigmentos sintéticos y antioxidantes. Además, un número creciente de estudios han demostrado que las antocianinas tienen la capacidad de prevenir las enfermedades crónicas y degenerativas, incluyendo diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares y el cáncer. Además Las antocianinas son de origen natural, polifenoles que imparten color brillante a las frutas, verduras y plantas en general. En este estudio se extrajo antocianinas de la piel de la fruta (Rhodomyrtus tomentosa (Ait.), se optimizó usando la metodología de superficie de respuesta (RSM). Utilizando 60% de etanol que contiene 0,1% (v / v) de ácido clorhídrico como extracción del disolvente, las condiciones óptimas para rendimientos máximos de antocianina (4,358 ± 0,045 mg / g) fueron 15.7:1 (v / w)

relación de líquido a sólido, 64,38 ° C con un tiempo de extracción 116,88 min. Los resultados mostraron buenos ajustes con el modelo propuesto para la extracción de antocianinas (R2 = 0,9944). Por otra parte, los resultados de cromatografía líquida-electropulverización - espectrometría de ionización de masas de alto (HPLC-ESI-MS) análisis de las antocianinas extraídas de la piel del fruto de la rosa, revelaron la presencia de cinco componentes de antocianina, que se identificaron tentativamente como delfinidina-3-glucósido, cianidina-3-glucósido, peonidina-3-glucósido, petunidina-3-glucósido y malvidina-3-glucósido.

Palabras clave: antocianinas; Rhodomyrtus tomentosa; metodología de superficie de respuesta, HPLC-ESI-MS

METODOLOGIA

Preparación de la muestra y reactivos

Frutas maduras frescas de la variedad suave rosa mirta "Gangren" se obtuvieron en septiembre de 2010 en un mercado local en Shaoguan (Guangdong, China). Pieles de muestras de la fruta se separaron manualmente. Las pieles se secaron en un secador por congelación (-40 ° C) (ZD-A3, Nanjing, China), pulverizadas por un desintegrador (FSD-100A, Taizhou, China) y desplazada a través de un tamiz de malla 100. El polvo de la piel rosa-mirta (contenido de agua <12%) se selló en una botella ambar y se mantuvo a -18 ° C hasta su posterior análisis. Los estándares de cianidina-3-glucósido, delfinidina-3-glucósido, petunidina-3-glucósido, peonidina-3-glucósido y malvidina-3-glucósido fueron proporcionados por Polyphenol AS (Sandnes, Noruega). Ácido fórmico y acetonitrilo de calidad HPLC, se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). Se obtuvieron Todos los otros productos de Guangzhou Industria Química (Guangzhou, China).

Extracción de antocianinas

Se añadieron muestras de polvo liofilizado (1,0 g) a un Erlenmeyer de 50 ml y luego se mezclaron con diferentes volúmenes de etanol al 60% que contiene 0,1% (v / v) de ácido clorhídrico (pH ~ 1,0) [17] para dar intervalos que van del 10 al 20 (v / w), y poner en baño de agua termostático a temperaturas seleccionadas (55-75 ° C) durante varios minutos (90-150 min), luego se centrifuga a 5400 g durante 10 min a 25 ° C. El sobrenadante se recogió y se diluyó a 50 ml con el mismo

disolvente. Todas las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, EE.UU.). Despues, se tomaron alícuotas de las muestras para evaluar contenido total de antocianinas y para identificar los componentes específicos de antocianina en el extracto.

Medición contenido total de antocianinas

El contenido total de antocianinas se determinó según el método espectrofotométrico de pH diferencial [18]. Tomamos, una alícuota (1 ml) del extracto se mezcló con tampón de cloruro de potasio 0,025 M (pH 1,0, 4 ml) y tampón de acetato de sodio 0,4 M (pH 4,5, 4 ml), respectivamente. La absorbancia de la mezcla se midió a 510 y 700 nm usando un espectrofotómetro modelo UV-Vis interfaz de usuario-trospec 2000 (Amersham Pharmacia Biotech, Dübendorf, Suiza). La absorbancia se calcula como A = [(A510 - A700) a pH 1,0] - [(A510 - A700) a pH 4,5] con un coeficiente de extinción molar de 26.900 para la antocianina.

Identificación de antocianinas en el extracto de piel de la fruta por HPLC-ESI-MS

Se utilizó; cromatografía líquida de alto rendimiento Una serie Agilent 1200 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.) acoplado a un Agilent 6410 Triple espectrómetro de masas cuadrupolo y una columna Zorbax SB-C18 de Agilent (2,1 mm × 50 mm 1,8-micras) para identificar las antocianinas en el extracto de la corteza del fruto. La separación cromatográfica se realizó usando una mezcla de dos eluyentes: disolvente A, 5% de ácido fórmico en agua (V / V), y el disolvente B, acetonitrilo. El programa de elución en gradiente se utilizó de la siguiente manera: 0 a 2 min, 6% de B y de 2 a 8 min, 6% a 12% de B; 8 a 20 min, 12% a 20% de B; 20 a 28 min, 20% B . temperatura de la columna fue de 25 ° C, velocidad de flujo fue de 0,5 ml / min, y el volumen de inyección fue de 2 l. Para la identificación de las antocianinas, ionización por electrospray (ESI) fue operado en el modo de iones positivos en el rango de masas 200 a 800 (m / z) y bajo las siguientes condiciones: voltaje capilar, 4500 V; nebulizador presión, 40 psi; gas de secado temperatura a 350 ° C se utilizó a una velocidad de flujo de 8,0 L / min.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado, y los resultados se expresan como medias ± SD (desviación estándar). Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete SPSS 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU., 2005). Un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

RESUMEN

El uso de insecticidas organofosforados ha ido en aumento desde la retirada de insecticidas organoclorados debido a su toxicidad, persistencia y bioacumulación en el medio ambiente. Por el contrario, la mayoría compuestos organofosforados no son tan persistente y sólo mantenerse activo durante unos horas a varios meses. Sin embargo, estos insecticidas se descomponen bastante rápidamente, la generación de subproductos que son tóxicos para losmicroorganismos acuáticos, peces, aves, humanos y otros mamíferos. Debido a su no persistente actividad, los agricultores tienen que aplicar insecticidas a

intervalos regulares para garantizar su control de insectos eficaz. Esto da como resultado continua acumulación de sustancias químicas en el medio ambiente. Se realizo un estudio de Plaguicidas organofosforados en agua de cuatro granjas de hortalizas en Provincia Patumtane, se analizaron mediante extracción en fase sólida (SPE) y cromatografía líquida de alta resolución reversa (HPLC). Experimentos SPE eran realizado en condiciones de una fase de SAO, una masa de sorbente de 100 mg, solución volumen de 100 ml, de disolvente de 60/40 acetonitrilo / agua de elución, el volumen de elución de 5 ml y una presión de 17 mm Hg. Método de extracción de recuperación fue confirmada por pesticidas estándar a 1 ppm. Cuantificación por un estándar externo método implicó un 90% de recuperación promedio de profenofos estándar. Profenofos fue detectado en 27 muestras de agua de tres granjas de hortalizas. El detectada intervalo de concentración fue de 0,11 a 1,11 ppm con una media de 0,44 ± 0,07 ppm. La estructuras químicas de plaguicidas fueron identificados por los espectros de masas.

Palabras clave: Pesticidas organofosforados, extracción en fase sólida.

METODOLOGIA

MaterialesLos solventes de grado de cromatografía líquida y los cartuchos C18 SPE fueron de, U.S.A. el agua fue doblemente destilada y filtrada a través de membranas de Millipore de tamaño del poro 0.45 ¼ m. Los organofosfatos estándar, de pureza 99 el %, el malatión, el metilo de paratión y chlorpyrefos, fueron comprados en Soekawa Chemical Co., Ltd., Japón.los Profenofos, con pureza del 99%. fueron donados por Ciba-Geigy (Tailandia). Las soluciones normales estándar estaban preparadas en acetonitrilo y se guardaban en - 200C. El Visiprep. SPE Vacuum que 5-7030 múltiplepara la fase de extracción

Las soluciones normales y la calibraciónLos profenofos estándar estándar (1000 g ml) estaban preparados en acetonitrilo y se guardaban en – 200C. Las soluciones normales en fueron 5.0, 10.0, 20.0, 30.0 y 40.0 g ml, respectivamente. Una prueba en blanco que la solución fue 100 ml de agua destilada. La calibración estándar externa fue obtenida dibujando la concentración en contra del área de los cromatogramas.

Prueba de recuperación porcentual 

Para experimentos de extracción en fase sólida se utilizaron cartuchos de silice Sep-Pak C18 cartuchos. Los parámetros de extracción, la cantidad de solvente, el tipo y volumen de  disolvente, y la presión de vacío, se determinaron. Las condiciones de extracción,   dando un alto% de recuperación fueron probados con una concentración de plaguicida estándar de 1 ppm  y cuantificado a partir de una curva de calibración estándar. El protocolo de variados parámetros y los resultados de porcentaje de recuperación de profenofos son  resumidos en la Tabla 1. De este porcentaje de recuperación, encontramos  las condiciones obtenidas para el extracto de muestra de agua. Todos los parámetros de prueba hemos elegido el porcentaje de recuperación más alto, excepto el volumen de elución. Se utilizó 5 ml de 60% de acetonitrilo / agua, produciendo la recuperación de 88,8%, en lugar de 7 ml, con un rendimiento de recuperación de 89,3%.

Muestreo de Agua 

Muestras de agua de drenaje agrícola se obtuvieron de cuatro granjas de hortalizas en Distrito Bangbuatong, provincia Patumtanee (un suburbio al norte de Bangkok).  Todos los sitios quedaban a unos 500 metros de la carretera principal. La principal hortaliza cultivada en las fincas era el brócoli chino. Treinta y seis muestras de agua fueron recolectadas de los canales a 30-50 cm de profundidad en  Intervalos de 30 días durante los períodos de cultivo durante tres meses. Cada dos litros de agua se recogieron y se mantuvieron en botellas de vidrio oscuro separadas y se enfriaron en las cajas de hielo durante el transporte. Las muestras de preconcentración se prepararon dentro de un día después del muestreo. 

Determinación organofosforados 

Una muestra de agua de 100 ml, se aspiró a través de un 100 mg preactivado seppak 18 cartucho a presión de 17 mm Hg. Atrapado pesticidas se eluyeron con 5 ml de acetonitrilo al 60% en agua y después se secaron bajo una corriente de gas nitrógeno .Se disolvieron Estas muestras concentradas en 100 l de acetonitrilo al 60%. Extraídas las muestras de 20 l se inyectaron a HPLC LDC4100 equipado con detector de UV funcionando a μ 220 nm, tasa de flujo de 1 ml / min; sensibilidad del detector, 0,05 AUFS;  columna ODS (sílice vínculo Octadecil), 12,5 cm x 4 mm ID; intervalo de inyección, 15 min. Las estructuras químicas de las muestras separadas se identificaron mediante un GC / MS  espectrómetro de JMS-DX 300 (JEOL). El espectro de masas de ionización de electrones (EI) fueron  medido a 70 eV, 1500 C.