TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

23
Ο ρόλος της HDL στα μονοπάτια μετάστασης καρκίνου στα οστά Τμήμα Βιολογίας Τόκα Ελπίδα Εργαστήριο Ανατομίας-Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, Ιατρική σχολή Πανεπιστημίου Πατρών

Transcript of TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Page 1: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Ο ρόλος της HDL στα μονοπάτια μετάστασης καρκίνου στα οστά

Τμήμα Βιολογίας

Τόκα Ελπίδα

Εργαστήριο Ανατομίας-Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, Ιατρική σχολή Πανεπιστημίου Πατρών

Page 2: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Οστίτης Ιστός

Σημασία οστών Στήριξη και μορφή σώματος Προστασία εσωτερικών οργάνων Κίνηση (μύες & τένοντες) Αιμοποίηση Αποθήκευση ανόργανων συστατικών Αντίληψη ερεθισμάτων

Εξειδικευμένη μορφή συνδετικού ιστού που χαρακτηρίζεται από σκληρή εξωκυττάρια ουσία.

Δομή μακρού οστού

• Επίφυση

• Μετάφυση

• Διάφυση

Page 3: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Φυσιολογία οστίτη ιστούΤύποι οστίτη ιστού• Σπογγώδες οστό: ελαφρύ με μορφή σπόγγου. Στις

κοιλότητες μεταξύ των οστικών δοκίδων υπάρχει ο ερυθρός μυελός των οστών.

• Συμπαγές οστό: ιδιαίτερα πυκνό και ομοιογενές. Διατρέχεται από τους πόρους των συστημάτων του Havers. Παρουσιάζει τρείς επιφάνειες: i) Περιοστική,

ii)Ενδοστική, iii) Επιφάνειες των πόρων του Havers

Σύνθεση οστίτη ιστού

Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία

Κύτταρα οστίτη ιστού

Οργανική Ανόργανη

ΚολλαγόνοΜη

κολλαγόνες πρωτεΐνες

Υδροξυαπατίτης

Άλλα ιόντα

• Ερυθρός μυελός: στις επιφύσεις των μακρών οστών και στα επίπεδα οστά. Αποτελείται από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα.

• Ωχρός μυελός: στη μυελική κοιλότητα της διάφυσης των μακρών οστών. Αποτελείται κυρίως από λιποκύτταρα.

• Στρώμα του ΜΟ: Αποτελείται από πολυδύναμα μεσεγχυματικά κύτταρα

Μυελός των οστών (ΜΟ)

(Uccelli et al., 2008; Bukett, 2006 )

Page 4: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Κύτταρα οστίτη ιστού

Οστεοκύτταρα

Επενδυτικά κύτταραΟστεοβλάστες• Βρίσκονται στις οστικές επιφάνειες• Μεγάλα κύτταρα με έκκεντρο πυρήνα• Κυβοειδές/ κυλινδρικό σχήμα• Συνθέτουν νέο οστό (οργανική &

ανόργανη ουσία)

Οστεοκλάστες …

• Σε οστικές επιφάνειες

• Εμπύρηνα με επίπεδο σχήμα

• Χαμηλή μεταβολική δραστηριότητα

• Προστατεύουν από οστεολυτική δράση των οστεοκλαστών

• Εντός βοθρίων οστεοειδούς

• Σφηνοειδές σχήμα με αποφυάδες

• Δεν πολλαπλασιάζονται

• Ελέγχουν ανάπτυξη οστώνi) αξιολογόντας τη σύσταση του εξωκυττάριου υγρούii)αξιολογόντας ηλεκτρικά & μηχανικά ερεθίσματα

(Papachristou et al., 2014; Junqueira and Carneiro, 2004).

Page 5: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

• Πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα• Κυτταρική μεμβράνη με πτυχωτή μορφή• Προέρχονται από σύντηξη μακροφάγων• Έντονη παραγωγική δραστηριότητα• Έκκριση υδρολυτικών ενζύμων και Η+• Απορρόφηση οστού ( η λύση της θεμέλιας ουσίας των οστών και η απόδοση

ασβεστίου στην κυκλοφορία του αίματος, συμβάλει στην επιδιόρθωση των δομικών ατελειών και μικροβλαβών του οστού).

Οστική ανακατασκευήΔιαδικασία διαδοχικής απορρόφησης και παραγωγής οστίτη ιστού με σκοπό τη συντήρηση και ανανέωση του οστού.

(Garg AK 2010)

Οστεοκλάστες

Φάση ηρεμίας Φάση

απορρόφησηςΦάση κυτταρικής

αναστροφήςΦάση οστικής

παραγωγής Οστεοποίηση

Page 6: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

ΚαρκίνοςΓενετική ασθένεια που χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτο πολ/σμό κυττάρων εξαιτίας μεταλλάξεων σε γονίδια που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο.

Μετάσταση

πρωτο-ογκογονίδια

ογκοκατασταλτικά γονίδια

επιδιορθωτικά γονίδια cisncancer.org (Yokota, 2000)

Seed & Soil theoryΗ εξάπλωση ενός καρκινικού όγκου και σε άλλους ιστούς πέρα από τον αρχικό.

1.Αγγειογένεση2.Αποκόλληση 3.Διήθηση 4.Κυκλοφορία 5.Προσκόλληση 6.Εξαγγείωση 7.Πολλαπλασιασμός

(Paget, 1989)

(Bendas and Borsig, 2012)

Page 7: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Οστικές μεταστάσεις

• σπονδυλική στήλη

• κρανίο

• πλευρές

• οστά του ισχίου

• βραχιόνιο οστό

• μηριαίο οστό

Οστικές μεταστάσεις

Οστεολυτική μορφή Ενδιάμεση μορφή Οστεοβλαστική μορφή

cancer hotspot(Rubens & Mundy, 2000)

Περιοχή του οστού με καρκίνο, ο οποίος έχει προέλθει από άλλο ιστό.

(Papachristou et al., 2010)

Οστεοβλαστική μετάσταση

Οστεολυτική μετάσταση

Page 8: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

CXCR4 – (CXCL12, MIF, Ubiquitin)

Μονοπάτια οστικών μεταστάσεωνCXCL12 – (CXCR4, CXCR7)

CXCL12

MIFCXCR4 CXCR4/CXCR7 dimer

CXCR7

β-arrestin

G-protein

MAPK

↑ Επιβίωση ↑ Πολ/σμος ↑ Χημειοταξία Ανακύκλωση της CXCL12

PI3K

Akt GRKG-protein

έκφραση σε καρκινικά κύτταρα.

(Dubrovska et al., 2013; Muller et al., 2001; Hopman & DiPersio, 2014 ; Chatterjee et al., 2014; Jung et al., 2014; Sun et al., 2010)

Διάδοση και ρύθμιση των μεταστάσεων συμπαγών όγκων (Lai et al., 2014) σε ποσοστό μεγαλύτερο του 75% όλων των καρκίνων.

Ανάπτυξη- Διήθηση- Αγγειογένεση

Στον ΜΟ εκκρίνεται από τους οστεοβλάστες. Υπεύθυνη για στρατολόγηση HSCs έκφραση σε περιοχές μετάστασης. Άξονας CXCL12/CXCR4 υπεύθυνος για την

εγκατάσταση των HSCs στον ΜΟ. Προσκόλληση- Επιβίωση- Πολ/σμος

Page 9: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

ANXA2 (CXCL12) CXCR6–(CXCL16 διαμεμβρανική/ διαλυτή)

Μονοπάτια οστικών μεταστάσεων (συνέχεια…)

Στον ΜΟ εντοπίζεται στην επιφάνεια των οστεοβλαστών. Παράγοντας προσκόλλησης κυττάρων σε ΜΟ. Άγκυρα για HSCs και CXCL12. έκφραση σε πολλούς τύπους καρκίνου

Προσκόλληση- Διήθηση- Πολαπλασιασμος- Αγγειογενεση.

(Bao et al., 2009; Havens et al., 2009 ).

έκφραση σε μεταστάσεις ενώ έκφραση πρωτοπαθείς όγκους.

CXCR6/CXCL16 (διαλυτή): πολ/σμος και μετανάστευση καρκινικών κυττάρων.

Συνδέεται με βαθμό κακοήθειας & επιθετικότητα καρκίνου.

Διήθηση- Πολαπλασιασμος- Αγγειογενεση

(Meijer et al., 2008, Lu et al., 2008, Wang et al., 2008).

Page 10: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Λιπίδια

Λιποπρωτεΐνες

Υδρόφοβα μόρια με υψηλή βιολογική αξία.

Λιπίδια(φωσφολιπίδια,

χοληστερόλη, τριγλυκερίδια κ.α.)

Απολιποπρωτεΐνες(apoA, apoB, apoC,

apoD, apoE)

Κατηγορίες λιποπρωτεϊνών

• Χυλομικρά (chylomicrons, CM)

• Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (VLDL)

• Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (IDL)

• Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (LDL)

• Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL)

(Karlson, Doenecke & Koolman, 1998) (Ridker,2014)

(Ridker, 2014)

Page 11: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

HDL Μικρό μέγεθος Υψηλή περιεκτικότητα σε

απολιποπρωτεΐνες (κυρίως apoA) Ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης

(περιφερειακοί ιστοί ήπαρ)(Murray et al., 2011).

Βιοσύνθεση HDL

1. Έκκριση apoA1 από λεπτό έντερο & ήπαρ

2. Λιπιδίωση HDL Αρτιγενής HDL

3. Εστεροποίηση της FC από την LCAT

4. Μετανάστευση CE στο εσωτερικό

της HDL ώριμη HDL

http://www.shrinkinguy.com/

Σημασία απολιποπρωτεΐνης apoA.

1. Αντιοξειδωτική δράση (α) απομακρύνει την χοληστερόλη (β) εμποδίζει την οξείδωση της LDL 2. Αντιθρομβωτική δράση3. Αντιφλεγμονώδης δράση 4. Προάγει την παραγωγή ενδοθηλιακού νιτρικού οξέος

(Rader, 2006)

(Rader, 2006)

Page 12: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Υλικά και μέθοδοι

RNA extraction

cDNA synthesis

RT-PCR

ANXA2

CXCL12 CXCR4

CXCR6

Ολικά κύτταρα μυελού των οστών

http://curesearch.org/

http://www.criver.com/http://www.taconic.com/

Page 13: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Υλικά• Ισοφλουράνη• 70% αιθανόλη • PBS pH 7.4 • φορμόλη 10% • Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml

1. Χειρισμός ζωικών προτύπων…

2. Λήψη & λύση ολικών κυττάρων ΜΟ…

Υλικά• Καλλιεργητικό υλικό (MEM-A

+ 10% FBS) • Lysing Buffer (555899, BD

Biosciences)• σύριγγα με βελόνα μεγέθους

26G Kyung et al., 2008

Cell lysis

Αναισθησία με ισοφλουράνη

Μέτρηση σωματικού βάρους

Θυσίες & λήψη μηριαίων

οστών

Page 14: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Υλικά• NucleoSpin RNA kit

(740955.50,Macherey-Nagel)• αιθανόλη 70% & 96-100%• Ολικά κύτταρα μυελού των οστών

3. Απομόνωση RNA & ποσοτικοποίηση…

4. Σύνθεση cDNA…Υλικά

• Ολικό RNA (απομονώθηκε)• Oligo dT Primer (50 μM) • dNTP Mixture (10 mM each)• RNase free H2O • PrimeScript RTase (200 U/μl) • PrimeScript Buffer • RNase Inhibitor (40 U/μl)

1. Επώαση Primer Mix στους 65 oC για 5min.

2. Eπώαση Master Mix :i) 30 oC για 10 minii) 42 oC για 30-60 miniii) 96 oC για 5 min

Primer Mix

Master Mix

Ποσοτικοποίηση: Υπολογισμός της συγκέντρωσης RNA με νόμο Lambert-Beer (C=A*ε*df ), ύστερα από φωτομέτρηση με Nanodrop.

Page 15: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

ΥλικάKAPA SYBR FAST Universal qPCR kit(KK4601, Kapa Bioststems): • SyBrGr (10 μl)• ROX Low (0,4 μl)

Εκκινητές: • Primer F (0,4 μl) • Primer R (0,4 μl)

Γενετικό υλικό: cDNA* (1μl)

Γονίδιο αναφοράς: GAPDH (1μl)

RNase-free H2O 7,8 μl

Taq πολυμεράση

5. RT- PCR…

6. Ποσοτικοποίηση & Στατιστική ανάλυση

Στατιστική ανάλυση με χρήση λογισμικού GraphPad Prism® : Student test ( , SD)

Μέθοδος σχετικής ποσοτικοποίησης με τη χρήση του γονιδίου αναφοράς GAPDH.― Σύγκριση τιμών CT.

Page 16: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Αποτελέσματα_1

ANXA2 mRNA quantity in whole BM cells Ο μέσος όρος έκφρασης του

mRNA για το γονίδιο ANXA2

παρουσιάζει μια σημαντική

μείωση (p=0.01) στην ομάδα

των ApoA-I deficient μυών

συγκριτικά με τα αντίστοιχα

επίπεδα σχετικής έκφρασης

στην ομάδα ελέγχου.

Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα

του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες.

Page 17: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Αποτελέσματα_2

Ο μέσος όρος έκφρασης του

mRNA για το γονίδιο CXCL12

παρουσιάζει μια σημαντική

μείωση (p=0.0001) στην

ομάδα των ApoA-I deficient

μυών συγκριτικά με τα

αντίστοιχα επίπεδα σχετικής

έκφρασης στην ομάδα

ελέγχου.

Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα

του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες.

CXCL12 mRNA quantity in whole BM cells

Page 18: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Αποτελέσματα_3

Ο μέσος όρος έκφρασης του

mRNA για το γονίδιο CXCR4

παρουσιάζει αύξηση (p=0.216)

στην ομάδα των ApoA-I

deficient μυών συγκριτικά με

τα αντίστοιχα επίπεδα

σχετικής έκφρασης στην

ομάδα ελέγχου. Παρόλα αυτά,

η αύξηση αυτή δεν είναι

στατιστικά σημαντική.

Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα

του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες.

CXCR4 mRNA quantity in whole BM cells

Page 19: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Αποτελέσματα_4

Ο μέσος όρος έκφρασης του

mRNA για το γονίδιο CXCR6

παρουσιάζει σημαντική αύξηση

(p=0.03) στην ομάδα των ApoA-I

deficient μυών συγκριτικά με τα

αντίστοιχα επίπεδα σχετικής

έκφρασης στην ομάδα ελέγχου.

Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα

του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες.

CXCR6 mRNA quantity in whole BM cells

Page 20: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Ερμηνεία αποτελεσμάτων

(Blair et al, 2016) (Jung et al., 2015; Havens et al., 2009 )

(Ren et al., 2015 ; Dubrovska et al., 2013 ; Kholodenko, 2006;) (Wang et al., 2008 ; Hu et al, 2008; Nakayama et al., 2003)

Page 21: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Συμπεράσματα

Λιποκύτταρα σε ΜΟ (Blair et al., 2016)

ΑΝΧΑ2

CXCL12

Μεταβολές στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών

apoA1

Τα οστά αποτελούν έναν από τους πλέον κοινούς τόπους μετάστασης. Το μικροπεριβάλλον των οστών ευνοεί την εγκατάσταση καρκινικών κυττάρων. Η HDL επηρεάζει τη φυσιολογία του ΜΟ.

CXCR6

CXCR6

CXCR4

αδυναμία εγκατάστασης των καρκινικών κυττάρων στο μυελό των οστών

ευνοεί την διαφοροποίηση και κινητοποίηση των HSCs προς την περιφέρεια

Τροποποίηση των καρκινικών κυττάρων στον ΜΟ με αποτέλεσμα την αύξηση της ικανότητάς τους να δώσουν μεταστάσεις σε άλλους ιστούς. (Ren et al., 2015)

(θετική ανατροφοδότηση)

Η apoA1 εμπλέκεται στην ρύθμιση του μικροπεριβάλλοντος του ΜΟ και η έλλειψή της ευνοεί την κινητοποίηση των HSCs και πιθανόν των καρκινικών κυττάρων από τον ΜΟ προς τη περιφέρεια.

Page 22: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Μελλοντικοί στόχοι

Έλεγχος έκφρασης της χημειοκίνης CXCL16 σε

κύτταρα ολικού ΜΟ apoA1 deficient ποντικών

Έλεγχος έκφρασης των μορίων CXCL12, CXCR4, ANXA2

και CXCR6 σε ποντίκια που πάσχουν από καρκίνο.

Έλεγχος έκφρασης της apoA1 σε ποντίκια που

παρουσιάζουν οστικές μεταστάσεις.

Page 23: TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ

Ευχαριστώ!