Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

72
ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Μοριακής Βιολογίας & Γενετικής Μελέτη σηματοδότησης στη Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία 1. Αιματολογική Κλινική και Μονάδα Μεταμόσχευσης Αιμοποιητικών Κυττάρων, ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου», Θεσσαλονίκη, Ελλάδα 2. Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ), Εθνικό Κέντρο Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ), Θεσσαλονίκη, Ελλάδα Καραμανλή Τζένη ΑΕΜ: 827 Επιβλέπων: Σταματόπουλος Κώστας M.D., Ph.D. Αλεξανδρούπολη, Ιούνιος 2014

Transcript of Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

Page 1: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ

Σχολή Επιστημών Υγείας

Τμήμα Μοριακής Βιολογίας & Γενετικής

Μελέτη σηματοδότησης στη

Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία

1. Αιματολογική Κλινική και Μονάδα Μεταμόσχευσης Αιμοποιητικών Κυττάρων,

ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου», Θεσσαλονίκη, Ελλάδα

2. Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ), Εθνικό Κέντρο Έρευνας και

Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ), Θεσσαλονίκη, Ελλάδα

Καραμανλή Τζένη

ΑΕΜ: 827

Επιβλέπων: Σταματόπουλος Κώστας M.D., Ph.D.

Αλεξανδρούπολη, Ιούνιος 2014

Page 2: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ...................................................................................................................................... 6

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ...................................................................................................................................... 8

ABSTRACT ..................................................................................................................................... 11

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ...................................................................................................................................... 13

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ..................................................................................... 13

ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ................................... 13

EΜΦΥΤΗ ΑΝΟΣΙΑ ............................................................................................................................................ 14

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ EΜΦΥΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ .......................................................................................... 15

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΥΠΟΥ TOLL .............................................................................................................. 15

ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΟΜΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR .......................................................................................... 15

ΠΡΟΣΔΕΤΕΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR ......................................................................................... 17

ΠΡΟΤΥΠΟ EΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR.................................................................... 18

ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR ..................................................... 20

MYD88-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ..................................................................................... 21

TRIF-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ........................................................................................... 22

ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ .......................................................................................................................... 23

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ....................................................................... 24

ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ .................................................................................................. 24

ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΤΟΠΟΙ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ........................................................................ 26

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ .............. 27

ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ .......................................................................... 27

ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ Β ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ...................................... 29

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ TLR ΣΤΑ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ........................................................................................... 30

ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ............................................................................................. 31

ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ .................................................................................................................. 31

STATUS ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ IGHV ....................................................................... 32

ΠΡΟΦΙΛ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ .................................................................................................. 32

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΕΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΕΣ ΣΤΗ ΧΛΛ ............................................................................. 33

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΑ ΥΠΟΣΥΝΟΛΑ #1 ΚΑΙ #4 ......................................................................................... 33

ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΜΕΣΩ BCR ΣΤΗ ΧΛΛ ........................................................................................ 34

Page 3: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

3

TLRS ΣΤΗ ΧΛΛ ............................................................................................................................................ 35

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ................................................................................................................. 37

ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ........................................................................................................................................... 37

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ CD19+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΔΕΙΓΜΑ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ

ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ .............................................................................................................. 37

ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΠΟΣΟΣΤΟΥ ΤΩΝ CD19+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ .......... 39

ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ............................................................................................................................. 40

ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ .................................................................................................................................... 42

ΛΗΨΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΟΛΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ................................................................................... 42

ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ................................................................................................... 43

ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ WESTERN .................................................................................................................. 45

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ............................................................................................................ 45

SDS-ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ............................................................................................ 46

ΗΛΕΚΤΡΟΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ PVDF (TRANSFER) ................... 46

ΧΡΩΣΗ ΜΕ PONCEAU S .......................................................................................................................... 47

ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ................................................................................................................................. 48

STRIPPING ................................................................................................................................................... 49

ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΣΗΜΑΤΩΝ ........................................................................ 50

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ......................................................................................................................... 52

ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ............................................................................................. 52

ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΧΛΛ ΕΜΦΑΝΙΖΟΥΝ ΕΝΕΡΓΟ MAPK ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΜΕΤΑ

ΑΠΟ ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΤΟΥ BCR ΚΑΙ ΤΩΝ TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9 ............................................. 52

Α-ΧΛΛ .................................................................................................................................................................... 53

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL ........................................................................................................................... 53

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR7 ΚΑΙ TLR9 .......................................................................................... 53

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR ............................................................................................................... 54

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #1 ................................................................................................................. 55

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL ........................................................................................................................... 55

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9 ...................................................................... 55

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR ............................................................................................................... 55

Page 4: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

4

Μ-ΧΛΛ ................................................................................................................................................................... 56

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL ........................................................................................................................... 56

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR7 ΚΑΙ TLR9 .......................................................................................... 57

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR ............................................................................................................... 57

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #4 ................................................................................................................. 58

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL ........................................................................................................................... 58

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9 ...................................................................... 59

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR ............................................................................................................... 59

ΣΥΖΗΤΗΣΗ .................................................................................................................................... 62

Α-ΧΛΛ ΕΝΑΝΤΙ Μ-ΧΛΛ ................................................................................................................................... 63

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΑ ΥΠΟΣΥΝΟΛΑ #1 ΕΝΑΝΤΙ #4......................................................................................... 64

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #1 ΕΝΑΝΤΙ Α-ΧΛΛ ................................................................................. 65

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #4 ΕΝΑΝΤΙ Μ-ΧΛΛ ................................................................................ 65

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ............................................................................................................................ 68

Page 5: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

5

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Page 6: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

6

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής και

Κυτταρικής Βιολογίας της Αιματολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταμόσχευσης

Αιμοποιητικών Κυττάρων του ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου» (Διευθυντής: Αχιλλέας

Αναγνωστόπουλος) και στο Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών του Εθνικού

Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (Διευθυντής: Κώστας

Σταματόπουλος). Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους δύο διευθυντές για την

δυνατότητα που μου προσέφεραν και την υποστήριξη που μου παρείχαν στην

εκπόνηση της παρούσας μελέτης και ειδικά τον κ. Κώστα Σταματόπουλο που

διετέλεσε τον ρόλο του επιβλέποντά μου, καθοδηγώντας τη βασική εκπαίδευση, το

πειραματικό μέρος και την ανάλυση των αποτελεσμάτων της μελέτης. Ο κ.

Σταματόπουλος παρακολούθησε όλα τα στάδια διεκπεραίωσης της παρούσας

διπλωματικής εργασίας, προσφέροντας λύσεις σε προβλήματα που προέκυπταν

στην εξέλιξη της μελέτης.

Η παρούσα μελέτη δεν θα είχε ολοκληρωθεί χωρίς την ανεκτίμητη βοήθεια της

βιολόγου Σταυρούλας Ντούφα, η οποία με συμβούλευσε και με καθοδήγησε από τα

πρώτα μου βήματα μέχρι την ολοκλήρωση της εργασίας.

Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους βιολόγους Ελισάβετ Χαρτοματσίδου και

Χρήστο Νικολάου, οι οποίοι με προθυμία μου προσέφεραν κάθε στιγμή τη βοήθεια

τους, συντελώντας με μια άψογη συνεργασία.

Ακόμη, επιθυμώ να ευχαριστήσω τον συμφοιτητή και συνεργάτη μου Αθανάσιο Νάνο

για την υποστήριξη του, άλλα και όλους τους συνεργάτες φοιτητές που γνώρισα κατά

τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας μου.

Τέλος, το μεγαλύτερο «ευχαριστώ» το οφείλω στην οικογένεια μου που με

ενθαρρύνει σε κάθε μου προσπάθεια και είναι πάντα δίπλα μου, στηρίζοντας τις

επιλογές μου.

Page 7: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

7

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Page 8: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

8

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Τα Β λεμφοκύτταρα της Χρόνιας Λεμφοκυτταρικής Λευχαιμίας (ΧΛΛ) αλληλεπιδρούν

με το μικροπεριβάλλον τους μέσω πολλαπλών υποδοχέων, και η αλληλεπίδραση

αυτή καθορίζει την εξέλιξη της νόσου. Οι ασθενείς της ΧΛΛ χωρίζονται σε ομάδες με

βάση τα μοριακά χαρακτηριστικά των Β κυτταρικών υποδοχέων (BCR) τους, όπως

είναι το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV και η στερεοτυπία του BCR. Ασθενείς

που ανήκουν σε ένα συγκεκριμένο στερεότυπο υποσύνολο έχουν κοινά

κλινοβιολογικά χαρακτηριστικά, φαινόμενο που αποτελεί ισχυρή ένδειξη

αναγνώρισης διακριτών αντιγόνων ή δομικά παρόμοιων επιτόπων. Τα στερεότυπα

υποσύνολα έχουν συσχετιστεί με διακριτά μοτίβα έκφρασης και λειτουργικότητας

των υποδοχέων TLR, τα οποία υποδεικνύουν διαφορετικούς τρόπους συνεργασίας

του BCR με συγκεκριμένους TLR, που μπορεί να οδηγήσουν σε διαφορετικές

κυτταρικές αποκρίσεις.

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετήσουμε και να συγκρίνουμε την

απόκριση υποομάδων ασθενών με ΧΛΛ μετά από διέγερση μέσω των BCR, TLR7,

TLR9 και TLR1/2, αλλά και την συνδιέγερση του BCR με κάθε TLR. Τα σηματοδοτικά

μονοπάτια των υποδοχέων συναντώνται στο επίπεδο των MAP κινασών, στις οποίες

ανήκει η ERK, την έκφραση της οποίας επιλέξαμε να εξετάσουμε.

Η ομάδα μελέτης μας περιελάμβανε 28 ασθενείς, 14 εκ των οποίων έφεραν

μεταλλαγμένα γονίδια IGHV (Μ-ΧΛΛ) και 4/14 ανήκαν στο στερεότυπο υποσύνολο

#4 (ΣΥ #4). Επιπλέον εξετάσαμε 14 ασθενείς που έφεραν αμετάλλακτα γονίδια IGHV

(Α-ΧΛΛ) εκ των οποίων οι 4 ανήκαν στο στερεότυπο υποσύνολο #1 (ΣΥ #1).

Διεγείραμε τα CD19+ κύτταρα με αντί-IgM (ή αντί-IgG στην περίπτωση του ΣΥ #4),

Imiquimod (Im), CpG ODN και Pam3CSK4 για τους BCR, TLR7, TLR9 και TLR1/2

αντιστοίχως. Οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν για τα χρονικά στιγμιότυπα των

15 και των 50 λεπτών υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 1) αδιέγερτο control, 2) διέγερση

μέσω BCR, 3) διέγερση μέσω TLR7, TLR9 ή TLR1/2, 4) διπλή διέγερση μέσω BCR/

TLR7, BCR/ TLR9 ή BCR/TLR1/2.

Μέσω της ανοσοανίχνευσης Western μετρήσαμε τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης

ERK σε όλα τα στιγμιότυπα και βρήκαμε ότι η ERK εκφράζεται ως ένα βαθμό σε όλες

τις περιπτώσεις. Παρατηρήσαμε πως στην Α-ΧΛΛ και στα στερεότυπα υποσύνολα #1

και #4 οι μεμονωμένες διεγέρσεις του BCR και των TLR οδηγούν σε ενεργοποίηση της

Page 9: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

9

ERK, ενώ στην Μ-ΧΛΛ απαιτείται συνδιέγερση των υποδοχέων για να αυξηθούν τα

επίπεδα της p-ERK. Επιπλέον παρατηρήσαμε ότι πως στην Α-ΧΛΛ το προφίλ

λειτουργικότητας της ERK είναι το ίδιο ανάμεσα στις περιπτώσεις που δεν ανήκουν

σε στερεότυπα υποσύνολα σε σύγκριση με τις περιπτώσεις που ανήκουν στο

στερεότυπο υποσύνολο #1, ενώ στη Μ-ΧΛΛ διαφέρει ανάμεσα στο ΣΥ #4 και το

γενικότερο σύνολο της Μ-ΧΛΛ.

Page 10: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

10

ABSTRACT

Page 11: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

11

ABSTRACT

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) B cells interact with the microenvironment

through their receptors and the signals they receive affect disease progression. CLL

patients can be subgrouped according to the molecular features of their B cell

receptors (BCR), such as the IGHV gene mutational status and BCR stereotypy.

Patients belonging to a certain stereotyped subset share common clinicobiological

features, which strongly suggests recognition of certain antigens or antigenic

patterns. Cases belonging to stereotyped subsets have discrete patterns of Toll-like

receptors (TLR) expression and function which indicates that distinct modes of BCR

collaboration with specific TLRs may lead to different cellular responses.

The purpose of the present work was to study and compare the responses of different

CLL subgroups following single stimulation of BCR, TLR7, TLR9 and TLR1/2 or dual

stimulation of BCR with a specific TLR. Since the signaling pathways of these

receptors intersect at the MAP kinases level, we chose to study the activation of one

of them, namely ERK.

We negatively selected CD19+ CLL cells from 28 cases. 14 of them carried mutated

IGHV genes (M-CLL) and 4/14 belonged to the stereotyped subset #4. The remaining

14 cases carried unmutated IGHV genes (U-CLL) and 4/14 belonged to the

stereotyped subset #1. We stimulated the cells with anti-IgM (or anti-IgG for subset

#4), Imiquimod (Im), CpG ODN and Pam3CSK4 for BCR, TLR7, TLR9 and TLR1/2

stimulation, respectively, for 15 and 50 minutes. Cultures were established under the

following conditions: 1) non-stimulated, 2) single BCR, TLR7, TLR9 or TLR1/2

stimulation, 3) dual BCR/TLR7, BCR/TLR9 or BCR/TLR1/2 stimulation.

Following Western Blot, we measured the levels of p-ERK and found that p-ERK is, at

some extent, expressed in all CLL cases. In U-CLL and subsets #1 and #4 single BCR

or TLR stimulation lead to ERK activation, whereas in M-CLL dual stimulation was

required in order for ERK to be activated. In addition, U-CLL cases, that either

belonged to subset #1 or didn’t belong to any subset showed the same pattern of ERK

activation, contrary to M-CLL, where there were different responses between subset

#4 and the non-subset cases.

Page 12: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

12

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Page 13: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

13

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ

Ως ανοσία ορίζεται η ικανότητα αντίστασης του οργανισμού σε λοίμωξη, νόσο ή άλλη

ανεπιθύμητη παρενέργεια λόγω παθογόνων παραγόντων ή καρκινικών κυττάρων.

Το σύνολο της τεράστιας ποικιλίας κυττάρων και μορίων που παράγονται για να

προστατέψουν τον οργανισμό αποτελούν το ανοσοποιητικό σύστημα, και η μεταξύ

τους συνεργασία την άνοση απόκριση. Οποιοδήποτε συστατικό ή μόριο ικανό να

επάγει μια άνοση απόκριση ονομάζεται αντιγόνο.

Όλοι οργανισμοί έχουν μηχανισμούς άμυνας εναντίον των διάφορων παθογόνων,

από το στοιχειώδες ανοσοποιητικό σύστημα των μονοκύτταρων οργανισμών έως το

πολύπλοκο σύστημα των σπονδυλωτών, το οποίο διακρίνεται σε δύο κατηγορίες:

έμφυτη ανοσία, που αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού, και

προσαρμοστική ανοσία, που παρουσιάζει υψηλό βαθμό εξειδίκευσης και

«μνήμη»(1).

ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

Ο συντονισμός της άνοσης απόκρισης γίνεται μέσω της συνεργασίας τριών ομάδων

λευκοκυττάρων:

λεμφοκύτταρα (κύτταρα φυσικοί φονείς (NK), T και B λεμφοκύτταρα),

αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα,

δενδριτικά κύτταρα των λεμφοζιδίων, Β λεμφοκύτταρα)

εκτελεστικά κύτταρα (Τ λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, κοκκιοκύτταρα)

Όλα τα παραπάνω κύτταρα προέρχονται από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, όπως

φαίνεται στην Εικόνα 1.

Το κατάλληλο μικροπεριβάλλον για την ωρίμανση των Β και Τ λεμφοκυττάρων είναι

τα πρωτογενή λεμφικά όργανα, δηλαδή ο μυελός των οστών και ο θύμος αδένας,

αντιστοίχως. Η επαφή των λεμφοκυττάρων με τα αντιγόνα και η τελική τους

ωρίμανση πραγματοποιούνται στο σπλήνα, στους λεμφαδένες, στις αμυγδαλές και

Page 14: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

14

τους λεμφικούς ιστούς των βλεννογόνων και του δέρματος, τα οποία αποτελούν τα

δευτερογενή λεμφικά όργανα(1).

Εικόνα 1: Αιμοποίηση (1)

EΜΦΥΤΗ ΑΝΟΣΙΑ

Η έμφυτη ανοσία είναι μη ειδική και αποτελεί ένα πρώιμο μηχανισμό άμυνας

εναντίον των λοιμώξεων μέσω ανατομικών (δέρμα, βλεννώδεις μεμβράνες),

φυσιολογικών (θερμοκρασία, pH, χημικοί μεσολαβητές), φαγοκυτταρικών,

ενδοκυτταρικών και φλεγμονωδών φραγμών(1).

Page 15: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

15

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ EΜΦΥΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ

Οι υποδοχείς της έμφυτης ανοσίας αναγνωρίζουν συγκεκριμένους τύπους μορίων

που είναι μοναδικοί στα μικρόβια και δεν συναντώνται στα κύτταρα του ξενιστή. Οι

υποδοχείς αυτοί ονομάζονται υποδοχείς αναγνώρισης μοριακών μοτίβων (Pattern

Recognition Receptors, PRRs) επειδή αναγνωρίζουν διατηρημένα μοριακά μοτίβα

κοινών παθογόνων (Pathogen Associated Molecular Patterns PAMPs)(2), π.χ.

λιποπολυσακχαρίτης των Gram- βακτηρίων (Lipopolysaccharide, LPS),

πεπτιδογλυκάνες, βακτηριακές φλαγκελίνες, μη-μεθυλιωμένες νησίδες κυτοσίνης-

γουανίνης (Cytidine-phosphate-Guanosine, CpG), βακτηριακά διακέτυλο- και

τριακέτυλο-λιποπεπτίδια, και RNA διαφόρων ιών. Στους PRRs συμπεριλαμβάνονται

οι υποδοχείς-ρακοσυλλέκτες (scavenger receptors) των μακροφάγων και

δενδριτικών κυττάρων, οι υποδοχείς τύπου Toll (Toll-Like Receptors, TLRs) και

ενδοκυττάριοι υποδοχείς, όπως οι υποδοχείς τύπου NOD (Nod-Like Receptors,

NLRs).

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΥΠΟΥ TOLL

Οι υποδοχείς τύπου Toll ονομάστηκαν έτσι λόγω της ομοιότητας τους με την

πρωτεΐνη Toll της Drosophila Melanogaster, η οποία είναι απαραίτητη για την

προστασία της μύγας απέναντι στις μικροβιακές λοιμώξεις. Η οικογένεια των

υποδοχέων τύπου Toll αποτελείται από 11 μέλη στον άνθρωπο και 13 στον ποντικό

(3). Οι TLRs έχουν καθοριστικό ρόλο στην έμφυτη ανοσία ενάντια σε μικροβιακά

παθογόνα και η ενεργοποίηση τους οδηγεί στην ωρίμανση των δενδριτικών

κυττάρων, την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων και σε φλεγμονώδεις αποκρίσεις,

όπως παραγωγή κυτταροκινών, χημειοκινών και ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN-α ή β),

διεργασίες που οδηγούν στην ενεργοποίηση της προσαρμοστικής ανοσίας(4, 5).

ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΟΜΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR

Οι υποδοχείς τύπου Toll είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες τύπου Ι που ανήκουν

στην υπεροικογένεια των TLR/IL-1R υποδοχέων. Η εξωκυττάρια επικράτεια των

TLR περιλαμβάνει 19-25 διαδοχικά αντίγραφα του επαναλαμβανόμενου μοτίβου

λευκίνης (Leukine-Rich Repeat, LRR) τα οποία σχηματίζουν μια πεταλοειδή δομή που

πιθανολογείται πως έχει άμεσο ρόλο στην αναγνώριση διάφορων παθογόνων. Η

Page 16: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

16

εξωκυττάρια επικράτεια συνδέεται μέσω μιας διαμεμβρανικής έλικας με την

κυτταροπλασματική επικράτεια, στην οποία οι TLR έχουν τις κυτταροπλασματικές

τους ουρές. Εκεί εντοπίζεται μια συντηρημένη περιοχή 200 περίπου αμινοξέων που

είναι γνωστή ως επικράτεια TIR (TLR/IL-1R). Μέσα στην επικράτεια TIR, οι ομόλογες

περιοχές αποτελούνται από τρία συντηρημένα κουτιά (Boxes) που είναι καίριας

σημασίας για την σηματοδότηση. Οι κρυσταλλικές δομές των επικρατειών TIR των

υποδοχέων TLR1, TLR2 και TLR3 έχουν αναλυθεί μέσω κρυσταλλογραφίας ακτινών

Χ και βρέθηκε ότι αποτελούνται από ένα κεντρικό παράλληλο β-φύλλο το οποίο

περιβάλλεται από πέντε α-έλικες σε κάθε πλευρά. Αυτά τα δύο στοιχεία της

δευτεροταγούς δομής συνδέονται με δομές γνωστές ως θηλιές, όπως για παράδειγμα

η θηλιά BB που συνδέει τον κλώνο β-Β με την έλικα α-Β. Τα συντηρημένα κουτιά 1

και 2 και η θηλιά BB βρίσκονται δίπλα-δίπλα και χρησιμοποιούν τις περισσότερες

από τις πλευρικές αλυσίδες τους για αλληλεπίδραση με προσαρμογείς (adaptors)(6, 7)

(Εικόνα 2).

Εικόνα 2: α) Δομή των υποδοχέων TLR, β) Κρυσταλλικές δομές των TLR1, TLR2 και TLR3(8)

Page 17: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

17

ΠΡΟΣΔΕΤΕΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR

Κάθε υποδοχέας τύπου Toll έχει την ικανότητα να επάγει ανοσοαπόκριση αφού

προσδεθεί και αναγνωρίσει ένα συγκεκριμένο προσδέτη (Εικόνα 3). Οι TLR3, TLR7

και TLR9 εντοπίζονται σε ενδοσώματα ώστε να είναι σε θέση να αναγνωρίζουν

νουκλεϊνικά οξέα που μπορεί να απελευθερωθούν από βακτήρια και ιούς μετά την

είσοδό τους στο κυτταρόπλασμα(5). Οι περισσότεροι TLR σηματοδοτούν

σχηματίζοντας ομοδιμερή, αλλά κάποιοι σχηματίζουν ετεροδιμερή με αποτέλεσμα να

αυξάνεται το εύρος των προσδετών τους(9). Ο TLR2 σε συνδυασμό με τον TLR1 ή με

τον TLR6 αναγνωρίζει ποικίλα βακτηριακά συστατικά, όπως πεπτιδογκυκάνη

(TLR2), τριακυλο-λιποπεπτίδια (TLR1/2) και δυακυλο-λιποπεπτίδια (TLR2/6). Ο

TLR3 αναγνωρίζει δίκλωνο DNA (dsDNA) που παράγεται από πολλούς ιούς κατά τη

διάρκεια του πολλαπλασιασμού τους. Ο TLR4 αναγνωρίζει τον λιποπολυσακχαρίτη

των Gram- βακτηρίων και ο TLR5 τις φλαγγελίνες των Gram+ και των Gram-

βακτηρίων. Ο TLR7 αναγνωρίζει συνθετικά συστατικά τύπου ιμιδαζοκινολίνης

(Imidazoquinoline-like), ανάλογα της γουανοσίνης όπως η λοξοριβίνη, ορισμένα

siRNAs και μονόκλωνο RNA (ssRNA) που προέρχεται από τους ιούς της γρίπης, της

φυσαλιδώδους στοματίτιδας και τον HIV-1. Ο TLR8 αναγνωρίζει συστατικά

ιμιδαζοκινολίνης και μονόκλωνο RNA και ο TLR9 μοτίβα μη-μεθυλιωμένων νησίδων

κυτοσίνης-γουανίνης (CpG) βακτηριακού και ιικού DNA καθώς και αιμοζωΐνη, τη

χρωστική της ελονοσίας(10-16). Στα ποντίκια, ο TLR11 αναγνωρίζει άγνωστα

συστατικά ουροπαθογών βακτηρίων και ένα μόριο του παρασίτου Toxoplasma

gondii. Στον άνθρωπο, ενώ το γονίδιο για την έκφραση του TLR11 υπάρχει, δεν

κωδικοποιείται λόγω της ύπαρξης ενός κωδικονίου λήξης στην κωδική του περιοχή(4,

17). Δεν υπάρχει γνωστός προσδέτης για τον TLR10, αλλά πιθανολογείται πως ο

υποδοχέας αυτός μπορεί να δρα σε συνδυασμό με τον TLR1 ή τον TLR6 και άρα να

έχει έναν παρόμοιο με αυτούς προσδέτη βακτηριακής προέλευσης(18).

Page 18: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

18

Εικόνα 3: Δομή, κυτταρική εντόπιση και ειδικότητα των υποδοχέων TLR (19)

ΠΡΟΤΥΠΟ EΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR

Οι TLR έχουν καθοριστικό ρόλο ως πρωταρχικοί ανιχνευτές της εισβολής παθογόνων

μικροοργανισμών και της επαγωγής της αντιμικροβιακής ανοσοαπόκρισης.

Εκφράζονται σε ποικίλους κυτταρικούς τύπους, π.χ. επιθηλιακά κύτταρα της

αναπνευστικής και της γαστρεντερικής οδού, Β λεμφοκύτταρα, σιτευτικά κύτταρα,

κύτταρα φυσικοί φονείς, δενδριτικά κύτταρα, ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα,

μακροφάγα, μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα, βασεόφιλα, ενδοθηλιακά κύτταρα και σε

διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων(20, 21) (Πίνακας 1).

Page 19: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

19

Πίνακας 1: Πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων TLR στους διάφορους κυτταρικούς τύπους.

TLRs Έκφραση

TLR 1 Οικουμενική

TLR 2 Μονοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα, ουδερερόφιλα, Τ λεμφοκύτταρα

TLR 3 Δενδριτικά κύτταρα, κύτταρα φυσικοί φονείς

TLR 4 Μακροφάφα, Τ λεμφοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα ενδοθηλιακά κύτταρα, ουδετερόφιλα

TLR 5 Μονοκύτταρα, ανώριμα δενδριτικά κύτταρα, κύτταρα φυσικοί φονείς, ουδετερόφιλα

TLR 6 Β λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, κύτταρα φυσικοί φονείς, ουδετερόφιλα

TLR 7 Β λεμφοκύτταρα, πλασμοκυττοειδή δενδριτικά κύτταρα, ουδετερόφιλα

TLR 8 Μονοκύτταρα, κύτταρα φυσικοί φονείς, ουδετερόφιλα

TLR 9 Πλασμοκυττοειδή δενδριτικά κύτταρα, Β λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, κύτταρα φυσικοί φονείς, ουδετερόφιλα

TLR 10 Β λεμφοκύτταρα, πλασμοκυττοειδή δενδριτικά κύτταρα, ουδετερόφιλα

TLR 11 - (μη λειτουργικό γονίδιο)

Μετά την αναγνώριση ενός μικροβιακού παθογόνου, οι TLR ενεργοποιούν

ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγουν την παραγωγή κυτταροκινών,

ιντερφερονών τύπου Ι και χημειοκινών. Επιπλέον, η σηματοδότηση μέσω TLR οδηγεί

στην υπερέκφραση συνδιεγερτικών μορίων των δενδριτικών κυττάρων που δρουν

ως αντιγονοπαρουσιαστικά. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται ωρίμανση των

δενδριτικών κυττάρων και είναι απαραίτητη για την επαγωγή ανοσοαποκρίσεων της

προσαρμοστικής ανοσίας, γεγονός που υποδεικνύει την σημασία των TLR ως

μεσολαβητές ανάμεσα στη έμφυτη και την προσαρμοστική ανοσία. Ένας σημαντικός

ρόλος τους είναι η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού που οδηγεί στην

παραγωγή κυτταροκινών, π.χ. του παράγοντα νέκρωσης όγκων α (Tumor Necrosis

Factor α, TNFα) και των ιντερλευκινών IL-6, IL-1β και IL-12. Επίσης σημαντικά είναι

και τα εναλλακτικά μονοπάτια των TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 και TLR9 που επάγουν

αντιικές ανοσοαποκρίσεις μέσω της παραγωγής ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN)(4).

Page 20: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

20

ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR

Μετά την ενεργοποίηση τους, οι TLR διμερίζονται και υφίστανται τις διαμορφωτικές

αλλαγές που είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση των αμέσως επόμενων μορίων

του σηματοδοτικού μονοπατιού, δηλαδή τις πρωτεΐνες που ονομάζονται

προσαρμογείς(6). Σε αυτές περιλαμβάνονται οι:

MyD88 (Myeloid differentiation primary response protein 88)

Mal (MyD88-adapter like) ή TIRAP (TIR domain containing adapter)

TRIF (TIR domain-containing adapter inducing Interferon-β ή TICAM-1 (TIR-

containing adapter molecule-1)

TRAM (TRIF-related adapter molecule) ή TICAM-2 (TIR-containing adapter

molecule-2)

SARM (Sterile α and HEAT-Armadillo motifs)

Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγονται από τους TLR χαρακτηρίζονται ως

MyD88-εξαρτώμενα ή TRIF-εξαρτώμενα, καθώς οι πρωτεΐνες MyD88 και TRIF είναι

οι κύριοι ρυθμιστές της σηματοδότησης. Και στα δύο μονοπάτια επάγεται η

παραγωγή κυτταροκινών και ιντερφερονών τύπου Ι μέσω της ενεργοποίησης

μεταγραφικών παραγόντων και κινασών(20, 22) (Εικόνα 4).

Εικόνα 4: Οι υποδοχείς TLR με τους προσδέτες που τους ενεργοποιούν, τους προσαρμογείς με τους οποίους αλληλεπιδρούν και τα προϊόντα της σηματοδοτικής τους οδού (3)

Page 21: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

21

MYD88-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ

Η πρωτεΐνη MyD88 διαθέτει μια περιοχή θανάτου (Death Domain, DD) στο Ν-τελικό

άκρο της και μια επικράτεια TIR στο C-τελικό άκρο της, μέσω της οποίας

αλληλεπιδρά με όλους τους TLR εκτός του TLR3. Οι TLR1, TLR2, TLR4 και TLR6

χρειάζονται και την πρωτεΐνη TIRAP ως ένα ενδιάμεσο μόριο για σύνδεση τους με την

MyD88, ενώ οι TLR5, TLR7, TLR9 και TLR11 μπορεί να συνδεθούν απευθείας. Όταν

ένας προσδέτης δεσμευτεί σ’ έναν TLR, η MyD88 επιστρατεύει τα μέλη της

οικογένειας κινασών IRAK (IL-1 Receptor-Associated Kinases) μέσω της

αλληλεπίδρασης των περιοχών θανάτου και των δύο μορίων. Μετά την

ενεργοποίησή της, η IRAK-4 φωσφορυλιώνει την IRAK-1, η οποία με τη σειρά της

ενεργοποιεί τον προσαρμογέα TRAF6 (TNF Receptor-Associated Factor 6) και

συνδέεται με αυτόν. Στη συνέχεια, το σύμπλοκο IRAK-1/TRAF6 απομακρύνεται από

τον υποδοχέα και αλληλεπιδρά με την κινάση TAK1 (TGF-β-Activated Kinase 1) και

τις πρωτεΐνες που την δεσμεύουν, TAB1 και TAB2 (TAK1-Binding Proteins). Ενώ η

IRAK-1 παραμένει στη μεμβράνη όπου και αποδομείται, το σύμπλοκο των TRAF6,

TAK1, TAB1 και TAB2 μετακινείται στο κυτταρόπλασμα όπου συνδέεται και με άλλες

πρωτεΐνες, π.χ. Ubc13 και Uev1A. Η ενεργοποίηση της TAK1 επιφέρει ενεργοποίηση

του συμπλόκου ΙΚΚ (IκB Kinase Complex) το οποίο επάγει τη φωσφορυλίωση της

πρωτείνης IκB και την απελευθέρωση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB.

Παράλληλα, η TAK1 ενεργοποιεί τις κινάσες JNK και p38 και ERK μέσω της

φωσφορυλίωσης διαφόρων MAP κινασών, οι οποίες με τη σειρά τους ενεργοποιούν

τον μεταγραφικό παράγοντα AP-1(23-26) (Εικόνα 5).

Page 22: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

22

Εικόνα 5: MyD88-εξαρτώμενο σηματοδοτικό μονοπάτι(27)

TRIF-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ

Μέσω του TRIF-εξαρτώμενου μονοπατιού σηματοδοτούν ο μεν TLR3 απευθείας και

ο TLR4 με τη μεσολάβηση του TRAM. Ο προσαρμογέας TRIF ενεργοποιεί τον

προσαρμογέα RIP1 μέσω ενός μοτίβου ομοτυπικής αλληλεπίδρασης και δημιουργεί

ένα σύμπλοκο με αυτόν και με τις πρωτεΐνες TRAF6, TRADD και Pellino-1. Το

σύμπλοκο ενεργοποιεί την TAK1 μέσω της οποίας επάγεται η ενεργοποίηση της NF-

κB και των MAP κινασών με διαδικασία αντίστοιχη με αυτή του MyD88-εξαρτώμενου

μονοπατιού. Ακόμα, ο TRIF μέσω του συμπλόκου που περιλαμβάνει τις κινάσες TBK1

(TANK-Binding Kinase 1) και IKKε (Inducible IκB Kinase) καταλύει τη

φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα IRF3 και την μετακίνηση του στον

πυρήνα, οδηγώντας στην παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι(28, 29) (Εικόνα 6).

Page 23: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

23

Εικόνα 6: TRIF-εξαρτώμενο σηματοδοτικό μονοπάτι(30)

ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ

Η προσαρμοστική ανοσία χαρακτηρίζεται από τη δράση κυττάρων υψηλής

εξειδίκευσης (Τ και Β λεμφοκύτταρα) και έχει τέσσερα βασικά χαρακτηριστικά:

Αντιγονική ειδικότητα, η οποία επιτρέπει το ανοσοποιητικό σύστημα να

διακρίνει λεπτές διαφορές μεταξύ των διάφορων αντιγόνων.

Ποικιλομορφία, που επιτυγχάνεται μέσω της παραγωγής τεράστιας

ποικιλίας μορίων που αναγνωρίζουν δισεκατομμύρια μοναδικών,

διαφορετικών δομών ξένων αντιγόνων.

Άνοση μνήμη που βοηθά το ανοσοποιητικό σύστημα να παρέχει ανοσία

μεγάλης διαρκείας, καθώς μια δεύτερη επαφή με το ίδιο αντιγόνο επάγει μια

πιο ισχυρή άνοση απόκριση.

Page 24: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

24

Αναγνώριση εαυτού/ μη εαυτού, βασικό χαρακτηριστικό του

ανοσοποιητικού συστήματος που προστατεύει τον οργανισμό, καθώς τα

κύτταρα που συμμετέχουν στην ανοσία αναγνωρίζουν μόνο ξένα και όχι

εαυτά αντιγόνα.

Οι λειτουργίες αυτές πραγματοποιούνται μέσω δύο οδών, χυμική και κυτταρική

ανοσία. Η χυμική ανοσία αφορά στα Β λεμφοκύτταρα και τα αντισώματα που

εκκρίνονται από αυτά όταν αναγνωρίσουν ένα αντιγόνο. Η κυτταρική ανοσία

μεσολαβείται από τα Τ λεμφοκύτταρα τα οποία αλληλεπιδρούν με άλλα κύτταρα που

εμπλέκονται στην ανοσία με αποτέλεσμα την εξάλειψη του κινδύνου(1).

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ

Σκοπός των υποδοχέων της προσαρμοστικής ανοσίας είναι η ανίχνευση των

αντιγόνων και η ενεργοποίηση των κατάλληλων ανοσοαποκρίσεων από τα κύτταρα

στα οποία εκφράζονται. Συγκεκριμένα:

Τα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν πεπτίδια ή τμήματα πεπτιδίων μόνο όταν

αυτά είναι συνδεδεμένα με μόρια του μείζονος συμπλέγματος

ιστοσυμβατότητας (major histocompability complex, MHC) τα οποία

βρίσκονται στη μεμβράνη των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (antigen-

presenting cells, APCs).

Τα Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν απευθείας αντιγόνα όπως πρωτεΐνες,

λιπίδια, υδατάνθρακες και νουκλεϊνικά οξέα(1).

ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ

Οι ανοσοσφαιρίνες είναι γλυκοπρωτεΐνες που παράγονται από τα Β λεμφοκύτταρα

και εντοπίζονται είτε στην επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων, όπου δρουν ως

υποδοχείς, είτε στο πλάσμα του αίματος υπό μορφή των αντισωμάτων που

εκκρίνονται από τα πλασματοκύτταρα.

Δομικά, οι ανοσοσφαιρίνες αποτελούνται από δύο βαριές αλυσίδες (Heavy Chains,

H) μοριακού βάρους 50-70 kDa, και δύο ελαφριές αλυσίδες (Light Chains, L)

μοριακού βάρους 25 kDa. Οι βαριές και ελαφριές αλυσίδες συνδέονται ομοιοπολικά

με δισουλφυδρυλικούς δεσμούς που σχηματίζονται μεταξύ υπολειμμάτων κυστεΐνης

Page 25: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

25

στο καρβοξυτελικό άκρο της ελαφριάς αλυσίδας και του CH1 τομέα της βαριάς

αλυσίδας (Εικόνα 7), αλλά και με μη ομοιοπολικούς δεσμούς (ιοντικούς, υδρογόνου

ή υδρόφοβους). Με μη ομοιοπολικούς δεσμούς και δισουλφυδρυλικές γέφυρες

συνδέονται και οι πανομοιότυπες ελαφριές και βαριές αλυσίδες μεταξύ τους για να

παράγουν το διμερές της ανοσοσφαιρίνης.

Τόσο οι βαριές όσο και οι ελαφριές αλυσίδες έχουν τμήματα υψηλής

μεταβλητότητας στις αμινοτελικές περιοχές, οι οποίες ονομάζονται μεταβλητές

(Variable, V) περιοχές και είναι υπεύθυνες για την ποικιλία των ειδικοτήτων μεταξύ

διαφορετικών ανοσοσφαιρινών. Αντίθετα, οι υπόλοιπες περιοχές του μορίου έχουν

ελάχιστες διαφορές μεταξύ ανοσοσφαιρινών της ίδιας τάξης και καλούνται

σταθερές (Constant, C).

Η θέση δέσμευσης ενός αντιγόνου στην ανοσοσφαιρίνη σχηματίζεται από τις

υπερμεταβλητές περιοχές που βρίσκονται στις μεταβλητές περιοχές των βαριών και

ελαφριών αλυσίδων και αποτελούν τα τμήματα με τη μέγιστη ποικιλότητα

αμινοξικών ακολουθιών. Επειδή καθορίζουν την εξειδίκευση της ανοσοσφαιρίνης

καλούνται και περιοχές καθορισμού της συμπληρωματικότητας (Complementary

Determining Regions, CDRs). Η μεταβλητή περιοχή κάθε αλυσίδας περιέχει τρεις

υπερμεταβλητές περιοχές: η CDR3 που βρίσκεται στο σημείο σύνδεσης των

περιοχών C και V έχει τη μεγαλύτερη μεταβλητότητα και πιο σημαντικό ρόλο στην

πρόσδεση με το αντιγόνο.

Υπάρχουν δύο τύποι ελαφριάς αλυσίδας, κ και λ (με ποσοστό στον άνθρωπο 60%

και 40%, αντιστοίχως). Κάθε ανοσοσφαιρίνη εκφράζει μόνον έναν από τους δύο

τύπους. Στις βαριές αλυσίδες υπάρχουν πέντε τύποι, μ, γ, α, δ και ε, οι οποίοι

ονομάζονται ισότυποι. Ο ισότυπος της βαριάς αλυσίδας καθορίζει την τάξη της

ανοσοσφαιρίνης η οποία μπορεί να είναι IgM (μ), IgG (γ), IgA (α), IgD (δ) ή IgE (ε).

Επειδή υπάρχουν μικρές διαφορές στις ακολουθίες αμινοξέων στις αλυσίδες α και γ,

αυτές κατατάσσονται σε υποτάξεις. Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο υποτάξεις α

αλυσίδων (α1 και α2), ενώ στο ποντίκι τέσσερις υποτάξεις γ (γ1, γ2α, γ2β και γ3)(1).

Page 26: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

26

Εικόνα 7: Δομή του ανοσοσφαιρινικού μορίου (Τροποποιημένο από: http://www.ebioscience.com/knowledge-center/antigen/immunoglobulin/structure.htm)

ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΤΟΠΟΙ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ

Ο γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας αποτελείται από τα γονίδια V (Variable), D

(Diversity), J (Joining) και C (Constant). Τα γονίδια V, D, J κωδικοποιούν τη μεταβλητή

περιοχή, ενώ τα C τη σταθερή. Οι γενετικοί τόποι των κ και λ ελαφριών αλυσίδων

περιλαμβάνουν V, J και C γονίδια. Σε κάθε 5’ άκρο ενός γονίδιου V υπάρχει ένα μικρό

εξώνιο που κωδικοποιεί ένα βραχύ πεπτίδιο-σήμα ή οδηγό (L) (Signal or Leader

Peptide) που κατευθύνει τη βαριά ή την ελαφριά αλυσίδα στο ενδοπλασματικό

δίκτυο. Το πεπτίδιο αυτό αφαιρείται από τις αλυσίδες πριν τη συναρμολόγηση του

μορίου της ανοσοσφαιρίνης(1) (Εικόνα 8).

Page 27: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

27

Εικόνα 8: Οργάνωση των ανοσοσφαιρινικών γονιδίων της βλαστικής σειράς(8)

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ

Μια από τις χαρακτηριστικές ιδιότητες της προσαρμοστικής ανοσίας είναι η

ικανότητά της να αναγνωρίζει και να αποκρίνεται σε τεράστιο αριθμό ξένων

παθογόνων. Στον άνθρωπο υπολογίζεται ότι οι αντιγονικοί επίτοποι που

αναγνωρίζονται είναι περίπου 107-109. Η τεράστια αυτή ποικιλότητα οφείλεται

στους παρακάτω μηχανισμούς:

Πολλαπλά γονίδια V, D, J, C στα κύτταρα της βλαστικής σειράς

Ανασυνδυασμός V-(D)-J

Συνδετική ποικιλότητα

Προσθήκη P νουκλεοτιδίων στην περιοχή Ρ

Προσθήκη N νουκλεοτιδίων στην περιοχή Ν

Σωματική υπερμεταλλαξιγένεση

Συνδυαστική σύζευξη των ελαφριών και βαριών αλυσίδων(1)

ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ

Η ανάπτυξη των Β λεμφοκυττάρων ξεκινά όταν λεμφοειδή στελεχιαία κύτταρα

διαφοροποιούνται προς την κυτταρική σειρά των αρχέγονων Β λεμφοκυττάρων. Η

παραγωγή ώριμων Β λεμφοκυττάρων συμβαίνει αρχικά στο έμβρυο με θέσεις

ωρίμανσης το λεκιθικό ασκό, το εμβρυικό ήπαρ και τον εμβρυικό μυελό των οστών,

ενώ μετά τη γέννηση η θέση ωρίμανσης είναι ο μυελός των οστών. Η ανάπτυξη των

Page 28: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

28

Β λεμφοκυττάρων εξελίσσεται σε ποικίλα στάδια, καθένα από τα οποία καθορίζεται

από τις αναδιατάξεις των γονίδιων των ανοσοσφαιρινών και την έκφραση

ανοσοσφαιρινών, προσδετικών μορίων και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην

επιφάνεια των αναπτυσσόμενων Β λεμφοκυττάρων(31, 32). Η διεργασία των

αναδιατάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών καλείται ανασυνδυασμός V-(D)-J

κι έχει ιεραρχικό χαρακτήρα.

Τα παρθένα Β λεμφοκύτταρα εγκαταλείπουν το μυελό των οστών εκφράζοντας

μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες συγκεκριμένης αντιγονικής ειδικότητας και

εισέρχονται στα δευτερογενή λεμφικά όργανα μέσω της κυκλοφορίας του αίματος

και της λέμφου(33). Εάν τα κύτταρα ενεργοποιηθούν από αντιγόνο, το οποίο

αναγνωρίζεται από την ανοσοσφαιρίνη τους, τότε πολλαπλασιάζονται και μερικά

από αυτά μεταναστεύουν στο κέντρο των λεμφοζιδίων, οπού δημιουργούν τα

βλαστικά κέντρα (Germinal Centers)(34). Στα βλαστικά κέντρα συμβαίνει σωματική

υπερμεταλλαξιγένεση (ΣΥΜ) (somatic hypermutation, SHM), διεργασία εισαγωγής

μεταλλάξεων στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών που ακολουθεί την επαφή με το

αντιγόνο και σκοπό έχει ν’ αυξήσει τη συγγένεια της ανοσοσφαιρίνης για το αντιγόνο.

Ο όρος «υπερμεταλλαξιγένεση» οφείλεται στην εξαιρετικά υψηλή συχνότητα

εισαγωγής μεταλλάξεων, η οποία κυμαίνεται από 10-5 έως 10-3/bp/κυτταρική γενιά

και είναι σαφώς μεγαλύτερη από τη συχνότητα εισαγωγής μεταλλάξεων στο

γονιδίωμα ενός φυσιολογικού κυττάρου (10-9-10-11)(35). Όσα Β λεμφοκύτταρα

περάσουν επιτυχώς τη διαδικασία επιλογής που επάγεται από τα δενδριτικά

κύτταρα των λεμφοζιδίων και τα TH κύτταρα, διαφοροποιούνται είτε προς Β

λεμφοκύτταρα μνήμης, είτε προς πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα

(Εικόνα 9).

Page 29: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

29

Εικόνα 9: Στάδια ανάπτυξης των Β λεμφοκυττάρων(33)

ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ Β ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ

Επειδή η κυτταροπλασματική ουρά τους είναι κοντή, οι ανοσοσφαιρίνες δεν έχουν

την ικανότητα να μεταδώσουν ενδοκυττάρια σήματα. Για το λόγο αυτό, η

μεμβρανική Ig συνδέεται με το ετεροδιμερές Igα/Igβ, το οποίο σταθεροποιείται με

δισουλφυδρυλικούς δεσμούς, και έτσι σχηματίζεται ο Β κυτταρικός υποδοχέας (B-

cell receptor, BCR). Οι κυτταροπλασματικές ουρές των Igα και Igβ περιέχουν μοτίβα

ενεργοποίησης των ανοσοϋποδοχέων βασισμένα στην τυροσίνη (Immunoreceptor

Tyrosine-Based Activation Motifs, ITAMs), τα οποία απαιτούν τη συνάθροιση δύο ή

περισσότερων ανοσοσφαιρινών για να ενεργοποιηθούν και ν’ αρχίσουν τη

σηματοδότηση μέσω του BCR. Αρχικό συμβάν της σηματοδότησης είναι η

φωσφωρυλίωση των ITAM από τις πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης της οικογένειας

Src (Lyn, Syk) και η δημιουργία ενός λειτουργικού συμπλέγματος του υποδοχέα με

ικανότητα σηματοδότησης. Σε μια οδό η Syk ενεργοποιεί την PLCγ μέσω

φωσφορυλίωσης της τυροσίνης, η οποία στη συνέχεια υδρολύει το PIP2 παράγοντας

τα δεύτερα μηνύματα DAG και IP3. Η IP3 ελευθερώνει ιόντα Ca2+ και επάγει διάφορα

σηματοδοτικά μονοπάτια. Η DAG, μαζί με ιόντα Ca2+ που έχουν ελευθερωθεί από τη

δράση της IP3, ενεργοποιεί την PKC η οποία, με τη σειρά της, ενεργοποιεί πρόσθετες

οδούς σηματοδότησης. Το σύμπλοκο του υποδοχέα παράγει επίσης μηνύματα που

Page 30: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

30

ενεργοποιούν το σηματοδοτικό μονοπάτι Ras, το οποίο ενεργοποιεί με διαδοχικές

φωσφορυλιώσεις τις κινάσες ERK και JNK και, παράλληλα με τα άλλα μονοπάτια,

οδηγεί στην ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κB, AP-1 και NFAT(1,

19, 36) (Εικόνα 10).

Εικόνα 10: Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγονται από την ενεργοποίηση του BCR(19)

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ TLR ΣΤΑ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ

Διάφορα είδη Β λεμφοκυττάρων εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα υποδοχέων TLR.

Τα ανώριμα Β λεμφοκύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα των TLR, ενώ τα

ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα και τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης εκφράζουν υψηλά

επίπεδα των TLR1, TLR6, TLR7, TLR9 και TLR10 και χαμηλά επίπεδα του TLR2. Η

έκφραση των TLR αυξάνει μετά από ενεργοποίηση του BCR ή του CD40, ιδίως στην

Page 31: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

31

περίπτωση των TLR9 και TLR10. Στα πλασματοκύτταρα εκφράζονται πολλοί TLR,

συμπεριλαμβανομένων των TLR3 και TLR4, και παρατηρείται αύξηση της ποσότητας

των εκκρινόμενων αντισωμάτων μετά από ενεργοποίηση των TLR. Η συνδιέγερση

των TLR με τον BCR δρα ως ένα τρίτο σήμα που προάγει την ενεργοποίηση, τον

πολλαπλασιασμό και την τελική διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων και μπορεί

επίσης να υποβοηθά τις διαδικασίες της μεταστροφής ισοτύπου, της σωματικής

υπερμεταλλαξιγένεσης και την ανάπτυξη ή συντήρηση των βλαστικών κέντρων(37, 38).

Επίσης, σύμφωνα με ορισμένες ενδείξεις, οι TLR εμπλέκονται στην αρνητική επιλογή

των Β λεμφοκυττάρων, καθώς έχει παρατηρηθεί αυξημένος αριθμός αυτοδραστικών

ανώριμων Β λεμφοκυττάρων σε άτομα με έλλειψη των πρωτεϊνών MyD88 ή IRAK4

που συμμετέχουν στα σηματοδοτικά μονοπάτια των TLR(39, 40).

ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ

Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι η πιο κοινή μορφή λευχαιμίας στο

Δυτικό ημισφαίριο, αφού αποτελεί το 30% του συνόλου των λευχαιμιών.

Εκδηλώνεται σχεδόν αποκλειστικά σε ενήλικες άνω των 50 ετών και προσβάλει τους

άντρες σε διπλάσια συχνότητα σε σχέση με τις γυναίκες(41). Η ΧΛΛ είναι κακοήθες

νεόπλασμα των Β λεμφοκυττάρων και χαρακτηρίζεται από προοδευτική

συσσώρευση μονοκλωνικών CD5+ Β-λεμφοκυττάρων στους λεμφικούς ιστούς, το

μυελό των οστών και το αίμα(42, 43).

Παρότι δεν έχει ακόμα διασαφηνιστεί ποιό/ά είναι τα κύτταρα προέλευσης της ΧΛΛ,

είναι πλέον κοινώς αποδεκτό πως τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ έχουν εμπειρία

αντιγόνου καθώς παρουσιάζουν κοινό ανοσοφαινότυπο και προφίλ γονιδιακής

έκφρασης με τα ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα(44-46). Πρόσφατες έρευνες δείχνουν

ότι τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ αλληλεπιδρούν με το μικροπεριβάλλον λαμβάνοντας

σήματα επιβίωσης μέσω πολλαπλών υποδοχέων, από τους οποίους ο Β κυτταρικός

υποδοχέας διαδραματίζει τον πιο σημαντικό ρόλο, και πως η αλληλεπίδραση αυτή

καθορίζει την εξέλιξη της νόσου(47, 48). Ωστόσο, ο ακριβής αντίκτυπος της αντιγονικής

διέγερσης στη ΧΛΛ, το είδος των αντιγόνων καθώς και οι παράγοντες του

μικροπεριβάλλοντος που μπορεί να οδηγήσουν σε ανάπτυξη και επέκταση του

λευχαιμικού κλώνου δεν έχουν αποσαφηνιστεί.

Page 32: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

32

STATUS ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ IGHV

Οι ασθενείς με ΧΛΛ διαχωρίζονται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με το ποσοστό των

σωματικών μεταλλάξεων στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών. Οι αλληλουχίες των

γονιδίων IGHV που έχουν ομολογία μικρότερη από 98% με το αντίστοιχο μη

αναδιατεταγμένο γονίδιο χαρακτηρίζονται ως μεταλλαγμένες (Μ-ΧΛΛ). Αντίστροφα,

αλληλουχίες με ομολογία μεγαλύτερη από 98% σε σχέση με το αντίστοιχο μη

αναδιατεταγμένο γονίδιο ορίζονται ως αμετάλλακτες (Α-ΧΛΛ). Το status

μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς

προγνωστικούς δείκτες, καθώς οι περιπτώσεις της Α-ΧΛΛ εμφανίζουν πιο επιθετική

μορφή της νόσου ενώ οι περιπτώσεις της Μ-ΧΛΛ έχουν πιο ήπια κλινική πορεία(49-51).

ΠΡΟΦΙΛ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ

Τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης της Α-ΧΛΛ και Μ-ΧΛΛ είναι ομοιόμορφα, με τα

κύτταρα να χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση των δεικτών ενεργοποίησης

CD23, CD25, CD69 και CD71, και χαμηλή έκφραση των CD22, Fcγ υποδοχέα IIb,

CD79b και IgD. Ακόμα, όλα τα κύτταρα εκφράζουν CD27, το οποίο είναι

χαρακτηριστικό των Β λεμφοκυττάρων μνήμης(52-54). Υπάρχουν όμως και ορισμένες

διαφορές στην έκφραση κάποιων γονιδίων, όπως στην περίπτωση των μορίων CD38

και ZAP-70 τα οποία εμπλέκονται στη σηματοδότηση μέσω του BCR και

χρησιμοποιούνται ως προγνωστικοί δείκτες(55, 56).

Το CD38 είναι μεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που συναντάται σε πολλά είδη λευκών

αιμοσφαιρίων, μεταξύ των οποίων και τα Β λεμφοκύτταρα. Ο ρόλος του είναι η

ενίσχυση της σηματοδότησης μέσω του BCR και η παροχή σημάτων που ρυθμίζουν

την απόπτωση και τα επίπεδα του κυτταροπλασματικού ασβεστίου. Στη ΧΛΛ, μέσω

του σηματοδοτικού μονοπατιού της ZAP-70 και της ERK 1/2, το CD38 προάγει

σήματα επιβίωσης και πολλαπλασιασμού(57). Η ZAP-70 είναι κυτταροπλασματική

πρωτεΐνη που παρέχει σήματα ενεργοποίησης στα Τ ή Β λεμφοκύτταρα. Στη ΧΛΛ,

κύτταρα θετικά για ZAP-70 έχουν μεγάλη πιθανότητα να εκφράζουν μόρια

προσκόλλησης και υποδοχείς χημειοκινών που προωθούν τη μετανάστευση των

κυττάρων προς μια βαθμίδωση χημειοκινών με αποτέλεσμα την αναστολή του

μηχανισμού της απόπτωσης(58). Στην Α-ΧΛΛ παρατηρείται υψηλή έκφραση των CD38

και ZAP-70, αντίθετα από την Μ-ΧΛΛ(59).

Page 33: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

33

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΕΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΕΣ ΣΤΗ ΧΛΛ

Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στην ΧΛΛ διαφέρει πολύ από το αντίστοιχο των

φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων και μοναδικά χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη

υποσυνόλων ασθενών με σχεδόν ταυτόσημους BCR (στερεότυποι BCR). Οι ασθενείς

που ανήκουν σε ένα στερεότυπο υποσύνολο έχουν ακριβώς ή σχεδόν ίδιες

αλληλουχίες των βαριών και ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών, μεταξύ

άλλων και πολύ όμοιες υπερμεταβλητές περιοχές CDR3(60-64). Η στερεοτυπία είναι

συχνό φαινόμενο στη ΧΛΛ καθώς 30% των ασθενών φέρουν στερεότυπους BCR(65,

66). Η συχνότητα αυτή είναι αξιοσημείωτη, καθώς αν αναλογιστεί κανείς τους

μηχανισμούς δημιουργίας ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών, η πιθανότητα δύο

διαφορετικά Β λεμφοκύτταρα να εκφράζουν στερεότυπους υποδοχείς είναι πολύ

χαμηλή (10-12). Η έκφραση των στερεότυπων BCR είναι υψηλότερη στην Α-ΧΛΛ σε

σχέση με τη Μ-ΧΛΛ(63, 64). Η στερεοτυπία του BCR θεωρείται ισχυρή ένδειξη

αναγνώρισης διακριτών αντιγόνων ή δομικά παρόμοιων επιτόπων και πολλά

δεδομένα δείχνουν ότι έχει και κλινική σημασία αφού πλέον συγκεκριμένα

στερεότυπα υποσύνολα σχετίζονται με ιδιαίτερη πρόγνωση(67). Το πιο

χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι οι ασθενείς που ανήκουν στο στερεότυπο

υποσύνολο #2 οι οποίοι αν και φέρουν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV έχουν κακή

πρόγνωση(67).

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΑ ΥΠΟΣΥΝΟΛΑ #1 ΚΑΙ #4

Οι περιπτώσεις ΧΛΛ που εκφράζουν αμετάλλακτους IGHV1/5/7-IGKV1(D)-39 BCRs

ανήκουν στο στερεότυπο υποσύνολο #1 (ΣΥ #1), ενώ περιπτώσεις που εκφράζουν

μεταλλαγμένους IGHV4-34/IGKV2-30 BCRs ισοτύπου IgG ανήκουν στο στερεότυπο

υποσύνολο #4 (ΣΥ #4). Τα δύο αυτά στερεότυπα υποσύνολα έχουν τη μεγαλύτερη

συχνότητα στη Α-ΧΧΛ και Μ-ΧΛΛ, αντιστοίχως. Το ΣΥ#1 αποτελεί το 2,5-3% ενώ το

ΣΥ #4 το 1% της ΧΛΛ(64, 65, 68). Οι ασθενείς που ανήκουν στο ΣΥ #1 έχουν υψηλά

επίπεδα CD38, CD49d και ZAP-70, παρουσιάζουν διάφορα δυσμενή χαρακτηριστικά,

όπως υψηλή τάση ανάπτυξης αυτοάνοσης θρομβοπενίας, και έχουν πολύ κακή

πρόγνωση, η οποία επιδεινώνεται από την υψηλή συχνότητα ανεπιθύμητων

χρωμοσωμικών ανωμαλιών που έχουν παρατηρηθεί σε αυτό το υποσύνολο.

Αντίθετα, οι ασθενείς που ανήκουν στο ΣΥ #4 δεν εκφράζουν CD38 και ZAP-70, έχουν

λίγες γενετικές βλάβες και ακολουθούν πολύ ήπια κλινική πορεία, ακόμα και σε

Page 34: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

34

σύγκριση με άλλες περιπτώσεις Μ-ΧΛΛ(67). Λόγω αυτών των χαρακτηριστικών, το ΣΥ

#1 και το ΣΥ #4 θεωρούνται πρότυπα κακής και καλής πρόγνωσης αντίστοιχα.

ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΜΕΣΩ BCR ΣΤΗ ΧΛΛ

Οι αποκρίσεις των Β λεμφοκυττάρων της ΧΛΛ μετά από διέγερση του BCR διαφέρουν

ανάμεσα σε διαφορετικές περιπτώσεις. Σε όλες τις περιπτώσεις ΧΛΛ, τα επίπεδα της

επιφανειακής IgM (sIgM) είναι μειωμένα και παρατηρείται μειωμένη απόκριση μετά

από διέγερση του BCR σε σχέση με τα φυσιολογικά Β λεμφοκύτταρα (69-71).

Περιπτώσεις με αμετάλλακτα γονίδια IGHV και/ή υψηλό ποσοστό κυττάρων θετικών

για ZAP-70 ή/και CD38 αποκρίνονται πιο συχνά στη δέσμευση της sIgM. Στην Μ-ΧΛΛ,

φαίνεται πως τα Β λεμφοκύτταρα δεν ανταποκρίνονται στη διέγερση μέσω του BCR,

τουλάχιστον όταν χρησιμοποιείται το αντί-IgM ως αντιγόνο(72, 73). Μια συστηματική

μελέτη προσπάθησε να συσχετίσει την ενεργοποίηση των κινασών καθοδικά του

BCR με το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV. Βρέθηκε πως οι Akt και ERK ήταν

φωσφορυλιωμένες στο σύνολο των περιπτώσεων της Α-ΧΛΛ και στο 75% των

περιπτώσεων της Μ-ΧΛΛ, γεγονός που υποδηλώνει ότι το μονοπάτι είναι ως ένα

βαθμό ενεργό στις περισσότερες περιπτώσεις ΧΛΛ. Ωστόσο, στην πλειονότητα των

περιπτώσεων παρατηρήθηκε περιορισμένη ενεργοποίηση των μονοπατιών της JNK

και του NF-κB. Αυτό το μοριακό πρότυπο ατελούς ανοσοαπόκρισης μετά από

διέγερση του BCR είναι παρόμοιο με το αντίστοιχο ανεργικών Β λεμφοκυττάρων στα

ποντίκια(74-78). Επιπλέον, σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη, σε μια υποομάδα ασθενών

η αδυναμία σηματοδότησης μέσω του BCR χαρακτηρίζεται από φωσφορυλίωση της

κινάσης ERK1/2, ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-ATc1 και

ανενεργό Akt. Στις περιπτώσεις αυτές, η χρήση αναστολέων της ERK1/2 και του NF-

ATc1 κατέστησε τα κύτταρα ικανά να ανταποκριθούν στη διέγερση με αντί-IgM και

τελικά οδήγησε σε απόπτωση, δημιουργώντας νέες θεραπευτικές προοπτικές. Όπως

έχει αναφερθεί και σε άλλες μελέτες, η στόχευση μορίων που βρίσκονται σε

προχωρημένα στάδια του σηματοδοτικού μονοπατιού του BCR προσφέρει το

πλεονέκτημα της άμεσης διαμόρφωσης των μηχανισμών επιβίωσης και

πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σε αντίθεση με τη στόχευση μορίων που

βρίσκονται στα πρώτα στάδια του μονοπατιού τα οποία μπορεί να επηρεάζονται και

από ερεθίσματα μέσω άλλων υποδοχέων(75, 79, 80).

Page 35: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

35

TLRS ΣΤΗ ΧΛΛ

Τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ εκφράζουν συχνά BCRs που προσδένονται με

αυτοαντιγόνα αλλά και κοινά παθογόνα, όπως συστατικά του βακτηριακού

τοιχώματος. Οι TLR που αναγνωρίζουν αυτού του είδους τα μοριακά μοτίβα

εκφράζονται στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ και έχουν προφίλ έκφρασης παρόμοιο με

το αντίστοιχο των Β λεμφοκυττάρων με εμπειρία αντιγόνου(79, 81-84). Έχουν

παρατηρηθεί υψηλά επίπεδα mRNA των TLR1, TLR2, TLR6, TLR7, TLR9 και TLR10,

πολύ χαμηλά επίπεδα mRNA των TLR4 και TLR8 και απουσία των TLR3 και TLR5. Οι

TLR που εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα είναι λειτουργικοί στα λευχαιμικά κύτταρα,

όπου επάγουν σήματα είτε πολλαπλασιασμού ή απόπτωσης και αναστέλλουν την

αγγειογένεση των όγκων(82-91). Μέχρι πρόσφατα, η έρευνα στη ΧΛΛ είχε εστιαστεί

στους TLR7 και TLR9, με αντικρουόμενα αποτελέσματα. Κάποιες μελέτες

υποστηρίζουν ότι η διέγερση του με CpG επάγει τον πολλαπλασιασμό των Β

λεμφοκυττάρων και την παραγωγή κυτταροκινών(87, 91), ενώ άλλες αναφέρουν πως η

διέγερση με CpG οδήγησε τα κύτταρα σε απόπτωση(90). Επιπλέον, φαίνεται πως η

απόκριση στη διέγερση του TLR9 ποικίλλει ανάμεσα σε διαφορετικές ομάδες

ασθενών(82, 84, 91), αν και φαίνεται πως επάγει επιλεκτικά απόπτωση στην Μ-ΧΛΛ(82,

92). Η διέγερση μέσω του TLR7 βρέθηκε να έχει γενικά αντι-αποπτωτική δράση(93)

αλλά τελευταία δεδομένα δείχνουν ότι στη Μ-ΧΛΛ μπορεί να επάγει απόπτωση(82).

Επίσης, ο TLR7 έχει την ικανότητα να επάγει την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων,

με μεγάλη ωστόσο ετερογένεια(94, 95). Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι διαφορετικά

στερεότυπα υποσύνολα εμφανίζουν διαφορετικά προφίλ έκφρασης και

λειτουργικότητας των TLR(81, 82). Για παράδειγμα, η διέγερση μέσω των TLR1/2,

TLR2/6 και TLR9 σε ασθενείς των ΣΥ #1 και #4, οδήγησε σε σημαντική αύξηση της

έκφρασης του CD86 στο ΣΥ #4, ενώ δεν είχε κάποιο αποτέλεσμα στο ΣΥ #1. Αντίθετα,

η διέγερση μέσω του TLR7 αύξησε την έκφραση του CD25 στο ΣΥ #1 περισσότερο

απ’ ό,τι στο ΣΥ #4(82).

Page 36: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

36

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Page 37: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

37

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ

Η ομάδα μελέτης περιλάμβανε 28 ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία

που παρακολουθούνται στην Αιματολογική Κλινική του ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου». Οι

14 έφεραν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV και οι άλλοι 14 αμετάλλακτα. Οι 4 από αυτούς

ανήκαν στο στερεότυπο υποσύνολο #4 (IGHV4-34/IGKV2-30) και εξέφραζαν

μεταλλαγμένους BCR IgG ισομορφής. Επίσης, άλλοι 4 ασθενείς ανήκαν στο

στερεότυπο υποσύνολο #1 (IGHV1/5/7-IGKV1(D)-39) και εξέφραζαν

αμετάλλακτους BCR IgM ισομορφής.

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ CD19+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΔΕΙΓΜΑ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

Η απομόνωση των CD19+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε με χρήση της τεχνολογίας

RosetteSep κατά την οποία πραγματοποιείται αρνητική επιλογή των επιθυμητών

κυττάρων (Πίνακας 2) με την πρόσδεση μονοκλωνικών αντισωμάτων σε αυτά. Η

μέθοδος οδηγεί στο σχηματισμό ροζετών των ανεπιθύμητων κυττάρων με τα ερυθρά

αιμοσφαίρια και επακόλουθη καθίζηση τους όταν φυγοκεντρηθούν παρουσία

φικόλης (Εικόνα 11).

Πίνακας 2: Αντισώματα για τους δείκτες των ανεπιθύμητων κυττάρων.

Δείκτες Κυτταρικός τύπος έκφρασης

CD2 Τ λεμφοκύτταρα, ΝΚ κύτταρα, Θυμοκύτταρα

CD3 Τ λεμφοκύτταρα, Θυμοκύτταρα

CD16 ΝΚ κύτταρα, Ουδετερόφιλα, Μακροφάγα

CD36 Μονοπύρηνα, Αιμοπετάλια

CD56 ΝΚ κύτταρα

CD66b Κοκκιοκύτταρα

Page 38: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

38

Εικόνα 11: Αρνητική επιλογή των CD19+ κυττάρων με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. (Τροποποιημένο από: http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/RosetteSep-Human-B-Cell-Enrichment-Cocktail.aspx)

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Προσθήκη 50 μl μονοκλωνικών αντισωμάτων RosetteSep ανά ml ολικού

αίματος και καλή ανάδευση του περιεχομένου

2. Επώαση για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου

3. Προσθήκη ίσου όγκου Phosphate Buffered saline (PBS) με περιεκτικότητα 2%

Fetal Bovine Serum (FBS) (PBS-FBS 2%) στο ολικό αίμα και ανάδευση

4. Επιστοίβαση σε ίσο όγκο φικόλης

5. Φυγοκέντρηση στις 2.000 στροφές για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου

6. Συλλογή της στιβάδας που περιέχει τα εμπλουτισμένα κύτταρα σε καινούργιο

falcon

7. Προσθήκη PBS-FBS 2% μέχρι τελικό όγκο 12 ml

8. Φυγοκέντρηση στις 2.000 στροφές για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου

9. Αφαίρεση υπερκειμένου

Page 39: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

39

10. Προσθήκη 10 ml PBS/FBS 2%

11. Επανάληψη της διαδικασίας φυγοκέντρησης και αφαίρεσης υπερκειμένου

άλλες δύο φορές

12. Επαναιώρηση των κυττάρων σε ποσότητα PBS-FBS 2% ανάλογη με την

ποσότητα του ιζήματος

13. Χρώση μικρής ποσότητας των κυττάρων με τη χρωστική Trypan Blue

14. Μεταφορά των κυττάρων σε καταμετρική πλάκα Νeubauer

15. Μέτρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο

ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΠΟΣΟΣΤΟΥ ΤΩΝ CD19+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ

Η μέτρηση του ποσοστού των CD19+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε με

κυτταρομετρία ροής (FACS) σε αναλυτή BD FACS CANTO και τα αποτελέσματα

αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού BD FACS DIVA.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Προσθήκη 10 μl μίγματος μονοκλωνικών αντισωμάτων CD3-FITC και CD19-

PE σε 100 μl ολικού αίματος

2. Ανακίνηση και επώαση των δειγμάτων για 10 λεπτά σε θερμοκρασία

δωματίου

3. Προσθήκη 2 ml διαλύματος χλωριούχου αμμωνίου (NH4CL) για λύση των

ερυθροκυτττάρων

4. Ανακίνηση και επώαση των δειγμάτων για 10 λεπτά σε θερμοκρασία

δωματίου

5. Φυγοκέντρηση στις 2.000 στροφές για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου

6. Απόρριψη του υπερκειμένου

7. Προσθήκη 1 ml DPBS 1X σε κάθε δείγμα

8. Μέτρηση του ποσοστού των CD19+ κυττάρων στον αναλυτή

Η διαδικασία επαναλήφθηκε και μετά την αρνητική επιλογή των CD19+ κυττάρων

και για χρήση στην πειραματική διαδικασία επιλέχθηκαν τα δείγματα που τα

περιείχαν σε ποσοστό μεγαλύτερο από 95% (Εικόνα 12).

Page 40: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

40

Εικόνα 12: Ανάλυση του ποσοστού των CD19+ κυττάρων πριν (Α) και μετά (Β) τη διαδικασία της αρνητικής επιλογής.

ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ

Η διέγερση των υποδοχέων TLR και BCR των CD19+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε

με τη χρήση προσδετών κατάλληλων για τους υποδοχείς που επιθυμούμε να

μελετήσουμε (Πίνακας 3). Οι υγρές καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε ατμόσφαιρα με

περιεκτικότητα 5% CO2 στους 37 oC για συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα.

Πίνακας 3: Προσδέτες που χρησιμοποιήθηκαν για τη διέγερση των υποδοχέων TLR και BCR.

Υποδοχείς Προσδέτες Όγκοι

TLR1/2 Pam3CSK4 1 μg/ml

TLR7 Imiquimod - R837 0,1 μg/ml

TLR9 CpG ODN 2,5 μg/ml

BCR αντί-IgM 20 μg/ml

BCR (ΣΥ #4) αντί-IgG 20 μg/ml

Page 41: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

41

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Επαναδιάλυση των κυττάρων σε θρεπτικό υλικό RPMI Complete (RPMI 1640

με περιεκτικότητα 10% fetal calf serum, 2 mmol/l l-glutamine και 15 μg/ml

gentamicin) με τελική συγκέντρωση 3x106 κύτταρων ανά ml θρεπτικού

υλικού

2. Μεταφορά 1 ml δείγματος στο αντίστοιχο πηγαδάκι πλάκας 24 πηγαδιών

3. Προσθήκη του κατάλληλου προσδέτη ή συνδυασμού προσδετών σε κάθε

πηγαδάκι με τη διάταξη της Εικόνας 13

4. Τοποθέτηση σε κλίβανο περιεκτικότητας 5% CO2 στους 37 οC και επώαση

των αντίστοιχων πλακών για 15 και 50 λεπτά

Εικόνα 13: Διάταξη της καλλιέργειας ανά χρονικό στιγμιότυπο, όπου CTL είναι το αδιέγερτο control, IgM το αντί-IgM, IgG το αντί-IgG, C το CpG ODN, Im το Imiquimod-R837 και PAM το Pam3CSK4.

Page 42: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

42

ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Στο τέλος της επώασης πραγματοποιήθηκε συλλογή των κυττάρων.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Συλλογή της κυτταροκαλλιέργειας του κάθε πηγαδιού σε ξεχωριστό

eppendorf

2. Φυγοκέντρηση στις 5.000 στροφές για 5 λεπτά στους 4 οC

3. Αφαίρεση υπερκειμένου

4. Προσθήκη 1 ml DPBS 1X

5. Επανάληψη της διαδικασίας φυγοκέντρησης, αφαίρεσης υπερκειμένου και

προσθήκης DPBS

6. Επανάληψη της φυγοκέντρησης και αφαίρεση υπερκειμένου

7. Αποθήκευση στους -20 οC

ΛΗΨΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΟΛΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Προετοιμασία του διαλύματος λύσης των κυττάρων (Lysis Buffer) του οποίου

η σύσταση αναφέρεται στον Πίνακα 4

2. Προσθήκη αναστολέων πρωτεασών (PMSF, Leupeptin, Na3VO4) και

φωσφατάσης (NaF), των οποίων οι συγκεντρώσεις φαίνονται στον Πίνακα 5

3. Επαναδιάλυση του ιζήματος σε κατάλληλο όγκο του Lysis Buffer που περιέχει

τους αναστολείς (20 μl Lysis Buffer ανά 2x106 κύτταρα)

4. Επώαση στον πάγο για 15 λεπτά

5. Φυγοκέντρηση στις 14.000 στροφές για 15 λεπτά στους 4 οC

6. Μεταφορά του υπερκειμένου σε παγωμένα eppendorfs

7. Αποθήκευση στους -20 οC ή στους -80 οC για μεγάλο χρονικό διάστημα

Page 43: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

43

Πίνακας 4: Σύσταση του Lysis Buffer.

Αντιδραστήρια Όγκοι

Glycerol 5 ml

NaCl (5 M) 1 ml

Tris (1 M pH=7.4) 1 ml

10% SDS 500 μl

1% Triton X-100 500 μl

EDTA (0,5 M pH=8) 100 μl

sodium deoxycholate 0,25 gr

dH20 έως τελικό όγκο 50 ml

Πίνακας 5: Συγκέντρωση των αναστολέων στο Lysis Buffer.

Αναστολείς Όγκοι

NaF 1 mM

PMSF 0,421 mM

Leupeptin 5 ng /300 μl

Na3VO4 1 mM

ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

Για επιτυχή σύγκριση των πρωτεϊνικών σημάτων που θα προκύψουν από την

ανοσοανίχνευση Western είναι απαραίτητο να πραγματοποιηθεί ανάλυση ίσων

ποσοτήτων πρωτεϊνών. Αυτό επιτυγχάνεται με τη μέθοδο ποσοτικοποίησης

πρωτεϊνών Bradford που χρησιμοποιεί τη χρωστική Coomassie (Coomassie Plus

Bradford Assay kit, Pierce Biotechnology, Rockford, USA). Η ποσοτικοποίηση

βασίζεται στην ιδιότητα της Coomassie να προσδένεται στις πρωτεΐνες σε

περιβάλλον όξινου pH, αλλάζοντας το χρώμα του διαλύματος από κόκκινο σε μπλε

Page 44: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

44

όταν ολοκληρωθεί η πρόσδεση (Εικόνα 14). Η ποσότητα του συμπλόκου πρωτεΐνης-

χρωστικής στο διάλυμα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης, επομένως

με τη μέτρηση της απορρόφησης του συμπλόκου στα 595 nm και τη βοήθεια μιας

πρότυπης καμπύλης (Πίνακας 6), μπορεί να προσδιοριστεί η συγκέντρωση των

πρωτεϊνών ενός άγνωστου δείγματος.

Εικόνα 14: Απεικόνιση των αυξανόμενων συγκεντρώσεων πρωτεΐνης (από αριστερά προς τα δεξιά) οι οποίες αποδίδονται με εντονότερο μπλε χρώμα, σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford(Πηγή: www.eiroforum.org/media/photo_galleries/embl/index.html)

Πίνακας 6: Πρόγραμμα αραίωσης για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης. Η επιλογή της αλβουμίνης (BSA) ως την χρησιμοποιούμενη πρωτεΐνη οφείλεται στο γεγονός ότι οι σφαιρικές πρωτεΐνες δεσμεύουν τη χρωστική καλύτερα.

Φιαλίδιο Όγκος διαλύματος

αραίωσης Όγκος BSA

Τελική συγκέντρωση BSA

1 0 μl 300 μl από stock 2000 μg/ml

2 125 μl 375 μl από stock 1500 μg/ml

3 325 μl 325 μl από stock 1000 μg/ml

4 175 μl 175 μl από φιαλίδιο 2 750 μg/ml

5 325 μl 325 μl από φιαλίδιο 3 500 μg/ml

6 325 μl 325 μl από φιαλίδιο 5 250 μg/ml

7 325 μl 325 μl από φιαλίδιο 6 125 μg/ml

8 400 μl 100 μl από φιαλίδιο 7 25 μg/ml

9 400 μl 0 μl 0 μg/ml (control)

Page 45: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

45

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Μεταφορά 50 μl από κάθε δείγμα στους κατάλληλους δοκιμαστικούς

σωλήνες

2. Προσθήκη 1,5 ml Coomassie Plus Reagent και καλή ανάμιξη

3. Επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου

4. Μέτρηση του BSA και δημιουργία πρότυπης καμπύλης

5. Μέτρηση της απορρόφησης όλων των δειγμάτων

6. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα με βάση την

πρότυπη καμπύλη

ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ WESTERN

Η ανοσοανίχνευση Western (Western Blot) είναι αναλυτική μέθοδος μεταφοράς

πρωτεϊνών σε μεμβράνη με στόχο την ανίχνευση και ταυτοποίηση τους. Αρχικά, οι

μετουσιωμένες πρωτεΐνες ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (10%

NuPAGE Bis-Tris gel, Ιnvitrogen, Paisley, UK) και έτσι διαχωρίζονται με βάση το

μοριακό βάρος. Στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF (Ιnvitrogen, Paisley,

UK) όπου ακινητοποιούνται, και επωάζονται με αντισώματα τα οποία είναι ειδικά για

μια πρωτεΐνη-στόχο και συνδέονται μόνο με αυτή.

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Προετοιμασία δειγμάτων σύμφωνα με τον Πίνακα 7

2. Τοποθέτηση των δειγμάτων για 10 λεπτά στους 70 οC

3. Μεταφορά των δειγμάτων στον πάγο

Page 46: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

46

Πίνακας 7: Σύσταση των δειγμάτων προς φόρτωση στη πηκτή.

Αντιδραστήρια Όγκοι

Πρωτεΐνη 15 μg (9,5 μl)

NuPAGE LDS Sample Buffer 4 μl

NuPAGE Reducing 1,5 μl

Τελικός Όγκος 15 μl

SDS-ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Αραίωση του Running Buffer 20X (Ιnvitrogen, Paisley, UK) σε τελική

συγκέντρωση 1X με αποσταγμένο νερό

2. Τοποθέτηση της πηκτής πολυακρυλαμίδης στη συσκευή Invitrogen XCell

SureLock

3. Γέμισμα του εσωτερικού θαλάμου της συσκευής με περίπου 200 ml Running

Buffer και 500 μl Antioxidant (Ιnvitrogen, Paisley, UK)

4. Γέμισμα του εξωτερικού θαλάμου της συσκευής με 600 ml Running Buffer

5. Φόρτωμα των δειγμάτων στην πηκτή πολυακρυλαμίδης

6. Ρύθμιση της συσκευής ηλεκτροφόρησης για 1 ώρα στα 180 Volt

ΗΛΕΚΤΡΟΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ PVDF (TRANSFER)

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Προετοιμασία του διαλύματος μεταφοράς (Transfer Buffer) σύμφωνα με τον

Πίνακα 8

2. Εμποτισμός της μεμβράνης PVDF σε μεθανόλη για 5 λεπτά

3. Εμποτισμός σφουγγαριών, χαρτιών Whatman, μεμβράνης PVDF και της

πηκτής πολυακρυλαμίδης σε Transfer Buffer

4. Διάταξη των παραπάνω όπως φαίνεται στην Εικόνα 15

Page 47: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

47

5. Γέμισμα του εσωτερικού θαλάμου της συσκευής με Transfer Buffer

6. Ρύθμιση της συσκευής ηλεκτροφόρησης για 1 ώρα και 38 λεπτά στα 40 Volt

7. Μετά το πέρας της διαδικασίας πλύσιμο της μεμβράνης με PBS Tween (PBS-

T) 0,001% 3 φορές επί 5 λεπτά

Πίνακας 8: Σύσταση του Transfer Buffer.

Αντιδραστήρια Όγκοι

Μεθανόλη 100 ml

NuPAGE Transfer Buffer 20x (Invitrogen) 50 ml

NuPAGE Antioxidant (Invitrogen) 1 ml

dH2O Έως τελικό όγκο 1000 ml

Τελικός όγκος 1000 ml

Εικόνα 15: Διάταξη του Transfer. (Τροποποιημένο από: http://tools.invitrogen.com/ content/sfs/manuals/blotmod_pro.pdf)

ΧΡΩΣΗ ΜΕ PONCEAU S

Για να επιβεβαιωθεί αν η μεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή στη μεμβράνη

ήταν επιτυχής, πραγματοποιείται χρώση της μεμβράνης με τη χρωστική Ponceau S

(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany) που προσδίδει στις πρωτεϊνικές ζώνες

κόκκινο χρώμα (Εικόνα 16).

Page 48: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

48

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Προσθήκη χρωστικής Ponceau S στη μεμβράνη και επώαση για 5 λεπτά σε

θερμοκρασία δωματίου

2. Πλύσιμο της μεμβράνης με dH2O έως ότου φύγει η περίσσεια χρωστικής

3. Παρατήρηση των ζωνών που σχηματίστηκαν

4. Πλύσιμο της μεμβράνης με dH2O επί 5 λεπτά

5. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 2 φορές επί 5 λεπτά

Εικόνα 16: Χρώση μεμβράνης με Ponceau S. Όσο πιο έντονο το χρώμα, τόσο μεγαλύτερη η ποσότητα της πρωτεΐνης.

ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Επώαση της μεμβράνης με 2,5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη διαλυμένο

σε PBS-T για 1 ώρα (με σκοπό τη δέσμευση των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης

των αντισωμάτων και μείωση του «θορύβου» στις εικόνες)

2. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά

3. Επώαση της μεμβράνης με πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα διαλυμένο

είτε σε γάλα είτε σε BSA (οι συγκεντρώσεις των αντισωμάτων που

Page 49: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

49

χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 9) για 2 ώρες σε θερμοκρασία

δωματίου ή overnight στους 4 οC

4. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά

5. Επώαση της μεμβράνης με δευτερογενές μονοκλωνικό αντίσωμα IgG

(συνδεδεμένο με ραφανική υπεροξειδάση) (1:10.000 σε γάλα 2,5%) για 2

ώρες σε θερμοκρασία δωματίου

6. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά

7. Επώαση της μεμβράνης με κατάλληλο υπόστρωμα που πραγματοποιεί

αντίδραση χημειοφωταύγειας (Super signal west pico chemiluminescent

substrate, Pierce Biotechnology, Rockford, USA)

8. Καλό στέγνωμα της μεμβράνης και τοποθέτησή της στο μηχάνημα

GeneGnome της Syngene για λήψη εικόνας

Πίνακας 9: Οι συγκεντρώσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν.

Μονοκλωνικά Αντισώματα

Συγκεντρώσεις

p-ERK 1:500 σε BSA 0,1%

β-actin HRP 1:50.000 σε γάλα 2,5%

STRIPPING

Σε περίπτωση που το μοριακό βάρος δυο πρωτεϊνών είναι παρόμοιο ή ταυτόσημο και

υπάρχει περίπτωση οι ζώνες να μην είναι ξεκάθαρες, πρέπει να απομακρυνθεί το

πρώτο μονοκλωνικό. Για το σκοπό αυτό επωάζουμε τη μεμβράνη με Stripping Buffer

(Pierce Biotechnology, Rockford, USA).

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά

2. Επώαση με Stripping Buffer για 10-40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ή

στους 37 οC (ανάλογα με το πόσο ισχυρά συνδεδεμένο είναι το πρωτογενές

μονοκλωνικό αντίσωμα που πρέπει να απομακρυνθεί)

3. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά

Page 50: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

50

4. Blocking με γάλα 2,5% για 10-40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου

5. Επώαση της μεμβράνης με πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα

ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΣΗΜΑΤΩΝ

Για την ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής έκφρασης των δειγμάτων που

αναλύθηκαν, πραγματοποιείται επώαση της ίδιας μεμβράνης με αντίσωμα για β-

ακτίνη, δομική πρωτεΐνη που θεωρείται ότι εκφράζεται ισόποσα σε όλα τα κύτταρα

ανεξάρτητα από τις συνθήκες. Τα σήματα της εξεταζόμενης πρωτεΐνης και της β-

ακτίνης μετρώνται με το πρόγραμμα Image J (http://lukemiller.org/index.php/

2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/). Για κάθε δείγμα

υπολογίζεται ο λόγος έντασης της εξεταζόμενης πρωτεΐνης προς την ένταση της β-

ακτίνης.

Page 51: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

51

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Page 52: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

52

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΧΛΛ ΕΜΦΑΝΙΖΟΥΝ ΕΝΕΡΓΟ MAPK ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΤΟΥ BCR ΚΑΙ ΤΩΝ TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9

Για να προσδιορίσουμε την επίδραση της διέγερσης του BCR και των TLR1/2/7/9

αλλά και της συνδιέγερσης τους στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ διερευνήσαμε τη

φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των MAP κινασών ERK1/2 (p-ERK1/2) καθοδικά

του σηματοδοτικού μονοπατιού το οποίο ενεργοποιείται τόσο από τον BCR όσο και

από τους TLRs. Η ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού εξετάστηκε σε 28 ασθενείς

με ΧΛΛ, από τους οποίους 14 έφεραν αμετάλλακτα γονίδια IGHV (Α-ΧΛΛ) ενώ οι

υπόλοιποι 14 έφεραν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV (Μ-ΧΛΛ). Οι 4/14 ασθενείς της Α-

ΧΛΛ ανήκαν στο ΣΥ #1, ενώ οι 4/14 ασθενείς της Α-ΧΛΛ ανήκαν στο ΣΥ #4. Όλοι οι

λευχαιμικοί κλώνοι εξέφραζαν ανοσοσφαιρίνες ισοτύπου IgM εκτός από τους

κλώνους των ασθενών του ΣΥ #4 που εξέφραζαν IgG.

Η διέγερση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε υγρή καλλιέργεια με χρήση ειδικών

προσδετών για όλους τους υποδοχείς. Συγκεκριμένα, ο BCR διεγέρθηκε με αντί-

ανθρώπινα αντισώματα IgM ή IgG, κατά περίπτωση, και οι TLR1/2, TLR7 και TLR9

με τους προσδέτες Pam3CSK4, Imiquimod και CpG ODN, αντιστοίχως. Σε όλους τους

ασθενείς πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια μέσω των TLR9 και TLR7 αφού οι

υποδοχείς αυτοί είναι από τους καλύτερα μελετημένους στη ΧΛΛ, ωστόσο τα

αποτελέσματα των διεγέρσεών τους είναι ετερογενή και χρήζουν περαιτέρω

μελέτης(87, 90, 91, 93-95).

Για τους ασθενείς που ανήκαν στα στερεότυπα υποσύνολα #1 και #4 στην

καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε και ο προσδέτης του TLR1/2, καθώς σε προηγούμενη

μελέτη προέκυψε ότι η απόκριση στη διέγερση του ετεροδιμερούς είχε αρκετές

διαφορές ανάμεσα στα δύο υποσύνολα(82). Επιπλέον, σε όλους τους ασθενείς

πραγματοποιήθηκε διέγερση μέσω του BCR, καθώς και συνδιέγερσή του με τους TLR,

με σκοπό να μελετηθεί ο ρόλος των TLR στη σηματοδότηση μέσω του BCR. Ως

αρνητικός μάρτυρας (control) χρησιμοποιήθηκαν αδιέγερτα κύτταρα της κάθε

περίπτωσης, καλλιεργημένα υπό τις ίδιες συνθήκες.

Page 53: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

53

Η έκφραση της p-ERK μετρήθηκε με ανοσοανίχνευση Western με τη χρήση ειδικών

αντισωμάτων στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών. Τα αποτελέσματα

εκφράστηκαν ως λόγος της έντασης της ζώνης της πρωτεΐνης-στόχου σε σχέση με

την ένταση της ζώνης της β-ακτίνης. Θεωρήσαμε ότι υπήρχε αύξηση της p-ERK εάν η

διαφορά με το αντίστοιχο αδιέγερτο control ήταν μεγαλύτερη από |1,2|x.

Α-ΧΛΛ

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL

Στα αδιέγερτα κύτταρα των ασθενών με αμετάλλακτα γονίδια IGHV, η ERK ήταν

φωσφορυλιωμένη στο σύνολο των περιπτώσεων, με πτώση των επιπέδων της p-ERK

να παρατηρείται στα 50 λεπτά (fold=0,7).

Εικόνα 17: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στην Α-ΧΛΛ για τα αδιέγερτα κύτταρα στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR7 ΚΑΙ TLR9

Η διέγερση μέσω του BCR για 15 λεπτά δεν οδήγησε σε κάποια διαφορά στα επίπεδα

έκφρασης της p-ERK αλλά στη παρατεταμένη έκθεση των κυττάρων σε αντί-IgM για

50 λεπτά παρατηρήθηκε αύξησή τους (fold=1,6). Τα διεγερμένα κύτταρα μέσω TLR9

παρουσίασαν υψηλά επίπεδα p-ERK σε σχέση με τα αδιέγερτα (fold=2,1), ενώ η

διέγερση μέσω του TLR7 αύξησε ελάχιστα την φωσφορυλίωση της ERK (fold=1,3).

Page 54: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

54

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR

Οι συνδιεγέρσεις των κυττάρων με αντί-IgM + Im και με αντί-IgM + CpG οδήγησαν σε

μικρή αύξηση των επιπέδων της p-ERK σε σχέση με το αδιέγερτο (fold=1,4 και 1,5),

παρατηρήθηκε όμως μείωση των επιπέδων της p-ERK σε σύγκριση με τη διέγερση

των μονών διεγέρσεων του BCR και των TLR (fold=0,5-0,9).

Εικόνα 18: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στην Α-ΧΛΛ στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

Εικόνα 19: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση της Α-ΧΛΛ

Page 55: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

55

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #1

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL

Στα αδιέγερτα κύτταρα του στερεότυπου υποσυνόλου #1 παρατηρήθηκε

φωσφορυλίωση της ERK και στα δύο χρονικά στιγμιότυπα, με τα επίπεδα της p-ERK

να μειώνονται στα 50 λεπτά (fold=0,4).

Εικόνα 20: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τα αδιέγερτα κύτταρα, στο ΣΥ #1 στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9

Η έκθεση των κυττάρων σε αντί-IgM οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της p-ERK

(fold=1,6) στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών, ενώ στα 15 λεπτά δεν

παρατηρήθηκε διαφορά σε σχέση με το αδιέγερτο control. Σε όλες τις διεγέρσεις

μέσω των TLR ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα p-ERK, με μεγαλύτερη διαφορά σε

σχέση με τα αδιέγερτα κύτταρα να εμφανίζει η διέγερση μέσω των TLR1/2

(fold=2,4).

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR

Όλες οι συνδιεγέρσεις οδήγησαν σε αύξηση των επιπέδων έκφρασης της p-ERK σε

σύγκριση με το αδιέγερτο control, αλλά παρατηρήθηκε είτε μείωση ή καμία διαφορά

στα επίπεδα της p-ERK σε σύγκριση με όλες μεμονωμένες διεγέρσεις (fold=0,6-1).

Page 56: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

56

Εικόνα 21: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στο ΣΥ #1 στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

Εικόνα 22: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση του ΣΥ #1

Μ-ΧΛΛ

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL

Στα αδιέγερτα κύτταρα των ασθενών με μεταλλαγμένα γονίδια IGHV η ERK ήταν

φωσφορυλιωμένη και στα δύο χρονικά στιγμιότυπα, με τα επίπεδα έκφρασής της να

μειώνονται σημαντικά στα 50 λεπτά (fold=0,3).

Page 57: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

57

Εικόνα 23: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τα αδιέγερτα κύτταρα στη Μ-ΧΛΛ στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR7 ΚΑΙ TLR9

Μετά από έκθεση στο αντίσωμα αντί-IgM για 15 λεπτά, τα επίπεδα έκφρασης της p-

ERK αυξήθηκαν (fold=1,4), ενώ μετά από έκθεση για 50 λεπτά παρατηρήθηκε μείωσή

τους σε σχέση με τα αδιέγερτα κύτταρα (fold=0,8). Οι διεγέρσεις μέσω των TLR7 και

TLR9 δεν είχαν κάποιο αντίκτυπο στη φωσφορυλίωση της ERK (fold=1,1 και 1,2).

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR

Μετά από έκθεση σε αντί-IgM + Im και αντί-IgM + CpG ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα

της p-ERK συγκριτικά με το αδιέγερτο control (fold=1,8 και 2,8) και τις μεμονωμένες

διεγέρσεις του BCR (fold=1,6 και 1,7). Η συνδιέγερση του BCR με τον TLR9 αύξησε

τα επίπεδα της p-ERK (fold=1,7) σε σχέση με την μονή διέγερση με CpG, ενώ η

συνδιέγερση του BCR με τον TLR7 δεν εμφάνισε διαφορές στην έκφραση της p-ERK

σε σχέση με την μονή διέγερση με Im (fold=1).

Page 58: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

58

Εικόνα 24: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τη Μ-ΧΛΛ στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

Εικόνα 25: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση της Μ-ΧΛΛ

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #4

ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL

Στα αδιέγερτα κύτταρα των ασθενών που ανήκουν στο στερεότυπο υποσύνολο 4

ανιχνεύθηκε p-ERK και στα δύο χρονικά στιγμιότυπα, με τα επίπεδα έκφρασής της

να είναι υψηλότερα στα 15 λεπτά (fold=3,2).

Page 59: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

59

Εικόνα 26: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τα αδιέγερτα κύτταρα στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9

Η διέγερση μέσω του BCR οδήγησε σε ετερογενείς αποκρίσεις, με τα επίπεδα της p-

ERK να μειώνονται στα 15 λεπτά (fold=0,8) αλλά να αυξάνονται αρκετά στα 50 λεπτά

(fold=2,1). Μετά από έκθεση στους προσδέτες Im, CpG και PAM, τα επίπεδα

έκφρασης της p-ERK αυξάνονται, με την διέγερση μέσω του TLR1/2 να εμφανίζει τη

μεγαλύτερη διαφορά σε σχέση με το control (fold=2,5).

ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR

Οι συνδιεγέρσεις του BCR με τους TLR1/2, TLR7, και TLR9 αύξησαν τη

φωσφορυλίωση της ERK συγκριτικά με τα αδιέγερτα κύτταρα (fold=1,2-2,2), άλλα

στην πλειοψηφία των περιπτώσεων μείωσαν τα επίπεδα της p-ERK σε σχέση με τις

μεμονωμένες διεγέρσεις των υποδοχέων (fold=0,2-1). Μόνο η συνδιέγερση του BCR

με τον TLR7 αύξησε την έκφραση της p-ERK σε σχέση με την μονή διέγερση με Im

(fold=3,6).

Page 60: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

60

Εικόνα 27: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στο ΣΥ #4 για στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

Εικόνα 28: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση του ΣΥ #4

Page 61: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

61

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Page 62: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

62

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ παρουσιάζουν

εμπειρία αντιγόνου και αλληλεπιδρούν με το μικροπεριβάλλον μέσω των υποδοχέων

τους, με βασικότερο τον BCR, ο οποίος διεγείρεται τόσο από αυτοαντιγόνα όσο και

από εξωγενή αντιγόνα(46, 96).

Η διάκριση των ασθενών με ΧΛΛ που γίνεται με βάση την κατάσταση μεταλλάξεων

των γονίδιων IGHV (Α-ΧΛΛ και Μ-ΧΛΛ) έχει τόσο κλινική όσο και λειτουργική

σημασία. Μολονότι και οι δύο ομάδες γενικά παρουσιάζουν μειωμένη απόκριση στη

διέγερση μέσω του BCR(69-71), υπάρχουν ορισμένες διαφορές. Συγκεκριμένα, στην Α-

ΧΛΛ παρατηρείται πολυαντιδραστικότητα και ενεργός σηματοδότηση μέσω του

BCR, ενώ στην Μ-ΧΛΛ η μεταβίβαση σημάτων μέσω του υποδοχέα είναι μειωμένη(72,

73, 97). Φαίνεται πως η ικανότητα σηματοδότησης μέσω του BCR έχει κλινική σημασία,

καθότι η Μ-ΧΛΛ σχετίζεται με ήπια κλινική πορεία, ενώ η Α-ΧΛΛ με επιθετική πορεία.

Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της ΧΛΛ είναι η κατάταξη των ασθενών σε υποσύνολα

με βάση την έκφραση στερεότυπων BCR. Οι ασθενείς που ανήκουν σε ένα ορισμένο

στερεότυπο υποσύνολο χαρακτηρίζονται από ταυτόσημους BCR και ιδιαίτερη

κλινική πορεία που συχνά είναι ανεξάρτητη από το status μεταλλάξεων των γονιδίων

IGHV(67). Σχεδόν το 30% των περιπτώσεων της ΧΛΛ ανήκει σε κάποιο στερεότυπο

υποσύνολο(64), καθιστώντας τις μελέτες σχετικά με τη στερεοτυπία σημαντικές πηγές

πληροφοριών για την ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου.

Δύο από τα πιο σημαντικά στερεότυπα υποσύνολα είναι το #1 που εκφράζει

αμετάλλακτους IGHV1/5/7-IGKV1(D)-39 BCRs και το #4 που εκφράζει

μεταλλαγμένους IGHV4-34/IGKV2-30 BCRs ισοτύπου IgG. Τα δύο αυτά στερεότυπα

υποσύνολα θεωρούνται πρότυπα κακής και καλής πρόγνωσης, αντιστοίχως(67).

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύτταρα της ΧΛΛ μέσω των BCR τους

αναγνωρίζουν κοινά παθογόνα, τα οποία αναγνωρίζονται επίσης και από τους

υποδοχείς TLR(81-84). Οι TLR συνδέουν την έμφυτη με τη προσαρμοστική ανοσία,

καθώς η ενεργοποίηση τους αποτελεί το τρίτο σήμα για την ενεργοποίηση των

ανώριμων Β λεμφοκυττάρων επικουρικά στην ειδική σύνδεση του αντιγόνου με τον

BCR (πρώτο σήμα) και την αλληλεπίδραση του με τα Τ λεμφοκύτταρα (δεύτερο

σήμα). Οι TLR φαίνεται να λειτουργούν καθοδικά του BCR, καθώς η ενεργοποίηση

του BCR οδηγεί σε ραγδαία επαγωγή ορισμένων TLR. Γνωρίζουμε ότι η διέγερση του

Page 63: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

63

BCR των TLR ενεργοποιεί διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία

συναντώνται στο επίπεδο των MAP κινασών και του NF-κB, αλλά ακόμη ο

αντίκτυπος της συνδιέγερσης αυτής των υποδοχέων αυτών στα Β λεμφοκύτταρα δεν

έχει μελετηθεί εκτενώς.

Οι TLR εκφράζονται στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ, με προφίλ έκφρασης παρόμοιο

με το αντίστοιχο των Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Επιπλέον, είναι λειτουργικοί καθώς

επάγουν την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων και, κατά περίπτωση,

πολλαπλασιασμό ή απόπτωση. Έχουν παρατηρηθεί διαφορετικά πρότυπα έκφρασης

των TLR ανάλογα με την κατάσταση μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV ενός ασθενούς

ή με βάση το στερεότυπο υποσύνολο στο οποίο ανήκει, αλλά τα αποτελέσματα

διαφορετικών μελετών παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια(81-83, 86-95).

Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε πιθανές διαφορές στην

ενδοκυττάρια σηματοδότηση μετά από διέγερση του BCR, επιλεγμένων TLR καθώς

και συνδιέγερσή τους σε καλά χαρακτηρισμένες ομάδες ασθενών. Συγκεκριμένα,

μελετήσαμε τα αποτελέσματα της διέγερσης του BCR και των TLR1/2, TLR7 και

TLR9 καθώς και την επίδραση διπλών σημάτων (μέσω BCR και TLR) σε σχέση με τα

σήματα που προέρχονται από έναν μόνο υποδοχέα. Εξετάσαμε την ενεργοποίηση της

σηματοδοτικής οδού των MAP κινασών σε 28 περιπτώσεις ασθενών με ΧΛΛ: 14 Μ-

ΧΛΛ από τους οποίους οι 4 ανήκουν στο ΣΥ #4 και 14 Α-ΧΛΛ από τους οποίους οι 4

ανήκουν στο ΣΥ #1. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία αντί-IgM, Im,

CpG και PAM μεμονωμένα, αλλά και μετά από διπλή διέγερση με αντί-IgM + Im, αντί-

IgM + CpG ή αντί-IgM + PAM. Στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών

αναλύθηκε η ενεργοποίηση της κινάσης ERK μέσω ανοσοανίχνευσης Western.

Α-ΧΛΛ ΕΝΑΝΤΙ Μ-ΧΛΛ

Σύμφωνα με μια πρόσφατη μελέτη, η ERK είναι συνεχώς φωσφορυλιωμένη σε

περιπτώσεις στις οποίες δεν υπάρχει ανταπόκριση μετά από διέγερση του BCR, ιδίως

στην Μ-ΧΛΛ. Οι περιπτώσεις αυτές χαρακτηρίζονται επιπλέον από συνεχή

ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-ATc1 και ανενεργό Akt(79),

χαρακτηριστικά που συσχετίζονται με την ανεργία Β λεμφοκυττάρων στα

ποντίκια(77). Έτσι ενισχύεται η άποψη ότι τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ που φέρουν

αυτά τα χαρακτηριστικά έχουν καταστεί ανεργικά μετά από παρατεταμένη έκθεση

Page 64: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

64

σε αυτό-αντιγόνα. Στην παρούσα μελέτη δεν επιβεβαιώθηκε το συγκεκριμένο

αποτέλεσμα, αφού παρατηρήθηκε υψηλότερη έκφραση φωσφορυλιωμένης ERK στα

αδιέγερτα κύτταρα της Α-ΧΛΛ.

Μετά από διέγερση μέσω του BCR με αντί-IgM επί 15 λεπτά παρατηρήθηκε αυξημένη

φωσφορυλίωση της ERK στη Μ-ΧΛΛ, ενώ στην παρατεταμένη έκθεση των 50 λεπτών

δεν παρατηρήθηκε διέγερση. Αντίθετα αποτελέσματα παρουσίασε η Α-ΧΛΛ, όπου τα

επίπεδα της p-ERK δε διέφεραν ιδιαίτερα από το control στα 15 λεπτά, άλλα

αυξάνονταν στα 50 λεπτά. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα κύτταρα της Μ-

ΧΛΛ έχουν γρηγορότερη απόκριση μετά από διέγερση μέσω του BCR, άλλα το σήμα

είναι παροδικό, ενώ στα κύτταρα της Α-ΧΛΛ το σήμα έχει μεγαλύτερη διάρκεια.

Η διέγερση μέσω των TLR7 και TLR9 στα 50 λεπτά, οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων

της p-ΕΡΚ στην Α-ΧΛΛ ενώ στη Μ-ΧΛΛ δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά σε σχέση

με τα αδιέγερτα κύτταρα. Επομένως, διέγερση που πραγματοποιείται μόνο μέσω

αυτών των υποδοχέων έχει θετικό αποτέλεσμα μόνο στην Α-ΧΛΛ.

Στη Μ-ΧΛΛ η συνδιέγερση του BCR/TLR7 και BCR/TLR9 κατάφερε να αυξήσει την

έκφραση της p-ERK σε σχέση με το αδιέγερτο control, κατά το αναμενόμενο. Επίσης,

μετά τη διπλή διέγερση τα επίπεδα της p-ΕΡΚ αυξήθηκαν περισσότερο σε σχέση με

τις μεμονωμένες διεγέρσεις μέσω των BCR, TLR7 και TLR9, με μεγαλύτερο αντίκτυπο

να έχει η συνδιέγερση του BCR με τον TLR9. Στην Α-ΧΛΛ τα επίπεδα της p-ERK

αυξήθηκαν μόνο σε σχέση με τα αδιέγερτα κύτταρα και δεν παρουσίασαν διαφορά ή

παρουσίασαν μείωση σε σχέση με της μονές διεγέρσεις. Συνεπώς, φαίνεται πως στην

Μ-ΧΛΛ για να ενεργοποιηθεί η ERK απαιτείται συνδιέγερση του BCR με τους TLR, ενώ

στην Α-ΧΛΛ οι μεμονωμένες διεγέρσεις έχουν καλύτερα αποτελέσματα.

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΑ ΥΠΟΣΥΝΟΛΑ #1 ΕΝΑΝΤΙ #4

Μετά από διέγερση μέσω του BCR επί 15 λεπτά παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων

της p-ERK σε σχέση με το αδιέγερτο control στο ΣΥ #4 και καμία διαφορά στο ΣΥ #1,

ενώ μετά την παρατεταμένη διέγερση των 50 λεπτών αυξήθηκε η φωσφορυλίωση

της ERK και στα δύο υποσύνολα. Αυτό δείχνει πως η απόκριση των κυττάρων στη

διέγερση του BCR είναι αργή αλλά το σήμα έχει μεγαλύτερη διάρκεια. Στο ΣΥ #4, η

μεγάλη διαφορά στα επίπεδα της p-ERK ανάμεσα στα 15 και 50 λεπτά πιθανόν

οφείλεται στο γεγονός ότι υπό κανονικές συνθήκες τα κύτταρα είναι ανεργικά και

Page 65: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

65

επομένως χρειάζεται κάποιος χρόνος ώστε να αποκατασταθεί η δυνατότητα

σηματοδότησης μέσω του BCR.

Τα δύο υποσύνολα είχαν παρόμοιες αποκρίσεις και στη διέγερση μέσω των TLR1/2,

TLR7 και TLR9 με PAM, Im και CpG, αντιστοίχως, η οποία οδήγησε σε αύξηση των

επιπέδων της p-ERK στο στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε όλες τις περιπτώσεις. Και

στα δύο υποσύνολα, μεγαλύτερη αύξηση επέφερε η διέγερση μέσω των TLR1/2.

Μετά από τις διπλές διεγέρσεις του BCR με τους TLR παρατηρήθηκε αύξηση της

φωσφορυλίωσης της ERK σε σχέση με το αδιέγερτο control και στα δύο υποσύνολα,

αλλά μείωση σε σχέση με τις μεμονωμένες διεγέρσεις των υποδοχέων. Γενικότερα,

στα ΣΥ #1 και #4 φαίνεται πως οι διεγέρσεις μέσω ενός μόνο υποδοχέα αυξάνουν την

έκφραση της p-ERK περισσότερο σε σχέση με τις διπλές διεγέρσεις.

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #1 ΕΝΑΝΤΙ Α-ΧΛΛ

Η διέγερση του BCR με αντί-IgM είχε το ίδιο αποτέλεσμα τόσο στην Α-ΧΛΛ όσο και

στο ΣΥ #1, με τη φωσφορυλίωση της ERK να μην παρουσιάζει διαφορά από τα

αδιέγερτα κύτταρα στα 15 λεπτά, αλλά να αυξάνεται στα 50 λεπτά.

Η διέγερση μέσω των TLR7 και TLR9 αύξησε τα επίπεδα της p-ERK τόσο στην Α-ΧΛΛ

όσο και στο ΣΥ #1, με τη διέγερση μέσω του TLR9 να επιφέρει τη μεγαλύτερη αύξηση

και στις δύο περιπτώσεις. Ομοιότητες ανάμεσα στις δύο ομάδες παρατηρήθηκαν και

στις συνδιεγέρσεις του BCR με τους TLR7 και TLR9, καθώς τόσο στην Α-ΧΛΛ και στο

ΣΥ #1 η p-ERK αυξήθηκε μόνο συγκριτικά με το αδιέγερτο control, αλλά ήταν

μειωμένη ή σταθερή σε σχέση με όλες τις μονές διεγέρσεις των υποδοχέων. Συνεπώς,

τουλάχιστον στη συγκεκριμένη μελέτη, όλοι οι ασθενείς που φέρουν αμετάλλακτα

γονίδια, είτε ανήκουν στο ΣΥ #1 είτε στο γενικό σύνολο της Α-ΧΛΛ, ανταποκρίνονται

καλύτερα στις διεγέρσεις μέσω ενός μεμονωμένου υποδοχέα, με τη μεγαλύτερη

αύξηση στα επίπεδα της p-ERK να παρατηρείται μετά από διέγερση μέσω του TLR9.

ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #4 ΕΝΑΝΤΙ Μ-ΧΛΛ

Συγκρίνοντας τη φωσφορυλίωση της ERK μετά από διέγερση μέσω του BCR σε σχέση

με το αδιέγερτο control στην περίπτωση της Μ-ΧΛΛ παρατηρήθηκε αύξηση στα 15

Page 66: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

66

λεπτά και μείωση στα 50 λεπτά, ενώ στο ΣΥ #4 ακριβώς το αντίθετο, γεγονός που

δείχνει ότι οι ασθενείς που ανήκουν στη Μ-ΧΛΛ δε φέρουν όλοι ανεργικούς BCR.

Οι διεγέρσεις των TLR7 και TLR9 οδήγησαν σε αύξηση της p-ERK μόνο στο ΣΥ #4,

ενώ στην Μ-ΧΛΛ δεν είχαν κάποιο αντίκτυπο. Στη Μ-ΧΛΛ, μετά τις διπλές διεγέρσεις

του BCR και των TLR7 και TLR9 αυξήθηκε η φωσφορυλίωση της ERK σε σχέση με τα

αδιέγερτα κύτταρα ή τις μεμονωμένες διεγέρσεις. Αντίθετα, στο ΣΥ #4 η p-ERK ήταν

μειωμένη ή σταθερή σε σχέση με τις μονές διεγέρσεις των υποδοχέων και αύξηση της

παρατηρήθηκε μόνο σε σχέση με το control. Το συμπέρασμα που προκύπτει από

αυτές τις παρατηρήσεις είναι ότι η p-ERK έχει διαφορετικά προφίλ λειτουργικότητας

στους μεταλλαγμένους ασθενείς του ΣΥ #4 έναντι των ασθενών της γενικότερης

κατηγορίας της Μ-ΧΛΛ.

Page 67: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

67

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Page 68: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

68

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1 Kindt, T.J., et al., Kuby immunology. 6th ed. 2007, New York: W.H. Freeman. xxii,

574, I-27 p.

2 Medzhitov, R. and C.A. Janeway, Jr., Innate immunity: the virtues of a nonclonal

system of recognition. Cell, 1997. 91(3): p. 295-8.

3 Kawai, T. and S. Akira, TLR signaling. Semin Immunol, 2007. 19(1): p. 24-32.

4 Kawai, T. and S. Akira, TLR signaling. Cell Death Differ, 2006. 13(5): p. 816-25.

5 Kawai, T. and S. Akira, Pathogen recognition with Toll-like receptors. Curr Opin

Immunol, 2005. 17(4): p. 338-44.

6 Akira, S. and K. Takeda, Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol, 2004. 4(7):

p. 499-511.

7 Bauer, S., G. Hartmann, and S. Akira, Toll-like receptors (TLRs) and innate

immunity. Handbook of experimental pharmacology. 2008, Berlin: Springer. xi,

240 p.

8 Owen, J.A., et al., Kuby immunology. 7th ed. 2013, New York: W.H. Freeman. xxvii,

692, 109 p.

9 McGettrick, A.F. and L.A. O'Neill, Toll-like receptors: key activators of leucocytes and

regulator of haematopoiesis. Br J Haematol, 2007. 139(2): p. 185-93.

10 Takeuchi, O. and S. Akira, Toll-like receptors; their physiological role and signal

transduction system. Int Immunopharmacol, 2001. 1(4): p. 625-35.

11 Lund, J.M., et al., Recognition of single-stranded RNA viruses by Toll-like receptor 7.

Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(15): p. 5598-603.

12 Nagai, Y., et al., Essential role of MD-2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution.

Nat Immunol, 2002. 3(7): p. 667-72.

13 Takeuchi, O., et al., Cutting edge: preferentially the R-stereoisomer of the

mycoplasmal lipopeptide macrophage-activating lipopeptide-2 activates immune

cells through a toll-like receptor 2- and MyD88-dependent signaling pathway. J

Immunol, 2000. 164(2): p. 554-7.

14 Takeuchi, O., et al., Discrimination of bacterial lipoproteins by Toll-like receptor 6.

Int Immunol, 2001. 13(7): p. 933-40.

15 Takeuchi, O., et al., Cutting edge: role of Toll-like receptor 1 in mediating immune

response to microbial lipoproteins. J Immunol, 2002. 169(1): p. 10-4.

16 Hayashi, F., et al., The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by

Toll-like receptor 5. Nature, 2001. 410(6832): p. 1099-103.

17 O'Neill, L.A.J. and E. Brint, Toll-like receptors in inflammation. Progress in

inflammation research. 2005, Basel ; Boston: Birkhauser Verlag. xii, 244 p.

18 Hasan, U., et al., Human TLR10 is a functional receptor, expressed by B cells and

plasmacytoid dendritic cells, which activates gene transcription through MyD88. J

Immunol, 2005. 174(5): p. 2942-50.

19 Abbas, A.K., A.H. Lichtman, and S. Pillai, Cellular and molecular immunology. 7th

ed. 2012, Philadelphia: Elsevier/Saunders. x, 545 p.

20 Pandey, S. and D.K. Agrawal, Immunobiology of Toll-like receptors: emerging

trends. Immunol Cell Biol, 2006. 84(4): p. 333-41.

21 Yu, L. and S. Chen, Toll-like receptors expressed in tumor cells: targets for therapy.

Cancer Immunol Immunother, 2008. 57(9): p. 1271-8.

Page 69: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

69

22 Konat, G.W., Signaling by toll-like receptors. Methods in signal transduction series.

2008, Boca Raton: CRC Press. xxi, 195 p., 2 p. of plates.

23 Takeda, K. and S. Akira, Microbial recognition by Toll-like receptors. J Dermatol Sci,

2004. 34(2): p. 73-82.

24 Takeda, K. and S. Akira, TLR signaling pathways. Semin Immunol, 2004. 16(1): p.

3-9.

25 Kumar, H., T. Kawai, and S. Akira, Toll-like receptors and innate immunity. Biochem

Biophys Res Commun, 2009. 388(4): p. 621-5.

26 Coban, C., K.J. Ishii, and S. Akira, Immune interventions of human diseases through

toll-like receptors. Adv Exp Med Biol, 2009. 655: p. 63-80.

27 Li, Q., M.S. Valerio, and K.L. Kirkwood, MAPK usage in periodontal disease

progression. J Signal Transduct, 2012. 2012: p. 308943.

28 Kawai, T. and S. Akira, The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:

update on Toll-like receptors. Nat Immunol, 2010. 11(5): p. 373-84.

29 Yamamoto, M., K. Takeda, and S. Akira, TIR domain-containing adaptors define the

specificity of TLR signaling. Mol Immunol, 2004. 40(12): p. 861-8.

30 Patel, H., et al., Toll-like receptors in ischaemia and its potential role in the

pathophysiology of muscle damage in critical limb ischaemia. Cardiol Res Pract,

2012. 2012: p. 121237.

31 Matthias, P. and A.G. Rolink, Transcriptional networks in developing and mature B

cells. Nat Rev Immunol, 2005. 5(6): p. 497-508.

32 LeBien, T.W. and T.F. Tedder, B lymphocytes: how they develop and function. Blood,

2008. 112(5): p. 1570-80.

33 Parham, P. and C. Janeway, The immune system. 3rd ed. 2009, London ; New York:

Garland Science.

34 Klein, U. and R. Dalla-Favera, Germinal centres: role in B-cell physiology and

malignancy. Nat Rev Immunol, 2008. 8(1): p. 22-33.

35 Delves, P.J. and I.M. Roitt, Roitt's essential immunology. 12th ed. Essentials. 2011,

Chichester, West Sussex ; Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell. xiii, 546 p.

36 Kurosaki, T., H. Shinohara, and Y. Baba, B cell signaling and fate decision. Annu Rev

Immunol, 2010. 28: p. 21-55.

37 Bernasconi, N.L., N. Onai, and A. Lanzavecchia, A role for Toll-like receptors in

acquired immunity: up-regulation of TLR9 by BCR triggering in naive B cells and

constitutive expression in memory B cells. Blood, 2003. 101(11): p. 4500-4.

38 Fillatreau, S. and R.A. Manz, Tolls for B cells. Eur J Immunol, 2006. 36(4): p. 798-

801.

39 Browne, E.P., Regulation of B-cell responses by Toll-like receptors. Immunology,

2012. 136(4): p. 370-9.

40 Hua, Z. and B. Hou, TLR signaling in B-cell development and activation. Cell Mol

Immunol, 2013. 10(2): p. 103-6.

41 Watson, L., P. Wyld, and D. Catovsky, Disease burden of chronic lymphocytic

leukaemia within the European Union. Eur J Haematol, 2008. 81(4): p. 253-8.

42 Matutes, E., et al., The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a

scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia, 1994. 8(10): p. 1640-5.

43 Chiorazzi, N., K.R. Rai, and M. Ferrarini, Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J

Med, 2005. 352(8): p. 804-15.

Page 70: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

70

44 Ghia, P. and F. Caligaris-Cappio, The origin of B-cell chronic lymphocytic leukemia.

Semin Oncol, 2006. 33(2): p. 150-6.

45 Caligaris-Cappio, F. and P. Ghia, The nature and origin of the B-chronic lymphocytic

leukemia cell: a tentative model. Hematol Oncol Clin North Am, 2004. 18(4): p. 849-

62, viii.

46 Stamatopoulos, K. and E. al., in EHA. 2010.

47 Ghia, P., N. Chiorazzi, and K. Stamatopoulos, Microenvironmental influences in

chronic lymphocytic leukaemia: the role of antigen stimulation. J Intern Med, 2008.

264(6): p. 549-62.

48 Burger, J.A., Nurture versus nature: the microenvironment in chronic lymphocytic

leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2011. 2011: p. 96-103.

49 Damle, R.N., et al., Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel

prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1999. 94(6): p. 1840-

7.

50 Hamblin, T.J., et al., Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive

form of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1999. 94(6): p. 1848-54.

51 Krober, A., et al., V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations,

and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 2002. 100(4): p. 1410-6.

52 Damle, R.N., et al., B-cell chronic lymphocytic leukemia cells express a surface

membrane phenotype of activated, antigen-experienced B lymphocytes. Blood,

2002. 99(11): p. 4087-93.

53 Klein, U., et al., Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia

reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. J Exp Med, 2001.

194(11): p. 1625-38.

54 Rosenwald, A., et al., Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin

mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med, 2001.

194(11): p. 1639-47.

55 Moreno, C. and E. Montserrat, New prognostic markers in chronic lymphocytic

leukemia. Blood Rev, 2008. 22(4): p. 211-9.

56 Rassenti, L.Z., et al., Relative value of ZAP-70, CD38, and immunoglobulin mutation

status in predicting aggressive disease in chronic lymphocytic leukemia. Blood,

2008. 112(5): p. 1923-30.

57 Malavasi, F., et al., CD38 and chronic lymphocytic leukemia: a decade later. Blood,

2011. 118(13): p. 3470-8.

58 Chiorazzi, N., Implications of new prognostic markers in chronic lymphocytic

leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2012. 2012: p. 76-87.

59 Boonstra, J.G., et al., CD38 as a prognostic factor in B cell chronic lymphocytic

leukaemia (B-CLL): comparison of three approaches to analyze its expression.

Cytometry B Clin Cytom, 2006. 70(3): p. 136-41.

60 Tobin, G., et al., Somatically mutated Ig V(H)3-21 genes characterize a new subset

of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 2002. 99(6): p. 2262-4.

61 Tobin, G., et al., Chronic lymphocytic leukemias utilizing the VH3-21 gene display

highly restricted Vlambda2-14 gene use and homologous CDR3s: implicating

recognition of a common antigen epitope. Blood, 2003. 101(12): p. 4952-7.

62 Messmer, B.T., et al., Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate

a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med, 2004.

200(4): p. 519-25.

Page 71: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

71

63 Murray, F., et al., Stereotyped patterns of somatic hypermutation in subsets of

patients with chronic lymphocytic leukemia: implications for the role of antigen

selection in leukemogenesis. Blood, 2008. 111(3): p. 1524-33.

64 Stamatopoulos, K., et al., Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia

carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations.

Blood, 2007. 109(1): p. 259-70.

65 Darzentas, N., et al., A different ontogenesis for chronic lymphocytic leukemia cases

carrying stereotyped antigen receptors: molecular and computational evidence.

Leukemia, 2010. 24(1): p. 125-32.

66 Agathangelidis, A., et al., Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic

lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted

therapies. Blood, 2012. 119(19): p. 4467-75.

67 Malek, S., Advances in chronic lymphocytic leukemia. Advances in experimental

medicine and biology,. xi, 334 pages.

68 Bomben, R., et al., Molecular and clinical features of chronic lymphocytic leukaemia

with stereotyped B cell receptors: results from an Italian multicentre study. Br J

Haematol, 2009. 144(4): p. 492-506.

69 Hivroz, C., et al., Heterogeneity of responsiveness of chronic lymphocytic leukemic B

cells to B cell growth factor or interleukin 2. Eur J Immunol, 1986. 16(8): p. 1001-

4.

70 Lankester, A.C., et al., Antigen receptor nonresponsiveness in chronic lymphocytic

leukemia B cells. Blood, 1995. 86(3): p. 1090-7.

71 Kipps, T.J., Signal transduction pathways and mechanisms of apoptosis in CLL B-

lymphocytes: their role in CLL pathogenesis. Hematol Cell Ther, 1997. 39 Suppl 1:

p. S17-27.

72 Kipps, T.J., The B-cell receptor and ZAP-70 in chronic lymphocytic leukemia. Best

Pract Res Clin Haematol, 2007. 20(3): p. 415-24.

73 Lanham, S., et al., Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene

mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood,

2003. 101(3): p. 1087-93.

74 Efremov, D.G., S. Gobessi, and P.G. Longo, Signaling pathways activated by antigen-

receptor engagement in chronic lymphocytic leukemia B-cells. Autoimmun Rev,

2007. 7(2): p. 102-8.

75 Stevenson, F.K., et al., B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia.

Blood, 2011. 118(16): p. 4313-20.

76 Petlickovski, A., et al., Sustained signaling through the B-cell receptor induces Mcl-

1 and promotes survival of chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood, 2005.

105(12): p. 4820-7.

77 Merrell, K.T., et al., Identification of anergic B cells within a wild-type repertoire.

Immunity, 2006. 25(6): p. 953-62.

78 Healy, J.I., et al., Different nuclear signals are activated by the B cell receptor during

positive versus negative signaling. Immunity, 1997. 6(4): p. 419-28.

79 Muzio, M., et al., Constitutive activation of distinct BCR-signaling pathways in a

subset of CLL patients: a molecular signature of anergy. Blood, 2008. 112(1): p.

188-95.

80 Apollonio, B., et al., Targeting B-cell anergy in chronic lymphocytic leukemia. Blood,

2013. 121(19): p. 3879-88, S1-8.

Page 72: Thesis - Immune Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia

72

81 Arvaniti, E., et al., Toll-like receptor signaling pathway in chronic lymphocytic

leukemia: distinct gene expression profiles of potential pathogenic significance in

specific subsets of patients. Haematologica, 2011. 96(11): p. 1644-52.

82 Ntoufa, S., et al., Distinct innate immunity pathways to activation and tolerance in

subgroups of chronic lymphocytic leukemia with distinct immunoglobulin receptors.

Mol Med, 2012. 18: p. 1281-91.

83 Grandjenette, C., et al., Expression of functional toll-like receptors by B-chronic

lymphocytic leukemia cells. Haematologica, 2007. 92(9): p. 1279-81.

84 Muzio, M., et al., Expression and function of toll like receptors in chronic lymphocytic

leukaemia cells. Br J Haematol, 2009. 144(4): p. 507-16.

85 Pasare, C. and R. Medzhitov, Toll-like receptors: linking innate and adaptive

immunity. Microbes Infect, 2004. 6(15): p. 1382-7.

86 Lanzavecchia, A. and F. Sallusto, Toll-like receptors and innate immunity in B-cell

activation and antibody responses. Curr Opin Immunol, 2007. 19(3): p. 268-74.

87 Decker, T., et al., Immunostimulatory CpG-oligonucleotides cause proliferation,

cytokine production, and an immunogenic phenotype in chronic lymphocytic

leukemia B cells. Blood, 2000. 95(3): p. 999-1006.

88 Jahrsdorfer, B., et al., CpG DNA increases primary malignant B cell expression of

costimulatory molecules and target antigens. J Leukoc Biol, 2001. 69(1): p. 81-8.

89 Rozkova, D., et al., Toll-like receptors on B-CLL cells: expression and functional

consequences of their stimulation. Int J Cancer, 2010. 126(5): p. 1132-43.

90 Liang, X., et al., Toll-like receptor 9 signaling by CpG-B oligodeoxynucleotides

induces an apoptotic pathway in human chronic lymphocytic leukemia B cells.

Blood, 2010. 115(24): p. 5041-52.

91 Jahrsdorfer, B., et al., Modulation of malignant B cell activation and apoptosis by

bcl-2 antisense ODN and immunostimulatory CpG ODN. J Leukoc Biol, 2002. 72(1):

p. 83-92.

92 Longo, P.G., et al., The Akt signaling pathway determines the different proliferative

capacity of chronic lymphocytic leukemia B-cells from patients with progressive and

stable disease. Leukemia, 2007. 21(1): p. 110-20.

93 Hammadi, A., et al., Stimulation of iNOS expression and apoptosis resistance in B-

cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells through engagement of Toll-like

receptor 7 (TLR-7) and NF-kappaB activation. Nitric Oxide, 2008. 19(2): p. 138-45.

94 Spaner, D.E., et al., Immunomodulatory effects of Toll-like receptor-7 activation on

chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia, 2006. 20(2): p. 286-95.

95 Tomic, J., et al., Sensitization of IL-2 signaling through TLR-7 enhances B lymphoma

cell immunogenicity. J Immunol, 2006. 176(6): p. 3830-9.

96 Bannerji, R. and J.C. Byrd, Update on the biology of chronic lymphocytic leukemia.

Curr Opin Oncol, 2000. 12(1): p. 22-9.

97 Stevenson, F.K. and F. Caligaris-Cappio, Chronic lymphocytic leukemia: revelations

from the B-cell receptor. Blood, 2004. 103(12): p. 4389-95.