UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTOS EN CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

Tesis de Licenciatura

“Efecto in vitro del β-caroteno natural obtenido a partir de

Dunaliella salina (Chlorophyta) sobre la línea celular de cáncer

MDA-MB-231”

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL

Título de Biólogo Marino

PRESENTA:

Ilhui Rocío Gómez Pacheco

DIRECTOR:

Jorge Olmos Soto

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, AGOSTO DE 2013

Dedicatoria

A

Mi mamá

Que nunca deja de sorprenderme con lo maravillosa que es.

Abuelita Lupita

Que siempre cuido y amó a todos. Te llevo siempre conmigo.

Mi abuela Toña,

El amor de mis amores. Gracias por estar siempre a mi lado.

Javier y Andrés,

El regalo más bonito que tuve por mis padres. Los adoro.

A mi tía Laura Lilían,

Porque las batallas más grandes, solo se pueden ganar con amor a la vida.

A mis tías María Elena e Ilhui,

Por inspirarme siempre a seguir estudiando.

Mi papá,

Y mis abuelos Sergio y Carlos

Por todo su cariño.

Agradecimientos académicos Al Dr. Jorge Olmos Soto por la dirección de esta tesis y por el apoyo brindado;

pero sobre todo, por aceptarme y darme la oportunidad de aprender cosas

nuevas.

A la M.C. Rosalía Contreras Flores técnico del laboratorio, durante el cultivo de

Dunaliella salina y en toda mi estancia como estudiante del laboratorio. Gracias

nuevamente.

A la M.C. Silvia Viviana Pitones Rubios, por su enorme ayuda técnica y asesoría

durante la fase de cultivo celular, en la elaboración de los ensayos y por la

bibliografía compartida. Muchas gracias sin tu ayuda no podría haber realizado

esta tesis.

Al M.C. Eduardo Morales Guerrero por toda su asesoría y ayuda brindada al

realizar los análisis por HPLC.

Al M.C. Viktor Iván Rodríguez Abdalá, por su ayuda en el lenguaje de

programación R.

Al Dr. Jose Luis Ortiz Galindo y al Dr. Noé Díaz Viloria, por la extensa revisión de

la tesis. Mil gracias por todo.

Al comité revisor tesis: Dr. Sergio Flores Ramírez, M.C. Marco Antonio Medina

López, al Dr. Noé Díaz Viloria y al Dr. Carlos Sánchez Ortiz.

A Beti y al Dr. Alejandro Gómez por su ayuda en los trámites administrativos. A la

UABCS y al CICESE.

Agradecimientos personales

A mi mamá, por todo su amor y todo el tiempo que me ha dedicado desde el día

en que nací. Muchas gracias por estar siempre a mi lado, en las buenas y en las

malas, por regañarme siempre que lo necesité, Por enseñarme todo cuanto sé.

A Silvia Viviana Pitones, por tu amistad, tu tiempo, tu compañía y gran ayuda no

solo académica sino personal. Siempre estaré en deuda contigo, eres una persona

muy especial y valiosa. Gracias por todo.

A José Luis Ortiz Galindo, muchas gracias tío por todo el cariño, tiempo y apoyo,

que me has dado siempre, por ser parte de nuestra familia.

A mi tía María Elena Gómez Rojo, muchas gracias por todo tu cariño, apoyo y

ánimos. Te quiero mucho madrina.

A toda mi hermosa familia que siempre me ha apoyado desde lejos.

A las familias Norzagaray-Navarro y Silva-Cruz por ser como mi familia.

A Laura Camacho, muchas gracias por animarme a hacer la tesis en ensenada; y

por tu gran amistad. Te quiero mucho.

A Magaly Gómez, Malissa Fragoso, Angelina Lazcano, Betsabé Luna, Diana

Zaleta, Mirelle Dávila, Rocío González, Casandra Gálvez, Marcela Valdovinos,

Christian por su amistad.

A Iván Rodríguez, muchas gracias por estar a mi lado.

Índice

Lista de figuras i

Lista de cuadros iiI

Lista de anexos iii

Glosario iv

Resumen vi

1. Introducción 1

2. Antecedentes 2

2.1. Los carotenoides 2

2.2. Dunaliella salina 5

2.3. Desarrollo del cáncer 8

3. Justificación 12

4. Hipótesis 12

5. Objetivo general 13

5.1. Objetivos particulares 13

6. Materiales y Métodos 14

7. Resultados 20

7.1 Cultivo de Dunaliella salina 20

7.2 β-Caroteno 21

7.3 Curva de crecimiento 26

7.4 Ensayo de viabilidad celular con β-caroteno 26

8. Discusión 30

9. Conclusiones 34

10. Recomendaciones 35

11. Bibliografía 36

12. Anexos 41

i

Lista de figuras Figura 1 Molécula de β-caroteno. 5

Figura 2 Dunaliella salina. Contraste de fases con

fluorescencia, objetivo 100X.

5

Figura 3 Línea celular MDA-MB-231. Microscopio de

Contraste de fases, objetivo 10X.

10

Figura 4. Línea celuar HaCat. Microscopio de Contraste

de fases, objetivo de 10X.

11

Figura 5. Curva de crecimiento poblacional del cultivo de

Dunaliella salina hasta alcanzar la fase

estacionaria.

20

Figura 6 Cromatogramas obtenidos por HPLC a una

longitud de onda de 450 nm.

22

Figura 7 Cromatogramas sobrepuestos del estándar y el

extracto natural de D. salina.

23

Figura 8 Curva de calibración por HPLC para estimar la

concentración de β-caroteno en el extracto

natural.

25

Figura 9 Resultados del ensayo de viabilidad celular

realizado con β-caroteno sobre MDA-MB-231.

29

Figura 10 Resultados del ensayo de viabilidad celular

realizado con β-caroteno sobre HaCat.

29

Figura 11 Variación dentro del tratamiento de 2h con β-

caroteno en la línea celular MDA-MB-231

51

Figura 12 Variación dentro de grupos con el tratamiento

de 2h con β-caroteno.

52

ii

List

a de cuadros

Figura 13 Variación dentro del tratamiento de 24h con β-

caroteno en la línea celular MDA-MB-231.

54

Figura 14 Variación dentro del tratamiento de 24h con β-

caroteno en la línea celular MDA-MB-231:

1)Células con BS, 2) Células con BN.

54

Figura 15 Variación dentro del tratamiento de 24h con β-

caroteno en la línea celular HaCat: 1)Células

HaCat con BS, 2)Células HaCat con BN.

55

Figura 16 Variación entre grupos con el tratamiento de

24h con β-caroteno. Células MDA-MB-231 con

BS, 2) Células MDA-MB-231 con BN, 3)Células

HaCat con BS, 4) Células HaCat con BN.

56

iii

Lista de cuadros

Cuadro I Incrementos en la concentración de NaCl

realizados en el cultivo L.

15

Cuadro II Esquema general del ensayo con β-caroteno. 18

Cuadro III Mediciones de absorbancia obtenidas en el

cromatógrafo HPLC al analizar el estándar

sintético de trans β-caroteno y el extracto

natural de D. salina.

24

Lista de Anexos Anexo I Cultivo de D. salina. 41

Anexo II Soluciones y medios empleados para el cultivo

de las líneas celulares.

46

Anexo III Ensayo con β-caroteno. 48

Anexo IV Ensayo colorimétrico de MTT. 50

Anexo V Resultados del ANOVA realizado con el

programa R.

51

iv

Glosario

Adenocarcinoma: Cáncer que empieza en las células glandulares. Las células

glandulares se encuentran en el tejido que reviste algunos órganos internos y que

producen y liberan sustancias en el cuerpo. La mayoría de los cánceres de mama,

páncreas, pulmón, próstata y colon son adenocarcinomas (INC, 2013).

Antioxidante: Es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación (pérdida

de electrones) de otra molécula, sin llegar a perder su estabilidad (Holum, 1999).

Pro-oxidante: Es una molécula capaz de reducir a otra molécula (Holum, 1999).

Medio suplementado: Medio que ha sido complementado o enriquecido con suero

fetal bovino; y que por ello cuenta con los nutrientes, cofactores y hormonas de

crecimiento necesarios para el mantenimiento de un cultivo celular (Pitones-Rubio

y Olmos-Soto, 2010).

Confluencia: La cantidad de células que crecen sobre la superficie de una caja o

placa de cultivo; esta generalmente se expresa en porcentajes (Langdon, 2004).

Cultivo primario: El cultivo iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados

directamente de un organismo (Langdon, 2004).

Pase: Consiste en tomar una fracción de células a partir de un cultivo establecido

para colocarlas en una nueva placa o caja que cuenta con el medio y los

nutrientes necesarios para poder iniciar un nuevo sub-cultivo celular (Langdon,

2004).

v

Línea celular continua: Son células de un tipo único (humano, animal o vegetal),

que han sido sub-cultivadas a partir de un cultivo primario del cual derivan. Estas

células tienen alteraciones genéticas que les dan la capacidad de proliferar

indefinidamente si se les brindan las condiciones ambientales y los nutrientes

esenciales para su mantenimiento (Langdon, 2004).

vi

Resumen

Dunaliella salina es una microalga Cholorophyta produce de forma natural grandes

cantidades de β-caroteno. En humanos se ha observado que esta molécula tiene

distintas funciones biológicas como estabilizador de membrana, antioxidante y

precursor de la vitamina A; además puede actuar como quimio-protector y

anticancerígeno. Por ello el objetivo de este trabajo fue demostrar si el β-caroteno

tiene un efecto in vitro sobre la supervivencia de la línea celular para cáncer de

mama MDA-MB-231. Para ello se realizó un ensayo en el que se aplicaron dos

tratamientos de 6 µg/µl de β-caroteno, cada uno con dos condiciones de

incubación con distintas duraciones de tiempo (2 y 24 horas). Los tratamientos

consistieron en un extracto natural obtenido a partir de D. salina y en trans β-

caroteno sintético. Ambos tratamientos disminuyeron significativamente la

supervivencia de las células de MDA-MB-231; sin embargo el efecto se vio

potenciado cuando se aplicó β-caroteno de origen natural. El mayor efecto se

observó con un tiempo de incubación de 2 horas, en el cual la supervivencia de las

células de MDA-MB-231 fue de un 27.9 %.

1

1 Introducción En los océanos del mundo habita una gran diversidad de microorganismos

conformada por bacterias, virus, hongos, protozoarios y algas. Estos

microorganismos producen en conjunto, un reservorio natural de sustancias bio-

activas, que son producto de su metabolismo primario y secundario. Estas

sustancias son muy novedosas, ya que tienen amplias aplicaciones en la industria

y en las ciencias de la salud (Ireland et al., 1993; Paniagua-Michel, 2009).

Entre estos microorganismos se encuentra Dunaliella salina, una microalga

Chlorophyta que es uno de los eukariotas más extremófilos que se conoce y que

bajo condiciones de estrés salino, alta irradianza y falta de nutrientes, produce

grandes cantidades de β-caroteno, para proteger la clorofila a y el DNA nuclear

(Ben-Amotz et al., 1987; Borowitzka, 1990; Olmos-Soto et al., 2002; Ben-Amotz et

al., 2009).

El β-caroteno es una molécula que presenta una fuerte actividad antioxidante,

capaz de captar y destruir los radicales producidos por la quimioterapia durante el

tratamiento del cáncer. Por esta razón, se le atribuye la propiedad de agente

quimio-preventivo y anticancerígeno (Bendich y Olson, 1989; Lamson y Brignall,

1999). A este caroteno, también se le ha atribuido la capacidad de detener el

proceso de metástasis en algunas clases de cáncer, como lo son: el de piel, boca

y pulmón (Venugopal, 2009). Sin embargo, en lo que concierne a la aparición de

este último tipo de cáncer, hay estudios que consideran que el consumo del β-

caroteno junto con el tabaco y el alcohol es un factor de riesgo (Leo y Lieber,

1999).

En México el tipo de cáncer más común en mujeres mayores de 20 años es el

carcinoma de mama (CaMa) (INEGI, 2013). Debido a lo anterior, en este trabajo

2

se busca probar si el β-caroteno producido por D. salina, al que ya se le han

atribuido actividades anticancerígenas (Borowitska, 1990; Ben-Amotz, 2009;

Venugopal, 2009); presenta un efecto in vitro sobre una línea celular de cáncer de

mama.

2 Antecedentes

2. 1 Los carotenoides

Los carotenoides son una familia de pigmentos de color amarillo- naranja o rojo

que proveen de un intenso color a muchas especies de organismos (Asker et al.,

2012). Estos pigmentos son los más ampliamente distribuidos en la naturaleza, ya

que se les encuentra en las plantas, las bacterias, las algas, los hongos y los

animales; sin importar si se trata de especies marinas, terrestres o de agua dulce

(Mínguez-Mosquera et al., 2008; Venugopal, 2009). Hasta la fecha se han

descubierto más de 700 carotenos distintos en la naturaleza (Asker et al., 2012),

entre ellos el β-caroteno.

2. 1. 1 Función biológica

En los organismos fotosintéticos los carotenoides sirven como pigmentos

accesorios, ayudando a absorber la luz y transfiriendo la energía a la clorofila

(Asker et al., 2012). Otra función de los carotenoides en organismos fototróficos y

no-fototróficos, es la de proteger a las células contra daños en el núcleo causados

por la producción de radicales libres, y que puedan originar mutaciones u otras

alteraciones genéticas (Bendich y Olson, 1989).

En los miembros del reino animal incluyendo a los humanos, vacas, aves, peces y

algunos crustáceos, los carotenoides no pueden ser sintetizados y tienen que ser

3

adquiridos en la dieta. Algunas de sus principales funciones son: Actuar como un

precursores de la Vitamina A en todas sus formas activas (retinol, retinal y ácido

retinoico) (Holum, 1999; Venugocopal, 2009; Asker et al., 2012), como

antioxidantes y pro-oxidantes (Krinsky, 1988; Bendich y Olson, 1989).

Además, en los seres humanos los carotenoides son constituyentes normales de

la sangre y algunos tejidos. Así, en el cuerpo de una persona bien nutrida la

cantidad total de carotenoides varía de 100-150 mg. De ese total el 1% está

presente en el suero sanguíneo, el 80-85% en el tejido adiposo, el 8-12% en el

hígado (8-12%) y el 2-3% en los músculos. Los carotenoides que se encuentran

en mayor cantidad en el suero humano son el β-caroteno, el α-caroteno, la

cryptoxantina, el licopeno y la luteína de los cuales el β-caroteno es el más

abundante (15 al 30%) (Bendich y Olson, 1989).

2. 1. 2 Uso de los carotenoides en la industria y ciencias de la salud

Los carotenoides se emplean en la elaboración de alimento para aves de corral,

para organismos cultivados por acuacultura y como colorante en la manufactura

de alimentos para humanos (Venugopal, 2009). También se emplean como

complemento nutricional y fuente de provitamina-A, de las cuales el β-caroteno

tiene la mayor actividad. También se les emplea como aditivo en cosméticos

(Holum, 1999).

En ciencias de la salud hay estudios que muestran que en humanos, los

carotenoides reducen los niveles de colesterol, homocisteína, agregación

plaquetaria y presión sanguínea, teniendo una función cardio-protectora debido a

su alta actividad antioxidante. Hay evidencia que indica, que también ayudan a

prevenir la aparición de úlceras gástricas, combatir enfermedades neuro-

degenetarivas, a la activación de las células T del sistema inmune, y que protegen

4

a las células-β de la presencia de radicales libres en pacientes con diabetes

mellitus (Holum, 1999; Herchberg, 2005; Mínguez-Mosquera et al., 2008;

Venugopal, 2009).

En relación al cáncer existen estudios epidemiológicos y oncológicos, en los que

se muestra que algunos carotenoides como la Aztaxantina, el Lycopeno y el β-

caroteno tienen una actividad anticancerígena, ya sea como agentes

quimiopreventivos contra el desarrollo del cáncer de piel, boca, pulmón y seno,

como inhibidores del proceso de metástasis en casos de cáncer de hígado

(Dimitrov et al., 1988; Mínguez-Mosquera et al., 2008; Emeish, 2012).

Además, se ha observado que la administración de β-caroteno de origen natural

potencia el efecto de la quimioterapia y la radioterapia, e incluso incrementa la

supervivencia en pacientes enfermos de cáncer (Lamson y Brignall, 1999).

2. 1.3 β-caroteno: Molécula y propiedades generales

El β-caroteno (C40H56) tiene un peso molecular de 536.9 umas y es uno de los

carotenoides más ampliamente distribuido en la naturaleza (Figura 1). Es un

hidrocarburo poli-insaturado compuesto por dos moléculas de retinol. Al tratarse

de una molécula lipofílica, es insoluble en soluciones acuosas a menos que

tengan cierto grado de polaridad, como los solventes orgánicos: acetona y

diclorometano (Venugopal, 2009).

La presencia de dobles enlaces conjugados en el β-caroteno hace que presente

isómeros geométricos cis y trans (E/Z), que pueden ínter-convertirse cuando se

encuentran en solución y que presentan sus enlaces dobles en distintas

posiciones. Estos cambios en la geometría afectan el punto de fusión, el color, la

solubilidad, la estabilidad y un poco sus propiedades ópticas de absorción de luz

5

(Venugopal, 2009). Así, aunque presentan un máximo de absorción a una longitud

de onda de 450 nm, esta es interferida por la presencia de sus anillos β y enlaces

dobles (Mínguez-Mosquera et al., 2008). Cuando la molécula del β-caroteno se

encuentra en solución con presencia de luz y oxígeno se oxida, puede polimerizar

y actuar agente quelante, además de formar isómeros (Venugopal, 2009).

Figura 1. Molécula de β-caroteno

2. 2 Dunaliella salina

2. 2. 1 Taxonomía

De acuerdo al ITIS (2003), la clasificación de la especie es la siguiente:

División Chlorophyta

Clase Chlorophyceae

Orden Volvocales

Family Dunaliellaceae

Género Dunaliella

Especie Dunaliella salina (Teodoresco, 1905).

6

Figura 2. Dunaliella salina. Contraste de fases con fluorescencia, objetivo

100X.

2. 2. 2 Características generales de la especie

D. salina es una microoalga verde unicelular que tiene una forma ovoide, dos

flagelos apicales y un color que varía de verde-amarillo a rojo profundo (Parra et

al., 1990). Esta microalga pertenece al género Dunaliella conformado por 27

especies, las cuales comparten las siguientes características: Carecen de una

pared celular rígida de polisacáridos, están rodeadas por una delgada membrana

plasmática cubierta por una capa mucilaginosa, tienen un solo cloroplasto,

pirenoide, un núcleo y nucléolo (Borowitzka, 1990; Wilcox y Graham, 2000; Ben-

Amotz et al., 2009). Sin embargo solo D. salina y Dunaliella bardawil poseen la

capacidad de acumular grandes cantidades de β-caroteno y glicerol en su interior,

cuando se encuentra en ambientes extremos hipersalinos y en los que hay una

intensa radiación solar (Olmos-Soto et al., 2012).

2. 2. 3 Estudios nutricionales con Dunaliella

Entre los antecedentes más importantes se encuentran los de Ben-Amotz y

colaboradores (1987) y Ben-Amotz y Avron (1992). En estos trabajos se encontró

que D. salina produce una combinación de isómeros: 15-cis-β-caroteno (10%), 9-

7

cis-β-caroteno (41%), trans β-caroteno (42%) y 2 isómeros sin identificar (7%).

Ben-Amotz y Levi (1996) realizaron un estudio in vivo con humanos y observaron

que la mezcla isomérica de β-caroteno producida por Dunaliella bardawil fue más

absorbida, con respecto a otras formas de β-caroteno trans de origen sintético que

fueron administradas. También descubrieron, que tuvo una actividad antioxidante

más potente.

Diversos investigadores (Borowitska, 1990; Venugopal, 2009), mencionaron a D.

salina como una fuente importante de β-caroteno y complemento nutricional para

humanos, por su fuerte actividad pro vitamina A, entre otros beneficios.

2. 2. 4 Estudios previos en el noroeste de México

Se han aislado e identificado bioquímicamente varias cepas locales pertenecientes

al género Dunaliella, entre ellas D. salina en lagunas hipersalinas costeras

ubicadas en los estados de Baja California (San Quintin, La Salina) y Baja

California Sur (Salina de Guerrero Negro) (Gutiérrez-Millán, 1996; Sánchez-

Castrejón, 1998).

En el 2004, Capa-Robles (2004) estudió la fisiología de la especie para inducir la

producción de β-caroteno con fines comerciales. Para ello, estudió el efecto de la

salinidad, así como la presencia o ausencia de vitaminas en condiciones no

estresantes de cultivo; además de que identificó la presencia de tres tipos de β-

caroteno: 1)trans-β-caroteno, 2)α-caroteno y 3)de tipo no trans.

Olmos y colaboradores (2002) identificaron molecularmente a la especie por

medio del método de intron-zising finger-printing, demostrando que las especies

de Dunaliella tiene un tamaño específico, de 18S ADNr (Olmos-Soto et al., 2012).

8

Contreras-Flores (2005) estudió la variabilidad intraespecie y en función a ella

evaluó la acumulación de β-caroteno bajo distintas condiciones de cultivo.

2. 3 Desarrollo del cáncer

Cáncer es el nombre general que se da a más de 100 enfermedades distintas pero

que presentan una característica: Todas se originan a partir de células anormales

o neoplásicas que proliferan de forma continua y descontrolada, formando masas

de tejido llamados tumores. Algunas de estas células adquieren la habilidad de

invadir nuevos tejidos y órganos causando la enfermedad del cáncer (INC, 2013).

La proliferación celular que da origen al cáncer es ocasionada por una alteración

de los eventos que comprenden el ciclo celular, y que dependen de los niveles

apropiados de la transcripción y traducción de ciertos genes, cuyas mutaciones o

fallas han sido estrechamente relacionadas con el desarrollo del cáncer. Estos

genes se dividen en dos clases: 1) Los proto-oncogenes, o genes cuyas proteínas

estimulan la división celular e inhiben la muerte celular programada o apoptosis; y

2) Los genes supresores de tumores, cuyas proteínas restringen el crecimiento

celular o conllevan a la apoptosis (Lodish et al., 2002). Las mutaciones en estos

genes son ocasionadas por diversos factores que dañan el ADN nuclear (Baba,

2007).

Los factores carcinógenos pueden ser de tipo físico, como la radiación UV-A y UV-

B, los rayos X, y rayos Gama; químico, debido a la presencia de epóxidos,

nitrosaminas, hidrocarburos aromáticos y minerales (As, Cr, Cd y Ni); biológico, lo

que incluye a sustancias liberadas por parásitos, plantas, o microorganismos, o

que se encuentran en alimentos y medicinas (Flavonoides, taninos, Ochratoxina A,

caspacianina); y genético (Baba, 2007). Los factores genéticos pueden tener

9

distintos orígenes como son: mutaciones heredas en ciertos genes (genes BRCA-

1 y BRCA-2), la acción de algunos tipos de virus (Papilomavirus, herpesvirus y

adenovirus), y la liberación de especies reactivas de Oxígeno (1O2 ) y otros

radicales libres (1OH, -NO) durante el metabolismo celular (Baba, 2007; Musolino

et al., 2007; Fiaschi y Chiaruggi, 2012).

El nombre que se le da a cada tipo de cáncer está determinado por el tipo de

tejido y órgano en el cual se origina. Así, existe cáncer de seno, piel, de hígado,

hueso y pulmón, entre muchos otros (INC, 2013).

2. 3. 1 Cáncer de mama

El cáncer de mama (CaMa) es causado cuando hay una proliferación acelerada,

desordenada y no controlada de las células de los tejidos de la glándula mamaria,

y es causado por mutaciones que ocurren en los genes que actúan normalmente

suprimiendo o estimulando la continuidad del ciclo celular (Rodríguez-Bandala,

2010).

De los tipos de cáncer que existen, el CaMa junto con el cáncer de próstata, son

de los más agresivos, ya que hacen metástasis en los huesos y la mayoría de los

pacientes mueren cuando esto sucede (Kowalski et al., 2003).

2. 3. 2. Incidencia del Cáncer de Mama en México

El cáncer es una enfermedad que en muchos casos va asociada a la edad y a la

senectud, por lo que desde el último siglo ha ido incrementándose junto con la

edad de las personas y está en continuo aumento; siendo el cáncer de mama uno

de los más comunes en el mundo (WCR, 2008). En México las cifras son

alarmantes, ya que desde 2010 el CaMa es el tipo de cáncer más común en

mujeres mayores de 20 años (24%) y actualmente es la segunda causa de muerte

10

natural en mujeres de 35 años y más (INEGI, 2013).

2. 4 Líneas celulares

MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26)

Esta línea celular fue aislada a partir de una paciente femenina de 51 años, de

origen caucásico, que presentaba un adenocarcinoma grado III de glándula de

mama; por lo que fueron elegidas como modelo para estudiar el efecto en ellas del

β-caroteno de origen natural. Estas células carecen de la capacidad de

diferenciarse, no forman tejidos, presentan un número cromosómico alterado (64-

69) y su forma es epitelial adherente (Cailleau et al., 1974).

Figura 3. Línea celular MDA-MB-231. Microscopio de Contraste de fases,

objetivo 10X

11

HaCat

Es una línea celular inmortal de queratinocitos humanos (QHA), cuyas células

conservan la capacidad de diferenciarse y crecer de forma semejante al tejido de

la piel humana (NHEQ) (Lehman, 1997). Debido a sus características las células

de esta línea fueron empleadas como modelo, para ver el efecto del β-caroteno en

células normales.

Figura 4. Línea celuar HaCat. Microscopio de Contraste de fases, objetivo de

10X.

12

3 Justificación Muchos de los tratamientos contra el cáncer en general y no solo de mama, son

altamente invasivos y poseen muchos efectos secundarios. Por ello encontrar

biomoléculas de origen natural como el β-caroteno producido por D. salina que

puedan actuar como agentes preventivos, o curativos en el tratamiento, ya sea

que inhiban la proliferación celular descontrolada o puedan inducir la apoptosis de

las células neoplásicas, sin causar efectos tan dañinos como la quimio o

radioterapia, aún es una panacea en la lucha contra todos los tipos de cáncer que

existen.

Por otro lado, hay estudios previos que indican que el β-caroteno puede ser un

factor que predisponga a algunos tipos de cáncer y otros que indican que tiene

una función preventiva. Este estudio puede ayudar a probar in vitro si esta

molécula: 1) Tiene un efecto en la supervivencia de las células de cáncer de

mama y 2) Si su origen sintético o natural causa alguna diferencia.

4 Hipótesis

Debido a que en otras especies de Dunaliella (Dunaliella bardawil) se demostró

una mayor absorción y una actividad antioxidante más potente con respecto al β-

caroteno de origen sintético; el β-catoteno natural obtenido a partir de Dunaliella

salina puede tener un mayor efecto en la supervivencia de las células MDA-MB-

231 que β-caroteno de origen sintético.

13

5 Objetivo General

Demostrar el efecto que tendrá el β-caroteno de origen natural presente en un

extracto obtenido a partir de la microoalga D. salina en la supervivencia de la línea

celular MDA-MB-231.

5. 1 Objetivos particulares

-Estandarizar una fase móvil que permita detectar y cuantificar por medio de

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), el β-caroteno sintético (comercial)

y de origen natural.

-Cuantificar el β-caroteno natural presente en el extracto natural de D. salina.

-Evaluar el efecto del β-caroteno natural y sintético en la supervivencia de la línea

celular MDA-MB-231.

-Evaluar si hay un efecto diferencial entre el β-caroteno natural y sintético en la

línea celular HaCat.

-Observar si el tiempo de incubación con ambos tratamientos con β-caroteno,

también causa un efecto sobre ambas líneas celulares.

14

6 Materiales y Métodos

6. 1 Dunaliella salina

La cepa de D. salina (UTEX LB2538) empleada para este estudio, proviene de un

lugar conocido como La Salina, localizada 35 km al norte de la ciudad de

Ensenada, B.C. (Contreras-Flores, 2005) y forma parte de la colección del

laboratorio de Microbiología Molecular del Centro de Investigación Científica y de

Educación Superior de Ensenada, B. C. lugar en donde se realizó este trabajo.

6. 1. 1 Condiciones iniciales de Cultivo

En dos matraces Erlenmeyer de 250 ml se colocaron por separado dos inóculos

iniciales de aproximadamente 13,800 células de D. salina a los que se les nombró

como cultivos F y L . A cada cultivo se les agregó 50 ml de un medio nutritivo, el

cual fue elaborado con la mezcla de los de medios cultivo para microalgas F2

(Guillard y Ryter, 1962) y Erdschreiber's (1:1) a una concentración 1.0 M de NaCl.

Los cultivos F y L fueron mantenidos con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 12

horas, una temperatura de 25°C y un flujo luminoso de 20 quanta m-2 seg-1 hasta

que alcanzaron su fase de crecimiento estacionario. Durante este periodo, cada

cultivo fue agitado manualmente por la mañana y por la tarde, para favorecer el

intercambio gaseoso (Ver ANEXO I).

6. 1. 2. Cálculo de la densidad poblacional

Cada tres días se realizaron conteos directos a los cultivos F y L al microscopio

óptico con ayuda de una cámara de Neubauer. Para ello, se tomó una alícuota de

1 ml a partir de cada cultivo y se le agregaron 70 μl de solución de Lugol ácido

para inmovilizar las células y contarlas.

15

Para calcular la densidad celular del cultivo se utilizó la siguiente ecuación:

D= C * 104

En donde:

D= Densidad del cultivo en células/ml

C= Número de células en toda una cuadrícula de 1mm2

104= Factor de dilución

(Voltolina-Lobina et al., 1989).

6. 1. 3. Inducción

Una vez que se logró la fase estacionaria del cultivo, se eligió al cultivo F como

control, mientras que el cultivo L fue tomado como experimental. Al cultivo

experimental (L) se le realizaron incrementos graduales de salinidad en el medio

nutritivo hasta llegar a una concentración final de 3.0 M NaCl en el matraz y

además se incrementó el flujo luminoso a 26 quanta m-2 seg-1 sin alterar la

temperatura. Al cultivo control F, no se le alteraron las condiciones iniciales. Esta

fase tuvo una duración de 28 días.

Cuadro I. Incrementos en la concentración de NaCl realizados en el cultivo L

Día de cultivo Concentración Molar NaCl NaCl adicionado

12 1.5 M 2.61 g

15 2.0 M 1.46 g

18 2.5 M 1.32 g

21 3.0 M 1.61 g

16

6. 2 Betacaroteno

En este estudio se emplearon dos fuentes de β-caroteno: Una de origen natural

contenido en un extracto de D. salina obtenido con solventes orgánicos; cuya

elaboración no se describe ampliamente por motivos de patente. El segundo tipo

fue β-caroteno trans de origen sintético, fabricado por la empresa Sigma®.

6. 2. 1 Detección y cuantificación por HPLC

Para cuantificar e identificar el β-caroteno natural y sintético se empleó la técnica

de Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El análisis se realizó en un

cromatógrafo Hewlett Packard serie 1100 con inyector manual, un sistema

cuaternario para solventes y un detector múltiple para longitud de onda. Se

empleó una columna Zorbax C8 de fase inversa con un tamaño de partícula de 5

μm, una elución isocrática con metanol al 100% a una velocidad de flujo de 0.5

ml/min y 25 minutos de corrida.

Para cuantificar el β-caroteno natural presente en el extracto, se realizaron

diluciones con metanol al 100% del estándar sintético (0.5, 1, 1.5 y 3 µg/µl) con

las cuales se obtuvo una curva de calibración con las mediciones obtenidas en el

cromatógrafo.

6.3 Cultivo celular

6. 3. 1 Condiciones de crecimiento

Para su crecimiento, las líneas HaCat y MDA-MB-231 (ATTC® HTB-26®) fueron

sembradas en cajas de cultivo (Corning®) con 7 ml del medio RPMI-1640

(GIBCO®) suplementado con 10% de SFB (Suero fetal bóvino) inactivado

17

(GIBCO®) y 1% del antibiótico comercial anti-ant (Invitrogen®). Las líneas

celulares siempre fueron incubadas en un ambiente estéril, a una temperatura de

37°C y una atmósfera húmeda con 4% de CO2 (Ver Anexo II).

6. 3. 2 Desprendimiento de líneas celulares

Cuando los cultivos presentaron una confluencia aproximada de un 85%, las

células fueron lavadas con 2 ml PBS y se les aplicó un tratamiento con una

solución de tripsina-EDTA y Verseno (1:1) (1 ml) (Ver Anexo II). Enseguida se

tomó una porción de las células desprendidas, y se les sembró en una caja nueva

con medio RPMI-1640 suplementado. Para realizar los ensayos posteriores con el

β-caroteno, solo se emplearon las células obtenidas a partir de un cuarto pase,

siguiendo lo propuesto por Pitones-Rubio y Olmos-Soto, 2010.

6. 3. 3. Curva de crecimiento

Para estimar la cantidad de células adecuada para realizar el ensayo con β-

caroteno fue necesario obtener una curva de crecimiento basada en la

confluencia. Para esto se utilizó una placa de cultivo de 96 pozos (Corning®), en

donde se colocaron en cada pozo, diferentes cantidades de células de MDA-MB-

231 (1000, 2000, 3000, 4000 y 5000) en 100 µl de medio RPMI suplementado, las

cuales fueron incubadas durante 4 horas a una temperatura de 70°C y una

atmósfera húmeda de CO2 al 4%. Transcurrido ese tiempo, a las células se les

realizó el arresto celular, para lo cual se les cambió el medio a RPMI sin

suplementar. Después con ayuda de un microscopio invertido Axiovert Zeiss se

observó de forma visual la confluencia celular. De inmediato, las células

nuevamente fueron incubadas durante 20 horas bajo las mismas condiciones de

crecimiento. Al cabo de ese tiempo la confluencia fue revisada nuevamente.

18

6. 3. 4. Ensayo con β-caroteno

El ensayo estuvo compuesto por dos tratamientos sobre cada uno de los linajes

celulares (MDA-MB-231 y Hacat). El primer tratamiento consistió en una solución

elaborada con β-caroteno de origen natural; mientras que el segundo en una

solución realizada con β-caroteno de origen sintético. Para cada tratamiento hubo

dos condiciones en el tiempo de incubación: 2 y 24 horas. Los tratamientos con la

condición de 2 horas (h) iniciaron 22h después del arresto celular; mientras que

los tratamientos con la condición de 24h se aplicaron sin esperar a que se

cumpliera un tiempo previo al arresto celular (Cuadro II). El ensayo fue realizado

en multi-placas para cultivo celular de 96 pozos (Corning®), en los que se

colocaron 5,000 células del linaje celular correspondiente, y a las que se les

aplicaron 100 µl de cada uno de los dos tratamientos de β-caroteno con sus

respectivas condiciones. Como control positivo se utilizó DMSO al 100% y como

control negativo medio RPMI sin suplementar. El ensayo se realizó en condiciones

de oscuridad, por triplicado para cada tratamiento y condición, a 37°C en una

atmósfera húmeda con 4% de CO2. Para medir el efecto del β-caroteno de origen

natural y sintético en la supervivencia celular, fue llevado a cabo el ensayo

colorimétrico de MTT, de acuerdo al método de Pitones-Rubio y Olmos-Soto

(2010) (Ver Anexos III y IV).

Cuadro II. Esquema general del ensayo con β-caroteno

Línea celular Tratamientos con sus condiciones de incubación

MDA-MB-231 1. β-caroteno natural 2. β-caroteno sintético

2 h 24 h 2 h 24 h

HaCat β-caroteno natural β-caroteno sintético

2 h 24 h 2 h 24 h

19

6.3.5 Análisis estadísticos

Las absorbancias obtenidos en el ensayo final de MTT fueron analizadas con los

programas Calc de Libre Oppen Office y con R (Ihaka y Gentleman, 1996). En el

primero, se realizaron los estadísticos básicos y se probó la normalidad y

homocedasticidad de los datos. Con el programa R se realizaron varios análisis de

variancia (ANDEVA), mediante el uso de matrices, con el fin de establecer si

existió una diferencia entre los tratamientos de β-caroteno con base al estadístico

F.

20

7 Resultados

7.1 Cultivo de Dunaliella salina

La fase de cultivo inicial, duró 12 días. Los cultivos llegaron a una fase

estacionaria y alcanzaron un número máximo de 410,000 y 421,250 células/ml

(Ver Anexo V) al cabo de 9 días de cultivo. Durante esta fase las células de D.

salina midieron en promedio: 9-11µm de largo, presentaron una coloración verde y

con una forma ligeramente ovalada.

Figura 5. Curva de crecimiento poblacional del cultivo de Dunaliella salina

hasta alcanzar la fase estacionaria

El proceso de betacarogénesis en el cultivo L de D. salina fue completamente

visible hasta el día 37 de cultivo. En esta fase las células incrementaron su

tamaño, adquirieron una forma redonda, perdieron sus flagelos y presentaron

grandes glóbulos de β-caroteno y glicerol. El cultivo experimental L cambió su

coloración de verde a amarillo, y de este a rojo en el día 40 de cultivo.

1 3 6 9 12

0

100000

200000

300000

400000

500000

Día de Cultivo

Densid

ad p

obla

cio

nal (

Cél/m

l)

Cultivo F

Cultivo L

21

7.2 β-caroteno

En los cromatogramas obtenidos por HPLC el β-caroteno presentó su mayor pico

de absorción a una longitud de onda de 450 nm. Al analizar el estándar sintético

se observó un pico mayor correspondiente al trans β-caroteno, el cual tuvo un

8.105 min. En el extracto natural, se identificó un pico muy semejante, pero con un

tiempo de retención de 8.432 min. (Figura 6). Sin embargo, al sobreponer los

cromatogramas obtenidos con dos diluciones del estándar y una muestra del

extracto natural, se pudo confirmar la presencia trans β-caroteno en D. salina tal y

como se puede ver en la Figura 7.

22

Figura 6. Cromatogramas obtenidos por HPLC a una longitud de onda de

450 nm. A) Estándar de trans β-caroteno, B) Extracto natural de D. salina y

C) Blanco de metanol al 100%

A

B

C

23

Figura 7. Cromatogramas sobrepuestos del estándar y el extracto natural

de D. salina. Las líneas punteadas (…) corresponden al estándar sintético,

mientras que la línea continua inferior (__) al extracto natural.

24

En el siguiente cuadro se muestran los datos de absorbancia obtenidos en el

cromatógrafo al analizar el estándar sintético del trans β-caroteno, así como las

concentraciones de β-caroteno estimadas en distintas diluciones del extracto

natural de D. salina:

Cuadro III. Mediciones de absorbancia obtenidas en el cromatógrafo HPLC al

analizar el estándar sintético de trans β-caroteno (ES) y el extracto natural de

Dunaliella salina (BN).

Fuente de

β-caroteno

Concentración β-caroteno

(µg/µl)

Área (mAU*min)

ES1 0.5 227.682

ES2 0.75 673.028

ES3 1.5 1759.24

ES4 3 3518

BN1 0.64 513.841

BN2 2.95 3511.8

BN3 4.21 5150.46

25

En la figura 8 se muestra la curva de calibración obtenida a partir de las

mediciones anteriores con el estándar sintético y el extracto natural. Esta curva

presentó una relación lineal, en cuya ecuación de la recta se obtuvo una r2 de

0.99796 dando certeza del método de cuantificación empleado.

Figura 8. Curva de calibración por HPLC para estimar la concentración de

β-caroteno en el extracto natural

y = 1298.6x - 322.26 R² = 0.998

0 1 2 3 4 5

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Concentración betacaroteno (ug/ul)

Áre

a c

rom

ato

gra

ma (m

AU

*min

)

Estándar

sintético

BN1

BN2

BN3

26

7.3 Curva de crecimiento

Al realizar la curva, se determinó que la cantidad óptima de células para realizar

los ensayos fue de 5,000 células debido a las confluencias iniciales y finales

obtenidas, como se puede observar en el siguiente cuadro:

Cuadro IV. Resultados obtenidos para la curva de crecimiento con la línea

celular MDA-MB-231.

Células/ml Confluencia 4h Confluencia 20h

MDA-MB-231

1000 10% 20%

2000 15-20% 35%

3000 20-25% 50%

4000 30-35% 65-70%

5000 40-45% 85-90%

7.4 Ensayo de viabilidad celular con β-caroteno

Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos, los datos presentaron en

todos los casos una distribución normal, al realizar intervalos de confianza para un

α de 0.05.

7.4.1 Tratamiento de β-caroteno: 2 horas

En la línea celular MDA-MB-231 el β-caroteno natural tuvo un fuerte efecto, ya que

la supervivencia fue del 27.9%, contra una supervivencia del 64.45% originado por

el trans β-caroteno sintético (Figura 9). Al realizar el ANDEVA se obtuvo una F=

27

1148.3 con un valor de P=4.45e-6 (P <0.05). Esto demostró que la diferencia fue

estadísticamente significativa entre tratamientos (Ver Figura 11 en Anexo 5). Al

comparar contra el control interno de la propia línea celular MDA-MB-231 (control

negativo) nuevamente existió diferencia significativa. Además la diferencia más

grande se presentó en las células tratadas con β-caroteno natural.

En la línea celular HaCat, la supervivencia fue de un 96.04% y de un 89.13% al

ser tratadas con el β-caroteno natural y sintético respectivamente (Figura 10). El

ANDEVA realizado indicó que no existió una diferencia significativa entre la

supervivencia de las células HaCat tratadas con ambas fuentes de β-caroteno

(Figura 12).

Por medio de una cuarta comparación entre ambas líneas celulares (MDA-MB-231

y HaCat) tratadas con β-caroteno (natural y sintético) durante 24h, se tuvo una

F=55.526 con una P= 1.065e-6 (P<0.05); por lo que nuevamente se encontró una

diferencia estadísticamente significativa. Esto se puede observar con mayor

detenimiento en la Figura 13, en donde se ve una marcada diferencia entre grupos

y en el caso de MDA-MB-231 entre tratamientos.

7. 4. 2 Tratamiento de β-caroteno: 24 horas

En las células de MDA-MB-231 que fueron sometidas al de β-caroteno natural

durante 24h, hubo una supervivencia del 70.98%; mientras que al ser tratadas con

el de origen sintético fue de un 96.74% (Figura 9). Al realizar el ANDEVA se obtuvo

una F=474.32 con un valor de P=2.63e-6 (P<0.05), por lo que existió una

diferencia entre ambos tratamientos (Ver figura 14 en Anexo V). Al comparar

nuevamente contra el control interno de la línea celular, nuevamente existió

diferencia significativa, y la diferencia más grande se presentó entre las células

MDA-MB-231 control interno y las tratadas con β-caroteno natural, corroborando el

28

resultado anterior (Ver Figura 17).

En la línea celular HaCat la supervivencia fue de un 79.71% para el β-caroteno

natural y 83.3% para el sintético durante 24 horas (Figura 10). El ANDEVA indicó

que no existió una diferencia significativa entre ambas condiciones (Figura 15).

Sin embrago, al realizar una cuarta prueba considerando a las células de control

interno para HaCat, se encontró diferencia significativa con un valor de F=20.878

con una P=0.00019 (P< 0.05). En este caso la mayor variación se pudo observar

entre las células del control negativo y las células tratadas con β-caroteno

sintético.

Al comparar los resultados de ambas líneas celulares (MDA-MB-231) tratadas con

ambos tipos de β-caroteno por 24 horas, nuevamente se encontró una diferencia

entre los tratamientos. Se obtuvo una F=30.198 con un valor de P=0.001 (P<0.05).

Ver Figura 16, en el Anexo V.

Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos en ambos tratamientos con β-

caroteno (2 y 24 horas), se acepta la hipótesis planteada en este trabajo.

29

Figura 9. Resultados del ensayo de viabilidad celular realizado con β-caroteno sobre

MDA-MB-231.

Figura 10.Resultados del ensayo con β-caroteno sobre HaCat

24 horas 2 horas

0

20

40

60

80

100

120

Tratamiento después de arresto

% S

up

ervi

ven

cia

Βetacaroteno Natural

Betacaroteno Sintético

Control

24 horas 2 horas

0

20

40

60

80

100

120

Tratamientos después de arresto celular

Sup

ervi

ven

cia

(%)

Βetacaroteno Natural

Betacaroteno Sintético

Control

30

8 Discusión

Los resultados obtenidos en el ensayo mostraron un claro efecto del β-caroteno de

origen natural sobre las células de cáncer de mama MDA-MB-231, y que además

fue significativamente mayor con respecto al efecto que causó el trans β-caroteno

de origen sintético. Con base en este resultado podríamos platearnos la siguiente

pregunta: ¿De qué forma puede interactuar la molécula de β-caroteno con las

células cancerígenas para causarles una disminución de su supervivencia? Una

forma podría ser por medio de su actividad antioxidante (Dimitrov et al., 1988;

Bendich y Olson, 1989; Mínguez-Mosquera et al., 2008).

En 1924 se descubrió que las células cancerígenas presentan una alteración en el

metabolismo celular, llamado efecto Warburg y que las distingue de las células

normales. Debido a esta alteración las células de cáncer llevan a cabo la gilcólisis

anaeróbica (convirtiendo la glucosa en lactato) para obtener su energía y realizar

sus actividades vitales (Lehninger, 1995; Dang, 2012). Sin embargo, este proceso

es menos eficiente, de forma que las mitocondrias de las células cancerígenas

deben trabajar más y por ende tienen una mayor actividad. Cada vez que las

mitocondrias llevan a cabo sus actividades nuevamente liberan especies reactivas

de oxígeno -1O2 (ROS); por lo que en donde hay células cancerígenas se forma un

microambiente químico en el que hay condiciones de hipoxia y una mayor cantidad

de ROS (Dang, 2012).

Las ROS tienen un papel importante durante el desarrollo del cáncer, activando o

inhibiendo la actividad de distintos proto-oncogenes y genes supresores de

tumores. Un caso es el del oncogen Myc, que en presencia de ROS es sobre-

expresado en las células de cáncer. Myc es un regulador central del crecimiento

31

celular, de forma que un fallo es un su funcionamiento acelera el metabolismo, y la

proliferación celular. Otro oncogen, que se ve afectado por la presencia de ROS es

el Factor inducible a la hipoxia (HIF-1); este es un factor trans-cripsional que

induce continuamente la activación de la glicólisis anaerobia (efecto Warburg) y

tiene una sobre actividad metabólica, que las prepara para poder proliferar

continuamente (Dang, 2012). También se sabe que las ROS disminuyen la

expresión de distintos genes supresores de tumores, entre los cuales se encuentra

el gen que codifica la Tensin-fosfatasa homóloga (PTEN). La expresión de esta

enzima, detiene la proliferación celular. Un gen supresor de tumores que también

se ve afectado por la presencia de ROS en células cancerígenas es P53 (Lau et

al., 2011; Fiachi y Chiarugui, 2012).

Como ha sido ampliamente descrito, la molécula de β-caroteno posee un largo

esqueleto poli-insaturado, es decir que cuenta con muchos dobles enlaces,

situados en distintos ángulos y posiciones geométricas, lo que le hace capaz (al

oxidarse) de atrapar y destruir, moléculas altamente reactivas, como las especies

reactivas de oxígeno activado (Holum, 1999). Es por eso, que una actividad

antioxidante que atrape ROS por parte del β-caroteno pudo disminuir la

supervivencia de las células MDA-MB-231 en este trabajo, al dañar directamente

su metabolismo, y alterar señalizaciones que les permiten evadir la apoptosis e

inducir la proliferación celular; ya sea que altere las condiciones de hipoxia y

modifique el ambiente químico externo en el que se encuentran las células o bien

que actúe dentro de ellas al ser asimilado.

Por otro lado, Minguez-Mosquera (2008) además de otros autores, mencionan que

los carotenoides pueden, tener una actividad anticancerígena sin actuar como

antioxidantes; interactuando directamente con receptores celulares que se

encuentran embebidos en las membranas celulares (Bendich y Olson, 1989;

32

Lamson y Brignall, 1999; Heber y Lu, 2002. A su vez, esos receptores celulares

podrían intervenir en la señalización para la progresión del ciclo celular, evitando la

proliferación característica del cáncer (Heber y Lu, 2002). Si esto ocurrió en el

ensayo realizado, uno de los receptores involucrados podrían ser Cadherina-11 y

E-cadherina.

E-cadherina es una proteína de membrana de importancia fundamental para el

mantenimiento y la formación de tejidos; ya que junto con otras proteínas

conforman las uniones intercelulares (uniones GAP). Cadherina-11, es un receptor

celular que se expresa en las células de MDA-MB-231 una vez que estas han

sufrido un proceso epigenetico, y jugando un importante papel en el desarrollo de

la metástasis (Onder et. al., 2008; Benton et al., 2009; Lau et al., 2011). Una

diferencia a nivel de receptores como estos también podría explicar, porque el β-

caroteno tuvo un efecto sobre las células cancerígenas de mama y no en las

células HaCat. Además se sabe, que la expresión de Cadherina-11 en células de

cáncer obedece a un aumento en su proliferación (Qureshi et al., 2006), pudiendo

explicar porque el efecto del β-caroteno fue mayor en el ensayo de 2 horas, ya que

en este caso la confluencia celular era cercana al 100%.

La diferencia que existió en el efecto causado con respecto al origen de la

molécula de β-caroteno se debe a que D. salina produce de forma natural, una

mezcla de isómeros: 15-cis-β-caroteno (10%), 9-cis-β-caroteno (41%), trans β-

caroteno (42%) y además de otros isómeros sin identificar (7%). Esta combinación

de isómeros hace que sean más fácilmente asimilados y metabolizado por las

células humanas que las fuentes sintéticas de tipo trans (Ben-Amotz, 1992); Esto

también podría explicar porque tuvo un efecto mayor. Además, aunque

actualmente la producción comercial de carotenoides es en su mayoría llevada a

cabo por síntesis química con alto grado de pureza y bajo costo; en ella a menudo

33

quedan algunos precursores de las reacciones o -productos no biológicos que

pueden tener efectos no deseados (Asker et al., 2012). Por ello, en este trabajo se

consideró importante utilizar una fuente sintética de β-caroteno y comparar su

efecto contra uno de origen natural.

Cualquiera que haya sido el mecanismo de acción del β-caroteno, la actividad

anticancerígena reportada en este trabajo coincide con lo ya expuesto por Bendich

y Olson (1989); Lamson y colaboradores (1989), Venugocopal (2009) y Ben-Amotz

(2009) entre otros en distintos tipos de cáncer.

34

9 Conclusiones

-Fue posible inducir la β-carotenogénesis en D. salina por medio de estrés salino

bajo condiciones de laboratorio.

-El β-caroteno obtenido a partir de D. salina tuvo in vitro una actividad negativa en

la supervivencia de las células cancerígenas MDA-MB-231 en todos los

tratamientos.

-El β-caroteno trans sintético afectó en menor grado la supervivencia de las

células cancerígenas MDA-MB-231 en todos los tratamientos.

-En células normales HaCat el β-caroteno sintético tuvo un mayor efecto negativo

en la supervivencia, con respecto al de origen natural en el tratamiento de 2

horas.

-En células normales HaCat tratadas durante 24 horas con el β-caroteno natural la

diferencia fue mínima.

-El β-caroteno de origen natural obtenido a partir de D. salina puede ser un buen

candidato para la prevención y el tratamiento del cáncer de mama.

35

10 Recomendaciones

-Optimizar las condiciones de cultivo y de estrés para D. salina.

-Obtener cultivos masivos de D. salina para lograr una mayor producción de β-

caroteno en menos tiempo.

-Confirmar el efecto del β-caroteno producido naturalmente por D. salina en otras

líneas celulares de cáncer.

-Estudiar los mecanismos mediante los cuales el β-caroteno de origen natural

puede interactuar con las células de cáncer..

-Estudiar las rutas metabólicas que inducen la β-carotenogénesis en D. salina

desde un punto de vista genético, con el fin de generar cepas super-

productoras del pigmento.

36

Bibliografía

Asker, D., Awad, T., Beppu, T. y K. Ueda. 2012. Isolation, characterization, and

diversity of novel radiotolerant carotenoid-producing bacteria. En: Microbial

Crotenoids from Bacteria and Michroalgae. Methods and Protocols. Barredo, J.

(Ed). Human Press. Estados Unidos. 355 pp.

Ames y Shigenaga. 1992. Molecular Biology of free Radicals scavenging systems.

Cold Spring harbor. Estados Unidos. 128 pp.

Baba, A. I. 2007. Comparative Oncology. The publishing house of the Rumanian

Academy. Rumania. 782 pp.

Ben-Amotz, A. y M. Avron. 1992. Dunaliella: Physiology, Biochemistry and

Biotechnology. CRC Press. Estados Unidos. 240 pp.

Ben-Amotz, A. y Y. Levi. 1996. Bioavailabity of a natural isomer mixture compared

with synthetic all trans β-carotene in human serum. Am. J. Clin. Nutr. 63: 729-

34.

Ben-Amotz, A., L. Amnon, y M. Avron. 1987. Steroisomers of β-carotene and

Phytoene in the Alga Dunaliella bardawill. Plant Physiol. 86: 1286-1291.

Ben-Amotz, A.,, J. Polle, y D.V. Subba-Rao. 2009. The Alga Dunaliella

Biodiversity, Physiology and Biotecnology. CRC Press. Estados Unidos. 550

pp.

Bendich, A. y J. Olson. 1989. Biological actions of carotenoids. FASEB J., 3(8):

1927-1932.

Benton, G.; Crooke, E. y J. George. 2009. Laminin-1 induces E-cadherin

expression in 3-dimensional cultured breast cancer cells by inhibiting DNA

methyltransferase 1 and reversing promoter methylation status. FASEB 23:

3884-3893.

Borowitzka, M. 1990. The mass culture of Dunaliella salina, pp. 63-80. En:

37

Technical resource papers. Regional workshop on the culture and utilization of

seaweeds 2. Regional seafarming development and demostration project,

FAO Network of Aquaculture Centres in Asia: Bangkok, Thailand.

Capa-Robles, W. 2004. Caracterización de vías metabólicas de formación de

isoprenoides y beta-caroteno durante la carotenogénesis de D. salina BC02.

Tesis de maestría. CICESE. 86 pp.

Cailleau, R.; Young, R.; Olivé, M. y J. Reeves. 1974. Breast tumor cell lines form

pleural efussions. J. Natl. Cancer Inst 53: 661-674.

Contreras-Flores, R. 2005. Identificación molecular de cepas de Dunaliella salina,

evaluación de la acumulación de β-caroteno y determinación de la variabilidad

genética intraespecie. Tesis de maestría. CICESE. 71 pp.

Dang, C. 2013. Links between metabolism and cáncer. Genes Dev. 26: 877-890.

Dimitrov, N., C. Meyer,, D. Ullrey,; W. Chenowerth,, W. Malone,, C.Boone y G. Fink.

1988. Bioavility of B-carotene in humans. Am. J. Clin. Nutr. 48: 298-304.

Emeish, S. 2012. Production of natural β-carotene from Dunaliella living in the

Dead Sea. JJEES 4(2): 23-27.

Fiaschi, T. y P. Chiarugi. 2012. Oxidative stress, tumor microenviroment, and

metabolic reprograming: A diabolic liaison. International Journal of Cell

Biology 2012: 1-8.

Guillard, R. L. y J. Rither. 1962. Studies on marine planktonic diatoms. Can. J.

Microbiol. 8: 229-239.

Gutierrez-Millán, L. 1996. Ácido desoxirribonucleico, proteínas y pigmentos

durante la carotenogénesis inducida de una nueva cepa de Dunaliella salina

(Chlorophyta) aislada de una laguna salina hipersalina de Baja California.

Tesis de maestría. CICESE. 82 pp.

Heber, D. y Q.Y. Lu. 2002. Overview of mechanism of action of Lycopene. Exp.

Biol. Med. 227: 920-923.

Herchberg, S. 2005. The history of β-caroteno and cancers: from observational to

38

intervention studies. What lessons can be drawn for future research on

polyphenols?. Am. J. Clin. Nutr. 81: 218-222.

Holum, J. 1999. Fundamentos de química general, orgánica y bioquímica para

ciencias de la salud. LIMUSA-Colección de textos del IPN. México. 865 pp.

Ihaka R. y R. Gentleman. 1996. R: a language for data analysis and graphics. J.

Comput Graph. Stat. 5: 299–314.

INEGI. 2013. Estadística a propósito del día mundial del cáncer. En:

http://www.inegi.con,mx (consultado el 9 de junio de 2013).

INC. 2013. Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos. En:

http://www.cancer.gov/ (consultado el 14 de mayo de 2013).

Ireland, C.M.; Copp, B.; Foster, M.; Macdonald, L.; Radisky, D. and J.C. Swerser.

1993. En: Marine Biotechnology, Volume 1: Pharmeceutical and bioactive

Natural Products. Haltaway, H. y O. Zabosrky (Eds). P. 1-11.

Kowalski, P.J.; Rubin, M.A. y C. Kleer. 2003. E-cadherin expression in primary

carcinomas of the breast and its distant metastasis. Breast Cancer Reserch.

5: R217-R222.

Krinsky, N. 1988. Antioxidant functions of carotenoids. Free Radical Biology and

Medicine 7: 617-635.

Lamson, D.W. y M. S. Brignall. 1999. Antioxidants in Cancer therapy; their actions

and interactions with oncologic therapies. Alt. Med. Rev., 4(5): 304-329.

Langdon, S. 2004. Cancer cell culture. Humana Press. Estados Unidos. 361 pp.

Lehmann, B. 1997. HaCat cell line as a model system for Vitamin D3 metabolism

in human skin.J. Inv. Derm. 108: 72-82.Lau, M.; Klausen, C. y P. Leung. 2011.

E-cadherin inhibits tumor cell growth by suppressing PI3K/Akt signaling via β-

catenin-Egr-1mediated PTEN expression. Oncogene: 1-14

Leo, A. y C. Lieber. 1999. Alcohol, vitamin A, and β-carotene: adverse interactions

including heptotoxity and carcinogenicity. Am. J. Clin. Nutr. 69: 1071-85.

Lehninger, A. 1995. Bioqímica. Omega. España. 1116 pp.

39

Lodish, H.; Matthew, P.; Scott, M.; Matsudaira, P.; Darnell, J.; Zipursky, L.; Kaiser,

C.; Berk, A. y M. Krieger. 2002. Biología molecular y celular. Panamericana.

México. 863 pp.

Mínguez-Mosquera, M., D. Hornero-Méndez, y A. Pérez-Gálvez. 2008.

Carotenoids and provitamin A in functional foods. En: Methods of analysis for

functional food and nutraceuticals. (Ed.) W.J. Hurst, CRC Press. Estados

Unidos. 532 pp.

Musolino, A.; Bella, A.; Bortesi, B.; Michiaria, M.; Naldi, N.; Zanelli, P.; Neri, T. Y A.

Ardizzoni. 2007. BRCA mutations, molecular markers and clinical variables in

early one set breast cancer. The Breast, 16: 280-292.

Olmos-Soto, J., J. Paniagua-Michel, R. Contreras y L. Trujillo. 2002. Molecular

identification of β-carotene hyper-producing strains of Dunaliella from saline

environments using species-specific oligonucleotides. Biotechnol. Lett. 24:

365-369.

Olmos-Soto, J.; Paniagua-Michel, J.; Contreras, R. y L. Ochoa. 2012. DNA

Fingerpringting Intron Method to acomplish specific, rapid, and sensitive

identification of Carotenogenic Dunaliella especies, pp. . En: Microbial

Carotenoids from Bacteria and Michroalgae. Methods and Protocols. Bárredo

(Eds). Human Press. Estados Unidos.

Onder, T.; Gupta, P. y S. Mani. 2008. Loss of E-cadherin promotes metástasis vía

multiple downstream transcriptional pathways. Can. Res 68: 3648-3654.

Paniagua-Michel, J. 2009. Productos naturales marinos, metabolitos con actividad

biológica, pp. 147-186. En: Biotecnología marina. Capítulo 6. (Eds) J.

Paniagua-Michel. AGT-Editor S.A. P.

Pitones-Rubio, S. y J. Olmos-Soto. 2010. Manual técnico de cultivo celular.

Laboratorio de Microbiología Molecular. Centro de Investigación Científica y de

educación superior de Ensenada, B. C. 23 pp.

Qureshi, H., M. Linden,y U. Raju. 2006. E-cadherin status in breast cáncer

40

correlates with histologic type but does not correlate with established

prognostic parameters. Am. J. Clin. Pathol. 125: 377-385.

Rodríguez -Bandala, C. 2010. Identificación del receptor SV2 isoforma en cáncer

de mama in vitro e in vivo. Tesis de Maestría en Ciencias de la Salud.

Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional. México. 64 pp.

Sánchez-Castrejón, E. 1998. Ácido desoxirribunocleico, proteína, y pigmentos

durante la carotenogénesis inducida en una nueva cepa de Dunaliella salina

(CLOROPHYTA), aislada de una laguna hipersalina de Baja California,

México. Tesis de maestría. CICESE. 81 pp.

Venugocopal, V. 2009. Marine Products for Healthcare. Functional and

bioactive nutraceutical compounds form the ocean. CRC. Estados Unidos.

525 pp.

Voltolina-Lobina; D; Buckle-Ramírez y E. Morales-Guerrero. 1989. Manual de

metodologías y alternativas para el cultivo de microalgas. Segunda edición.

CICESE. 60 pp.

Wilcox, L. y L. Graham. 2000. Algae. University of Michigan. Prentice Hall.

Estados Undos.640 pp.

World Cancer Report. 2008. World Health Organization. International Agency

for Research on Cancer. Francia. 508 pp.

41

ANEXO I

Cultivo de D. salina

a) Medio nutritivo

Este medio consistió en una combinación de los medios Erdschreiber´s y F/2 en

una proporción 1:1 y a una concentración de 1.0 M de NaCl. Para preparar 1L total

es necesario:

1. Combinar los componentes.

2. Guardar a temperatura ambiente.

Cuadro V. Componentes del medio de cultivo nutritivo

Componente Cantidad

Medio Ersdschraver´s 1.0 M NaCl 500 ml

Medio F/2 1.0 M NaCl 500 ml

b) Medio Erdschreiber´s modificado 1.0 m NaCl.

Para preparar 1 l de medio se debe:

1. Agregar a 3 l de agua de mar (30-35 ppt) pasteurizada, cada uno de los

componentes en el orden especificado con exceptuando las vitaminas.

2. Agitar vigorosamente y vaciar en un recipiente con tapa.

3. Esterilizar en autoclave durante 30 minutos.

4. Cuando el medio esté temperado agregar la solución de vitamina B12.

5. Guardar a 4°C.

42

Cuadro VI. Componentes del medio Erdschreiber´s empleado

Componente Cantidad Concentración final

Solución de Metales Traza P-IV 12 ml

NaNO3 0.1955 g/l 2.3 mM

Na2HPO4·7H2O 0.9511 g/l 6.7 mM

NaCl 23 g/l 1 M

Solución de Vitamina B12 1 ml

*El medio original puede ser consultado en la página de internet perteneciente a la

Colección de Algas de la Universidad de Texas, UTEX (2013).

c) Medio F/2 modificado 1.0 m NaCl

Para preparar 1 l de medio fue necesario:

6. Agregar a 950 ml de agua de mar (30-35 ppt) pasteurizada, cada uno de los

componentes en el orden especificado (a excepción de las vitaminas)

mientras se agita constantemente.

7. Llevar el volumen total a 1 l con agua de mar pasteurizada.

8. Cubrir y esterilizar en autoclave durante 30 minutos.

9. Cuando el medio esté a temperatura ambiente agregar las soluciones de

vitaminas.

43

Cuadro VII. Componentes del medio F/2 empleado

Componente Cantidad Concentración

Solución Stock

Concentración

final

NaNO3 1 ml 7.5 g/100 ml H2O 880 µM

NaH2PO4·H2O 1 ml 0.5 g/ 100 ml H2O 36 µM

Solución de metales traza

para F/2

1 ml

NaCl 23 g/l 1 M

Solución de Vitaminas

para F/2

1 ml

*Para preparar el medio original consultar a Guillard y Ryter (1962).

d) Solución de metales traza para medio Erdschreiber´s

Para preparar 1 l se debe:

1. Agregar a 950 ml de agua destilada todos los nutrientes en el orden

enlistado mientras se agita vigorosamente.

2. Llevar a un volumen total de 1 l con agua destilada.

3. Guardar a 4° C.

44

Cuadro VIII. Solución de metales traza para preparar el medio Erdschreiber´s

Componente Cantidad Concentración final

Na2EDTA·2H2O 0.75 g/l 2 mM

FeCl3·6H2O 0.097 g/l 0.36 mM

MnCl2·4H2O 0.041 g/l 0.21 mM

ZnCl2 0.005 g/l 0.037 mM

CoCl2 0.002 g/l 0.0084 mM

Na2MoO4·2 H 2O 0.004 gl 0.018 mM

e) Solución de Vitamina B12 para medio Erdschreiber´s

Para preparar 200 ml es necesario:

1. Prepara 200 ml del amortiguador HEPES (50mM)

2. Ajustar el ph a 7.8.

3. Agregar la Vitamina B12 (0.1 mN) y esperar a que se disuelva por completo.

4. Esterilizarla solución por medio de un filtro Millipore de 0.45 µm.

5. Guardar es oscuridad a 4°C.

Cuadro IX. Vitaminas adicionadas en el medio Erdschreiber´s

Componente Cantidad

Amortiguador HEPES pH 7.8 2.4 g/200 ml H20

Vitamina B12 0.027 g/200 ml H20

f) Solución de metales traza para medio F/2

Para preparar 500 ml se debe:

1. Colocar en un vaso de precipitado 450 ml de agua destilada.

2. Calentar el agua en hasta casi alcanzar el hervor y en agitación constante

45

agregar los componentes.

3. Llevar a un volumen total de 500 ml con agua destilada

Cuadro X. Solución de metales traza para preparar el medio F/2

Componente Cantidad Concentración final

ZnSO4·7H2O 23 mg/500 ml 0.08 µM

MnSO4·H2O 152 mg/500 ml 0.9 µM

Na2MoO4·2H 2O 7.3 mg/500 ml 0.03 µM

CoSO4·7H2O 14 mg/500 ml 0.05 µM

CuCl2·2H 2O 6.8 mg/500 ml 0.04 µM

Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 4.6 mg/500 ml 11.7 µM

Na2EDTA·2H2O 4.4 mg/500 ml 11.6 µM

g) Solución de Vitaminas para medio F/2

Para preparar 200 ml es necesario:

1. Prepara 200 ml del amortiguador HEPES (50mM)

2. Ajustar el ph a 7.8.

3. Agregar los componentes y esperar a que se disuelvan por completo.

4. Esterilizarla por medio de un filtro Millipore de 0.45 µm.

5. Guardar es oscuridad a 4°C.

6.

Cuadro XI. Solución de Vitaminas adicionadas en el medio F/2

Componente Cantidad

Amortiguador HEPES pH 7.8 2.4 g/ 200 ml H20

Vitamina B12 0.027 g/ 200 ml H20

Biotina 0.005 g/ 200 ml H20

Tiamina 0.22 g/ 200 ml H20

46

ANEXO II

Soluciones y medios empleados para el cultivo de las líneas celulares

a) Solución PBS

Para preparar una solución de PBS 10X se deben mezclar en 950 ml de agua

destilada, los componentes mostrados a continuación:

Cuadro XII. Componentes del buffer PBS

Reactivo Cantidad NaCl 8 g

KCl 2 g Na2HPO4 17 mg

KH2PO4 1.63 g

Posteriormente, se debe titular hasta llegar a pH 7.4 con HCl ó NaOH, llevar a 1L

con agua destilada y esterilizar a 15 lb de presión durante 30 minutos en

autoclave.

b) Verseno

Para preparar 60 ml, se debe pesar el EDTA y disolverlo en PBS estéril en

constante agitación.:

Cuadro XIII. Reactivos para preparar EDTA/PBS [1 mM].

Reactivo Cantidad

EDTA 0.0228 g PBS 60 ml

Una vez preparada la solución, esta debe ser esterilizada por medio de un filtro

Millipore de 0.2 µm.

47

c) Suero fetal bovino

Antes de añadir el SFB (GIBCO®) al medio RPMI-1640, este fue inactivado. Para

ello es necesario colocarlo en un baño maría y calentarlo a 55°C durante 20

minutos.

d) Medio RPMI-1640 (Invitrogen ®)

Para preparar 50 ml de medio suplementado es necesario:

1. Tomar 45 ml de medio RPMI y agregar cada uno de los componentes.

2. Filtrar el medio por medio de un filtro Millipore de 0.2 µm con ayuda de una

bomba de vacío.

3. Cerrar y guardarlo a 4°C.

Cuadro XIV. Medio RPMI suplementado.

Componente Cantidad RPMI-1640 45 ml

SFB inactivado 5 ml Ant-Ant 500 µl

48

Anexo III

Ensayo con β-caroteno

a) Solución β-caroteno natural

Para preparar las soluciones de β-caroteno natural:

1. Se mezclaron en un tubo falcon de 15 ml los componentes enumerados en la

siguiente tabla:

Cuadro XV. Solución A elaborada a partir del extracto de D. salina.

Reactivos Cantidades

CH3Cl2 100 μl DMSO 40 μl

Extracto 12 μl EtOH 248 μl

Medio RPMI sin suplementar

2.6 ml

Volumen final 3 ml

2. En otro tubo falcon de 15 ml se colocaron 9 ml de medio RPMI con o sin

suplementar según el caso necesario.

3. Calentó en baño maría a 37° C durante 3 minutos y agregar 1 ml de la mezcla

4. Agregar 1 ml de la solución A preparada.

5. Mantener en baño de hielo y oscuridad, ya que la solución es fotolábil.

b) β-caroteno sintético

Para preparar las soluciones de β-caroteno sintético:

6. Se mezclaron en un tubo falcon de 15 ml los componentes enumerados en la

siguiente tabla.

49

Cuadro XVI. Solución B de β-caroteno trans sintético.

Reactivos Cantidades

CH3Cl2 50 μl DMSO 20 μl

β-caroteno trans 18 mg

EtOH 112 μl Medio RPMI-1640 Sin suplementar

2800

Volumen final 3 ml

7. En otro tubo falcon de 15 ml se colocaron 9 ml de medio RPMI con o sin

suplementar según el caso necesario.

8. Calentó en baño maría a 37° C durante 3 minutos y agregar 1 ml de la mezcla

9. Agregar 1 ml de la solución B preparada.

10. Mantener en baño de hielo y oscuridad, ya que la solución es fotolábil.

* La concentración final de todas las soluciones empleadas en los tratamientos fue

de 6 µg/µl de β-caroteno.

50

Anexo IV

Ensayo colorimétrico de MTT

Para realizar el ensayo se debe:

1. Preparar el reactivo de MTT (Sal de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5

difeniltetrazolio) con una concentración de 5mg/ml. Para ello se mezclan en

completa oscuridad los siguientes componentes:

Cuadro XVII. Componentes del Reactivo de MTT.

Componente Cantidad

Sal de MTT 25 mg

PBS estéril 5 ml

2 Con ayuda de una micro-peta agregar 50 ul de de medio RPMI sin suplementar

en cada pozo de la placa en la que se llevó a cabo el ensayo (muestras, blancos y

controles).

3 Enseguida adicionar 50 ul reactivo de la sal de MTT en cada pozo. Este paso

debe hacerse sin presencia de luz blanca.

4 Agitar suavemente la placa para mezclar la sal de MTT con el medio de cultivo.

5 Introducir en la incubadora durante 2 horas y media, a una temperatura de 37°C

y a un 5% CO2.

6 Sacar la placa de la incubadora y con cuidado extraer el sobrenadante de cada

de pozo. Este paso debe de hacerse con sumo cuidado, ya que se debe evitar

quitar los cristales formados en el fondo de cada pozo.

7 Adicionar 100 ul de isopropanol a cada pozo e incubar tres minutos.

8 Agitar suavemente la placa durante 10 minutos, hasta observar que haya una

51

coloración (azul-roja) que sea homogénea.

9 Leer en un micro-lector de placas a una absorbancia de 490 nm.

ANEXO V

“Resultados del ANOVA realizado con el programa R”

1. Comandos empleados en R, y resultados obtenidos en el tratamiento de 2 Horas con β-caroteno para cada línea celular

a) MDA

>y1=c(.249, .258, .264) y>2=c(.107, .108, .109) >y=c(y1,y2) >n=rep(3,2) >group=rep(1:2,n) >data=data.frame(y=y,group=factor(group)) >fit=lm(y ~ group,data) >anova(fit) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.033302 0.033302 1148.3 4.524e-06 *** Residuals 4 0.000116 0.000029 Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

Figura 11. Variación dentro del tratamiento de 2h con β-caroteno en la línea

52

celular MDA-MB-231. 1)Células con β-caroteno trans sintético (BS),

2)Células con β-caroteno natural (BN).

b ) MDA vs control negativo

>y1=c(.249, .258, .264) >y2=c(.107, .108, .109) >y3=c(.401, .414, .302) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.105375 0.052687 41.483 0.0003068 *** Residuals 6 0.007621 0.001270 c) Hacat

>y1=c(.288, .260, .246) >y2=c(.276, .227, .237) >y=c(y1,y2) >n=rep(3,2) >group=rep(1:2,n) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.0004860 0.00048600 0.862 0.4057 Residuals 4 0.0022553 0.00056383

Figura 12. Variación dentro del tratamiento de 2h con β-caroteno en la línea

celular HaCat 1)Células con BN, 2)Células con BS

53

d) HaCat con control interno

>y1=c(.276, .227, .236) >y2=c(.288, .260, .246) >y3=c(.296, .271, .275) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.0017709 0.00088544 .0154 0.214 Residuals 6 0.0026360 0.00043933 e) MDA-MB-231 Vs HaCat Beta Natural

>y1=c(.107, .108, .109) >y2=c(.276, .227, .236) >y3=c(y1,y2) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.0287042 0.0287042 84.259 0.0007822 *** Residuals 4 0.0013627 0.0003407 f) MDA-MB-231 Vs HaCat (Todos los tratamientos)

>y1=c(.249, .258, .264) >y2=c(.107, .108, .109) >y3=c(.276, .227, .236) >y4=c(.288, .260, .246) >y=c(y1,y2,y3,y4) >n=rep(3,4) >group=rep(1:4,n) >data=data.frame(y=y,group=factor(group)) >fit=lm(y ~ group,data) >anova(fit) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 3 0.049793 0.0165976 55.526 1.065e-05 *** Residuals 8 0.002391 0.0002989

54

Figura 13. Variación dentro de grupos con el tratamiento de 2h con β-

caroteno: 1)MDA-MB-231 con BS 2)MDA-MB-231 con BN, 3)HaCat con BS,

4)HaCat con BN.

2. Tratamiento: 24 Horas con β-caroteno

a) MDA

>y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.0158107 0.0158107 474.32 2.63e-05 *** Residuals 4 0.0001333 0.0000333

Figura 14. Variación dentro del tratamiento de 24h con β-caroteno en la

línea celular MDA-MB-231: 1) Células con BS, 2) Células con BN.

55

b) MDA con control interno

>y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) >y3=c(.401, .414, .382) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.0242607 0.0121303 111.74 1.787e-05 *** Residuals 6 0.0006513 0.0001086

c) Hacat

>y1=c(.246, .216, .228) >y2=c(.228, .216, .217) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.00014017 0.00014017 1.0294 0.3677 Residuals 4 0.00054467 0.00013617

Figura 15. Variación dentro del tratamiento de 24h con β-caroteno en la

línea celular HaCat: 1)Células HaCat con BS, 2)Células HaCat con BN.

56

d) Hacat con control interno

>y1=c(.246, .216, .228) >y2=c(.228, .216, .217) >y3=c(.296, .271, .275) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.0063007 0.00315033 20.878 0.001983 ** Residuals 6 0.0009053 0.00015089

e) MDA vs HaCat (Todos los tratamientos) >y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) >y3=c(.246, .216, .228) >y4=c(.288, .216, .217) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 3 0.045275 0.0150916 30.198 0.0001031 *** Residuals 8 0.003998 0.0004997

Figura 16. Variación entre grupos con el tratamiento de 24h con β-

caroteno. Células MDA-MB-231 con BS, 2) Células MDA-MB-231 con

BN, 3)Células HaCat con BS, 4) Células HaCat con BN