Tesi di Laurea Triennale Anna Pezzutto · Opportunitàdi confrontare proteine con un backbone...

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Tesi di Laurea Triennale Anna Pezzutto

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Tesi di Laurea Triennale

Anna Pezzutto

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� Glicoproteine transmembrana eterodimeriche (α/β)

� 18 subunità α e 8 β che si possono assemblare in 24

diversi eterodimeri

� Mediano interazioni cellula-cellula e cellula-matrice ancorandosi internamente al citoscheletro

� Trasducono numerose vie di segnalazione

� Ruolo chiave in vari processi fisiologici e patologici

mediando fenomeni cellulari quali l’adesione, lamigrazione e vasculo- / angio- genesi

RECETTORI INTEGRINICIRECETTORI INTEGRINICI

� Il legame al ligando dipende da:

• stato conformazionale esteso (attivo) o

“genuflesso” (inattivo)

• presenza di cationi divalenti (Ca2+, Mg2+ Mn2+)

� Sequenze consenso lineari basate su Acido Aspartico

o Acido Glutammico legano la maggior parte delle

integrine

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INTEGRINA INTEGRINA αα44ββ11 (VLA(VLA--4)4)

� Eterodimero composto dalla subunità α4 (155 kDa) e dalla subunità β1 (150 kDa)

� Pattern di espressione prevalentemente leucocitario

� Coinvolta in: • trafficking leucocitario

• adesione e migrazione cellulare in vivo

• sviluppo di malattie infiammatorie ed autoimmunitarie

• sviluppo di metastasi

• ruolo emergente nell’angiogenesi

� Principali ligandi: VCAM-1 e Fibronectina (splicing variant)

α4β1 riconosce e lega il

motivo LDV localizzato

nel Connecting Segment

1 (CS-1) derivante da

splicing alternativo del

connecting segment di

tipo III (IIICS) della

Fibronectina

SEGMENTO CS1 (25 aa)

DELPLVTLPHPNLHGPEILDVPST

SEGMENTO CS1 (25 aa)

DELPLVTLPHPNLHGPEILDVPST

PEPTIDE CS1 (8 aa)

EILDVPST

PEPTIDE CS1 (8 aa)

EILDVPST

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EMILIN1EMILIN1

EElastinlastin MMicrofibrilicrofibril IInterfacenterface LLocated proteocated proteININ

� Glicoproteina non collagenica della matrice extracellulare del peso molecolare di 115 kDa

� Espressa abbondantemente nei tessuti ricchi di elastina (vasi sanguigni, tessuti connettivi, pelle,

cuore, polmoni, milza, rene)

Omeostasi della pressione

sanguigna:

regolazione della maturazione

del TGF-β

(Zacchigna et al, 2006)

Elastogenesi e mantenimento della morfologia delle

cellule del tessuto vascolare (Zanetti et al, 2004);

coinvolgimento nella struttura e funzione dei vasi

linfatici (Danussi et al, 2008)

Trimerizzazione di EMILINA1

(Mongiat et al, 2000); adesione,

migrazione e proliferazione cellulari

mediate dall’integrina α4β1

(Spessotto et al, 2003; Spessotto,

Danussi et al, 2006 e 2011)

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� Organizzazione omotrimerica

� Localizzazione C-terminale

� 151 (anziché 140) residui aa

� 9 (anziché 10) β-strand

� La presenza di un loop flessibile,

non strutturato, risultante da

un’inserzione di 10 aa unica di

EMILINA1 e 2, localizzato

all’apice del trimero a monte

dello strand mancante

Struttura

IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1

Funzione

� Tra i membri della superfamiglia C1q-TNF, il gC1q di EMILINA1 (e di EMILINA 2) è l’unico

capace di interagire con l’integrina α4β1

� L’interazione è efficiente:

basse concentrazioni di ligando forte adesione e migrazione cellulare

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IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1

� Usando un approccio di mutagenesi diretta è stato dimostrato

che il sito di legame ad α4β1 è localizzato a livello del loop

flessibile (Y927-G945) all’apice della struttura trimerica e che è

assolutamente dipendente dal residuo E933

Interazioni con l’integrina α4β1

� L’utilizzo di sistemi batterici bicistronici ha permesso di

dimostrare che l’interazione tra EMILINA1 e integrina α4β1

necessita la presenza di tre specifici residui di Acido

Glutammico (E933) del trimero, uno per ciascun monomero

INEDITA MODALITAINEDITA MODALITA’’ DI INTERAZIONE CON DI INTERAZIONE CON αα44ββ11 ::

� Per la prima volta viene riportato un sito di legame

per l’integrina su un complesso omotrimerico

� Legame integrinico più complesso rispetto ai canonici

peptidi lineari contenenti sequenze consenso

(Verdone et al, 2008)

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SCOPO DELLA TESISCOPO DELLA TESI

Il lavoro di tesi è organizzato in due parti principali:

1. Generazione di molecole chimeriche del dominio gC1q di EMILINA1 e analisi della stechiometria

di legame

2. Caratterizzazione degli effetti specifici dell'interazione tra C1q di EMILINA1 e l'integrina α4β1 in

fenomeni biologici quali adesione, migrazione e formazione di tubuli in vitro, paragonandoli a

quelli osservabili utilizzando il frammento CS1

Comprendere i meccanismi molecolari e gli effetti biologici dell'interazione

tra EMILINA1 e il recettore cellulare integrinico α4β1 utilizzando come termine

di confronto il peptide CS1 della fibronectina, un ben noto interattore del

medesimo recettore.

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GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q -- CS1CS1

+

1:3/1:10 peso:peso

CS1-BSA COUPLING:CS1-BSA COUPLING:APPROCCIO MOLECOLARE:APPROCCIO MOLECOLARE:

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GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q -- CS1CS1

Dominio chimerico

C1q - CS1.25

frammento

CS1.25

Dominio chimerico

C1q – CS1.8

frammento

CS1.8

POSSIBILI VANTAGGIPOSSIBILI VANTAGGI

POSSIBILI SVANTAGGIPOSSIBILI SVANTAGGI

� Superamento dei problemi di stechiometria incontrati

�Possibilità di testare l’intera sequenza CS1

� Opportunità di confrontare proteine con un backbone identico

� Le proteine chimeriche potrebbero presentare un folding scorretto/inatteso

SDS PAGE 4-20%

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CURVE DI MELTINGCURVE DI MELTING

Dominio

C1q - CS1.25

SDS FREE 12% PAGE

VALUTAZIONE DEL VALUTAZIONE DEL FOLDINGFOLDING PROTEICOPROTEICO

SDS FREE 12% PAGE

DominioC1q – CS1.8

SAGGIO ELISASAGGIO ELISA

1H2G8 Ab monoclonale (0,5 µµµµg/well)556 Ab policlonale (40 ng/well)

� L’inserimento di CS1.25 e CS1.8 nel backbone C1q di EMILINA1, non

altera né folding né stabilità termica del gC1q wt; tutti i domini

chimerici vengono riconosciuti dalle immunoglobuline impiegate

� si trovano nella conformazione spaziale corretta; possono quindi essere

considerati molecole ideali per esperimenti in cui si vogliano

confrontare le caratteristiche di legame all’integrina α4β1 da parte del

gC1q e del CS1

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SAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKATSAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKAT

VALUTAZIONE DELLVALUTAZIONE DELL’’INTERAZIONE DEI INTERAZIONE DEI

DOMINI CHIMERICI CON LDOMINI CHIMERICI CON L’’INTEGRINA INTEGRINA αα44ββ11

� Forte adesione C1q wt mediata

� Perdita di capacità adesiva della

chimera CS1.25 mutata in D

� Differenza molare tra chimera CS1 e

molecola BSA-CS1

� Forte adesione C1q wt mediata

� Alcuna differenza riscontrata tra

l’isoforma wt e mutata della chimera

CS1.8

gC1q – CS1.25

gC1q – CS1.8

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SCOPO DELLA TESISCOPO DELLA TESI

Il lavoro di tesi è organizzato in due parti principali:

1. Generazione di molecole chimeriche del dominio gC1q di EMILINA1 e analisi della stechiometria

di legame

2. Caratterizzazione degli effetti specifici dell'interazione tra C1q di EMILINA1 e l'integrina α4β1 in

fenomeni biologici quali adesione, migrazione e formazione di tubuli in vitro, paragonandoli a

quelli osservabili utilizzando il frammento CS1

Comprendere i meccanismi molecolari e gli effetti biologici dell'interazione

tra EMILINA1 e il recettore cellulare integrinico α4β1 utilizzando come termine

di confronto il peptide CS1 della fibronectina, un ben noto interattore del

medesimo recettore.

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PERCHE’ UN MODELLO BASATO SU CELLULE ENDOTELIALI?

� Studi recenti hanno descritto il ruolo emergente dell’interazione α4β1-VCAM-1/FN nella

maturazione dei vasi sanguigni e nella neoangiogenesi.

�Abbiamo considerato l’ipotesi che interazioni tra EMILINA1/CS1 e α4β1 possano essere

coinvolte nella neoangiogenesi con meccanismi simili

RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END E HUVEC CONSEGUENTI END E HUVEC CONSEGUENTI

ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25

M1

Marker % Gated Median

All 100.00 340.00

M1 78.28 356.00

CELLULE H-END 73

M1

Marker % Gated Median

All 100.00 241.00

M1 0.60 490.00

CELLULE HUVEC

Livelli di espressione opposti

per le due linee cellulari:

L’espressione dell’integrina α4β1 in

cellule endoteliali dipende

apparentemente dalla loro origine, è

variabile e instabile, legata alla fase di

crescita e alla vitalità cellulari

Analisi FACS di cellule H-END 73 e HUVEC

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SAGGI DI TUBULIGENESI IN VITRO

Le cellule endoteliali H-END 73 sono state

cresciute su un coating di MATRIGEL, e

sono stati aggiunti vari stimoli alla

concentrazione di 10 µg/ml (C1q WT di

EMILINA1, C1q Del(L932-G945) di

EMILINA1, chimera C1q-CS1.25 WT o

mutato)

RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI

ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25

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Le cellule trattate con tutti gli stimoli a

disposizione non hanno mostrato alcuna

variazione per quanto riguarda la spontanea

formazione di tubuli al pari di quanto avviene

per il controllo negativo

Ciò suggerisce che l’interazione

dell’integrina α4β1 con tutti i ligandi

testati non interferisce nei fenomeni di

tubuligenesi in vitro

RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI

ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25SAGGI DI TUBULIGENESI IN VITRO

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SAGGI DI WOUND HEALING

Le cellule

endoteliali H-

END 73 sono

state incubate in

terreno senza

siero contente

diversi stimoli

alla

concentrazione

di 10 µg/ml (C1q

WT di EMILINA1,

C1q Del(L932-

G945) di

EMILINA1,

chimera C1q-

CS1.25 WT o

mutato) e

monitorate per

24 ore.

Nessuno degli stimoli testati ha

mostrato un effetto biologico

rilevante sul processo di

migrazione cellulare

RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI

ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25

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CONCLUSIONICONCLUSIONI

� E’ possibile mutagenizzare il dominio gC1q di EMILINA1 sostituendo il loop

destrutturato senza alterare le caratteristiche strutturali e funzionali del backbone

trimerico

� In esperimenti di adesione il dominio gC1q di EMILINA1 è in grado di legare cellule

Jurkat con efficienza fino a 103 superiore rispetto al CS1

� Con le H-END 73, pur esprimenti l’integrina α4β1 non è stato possibile ottenere

adesione né tantomeno effetti in saggi funzionali quali tubuligenesi e riparo di ferite

� MANCATA INTERAZIONE che potrebbe essere spiegata con:

• una scarsa o nulla attivazione dell’integrina stessa in

questo tipo cellulare

• una bassa espressione dell’integrina su questa linea

rispetto alle cellule Jurkat

• una combinazione dei due fattori

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PROSPETTIVE FUTUREPROSPETTIVE FUTURE

� Futuri esperimenti utilizzando saggi con cellule endoteliali in un contesto più

fisiologico, quali ad esempio quelli su tessuto aortico ex vivo (aortic ring assay),

potranno aiutare a superare le difficoltà incontrate e a chiarire un eventuale ruolo

specifico del dominio gC1q nei processi di sviluppo e maturazione vasali.

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La composizione del trimero

gC1q di EMILINA1 è stata

alterata preparando

eterotrimeri con diversi

monomeri gC1qDel(L932-

G945) e gC1q-CS1 WT o

mutato. Per questo è stato

usato un sistema batterico

bicistronico

GENERAZIONE DI ETEROTRIMERI DEL TIPO GENERAZIONE DI ETEROTRIMERI DEL TIPO

gC1q Del(L932gC1q Del(L932--G945) G945) -- CS1.25 WT / MUTCS1.25 WT / MUT

PURIFICAZIONE

Ni - NTA

PURIFICAZIONE

Ni - NTA

L’HIS-TAG fuso al mutante permette la purificazione selettiva

dei trimeri contenenti almeno un monomero gC1q deleto

3 HIS

1 HIS

2 HIS

His-C1q Del /

C1q-CS1.25

mutato

His-C1q Del /

C1q-CS1.25 WT

SDS PAGE 4 – 20 %

SAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKATSAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKAT

� Solo uno dei tre frammenti

CS1 va a fornire la sequenza

lineare attiva per il legame ad

un’unica molecola integrinica

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SAGGIO CAFCA CON CELLULE H-END 73

RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI

ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25

�Le cellule H-END 73 non

presentano alcuna capacità

di adesione in presenza di

tutte le forme saggiate del

dominio gC1q, nemmeno

per il trimero nativo wild

type

�La fibronectina, usata come

controllo positivo, è, invece,

capace di fornire un’alta

percentuale di legame per le

H-END 73 fino a

concentrazioni ridotte (1,1

µg/ml)