Tesi di Laurea Triennale Anna Pezzutto · Opportunitàdi confrontare proteine con un backbone...
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Tesi di Laurea Triennale
Anna Pezzutto
� Glicoproteine transmembrana eterodimeriche (α/β)
� 18 subunità α e 8 β che si possono assemblare in 24
diversi eterodimeri
� Mediano interazioni cellula-cellula e cellula-matrice ancorandosi internamente al citoscheletro
� Trasducono numerose vie di segnalazione
� Ruolo chiave in vari processi fisiologici e patologici
mediando fenomeni cellulari quali l’adesione, lamigrazione e vasculo- / angio- genesi
RECETTORI INTEGRINICIRECETTORI INTEGRINICI
� Il legame al ligando dipende da:
• stato conformazionale esteso (attivo) o
“genuflesso” (inattivo)
• presenza di cationi divalenti (Ca2+, Mg2+ Mn2+)
� Sequenze consenso lineari basate su Acido Aspartico
o Acido Glutammico legano la maggior parte delle
integrine
INTEGRINA INTEGRINA αα44ββ11 (VLA(VLA--4)4)
� Eterodimero composto dalla subunità α4 (155 kDa) e dalla subunità β1 (150 kDa)
� Pattern di espressione prevalentemente leucocitario
� Coinvolta in: • trafficking leucocitario
• adesione e migrazione cellulare in vivo
• sviluppo di malattie infiammatorie ed autoimmunitarie
• sviluppo di metastasi
• ruolo emergente nell’angiogenesi
� Principali ligandi: VCAM-1 e Fibronectina (splicing variant)
α4β1 riconosce e lega il
motivo LDV localizzato
nel Connecting Segment
1 (CS-1) derivante da
splicing alternativo del
connecting segment di
tipo III (IIICS) della
Fibronectina
SEGMENTO CS1 (25 aa)
DELPLVTLPHPNLHGPEILDVPST
SEGMENTO CS1 (25 aa)
DELPLVTLPHPNLHGPEILDVPST
PEPTIDE CS1 (8 aa)
EILDVPST
PEPTIDE CS1 (8 aa)
EILDVPST
EMILIN1EMILIN1
EElastinlastin MMicrofibrilicrofibril IInterfacenterface LLocated proteocated proteININ
� Glicoproteina non collagenica della matrice extracellulare del peso molecolare di 115 kDa
� Espressa abbondantemente nei tessuti ricchi di elastina (vasi sanguigni, tessuti connettivi, pelle,
cuore, polmoni, milza, rene)
Omeostasi della pressione
sanguigna:
regolazione della maturazione
del TGF-β
(Zacchigna et al, 2006)
Elastogenesi e mantenimento della morfologia delle
cellule del tessuto vascolare (Zanetti et al, 2004);
coinvolgimento nella struttura e funzione dei vasi
linfatici (Danussi et al, 2008)
Trimerizzazione di EMILINA1
(Mongiat et al, 2000); adesione,
migrazione e proliferazione cellulari
mediate dall’integrina α4β1
(Spessotto et al, 2003; Spessotto,
Danussi et al, 2006 e 2011)
� Organizzazione omotrimerica
� Localizzazione C-terminale
� 151 (anziché 140) residui aa
� 9 (anziché 10) β-strand
� La presenza di un loop flessibile,
non strutturato, risultante da
un’inserzione di 10 aa unica di
EMILINA1 e 2, localizzato
all’apice del trimero a monte
dello strand mancante
Struttura
IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1
Funzione
� Tra i membri della superfamiglia C1q-TNF, il gC1q di EMILINA1 (e di EMILINA 2) è l’unico
capace di interagire con l’integrina α4β1
� L’interazione è efficiente:
basse concentrazioni di ligando forte adesione e migrazione cellulare
IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1IL DOMINIO gC1q DI EMILINA1
� Usando un approccio di mutagenesi diretta è stato dimostrato
che il sito di legame ad α4β1 è localizzato a livello del loop
flessibile (Y927-G945) all’apice della struttura trimerica e che è
assolutamente dipendente dal residuo E933
Interazioni con l’integrina α4β1
� L’utilizzo di sistemi batterici bicistronici ha permesso di
dimostrare che l’interazione tra EMILINA1 e integrina α4β1
necessita la presenza di tre specifici residui di Acido
Glutammico (E933) del trimero, uno per ciascun monomero
INEDITA MODALITAINEDITA MODALITA’’ DI INTERAZIONE CON DI INTERAZIONE CON αα44ββ11 ::
� Per la prima volta viene riportato un sito di legame
per l’integrina su un complesso omotrimerico
� Legame integrinico più complesso rispetto ai canonici
peptidi lineari contenenti sequenze consenso
(Verdone et al, 2008)
SCOPO DELLA TESISCOPO DELLA TESI
Il lavoro di tesi è organizzato in due parti principali:
1. Generazione di molecole chimeriche del dominio gC1q di EMILINA1 e analisi della stechiometria
di legame
2. Caratterizzazione degli effetti specifici dell'interazione tra C1q di EMILINA1 e l'integrina α4β1 in
fenomeni biologici quali adesione, migrazione e formazione di tubuli in vitro, paragonandoli a
quelli osservabili utilizzando il frammento CS1
Comprendere i meccanismi molecolari e gli effetti biologici dell'interazione
tra EMILINA1 e il recettore cellulare integrinico α4β1 utilizzando come termine
di confronto il peptide CS1 della fibronectina, un ben noto interattore del
medesimo recettore.
GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q -- CS1CS1
+
1:3/1:10 peso:peso
CS1-BSA COUPLING:CS1-BSA COUPLING:APPROCCIO MOLECOLARE:APPROCCIO MOLECOLARE:
GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q GENERAZIONE DI CHIMERE gC1q -- CS1CS1
Dominio chimerico
C1q - CS1.25
frammento
CS1.25
Dominio chimerico
C1q – CS1.8
frammento
CS1.8
POSSIBILI VANTAGGIPOSSIBILI VANTAGGI
POSSIBILI SVANTAGGIPOSSIBILI SVANTAGGI
� Superamento dei problemi di stechiometria incontrati
�Possibilità di testare l’intera sequenza CS1
� Opportunità di confrontare proteine con un backbone identico
� Le proteine chimeriche potrebbero presentare un folding scorretto/inatteso
SDS PAGE 4-20%
CURVE DI MELTINGCURVE DI MELTING
Dominio
C1q - CS1.25
SDS FREE 12% PAGE
VALUTAZIONE DEL VALUTAZIONE DEL FOLDINGFOLDING PROTEICOPROTEICO
SDS FREE 12% PAGE
DominioC1q – CS1.8
SAGGIO ELISASAGGIO ELISA
1H2G8 Ab monoclonale (0,5 µµµµg/well)556 Ab policlonale (40 ng/well)
� L’inserimento di CS1.25 e CS1.8 nel backbone C1q di EMILINA1, non
altera né folding né stabilità termica del gC1q wt; tutti i domini
chimerici vengono riconosciuti dalle immunoglobuline impiegate
� si trovano nella conformazione spaziale corretta; possono quindi essere
considerati molecole ideali per esperimenti in cui si vogliano
confrontare le caratteristiche di legame all’integrina α4β1 da parte del
gC1q e del CS1
SAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKATSAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKAT
VALUTAZIONE DELLVALUTAZIONE DELL’’INTERAZIONE DEI INTERAZIONE DEI
DOMINI CHIMERICI CON LDOMINI CHIMERICI CON L’’INTEGRINA INTEGRINA αα44ββ11
� Forte adesione C1q wt mediata
� Perdita di capacità adesiva della
chimera CS1.25 mutata in D
� Differenza molare tra chimera CS1 e
molecola BSA-CS1
� Forte adesione C1q wt mediata
� Alcuna differenza riscontrata tra
l’isoforma wt e mutata della chimera
CS1.8
gC1q – CS1.25
gC1q – CS1.8
SCOPO DELLA TESISCOPO DELLA TESI
Il lavoro di tesi è organizzato in due parti principali:
1. Generazione di molecole chimeriche del dominio gC1q di EMILINA1 e analisi della stechiometria
di legame
2. Caratterizzazione degli effetti specifici dell'interazione tra C1q di EMILINA1 e l'integrina α4β1 in
fenomeni biologici quali adesione, migrazione e formazione di tubuli in vitro, paragonandoli a
quelli osservabili utilizzando il frammento CS1
Comprendere i meccanismi molecolari e gli effetti biologici dell'interazione
tra EMILINA1 e il recettore cellulare integrinico α4β1 utilizzando come termine
di confronto il peptide CS1 della fibronectina, un ben noto interattore del
medesimo recettore.
PERCHE’ UN MODELLO BASATO SU CELLULE ENDOTELIALI?
� Studi recenti hanno descritto il ruolo emergente dell’interazione α4β1-VCAM-1/FN nella
maturazione dei vasi sanguigni e nella neoangiogenesi.
�Abbiamo considerato l’ipotesi che interazioni tra EMILINA1/CS1 e α4β1 possano essere
coinvolte nella neoangiogenesi con meccanismi simili
RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END E HUVEC CONSEGUENTI END E HUVEC CONSEGUENTI
ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25
M1
Marker % Gated Median
All 100.00 340.00
M1 78.28 356.00
CELLULE H-END 73
M1
Marker % Gated Median
All 100.00 241.00
M1 0.60 490.00
CELLULE HUVEC
Livelli di espressione opposti
per le due linee cellulari:
L’espressione dell’integrina α4β1 in
cellule endoteliali dipende
apparentemente dalla loro origine, è
variabile e instabile, legata alla fase di
crescita e alla vitalità cellulari
Analisi FACS di cellule H-END 73 e HUVEC
SAGGI DI TUBULIGENESI IN VITRO
Le cellule endoteliali H-END 73 sono state
cresciute su un coating di MATRIGEL, e
sono stati aggiunti vari stimoli alla
concentrazione di 10 µg/ml (C1q WT di
EMILINA1, C1q Del(L932-G945) di
EMILINA1, chimera C1q-CS1.25 WT o
mutato)
RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI
ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25
Le cellule trattate con tutti gli stimoli a
disposizione non hanno mostrato alcuna
variazione per quanto riguarda la spontanea
formazione di tubuli al pari di quanto avviene
per il controllo negativo
Ciò suggerisce che l’interazione
dell’integrina α4β1 con tutti i ligandi
testati non interferisce nei fenomeni di
tubuligenesi in vitro
RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI
ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25SAGGI DI TUBULIGENESI IN VITRO
SAGGI DI WOUND HEALING
Le cellule
endoteliali H-
END 73 sono
state incubate in
terreno senza
siero contente
diversi stimoli
alla
concentrazione
di 10 µg/ml (C1q
WT di EMILINA1,
C1q Del(L932-
G945) di
EMILINA1,
chimera C1q-
CS1.25 WT o
mutato) e
monitorate per
24 ore.
Nessuno degli stimoli testati ha
mostrato un effetto biologico
rilevante sul processo di
migrazione cellulare
RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI
ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25
CONCLUSIONICONCLUSIONI
� E’ possibile mutagenizzare il dominio gC1q di EMILINA1 sostituendo il loop
destrutturato senza alterare le caratteristiche strutturali e funzionali del backbone
trimerico
� In esperimenti di adesione il dominio gC1q di EMILINA1 è in grado di legare cellule
Jurkat con efficienza fino a 103 superiore rispetto al CS1
� Con le H-END 73, pur esprimenti l’integrina α4β1 non è stato possibile ottenere
adesione né tantomeno effetti in saggi funzionali quali tubuligenesi e riparo di ferite
� MANCATA INTERAZIONE che potrebbe essere spiegata con:
• una scarsa o nulla attivazione dell’integrina stessa in
questo tipo cellulare
• una bassa espressione dell’integrina su questa linea
rispetto alle cellule Jurkat
• una combinazione dei due fattori
PROSPETTIVE FUTUREPROSPETTIVE FUTURE
� Futuri esperimenti utilizzando saggi con cellule endoteliali in un contesto più
fisiologico, quali ad esempio quelli su tessuto aortico ex vivo (aortic ring assay),
potranno aiutare a superare le difficoltà incontrate e a chiarire un eventuale ruolo
specifico del dominio gC1q nei processi di sviluppo e maturazione vasali.
La composizione del trimero
gC1q di EMILINA1 è stata
alterata preparando
eterotrimeri con diversi
monomeri gC1qDel(L932-
G945) e gC1q-CS1 WT o
mutato. Per questo è stato
usato un sistema batterico
bicistronico
GENERAZIONE DI ETEROTRIMERI DEL TIPO GENERAZIONE DI ETEROTRIMERI DEL TIPO
gC1q Del(L932gC1q Del(L932--G945) G945) -- CS1.25 WT / MUTCS1.25 WT / MUT
PURIFICAZIONE
Ni - NTA
PURIFICAZIONE
Ni - NTA
L’HIS-TAG fuso al mutante permette la purificazione selettiva
dei trimeri contenenti almeno un monomero gC1q deleto
3 HIS
1 HIS
2 HIS
His-C1q Del /
C1q-CS1.25
mutato
His-C1q Del /
C1q-CS1.25 WT
SDS PAGE 4 – 20 %
SAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKATSAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKAT
� Solo uno dei tre frammenti
CS1 va a fornire la sequenza
lineare attiva per il legame ad
un’unica molecola integrinica
SAGGIO CAFCA CON CELLULE H-END 73
RISPOSTE DI CELLULE HRISPOSTE DI CELLULE H--END 73 CONSEGUENTI END 73 CONSEGUENTI
ALLALL’’INTERAZIONE TRA INTERAZIONE TRA αα44ββ11 E DOMINI gC1q E DOMINI gC1q –– CS1.25CS1.25
�Le cellule H-END 73 non
presentano alcuna capacità
di adesione in presenza di
tutte le forme saggiate del
dominio gC1q, nemmeno
per il trimero nativo wild
type
�La fibronectina, usata come
controllo positivo, è, invece,
capace di fornire un’alta
percentuale di legame per le
H-END 73 fino a
concentrazioni ridotte (1,1
µg/ml)