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1 TEMA 1.- TÉCNICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA (I) 1ª PARTE (1.1 a 1.3) 1.1.- Introducción a las técnicas bioquímicas 1.2.- Las técnicas espectrofotométricas 1.3.-Espectrofotometría de absorción molecular 1.4.- Espectrofotometría de absorción atómica 1.5.- Espectrofotometría de emisión atómica 1.6.- Espectrofotometría de luminiscencia 1.7.- Espectrofotometría de dispersión de la radiación 1.8.- Refractometría de líquidos 1.9.- Fotometría de reflectancia 1.1.- INTRODUCCIÓN La B.C. es la especialidad de las ciencias de la salud que estudia los procesos metabólicos y moleculares que tienen lugar en nuestro organismo. A partir de muestras biológicas, la B.C. determina las magnitudes biológicas: signos clínicos, valores cuantitativos de la química de los procesos metabólicos que se utilizan para conocer el estado clínico de un paciente. Proporcionan información básica en la prevención, diagnóstico, evolución y pronóstico de una enfermedad, así como el seguimiento de la respuesta a un tratamiento. Las magnitudes bioquímicas son muy diversas y se obtienen de distintas muestras biológicas. 1.2.- LAS TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. Estudia la capacidad que poseen las moléculas para absorber y emitir radiación electromagnética.

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TEMA 1.- TÉCNICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA (I)

1ª PARTE (1.1 a 1.3)

1.1.- Introducción a las técnicas bioquímicas

1.2.- Las técnicas espectrofotométricas

1.3.-Espectrofotometría de absorción molecular

1.4.- Espectrofotometría de absorción atómica

1.5.- Espectrofotometría de emisión atómica

1.6.- Espectrofotometría de luminiscencia

1.7.- Espectrofotometría de dispersión de la radiación

1.8.- Refractometría de líquidos

1.9.- Fotometría de reflectancia

1.1.- INTRODUCCIÓN

La B.C. es la especialidad de las ciencias de la salud que estudia los procesos

metabólicos y moleculares que tienen lugar en nuestro organismo.

A partir de muestras biológicas, la B.C. determina las magnitudes biológicas: signos

clínicos, valores cuantitativos de la química de los procesos metabólicos que se utilizan

para conocer el estado clínico de un paciente.

Proporcionan información básica en la prevención, diagnóstico, evolución y pronóstico

de una enfermedad, así como el seguimiento de la respuesta a un tratamiento.

Las magnitudes bioquímicas son muy diversas y se obtienen de distintas muestras

biológicas.

1.2.- LAS TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones

químicas y biológicas. Estudia la capacidad que poseen las moléculas para absorber y

emitir radiación electromagnética.

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Las REM son formas de energía que cuando se hacen incidir sobre una muestra que

contiene un compuesto que se pretende analizar, ocurren diferentes fenómenos que se

pueden medir y que aportan información sobre el analito que se estudia.

Las técnicas espectrofotométricas son aquellas que se basan en la medición de REM

por sus propiedades de interacción con la muestra.

En B.C. las principales REM que se utilizan son la luz visible, la luz ultravioleta y la

infrarroja.

1.2.1.- Conceptos básicos de las REM

Las radiaciones o energía electromagnética (ELM) es una forma de energía radiante que

se propaga:

- Mediante ondas: son oscilaciones del campo electromagnético que vibran

perpendicularmente entre sí y de forma asociada se propagan en el espacio. Sus

magnitudes son:

o Amplitud(A): desviación máxima en relación a su valor medio.

o Longitud de onda (λ) es la distancia entre dos crestas de un ciclo

completo del movimiento ondulatorio. Se expresa en nm.

o Frecuencia (γ) es el número de ondas que se produce en un segundo

(Hz).

- Mediante partícula: como fotón1 (partícula de energía). Se relaciona con la

frecuencia y con la longitud de onda mediante la expresión siguiente:

1 El fotón presenta tanto propiedades corpusculares como ondulatorias ("dualidad onda-corpúsculo").

Se comporta como una onda en fenómenos como la refracción que tiene lugar en una lente; sin embargo, se comporta como una partícula cuando interactúa con la materia para transferir una cantidad fija de energía. La luz son paquetes discontinuos de energía la cual depende de su frecuencia y de su longitud de onda.

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E= h.γ (h= cte de Plank)

λ = c /γ .

E=h.c/ λ

La letra griega lambda (λ), representa la longitud de onda. La letra griega (γ)

representa la frecuencia de esa onda. La letra “c” representa la velocidad de la luz en el

vacío.

Se deduce pues que:

- Cuanto mayor frecuencia, mayor energía

- Cuanto mayor es la longitud de onda menor es su energía

El espectro electromagnético cubre un amplio intervalo de energía radiante, que

se ordena en regiones.

El ojo humano responde a la REM entre los 380 y 750 nm (espectro visible), por

encima y por debajo se encuentran las infrarrojas y las UV. Son estos tres tipos de

radiaciones las que se utilizan en las técnicas espectrofotométricas. En el espectro

visible la luz se descompone en colores (a cada color le corresponde una longitud de

onda diferente).

1.2.2.-Fenómenos de interacción entre luz y materia.

Cuando un haz de luz incide sobre la materia se producen varios fenómenos que tienen

aplicación en las técnicas espectrofotométricas. Los más utilizados son:

- Transmisión: la radiación incide sobre una sustancia sin producirse pérdida de

energía ni cambios de dirección.

- Absorción: se produce una pérdida de E y la absorben las moléculas o partículas

que pasan a un estado excitado (depende de las características de la partícula, λ,

etc,). La partícula tiende a regresar a su estado de reposo desprendiendo la

energía absorbida en forma de calor.

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Aº + h.γ A* Aº + calor

- Emisión: cuando la molécula o átomo en estado excitado libera su energía y

vuelve a su estado de reposo

Aº + h.γ 1 A* Aº + h.γ2

- Dispersión El haz de radiación choca con la partícula en suspensión y cambia de

dirección sin cambiar su energía.

- Refracción: el haz de radiación al atravesar una solución cambia de dirección.

- Reflexión: el haz de luz, al incidir en una superficie, rebota y cambia de

dirección.

- Difracción. El haz de luz se desvía al pasar por el extremo de una superficie o al

atravesar una rendija.

Por tanto, la espectroscopia es el estudio de la interacción entre la luz y la materia, que

podemos cuantificar y aplicarla a la cuantificación de magnitudes bioquímicas. Las

técnicas espectrofotométricas se pueden clasificar en:

1.2.3.- El espectrofotómetro

Es el equipo que se utiliza en las técnicas espectrofotométricas. Su diseño varía en

función de la técnica que utilice, pero todos constan de unos elementos comunes:

A) Fuente de radiación. Es el componente que proporciona la energía radiante.

Según el tipo de espectro y las longitudes de onda que emitan se distingue entre:

a. Fuentes de espectro continuo. Se usan en las técnicas de absorción

molecular (UV, VIS e IR) y de emisión molecular por fluorescencia. Las

más comunes son:

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i. Lámparas de filamento de tungsteno (wolframio). Emite

longitudes de onda del espectro UV y VIS (360 a 950 nm).

ii. Lámparas de filamento de haluro de tungsteno. Emiten en la

mismas longitudes de onda que la anterior, pero con más

intensidad

iii. Lámparas de hidrógeno y deuterio. Producen un espectro

continuo en la región UV.

iv. Lámpara de arco de xenón o mercurio. Dan altas intensidades

entre 200 y 1000 nm.

v. Fuentes de espectros de líneas. Emiten radiaciones en forma de

líneas discretas. Se emplean en técnicas de absorción atómica y

de emisión molecular por fluorescencia. Las más comunes son las

lámparas de vapores de mercurio, de vapor de sodio y de cátodo

hueco.

b. Fuentes de luz láser. Permiten aplicar luz completamente

monocromática, sin ancho de banda.

B) Monocromador. Es un dispositivo óptico que permite seleccionar y transmitir

una radiación monocromática a partir de la luz generada por la fuente de

emisión. Consta de:

a. Rendija de entrada. Elemento que evita la entrada de luz dispersa. Suelen

ser lentes colimadoras que colecta el rayo de luz y los organiza en haces

paralelos.

b. Selector de longitud de onda. Modifica la longitud de onda de la

radiación. Se caracterizan por al ancho de banda (intervalo de longitudes

de onda) que pueden seleccionar. Cuanto más estrecho es el ancho de

banda, más pura será la radiación que incida sobre la muestra y más

exactos los valores obtenidos. Hay dos tipos:

i. Redes de difracción. Consiste en un gran número de hendiduras

paralelas trazadas sobre un vidrio o una superficie metálica. Cada

hendidura se comporta como un prisma cuando incide un haz de

luz sobre ellas.

ii. Prismas. Son elementos en forma de cuña que descomponen un

haz de luz en sus distintas longitudes de onda.

c. Rendija de salida. Deja pasar la parte del abanico desplegado por la red o

el prisma que corresponde a las longitudes de onda seleccionadas y lo

dirige hacia la cubeta.

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C) Cubetas. Son los recipientes en que se coloca la muestra. Pueden ser de distintos

tipos y tamaños, pero todas tienen un ancho de 1 cm. Se fabrican en materiales

que no absorben a la longitud de onda deseada: plástico para la luz visible y

cuarzo para UV.

D) Detector. Está basado en el efecto fotoeléctrico, es decir, que los fotones que

inciden sobre un material liberan electrones que producen una corriente

eléctrica, la cual se puede amplificar. Su cometido es convertir la respuesta

lumínica en una señal eléctrica medible. Dependiendo del tipo de luz con el que

se trabaja existen distintos tipos de detectores:

a. Célula fotovoltaica o fotocélulas o fotodiodo. El haz de luz incide sobre

un diodo produciendo un flujo de electrones que se puede medir con un

amperímetro.

b. Fototubos o fototubos multiplicadores. La luz incide sobre un cátodo

fotosensible que desprende electrones, los cuales pasan a un ánodo o a

varios dínodos para amplificar la corriente.

c. Detectores de carga acoplada. Son semejantes a los usados en fotografía

digital.

E) Sistema de registro y lectura. La energía eléctrica del detector se refleja en

sistemas de lecturas y presentación de datos. Estos pueden ser:

a. Sistemas de lectura directa, generalmente asociada a la detección con

fotocélulas. Utilizan un Galvanómetro.

b. Sistema de amplificación de señal, generalmente asociada a aparatos con

fototubos. Usa sistemas Digitales, Ordenador, Impresora.

D) Tipos de espectrofotómetros. Según la disposición de sus componentes se

pueden distinguir tres:

1.- Espectrofotómetro de haz simple. Tiene los componentes ya estudiados.

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2.- Espectrofotómetro de doble haz: en el tiempo. Tiene un dispositivo reflectante

(Chopper) que permite a la radiación procedente del monocromador a seguir

alternativamente dos direcciones, una hacia el blanco y otra hacia la muestra.

3.- espectrofotómetro de doble haz en el espacio. Todos los componentes están

duplicados excepto la lámpara, por lo que dos haces de luz llegan al mismo tiempo a

dos muestras.

1.3. ESPECTROFOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR

Se basa en la capacidad de las moléculas de absorber una parte de la radiación que

reciben. Las longitudes de onda que cada sustancia absorbe son características de cada

molécula y por lo tanto se puede usar para identificarla. El análisis de esta absorción

puede ser:

a) Cuantitativo. Se realiza con radiaciones del espectro UV y VIS. Es el más

usado en los laboratorios de bioquímica

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b) Cualitativo. Se realiza con radiaciones del IR y en laboratorio clínico se usa

fundamentalmente para análisis de la composición de cálculos.

1.3.1.- La absorción molecular.

Cuando una molécula absorbe REM pasa de un estado de reposo a otro de mayor

energía o excitado (cambio de energía en los electrones y en su estructura electrónica),

que se conoce como transiciones (depende del tipo de enlace entre sus átomos y de la

longitud de onda que le incida). Las radiaciones de mayor energía UV-VIS son capaces

de producir transiciones electrónicas entre átomos, las IR de menor energía son sólo

capaces de producir transiciones de vibración o rotación en la moléculas y se usan para

análisis cualitativos.

Para medir la absorción de energía radiante que caracteriza a una molécula se utilizan

dos términos: transmitancia y absorbancia. La transmitancia (T) es el cociente entre la

intensidad de la luz transmitida (It) y la intensidad de la luz incidente (Io). No tiene

unidades y se da en %

%T= It/Io x 100

En la práctica esta magnitud no se maneja por ser exponencialmente inversa a la

concentración de la muestra y al ancho de la cubeta. Los espectrofotómetros miden la

transmitancia, pero hacen cálculos logarítmicos automáticamente para convertirla en

absorbancia que es lineal y positiva a la concentración de la muestra.

Cuando se estudian las absorbancias para un rango de longitudes de onda se obtiene el

Espectro de absorción (PRÁCTICA 1) que se define como el conjunto de bandas

(transiciones electrónicas) que indican la cantidad de luz absorbida por una sustancia a

diferentes valores de longitudes de onda. Se representan en un gráfico relacionando la

longitud de onda que incide sobre una sustancia y su absorbancia. Cada cromógeno

(sustancia absorbente) tiene un espectro de absorción característico. De ahí su utilidad

para seleccionar la longitud de onda más adecuada para realizar una medición

cuantitativa (longitud de onda a la que la absorción es máxima), como para fines de

identificación cualitativa.

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1.3.2.- La ley de Lambert-Beer.

La espectrofotometría de absorción consiste en la medida de la radiación que llega a un

detector tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia

absorbente. En química clínica las medidas se hacen dentro del espectro comprendido

entre 220 nm a 800 nm.

Está basada en la Ley de Lambert-Beer la cual indica que la absorbancia (A) es

directamente proporcional a la absortividad o coeficiente de extinción molar (1 mol/cm)

de una solución (a), a la anchura de la cubeta (b) (1 cm) y a la concentración de la

muestra (c).

A = a.b.c A= 1 . 1 . C de lo cual se deduce que:

A = C

Es decir, que la absorbancia de una sustancia es directamente proporcional a su

concentración.

Cuando un haz de luz incide en una disolución, parte de la energía queda retenida en la

muestra (Absorbancia) y parte de ella se transmite (Transmitancia). Tanto la absorción

como la transmisión dependen de la concentración de la solución. La relación entre la

concentración y la absorbancia es directamente proporcional, mientras que en la

transmitancia es inversa y logarítmica. Por lo que usaremos, fundamentalmente, la

absorbancia para la medida de concentración de sustancias.

1.3.3.- La aplicación de la Ley de Lambert-Beer nos permite medir la concentración

de una sustancia (analito) en una solución, basándose en la relación lineal entre

absorbancia y concentración. Se puede realizar de dos maneras:

– Por comparación con una solución conocida (patrón o standard):

Ap = Cp

Apr = Cpr

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-Mediante una curva de calibración (PRÁCTICA 2). Consiste en la

representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia frente a concentración.

Se elabora ensayando varias soluciones de concentración conocida y determinando sus

absorbancias. La concentración de la solución problema se averigua interpolando su

absorbancia en la recta de calibración.

Límite de linearidad. Es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre

las cuales existe una relación lineal entre concentración y absorbancia, es decir,

se cumple la Ley de L-B. Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los

límites de linearidad, la Ley de L-B deja de cumplirse, convirtiéndose la recta en

una curva. Cuando la lectura de una absorbancia queda fuera de los límites de

linearidad, hay que diluir la muestra para que su concentración entre dentro de

los límites de linearidad.

1.3.4.- Aspectos prácticos de la espectrofotometría.

A) BLANCO.- Antes de medir la muestra debemos eliminar aquellas absorbancias que no

son debidas a la sustancia que queremos medir (disolvente, cubetas, otras sustancias en

disolución etc.). La determinación de estas absorbancias se conoce con el nombre de

y = 0,335x - 0,030R² = 0,998

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ab

sorb

acia

(460

nm

)

Concentración mg/mL

Regresión lineal

Series1

Lineal (Series1)

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blancos. Estos establecen una línea basal de absorbancias sobre la que se aplica la ley de

Lambert-Beer, la cual realmente sería:

A= axbxc+n

Siendo n la absorbancia de los blancos.

Para que se cumpla la Ley de Lambert-Beer (absorbancia directamente proporcional a la

concentración del analito) se debe anular (restar) la absorbancia de los blancos. Para ello

se pone a 0 el espectrofotómetro con una «solución blanco».

En la práctica, el blanco, consiste en una solución que no contiene el analito a analizar.

Con él se pone el espectrofotómetro a cero (con ello se anula la absorbancia

correspondiente a sustancias en la disolución que no corresponden a la sustancia a

ensayar y a la cubeta). Se pueden emplear varios tipos:

- Blanco de agua destilada (el más habitual).

- Blanco de reactivo: se prepara con los mismos reactivos a añadir a la muestra

problema para ensayar un analito.

- Blanco de suero: se utiliza el suero del paciente sin reactivos que interaccionen

con el analito a medir.

B) FACTOR DE CALIBRACIÓN (K o F).- Comparando la concentración de la muestra con

una solución de concentración conocida de la misma muestra

Ap= axbxcp Am= axbxcm

Cm = F. Am

c) PATRÓN O STANDARD: disolución que contiene una o dos sustancias de concentración

conocida.

d) MUESTRA PROBLEMA: sangre, suero, orina, plasma, LCR, etc a la que se añaden

reactivos apropiados para poder cuantificar un determinado analito.

e) SUERO CONTROL: disolución que contiene gran cantidad de analitos de concentración

conocida. Su finalidad es verificar que los resultados obtenidos para la muestra

problema son fiables. Los analitos pueden encontrarse en concentraciones normales o

patológicas.

C pr

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Desviaciones de la ley de Lambert-Beer. Básicamente pueden ser de dos tipos:

2)Desviaciones instrumentales:

- Alteraciones en la luz incidente, por ejemplo que no sea monocromática.

- Errores en la rendija de salida.

- La cubeta: calidad del material, deterioro, rayaduras, huellas grasas, …

- Detector, ejemplo cuando llega luz procedente de otros lugares distintos al de la

fuente de luz

2) Desviaciones químicas:

- ph de la solución

- Absorbancia del solvente: si es significativa con la del soluto

- Interferencias: otros compuestos que absorben a la misma longitud de onda, etc

1.3.5.- Tipos básicos de medición

La mayoría de las magnitudes bioquímicas (analitos), no absorben luz, por lo

que hay que someterlos a una serie de reacciones para obtener, una sustancias

mensurable.

A + R = Sm

Cuando la reacción da lugar a sustancia que absorben dentro del espectro visible, de

denomina método colorimétrico.

Cuando una reacción es mediatizada por enzimas, se denomina método enzimático.

En ambos tipos de reacciones, el cálculo de las magnitudes bioquímicas se divide en

tres grandes grupos:

- Punto final. Significa que la reacción entre muestra y reactivos se ha producido

completamente y la concentración del analito es directamente proporcional a la

concentración de algunos de los productos formados, que es el que se mide

espectrofotométricamente. En ellos se cumple la ley de L-B. requiere uso de

patrón y debe esperarse para medir, que transcurra el tiempo necesario para que

se lleve a cabo toda la reacción entre reactivos y analitos.

- Análisis de velocidad o cinético. En ellas se mide la velocidad de reacción antes

de que ésta concluya. Las condiciones de temperatura y tiempo de medida deben

ser muy estrictas para garantizar los resultados. No requiere patrón o standard y

mide la variación de la absorbancia durante la reacción entre reactivos y analitos

durante varios minutos.

- Análisis mixtos, (cinéticos con patrón). No hay que esperar a que la reacción

termine. Suele hacerse dos mediciones en el tiempo, pero se compara frente a un

patrón.

1.3.6- Cálculo de la actividad enzimática.

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La concentración de enzimas en suero es muy baja pero dado que tiene gran capacidad

catalítica es posible determinar su actividad y presuponer que es directamente

proporcional a su concentración.

El cálculo de su actividad se realiza midiendo su velocidad de reacción de dos formas:

- Midiendo la cantidad de sustrato que desaparece

- Midiendo la cantidad de producto que se forma

Todas las reacciones enzimáticas deben hacerse en condiciones estrictas de ph,

temperatura, tiempos y concentraciones de reactivos.

Métodos a punto final. Puede ser :

- A un punto: (la enzima no tiene periodo de incubación)

- A dos puntos: (cuando sí tiene. Se realiza una medida tras el

periodo de incubación y otra al final de la reacción)

Métodos cinéticos. Se leen las absorbancias cada minuto durante 3 a 5

minutos. Ventajas: detectan desvíos de linealidad entre las medidas.

1.3.7.- Espectrofotometría de infrarrojos

En bioquímica clínica se utiliza para averiguar la composición química de los cálculos

urinarios.

La espectroscopia infrarroja es usada con mayor frecuencia como un medio para

identificar sustancias químicas y analizar sus composiciones debido a que la absorción

de determinadas longitudes de onda indican qué grupos químicos están presentes en la

molécula y, a veces, cómo están enlazados. Aunque los patrones de los movimientos de

vibración de moléculas poliatómicas grandes son complejos, grupos químicos

específicos producen bandas características en un espectro infrarrojo. Estos son

conocidos como grupos vibracionales y reflejan generalmente las vibraciones

extensoras de enlaces individuales

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PRÁCTICA 1.- CURVA DE ABSORCIÓN

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PRÁCTICA 2.- CURVA DE CALIBRACIÓN