Gestión del gluten en la Industria Alimentaria

20 0ctubre 2006 Barcelona

Enrique MéndezCentro Nacional de Biotecnología

Técnicas necesarias para garantizar el gluten en alimentos

grupobonmacor

ATROFIA TOTAL-SUBTOTAL

GLUTEN

¿ComponentesTóxicos ?

α β γ ωGliadinas (trigo)Hordeinas (cebada)

Secalinnas (centeno)

La enfermedad Celiaca es una intolerancia a lasprolaminas de trigo de la cebada y del centeno

Prevalencia de 1-200

El único tratamiento para las personas con enfermedad celiaca es una dieta de por vida sin-gluten

Codex

Los alimentos sin-gluten para los celiacos tienen que estar exentos de los cereales tóxicos:trigo, cebada centeno (avena)

Sin-gluten por naturaleza (20 ppm)

Sin-gluten elaborados (200 ppm)

Para medir el gluten en alimentos sin-glutense necesitan métodos fiables

(100 ppm) PWG

Medicamento

celiacos

Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor TIFF (LZW).

No hay total garantíadel control del gluten en alimentos para celiacos

¿Donde está el gluten?

trigotrigo

maizmaiz

arrozarroz

centenocenteno

cebadacebada

avenaavena

+Falsos positivosFalsos negativos Extracción / Detección-

hidrolizados calentados modificados

gluten1. Los ingredientes de los alimento son muy complejos

Glutensin calor

harinas arrozalmidones

Glutencon calor

papillassojagalletaspaneschocolates

Glutenhidrolizado

siropes cervezasalmidones

Glutencon calor

hidrolizado

papillasalmidónalimentos ????cereales desayuno

Extracción de gluten de alimentos tratadosy no tratados con calor

almidones

TECNICAS COMPLEMENTARIAS NECESÁRIAS PARA CUANTIFICAR Y CONFIRMAR LOS NIVELES DE GLUTEN EN ALIMENTOS

No tratados calor

extracción

CocktailEtanol 60%

Tratados con calor

SandwichSandwichR5R5--ELISAELISA

Espectrometria de Masas

4x PCR cuantitativaDNA de trigoDNA de cebadaDNA de centeno

DNA trigo+cebada+centeno

Western Blot-R5

Técnicas Confirmatorias

ELISAELISA--R5R5CompetitivoCompetitivo

Hidrolizados

Etanol 60%

Gluten nativo

Gluten hidrolizado

ALIMENTOS

Gel agarosa

Glutensin calor

60% etanol

ELISA-R5Sandwich

harinas arrozalmidonessojaalforfón

Glutencon calor

cocktail

papillassojagalletaspaneschocolates

cocktail

ELISA-R5Competitivo

Glutenhidrolizado

60% etanol

siropes cervezasalmidones

Glutencon calor

hidrolizadopapillasalimentos/almidónalimentos ????cereales desayuno

60% etanolcocktail

Elección del tipo de extracción y del método de análisis para alimentos sin-gluten

MALDI-TOF Western blot PCR

Técnicas confirmatorias

Es insensible a la CEBADA

0

0,5

1,0

1,5

0,001 0,01 0,1 1 10

Trigo

Centeno

Cebada

Anticuerpo

ω

20 ppm

ELISA-ω

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

1 10 100 1000

Transia-GliadinPWG-GliadinSigma-GliadinGluten RM 8418

ω antibody

Cebada

Trigo

0,001 0,01 0,1 1 10

1,0

2,0

xx

xx

xx

Centeno

Anticuerpo R5

3 ppm

ELISA-R5

Detecta péptidos tóxicosQQPFP y el 33 mer

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 1 10 100 1000

Mea

n A

450

Sigma-Gliadin

PWG-Gliadin

R5 antibody

2001-2006

HolandaIrlanda

U.K

Alemania

España

ELISA-ω- Skerrit: Método oficial

Italia

Austria

Noruega Suecia Suiza Finlandia

2006ELISA- R5

R5

R5R5

R5

R5

R5

ω

No hay método oficial

R5 R5 R5

R5

1991-2006

Países del mundo que utilizan y distribuyen los kits ELISA-R5 de las casas comerciales Biopharm, Ingenasa and Diffchamb

Europa

America del Norte

America delSur

1. U. K 2. Belgium3. Sweden

4. Netherlands

5. Germany

6. France

7. Italy

8. Spain

9. Finland

10. Austria11. Switzerland

12. Ireland

13. Poland14. Croatia

20. Czech Republic

16. Slovakia

17. Slovenia

18. Hungary

19. Romania

15. Bulgaria

21. Serbia

28.USA29. Canada

32. Chile33. Brasil

27. Russia

24. Greece23. Portugal

26. Norway

25. Luxemburg

22. Malta

34. Mexico

35. Argentina

39. Japan

36. Hong Kong37. Israel38. Korea

Asia

Australia

30. Australia31. New Zealand

40. South Africa

Africa

R5 -ELISA kits

INGEZIM GLUTENGLIADIN KIT(R-7001)

FAST GLIADIN(R-7002)

Quit GLIADIN(R-7003)

R-Biopharm

Ingenasa

TRANSIA PROLAMIN

R5 R5R5

1

2

5

3

Diffchamb

4

Operon

STICKS GLUTEN 6

Kits comerciales de ELISA y tiras basados en el anticuerpo R5

Heat

Nuevo sistema eficaz de extracción de Gluten en alimentos tratados y no tratados con calor

95-98 % Gluten

Cocktail

1 2 4 50

200

ppm

3Alimentos tratados con calor

% recuperados con 60% etanol

Valores reales de gluten

98 94

94

95

98

% recuperados con Cocktail

Límite de detección : 3 ppm gliadinas

Recuperación: 90-96 %

Reproducibilidad :

Repetitividad :

7.7 %

4.7 %

Basado en el anticuerpo R5

Sistema de ELISA competitivo para medir gluten hidrolizado

Cervezas Extractos de maltaSiropes

Papillas infantiles

50

CervezasELISA Sandwich-R5

ppmgiuten

Czech Republic Spain

Belgium France Ireland Denmark

50

25

USA HollItaly

AustrGermEngl

Mexico

Finland

20

10

ppmgluten

ELISA Competitivo -R5

cervera Lote ELISA R5Sándwich

ELISA R5Competitivo

Laitila primera cerveza de malta de cebada sin gluten del mundo

12342 TGX-629

12343 EKX-752

12344 YAN-898

12345 EKX-752

12346 TGX-629

12347 UIK-448

12348 YAN-898 / A

12349 YAN-898 / B

12350 TGX-629

12351 YAN-898

12352 EKX-752

12353 YAN-898

12354 TGX-629

12355 TGX-629

12356 EKX-752

12357 TGX-629

< 6

< 6

9

< 6

< 6

9

10

< 6

< 6

< 6

< 6

< 6

< 6

< 6

7

8

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

< 3

0

10

20

1 2 3 4 5 6 7 8 1510 11 12 13 14 169

Tratados con calorParcialmentehidrolizados

ppmgluten

R5 Sandwich

Papillasinfantiles

Nativas

1917 gliadinas

Hidrolizadas

18 19 2017 21

R5 competitivo

Detección de gliadinss en alimentos por Espectrometría de Masas MALDI-TOF M S

Basado on observación directa del típico pérfil de gliadinas permitiendo la identificación de gliadinas en alimentos

α γgliadinss

Alimento

Alimento

Espectrómetro de Masas

31394

33981

38638(6208)

56 ppm gliadins(R5-ELISA)100

18000 60000

100

3154135191

38637

4185254852

164 ppm gliadins (R5-ELISA)

(6683)

Mass (m/z)

α, β, γ

18000 60000

100

Mass (m/z)

ω

31310 35101

(7700)

50 ppm gliadins (R5-ELISA)

Identificación directa de gliadinas en alimentos por

Espectrometría de masas MALDI-TOF MS

DNA

Sensibilidad0.5 ppm

PCR

Geles de agarosa

systemas de PCR

3. Centeno

1. Trigo

2. Cebada

4. Trigo +Cebada+Centeno

Sistema de PCR cuantitativo en tiempo real para la detección de DNA de trigo, de cebada y de centeno

(método no inmunológico)

Sirope 1

Cerveza 3

Cerveza 2

Cerveza 1

Muestra

Valores en ppm de gluten y en ng DNA/mg

Sirope 2

Sirope 3

Extracto de malta 1

Extracto de malta 3

Extracto de malta 2

Extracto de malta 4

Cereales desayuno 1

Cereales desayuno 2

Cereales desayuno 3

Limitaciones de la PCR como “única” técnica para la cuantificación de gluten en alimentos en los que el ADN está hidrolizado

ELISA-R5

105

32

48

51

10257

4755

55

487

600

697

23

25

Gluten intacto

ELISA-R5

PCR

< 0,5

< 0,5

< 0,5

< 0,5

< 0,5< 0,5

< 0,5

< 0,5

< 0,5

< 0,5

< 0,5

< 0,5

< 0,5

ADN hidrolizado

PCR

Cornflakesmaíz

Aceptados para su consumoen países nórdicos

Alimento Extracción

Sin-gluten

hidrolizados

complejos

Cereales de desayunoPapillas infantiles

Lácticos

Embutidos

calor

Preparación de la muestrasmolienda

Especiales

1000

3000

5000

7000

9000

11000

13000

1 2 3 4 5 13121176 8 9 10 14 15 16 17 18 2625242019 21 22 23 27 28 29 30 31 3332 34 35 36 37 38 4039 41 42 43 44 45 46 47

CNB ELISA-R5

Suecia ELISA-R5

Efecto de la preparación de la muestra en la cuantificación de gluten

Glu

ten

(ppm

)CNB

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

CNB ELISA-R5

Suecia ELISA-R5

Suecia

Suecia

Sin-gluten

hidrolizados

complejos

Cereales de desayunoPapillas infantiles

Lácticos

Embutidos

Lab7Lab1 Lab6Lab5Lab4Lab3Lab2

Los laboratorios existentes en España tienen capacidad tecnólogica y conocimiento suficiente para garantizar con fiabilidad el gluten

en alimentos

Sin-gluten

hidrolizados

complejos

Cereales de desayunoPapillas infantiles

Lácticos

Embutidos

Lab7Lab1 Lab6Lab5Lab4Lab3Lab2

Las empresas que elaboran alimentos sin-gluten o aptos para celiacostienen información real de los problemas analíticos del gluten?

Asociaciones Celiacos

Empresas

Administración

Laboratorios análisis

Información ?

LabLabLabLabLabLab

Laboratorios análisispropios- Consumo

- Consejerías

-Ayuntamientos

ELISA R5 la técnica más común de análisis de gluten en España

¿Todos los laboratorios analíticos trabajan con la misma fiabilidad?

¿ Son comparables los resultados?

Alimento Pesada Extracción ELISA

Sin glutenEspeciales (chocolates)

Balanza Pipetas Pipetas

Placa de ELISA

Aptos-celiacos?(Ingredientes complejos)

Nº muestras por Placa

2 diluciones x 2

1 diluciones x 2

1 dilución

S8S8

S7S7

S6S6

S5S5

S4S4

S3S3

1/25S2S2

1/25S1S1

S8S8

S7S7

S6S6

S5S5

S4S4

S3S3

1/501/25S2S2

1/501/25S1S1

BlS8S8

C+S7S7

S6S6

S5S5

S4S4

S3S3

S2S2

1/25S1S1

Blanco

Control +

Control +

Blanco

2 x 1/25

2 x 1/5018 muestras

2 x 1/25 38 muestras

1 x 1/25 78 muestras

Factor

Precio/muestra

X 4

X 2

X 1

Est

ánda

rE

stán

dar

Est

ánda

r

2 diluciones x 2

1 dilución x 2

1 dilución

1/50

1/25

Media 14 49 47

99

107

14

13

Media 112 81 103

2 Diluciones

1/25

1/50

1/100

1/200

A

49

48

B C

1/200

1/100

D E F

43

50

120

104

82

80

1/100

1/50

Media 736 644 615

301

291

600

873

Media 311 304 296

2 Diluciones1/501/100

1/400

1/800

A

514

775

B C

1/800

1/400

D E F

526

705

314

308

295

313

Media 66

92

110

63

112

Media 113 101

1/50

1/25

119

106

119

189

2 Diluciones

1/100

1/50

1/251/50G H I

1/100

1/200

65

67

168

204

1/50

1/100

1/200

1/100

1/50

1/25

112

Media 66

189 204

92

110

63

112112

Media 113

189

101

1/50

1/25

1 Dilución

204

119

189

2 Diluciones

1/100

1/50

1/251/50

G

65

67

H

168

204

I G H I

(1 Dilución)

Media66 113 101

1/200

1/100

(2 Diluciones)

1/100

1/200

1/50

1/100

119

106

Importante

Dilución 1/25 38 ppm

Dilución 1/25 37 ppm

Dilución 1/50 40 ppmDilución 1/50 39 ppm

media 38 ppm de gluten

Hacer 2 diluciones por duplicado por muestrasy en informe indicar los 4 valores y la media

(aunque el coste sea mayor)

2000

Ayuda del CSIC y la C.A.M a la Unidad de Gluten del CNB para la implantación del Sistema de Calidad

ISO/17025/2000-12-05

ELISA-R5 Western BlotEspectrometría de Masas MALDI-TOF

Responsable Técnico y de CalidadAuditoría por AENOR en 2004-5

Normas ISO

Técnicas analíticas

ELISA R5 Sandwich (Comercial)ELISA R5 Competitivo (No Comercial)PCR T/Cb/ Cn (No Comercial)E. Masas (No Comercial)

Servicio

Al Campo

Mercadona

etc.

Campofrio

C.Tarradellas

Nestle

DanonePizzas

Embutidos

Potitos

Jamones

Lacticos

Zumos

Papillas

Productos que salen con el etiquetado de sin-glutenaptos para celiacos

H. inversores(Joss SRL)

Alimentos de alta complejidadaptos para celiacos

¿Se puede analizar con “garantía” el contenido de gluten de estos alimentos que sale al mercado con la etiqueta de aptos para celiacos?

Sin-gluten

hidrolizados

complejos

Cereales de desayunoPapillas infantiles

Lácticos

Embutidos

Lista de FACE

Lista de SMAP

¿ Actualmente tienen “total” garantía los productos de las lista de lasAsociaciones de Celiacos para ser consumidos por los celiacos ?

El símbolo

No da garantía el control

si no hay responsabilidad

De quien depende la garantía y la responsabilidad

MedicamentoPara ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor TIFF (LZW).

Control

Responsabilidad Administración

Empresas

Recomendar

Medicamento

celiacos

Responsabilidad Administración

Empresas Recomendar

AsociaciónCeliacos

Control

Administración MédicosCientíficosAsociaciones de. Celiacos

Control del gluten en alimentos

FACE SMAP

Empresas

sin-gluten

Laboratorios

análisis

CeliacosConsultoras

Gracias

¿ Con o sin gluten la cuestiónestá en el análisis