Supplementary Materials CLEAN -...

14
Supplementary Materials 1 TABLE S1 2 Overview on generation of isogeneic mutants and their genotypes. 3 strain cID* genotype AA substitutions parent SS WT SC5314 FKS1/FKS1 None CAMT424 FKS1/fks1Δ::FRT None SC5314 CAMT432 FKS1/fks1Δ::FKS1 None CAMT424 RR MH2 CAMT441 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Heterozygous R647R/G; P649P/L CAMT424 CAMT442 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Heterozygous R647R/G; P649P/L CAMT424 CAMT443 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Heterozygous R647R/G; P649P/L CAMT424 RS MH1 CAMT453 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CAMT424 CAMT454 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CAMT424 SR MH1 CAMT455 FKS1/fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CAMT424 CAMT456 FKS1/fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CAMT424 CAMT457 fks1Δ::FRT/fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CAMT424 CAMT458 fks1Δ::FRT/fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CAMT424 CAMT463 fks1Δ:: FKS1 A1939G /fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CAMT457 CAMT464 fks1Δ:: FKS1 A1939G /fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CAMT457 CAMT465 fks1Δ:: FKS1 C1946T /fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CAMT458 CAMT466 fks1Δ:: FKS1 C1946T /fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CAMT458 RR MHO2 CAMT468 fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T /fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Homozygous R647R/G; P649P/L CAMT441 construction ID (cID) 4 5

Transcript of Supplementary Materials CLEAN -...

Page 1: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

Supplementary Materials 1 

TABLE S1 2 

Overview on generation of isogeneic mutants and their genotypes.  3 

strain  c‐ID* genotype  AA substitutions  parentSSWT  SC5314 FKS1/FKS1  None  CA‐MT424 FKS1/fks1Δ::FRT  None SC5314  CA‐MT432 FKS1/fks1Δ::FKS1  None CA‐MT424RRMH2  CA‐MT441 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Heterozygous R647R/G; P649P/L CA‐MT424  CA‐MT442 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Heterozygous R647R/G; P649P/L CA‐MT424  CA‐MT443 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Heterozygous R647R/G; P649P/L CA‐MT424RSMH1  CA‐MT453 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CA‐MT424  CA‐MT454 FKS1/fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CA‐MT424SRMH1  CA‐MT455 FKS1/fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CA‐MT424  CA‐MT456 FKS1/fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CA‐MT424  CA‐MT457 fks1Δ::FRT/fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CA‐MT424  CA‐MT458 fks1Δ::FRT/fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CA‐MT424  CA‐MT463 fks1Δ:: FKS1 A1939G /fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CA‐MT457  CA‐MT464 fks1Δ:: FKS1 A1939G /fks1Δ::FKS1 A1939G Heterozygous R647R/G CA‐MT457  CA‐MT465 fks1Δ:: FKS1 C1946T /fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CA‐MT458  CA‐MT466 fks1Δ:: FKS1 C1946T /fks1Δ::FKS1 C1946T Heterozygous P649P/L CA‐MT458RRMHO2  CA‐MT468 fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T /fks1Δ::FKS1 A1939G C1946T Homozygous R647R/G; P649P/L CA‐MT441construction ID (c‐ID)  4 

   5 

Page 2: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

TABLE S2 6 

Plasmids used for inserting FKS1 mutations into parental strain SSWT.  7 

plasmid name  relevant inserts and cloning sites  parent 

     

pSFS2a     

pSFS2a‐FKS1dr  SacII‐FKS1 3’ region‐SacI  pSFS2a 

pSFS2a‐FKS1drur  ApaI‐FKS1 5’ region‐XhoI‐SAT1‐FLP‐SacII‐FKS1 3’ region‐SacI  pSFS2a‐FKS1dr

pSFS2a‐FKS1reint  ApaI‐FKS1 coding sequence‐XhoI‐SAT1‐FLP‐SacII‐FKS1 3’ region‐SacI  pSFS2a‐FKS1dr

pSFS2a‐FKS1A1939G_reint  ApaI‐FKS1 A1939G coding sequence‐XhoI‐SAT1‐FLP‐SacII‐FKS1 3’ region‐SacI  pSFS2a‐FKS1dr

pSFS2a‐FKS1C1946T_reint  ApaI‐FKS1 C1946T coding sequence‐XhoI‐SAT1‐FLP‐SacII‐FKS1 3’ region‐SacI  pSFS2a‐FKS1dr

pSFS2a‐FKS1_2mut _reint  ApaI‐FKS1 A1939G C1946T coding sequence‐XhoI‐SAT1‐FLP‐SacII‐FKS1 3’ region‐SacI pSFS2a‐FKS1dr

 8 

   9 

Page 3: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

TABLE S3 10 

Primers used for manipulation of nucleic acids and strain construction.  11 

name  sequence (5’ – 3’)* FKS1_55  gctagggccctagccgatcgGAACCGTGTGATCACTCCAC FKS1KO_53  gtcgctcgagCCTTTCCCCCGTTTTACTG FKS1_35  gctaccgcggATTATTTCCAAATGTAACTTTATATATTAG FKS1_33  gtcggagctccgaccgatcgCTTTTATGGTCGTGTTCGGGTG FKS1clo_53  gtcgctcgagCCTTTCCCCCGTTTTACTG FKS1_55_2  CAGATTCATCAGATCTCAAGTTTATG FKS1_33_2  CCTCTTCCTCCTATTATCAGACC FKS1_A1939G_fwd  GACATTGTCTTTAgGAGATCCTATTAG FKS1_A1939G_rev  CTAATAGGATCTCcTAAAGACAATGTC FKS1_C1946T_fwd  GTCTTTAAGAGATCtTATTAGAAACTTG FKS1_C1946T_rev  CAAGTTTCTAATAaGATCTCTTAAAGAC FKS1_A1939G_C1946T_fwd  GACATTGTCTTTAgGAGATCtTATTAGAAACTTG FKS1_A1939G_C1946T_rev  CAAGTTTCTAATAaGATCTCcTAAAGACAATGTC lower case and upper case letters denote exogenous and endogenous sequences, respectively 12 

   13 

Page 4: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

Table S4. Statistical significance calculation using Kruskal‐Wallis test and Dunnett's multiple comparisons.  14 

Outlier within the placebo treated control groups (P < 100 CFU/ml kidney homogenate) were excluded from calculations. Statistical significance is 15 

indicated as follows: P < 0.05 (*), P < 0.01 (**), P < 0.001 (***).  16 

  SclANI500  SclANI100  SclCAS500  SclCAS100  SclMICA500  SclMICA100  RRclANI500  RRclANI100  RRclCAS500  RRclCAS100  RRclMICA500  RRclMICA100  RRclC SclC  **  **  **  **  **  *              n.s. 

RRclC              n.s.  n.s  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.   

                           

SclANI500  SclCAS500  SclMICA500  RRclANI500  RRclCAS500  RRclMICA500 

SclANI100  n.s. 

SclCAS100  n.s. 

SclMICA100  n.s. 

RRclANI100  n.s. 

RRclCAS100  n.s. 

RRclMICA100  n.s. 

SclANI500  SclANI100  SclCAS500  SclCAS100  SclMICA500  SclMICA100 

RRclANI500  n.s. 

RRclANI100  n.s. 

RRclCAS500  n.s. 

RRclCAS100  n.s. 

RRclMICA500  n.s.   

RRclMICA100  n.s   

 

 17 

 18 

Page 5: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

Table S5. Median and  interquartile  for mice challenged with a clinical  isolate or an  isogeneic mutant strain and  treated with anidulafungin 19 

(ANI), caspofungin (CAS), or micafungin (MICA).  20 

Median CFU/mL kidney tissue homogenates   Clinical isolates #    Isogeneic mutant strains #   SCL RRCL    SSWT  RRMH2 RSMH1 SRMH1 RRMHO2

ANI500  20* 100    20*  23* 20* 20* 75ANI100  20* 250    20*  75 20* 23* 150CANI  ‐ ‐    5250   8375 1203 2853 2500CAS500  20* 162    20*  20* 20* 20* 20*CAS100  20* 175    20*  85 23* 20* 20*CCAS  ‐ ‐    12300  7750 3500 2250 12650MICA500  23* 937    20*  20* 25* 20* 135MICA100  23* 865    20*  188 25* 38 113CMICA  ‐ ‐    4375  14000 7000 7500 9750CTOTAL  2625 287    ‐  ‐ ‐ ‐ ‐# clinical strains 11304 (S

cl ; no mutation in FKS1) and 110.12 (RR

cl; heterozygous double mutation in FKS1 at position R647R/G and P649P/L); isogenetic mutant 21 

strains: SSwt parental strain (no mutation in FKS1), RR

MH2 heterozygous double mutation (R647R/G and P649P/L), RS

MH1 heterozygous single mutation 22 

(R647R/G), SRMH1

 (P649P/L), and RRMHO2 

homozygous double mutation (R647G and P649L); for more detailed information see Table 3.  23 

*Limit of Detection (LoD) was set at 25 CFU/mL tissue homogenate.  24 

   25 

Page 6: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

Table S6. Statistical significance calculation using Kruskal‐Wallis test and Dunnett's multiple comparisons.  26 

Outlier within the placebo treated control groups (P < 100 CFU/mL kidney homogenate) were excluded from calculations. Statistical significance is 27 

indicated as follows: P < 0.05 (*), P < 0.01 (**), P < 0.001 (***). A anidulafungin, B caspofungin, and C micafungin.  28 

   29 

Page 7: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

A 30 

  SSWTANI500  SSWTANI100  SSWTC  RRMH2ANI500  RRMH2ANI100  RRMH2C  RSMH1ANI500  RSMH1ANI100  RSMH1C  SRMH1ANI500  SRMH1ANI100  SRMH1C  RRMH1ANI500  RRMHO2ANI100  RRMHO2C 

SSWTC  **  **        n.s.      n.s.      n.s      n.s. 

RRMH2C        **  *                     

RSMH1C              **  **               

SRMH1C                    **  *         

RRMHO2C                          **  *   

  SSWTANI500  RRMH2ANI500  RSMH1ANI500  SRMH1ANI500  RRMHO2ANI500                     

SSWTANI100  n.s.                             

RRMH2ANI100    n.s.                           

RSMH1ANI100      n.s.                         

SRMH1ANI100        n.s.                       

RRMHO2ANI100          n.s.                     

  SSWTANI500  RRMH2ANI500  RSMH1ANI500  SRMH1ANI500  RRMHO2ANI500                     

SSWTANI500    n.s.  n.s.  n.s.  n.s                     

RRMH2ANI500  n.s.    n.s.  n.s.  n.s.                     

RSMH1ANI500  n.s.  n.s.    n.s.  n.s.                     

SRMH1ANI500  n.s.  n.s.  n.s.    n.s.                     

RRMHO2ANI500  n.s.  n.s  n.s.  n.s.                       

  SSWTANI100  RRMH2ANI100  RSMH1ANI100  SRMH1ANI100  RRMHO2ANI100                     

SSWTANI100    n.s.  n.s.  n.s.  n.s                     

RRMH2ANI100  n.s.    n.s.  n.s.  n.s.                     

RSMH1ANI100  n.s.  n.s.    n.s.  n.s.                     

SRMH1ANI100  n.s.  n.s.  n.s.    n.s.                     

RRMHO2ANI100  n.s.  n.s  n.s.  n.s.                       

 31 

   32 

Page 8: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

B 33 

  SSWTCAS500  SSWTCAS100  SSWTC  RRMH2CAS500  RRMH2CAS100  RRMH2C  RSMH1CAS500  RSMH1CAS100  RSMH1C  SRMH1CAS500  SRMH1CAS100  SRMH1C  RRMH1CAS500  RRMHO2CAS100  RRMHO2C 

SSWTC  **  **    n.s.  n.s.  n.s.  n.s. 

RRMH2C        **  *                     

RSMH1C      ***  **   

SRMH1C      **  **   

RRMHO2C      **  **   

  SSWTCAS500  RRMH2CAS500  RSMH1CAS500  SRMH1CAS500  RRMHO2CAS500   

SSWTCAS100  n.s.       

RRMH2CAS100  n.s.     

RSMH1CAS100    n.s.   

SRMH1CAS100      n.s.   

RRMHO2CAS100      n.s.   

  SSWTCAS500  RRMH2CAS500  RSMH1CAS500  SRMH1CAS500  RRMHO2CAS500   

SSWTCAS500  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.   

RRMH2CAS500  n.s.    n.s.  n.s.  n.s.   

RSMH1CAS500  n.s.  n.s.    n.s.  n.s.   

SRMH1CAS500  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.   

RRMHO2CAS500  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.   

  SSWTCAS100  RRMH2CAS100  RSMH1CAS100  SRMH1CAS100  RRMHO2CAS100   

SSWTCAS100  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.   

RRMH2CAS100  n.s.    n.s.  n.s.  n.s.   

RSMH1CAS100  n.s.  n.s.    n.s.  n.s.   

SRMH1CAS100  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.   

RRMHO2CAS100  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.    34 

   35 

Page 9: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

C 36 

SSWTMICA500  SSWTMICA100  SSWTC  RRMH2MICA500  RRMH2MICA100  RRMH2C  RSMH1MICA500  RSMH1MICA100  RSMH1C  SRMH1MICA500  SRMH1MICA100  SRMH1C  RRMH1MICA500  RRMHO2MICA100   SSWTC  **  **    *  n.s.  n.s.     RRMH2C      ***  *     RSMH1C      **  **     SRMH1C      ***  *     RRMHO2C      **  *   

  SSWTMICA500  RRMH2MICA500  RSMH1MICA500  SRMH1MICA500  RRMHO2MICA500     SSWTMICA100  n.s.         RRMH2MICA100  n.s.       RSMH1MICA100    n.s.     SRMH1MICA100      n.s.     RRMHO2MICA100      n.s.     

  SSWTMICA500  RRMH2MICA500  RSMH1MICA500  SRMH1MICA500  RRMHO2MICA500     SSWTMICA500  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.     RRMH2MICA500  n.s.    n.s.  n.s.  n.s.     RSMH1MICA500  n.s.  n.s.    n.s.  n.s.     SRMH1MICA500  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.     RRMHO2MICA500  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.     

  SSWTMICA100  RRMH2MICA100  RSMH1MICA100  SRMH1MICA100  RRMHO2MICA100     SSWTMICA100  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.     RRMH2MICA100  n.s.    n.s.  n.s.  n.s.     RSMH1MICA100  n.s.  n.s.    n.s.  n.s.     SRMH1MICA100  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.     

RRMHO2MICA100  n.s.  n.s.  n.s.  n.s.                       

Page 10: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

   

Page 11: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

 

Page 12: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

FIG S1 Chitin content measurement for parental strain SSWT (SC5314) and its isogenic mutants: A RRMHO2 homozygous double mutation (R647G and 

P649L), B RSMH1 heterozygous single mutation (R647R/G), C SRMH1 (P649P/L), and D RRMH2 heterozygous double mutation (R647R/G and P649P/L), 

using calcofluor white as fluorescent dye. Stained cells were detected in a fluorescence‐activated cell sorter (FACSverse, BD).  

SSWT was used as wild  type  reference and  is  indicated  in all  centre plots as green population. Centre plots  show  cell  count and  fluorescence 

intensity. Relative size and granularity of yeast cells is given in the left column with forward (FSC‐A) and sideward scatter (SSC‐A) values. SSC‐A and 

fluorescence intensity are given in the right column. Gated cells are indicated by P1.  

Page 13: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

 

Page 14: Supplementary Materials CLEAN - aac.asm.orgaac.asm.org/content/suppl/2014/06/11/AAC.00123-14.DCSupplemental/... · cas ‐‐ 12300 7750 3500 2250 ... ss cas 500 ss wtcas 100 ss c

FIG S2 Chitin content measurement for SCL (no mutation in fks1) and RRCL (heterozygous double mutation in fks1 at position R647R/G and 

P649P/L) using calcofluor white as fluorescent dye. Stained cells were detected in a fluorescence‐activated cell sorter (FACSverse, BD).  

SSWT (SC5314) was used as wild type reference and is indicated in all centre plots as green population. Centre plots show cell count and 

fluorescence intensity. Relative size and granularity of yeast cells is given in the left column with forward (FSC‐A) and sideward scatter (SSC‐A) 

values. SSC‐A and fluorescence intensity are given in the right column. Gated cells are indicated by P1. 

Cells in B were found to strongly aggregate with each other, resulting in overexposed cell clumps.