Struktura i funkcija

prokariotske ćelije

Elektronska mikrografija bakterije

(Heliobacterium, 1 x 3 μm)

• Prokariotska ćelija je jednostavnije građena i ne

poseduje organele obavijene membranom.

• Makromolekuli: proteini, nukleinske kiseline, lipidi i

polisaharidi (univerzalni za živi svet, zajednički

predak).

• Sadrži genetički materijal ćelije,

“hromozom”

• Hromozom najčešće kružan

molekul DNK

• Sadrži jednu garnituru gena,

haploidni genom

• Bacteria -nema histona, u

strukturi učestvuje HU protein (E.

coli, strain U93)

• Archaea – poseduju proteine

slične histonima eukariota

Nukleoid

Izolovani nukleoid iz E. coli

Domeni negativne superspiralizacije kod E. coli

Plazmidi

• Mali, najčešće cirkularni DNK molekuli koji se nalaze van

hromozoma, karakteristični za bakterije

• Autonomno se repliciraju, broj kopija u ćeliji je regulisan

• Nose genetičke informacije neesencijalne za domaćina, ali

povećavaju kompetitivnost u specifičnim uslovima životne

sredine

F faktor kod E.coli

Ribozomi prokariota

70S ribozom, 2 subjedinice:

30S i 50S

30S - 16S rRNK i ~ 20 proteina

50S - 23S i 5S rRNK i ~ 34

proteina

• Ribozomi učestvuju u sintezi

proteina

• Često se uočavaju na iRNK,

polizomi

16s rDNK sekvenca ima visoko konzervirane regione (mala variranja

sekvence među evolutivno udaljenim vrstama) i hipervarijabilne regione

(sekvence su izmenjene tokom dužeg evolutivnog perioda, pokazatelj

evolutivne udaljenosti među vrstama); konzervirani i hipervarijabilni

regioni se međusobno smenjuju.

• Prajmeri se dizajniraju

tako da se vezuju za

konzervirane regione a

umnožavaju varijabilne

regione.

• DNK sekvenca 16S rDNK

gena je determinisana za

veliki broj vrsta (ni jedan

drugi gen nije tako dobro

okarekterisan kod tako

velikog broja vrsta)

Visoka konzerviranost rRNK gena kod fragmenata 16S rRNK

gena poreklom od različitih organizama:

Čovek

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGCTGCAGTTAAAAAG

Kvasac

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAG

Kukuruz

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAG

E. coli

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG

Anacystis nidulans (cijanobakterija)

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGAGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCG

(Thermotoga maritima (bakterija termofil 80ºC)

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTACCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGG

Methanococcus vannielii (arhea)

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACCGACGGCCCGAGTGGTAGCCACTCTTATTGGGCCTAAAGCG

Thermococcus celer (ekstremofilna arhea optimum na 85 ºC)

GTGGCAGCCGCCGCGGTAATACCGGCGGCCCGAGTGGTGGCCGCTATTATTGGGCCTAAAGCG

Sulfolobus sulfotaricus (arhea )

GTGTCAGCCGCCGCGGTAATACCAGCTCCGCGAGTGGTCGGGGTGATTACTGGGCCTAAAGCG

Analiza sekvence 16s rDNK → konstrukcija univerzalnog

filogenetskog stabla

rRNK molekul, kodiran visoko konzerviranom sekvencom rDNK (veoma slična i kod veoma udaljenih organizama).

Analiza sekvenci gena koji kodiraju rRNK (rDNK) široko se koristi u taksonomiji I filogeniji (pokazatelj evolutivne srodnosti, koristi se za procenu stepena divergencije vrsta među bakterijama.

Pionir u ovim istraživanjima Carl Woese je na osnovu sekvenci rDNK predložio klasifikaciju koja se sastoji iz 3 domena (Domain system) - Archaea, Bacteria i Eukarya.

Ćelijski zid Bacteria

Gram pozitivne bakterije Gram negativne bakterije

Na osnovu građe ćelijskog zida i različitog bojenja po Gramu

bakterije se dele na gram-pozitivne i gram-negativne.

Peptidoglikan – sastavni deo zida svih bakterija

Ćelijski zid - uloga u formiranju oblika i čvrstine, turgorski pritisak

kod E. coli 2 atm.

Peptidoglikan

Glikanski deo:

Derivati šećera –

N-acetilglukozamin i

N-acetilmuraminska

kiselina, povezani β(1,4)

glikozidnom vezom

(osetljiva na lizozim)

Peptidni deo: L-alanin,

D-alanin, D-glutaminska

kiselina i mezo-diamino

pimelinska kiselina -DAP

(ili lizin, mnoge G+)

Glikan tetra peptid

Umrežavanje peptidoglikana

(transpeptidacija)

(inhibirano antibiotikom penicilinom)

Čvrstina zida - tetrapeptidne unakrsne veze (cross-links) između lanaca peptidoglikana (glikan tetrapeptid).

Gram-negativne bakterije – veza između DAP i D-alanina)

Gram-pozitivne bakterije – veza preko glicinskih međumostova (povezuju L-lizin i D-alanin)

Jednoslojan ćelijski zid kod gram pozitivnih

bakterija

90%

Građa ćelijskog zida gram pozitivnih bakterija

Tejhojna kiselina

Uronjena u ćelijski zid i citoplazmatičnu membranu (ukoliko postoji kapsula

na površini, prolazi i kroz kapsulu).

Vezana za muraminsku kiselinu peptidoglikana.

Ako je vezana za lipide membrane – lipotejhojna kiselina.

Odgovorna za negativno naelektrisanje zida G+ bakterija

Može da učestvuje u transportu Ca2+ i Mg2+ jona.

Višeslojan ćelijski zid kod gram negativnih

bakterija

5-20%

Gram-negativne bakterije - Spoljašnji sloj ćelijskog zida

(“outer membrane”) lipopolisaharidni sloj – LPS

• Struktura: Dvostruki lipidni sloj, polisaharidi i proteini.

Dvostruki lipidni sloj: unutrašnji deo podseća na fosfolipide citoplazmatične membrane, spoljašnji deo je lipid A

Polisaharidna komponenta – ’core’ (jezgro, srž, osnovni) polisaharid i O-polisaharid

Proteini su uronjeni u LPS sloj; porini – odgovrni za permeabilnost spoljašnje membrane

Struktura porina

3 identične subjedinice grade kanal za prolaz hidrofilnih supstanci (1nm). nespecifični ili visoko specifični porini

Endotoksin G- bakterija

Patogene Gram-negativne bakterije za čoveka i druge sisare rodovi Salmonella, Shigella i Escherichia.

faktor patogenosti: LPS bakterija (endotoksin)

Lipid A = endotoksin, i kod nekih nepatogenih bakterija ova komponenta zida ima toksična svojstva.

Periplazmatski prostor G- bakterija

Uloga spoljašnje membrane – permeabilna za male

molekule, nepropusna za velike molekule – enzime idr.

proteine

Ekstracelularni proteini G- bakterija se zadržavaju u

periplazmatskom prostoru (gel-konzistencija):

− egzoenzimi – hidrolitički enzimi

− vezujući proteini (uključeni u transport)

− hemoreceptori (uključeni u hemotaksije)

Strukturne razlike u građi ćelijskog zida G+i G- Bacteria dovode do razlike u

bojenju po Gramu.

Alkohol prolazi kroz lipidima bogatu “outer membrane” gram-negativnih

Bacteria i rastvara i ispira teško rastvorljiv kompleks kristal violet-jod.

Ćelijski zid Archaea

‣ Može biti građen iz pseudopeptidoglikana (pseudomureina)

primer Methanobacterium sp.

Pseudomurein -struktura

NAG = N-acetilglukozamin

NAT = N-acetiltalosaminuronska kiselina

povezani β(1,3) glikozidnom vezom

(otporna na lizozim)

Ćelijski zidovi Archaea od drugih polisaharida,

glikoproteina ili proteina

• Polisaharidni zid od glukoze, glukuronske kiseline, galaktozaminuronske kiseline i acetata – Methanosarcina sp.

• Sličan polisaharidni zid Halococcus sp., sadrži SO4

2- koji stabilizuju zid (vezuju Na+ jone) u ekstremno slanim sredinama (ekstremni halofil).

• Parakristalni sloj (S-sloj) od proteina ili glikoproteina - (ekstremni halofili, metanogeni i hipertermofili).

• Struktura nalik S-sloju postoji kao dodatna komponenta zida nekih G+ bakterija (Bacillus brevis)

S- sloj – parakristalna priroda

Funkcija ćelijskog zida

• Neki prokarioti su slobodno-živeći protoplasti (mogu preživeti bez ćelijskog zida).

• Grupa patogenih Bacteria, mikoplazme, ne poseduju ćelijski zid, žive u krvi toplokrvnih životinja.

Ćelijska membrana ojačana sterolima koje preuzimaju od domaćina; živi u sredini sa optimalnim osmotskim pritiskom, izotonični uslovi vladaju u ćeliji i oko nje

• Ekstremno acidofilna Archaea bez ćelijskog zida (Thermoplasma)

Ćelijska membrana jedinstvena, od lipopolisaharidnog materijala - lipoglikan (tetraetarski lipidni monosloj – čvrst i stabilan)

Mycoplasma (Bacteria) Thermoplasma (Archaea)

Citoplazmatična membrana

(model građe kod Bacteria i Eukarya)

Citoplazmatična membrana Bacteria

• Tanka struktura (6-8 nm), koja obavija citoplazmu.

• Dvostruki fosfolipidni sloj, hidrofobne i hidrofilne komponente grade selektivnu barijeru na površini – semipermeabilna (’polupropustljiva’, diferencijalno propustljiva).

• Organizacija fosfolipida u dvosloj je energetski najpovoljnija – spontana u vodenoj sredini

• Lipidi - masne kiseline su za glicerol povezane estarskom vezom.

• Steroli - ne nalaze se u prokariotskim membranama, rigidni, planarni molekuli daju čvrstinu eukariotskim membranama (5-25% ukupnih lipida)

(Izuzetak mikoplazme koje nemaju ćelijski zid, a sterole uzimaju od domaćina.)

• Antibiotici polieni reaguju sa sterolima i destabilizuju membranu.

• Hopanoidi - slični sterolima, postoje kod nekih bakterija i imaju sličnu ulogu kao steroli, kod Archaea nisu otkriveni.

holesterol hopanoid diplopten

Očvršćavanje citoplazmatične membrane

osnovna razlika bakterijska – eukariotska membrana

Ćelijska membrana Archaea

izopren

Lipidi – umesto masnih kiselina nalazi se fitanil (izgrađen

iz izoprenskih jedinica) koji je sa glicerolom povezan

etarskom vezom.

Hipertermofilne Archaea - jednoslojna membrana (“monolayer”),

2 fitanila povezana u bifitanil

(adaptacija na hipertermofilne uslove)

Citoplazmatična membrana Archaea

• Organizacija membrane u osnovi ista kao u ostalim domenima (spolja hidrofilne glave, unutra hidrofobni repovi)

Struktura Bacteria Archaea

Citoplazma-

tična

membrana

Dvostruki fosfolipidni sloj, hidrofobne

masne kiseline i hidrofilni glicerol vezani

estarskom vezom.

Proteini

Izopren vezan za glicerol etarskom vezom.

Hipertermofili – jednoslojna (bifitanil).

Proteini

Ćelijski zid Peptidoglikan (murein) N-acetil glukozamin

N-acetil muraminska kis.

β(1,4) glikozidna veza osetljiva na lizozim.

Peptid (L- i D-alanin, D-glutaminska kis.,

lizin ili diaminopimelinske kis. DAP).

Gram+ bakterije:

90% pepidoglikana.

Teihojna kiselina

Gram- bakterije:

10% peptidoglikana.

Lipopolisaharidni sloj- LPS na površini

core polisaharid, O-polisaharid,

lipid A (endotoksin).

Porini – kanali za transport malih

hidrofilnih molekula

Periplazma -12-15nm, sadrži proteine.

Pseudopeptidoglikan

(pseudomurein) N-acetil glukozamin

N-acetil talosaminuronska kis.

β(1,3) glikozidna veza otporna na lizozim

Peptid (L-alanin, glutaminska kis., lizin).

Polisaharidi

Glikoproteini

Proteini

S- sloj (halofili, metanogeni, hipertermofili).

Funkcije citoplazmatične membrane

1. Barijera za prolaz molekula

(semipermeabilna)

2. Mesto gde se nalaze

proteini za transport, dobijanje

energije i hemotaksiju

3. Konzervacija energije

(protonska pumpa,

proton motive force)

Citoplazmatična membrana – permeabilna barijera na

površini

Propustljivost membrane

– Mali hidrofobni molekuli mogu proći difuzijom

– Veliki hidrofobni molekuli moraju biti transportovani

– Polarni i naelektrisani molekuli moraju biti transportovani

Izuzetak: molekul vode (polaran, ali dovoljno mali – može da prođe

kroz membranu zahvaljujući akvaporinima (proteinski kanali za

trasport vode, AqZ kod Escherichia coli)

– Najčešće je neophodan transport nasuprot gradijentu koncentracije

(uz utrošak energije)

Neophodnost postojanja transportnih sistema u membrani

Najmanje 3 tipa transportera koji koriste energiju protonske

pumpe, ATP-a ili fosfoenolpiruvata

Evolutivna sličnost sva

tri tipa transportera

(sličan AK sastav, 12 α-

heliksa u strukturi

proteina)

Transport kroz

membranu uključuje

promenu konformacije

transportnih proteina –

vezivanje supstance na

jednoj strani i

oslobađanje na drugoj

strani membrane

Transportni proteini u membrani bakterija

Jednostavni transporteri

• Formiraju kanal za prolaz supstanci:

- uniporteri – transport jedne supstance u ćeliju.

- antiporteri – vrše transport dve supstance u različitim smerovima (unose jednu, a iznose drugu)

- simporteri - nose jednu supstancu sa drugom (najčešće protonom H+), u istom smeru.

Jednostavni transporteri

“Proton motive force” -

protonska pumpa

membrane prokariotskih

ćelija i unutrašnje

membrane mitohondrija i

hloroplasta

Fosfotransferazni sistem (translokacija grupa)

• Sistem fosfotransferaza kod E.coli,(24 proteina), proteini se alternativno fosforilišu ili defosforilišu.

• Energija iz fosfoenol piruvata (ekvivalentna energiji 1 ATP), koristi se kao donor fosfatne grupe.

• Glukoza je pripremljena za ulazak u centralni metabolizam (glikoliza)

ABC transporteri G-

bakterija

(ATP binding cassete)

Transport nekih šećra i

aminokiselina, neorganskih

nutrijenata i metala

Površinske strukture kod prokariota

‣ Prokariotske ćelije na svojoj površini mogu imati

različite strukture: kapsule i sluzave omotače,

flagele, fimbrije i pile.

‣ Uloga ovih struktura: zaštita od fagocitoze,

isušivanja, prihvatanje za podlogu (domaćina),

omogućavanje konjugacije među bakterijama,

kretanje.

Površinski omotači – kapsula i sluzavi omotač

Hemijski sastav:

polisaharidne prirode (glikokaliks) ili

proteinske prirode

Uloga:

pričvršćivanje za podlogu (strukture

domaćina) – formiranje biofilma, koncentracija

hranljivih materija, sprečavanje isušivanja, faktor

patogenosti kod nekih bakterija

kolonije Bacillus anthracis

Površinske strukture

Fimbrije Pili

Protenski nastavci za pričvršćivanje

(bakterija za supstrat, patogenih za

strukture domaćina, međusobno

povezivanje bakterija u tečnom

medijumu ili formiranje biofilma na

čvrstoj podlozi)

Duži nastavci, uloga –

pričvršćivanje (ista kao

fimbrije), u procesu konjugacije,

receptori za neke bakteriofage

Rezervne materije:

- glikogen

- polifosfat

- poli--hidroksi butirat PHB

Ćelijske inkluzije

Granule S kao rezultat oksidacije

H2S kod fotosintetičkih purpurnih

sumpornih bakterija.

Granule fosfata ili polifosfata

Inkluzije- Magnetozomi (magnetit Fe3O4)

• Magnetotaksija -

orijentacija i kretanje duž

linije geo-magnetnog

polja.

• Brojne, primarno

akvatične bakterije, i neke

alge.

Magnetozomi izolovani iz

Magnetospirillum magnetotacticum

(50 nm)

• Izduženog oblika, 5-20% ćelije, od šupljikavog proteina (300-700nm).

• Membrana od proteina (2 nm), nepropustljiva za vodu i druge rastvore, a propustljiva za većinu gasova.

• Sastav gasa u vezikuli odgovara gasu spoljašnje sredine (u vezikuli 1 atm).

Gasne vezikule

Održavaju mikroorganizme u vodenoj sredini na odgovarajućoj

dubini, gde su intenzitet i talasna dužina svetla optimalni za proces

fotosinteze.

Gasne vezikule kod cijanobakterije Anabaena

i Microcystic

Anabaena

Microcystic

Endospore

• Diferencirane strukture koje produkuju neke Gram-pozitivne

bakterije zemljišta (~20 rodova do sada poznato)

• Proces sporulacije dobro proučen: Bacillus i Clostridium

• Uloga – preživljavanje nepovoljnih uslova (otporne na visoku

temperaturu, hemijske i fizičke agense: boje, kiseline, dezinfekcione

supstance, zračenje).

• Sadrže Ca2+ soli dipikolinske kiseline – olakšava dehidrataciju spore,

redukuje nivo dostupne vode

• Mogu biti dormantne izuzetno dug vremenski period.

• Ćelijska diferencijacija: sporulacija (formiranje spora) i germinacija

(klijanje spora) su obrnuti procesi

Endospore

Položaj endospore u ćeliji je taksonomski karakter

Bojenje metodom po Šefer-Fultonu

Sporulacija Bacillus subtilis,

zelena fluorescentna zona -

proteini u omotaču spore.

Građa spore:

1. Egzosporijum na površini – proteinski sloj

2. Sporin omotač (spore coat) – proteinski sloj

3. Korteks – sadrži peptidoglikane

4. Srž (jezgro) spore (‘sporin protoplast’) – tu su zaštićene sve

vitalne strukture koje ćelija mora da sačuva: nukleoid, ribozomi,

membrana, deo citoplazme

SASPs – small acid-

soluble proteins, mali

proteini rastvorljivi u

kiselini , vezuju se za

DNK u srži i štite je od

nastanka lezija; prevode

DNK iz B-forme

(vegetativna ćelija) u

kompaktniju A-formu

Spore

• 10-30% vode.

• 10% suve težine spore: Ca- dipikolinat (DPA).

• pH je za jedinicu niži od pH vegetativne ćelije.

• Specifični proteini “small acid-soluble spore proteins (SASPs)” sintetišu se u toku sporulacije, tesno se vezuju za DNK i štite je od štetnih efekata.

• U procesu germinacija SASPs predstavljaju izvor C i energije.

Sporulacija

Germinacija endospore

Brz proces

Aktivacija povišenom, ali subletalnom temperaturom – termalni šok

Izrastanje: gubitak DPA – hidratacija, gubitak SASPs – izvor C i

energije, počinju metabolički procesi (sinteza DNK; RNK i proteina),

ćelija postaje podložna bojenju – lako prima boju (spore se teško

boje)

Bakterijske flagele

Salmonella enteritidis 10,000X

Desulfovibrio species. 15,000X

(a) peritriha – flagele ravnomerno raspoređene

(b) monotriha – jedna flagela na polu

(c) lofotriha – čuperak flagela na polu

(d) amfitriha (nije prikazano)

dva čuperka flagela na oba pola ćelije

Broj i položaj flagela je

taksonimski karakter

Strukture za kretanje – flagele

Gram negativne bakterije sa aksijalnim filamentima (endoflagella): Treponema

pallidum (izazivač sifilisa) i Borrelia bergdorfi (izazivač lajmske bolesti).

Kod spiroheta (G- bakterije) strukture slične flagelama, aksijalni filamenti,

koje se nalaze u periplazmatičnom prostoru, polaze sa polova ćelije i

spiralno je bavijaju.

Strukture za kretanje – aksijalni filamenti

Struktura flagela • Struktura flagela malo varira kod prokariota.

• Filament - izgrađen od subjedinica od

proteina flagelina (Bacteria), helikalnog

oblika (talasast), uloga – kretanje, rotacijom

poput propelera

• Bazalno telo flagela (‘motor’):

C i MS prstenovi u citoplazmi i membrani

P prsten u peptidoglikanskom sloju (samo

kod G- bakterija)

L prsten u LPS sloju (samo kod G- bakterija)

• Mot i Fil proteini okružuju C i MS prstene

• Fil proteini upravljaju rotacijom flagela kao

odgovor na intracelularni signal (regulatorni

proteini)

• Energija za kretanje – proton motive force

(‘protonska turbina’ – prolazak protona kroz Mot

protein (motorni proteini)

Pokretljivost klizanjem

• Mnogo sporije kretanje, filamentozni ili štapićasti oblici.

• Cijanobakterija, gram-negativne bakterije (Myxococcus xanthus i druge miksobakterije) i Cytophaga i Flavobacterium.

• Cijanobakterija - sekrecija polisaharidne sluzi kojom se prihvataju za površinu podloge i kreću.

• Nefotosintetičke klizeće bakterije Flavobacteriun johnsoniae, specifični proteini uronjeni u citoplazmu i ćelijski zid.

Filamentozne klizeće bakterije na

površini čvrste podloge (agar)

Gram negativna klizajuća bakterija

Flavobacterium johnsoniae

Mutant koji ne može da se

kreće klizanjem

Hemotaksija

Ćelija ima receptore za atraktante ili repelente koji prenose signal

mehanizmom signalne transdukcije na proteine regulatore

motornih proteina flagele

Pozitivna aerotaksija bakterija

koje se približavaju algi koja

oslobađa kiseonik (alga, bela

mrlja).

• Postoji senzorni protein

(hemoreceptor) u membrani koji

registruje promene spoljašnje

sredine.

• Signal se prenosi na regulator

odgovora.

• Dvokomponentni sistem – senzor

i regulator; proces prenosa je

signalna transdukcija.

• Pozitivna hemotaksija – kretanje

usmereno ka interesantnoj

supstanci.

• Negativna hemotaksija – ukoliko

se radi o nepovoljnim uslovima,

kretanje se odvija u suprotnom

smeru.

Fototaksija

• Fototrofi se kreću u pravcu svetla - fototaksija.

• Fotoreceptori, analogi hemoreceptorima, ocenjuju gradijente svetlosne energije.

• Fotaksija omogućuje orijentaciju i najefikasniju fotosintezu.

• Fenomen je analog pozitivnoj hemotaksiji, atraktant je svetlo.

• Regulatorni sitemi uključeni u hemotaksiju odgovorni su i za fototaksiju.

Izrazito pokretni organizam Rhodospirillum

centenum (purpurna fototrofna bakterija), cela

kolonija pokazuje fototaksiju.

(kolonija je golim okom vidljiva masa ćelija na površini čvrste hranljive

podloge koja predstavlja klon jedne ćelije)