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1 Spettroscopia Spettroscopia I.R. I.R. ed U.V. ed U.V. F. F. Ortuso Ortuso - - Analisi dei Medicinali II Analisi dei Medicinali II Classificazione delle radiazioni Classificazione delle radiazioni elettromagnetiche per elettromagnetiche per λ raggi raggi (0.01nm (0.01nm-1nm) 1nm) raggi raggi X (1nm X (1nm-100nm) 100nm) ultravioletto ultravioletto (100nm (100nm-400 nm) 400 nm) luce visibile luce visibile (400 (400-~700 ~700 nm nm) infrarosso (>750nm infrarosso (>750nm-0.4mm) 0.4mm) microonde microonde (0.4mm (0.4mm-100cm) 100cm) onde onde radio: radio: corte corte (1m (1m-100m) 100m) medie medie (>100m (>100m-600m) 600m) lunghe lunghe (>600m) (>600m) F. F. Ortuso Ortuso - - Analisi dei Medicinali II Analisi dei Medicinali II

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Spettroscopia Spettroscopia I.R.I.R. ed U.V.ed U.V.

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Classificazione delle radiazioni Classificazione delle radiazioni elettromagnetiche per elettromagnetiche per λλ

�� raggi raggi �� (0.01nm(0.01nm--1nm)1nm)�� raggiraggi X (1nmX (1nm--100nm)100nm)�� ultraviolettoultravioletto (100nm(100nm--400 nm)400 nm)�� luce visibileluce visibile (400(400--~700 ~700 nmnm))�� infrarosso (>750nminfrarosso (>750nm--0.4mm)0.4mm)�� microondemicroonde (0.4mm(0.4mm--100cm)100cm)�� ondeonde radio:radio:

�� cortecorte (1m(1m--100m)100m)�� mediemedie (>100m(>100m--600m)600m)�� lunghelunghe (>600m)(>600m)

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Radiazioni elettromagneticheRadiazioni elettromagnetiche

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COLORE: teoriaCOLORE: teoriaLa luce bianca La luce bianca èè costituita da radiazioni costituita da radiazioni comprese tra 400 (violetto) e circa 700 (rosso) comprese tra 400 (violetto) e circa 700 (rosso) nmnm..

Essa Essa èè la combinazioni di radiazioni colorate la combinazioni di radiazioni colorate

ognuna delle quali ha una certa ognuna delle quali ha una certa λλ..Se si ha assorbimento ad una certa Se si ha assorbimento ad una certa λ λ la sostanza la sostanza assume la colorazione complementare.assume la colorazione complementare.CromoforiCromofori sono i gruppi funzionali che sono i gruppi funzionali che assorbono nella zona dellassorbono nella zona dell’’UV.UV.

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COLORECOLOREEsistono vari composti farmaceutici colorati: Esistono vari composti farmaceutici colorati: nitrofurantoinanitrofurantoina, , fenotiazinafenotiazina, KMnO4., KMnO4.A volte la colorazione A volte la colorazione èè indice di alterazione indice di alterazione come nel caso della come nel caso della apomorfinaapomorfina (bianca (bianca cristallina) che facilmente si ossida a derivati cristallina) che facilmente si ossida a derivati chinonicichinonici (verde)(verde)

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Colore assorbito e osservatoColore assorbito e osservato

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Energia delle radiazioni Energia delle radiazioni elettromagneticheelettromagnetiche

La radiazione elettromagnetica possiede una componente La radiazione elettromagnetica possiede una componente ondulatoria ed una corpuscolare. I fotoni possiedo una massa e sondulatoria ed una corpuscolare. I fotoni possiedo una massa e si i muovono nello spazio pertanto la radiazione elettromagnetica ha muovono nello spazio pertanto la radiazione elettromagnetica ha una sua propria energia:una sua propria energia:

E = E = h h �� ��dove dove hh ee’’ la costante di la costante di PlanckPlanck e e �� rappresenta la frequenza.rappresenta la frequenza.

Considerato che la relazione tra Considerato che la relazione tra λλ e e �� le pone in proporzionalitle pone in proporzionalitààinversa (inversa (�� � ��� �� λλ; dove c rappresenta la velocit; dove c rappresenta la velocitàà di propagazione) si di propagazione) si intuisce come intuisce come ad una diminuzione della lunghezza dad una diminuzione della lunghezza d’’onda onda corrisponda un aumento della frequenza e quindi dellcorrisponda un aumento della frequenza e quindi dell’’energiaenergia!!

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Effetti delle radiazioni sulle molecoleEffetti delle radiazioni sulle molecoleL’energia interna della molecola è data dalla somma delle seguenti componenti:

Ei = Ee + Er + Ev

dove Ee rappresenta la componente elettronica (irradiazione ultravioletta;), Er quella rotazionale ed Ev la vibrazionale(irradiazione infrarossa).

Le componenti subiscono un incremento, la molecola passa ad uno stato eccitato

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Le componenti energetiche sono anchLe componenti energetiche sono anch’’esse quantizzate:esse quantizzate:

�� EeEe = energia elettronica (30= energia elettronica (30--250 kcal/250 kcal/molmol))

�� EvEv = energia vibrazionale (1= energia vibrazionale (1--15 kcal/mol)15 kcal/mol)

�� ErEr = energia rotazionale (0.1 = energia rotazionale (0.1 -- 0.001 kcal/0.001 kcal/molmol))

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SensibilitSensibilitàà allall’’irraggiamento irraggiamento

Ee viene influenzata dal salto dell’elettrone ad un orbitale di maggiore energia. Il contributo energetico e’ tale da richiedere l’U.V. per essere osservata.

I 3 principali tipi di elettrone presenti nei composti organici sono: � �� elettrone di legame, molto vicino al nucleo, stabile, necessita di elevata energia per passare allo stato eccitato (UV lontano)� �� elettrone di legame, stabile, necessita di minore energia per passare ad orbitali a maggiore energia (UV vicino)� �� elettrone appartenente ad un doppietto libero (UV vicino).Le transizioni osservabili all’UV sono quindi:� �� � � �� �� �� ��

Componenti energetiche influenzateComponenti energetiche influenzate

C O�� C O��F.F. Ortuso Ortuso -- Analisi dei Medicinali IIAnalisi dei Medicinali II

C O�� C O��Scarsamente rilevanti in ambito organico

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Transizioni elettroniche nellTransizioni elettroniche nell’’ UVUV

λλλλ = 150 nm

λλλλ = 175 nm

λλλλ = 270 nm

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Effetto della coniugazione in sistemi Effetto della coniugazione in sistemi H(CH=CH)H(CH=CH)nnHH nell'UVnell'UV

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ESEMPIO: vit. A e ESEMPIO: vit. A e ββ CaroteneCarotene

Vitamina A (5 ins. con.) forma anidra (6 ins. con.)

ββββ Carotene λλλλ max = 450 nm (11 ins. con.)

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Componenti energetiche influenzateComponenti energetiche influenzate

Ev richiede minore energia per subire variazioni, l’infrarossoe’ sufficiente). La componente vibrazionale puo’ essere ulteriormentesuddivisa in:

• energia di stretching (moto lineare simmetrico ed asimmetrico)

• energia di bending (moto entro e fuori dal piano)

• energia torsionale (scarsamente rilevante, aumenta solo la frequenza della rotazione)

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Variazione nelle componenti Variazione nelle componenti energetiche energetiche vibrazionalivibrazionali: : strecthingstrecthing

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Sono possibili variazioni superiori alla norma

Variazione nelle componenti Variazione nelle componenti energetiche energetiche vibrazionalivibrazionali: : strecthingstrecthing

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Sono possibili variazioni superiori alla norma

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Variazione nelle componenti Variazione nelle componenti energetiche energetiche vibrazionalivibrazionali: : bendingbending

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��Sono possibili variazioni superiori alla norma

Variazione nelle componenti Variazione nelle componenti energetiche energetiche vibrazionalivibrazionali: torsionale: torsionale

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��HH

H

HH

H

HH

H

Aumenta solo la frequenza!

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Legge di Legge di LamberLamber--BeerBeer

La legge fondamentale nella La legge fondamentale nella spettrofotometriaspettrofotometria UVUV--visibile visibile èè quella di quella di LambertLambert--BeerBeer::

A = A = εε xx b b xx c c Ad una data lunghezza dAd una data lunghezza d’’onda onda ll ll’’assorbanzaassorbanza AA di un di un campione campione èè data dal prodotto della data dal prodotto della assorbivitassorbivitàà o o coefficiente di estinzione molare coefficiente di estinzione molare εε per la lunghezza per la lunghezza del campione del campione bb e per la concentrazione dello stesso e per la concentrazione dello stesso cc..Generalmente b = 1 cm (lato della Generalmente b = 1 cm (lato della cuvettacuvetta))

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Lo spettro UVLo spettro UV

ÈÈ un grafico bidimensionale un grafico bidimensionale nel quale si riporta la nel quale si riporta la grandezza grandezza εε (coefficiente di (coefficiente di estinzione molare) in funzione estinzione molare) in funzione della della λλ lunghezza dlunghezza d’’onda della onda della radiazione incidente (da 200 radiazione incidente (da 200 nmnm fino a 300 fino a 300 nmnm oppure fino oppure fino a 500 a 500 nmnm). ).

ε

200 300 500 λ

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EsempiEsempi

262 nm 444 nm

polvere bianca polvere giallo-arancio

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Spettri UV : gruppi funzionali e Spettri UV : gruppi funzionali e principali composti farmaceuticiprincipali composti farmaceutici��InsaturazioniInsaturazioni C=C e CC=C e C≡≡CC��CarbonileCarbonile C=OC=O��Sistema Sistema benzenicobenzenico��Derivati Derivati naftalenicinaftalenici��FenotiazineFenotiazine��BarbituriciBarbiturici��BenzodiazepineBenzodiazepine��Antibiotici Antibiotici ββ--lattamicilattamici��TetraciclineTetracicline

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InsaturazioneInsaturazione C=C e CC=C e C≡≡CCIl C=C assorbe normalmente a Il C=C assorbe normalmente a λ λ = 180 = 180 nmnm. La transizione . La transizione coinvolta coinvolta èè quella quella ππ-->>ππ*. *. Similmente si comporta anche il Similmente si comporta anche il CC≡≡C che però non sono di per sC che però non sono di per séémolto diagnostici. Ad esempio il molto diagnostici. Ad esempio il linestrololinestrolo ha entrambi i gruppi ha entrambi i gruppi doppio e triplo ma non possiede doppio e triplo ma non possiede segnali significativi da un punto segnali significativi da un punto di vista analiticodi vista analitico

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Coniugazione C=CConiugazione C=C

Al contrario la Al contrario la ππ-->>ππ*con *con coniugazione richiede meno coniugazione richiede meno energia ovvero energia ovvero λλ maggiori maggiori ed ed èè pipiùù diagnostico. Ad diagnostico. Ad esempio lesempio l’’ergocaciferoloergocaciferolo

(D2) ha un (D2) ha un maxmax di di assorbimento caratteristico assorbimento caratteristico a 265 a 265 nmnm. .

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Coniugazione C=CConiugazione C=C

Un altro esempio Un altro esempio èè dato dalldato dall’’antibiotico antibiotico macrolidemacrolideamfociterinaamfociterina BB, che contenendo una esteso , che contenendo una esteso sistema coniugato sistema coniugato dienicodienico assorbe anche nel assorbe anche nel visibile (405 visibile (405 nmnm giallo) e nellgiallo) e nell’’UV a 362 e 381 UV a 362 e 381 nmnm..

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Regole empiriche di Regole empiriche di WoodwardWoodward e e FiesersFiesers

Studiando gli spettri UV di terpeni e steroidi Studiando gli spettri UV di terpeni e steroidi hanno formulato regole empiriche per predire la hanno formulato regole empiriche per predire la λλ di di dienidieni coniugati. coniugati. CromoforiCromofori di base (a, b, c, di base (a, b, c, d) hanno la loro d) hanno la loro λλmaxmax alla quale si aggiunge un alla quale si aggiunge un contributo che varia con la natura dei sostituenti. contributo che varia con la natura dei sostituenti. Es.Es. R alchilici + 5 R alchilici + 5 nmnm, un doppio legame 30 , un doppio legame 30 nmnm, , una ammina III 60 una ammina III 60 nmnm..

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CarbonileCarbonile C=OC=O

Le transizioni di base del Le transizioni di base del carbonilecarbonile sono:sono:ππ-->>ππ* 190 nm e n* 190 nm e n-->>ππ* 290 nm di per s* 290 nm di per séé poco utili.poco utili.La seconda La seconda èè però sensibile al però sensibile al solventesolvente. In ambiente . In ambiente acido essa scompare per la protonazione del O SP2 e acido essa scompare per la protonazione del O SP2 e allall’’aumentare della polaritaumentare della polaritàà del solvente subisce uno del solvente subisce uno spostamento ipsocromico.spostamento ipsocromico.La La coniugazioneconiugazione produce uno spostamento produce uno spostamento batocromicobatocromicodi circa 15di circa 15--45 45 nmnm. . EsEs aldeide aldeide crotonicacrotonica ((MeCH=CHCHOMeCH=CHCHO) ) assorbe assorbe ππ-->>ππ* 220 * 220 nmnm e ne n-->>ππ* 322 * 322 nmnm. Gli . Gli steroidisteroidi con con un un carbonilecarbonile α,βα,β insaturo nel ciclo A hanno assorbimento insaturo nel ciclo A hanno assorbimento a 240 a 240 nmnm..

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Sistema Sistema benzenicobenzenico

Le transizioni di base del sistema Le transizioni di base del sistema benzenicobenzenico::a 200 a 200 nmnm intensa e a intensa e a 255 255 nmnm caratteristicacaratteristica..La sostituzione sullLa sostituzione sull’’anello aromatico provoca anello aromatico provoca variazioni dello spettro (perdita nella finezza). variazioni dello spettro (perdita nella finezza). Gruppi alchilici ed alogeni danno effetto Gruppi alchilici ed alogeni danno effetto batocromicobatocromico (5 (5 nmnm), la coniugazione d), la coniugazione dàà effetti effetti pipiùù marcati. marcati.

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EfedrinaEfedrina-- BaclofenBaclofen -- AdrenalinaAdrenalina

pH acido

pH basico

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MorfinaMorfina--CodeinaCodeinapH acido

pH basico

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Lo spettro Lo spettro I.R.I.R.PuoPuo’’ sembrare simile a quello U.V. ma si ottiene a seguito di sembrare simile a quello U.V. ma si ottiene a seguito di fenomeni che non comportano transizioni elettroniche fenomeni che non comportano transizioni elettroniche (l(l’’energia somministrata non eenergia somministrata non e’’ sufficiente!).sufficiente!).

Il medesimo gruppo Il medesimo gruppo puopuo’’ dare origine a diversi segnali dovuti dare origine a diversi segnali dovuti alle diverse componenti coinvolte (es. alle diverse componenti coinvolte (es. stretchingstretching simmetrico simmetrico + + stretchingstretching asimmetrico + asimmetrico + bendingbending nel piano + nel piano + bendingbendingfuori dal piano)fuori dal piano)

La La regioneregione fingerprint, fingerprint, caratterizzatacaratterizzata dada elevataelevata variabilitavariabilita’’, se , se confrontataconfrontata rispettorispetto ad ad unouno standard standard puopuo’’ essereessere risolutivarisolutiva!!

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Lo spettro Lo spettro I.R.I.R.

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Lo spettro Lo spettro I.R.I.R.

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Lo spettro Lo spettro I.R.I.R.

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Fingerprint

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Lo spettro Lo spettro I.R.I.R.

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Fingerprint

Schema di uno Schema di uno spettrofotometrospettrofotometro

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SpettrometriaSpettrometriadi massadi massa

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Spettrometria di massa

E’ un metodo che consiste nel misurare le masse dei frammenti prodotti per bombardamento con un fascio di elettroni ad alta energia di molecole in fase gassosa ed a pressione molto ridotta. L’energia è pari a 70 eV. Un risultato del bombardamento è di rimuovere un elettrone della molecola e formare uno ione positivo detto ione molecolare.� � �� � � � ���������� ������ � ��� ������� ��������������

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Spettrometria di massa

Lo ione molecolare ha le proprietà sia di un catione che di un radicale libero, in quanto possiede un numero dispari di elettroni.Per esempio, nel bombardamento dell’ammoniaca avviene la seguente reazione.� � �� � �� � � �� � � ������ ����� � �� �� ������� � �������

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Spettrometria di massa

Un fascio di elettroni con l’energia di 70 eV non solo produce gli ioni molecolari, ma conferisce loro un considerevole eccesso di energia, che è nettamente superiore all’energia necessaria per rompere i legami covalenti; un altro risultato è la frammentazione dello ione molecolare.Per esempio l’ammoniaca può formare nella frammentazione numerose specie cationiche. Lo ione molecolare può espellere un atomo di H e formare il catione NH2

+.� � �� � �� � �F.F. Ortuso Ortuso -- Analisi dei Medicinali IIAnalisi dei Medicinali II

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Spettrometria di massa

Il catione NH2+ può perdere un atomo di idrogeno

per formare NH+, il quale a sua volta può generare la specie N+.� �� � � � �� � � � �

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Spettrometria di massa

Lo spettrometro di massa separa i cationi in base al loro rapporto massa/carica (m/e).Poiché nella maggior parte dei casi la carica degli ioni è+1, la separazione avviene sulla base delle rispettive masse.Nello spettrometro di massa gli ioni vengono accelerati mediante una serie di fenditure e quindi inviati in un condotto ricurvo. Questo tubo attraversa un campo magnetico variabile che influenza la traiettoria degli ioni.

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Spettrometria di massa

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Spettrometria di massa

A seconda della sua forza in un dato momento, il campo magnetico fa si ché la traiettoria degli ioni aventi un particolare rapporto m/e abbia un certo raggio di curvatura, che coincide con quello del condotto. All’estremità del condotto gli ioni attraversano un’altra fenditura ed impattano sul collettore di ioni, che misura elettronicamente l’intensità del fascio ionico collidente. Tale intensità è la misura dell’abbondanza relativa degli ioni con un determinato rapporto m/e.

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Spettrometria di massa

La vera separazione degli ioni avviene ad opera del campo magnetico, in quanto esso obbliga gli ioni che lo attraversano a descrivere una traiettoria circolare. Il raggio di curvatura della traiettoria (r, cm) è legato al rapporto m/e degli ioni, alla forza del campo magnetico (H, gauss) ed alla tensione di accelerazione (V, volts), secondo la seguente relazione.

m/e = 4,82 x 10-5 r 2 H2/ VAll’aumentare di H vengono registrati man mano gli ioni i cui rapporti m/e vanno aumentando.

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Spettrometria di massa

Poiché la carica di quasi tutti gli ioni è unitaria, sono “sventagliati” sul collettore e registrati gli ioni con masse progressivamente crescenti.Lo spettrometro “consegna” i risultati sotto forma di una serie di picchi di intensità variabile; la posizione di ogni picco corrisponde ad un determinato valore di m/e.

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Spettrometria di massa

Lo spettrometro di massa bombarda le molecole organiche con un fascio di elettroni, provocandone la ionizzazione e la frammentazione. Esso separa i diversi ioni in base al rispettivo rapporto m/e, misura l’abbondanza relativa di ciascun frammento ionico e disegna un diagramma dell’intensità del fascio ionico in funzione di m/e.

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Lo spettro di massa

Gli spettri di massa possono essere riportati in forma tabulare o come diagrammi a righe.In entrambi i casi le intensità dei picchi sono espresse in % del picco più intenso, definito “picco base”, a cui si assegna arbitrariamente il valore 100.Le masse degli ioni che si desumono dallo spettro sono quelle calcolabili arrotondando le masse degli atomi costituenti al numero intero più vicino. Per gli atomi che s’incontrano più comunemente gli arrotondamenti sono:

H = 1; C= 12; N= 14; O = 16; F= 19.

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Lo spettro di massa

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Lo spettro di massa

Nello spettro di massa dell’NH3 osserviamo una serie di picchi a m/e =14, 15, 16 e 17. Questi valori sono le masse dello ione molecolare e dei frammenti.

Nel caso dell’ammoniaca il picco base coincide con il picco molecolare.In gran parte degli spettri il picco base cade a valori di m/e diversi dallo ione molecolare, ciò è dovuto al fatto che spesso lo ione molecolare si frammenta rapidamente che qualche altro ione con m/e più piccolo diventa il picco principale.

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Determinazione della struttura e del P.M.

Ione molecolare e picchi isotopici

Nella tabella che segue si osserva che la maggior parte degli elementi che compongono i composti organici possiede diversi isotopi naturali.Per tre elementi (C, H e N) il principale isotopo pesante èquello la cui massa è superiore di un’unità a quella dell’isotopo più comune. Quando questi elementi sono presenti in un composto organico lo spettro di massa mostra dei piccoli picchi isotopici a M.+ +1.

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Determinazione della struttura e del P.M.

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Determinazione della struttura e del P.M.

Ione molecolare e picchi isotopici

Nel caso di O, S, Cl e Br, le masse degli isotopi pesanti sono superiori di due unità a quelle degli isotopi piùabbondanti, Perciò la presenza di questi elementi èrivelata dai picchi isotopici a M.+ +2.I picchi isotopici permettono di determinare le formule molecolari. Infatti le abbondanze isotopiche riportate nella tabella precedente sono riferite a 100 atomi.

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Frammentazione

Lo ione molecolare può decomporsi in un’ampia varietà di modi ed i frammenti prodotti possono subire un ulteriore processo di scissione.Il processo di frammentazione è governato da molti fattori che regolano il decorso delle normali reazioni chimiche; per esempio i fattori che regolano la stabilitàrelativa dei specie come i radicali ed i carbocationi hanno notevoli implicazioni per la comprensione delle reazioni che avvengono in uno spettrometro di massa.

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FrammentazioneFrammentazione per scissione di un legame multiplo

Quando questa scissione interessa il catione radicalico, essa può seguire due vie, ognuna delle quali produce un catione ed un radicale libero. Esempio: bombardamento del propano.������ ��� �� ��� � � ���� � � � �� ���� �� � ������ � ���� � � �

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FrammentazioneEquazioni di frammentazione

Nelle due equazioni relative alla rottura di un legame semplice del propano, abbiamo localizzato l’elettrone dispari e la carica positiva su uno dei legami sigmaC-C dello ione molecolare. La localizzazione dell’elettrone dispari e della carica è arbitraria.I potenziali di ionizzazione rivelano che gli elettroni non condivisi dell’O e dell’N e gli elettroni π degli alcheni e delle molecole aromatiche sono trattenuti più debolmente degli elettroni dei legami σ C-C e C-H.

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FrammentazioneEquazioni di frammentazione

Se la molecola contiene solamente legami σ C-C e C-H, la localizzazione dell’elettrone dispari e della carica ècompletamente arbitraria.In questi casi si ricorre ad un’altra formulazione, che consiste nello scrivere il catione radicalico tra parentesi quadre e nel disporre l’elettrone dispari e la carica esternamente. Es. reazioni di frammentazione del propano.��������� ������ � ������������ ������ � ���

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Frammentazione

Equazioni di frammentazione

Il tipo di frammentazione che un alcano a catena lunga può subire è vario. Nel caso del n-esano si nota che lo ione molecolare a m/e 86 è accompagnato da un piccolo segnale a M.+ +1. Il quadro delle frammentazioni del n-esano è descritto nel seguente modo:������������������ ��������������� ��� � � ������������� ������ � � � ��������� ��������� � � �������� � � �� ������������

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Spettro di massa del n-esano

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Frammentazione

Frammentazione per scissione di due legami

Quando si verifica a carico di uno ione radicale questo tipo di frammentazione con rottura di due legami covalenti, i prodotti sono un altro catione-radicale ed una molecola neutra. Ad esempio gli alcooli mostrano un picco intenso a M.+ -18. Questa frammentazione corrisponde alla perdita di una molecola di H2O.

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