1

Spektrálne metódy stanovenia biomakromolekúl

■ proteíny (prednášky PSF)

■ DNA, RNA

■ sacharidy

■ mastné kyseliny

2

Stanovenie proteínov

Biuretová metóda

BCA (Smithova) metóda

Lowryho metóda

λmax = 540 nm

λmax = 720 nm

λmax = 562 nm

3

Bradfordova metóda

Reakcia s fluoreskamínom

Ninhydrínova reakcia

λex = 390 nm

λem = 475 nm

λmax = 570 nm

λmax = 590 nm

4

Nitrácia proteínov (xanthoproteínová r.)

http

://ww

w.n

atu

re.c

om

/npro

t/journ

al/v

9/n

4/fu

ll/npro

t.20

14.0

52.h

tml

■ HNO3

■ λmax = 358 nm

■ detekčný limit: 5 μg

■ interferencia: TX-100, fenolové zlúčeniny

5

6

Stanovenie DNA

■ 1. krok: HClO4....depurinácia DNA

■ 2. krok: DABA....tvorba farebného produktu, λmax = 420 nm, príp. λex = 420 nm,

λem = 520 nm

R. s kyselinou 3,5-diaminobenzoovou (DABA)

■ r. je špecifická pre DNA

■ interferencia: lipidy, sacharidy, soli, TX-100

riešenie: precipitácia DNA pomocou EtOH

■ detekčný limit:

absorbancia 25 μg DNA

fluorescencia 10 ng DNA (1 μg/mL pri 10 μL vzorky DNA)

7

depurinácia:

reakcia s DABA:

8

R. s difenylamínom (DPA)

podobne ako pri DABA:

■ 1. krok: depurinácia DNA (tvorba ω-hydroxylevulinaldehydu)

■ 2. krok: r. s DPA....tvorba farebného produktu, λmax = 595 nm

■ interferencia: lipidy, sacharidy, proteíny, RNA

9

Fluorometrické metódy

■ vysoko citlivé

■ nízky detekčný limit

■ založené na nekovalentnej interakcii interkalačných činidiel

10

Stanovenie RNA

R. s orcinolom

■ 1. krok: HCl...depurinácia RNA/tvorba furfuralu

■ 2. krok: orcinol/Fe3+....tvorba farebného produktu, λmax = 660 nm

11

12

htt

ps:/

/ww

w.n

cbi.nlm

.nih

.gov/p

roje

cts

/gap/c

gi-

bin

/docum

ent.

cgi?

stu

dy_id

=phs000200.v

4.p

2&

ph

d=

19

61

https://pt.slideshare.net/acpammar/p-h-glass-electrode/5

Influence of the concentration and kind of the alkaline solution on

the pH-value (an electrode with a low alkaline error was used for

measurements)

https://www.researchgate.net/publication/228500946_Alkali-activated_binder_and_pozzolan_cement_binder-compete_binder_reaction_or_Two_sides_of_the_same_story/figures?lo=1

14

Stanovenie sacharidov

R. s ferrikyanidom

■ alkalický roztok ferrikyanidu, 100 °C, 10 min

■ vzniká ferrokyanid, λmax = 237 nm

■ interferencia: Trp, Tyr

■ detekčný limit: 1 nmol (mannóza)

15

R. s fenolom

■ 1. krok: hydrolýza polysach. v konc. H2SO4

■ 2. krok: reakcia s fenolom = vzniká žltý produkt, λmax = 492 nm

■ interferencia: Trp, Tyr

■ detekčný limit: 0.2 μg (maltóza)

16

R. s 2-aminotiofenolom

■ r. furfuralu s aminotiofenolom = vysoko fluorescenčný produkt

λex = 361 nm, λem = 411 nm

■ interferencia: SDS, TX-100, Tris

■ detekčný limit: 50 ng (Glc, Gal, Xyl), 10 ng (arabinóza)

17

Purpald®-ová metóda

■ na dôkaz bakteriálnych polysach.

■ λmax = 550 nm

■ detekčný limit: 15 μg/mL

18

Stanovenie MK

Stanovenie MK (C > 10)

■ r. MK s dusičnanom kobaltnatým v organickom rozpúšťadle

■ λmax = 435 nm

■ detekčný limit: 0.1 μM

■ interferencia: PLs

19https://en.wikipedia.org/wiki/Densitometer

■ vizualizácia iódom