UNIVERZITET U BEOGRADU

HEMIJSKI FAKULTET

Vuk V. Filipović

SINTEZA I KARAKTERIZACIJA HIDROGELOVA

NA BAZI 2-HIDROKSIETIL-METAKRILATA I

POLI(β-AMINOESTARA) ZA PRIMENU U

MEDICINI I FARMACIJI

doktorska disertacija

Beograd, 2020.

UNIVERSITY OF BELGRADE

FACULTY OF CHEMISTRY

Vuk V. Filipović

SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF HYDROGELS

BASED ON 2-HYDROXYETHYL METACRYLATE AND

POLY(β-AMINO ESTER)S FOR MEDICINAL AND

PHARMACEUTICAL APPLICATIONS

Doctoral Dissertation

Belgrade, 2020.

Mentori:

dr Simonida Lj. Tomić, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu,

Tehnološko-metalurški fakultet

dr Dušanka Milojković-Opsenica, redovni professor, Univerzitet u

Beogradu, Hemijski fakultet

Članovi komisije:

dr Goran Roglić, redovni professor, Univerzitet u Beogradu, Hemijski

fakultet

dr Jasmina Nikodinović-Runić, naučni savetnik, Univerzitet u

Beogradu, Institut za molekularnu genetiku i genetičko inžinjerstvo

Datum odbrane

Zahvalnica

Zahvaljujem se mentoru, prof. dr Simonidi Tomić, na ukazanoj prilici da doktorsku disertaciju

realizujem na Tehnološko-metalurškom fakultetu, na pomoći prilikom odabira teme, korisnim

savetima i pomoći prilikom izrade naučnih radova i pisanja teze.

Mom drugom mentoru, prof. dr Dušanki Milojković-Opsenici, se zahvaljujem na značajnoj podršci i

pomoći tokom doktorskih studija i prilikom izrade i pisanja same teze.

Dr Jasmini Nikodinović-Runić se zahvaljujem na velikoj pomoći oko in vitro i in vivo ispitivanja

biokompatibilnosti dobijenih materijala, kao i na dragocenim savetima.

Zahvaljujem se prof. dr Goranu Rogliću koji mi je učinio veliku čast i pristao da bude deo komisije

za odbranu i ocenu ove doktorske disertacije, i svojim sugestijama poboljšao kvalitet ove teze.

Zahvalnost dugujem i dr Dejanu Gođevcu na pomoći prilikom spektralnih analiza uzoraka.

Zahvaljujem se koleginicama dr Mariji Babić i dr Jovani Vuković na ukazanoj pomoći, savetima i

podršci.

Prijateljima i kolegama Jovani, Životi, Milici, Nini, Nataši, Miklošu i Dejanu zahvaljujem na podršci

tokom osnovnih, master i doktorskih studija.

Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici, bez čije apsolutne podrške izrada ove doktorske

disertacije ne bi bila moguća.

IZVOD

Sinteza i karakterizacija hidrogelova na bazi 2-hidroksietil-metakrilata

i poli(β-aminoestara) za primenu u medicini i farmaciji

U okviru ove disertacije su Majklovom adicijom sintetisani i karakterisani novi degradabilni PBAE i

cviterjonski PBAE makromeri. Oni su korišćeni za sintezu tri serije degradabilnih hidrogelova, slobodno-

radikalskom polimerizacijom: 1) Serije cviterjonskih PBAE hidrogelova, upotrebom PBAE makromera u

sistemu monomer/umreživač; 2) Dve serije superporoznih kriogelova na bazi HEMA sa PBAE

umreživačima, sa i bez želatina.

Serija cviterjonskih hidrogelova dobijena je iz PBAE makromera različitih molarnih masa, nastalih

variranjem odnosa gilicina i DEGDA u reakciji Majklove adicije. U dve serije kriogelova na bazi

HEMA, makromeri PBAE su korišćeni za uvođenje hidrolitički labilnih veza. Serija skafolda na bazi

hibridnih interpenetrirajućih mreža pHEMA/želatin je sintetisana kriogenom metodom, što je

omogućilo dobijanje porozne strukture sa dobrom mehaničkom jačinom.

Hemijska struktura PBAE makromera i hidrogelova određena je pomoću NMR i FTIC

spektroskopije. Karakterizacija uzoraka hidrogelova otkrila je da se njihova svojstva mogu

jednostavno optimizovati promenom strukture PBAE makromera. Bubrenje i degradacija hidrogelova

pokazali su veliku zavisnost od specifične cviterjonske strukture PBAE makromera. Eksperimenti in

vivo embriotoksičnosti, po prvi put izvedeni na modelu embriona zebra ribica (Danio rerio) za PBAE,

pokazali su da su materijali netoksični. Ispitivanje cviterjonskih hidrogelova kao sistema za in vitro

otpuštanje cefaleksina, ukazali su na pH-osetljivo otpuštanje kontrolisano strukturom hidrogela.

Sintetisani hidrogelovi na bazi HEMA i PBAE, pokazali su dobru biokompatibilnost i

biodegradabilnost, usled čega se može zaključiti da imaju veliki potencijal u nizu biomedicinskih

primena, uključujući regeneraciju tkiva i inteligentne sisteme za otpuštanje lekova.

Ključne reči: HEMA, PBAE, želatin, biokompatibilnost, degradacija, otpuštanje lekova, pH-osetljiv,

inženjerstvo tkiva, krioželiranje

Naučna oblast: Hemija

Uža naučna oblast: Organska hemija

ABSTRACT

Synthesis and characterization of hydrogels based on 2-hydroxyethyl-metacrylate

and poly(β-aminoester)s for medicinal and pharmaceutical application

A series of degradable PBAE and zwitterionic PBAE macromers were synthesized using Michael

addition and characterized in this PhD thesis. They were used for synthesis of three series of degradable

hydrogels, by free radical polymerization: 1) Series of zwitterionic PBAE hydrogels using zwitterionic

PBAE macromers as monomer/crosslinker system; 2) Two series of superporous cryogels based on

HEMA using PBAE crosslinkers, with and without gelatin.

Series of zwitterionic hydrogels were synthesized using PBAE macromers of different molecular weight,

obtained by varying the ratio of glycin and DEGDA in Michael addition. In two series of cryogels based

on HEMA, PBAE macromers were sucessfully used to introduce hydrolyticaly labile bonds. Series of

scafolds based on hybrid interpenetrating networks pHEMA/gelatine were synthetized using cryogenic

methods, which allowed for a porous structure with good mechanical properties.

The chemical structure of PBAE macromers and hydrogels was determined by NMR and FTIR

spectroscopy. Characterization of hydrogel samples determined that their properties can be easily

optimized by changing the structure of PBAE macromers. Swelling and degradation rates of

hydrogels demonstrated distinct dependance on pH and structure PBAE macromers. In vivo

embryotoxicity tests, using a zebra fish embryo model for the first time on PBAE, revealed that

materials are nontoxic. The zwitterionic PBAE hydrogels were examined for in vitro release of

Cephalexin, indicating pH-sensitive delivery controlled by hydrogel structure.

Synthetized hydrogels based on HEMA and PBAE, exhibit good biocompatibility and

biodegradability, and show great potential for a variety of biomedical applications, including tissue

regeneration and intelligent drug delivery systems.

Keywords: HEMA, PBAE, gelatin, biocompatible, degradable, drug delivery, pH-sensitive, tissue

engenering, cryogelation

Scientific field: Chemistry

Scientific discipline: Organic Chemistry

Lista skraćenica

AIC – Akaike informacioni kriterijum

APS – amonijum-persulfat

ASQ - Američko društvo za kvalitet

ATP – adenozin-trifosfat

ATR - prigušena totalna refleksija

BSA - goveđi serum albumin

CEX - Cefaleksin monohidrat

CFDA-AM – 5-karboksifluorescein-diacetat-acetoksimetil estar

DEGDA - di(etilen-glikol)diakrilat

DM – duple mreže

DMSO - dimetilsulfoksid

DNK - dezoksiribonukleinska kiselina

ECM – ekstracelularni matriks

EGDMA – etilen-glikol-dimetakrilat

EZR – embrion zebra ribice

FBS - fetalni kravlji serum

FTIC - infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom

HDDA - 1,6-heksametilen-diakrilat

HEMA - 2-hidroksietil-metakrilat

hpf – sati nakon oplodnje

IPM - interpenetrirajuća mreža

IT – izoelektrična tačka

KPS – kalijum-persulfat

LDH – laktat-dehidrogenaza

MTS - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijum

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum-bromid

NAD(P)-H – nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat

NVP - N-vinilpirolidon

OECD - Organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj

PBAE - poli(β-aminoestar)

PCL - polikaprolakton

PEG – poli(etilen-glikol)

PEGDA – poli(etilen-glikol-diakrilat)

PEK - polielektrolitski kompleks

PGA – poli(glikolna kiselina)

PHB – polihidroksibutirat

pHEMA – poli(2-hidroksietil-metakrilat)

PHV – polihidroksivalerat

PLA – poli(mlečna kiselina)

PLGA - poli(mlečna-ko-glikolna kiselina)

PPF - poli(propilenfumarat)

SDS – natrijum-dodecil-sulfat

SEM – skenirajuća elektronska mikroskopija

SSR – suma najmanjih kvadrata

TEMED - N,N,N',N'–tetrametiletilendiamin

TMS - trimetilsilan

TSP – trimetilsililpropanska kiselina

WST-8 - [2-(2-metoksi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfonil)-2H-tetrazolijum]

XTT - {2,3-bis(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)karbonil]-2H-tetrazolijum

SADRŽAJ

1. UVOD ......................................................................................................................................................................... 1

2. TEORIJSKI DEO ..................................................................................................................................................... 3

2.1. Klasifikacija hidrogelova ............................................................................................................. 3

2.1.1. Polimeri osetljivi na spoljne uticaje ............................................................................................... 5

2.1.1.1. pH-osetljivi hidrogelovi .............................................................................................................. 5

2.1.1.2. Teorija i mehanizam bubrenja pH-osetljivih hidrogelova ............................................. 5

2.1.1.3. Cviterjonski i poliamfolitni hidrogelovi ................................................................................ 7

2.2. Sinteza hidrogelova ....................................................................................................................... 9

2.2.1. Sinteza interpenetrirajućih polimernih mreža (IPM) ........................................................... 10

2.2.1.1. Dizajn IPM ...................................................................................................................................... 11

2.2.1.2. Sinteza hibridnih hidrogelova ................................................................................................ 12

2.2.1.3. Hidrogelovi na bazi proteina ................................................................................................... 14

2.2.2. Sinteza hidrogelova kriogenom metodom................................................................................. 14

2.2.3. Sinteza degradabilnih polimera ..................................................................................................... 17

2.2.3.1. Sinteza PBAE ................................................................................................................................. 18

2.3. Karakterizacija hidrogelova .................................................................................................... 20

2.3.1. Biodegradabilni polimeri ................................................................................................................. 20

2.3.1.1. Ispitivanje biodegradacije polimera .................................................................................... 24

2.3.2. Biokompatibilnost hidrogelova ..................................................................................................... 24

2.3.2.1. In vitro ispitivanja ....................................................................................................................... 25

2.3.2.2. MTT test .......................................................................................................................................... 26

2.3.2.3. In vivo ispitivanja na životinjama .......................................................................................... 27

2.3.2.4. Model zebra ribica za in vivo ispitivanje biomaterijala................................................. 29

2.4. Primena hidrogelova .................................................................................................................. 30

2.4.1. Sistemi za kontrolisano otpuštanje .............................................................................................. 30

2.4.2. Hidrogelovi u sistemima za kontrolisano otpuštanje ............................................................ 31

2.4.3. Mehanizam otpuštanja leka ............................................................................................................. 32

2.4.3.1. Sistemi koje kontroliše difuzija .............................................................................................. 32

2.4.3.2. Sistemi koje kontroliše bubrenje ........................................................................................... 33

2.4.3.3. Sistemi osetljivi na spoljne uticaje ........................................................................................ 34

2.4.3.4. Biodegradabilni sistemi hidrogelova za kontrolisano otpuštanje lekova ............. 34

2.4.3.5. Kvantitativno određivanje otpuštanja leka. ...................................................................... 35

2.4.4. Inženjerstvo tkiva ................................................................................................................................ 36

3. EKSPERIMENTALNI DEO ............................................................................................................................... 38

3.1. Sinteza poli(β-amino)estara (PBAE) .................................................................................... 38

3.1.1. Materijali ................................................................................................................................................. 38

3.1.2. Sinteza cviterjonskih PBAE (P1–P3) ............................................................................................ 41

3.1.3. Sinteza PBAE (P4–P6) ........................................................................................................................ 41

3.2. Karakterizacija PBAE makromera ........................................................................................ 43

3.2.1. Karakterizacija strukture PBAE ..................................................................................................... 43

3.3. Sinteza hidrogelova na bazi PBAE, pHEMA i želatina ..................................................... 43

3.3.1. Sinteza hidrogelova na bazi PBAE sa glicinom ........................................................................ 43

3.3.2. Sinteza kriogelova na bazi pHEMA (bez želatina) .................................................................. 43

3.3.3. Sinteza kriogelova na bazi pHEMA (sa želatinom) ................................................................. 43

3.4. Karakterizacija hidrogelova .................................................................................................... 44

3.4.1. Ispitivanje bubrenja hidrogelova .................................................................................................. 44

3.4.2. Ispitivanje pH-osetljivosti hidrogelova prilikom bubrenja ................................................. 44

3.4.3. Karakterizacija strukture hidrogelova i kriogelova ............................................................... 44

3.4.4. Mehanička svojstva kriogelova ...................................................................................................... 45

3.4.5. Morfologija kriogelova ...................................................................................................................... 45

3.4.6. Ispitivanje poroznosti kriogelova ................................................................................................. 45

3.4.7. Ispitivanje degradacije hidrogelova i kriogelova .................................................................... 45

3.4.7.1. Ispitivanje pH-osetljivosti hidrogelova prilikom degradacije.................................... 46

3.4.8. Ugradnja i in vitro otpuštanje cefaleksina iz hidrogelova .................................................... 46

3.4.8.1. Ispitivanje mehanizma transporta aktivne supstance .................................................. 46

3.4.9. Ispitivanje citotoksičnosti hidrogelova u in vitro uslovima ................................................ 47

3.4.10. Ispitivanje citotoksičnosti kriogelova u in vitro uslovima ................................................ 48

3.4.11. Ispitivanje toksičnosti hidrogelova u in vivo uslovima - embrioni zebra ribica ................. 48

4. REZULTATI I DISKUSIJA ................................................................................................................................ 50

4.1. Sinteza i karakterizacija novih cviterjonskih hidrogelova poli(βaminoestara) za

otpustanje lekova na ciljano mesto ............................................................................................... 50

4.1.1. Sinteza cviterjonskih PBAE makromera (P1–P3) ................................................................... 50

4.1.2. Strukturna svojstva cviterjonskih PBAE makromera............................................................ 50

4.1.3. Sinteza cviterjonskih hidrogelova na bazi PBAE ..................................................................... 51

4.1.4. Strukturna svojstva hidrogelova ................................................................................................... 51

4.1.5. Ispitivanje bubrenja hidrogelova .................................................................................................. 52

4.1.6. Degradacija hidrogelova ................................................................................................................... 53

4.1.7. Ispitivanje in vitro citotoksičnosti hidrogelova ....................................................................... 55

4.1.8. Ispitivanje in vivo toksičnosti hidrogelova ................................................................................ 55

4.1.9. Ispitivanje in vitro otpuštanja cefaleksina ................................................................................. 56

4.1.9.1. Matematička analiza procesa mehanizma transporta leka ......................................... 58

4.2. Biokompatibilni i biodegradabilni skafoldi na bazi 2-hidroksietil-metakrilata

umreženi poli(β -aminoestrima), sa i bez želatina .................................................................. 63

4.2.1. Sinteza PBAE makromera (P4–P6) ............................................................................................... 63

4.2.2. Strukturna svojstva PBAE makromera (P4–P6) ..................................................................... 64

4.2.3. Sinteza kriogelova na bazi pHEMA i PBAE, sa i bez želatina .............................................. 65

4.2.4. Strukturna svojstva kriogelova ...................................................................................................... 66

4.2.5. Ispitivanje bubrenja kriogelova ..................................................................................................... 67

4.2.6. Morfologija kriogelova ...................................................................................................................... 69

4.2.7. Poroznost kriogelova ......................................................................................................................... 70

4.2.8. Mehanička svojstva kriogelova ...................................................................................................... 70

4.2.9. Degradacija kriogelova ...................................................................................................................... 72

4.2.10. Biokompatibilnost kriogelova...................................................................................................... 74

5. ZAKLJUČAK .......................................................................................................................................................... 75

6. LITERATURA ....................................................................................................................................................... 77

1

1. UVOD

Biomedicinski hidrogelovi osetljivi na spoljne uticaje privukli su veliku pažnju usled velikog

broja primena, kao biomaterijali sa izvanrednim karakteristikama. Među najznačajnije primene ovih

materijala spadaju one za skafolde (eng. scaffold) u inžinjerstvu tkiva i u sistemima za otpuštanje

lekova. Dobar primer navedenih materijala predstavljaju poli(β-aminoestri) (PBAE), koji čine

interesantnu klasu pH-osetljivih [1], biokompatibilnih [2] i, usled prisustva degradabilnih estarskih

grupa u osnovnom lancu PBAE, biodegradabilnih materijala sa primenom u otpuštanju lekova [3],

transferu gena, inžinjerstvu tkiva [4] i regenerativnoj medicini [5]. PBAE se dobijaju jednostavnom

reakcijom Majklove adicije amino i diakrilatne komponente. Zamenom amino ili diakrilatne

komponente, ili njihovog odnosa u sintezi, moguće je dobiti širok opseg drugačijih, strukturno

različitih PBAE.

Dalji napredak u oblasti razvoja novih biomaterijala omogućila je ugradnja prirodnih amino-

kiselina ili peptida [6, 7], čime se postiže velika sličnost sa prirodnim proteinima. Usled velike

raznolikosti funkcionalnih grupa kod aminokiselina, moguće je sintetisati širok opseg dobro

definisanih funkcionalnih polimera različitih molarnih masa, sastava i arhitekture, čija svojstva

uključuju super-hidrofilnost i dobru biokompatibilnost. Hidrogelovi sa cviterjonskim funkcionalnim

grupama, poput poli(sulfobetain-metakrilata) ili poli(karboksibetain-metakrilata) su zbog odlične

biokompatibilnosti i velike otpornosti na „prljanje” bili predmet velikog broja ispitivanja [8], ali do

sad nisu publikovani rezultati koji sadrže cviterjonske PBAE ili kvazicviterjonske PBAE na bazi

aminokiselina.

Poslednjih godina biodegradabilni makroporozni polimerni hidrogelovi dobili su veliki značaj

u polju biomaterijala i inžinjerstva tkiva, pogotovo kao trodimenzionalni skafoldi za regeneraciju

oštećenih tkiva, koji ispunjavaju uslove za rast novih tkiva. Pokazalo se da su skafoldi sa

trodimenzionalnom strukturom i međusobno povezanim otvorenim porama različitih veličina,

neophodni za optimalnu proliferaciju ćelija i vaskularizaciju, kao i da bi omogućili razmenu tečnosti

i nutrijenata potrebnih za preživljavanje ćelija [9].

Cilj ove disertacije je bio dizajniranje biodegradabilnih i biokompatibilnih hidrogelova za

primenu u biomedicinskom inžinjerstvu i kao sistema za otpuštanje lekova.

Novi „inteligentni“ hidrogelovi PBAE na bazi dietilen-glikol-diakrilata (DEGDA) i glicina su

uspešno sintetizovani i karakterisani po prvi put u ovom radu. Linearni PBAE makromeri su dobijeni

korišćenjem reakcije Majklove adicije. Menjanjem stehiometrijskog odnosa diakrilat/amin, pri čemu

je on uvek bio veći od 1, su dobijeni uzorci sa različitim hemijskim strukturama koje imaju akrilatne

grupe na oba kraja. Hidrogelovi su zatim sintetisani iz makromera reakcijom slobodno-radikalske

polimerizacije. Hemijska struktura PBAE makromera i hidrogelova je potvrđena pomoću protonske

nuklearne magnetne rezonancije (1H NMR) i infracrvene spektroskopije sa Furijeovom

transformacijom (FTIC). Brzine bubrenja i degradacije hidrogelova, merene u fiziološkom opsegu

pH i temperature, su bile optimalne za materijale koji se koriste u otpuštanju lekova. Osim toga, one

se mogu fino podešavati promenom pH i hemijske strukture hidrogela. Određivanjem citotoksičnosti

in vitro i akutne embriotoksičnosti in vivo na modelu embriona zebra ribica (Danio rerio) pokazano

je da su uzorci sa manjim sadržajem glicina netoksični i biokompatibilni. Ispitivanjem otpuštanja leka

cefaleksin monohidrata in vitro, u puferima na pH vrednostima 2,20, 5,50 i 7,40, utvrđeno je pH-

osetljivo otpuštanje, sa profilima otpuštanja koji zavise od pH sredine i sastava hidrogela.

Sintetizovani PBAE hidrogelovi pokazuju veliki potencijal za biomedicinsku primenu, posebno u

oblasti „inteligentnih“ sistema za otpuštanje lekova, kao i za regeneraciju tkiva.

Imajući u vidu karakteristike koje su potrebne za trodimenzionalne skafolde, sintetisani su

novi hibridni biodegradabilni hidrogelovi na bazi sintetičkog i prirodnog polimera, u cilju postizanja

2

optimalnih svojstava oba tipa polimera. Sinteza interpenetrirajućih polimernih mreža (IPM) poli(2-

hidroksietil-metakrilata) (pHEMA) i želatina je izvedena u kriogenim uslovima. Degradabilni PBAE

makromeri različitih hemijskih sastava i molarnih masa, korišćeni su kao umreživači za HEMA, radi

uvođenja hidrolitički labilnih veza u polimernu mrežu. Slobodno-radikalskom polimerizacijom 2-

hidroksietil-metakrilata u prisustvu želatina u kriogenim uslovima obrazovana je semi-IPM. Zatim je

umrežavanjem želatina pomoću glutaraldehida dobijena IPM. Radi poređenja je sintetisan i niz

biodegradabilnih hidrogelova na bazi pHEMA, slobodno-radikalskom polimerizacijom u kriogenim

uslovima. Svi uzorci kriogelova su karakterisani i utvrđeno je da imaju vrednosti mehaničke jačine,

bubrenja, brzine degradacije i biokompatibilnosti u skladu sa onima koja su potrebna za izradu

skafolda u inženjerstvu tkiva. Mogućnost finog podešavanja svojstava dobijenih hibridnih

hidrogelova je ostvarena promenom tipa PBAE makromera koji je korišćen za umrežavanje. Rezultati

određivanja citotoksičnosti in vitro su pokazali zadovoljavajuću vijabilnost za sve uzorke, ali i da je

ona znatno poboljšana uvođenjem želatina. Navedeni materijali, nastali zajedničkim doprinosom

prirodnih i sintetičkih komponenti, kombinuju visok stepen biokompatibilnosti sa željenim fizičkim,

hemijskim, degradacionim i biološkim svojstvima koja su tražena u inženjerstvu tkiva.

3

2. TEORIJSKI DEO

Hidrogelovi su trodimenzionalne, hidrofilne, polimerne mreže koje imaju sposobnost da bubre

i apsorbuju veliku količinu vode ili bioloških fluida, istovremeno zadržavajući strukturu usled

hemijskih ili fizičkih umreženja polimernih lanaca.

Hidrogelovi se mogu sintetisati iz velikog broja vodorastvornih polimera, što uključuje

značajne varijacija u hemijskom sastavu i fizičkim svojstvima. Karakterišu ih jedinstvena fizička

svojstva kao što su viskoznost, gustina, veličina pora, elastičnost i zapremina. Hidrogelove je moguće

sintetisati u velikom broju različitih oblika, kao što su: blokovi, mikro- i nanočestice, premazi,

filmovi i membrane [10]. Zahvaljujući velikom udelu vode, poroznosti, mekoj konzistenciji i visokoj

biokompatibilnosti, umanjena je verovatnoća uspostavljanja nespecifičnih interakcija sa proteinima i

ćelijama, zbog čega hidrogelovi mogu da simuliraju tkiva živih organizama, kao što su

ekstracelularna matrica (ECM) ili sluzokoža, sa većom uspešnošću od ostalih sintetičkih

biomaterijala.

Hidrofilnost hidrogelova potiče od prisustva hidrofilnih funkcionalnih grupa u strukturi

polimernih lanaca, kao što su amino, karboksilna, hidroksilna, karboksamidna i sulfonatna grupa.

Mehanička i biohemijska svojstva hidrogelova su u velikoj meri povezana sa tipom i gustinom

umreženja polimernih lanaca. Hidrogelovi sačinjeni od istih monomera, ali sa različitom strukturom

umreživača ili gustinom umreženja, mogu posedovati različita svojstva [11]. Pažljivim odabirom

monomera i umreženja polimernih lanaca mogu se dobiti novi hidrogelovi sa unapred utvrđenim

karakteristikama.

Tokom poslednjih 50 godina hidrogelovi su privukli veliku pažnju usled širokog opsega

njihove primene, koja uključuje inžinjerstvo tkiva i regenerativnu medicinu [12], kontrolisano

otpuštanje lekova [13], dijagnostiku [14], imobilizaciju ćelija [15], razdvajanje biomolekula [16] i

upotrebu kao materijala za kontrolu biološke adhezije [17]. Unutar organizma hidrogelovi

omogućavaju održavanje vlažne sredine usled mogućnosti da apsorbuju vodu i fiziološke fluide, što

povećava njihovu biokompatibilnost i biodegradabilnost [18]. Elastična priroda hidratisanih

hidrogelova minimizira iritaciju okolnog tkiva nakon implementacije i smanjuje mogućnost

negativne imunološke reakcije smanjivanjem interfacialnog napona hidrogel/fiziološki fluid [19].

Pored toga, hidrogelovi se mogu upotrebiti za simulaciju angiogeneze, autolitičko čišćenje rana i

neuroprotekciju [20].

2.1. Klasifikacija hidrogelova

Klasifikaciju hidrogelova je moguće izvršiti na razne načine: na osnovu izvora dobijanja,

metoda pripreme, načina umrežavanja polimernih lanaca, fizičkih i hemijskih svojstava, prirode

bubrenja, jonskih šarži i podložnosti biodegradaciji. Na Slici 1 prikazana je osnovna klasifikacija

hidrogelova po navedenim svojstvima. Prema izvoru dobijanja hidrogelovi se dele na one dobijene iz

sintetičkih polimera i one iz prirodnih polimera. Najveći broj prirodnih polimera pokazuje dobru

citokompatibilnost i sadrži reaktivna mesta koja mogu poslužiti za umrežavanje, sprezanje liganada

i druge modifikacije, čijim je finim podešavanjem moguće dobiti niz polimera za vrlo veliki broj

primena u biomedicini [21].

Najvažniji prirodni polimeri koji se koriste u biomedicini su [22, 23]: polisaharidi (dekstran,

hijaluronska kiselina i hitozan), proteini (želatin, kolagen, lizozom, svila i fibrin), hibridni polimeri

polisaharida i proteina (želatin/hitozan, laminin/celuloza i fibrin/alginin) i DNK i modifikacije, koje

4

uključuju X-, Y-, T-DNK i DNK linearnih plazmida. Za razliku od prirodnih hidrogelova, koji

poseduju veoma kompleksnu i često loše definisanu strukturu koja može varirati u svakoj šarži,

sintetički hidrogelovi imaju konzistentan sastav i karakteristike koje su podložne dizajniranju prema

željenoj primeni [24].

Slika 1. Osnovna klasifikacija hidrogelova

U zavisnosti od vrste naelektrisanja hidrogelovi mogu biti katjonski, anjonski, neutralni ili

amfolitni. Agensi za umrežavanje mogu biti različiti, pa se po tom osnovu hidrogelovi dele na fizički,

hemijski ili biohemijski umrežene. Tip i gustina umreženja polimernih lanaca utiču na ponašanje

prilikom bubrenja i na stabilnost hidrogelova u vodenom rastvoru, i stoga predstavljaju bitne

karakteristike hidrogelova. Hidrogelovi kod kojih glavnu ulogu u formiranju veza između polimernih

lanaca imaju molekulski prepletaji ili sekundarne sile poput jonskih, vodoničnih veza ili hidrofobnih

interakcija, nazivaju se „fizički“ ili „reverzibilni“ gelovi. Fizički hidrogelovi podležu faznoj

transformaciji od tečnosti u stanje gela kao odgovor na promenu spoljašnjih uslova, kao što su

temperatura, pH vrednost, jonska sila, i drugi. Hemijski hidrogelovi sadrže kovalentne veze otporne

na promenu spoljašnjih uslova, i stoga su mehanički stabilni i nerastvorni. Kod hidrogelova nastalih

biohemijskim procesima, uz učešće bioloških agenasa, enzimi ili aminokiseline učestvuju u procesu

želiranja. Postoji i podela hidrogelova na osnovu njihove strukture na: amorfne, semi kristalinične,

kristalinične i hidrokoloidne agregate [25].

Hidrogelovi koji usled dejstva spoljašnjih stimulanasa podležu značajnim promenama fizičkih

ili hemijskih svojstava nazivaju se „inteligentnim“ hidrogelovima. Fizički stimulansi uključuju

temperaturu, električna i magnetna polja, sastav rastvarača, intenzitet svetla i pritisak, dok hemijski i

biohemijski stimulansi uključuju promenu pH, jona i specifične slučajeve molekulskog

prepoznavanja (osetljivost na glukozu, antigene, enzime). Promene u strukturi prouzrokovane

stimulansima najčešće su reverzibilne, tako da se nakon uklanjanja stimulansa hidrogel brzo vraća u

početno stanje. Odgovor hidrogela na spoljašnji stimulans u najvećoj meri određen je prirodom

monomera, stepenom umereženja i gustinom naelektrisanja polimernih lanaca, i njegov intenzitet

direktno je proporcionalan intenzitetu primenjenog spoljašnjeg stimulansa. Hidrogelovi koji sadrže

naelektrisane funkcionalne grupe tipično pokazuju promene u bubrenju usled variranja pH i mogu

podleći promeni oblika usled izlaganja električnom polju [26].

Hidrogelovi mogu biti hemijski otporni ili podložni biodegradaciji [27]. Pod biodegradacijom

materijala smatra se široki opseg svih tipova degradacije u in vivo uslovima, bilo da se radi o

hidrolitičkoj degradaciji ili metaboličkom procesu (enzimska degradacija) [28].

5

2.1.1. Polimeri osetljivi na spoljne uticaje

2.1.1.1. pH-osetljivi hidrogelovi

Bubrenje osetljivo na promenu pH vrednosti javlja se kod jonskih hidrogelova koji poseduju

naelektrisane funkcionalne grupe na bočnim ostacima polimernih lanaca, i kontrolišu ga

naelektrisanje, pKa vrednosti i stepen jonizacije jonizabilnih grupa, hidrofilnost, koncentracija

polimera, kao i pH vrednost medijuma za bubrenje [29]. Od navedenih faktora, najveći uticaj na

osobine pH-osetljivih hidrogelova imaju pH vrednost i priroda funkcionalnih grupa u bočnim

lancima.

2.1.1.2. Teorija i mehanizam bubrenja pH-osetljivih hidrogelova

Bubrenje jonskih hidrogelova kontrolišu dva bitna faktora: svojstva polimera koji čine

hidrogel, kao što su gustina umreženja, hidrofilnost, hidrofobnost, koncentracija, jonske šarže, pKa

vrednosti bočnih kiselih ili pKb vrednosti bočnih baznih grupa i svojstva medijuma za bubrenje, poput

jonske sile, pH vrednosti i prisustva kontra jona [30].

Kada se hidrogelovi urone u vodu ili fiziološki rastvor oni bubre u zavisnosti od osmotskog

pritiska unutar hidrogela, koji zavisi od hidrofilnosti polimera u mreži hidrogela, statičkog

naelektrisanja na lancima polimera i suprotno naelektrisanih jona u matrici hidrogela [29]. Proces

bubrenja hidrogelova odvija se u tri koraka: difuzija vode u mrežu hidrogela, razdvajanje polimernih

lanaca nakon prodiranja vode (hidratacije), i širenje mreže hidrogela usled relaksacije polimernih

lanaca [31].

Privlačenje molekula vode od strane hidrofilnih i polarnih grupa dovodi do njihove apsorpcije

u hidrogel, što se naziva primarno vezana voda, usled čega dolazi do bubrenja hidrogelova. Polimerna

mreža bubri usled potpune hidratacije polarnih grupa, tako da hidrofobne grupe postaju izložene vodi.

Ove izložene hidrofobne grupe takođe reaguju sa molekulima vode, pa nastaje hidrofobno vezana

voda, ili „sekundarno vezana voda“. Kombinacija primarne i sekundarno vezane vode se naziva

„vezana“ voda. Ta voda je sastavni deo strukture hidrogela jer je vezana za hidrofilne grupe u lancima

mreže vodoničnim vezama, i ne može se ukloniti iz hidrogela osim pod ekstremnim uslovima [29].

Po zasićenju hidrofilnih i hidrofobnih grupa, voda se dodatno absorbuje usled vučne sile osmotskog

pritiska lanaca mreže, i to se naziva slobodna voda. Osim vezane vode i slobodne vode postoji i sloj

vode koji se naziva semi-vezana voda, kao i međuprostorna voda u slobodnom prostoru između

hidratisanih lanaca hidrogela, koja nije vezana za lance hidrogela [32].

Upijanjem slobodne vode hidrogel dostiže ravnotežni stepen bubrenja [33], u kojem je

postignut balans između osmotskog pritiska i elastičnih sila zatezanja polimernih lanaca. Ovo je

objašnjeno Florijevom (Flory) i Renerovom (Rehner) teorijom, prema kojoj je bubrenje funkcija

elastične prirode polimernih lanaca i termodinamičke kompatibilnosti molekula vode i polimernih

lanaca. Do promene fazne zapremine dolazi prilikom izlaganja hidrogela osetljivog na spoljašnje

stimulanse dejstvu određenog stimulansa [34].

Kod hidrogelova koji sadrže kisele ili bazne bočne grupe na polimernim lancima, bubrenje

zavisi od pH vrednosti medijuma u odnosu na pojedinačne pKa vrednosti bočnih grupa. U slučaju

negativno naelektrisane, anjonske mreže, polimerni lanci sadrže karboksilne (–COOH) bočne grupe.

Kada je pH vrednost okružujućeg medijuma veća od pKa vrednosti bočnih grupa na polimernom

lancu, dolazi do jonizacije kiselih grupa. Ovo vodi formiranju fiksnog negativnog naelektrisanja na

6

polimernim lancima i mobilnih pozitivnih naelektrisanja na molekulima rastvarača. Kao rezultat

nastaje povećanje hidrofilnosti hidrogelova i broja fiksnih negativnih šarži, što dovodi do povećanja

međusobnog elektrostatičkog odbijanja lanaca polimera i do bubrenja mreže hidrogela. Anjonski

hidrogelovi poput karboksimetil-agaroze [35] bubre pri višim vrednostima pH (bazni medijum) usled

jonizacije karboksilnih grupa u bočnim lancima, čije negativne šarže uzrokuju odbijanje polimernih

lanaca. Zbog navedenih svojstava, anjonski hidrogelovi se mogu koristiti za ciljano otpuštanje lekova

u debelom crevu pri pH vrednosti većoj od 7,4, jer tada bubre, a u kiseloj sredini želuca su

kontrahovani, pa ne otpuštaju lek, dok ga istovremeno štite od nepoželjnog dejstva kisele sredine

[36].

U slučaju katjonske mreže, polimerni lanci sadrže amino (–NH2) bočne grupe, koje sadrže

fiksne pozitivne šarže na polimernim lancima kada je pH vrednost okružujućeg medijuma niža od

pKa vrednosti bočnih grupa, i mobilna negativna naelektrisanja na molekulima rastvarača. Posledica

toga je povećanje hidrofilne prirode polimernih lanaca, broja fiksnih pozitivnih šarži i elektrostatičkih

odbijanja između bočnih grupa, što vodi većem bubrenju hidrogela. Do suprotnog efekta dolazi u

slučaju da je pH vrednost veća od pKa vrednosti bočnih amino grupa [37]. Zavisnost jonizacije

određenih kiselih ili baznih funkcionalnih grupa hidrogelova od pH vrednosti i njen uticaj na bubrenje

hidrogelova prikazan je na Slici 2.

Slika 2. Bubrenje katjonskih i anjonskih hidrogelova u kiselim i baznim rastvorima

Katjonski hidrogelovi poput poli(lizina) i poli(dimetilaminoetil-metakrilata) [38] najviše

bubre na niskim vrednostima pH (kiseli medijum), usled protonovanja amino grupa, jer pozitivne

šarže uzrokuju odbijanje polimernih lanaca hidrogela i omogućavaju ulazak veće količine medijuma

za bubrenje. Zbog toga se katjonski hidrogelovi mogu koristiti za ciljano otpuštanje antibiotika u

želudcu za lečenje ulceritisa ili kao nosači za drugi sistem za otpuštanje lekova.

Upotreba hidrogelova na bazi polielektrolitskih kompleksa (PEK) pokazala se kao uspešan

pristup za otpuštanje lekova, jer se izbegava korišćenje toksičnih kovalentnih umreživača. PEK

hidrogelovi sastoje se iz dve komponente, katjonskog polimera (poput hitozana) i anjonskog polimera

(poput karboksimetil hitozana), koje su stabilizovane elektrostatičkim interakcijama između suprotno

naelektrisanih šarži [32].

7

2.1.1.3. Cviterjonski i poliamfolitni hidrogelovi

Cviterjonski polimeri, u koje spadaju poliamfoliti i polibetaini, imaju i pozitivna i negativna

naelektrisanja ugrađena u svoju strukturu. Oni predstavljaju jedinstvenu klasu materijala koji se

primenjuju u nanotehnologiji, biomaterijalima, nanomedicini i zdravstvenoj nezi, i kao aditivi u

konstrukcionim materijalima i tretmanu voda [39]. Sličnost struktura poliamfolita i hidrofilnih delova

fosfolipida u ćelijskim membranama je u tome da u oba slučaja postoje fragmenti cviterjona koji

obrazuju dipole sa značajnim dipolnim momentima. Ta analogija je i razlog što se sve više proučava

sinteza i ponašanje policviterjona. Inspirisani prirodnim tkivima cviterjonski polimeri su dizajnirani

kao analozi biomolekula, tako da sadrže jednak broj katjonskih i anjonskih funkcionalnih grupa u

sastavu istog lanca polimera. Ova jedinstvena kombinacija omogućava cviterjonskim polimerima

specifična svojstva, kao što su elektroneutralnost u celoj strukturi u širokom intervalu pH, veliki

stepen hidrofilnosti (odnos slobodne vode i vezane vode u rastvorima i cviterjonskim hidrogelovima

je znatno veći nego kod drugih hidrofilnih polimera), jake parove dipola i anti polielektrolitske efekte

[40].

Slika 3. Naelektrisanje cviterjonskih molekula u zavisnosti od pH vrednosti

Za razliku od pravih polielektrolita, polikatjona i polianjona, kod kojih svaka jedinica koja

se ponavlja u lancu polimera poseduje istovetno naelektrisanje, cviterjonski polimeri sadrže

suprotno naelektrisane i katjonske i anjonske grupe. Kod ovih polimera je broj katjonskih i

anjonskih grupa ugrađenih u polimernu strukturu međusobno jednak, tako da oni pokazuju

amfolitičko ponašanje [39]. Stehiometrija naelektrisanja na lancu kod polijonskih polimera može

biti jedanaka, u kom slučaju je ukupno naelektrisanje jednako nuli, ili mogu posedovati pretežno

anjonski ili katjonski karakter (Slika 3).

Poliamfolitne i policviterjonske hidrogelove mogu da grade i prirodni i sintetički polimeri i

oni imaju veliku primenu u biomedicini zahvaljujući odličnoj biokompatibilnosti, maloj toksičnosti i

visokom stepenu hidratacije. Cviterjonski hidrogelovi su osetljivi na spoljne stimulanse jer usled

promene u okruženju dolazi do promene u odbijanju, hidrataciji ili intermolekulskim silama između

jonizovanih grupa koje se naizmenično smenjuju duž lanca, zbog čega se smatraju „inteligentnim“ ili

„pametnim“ materijalima. Prilikom promena u okruženju dolazi do reverzibilne promene stepena

bubrenja kao odgovora na promenu pH ili jonske sile u okolnoj sredini, a u nekim slučajevima i na

promenu temperature. Na primer, pri visokim vrednostima jonske sile ili na pH vrednosti rastvora

koja je daleko od izoelektrične tačke, hidrogel je nabubreo usled elektrostatičkog odbijanja, dok se

8

pri niskim koncentracijama soli ili na izoelektričnoj tački, gel kontrahuje jer sile privlačenja i

koacervacije dominiraju. Smatra se da je visok stepen hidratacije velikog broja jonizovanih grupa u

cviterjonskim polimerima razlog njihove otpornosti na „prljanje“ površina, usled nedostatka

elektrostatičkog privlačenja i teškog uklanjanja hidratisanog zaštitnog sloja na tim površinama [41].

Osim toga, hidrogelovi jako bubre u vodenoj sredini, tako da sterno odbijanje koje potiče od

entropije sistema, ima značajan doprinos svojstvu „neprljanja“. „Prljanje“ (fouling) predstavlja

neželjene procese u kojima se za površinu materijala vezuju čestice iz okoline, najčešće biomolekuli

ili čak ćelije i mikroorganizmi. Navedeni procesi su najčešći razlozi kvara uređaja i opreme u

biomedicinskoj i industrijskoj primeni [42]. Biofilmovi se formiraju na ugrađenim implantima

usled nespecifične apsorpcije proteina i reakcije organizma na prisustvo stranih tela, što vodi

enkapsulaciji i otkazivanja implantiranih biomaterijala [43]. Zbog toga je neophodno uklanjanje

implanta, što za posledicu ima povećan boravak u bolnici i dodatne troškove od milijardu dolara na

lećenje na godišnjem nivou [42].

Poliamfolitni hidrogelovi se mogu dobiti kopolimerizacijom monomera sa anjonskim

funkcionalnim grupama i monomera sa katjonskim funkcionalnim grupama, koji obrazuju anjonske

i katjonske grupe na različitim osnovnim jedinicama polimera [44], ili polimerizacijom cviterjonskog

monomera kad se anjonske i katjonske grupe nalaze na istoj osnovnoj jedinici polimera [45]. Ukupna

gustina naelektrisanja i njena raspodela su važni u dizajniranju poliamfolitnih hidrogelova.

Istovremeno, svojstva bubrenja hidrogelova su tesno povezana sa njihovom molekulskom

strukturom. Određivanje bubrenja poliamfolitnih hidrogelova može da pruži informacije koje pomažu

da se razume i kontroliše ponašanje ovih materijala. Studiju ponašanja za poliamfolite i policviterjone

pri bubrenju izveli su Gao i saradnici za tri moguća slučaja raspodele naelektrisanja: sa ravnotežnom

raspodelom naelektrisanja, za one sa viškom anjona i one sa viškom katjona (Slika 4) [46].

Slika 4. Šematski prikaz poliamfolita i policviterjona za hidrogelove sa ravnotežnom raspodelom

naelektrisanja, za one sa viškom anjona i one sa viškom katjona [46]

Kapacitet bubrenja i kinetika bubrenja hidrogela poliamfolita i policviterjona zavise od

njegovih molekulskih parametara, odnosno prisustva i sadržaja grupa sa ravnotežnom ili

9

neravnotežnom raspodelom naelektrisanja. U slučaju neravnoteže naelektrisanja jasno je da se sa

povećanjem viška anjona bubrenje odvija po principu onoga kod polielektrolita, dok se sa

povećanjem viška katjona bubrenje odvija po tipu anti-polielektrolita, odnosno da stepen bubrenja

raste sa povećanjem koncentracije soli u vodenom rastvoru. Poređenjem svojstva bubrenja između

poliamfolitnih hidrogelova i policviterjonskih hidrogelova sa ravnotežnom raspodelom naelektrisanja

pokazalo se da policviterjonski hidrogelovi imaju manji kapacitet bubrenja sa istom količinom

nominalnih naelektrisanja, usled većeg broja fizičkih umreženja koja se obrazuju pri nižim

vrednostima jonske sile.

Cviterjonski polimeri i poliamfoliti se sve više koriste za otpuštanje lekova i gena. Karakteristike

dizajna koje se moraju uzeti u obzir da bi se postigla optimizacija sistema za otpuštanje lekova na bazi

ovih polimera obuhvataju još i biokompatibilnost, multifunkcionalnost i osetljivost na mikrookruženje.

Zahvaljujući relativnoj ravnoteži naelektrisanja, vezivanje ovih polimera za različite supstrate je

stabilizovano cviterjonskom komponentom i pokazuje manju toksičnost u poređenju sa površinama

stabilizovanim katjonskim polielektrolitima. Ovaj fenomen su proučavali Strencel (Strenzel) i saradnici,

koji su pokazali da micele stabilizovane blokovima na bazi arginina imaju veliku vijabilnost [47].

Kod proučavanja otpuštanja lekova uz pomoć poliamfolita i cviterjonskih polimera u novije

vreme se koristi pH-osetljivost ovih sistema. Tako je pokazano da su poliamfoliti na bazi hitozana

pogodni za primenu kod otpuštanja proteina, jer su pokazali sposobnost za interakciju sa proteinima,

tj. da adsorbuju i desorbuju goveđi serum albumin (BSA) u zavisnosti od pH sredine [48]. Nanogelovi

koji su ispitani za primenu kod otpuštanja lekova pokazali su vrlo veliki potencijal usled svojstva da

kontrolišu otpuštanje lekova, obezbede zaštitu leka od degradacije i omogućuju ciljano otpuštanje na

određeno tkivo [49]. Akaši (Akashi) i saradnici sintetisali su nanočestice na bazi kalemljenih

kopolimera poli(γ-glutaminska kiselina)-γ-(L-arginin) i poli(γ-glutaminska kiselina-γ-(L-lizin) koje

mogu da vezuju i katjonske i anjonske proteine i zadrže ih duži vremenski period, od najmanje jedne

nedelje [50]. Macumura (Matsumura) i saradnici su kombinovali antifriz svojstva hidrofobno

modifikovanog karboksilovanog poli(L-lizina) sa svojstvom vezivanja proteina, za otpuštanje

proteina u ćelije [51]. Ovi primeri ističu da, usled vrlo velike mogućnosti kontrole i raznovrsnosti

svojstava, poliamfoliti i cviterjonski polimeri pokazuju veliki potencijal za poboljšanje sistema za

otpuštanje mnogih vrsta lekova uključujući male molekule, proteine i nukleinske kiseline.

2.2. Sinteza hidrogelova

U zavisnosti od metoda pripreme hidrogelovi se dele na homopolimere, kopolimere, semi-IPM

i IPM [52]. Homopolimeri su izvedeni iz jednog tipa monomera i mogu imati umreženu skeletnu

strukturu u zavisnosti od prirode monomera i tehnike polimerizacije. Kopolimereni hidrogelovi se

sastoje iz dve ili više monomernih vrsta, od kojih bar jedna sadrži hidrofilnu komponentu, sa

nasumičnom, naizmeničnom ili blok konfiguracijom duž polimernog lanca mreže.

Semi-IPM predstavljaju dve nezavisne prirodne i/ili sintetičke komponente unutar strukture

mreže, od kojih je jedna umreženi, a druga neumreženi polimer. IPM predstavljaju kombinaciju dve

isprepletane polimerne mreže, od kojih je bar jedna sintetisana ili umrežena u prisustvu druge.

Uz izbor monomera i umreživača, izbor adekvatnog načina pripreme hidrogelova ima bitan

uticaj na dobijanje željene strukture i egzaktno određenih svojstava. Umrežavanje različitih

polimernih lanaca može se izvesti metodama hemijskog i fizičkog umreživanja. Hemijski umreženi

hidrogelovi se mogu sintetisati reakcijom komplementarnih funkcionalnih grupa, polimerizacijom

putem slobodnih radikala, reakcijom ozračivanja monomera ili enzimskom reakcijom. Hidrofilne

funkcionalne grupe prisutne na vodorastvornim polimernim lancima, mogu reagovati sa

bifunkcionalnim jedinjenjima koja sadrže komplementarne funkcionalne grupe, gde dolazi do

10

formiranja kovalentnih veza između polimernih lanaca i nastajanja hidrogelova. U ovu svrhu,

najčešće se upotrebljavaju reakcije adicije, kondenzacije ili reakcije sa aldehidima [53].

Reakcije slobodnoradikalske polimerizacije odvijaju se u rastvoru uz pomoć sistema

umreživača (jedinjenja sa dve akrilatne ili metakrilatne funkcionalne grupe kao što su dietilen-

-glikol-diakrilat (DEGDA), poli(etilen-glikol-diakrilat) (PEGDA) ili etilen-glikol-dimetakrilat

(EGDMA)), inicijatora (peroksidi ili alifatična azo-jedinjenja) i katalizatora slobodnoradikalske

reakcije ili ubrzivača (najčešće se upotrebljava N,N,N',N'–tetrametiletilendiamin (TEMED)).

Modifikacijom polimernih lanaca moguće je dobiti lance koji na bočnim ostacima sadrže akrilatne

funkcionalne grupe, što omogućava umrežavanje slobodno-radikalskom polimerizacijom bez

dodatka umreživača [54]. Upotrebom fotoinicijatora, koji se razalažu na slobodnoradikalske vrste

nakon apsorpcije ultraljubičastog zračenja, moguće je izvršiti umrežavanje u kraćem vremenskom

intervalu, u poređenju sa klasičnim radikalskim polimerizacijama, bez upotrebe otrovnih katalizatora

poput TEMED [55].

Umrežavanje ozračivanjem odvija se u prisustvu zračenja visoke energije, poput gama zračenja

i zračenja elektronskim snopovima, i omogućava dobijanje sterilnih kovalentno umreženih hidrogelova

direktno iz vodenih rastvora monomera, bez dodavanja inicijatora i katalizatora [56]. Pažljivim

podešavanjem doze zračenja može se menjati stepen umrežavanja hidrogelova, što omogućava

jednostavnu kontrolu procesa. Navedene prednosti, kao i činjenica da u procesu nastaju sterilni

hidrogelovi, čini ovu metodu veoma atraktivnom za sintezu hidrogelova koji se upotrebljavaju u

biomedicinske svrhe.

Fizički umreženi hidrogelovi mogu se sintetisati jonskim ili hidrofobnim interakcijama,

stvaranjem stereo kompleksa, vodoničnim ili proteinskim interakcijama, ili kalemljenjem polimernih

lanaca [54].

2.2.1. Sinteza interpenetrirajućih polimernih mreža (IPM)

Prema IUPAC-ovoj definiciji IPM je polimerni materijal koji se sastoji iz dve ili više mreža

koje su delimično isprepletene na molekulskom nivou, ali nisu međusobno kovalentno povezane i

mogu se razdvojiti samo u slučaju kidanja veza. Smeša dva ili više prethodno obrazovanih polimera

polimera nije IPM [57]. IPM predstavljaju inovativne materijale za biomedicinske i farmaceutske

primene koji su privukli veliko interesovanje zahvaljujući boljim svojstvima žilavosti i čvrstoće u

odnosu na individualne konvencionalne jednostavne mreže od kojih su nastale [58]. Kombinacija

polimera u IPM treba da dovede do obrazovanja višekomponentnog sistema sa novim profilom

svojstava tako što se zadržavaju povoljna svojstva svake polimerne komponente IPM, ili se u nekim

slučajevima svojstva novonastalog materijala razlikuju od svojstava polaznih komponenti, sa ciljem

da se postigne kontrola, poboljšanje i kombinacija funkcionalnih svojstava polimera. Tako se, na

primer ugradnjom hidrogelova osetljivih na spoljne uticaje u IPM postižu znatno bolja mehanička

svojstva i odgovor na bubrenje/kontrakciju, nego u slučaju jednostavnih mreža, dok semi-IPM

arhitektura mreže znatno doprinosi poboljšanju osetljivosti ne spoljne uticaje [59].

U skorije vreme se u dizajniranju IPM kombinuju dve ili veći broj mreža da bi se

postigla bolja sličnost sa fizičkim svojstvima prirodnih tkiva i obezbedili bioaktivni centri ,

raspoloživi za ćelije u hidrogelnim konstrukcijama, ali i bolja kontrola održavanog otpuštanja

lekova u poređenju sa konvencionalnim hidrogelovima [60]. IPM se takođe mogu svrstati i u

klasu polimernih blendi. Guo i saradnici su pokazali da se kod trostrukih IPM na bazi kolagena,

hondroitin-sulfata modifikovanog metakrilatom i hijaluronske kiseline, mogu bolje kontrolisati

mehanička svojstva i ekspresija gena hondrogenih markera u odnosu na semi -IPM sa istim

komponentama [61].

11

Korišćenjem IPM višestruke mreže se mogu dizajnirati i tako da se postigne sinergetski

efektat [62], da se dizajniraju nanomaterijali sa dobrim mehaničkim svojstvima [63], pa čak i

biomaterijali koji imitiraju veštačka tkiva poput rožnjače [64].

2.2.1.1. Dizajn IPM

Može se reći da dizajn mreže kontroliše mehanička svojstva i degradaciju IPM. Prema

hemijskom procesu pripreme, IPM hidrogelovi se mogu klasifikovati kao simultane IPM, u slučaju

da se polazne komponente za sintezu obe mreže pomešaju i obe mreže sintetizuju istovremeno

lančanom reakcijom, ili stupnjevitom polimerizacijom, koje se nezavisno odvijaju i ne utiču jedna na

drugu. U ovu grupu spadaju i homo IPM kao poseban slučaj IPM u kojem oba polimera koji formiraju

nezavisne mreže imaju istu strukturu. Sekvencijalne IPM nastaju kada mreža prvog hidrogela nabubri

u rastvoru koji sadrži monomer, inicijator i aktivator, u prisustvu umreživača ili bez njega.

Kada je prisutan umreživač nastaju IPM dok se bez umreživača obrazuju semi-IPM, kod kojih

je linearni ili razgranati polimer smešten u mrežu prvog polimera. Iz semi-IPM se zatim može

obrazovati IPM selektivnom polimerizacijom neumreženog polimera [65]. Na Slici 5 je dat šematski

prikaz obrazovanja semi-IPM i IPM. Duple mreže (DM) predstavljaju mehanički unapređene IPM

hidrogelove, koje je prvi put sintetizovao Gong [66]. DM su privukle veliku pažnju zbog superiornih

mehaničkih svojstava i mogućnosti primene kao biomaterijala, uglavnom kao zamenu za prirodnu

hrskavicu. Ove nove hidrogelne IPM, koje karakterišu velika otpornost na habanje i jačina na lom, se

pripremaju korišćenjem jako umreženog jonskog hidrogela kao prva mreža, i slabo umreženog

neutralnog hidrogela kao druge mreže. Prva mreža obezbeđuje krutu strukturu, dok druga obezeđuje

veliku žilavost svojom fleksibilnšću. DM su veoma značajne jer se inkorporiraju u ECM hrskavica i

drugih skeletnih tkiva, čime se postiže velika mehanička jačina. Dvostruke mreže, za razliku od DM,

se definišu kao dva materijala zajedno umrežena u istu mrežu sa sličnim mehanizmom umrežavanja.

Iako dvostruke mreže nemaju veliku žilavost kao duple mreže, svaki materijal koji je ugrađen može

doprineti novonastalom hidrogelu svojim korisnim svojstvima. Tako jedan materijal može da

omogući efikasnu integraciju u okolno tkivo, dok drugi privlači ćelije i pospešuje njihovu migraciju

u hidrogel. Tako su Moreira, Teikseira (Teixeira) i saradnici koristili dekstran-tiramin i heparin-

tiramin hidrogelne dvostruke mreže da enkapsuliraju goveđe hondrocite in vitro, i utvrdili da se time

postiže veća vijabilnost i proliferacija ćelija [67].

Injektabilni hidrogelovi su vrlo pogodni za primenu u inženjerstvu tkiva hrskavice pošto se

mogu uneti putem direktnog ubrizgavanja ili artroskopski [68]. Hidrogelovi kojima se smanjuje

viskoznost, tj. povećava tečenje prilikom smicanja (shear-thinning), su važni zbog mogućnosti

unošenja na određeno mesto ubrizgavanjem. Po ubrizgavanju hidrogelu se smanji viskoznost zbog

prestanka smicanja, pa se ponovo uspostavlja prethodno viskoznije stanje. Primer ovakvog ponašanja

na bazi reverzibilnih veza između gosta (hijaluronske kiseline modifikovane adamantanom) i

domaćina (hijaluronske kiseline modifikovane β-ciklodekstrinom), koje su nazvane gost–domaćin

interakcije su prikazali Rodel (Rodell) i saradnici [69].

12

Slika 5. Šematski prikaz obrazovanja semi-IPM i IPM. Polimer A i polimer B su polazni polimeri

(linearni, kalemljeni ili u obliku češlja), α i β su hemijski ili fizički umreživači [70].

Kod ove vrste interakcija dolazi do brzog obrazovanja hidrogelova putem nekoovalentnih

interakcija tipa gost–domaćin. Na Slici 6 su prikazane različite vrste kombinacija mreža i polimera

koje se koriste za poboljšanje svojstava hidrogelova.

2.2.1.2. Sinteza hibridnih hidrogelova

Hibridni hidrogelovi su umreženi sistemi, koncipirani na način da obezbede strukturnu

potporu za rast, diferencijaciju i proliferaciju ćelija, što je omogućeno kombinacijom prirodnih i

sintetičkih polimera. Kako sintetički hidrogelovi ne poseduju sopstvenu bioaktivnost, potrebno je da

im se inkorporira neki biofunkcionalni polimer, kao što su oligopeptidi, proteini ili biološki molekuli

poput heparina, koji se nalazi u prirodnim tkivima, da bi se uspešno imitirale prirodne ECM [71]. Za

biološke primene materijal mora biti biokompatibilan, biodegradabilan i da poseduje adhezivnost za

čelije. Osim toga, mora imati poroznu, mehanički stabilnu trodimenzionalnu strukturu. Sintetički

polimeri, kao što je ranije pomenuto, obezbeđuju povoljne molekulske strukture i hemijska svojstva,

13

dok prirodni materijali obezbeđuju karakteristike koje su jedinstvene za prirodno tkivo [72]. Takođe,

ugradnjom različitih tipova struktura u matricu hidrogela mogu značajno da poboljšaju svojstva

trodimenzionalnih sistema.

Slika 6. Šematski prikaz različitih dizajna hidrogelova (a) konvencionalna mreža hidrogela koja se

sastoji iz jedne vrste polimera, (b) interpenetrirajuće polimerne mreže,

(c) semiinterpenetrirajuće polimerne mreže, (d) duple mreže

(e) dvostruke mreže i (f) mreže gost–domaćin [73]

U opštem slučaju to se može izvesti ubacivanjem sekundarne polimerne mreže ili polimera i

na taj način se formiraju hibridne IPM i semi-IPM, ili ubacivanjem mikro- ili nanočestica, ili

trodimenzionalnih struktura na bazi vlakana u osnovnu mrežu [74]. Kako su biološki inertni, sintetički

hidrogelovi su korisni za dobijanje trodimenzionalnih skafolda, koji služe za in vitro ispitivanje

odgovora ćelija na sintetički ECM, ali omogućavaju i nezavisnu kontrolu biomolekulskih i

strukturnih karakteristika prirodnih ECM [75]. Od sintetičkih polimernih komponenti u hibridnim

hidrogelovima za primenu u inženjerstvu tkiva mnogo su ispitivani hidrogelovi na bazi poli(etilen-

glikola) (PEG), usled mogućnosti jednostavne modifikacije strukture i velikog iskustva u primeni kod

mnogih klinički ispitanih proizvoda [76]. Da bi se dodatno poboljšala mehanička jačina umrežene

strukture, kompozitni hibridni hidrogelovi obezbeđuju mehaničko ojačanje [77]. Otpuštanje lekova

se može postići ubacivanjem i druge faze, koja se sastoji od nano- ili mikročestica sa inkorporiranim

lekom, u takav sistem [78]. Ugradnjom biofunkcionalnih molekula, kao što su faktori rasta [79] i

signalni molekuli [80], obezbeđuje se adhezija za ćelije i degradabilnost materijala. Kontrolisano

otpuštanje biomolekula može da izmeni imuni odgovor organizma na ugrađeni materijal [81] tako da

se istovremenim otpuštanjem terapeutskih agenasa i DNK mogu proširiti funkcije hidrogela i na

terapije kancera i terapije genima [82]. Primena hidrogelova sa podesivim svojstvima u inženjerstvu

14

tkiva je velika, između ostalog, zavaljujući lakoći podešavanja svojstava jednostavnom ugradnjom

komponenti koje su potrebne za određenu primenu.

2.2.1.3. Hidrogelovi na bazi proteina

Najvažnije vrste polimera koje se koriste za sintezu IPM su prirodni polimeri i njihovi derivati

(polisaharidi i proteini) i sintetički hidrofilni polimeri pri čemu su najčešće kombinacije

sintetički/sintetički polimer, protein/sintetički polimeri i polisaharid/sintetički polimeri. Za

kombinacije sa prirodnim proteinima se najčešće koriste kolagen, želatin, fibrin i fibroin svile, dok u

kombinacije sa polisaharidima ulaze hijaluronska kiselina, hondroitin-sulfat, alginati i hitozan.

Kolagen, koji kod različitih tkiva predstavlja osnovnu komponentu EMC, je vrlo interesantan

materijal za sintezu hidrogelova [83]. Njegov derivat želatin se takođe vrlo često koristi zbog dobre

rastvorljivosti u vodi i niže cene u poređenju sa kolagenom. Hidrogelovi na bazi želatina su dobri

kandidati za primenu u inženjerstvu tkiva [84]. Ugrađivanjem hijaluronske kiseline i želatina u

biološki neaktivan polikaprolakton (PCL), nastao je hibridni hidrogel koji ima povećanu bioaktivnost

i bolju citokompatibilnost [85].

2.2.2. Sinteza hidrogelova kriogenom metodom

U novije vreme je sinteza različitih polimera kriogenom metodom, koja se koristi za dobijanje

poroznih materijala, privukla veliku pažnju. Kriogenom metodom sinteze se obrazuju

trodimenzionalne strukture koje sadrže otvorene i međusobno povezane pore različitih veličina. Ovo

predstavlja rezultat kontrolisanog zamrzavanja u toku reakcije polimerizacije, da bi se na taj način

obezbedili mehanički stabilni skafoldi koji oponašaju funkciju ECM [12].

Osnovni zadatak koji treba da ispuni trodimenzionalna struktura za primene u inženjerstvu

tkiva je da sačuva sposobnost ćelija za diferenciranje i omogući optimalnu proliferaciju ćelija,

vaskularizaciju, razmenu tečnosti i hranljivih supstanci neophodnih za preživljavanje ćelija, kao i

uklanjanje otpadnih metabolita, za šta je potrebno prisustvo velikih pora koje su međusobno povezane

[86].

Postoji čitav niz prednost kriogelova u odnosu na klasične sisteme hidrogelova i druge načine

dobijanja makroporoznih mreža: izuzetno povoljna kombinacija velike poroznosti, velikog stepena

bubrenja, dobre osmotske stabilnosti i mehaničke čvrstoće, zbog čega se kriogelovi smatraju vrlo

perspektivnim materijalima za razne biomedicinske primene. Osnovna prednost kriogelova kod

primene u inženjerstvu tkiva je da obezbeđuju dobru vaskularizaciju [87]. Postupak sinteze

kriogelova je vrlo jednostavan, dok je primena vode kao rastvarača velika prednost za primene

sintetisanih materijala u biomedicini [88].

Makroporozna struktura hidrogelova se može obrazovati različitim metodama kao što su

ispiranje čestica (particle-leaching), razvijanje gasa (gas-blowing) i druge, ali ove metode dovode do

velikog udela pora sa tankim zidovima, usled čega dobijeni hidrogelovi poseduju slaba mehanička

svojstva.

15

Slika 7. Pojednostavljeni dijagram za formiranje

a) klasičnih makroporoznih hidrogelova i b) kriogelova [88]

Veliki broj materijala se može koristiti za dobijanje pora uključujući soli, silika-gel, šećere,

sfere želatina i žive bakterije. Problemi vezani za navedeni pristup se ogledaju u uklanjanju porogena

nakon sinteze i nedovoljnom stepenu umreženja nastalih pora [88]. U zavisnosti od hemijskog sastava

porogena, rastvarač koji se koristi za uklanjanje porogena može zaostati u strukturi skafolda, što

zahteva ispiranje velikom količinom vode da bi se sprečili, ili u najvećoj meri smanjili, štetni efekti

po ćelije. Posledica prekomernog ispiranja je da zahteva dosta vremena, stvara nepotrebni otpad i

nove prilike za dodatnu kontaminaciju materijala. S druge strane, porogeni koji nisu potpuno

uklonjeni iz hidrogelova mogu biti uzrok citotoksičnosti dobijenih materijala, što rezultuje u

nepovoljnim efektima nakon implantiranja u živi organizam.

Obrazovanje pora zasnovano na krioskopskom želiranju daje znatno bolje rezultate u pogledu

mehaničkih svojstava i povoljniju strukturu. Krioskopsko želiranje ili krioželiranje (cryogelation) se

odigrava nakon zamrzavanja reakcionog sistema. Pre formiranja kriogelova u početnoj smeši mora

da se odigra kristalizacija u masi rastvarača (koji je najčešće voda), tako što će se reakcija odigrati na

temperaturi ispod tačke mržnjenja rastvarača. U toku kriogenog postupka dolazi do smanjenja kritične

koncentracije monomer/polimer, kao i vremena potrebnog za želiranje. Kriogelovi se najčešće

formiraju stvaranjem kovalentnih veza u toku slobodno-radikalskom polimerizacijom, u vodenoj

sredini u kojoj su rastvorene hemikalije (monomeri/prepolimeri/umreživači i sistem inicijatora) [88].

Kako se prilikom kristalizacije čistog rastvarača u toku zamrzavanja smanjuje ukupna

zapremina faze koja nije zamrznuta u odnosu na početnu reakcionu zapreminu, koncentracija

monomera ili polimera se znatno poveća. U zamrznutom uzorku želiranje se odvija u koncentrovanoj

tečnoj mikrofazi koja se nalazi u međuprostoru između kristala rastvarača, koji imaju ulogu porogena

u toku obrazovanja gela. Želiranje polimera se može desiti u nekoj od faza kriogenog postupka: u

toku zamrzavanja početnog sistema, tokom čuvanja uzoraka u zamrznutom stanju ili u toku

odmrzavanja zamrznutog uzorka [89]. Kada se želiranje završi kristali rastvarača se lako uklanjaju

odmrzavanjem na sobnoj temperaturi. Pošto u toku krioželiranja kristali rastvarača rastu dok ne dođu

u kontakt sa drugim kristalima, nastaju hidrogelovi sa makroporoznom strukturom u kojoj su pore

međusobno povezane. Povećana koncentracija reaktanata u tečnoj mikrofazi je uzrok stvaranja velike

gustine polimernih zidova makropora. Kriogelovi dobijeni na ovaj način imaju nova, povoljna

16

svojstva, brzo bubre i imaju veliku stišljivost, pri čemu se ne oštećuje struktura gela. Ova praktična i

jednostavna metoda se danas mnogo koristi za primene u inženjerstvu tkiva [90]. Na Slici 8 su

prikazane različite tehnike, kao i odgovarajuće faze za dobijanje makroporoznih hidrogelova i

mikrografi dobijeni pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa (SEM) za dobijene uzorke:

so/porogen metoda [91], oslobađanje gasa [92], sušenje uz zamrzavanje (liofilizacija) [93] i

krioželiranje [94].

Slika 8. Različite tehnike i odgovarajuće faze za dobijanje makroporoznih hidrogelova i SEM

mikrografi dobijenih uzoraka. Bar na SEM mikrografima je 100 μm [95]

U Tabeli 1 je prikazan uticaj promenljivih parametara u sintezi na karakteristike i svojstva

obrazovanih makroporoznih polimernih mreža [95]. Osim povoljne morfologije, skafoldi za

inženjerstvo tkiva moraju biti biokompatibilni i biodegradabilni, pošto po stvaranju novog tkiva

skafold koji je služio kao matrica za njegovo obrazovanje, treba da se reapsorbuje a da pri tome ne

prouzrokuje zapaljenjski proces.

Makroporozne kriogelne matrice su uglavnom dobijene korišćenjem prirodnih biodegradabilnih

polimera. Kako prirodni polimeri i njihovi derivati poseduju određene mane, poput mogućnosti imune

reakcije ili nerastvorljivosti, koje zavise od izvora dobijanja, pojavila se potreba za obrazovanjem

skafolda na bazi sintetičkih polimera, kod kojih je moguća kontrola i reproduktivnost sinteze i dobijenih

svojstava. Ipak, do sada je objavljen relativno mali broj radova o kriogelovima na bazi sintetičkih

polimera. Primer kriogela na bazi sintetičkih polimera je sinteza kriogela na bazi N-vinilkaprolaktama,

koji podleže hidrolitičkoj degradaciji [96] kao i radovi o kriogelovima na bazi vinilnih monomera [97,

98]. U novije vreme se sve više koriste kompozitni [99] i hibridni kriogelovi na bazi prirodnih i

sintetskih polimera [100].

17

Tabela 1. Uticaj podesivih parametara na karakteristike i svojstva kriogelova

Parametri Uticaj

Tip umreženja

Fizičko umreženje: dobijaju se gelovi sa nedovoljno velikim

porama čija je jačina obrnuto proporcionalna brzini hlađenja

Hemijsko umreženje: dobijaju se gelovi sa dovoljno velikim

porama, ali je moguća citotoksičnost

Temperatura Kada se poveća: povećava se veličina pora, debljina zidova i

gustina pora

Molarna nasa polimera Kada se poveća: poveća se krutost gela

Kada se smanji: poveća se veličina pora

Krio koncentracija Kada se poveća: poveća se elastičnost

Kada se smanji: produži se vreme želiranja

Brzina umreženja Kada se poveća: opada veličina pora

2.2.3. Sinteza degradabilnih polimera

Razvoj i dizajn novih biomaterijala je tokom poslednjih nekoliko decenija mnogo napredovao

u pogledu dobijanja različitih struktura i dinamičkih funkcionalnosti (na bazi dinamičkih kovalentnih

veza), u cilju praćenja biološke složenosti i oponašanja funkcija organizma [101]. Primer takvih

biomaterijala su biodegradabilni i biokompatibilni katjonski polimeri, poli(β-aminoestri), koji su

zbog dobrih svojstava našli veliku primenu u razvoju sistema za kontrolisano otpuštanje lekova i gena

[102]. Za navedene sisteme su vrlo značajna svojstva PBAE kao što su pH-osetljivost,

biodegradabilnost, mala toksičnost, velika rastvorljivost u vodi, brzo otpuštanje leka u kiseloj sredini

i velika efikasnost prenosa DNK za terapiju genima [103]. Po strukturi PBAE su veoma slični

poli(amidoaminima), koji nastaju u reakciji konjugovane adicije amina sa bis(akrilamidima) [104].

Kako poseduju svojstva poliamina i mogu vršiti ulogu pufera u okolnoj sredini, PBAE su izuzetno

pogodni za otpuštanje polinukleotida i aktivnih supstanci labilnih u kiseloj sredini [105], a takođe se

mogu koristiti i za otpuštanje aktivnih supstanci male molarne mase kao i oligonukleotida i plazmida

DNK [106]. Studije citotoksičnosti i biokompatibilnosti pokazale su znatno manju toksičnost PBAE

u poređenju sa drugim katjonskim polimerima koji se danas koriste u medicini, kao što su

poli(etilenimin) i poli(L-lizin) [107]. Degradacija PBAE odvija se u fiziološkim uslovima, usled

hidrolize estarskih grupa u osnovnom lancu, pri čemu nastaju mali molekuli bis(β-aminokiselina) i diola

koji su relativno biokompatibilni kod sistemskih primena leka. Interakcijom pozitivnog naelektrisanja

na tercijarnoj amino grupi PBAE sa negativnim naelektrisanjem gena ili aktivnog agensa mogu nastati

nanočestice [1]. Osim toga, kod amino grupa se u zavosnosti od pH vrednosti okolne sredine odigrava

fazni prelaz, što za rezultat ima dualnu osetljivost ovih jedinjenja, pH-osetljivost i svojstvo

reverzibilnosti naelektrisanja, usled čega se PBAE mogu koristiti za pH-osetljivo i ciljano otpuštanje

leka, na određeno mesto i u određeno vreme [108]. PBAE su kompatibilni sa čitavim nizom sintetskih

polimera kao što su poli(etilen-glikol) [109], poli(mlečna kiselina) [110] i poli(ε-kaprolakton), sa

kojima grade blok kopolimere. Ovi primeri pokazuju raznovrsnost primene PBAE zahvaljujući

mogućnosti modifikovanja njihovih fizičkih, hemijskih i mehaničkih svojstava.

Uvođenjem terapeutskih sredstava koja se unose intraćelijski i dalje prenose u nukleus stvorila

se potreba za biomaterijalima osetljivim na intraćelijske stimulanse kao što je pH. PBAE u vodenoj

18

sredini pokazuju pH-osetljivost što ih čini pogodnim za primenu u sistemima za otpuštanje lekova,

kao okidača, ili za poboljšanje intraćelijskog otpuštanja leka, zahvaljujući dejstvu kisele sredine

[105].

Čvrsti neprotonovani uzorci PBAE nerastvorni su u fiziološkim uslovima (pH 7,4), ali se

trenutno rastvaraju u vodenoj sredini kada je pH vrednost ispod 6,5 [111]. Prelaz iz čvrstog stanja u

rastvoren oblik odvija se u opsegu ekstracelularnih i endozomalnih/lizozomalnih pH vrednosti (7,4

odnosno 5,0–6,5). PBAE mogu biti vrlo korisni za otpuštanje terapeutskih sredstava u blizini mase

tumora. Kada se nagomilaju na mestu tumora mogu delovati kao lokalni rezervoar leka i tako

obezbediti stalno doziranje leka direktno u masu tumora. Sistemi na bazi PBAE mogu se obraditi i

koristiti u različitim formulacijama poput nanokompozita, micela, hidrogelova i filmova za primene

kod terapeutskog otpuštanja i regeneracije tkiva.

2.2.3.1. Sinteza PBAE

Iako su otkriveni ranije, PBAE dolaze u žižu interesovanja tek od 2000. godine kada su Lin

(Lynn) i Langer objavili svoje istraživanje sinteze amina (N,N’-dimetiletilenediamina, piperazina i

4,4’-trimetilenedipiperidina) sa diakrilatom (1,4-butandiol-diakrilatom) [112]. PBAE nastaju

jednostavnom reakcijom Majklove adicije akrilatne i amino grupe u jednom stupnju. Monomeri

koji se koriste za sintezu PBAE makromera mogu imati hidrofobne (alkil, aril i estarska grupa) ili

hidrofilne grupe (etarska grupa). Pored toga, mogu se upoterbljavati i razni višefunkcionalni akrilati

kao tri-, tetra- ili pentaakrilati. U poređenju sa akrilatnim komponentama, amini više utiču na

svojstva PBAE kao što su hidrofobnost, osetljivost na spoljne stimulanse i mogućnost modifikacije

nakon sinteze [113]. PBAE poseduju svojstva karakteristična za tercijarne amine i estre. Iz širokog

spektra komercijalno dostupnih amina i diakrilata moguće je dobiti veliki broj različitih strukturnih

varijanti sa različitim fizičkim, hemijskim i mehaničkim svojstvima [104]. Na taj način je stvorena

polimerna biblioteka PBAE različite strukture sa mogućnošću dalje modifikacije, tako da se oni

mogu koristiti u različitim formulacijama, sami ili sa drugim jedinjenjima, da bi se primenili u

otpuštanju lekova, gena ili antimikrobnih sistema i regeneraciju tkiva.

Hidrogelovi na bazi PBAE se najčešće sintetizuju slobodno-radikalskom polimerizacijom

makromera. Hemijskom inicijacijom se dobijaju polimeri sa optimalnim svojstvima u pogledu

dimenzija i ugradnje bioaktivnih molekula. Polimerizacija se obično odvija na nižim

temperaturama, u trajanju od 20 do 72 h, čime se izbegava denaturacija bioaktivnih molekula.

Polimerizacija inicirana UV zračenjem pokazala se kao manje povoljna u poređenju sa hemijskom,

jer UV zraci imaju ograničen opseg prodiranja. Reakcija polimerizacije može se izvoditi u velikom

broju polarnih i nepolarnih rastvarača dok se halogenovani rastvarači izbegavaju usled

citotoksičnosti [107].

Struktura PBAE zavisi od broja (N) reaktivnih mesta u akrilatima i aminima koji se koriste u

reakciji polimerizacije. Primarni amini imaju dva reaktivna mesta (NB = 2) koja mogu da reaguju sa dva

odgovarajuća mesta na akrilatu (NA = 2) na krajevima lanca da bi nastali linearni polimeri. Slično se

događa kada amini poseduju dve sekundarne amino grupe, pošto jedna sekundarna amino grupa ima

jedno aktivno mesto koje može da reaguje sa jednom akrilatnom grupom. Razgranati PBAE se dobijaju

iz triakrilata (NA = 3) i amino jedinjenja koja imaju dva reaktivna mesta (NB = 2) i obrnuto (NA = 2, NB

= 3) (Slika 10) [114].

19

Slika 9. Šematski prikaz materijala na bazi PBAE i njihove primene

Fizičko-hemijska svojstva PBAE kao što su molarna masa, indeks polidisperznosti,

hidrofobnost i naelektrisanje zavise od monomera koji se koriste u reakciji polimerizacije. U

zavisnosti od prirode monomera i uslova sinteze molarna masa PBAE može da se kreće od 0,5–120

kDa, sa većim vrednostima za polidisperznost (>1,3), u poređenju sa drugim tipovima polimerizacije,

kao što su polimerizacija sa prenosom lančane aktivnosti i radikalna polimerizacija uz prenos atoma.

PBAE imaju tercijarnu amino grupu u osnovnom lancu polimera, koja protonovanjem postaje

pozitivno naelektrisana i hidrofilna, pa su stoga pH-osetljivi u širokom opsegu pH vrednosti (od 3,5

do 7,2) [5]. Vrednosti pKa tercijarne amino grupe kod PBAE u velikom stepenu zavise od

hidrofobnosti polimera. Mehanička svojstva i biodegradabilnost se mogu podešavati prilikom sinteze

PBAE i izuzetno su važni za njihovu primenu. Ova jedinjenja su stabilna u kiseloj sredini, dok se u

fiziološkim uslovima i u baznoj sredini degradiraju, najčešće hidrolizom estarskih grupa u osnovnom

lancu. Proizvodi hidrolize su mali molekuli poput bis(β-amino-kiselina) i diola [115], koji imaju mali

uticaj na metabolitičku aktivnost zdravih ćelija [116].

20

Slika 10. Šematski prikaz linearnih, razgranatih i umreženih PBAE

i primer sinteze Majklovom adicijom amina i akrilata [103]

2.3. Karakterizacija hidrogelova

2.3.1. Biodegradabilni polimeri

Biodegradabilni polimeri predstavljaju jednu od najvažnijih klasa biomaterijala koja pod

određenim uslovima može da degradira do netoksičnih proizvoda, u toku vremena primene ili

neposredno posle, zbog čega su našli široku primenu u medicini i farmaciji kao matrice za otpuštanje

lekova [117], skafoldi za inžinjering tkiva [118], degradabilni implanati u ortopedskoj hirurgiji [119]

i druge. Sve ove primene se zasnivaju na činjenici da polimeri potpuno degradiraju nakon što obave

željenu funkciju. Pod pojmom degradacije smatra se proces raskidanja kovalentnih veza u osnovnom

lanacu polimera, prilikom čega nastaju prvo oligomeri, a na kraju procesa monomeri (ili jedinjenja

male molarne mase).

Neželjena degradacija polimernih lanaca često ograničava učinak materijala za medicinsku i

farmaceutsku primenu. Na primer, polimeri koji se upotrebljavaju za pravljenje trajnih

biomedicinskih implanata moraju da budu stabilni u biološkom okruženju, kako bi uređaj mogao da

neometano obavlja svoju funkciju tokom dugog niza godina. Međutim, kada su u pitanju implanti za

inžinjering tkiva, potrebno je da se odaberu polimeri koji degradiraju unutar vremenskog okvira koji

je uporediv sa trajanjem procesa regeneracije tkiva (može trajati od par nedelja do nekoliko godina).

Slično, za polimere koji se koriste kao matrice za otpuštanje lekova, potrebno vreme degradacije se

kreće u opsegu od nekoliko dana do nekoliko godina.

21

Biodegradabilni polimeri se mogu klasifikovati na prirodne i sintetičke u zavisnosti od

porekla. Prirodni biodegradabilni polimeri prikazani su na Slici 11 [120]. Njihovu praktičnu primenu

ograničava slaba mehanička jačina, nepoznata brzina degradacije i visoka fiziološka aktivnost [119].

Da bi se savladale prepreke nametnute korišćenjem prirodnih biodegradabilnih polimera i uspešno

oponašale njihove povoljne osobine, dizajnirani su sintetički polimeri sa tačno poznatim

karakteristikama. Sintetički polimeri koji se najčešće upotrebljavaju u biomedicinske svrhe i njihova

primena prikazani su u Tabeli 2.

Slika 11. Podela prirodnih biodegradabilnih polimera [151]

Svi biodegradabilni polimeri sadrže veze koje podležu hidrolizi, te je stoga najvažniji

mehanizam degradacije hemijska degradacija putem hidrolize ili enzimski katalizovana hidroliza,

koja se naziva i biodegradacija, što znači da je degradacija bar delimično izazvana biološkom

sredinom. Prodiranje vode u masu polimera koji degradira obično je praćeno bubrenjem i služi kao

okidač za hemijsku degradaciju polimera, što dovodi do stvaranja oligomera i monomera.

Napredovanjem degradacije menja se mikrostruktura polimerne matrice i formiraju se pore u

trodimenzionalnoj strukturi, tako da se oligomeri i monomeri prisutni unutar matrice rastvaraju u

vodenoj sredini [121]. U isto vreme, proizvodi reakcije, koji uglavnom poseduju neku kiselinsko-

baznu funkcionalnost počinju da kontrolišu pH vrednost unutar pora. Konačno, oligomeri i monomeri

odlaze iz matrice, što dovodi do gubitka mase polimerne matrice [122].

Polimeri koji degradiraju hidrolitički uključuju alifatične poliestre, poliortoestre,

polianhidride, polikarbonate i poliamide (Šematski prikaz reakcije hidrolize prikazan je na Slici 12)

[123]. Faktori koji određuju brzinu hidrolitičke degradacije polimerne matrice su hidrofilnost, gustina

umreženja, pH, priroda labinih veza, poroznost i prisupačnost vode labilnim vezama, i u zavisnosti

od navedenih faktora hidroliza može trajati od nekoliko časova do nekoliko godina [124].

22

Tabela 2. Sintetički biodegradabilni polimeri i njihove primene [119]

Sintetički degradabilni polimeri Primene

Policijanoakrilati Adhezivi, otpuštanje lekova

Polianhidridi Otpuštanje lekova

Poli(aminokiseline) Otpuštanje lekova, inžinjering tkiva, primena u

ortopediji

Poli(ortoestri) Otpuštanje lekova, izrada stentova

Polifosfazeni Otpuštanje lekova, rekonstrukcija skeleta

Poli(propilenfumarat) Primena u ortopediji

Polilaktidi (PLA), poliglikolidi (PGA)

i njihovi kopolimeri

Membrane, otpuštanje lekova, regeneracija tkiva,

izrada stentova, inžinjering tkiva

Polihidroksibutirat (PHB), polihidroksivalerat

(PHV), i njihovi kopolimeri

Otpuštanje lekova u dužem vremenskom

periodu, primena u ortopediji, izrada stentova

Polikaprolakton (PCL) Otpuštanje lekova u dužem vremenskom

periodu, primena u ortopediji, izrada stentova

Polidioksanon Fiksiranje preloma za kosti koje ne nose veći

teret, zatvaranje rana

Poliestri se često koriste kao materijal za implante jer imaju prirodni metabolički put in vivo

[125] (in vitro je ovaj aspekt mnogo umanjen usled promene puferovanih medija). Tokom degradacije

poliestri otpuštaju vodonične jone, smanjujući lokalnu pH vrednost, što za posledicu ima ubrzavanje

procesa degradacije. Kod primena kod kojih je vaskularnost relativno ograničena, tj. ishrana ćelija se

odvija putem difuzije, kao kod hrskavice [126], brza degradacija poliestara bi mogla nepovoljno da

utiče na vijabilnost ćelija i prouzrokuje upale, što komplikuje regeneraciju tkiva [127]. U toku procesa

degradacije se povećavaju pore, što konačno rezultuje u povećanju površine za vezivanje ćelija i

moguće povećanje razmene fluida, što ubrzava regeneraciju tkiva i dokazuje da su procesi degradacije

biomaterijala i brzine regeneracije tkiva međusobno povezani [128].

Biodegradabilni polimeri koji su u najvećoj meri ispitivani su alifatični poliestri na bazi

mlečne i glikolne kiseline [129]. Homo i kopolimeri laktida i glikolida bili su u fokusu velikog broja

istraživanja usled odlične biokompatibilnosti i osobine da podležu hidrolitičkoj degradaciji do mlečne

i glikolne kiseline, koje se naknadno uklanjaju u vidu ugljen dioksida i vode preko Krebsovog ciklusa.

Polimeri se mogu učiniti biodegradabilnim uvođenjem labilne estarske, anhidridne ili amidne

hemijske veze, koje su podložne degradaciji poznatim mehanizmima.

Biodegradabilni polimeri podležu hidrolitičkom raskidanju veza usled čega nastaju proizvodi

degradacije koji su rastvorni u vodi i nevodenim sredinama, što rezultuje u eroziji polimera. Erozija

podrazumeva gubitak materijala iz polimernih matrica usled eliminacije oligomera i monomera koji su

nastali kao rezultat odigravanja degradacije. U navedenom kontekstu, degradacija je hemijski fenomen

i predstavlja ključni korak u procesu erozije, koja pored toga uključuje i fizičke fenomene, poput

bubrenja, rastvaranja i difuzije oligomera i monomera, kao i morfološke promene [122].

23

Slika 12. Reakcija hidrolitičkog raskidanja veza kod različitih funkcionalnih grupa [123]

Procesi koji se odigravaju pri eroziji polimera su komplikovani. Erozija polimernih matrica

može da se odvija preko dva alternativna fizička mehanizma: a) površinske erozije, gde dolazi do

gubitka materijala samo sa površine, i b) erozije u masi (Slika 13).

Slika 13. Šematski prikaz A) površinske erozije i B) erozije u masi, i efekata degradacije na

mehaničku jačinu, molarnu masu i preostalu masu materijala [124]

24

U idealnom slučaju površinske erozije, brzina erozije je proporcionalna spoljašnjoj površini

polimerne matrice. Pošto se masa gubi samo sa površine polimerne matrice, molarna masa preostalih

polimernih lanaca i mehanička snaga se ne menjaju. Kod erozije u masi, masa i dimenzije materijala

ostaju nepromenjene, sve dok polimerni lanci ne dostignu kritičnu vrednost molarne mase. Nakon

toga, materijal gubi mehaničku jačinu i dolazi do naglog otpuštanja proizvoda degradacije, što za

posledicu ima i nagli gubitak mase.

2.3.1.1. Ispitivanje biodegradacije polimera

Kod ispitivanja degradabilnog polimera za primenu u biomedicini, prvi korak je proučavanje

degradacije in vitro u sredini koja simulira biološke uslove u organizmu u pogledu temperature, pH

vrednosti, koncentracije jona u rastvoru i mehaničkog opterećenja. Osim toga, potrebno je da se

mehanizam degradacije, vreme potpune degradacije i gubitka mase, degradacioni proizvodi i brzina

njihovog otpuštanja dobro ispitaju da bi mogli da se kontrolišu [121]. Biodegradabilnost polimernih

materijala zavisi od njihove strukture, fizičkih i hemijskih svojstava i brzine otpuštanja proizvoda

degradacije. Najvažniji parametar za praćenje degradacije je molarma masa. Osim smanjenja molarne

mase predloženi su i drugi parametri za merenje degradacije, kao što je gubitak mase, opadanje

mehaničke jačine, potpuna degradacija do monomera ili otpuštanje monomera. Metode za praćenje

degradacije su i viskozimetrija, gel propusna hromatografija, mikro-računarska tomografija i druge.

2.3.2. Biokompatibilnost hidrogelova

Pojam biokompatibilnost pominje još od 1970. godine, ali je zvanična definicija formulisana

tek 1987. godine na konferenciji o biomaterijalima u Česteru, u Velikoj Britaniji, i ona glasi:

„Biokompatibilnost je sposobnost materijala da obavlja specifičnu funkciju sa povoljnim odgovorom

organizma-domaćina“ [130]. Iako precizna i korisna sa filozofskog aspekta, ova definicija ne pruža

uvid u to kako je moguće oceniti (vrednovati) biokompatibilnost ili je unaprediti [131]. Vilijams

(Williams) je 2008. godine proširio definiciju biokompatibilnosti tako da se ona odnosi na:

sposobnost biomaterijala da vrši odgovarajuću funkciju, imajući u vidu medicinsku terapiju, bez

izazivanja bilo kakvih neželjenih lokalnih ili sistemskih efekata kod primaoca ili korisnika terapije,

ali uz stvaranje željenog povoljnog odgovora ćelija ili tkiva u toj specifičnoj situaciji, uz optimizaciju

klinički bitnog učinka te terapije [130]. Koan (Kohane) i Langer su 2010. redefinisali

biokompatibilnost i pokušali da je opišu kroz novi kontekst kao: izraz benignosti odnosa između

materijala i biološkog okruženja [132]. Postoji velika raznolikost biomaterijala koji se koriste za

inžinjerstvo tkiva i oni se uopšteno mogu razvrstati na prirodne (dobijene iz autologih, alogenih ili

ksenogenih izvora), sintetičke ili hibridne materijale, koji predstavljaju mešavinu prirodnih i

sintetičkih [133]. Ove materijale je moguće razviti i obraditi kako bi dali funkcionalne porozne

skafolde koji se mogu koristiti za regeneraciju ili modifikaciju tkiva.

Funkcionalnost uređaja koji se zasnivaju na biomaterijalima je najvažnija za njihovu upotrebu

in vivo i ona podrazumeva: obnavljanje odgovarajuće funkcije i ćelijske fenotipske ekspresije tkiva,

inhibicija makrofaga i odgovora džinovskih ćelija tipa “oko stranog tela“ i imunog sistema koji bi

degradirali materijal i uništili funkcionalnost uređaja, i prevencija nastajanja ožiljaka koji bi ometali

funkcionisanje biomaterijala [134]. Poslednjih godina fokus inžinjerstva tkiva je na kreiranju

materijala koji bi dugoročno mogli da koegzistiraju sa živim tkivima i pružali veću kontrolu nad

inflamatornim i imunim odgovorima organizma radi smanjivanja verovatnoće odbacivanja implanata

kod pacijenata [135]. Prilikom implantiranja biomaterijala u organizam može doći do jedne ili više

povoljnih i/ili nepovoljnih reakcija, koje uključuju interakcije sa krvlju (hemoliza) ili matičnim

25

ćelijama, formiranje privremenog matriksa, privremene upale, lečenje tkiva, formiranje granularnog

tkiva, reakciju na strana tela ili oksidativni stress [136]. Pored toga, organizam može razviti stečeni

ili urođeni imuni odgovor na biološke komponente implanta, što potencijalno može učiniti

biomaterijal beskorisnim.

Cilj ispitivanja biokompatibilnosti materijala je određivanje njegovih fizičkih, mehaničkih i

hemijskih osobina, kao i potencijalnih citotoksičnih, mutagenih ili alergenih efekata, kako materijal

ne bi izazvao oštećenja ili neželjne toksične ili sporedne efekte u organizmu-domaćinu [137].

Radi što efikasnijeg testiranja biokompatibilnosti, biološki testovi za biomaterijale su

standardizovani, kako bi se dobio efektivni i bezbedni protokol, pouzdaniji od upoređivanja više

rezultata dobijenih iz različitih studija. Standardizacijom ispitivanja povećava se reproducibilnost,

kao i lakše poređenje rezultata koji su dobijeni pod identičnim uslovima u različitim laboratorijama.

Testovi za određivanje biokompatibilnosti podeljeni su u 3 grupe, primarne (nivo I, in vitro),

sekundarne (nivo II, in vivo) i predkliničke testove (nivo III) [138]. Navedeni testovi uključuju

ispitivanja citotoksičnosti, potenicijala iritacije i sistemske toksičnosti u životinjama kroz

intramuskularne i potkožne implante, kao i testove upotrebe materijala, posmatranjem reakcije tkiva

nakon ugradnje. Ispitivanje biokompatibilnosti je izuzetno kompleksan proces koji uključuje

postepeno istraživanje sistema na koji utiče veći broj parametara. U slučaju hidrogelova, navedeni

parametri uključuju karakteristike polimerne mase (sastav polimera, stepen kristaliničnosti i

morfologiju unutrašnjosti), površinska svojstva (hemijska svojstva površine polimera, hidrofilnost i

morfologiju površine), kinetiku degradacije i prirodu nastalih proizvoda degradacije, i supstanci koje

se ispuštaju iz hidrogela, kao i određivanje njihove potencijalne toksičnosti [136, 139]. Idealan

obrazac za razumevanje i ispitivanje svih navedenih parametara ne postoji, ali je primena

sistematičnog prisutupa dobra polazna tačka [139]. Međutim, upotreba standardizovanih ispitivanja

postala je opšteprihvaćeno pravilo, jer omogućava razumno poređenje rezultata dobijenih iz različitih

studija.

2.3.2.1. In vitro ispitivanja

In vitro testovi se izvode izvan živih organizama i procenjuju efekte materijala direktno na

zasejanim ćelijama, koje simuliraju reakciju tkiva. U poređenju sa in vivo testovima, karakteriše ih

znatno niža cena, i još važnije, manji stepen etičkih kontroverzi u poređenju sa in vivo testovima, jer

se za ispitivanja ne koriste životinje [140]. Koriste se u ranim stadijumima istraživanja i razvoja

materijala, pre testiranja na životinjama. Pružaju korisne informacije za inicijalni skrining o

bezbednosti korišćenja, poput citotoksičnosti materijala, i na taj način omogućavaju izbor najboljih

kandidata za buduća in vivo ispitivanja, štedeći vreme i novac. In vitro metode su osetljive, pouzdane,

jednostavne i reproduktivne, i uprkos nedostatku specifičnosti daju kvantitativne i kvalitativne

pretpostavke o potencijalnim opasnostima biomaterijala [141]. Pozitivan rezultat ispitivanja se mora

uzeti kao rani znak upozorenja za potencijalni biološki rizik materijala i kao takav zahteva dalja

istraživanja. Probe ćelijske citotoksičnosti bile su među prvim in vitro biološkim probama za

predviđanje toksičnosti materijala za potencijalnu upotrebu u medicini. Ova ispitivanja preporučuju

se za sve nove biomaterijale jer pružaju brzu procenu, uz standardizovane protokole koji

omogućavaju lako poređenje dobijenih rezultata, i odbacivanje toksičnih materijala pre testiranja na

životinjama [142]. Takođe, važni su za određivanje opsega koncentracija za dalja i sveobuhvatnija in

vitro ispitivanja, kako bi se dobili značajni podaci o genotoksičnosti, indukciji mutacija i apoptozi

[142]. Kombinacija različitih eseja može pružiti više informacija o mehanizmu citotoksičnosti koja

prouzrokuje smrt ćelija. Pored toga, mnogi sastojci sintetičkih biomaterijala koji su inicijalno

pokazali citotoksično dejstvo mogu se modifikovati, ili se njihova upotreba može kontrolisati od

strane proizvođača, kako bi se uklonila citotoksičnost. U zavisnosti od kontakta ispitivanih

26

hidrogelova sa ćelijama, postoje tri metode ispitivanja citotoksičnosti koje su propisane

međunarodnim standardima: a) metoda direktnog kontakta, b) metoda indireknog kontakta kroz sloj

agara ili difuzije kroz filter, c) metoda primene ekstrakta materijala na ćelije (pod fiziološkim ili

modifikovanim uslovima) pre ispitivanja citotoksičnosti [137]. Metoda koja će se koristiti zavisi od

prirode hidrogela i vremenskog perioda na koji će on biti implantiran u organizmu. Metoda direktnog

kontakta namenjena je očuvanju ispitivanog hidrogela prilikom testiranja citotoksičnosti, dok

indirektna metoda omogućava određivanje toksičnosti supstanci koje se otpuštaju iz materijala. Kod

biodegradabilnih hidrogelova indirektna metoda omogućava karakterizaciju skrivenih toksičnih

efekata, poput zaostalih monomera ili katalizatora, kao i efekata koji su vezani za eroziju polimera.

Pored dostupnih standarda i propisa, na izbor ćelija i ćelijskih modela koji se koriste u ispitivanju

citotoksičnosti utiče i željeni ishod. Najčešće se osnovni skrining izvodi na neizmenjenim kulturama

izolovanih besmrtnih ćelija, kao što su HeLa, MRC-5, 3T3 ili L929 [141]. Potpuniji rezultati

citotoksičnosti zahtevaju upotrebu specifičnih ćelijskih linija, poput životinjskih ili humanih

endotelnih i epitelnih ćelija, kako bi se uspešno predvidele biološke interakcije sa ispitivanim

materijalom. Klasifikacija metoda za određivanje citotoksičnosti i ćelijske vijabilnosti zasniva se na

osnovu tipa merenja koja se izvode na kraju završene probe (Tabela 3) [143].

Tabela 3. Klasifikacija metoda za određivanje citotoksičnosti i ćelijske vijabilnosti u zavisnosti od

tipa merenja na kraju završene probe.

Br. Tip merenja Metode

1. Metode ekskluzije boja Tripan plavo, eozin, Kongo crvena i eritrozin B eseji

2. Kolorimetrijske metode MTT, MTS, XTT, WST-1, WST-8, LDH eseji

3. Fluorometrijske metode AlamarBlue i CFDA-AM eseji

4. Luminometrijske metode ATP esej i esej vidljivosti u realnom vremenu

Kako bi se izbegla kontaminacija ćelija i pogrešno okarakterisala citotoksičnost materijala, za

in vitro ispitivanja neophodno je koristiti sterilne uzorke. Izbor metode sterilizacije igra važnu ulogu,

jer usled direktnog kontakta sa hidrogelovima pojedine metode mogu imati uticaj na strukturu

polimera i negativne posledice na rezultate citotoksičnosti [139]. Takođe, ukoliko se za sterilizaciju

materijala koristi sterilno filtriranje, postoji rizik da će toksične komponente ostati vezane za filter i

prouzrokovati netačne rezultate testova.

2.3.2.2. MTT test

MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazolijum-bromid) test jedan je od najčešće

upotrebljavanih kolorimetrijskih proba za određivanje citotoksičnosti i ćelijske vijabilnosti

materijala. Odlikuju ga jednostavnost korišćenja, bezbednost i veliki stepen reproduktivnosti rezultata

[144]. Princip rada kolorimetrijskih proba je merenje određenog biološkog markera radi evaluacije

metaboličke aktivnosti ćelija. Za određivanje se koriste reagensi za razvijanje boje, kao odgovora na

metaboličke aktivnosti, što omogućava kolorimetrijsko merenje ćelijske vijabilnosti pomoću

spektrofotometra. MTT test određuje vijabilnost ćelija merenjem mitohondrijske funkcije ćelija, tj.

aktivnosti mitohondrijalnih enzima, ćelijskih reduktaza zavisnih od NAD(P)-H [144].

27

Slika 14. Šematski prikaz redukcije MTT do formazana

Navedeni enzimi, poput sukcinat-dehidrogenaze, redukuju MTT do ljubičasto obojenog

formazana (Slika 14), čija se koncentracija u rastvoru može kvantitativno odrediti

spektrofotometrijski. Intenzitet ljubičaste boje direktno je proporcionalan broju metabolički aktivnih

ćelija. Formazan formira igličaste kristale unutar ćelija, koji nisu rastvorni u vodi, zbog čega je pre

merenja apsorbancije za rastvaranje neophodno dodavanje organskih rastvarača poput

dimetilsulfoksida (DMSO) ili izopropanola [145].

2.3.2.3. In vivo ispitivanja na životinjama

Sledeći nivo testiranja biokompatibilnosti je in vivo testiranje, koje predstavlja ključni korak

u evaluaciji biološkog odgovora koji izaziva materijal. Ljudski organizam predstavlja kompleksnu

formaciju koja sadrži preko 200 tipova ćelija organizovanih da proizvedu visokospecijalizovane

organe i sisteme organa [146]. Uprkos sveobuhvatnom i dobro razvijenom pristupu, nijedan in vitro

model nema mogućnost da u potpunosti predstavi skoro beskonačan broj bioloških procesa koji se

odigravaju u živim sistemima, i pod uticajem su lekova ili implantiranih materijala. Kako strukture

savremenih materijala i sistema za otpuštanje lekova iz godine u godinu postaju sve kompleksnije,

teže je predvideti njihov biološki efekat u organizmu. Stoga raste potreba za in vivo testiranjem novih

biomaterijala koji se razvijaju za upotrebu u medicinskim uređajima i farmaceutskim proizvodima.

Korišćenje životinja (glodara, riba, ptica, vodozemaca, primata i drugih) u svrhu naučnih istraživanja,

najčešće za ispitivanje lekova, novih tretmana za lečenje infektivnih i neinfektivnih bolesti, kao i

medicinskih procedura i hirurških implanata, je praksa koja se sprovodi već decenijama [147].

Njihova upotreba je pokazala poseban značaj u poljima kao što su ćelijska biologija, genetika,

anatomija i razvoj, biohemija, razvoj lekova i vakcina, inžinjerstvo tkiva i regenerativna medicina.

Uprkos preprekama, kao što su veliki broj kontroverzi, etičkih problema, visokih troškova i napornih

birokratskih izazova, životinjski modeli za ispitivanje biokompatibilnosti novih materijala su

poslednjih nekoliko decenija u velikoj meri razvijani za upotrebu u biomedicini. Po postavljanju

eksperimentalne hipoteze, izabrani životinjski model treba da pruži očekivane konzistentne odgovore

i da imitira kliničko stanje ljudskog organizma, što bi omogućilo ekstrapoliranje tačnih podataka.

Primena specifičnih kriterijuma za izbor odgovarajućeg životinjskog modela neophodna je za

biomedicinska istraživanja. Osnovni kriterijumi koji se tiču izbora životinjskog modela za

karakterizaciju biomaterijala su međusobno povezani, i nemoguće ih je razmatrati odvojeno. Pored

osnovnih kriterijuma, neophodno je razmotriti druga važna pitanja vezana za funkcionalne životinjske

modele koji se tiču regeneracije specifičnih tkiva, poput koštanog tkiva ili hrskavice.

28

Ukoliko eksperimenti na životinjama nisu dizajnirani, izvedeni i analizirani na odgovarajući

način, vrlo je verovatno da rezultati dobijeni u takvim studijama neće biti pouzdani. Ukoliko je to

slučaj, dobijene esperimentalne podatke nije moguće uzeti kao tačne informacije i životinje

iskorišćene za te eksperimente su bespotrebno žrtvovane, što moralno nije moguće opravdati [148].

Rasel (Russell) i Burč (Burch) su 1959. godine predložili tri principa kojih bi trebalo da se pridržavaju

svi naučnici koji vrše eksperimente na životinjama [149]:

1) zamena eksperimentalnih životinja njihovim neosetljivim alternativama,

2) redukovanje broja životinja korišćenih za eksperimente na minimum i

3) usavršavanje eksperimenata da bi se na najmanji mogući stepen smanjio nivo bola i

mučenja ispitivanih životinja.

Navedeni principi su u poslednje vreme široko prihvaćeni i specifično adaptirani za naučna

istraživanja, i inkorporirani su u zakone EU, Brazila i Japana kao ključni koncept za humano

korišćenje životinja u laboratorijskim eksperimentima [150]. Takođe, ovi koncepti su podrazumevani

u Aktovima o dobrobiti životinja koji se koriste u SAD, Kini i Indiji [150]. Kako bi se izbegao veliki

broj restrikcija nastalih usled etičkih problema vezanih za eksperimentalno korišćenje životinjskih

modela kičmenjaka, predložena je alternativa u vidu upotrebe nižih kičmenjaka i beskičmenjaka

(Tabela 4) [151]. Navedene vrste su atraktivna zamena za više kičmenjake, uključujući i sisare, usled

visokog stepena genetičke sličnosti, dok je za njihovu upotrebu vezan daleko manji broj etičkih

problema.

Tabela 4. Primeri organizama koji mogu da posluže kao alternativa laboratorijskom korišćenju

životinja.

Alternativni organizmi za in vivo testove

Prokariotski organizmi Escherichia coli

Bacillus subtilis

Caulobacter crescentus

Protisti Dictyostelium discoideum

Gljive Neurospora crassa

Saccharomyces cerevisiae

Schizosaccharomyces pombe

Aspergillus nidulans

Niži kičmenjaci Danio rerio / zebra ribica

Beskičmenjaci Amphimedon queenslandica

Aplysia sp. / morski puž

Caenorhabditis elegans

Drosophila melanogaster

Slatkovodna hidra

29

2.3.2.4. Model zebra ribica za in vivo ispitivanje biomaterijala

Kako bi se izbegla upotreba odraslih životinja, model embriona zebra ribica (EZR) se pokazao

kao veoma pogodan za testiranje novih biomaterijala [152]. Zebra ribice su sitne, lako ih je gajiti u

velikom broju i cena njihovog održavanja je niska. U laboratorijskim uslovima se gaje u specijalnim

sistemima sa mogućnošću kontrole ciklusa svetla i mraka, na konstantnoj temperaturi od 28,5 °C.

Prirodnim mrešćenjem ženka zebra ribice može da proizvede stotine jaja svake nedelje. Razvoj

embriona je brz i potrebno je samo 24 h da se jednoćelijski zigot razvije u pokretan transparentni

embrion, koji je istog sastava kao i telo kičmenjaka [153]. Pet dana nakon odplodnje embrion se

transformiše u larvu, koja je sposobna da slobodno pliva i samostalno se hrani. EZR imaju mnoge

druge prednosti, uključujući bolje tehničke karakteristike i etičke aspekte u poređenju sa ostalim

životinjskm modelima kičmenjaka, kao i veću ekonomičnost. Model EZR ne predstavlja ćelijsku

kulturu, jer su embrioni prošli stadijum viših ćelija 3 sata nakon oplodnje, ni in vivo životinjski model,

jer prema Evropskoj direktivi 2010/63/EU nisu klasifikovani kao životinje pošto do petog dana nakon

oplodnje nisu sposobni da se samostalno hrane [152].

Slika 15. Embrion zebra ribice a) 2 dana i b) 4 dana nakon oplodnje [154]

Stoga, model EZR nudi potencijal da premosti in vitro i in vivo modele ispitivanja, i pruži

bitne informacije pre određivanja biokompatibilnosti i ispitivanja toksičnosti u klasičnim in vivo

eksperimentima, i na taj način smanji potrebu za testiranjem na životinjama. Odgovor na ispitivane

materijale na nivou celog organizma, tokom osetljivog stadijuma embriogeneze, može ponuditi

preciznije i kompletnije informacije u poređenju sa informacijama dobijenim u in vitro testovima

[155]. EZR mogu pružiti i uvid u to kako su osnovni ćelijski procesi regulisani tokom razvića i kako

se narušavanje tih procesa može odraziti na embriogenezu. Prilikom korišćenja modela EZR

neophodno je poznavati fizičke i hemijske osobine ispitivanog materijala pošto zebra ribice poseduju

predodređenu osetljivost na određene supstance i jone. Sekundarni efekti pojedinih supstanci, kao što

su amonijak, bakar ili olovo, mogu prikriti reakciju zebra ribica na ispitivani materijal ili lek [156].

30

2.4. Primena hidrogelova

Zahvaljujući specifičnoj strukturi i mogućnostima primene pod različitim uslovima,

hidrogelovi se koriste u mnogim oblastima. Fleksibilnost i i biokompatibilnost hidrogelova, usled

velikog sadržaja vode, ih čini naročito pogodnim za primene u biomedicini za kontrolisano otpuštanje

lekova i inženjerstvo tkiva.

2.4.1. Sistemi za kontrolisano otpuštanje

Unošenje leka na konvencionalan način može imati negativne efekate po pacijenta ukoliko je

neophodno uneti veću dozu leka odjednom ili isti lek unositi više puta na dan, jer to može dovesti do

neželjenih sporednih efekata i toksičnosti. Lekovi se najčešće unose u telo oralno (pilule) ili

parenteralno (injekcije). Nedostaci navedenih načina unošenja leka su dugačak period nakon unošenja

u kojem je koncentracija leka u toksičnom intervalu doziranja, i nakon toga, kratko vreme u kojem je

koncentracija leka u terapeutskoj oblasti. Osim toga, kod oralnog unošenja vreme cirkulacije leka u

organizmu je kratko, a dopremanje do ciljanog mesta nije dovoljno precizno.

Sistemi za kontrolisano otpuštanje leka su farmaceutske formulacije ili naprave koje pomažu

da se postigne kontrolisano i/ili ciljano otpuštanje terapeutskih agenasa u organizmu [157]. Prednosti

sistema za kontrolisano otpuštanje, u odnosu na konvencionalni način unosa terapeutskih sredstava,

su da ne dolazi do brzog doziranja u toksičnoj koncentraciji leka, već se koncentracija dugo vremena

održava u terapeutskoj oblasti delovanja leka [158]. Terapeutska oblast ili tzv. „terapeutski prozor“

je oblast koncentracije leka u kojoj on ima optimalnu terapeutsku aktivnost. Koncentracije leka koje

su veće od te oblasti su toksične (minimalna toksična koncentracija), dok koncentracije manje od

koncentracije terapeutske oblasti nemaju dovoljnu terapeutsku aktivnost (minimalna efektivna

koncentracija).

U poslednjih nekoliko decenija velika pažnja je posvećena istraživanjima u oblasti

kontrolisanog otpuštanja lekova sa naročitim fokusom na dizajn novih sistema radi poboljšanja

farmakoloških i terapeutskih svojstava aktivnih supstanci i smanjenja korišćenih doza leka i

toksičnosti koja je uzrokovana preteranim doziranjem [159]. Pošto se sistemi za kontrolisano

otpuštanje unose u telo neophodno je da budu biokompatibilni i da proizvodi njihove degradacije nisu

toksični, odnosno da se putem metabolizma prevedu u netoksične proizvode. Po unošenju sistema za

otpuštanje leka u organizam aktivni sastojci se oslobađaju i prenose do mesta na kojem treba da

deluju, pri čemu na tom putu nailaze na različite fiziološke prepreke. U novije vreme razjašnjena je

uloga različitih prepreka za cirkulisanje i transport leka kroz tkiva i ćelije u organizmu što je dovelo

do daljeg razvoja sistema za kontrolisano otpuštanje [160]. Veliki broj ovakvih sistema primenjen je

i u kliničkoj praksi, ali je potreban njihov dalji razvoj radi eliminisanja sporednih efekata pojedinih

lekova, koji pokazuju štetno dejstvo na delove tela koji nisu ciljano mesto lečenja. Sporedni efekti

zavise od strukture leka, načina otpuštanja i reakcije samog organizma na uneti lek. Takođe, do

nepovoljnih sporednih efekata može doći zbog nagomilavanja velike količine leka u krvnoj plazmi

usled ponovljenog unošenja sistema za kontrolisano otpuštanje [159]. Zbog toga je neophodno

poboljšati ovakve sisteme čime bi se smanjila učestalost i broj unošenja leka i kontrolisala brzina

njegovog otpuštanja, što bi omogućilo konstantno održavanje koncentracije leka u okviru terapeutske

oblasti radi postizanja optimalnog efekta lečenja [161].

31

2.4.2. Hidrogelovi u sistemima za kontrolisano otpuštanje

Hidrogelovi, kao hidrofilne i viskoelastične polimerne mreže sa odličnim biološkim i fizičkim

svojstvima, imaju značajnu ulogu u dobijanju i razvoju sistema za kontrolisano otpuštanje lekova.

Porozna struktura, karakteristična za hidrogelove, olakšava bubrenje u vodi i procese unošenja leka i

njegovog otpuštanje iz matrice. Poroznost se lako može podesiti kontrolisanjem gustine umreženja i

afiniteta prema vodi [162]. Kapacitet bubrenja hidrogelova zavisi i od tipa umrežavanja u strukturi.

Umreženi polimeri poseduju različite stepene mehaničke jačine, koja se lako može podešavati, što

omogućava da se dobiju fizička svojstva slična pojedinim tkivima u ljudskom telu. Osim toga, zbog

hidrofilne površine polimernih mreža one mogu u nekim slučajevima da spreče prodiranje različitih

proteina i na taj način spreče degradaciju bioaktivnih supstanci u matrici hidrogela, usled difuzije

enzima. Ukoliko postoje različite interakcije hidrogela sa ugrađenim lekom moguće je dodatno

kontrolisati njegovo otpuštanje. Hidrogelovi u sistemima za kontrolisano otpuštanje se razlikuju po

veličini, arhitekturi i funkcionisanju, a ove razlike utiču na njihovu primenu u otpuštanju lekova. Oni

se mogu sintetizovati u različitim fizičkim oblicima, kao mikročestice, nanočestice, diskovi, premazi

i filmovi [163]. Vrlo značajnu grupu hidrogelova, kao izuzetnih materijala za kontrolisano otpuštanje

lekova i inženjerstvo tkiva, čine hidrogelovi osetljivi na spoljne stimulanse. To su takozvani

„inteligentni“ sistemi, koji pod dejstvom određenog stimulansa menjaju svoja fizička ili hemijska

svojstva. Stimulansi na koje su osetljivi pojedini hidrogelovi mogu biti fizički (temperatura, jonska

sila, rastvarači, radijacija-UV zračenje, vidljiva svetlost, električno i magnetno polje, visok pritisak)

hemijski (pH vrednost, specifični joni, hemijski agensi) ili biohemijski (enzimi ili specifični ligandi).

Kod takvih sistema je, između ostalog, moguće kontrolisati vreme i mesto otpuštanja lekova različitih

molarnih masa, kao i ćelija [32]. Osim toga, hidrogelovi imaju sposobnost da enkapsuliraju hidrofilne

lekove, kao i velike mogućnosti za variranje sastava i prilagođavanje različitim načinima unošenja

leka [164]. Značajna uloga hidrogelova je zaštita aktivne supstance nakon unošenja u organizam u

toku vremena koje je predviđeno za otpuštanje leka, što podrazumeva doziranje, rastvaranje i difuziju

molekula leka [165]. U novije vreme ispitan je i objavljen veliki broj sistema za kontrolisano otpuštanje

lekova na bazi hidrogelova [166, 167].

Na osnovu mehanizma otpuštanja leka hidrogelovi se dele na: sisteme koje kontroliše difuzija,

sisteme koje kontroliše bubrenje, hemijski kontrolisane sisteme, i sisteme osetljive na spoljne

stimulanse. Difuzija je najčešći mehanizam koji kontroliše otpuštanje u sistemima za otpuštanje

lekova. Kod dobro rastvorljivih lekova dolazi do brzog otpuštanja leka, što predstavlja neželjeni

efekat ovog mehanizma. Da bi se kontrolisalo otpuštanje leka važno je da se u toku sinteze hidrogela

vodi računa o tipu umreženja i najpovoljnijoj gustini umreženja trodimenzionalne mreže. U tom

smislu je povoljnije da hidrogel ima veći stepen umreženja radi boljeg doziranja leka. Mehanizam

otpuštanja u ovim trodimenzionalnim mrežama hidrogelova se odigrava preko relaksacije polimernih

lanaca u toku procesa bubrenja, što obrazuje vodenu prepreku koja omogućava bolje doziranje.

Svojstva koja su veoma značajna za primenu hidrogelova u sistemima za kontrolisano otpuštanje su

biokompatibilnost i biodegradacija. Biokompatibilnost hidrogelova potiče od velikog sadržaja vode

(najčešče 70–99%) što doprinosi njihovoj permeabilnosti, sličnoj prirodnim tkivima. Usled direktnog

kontakta sa živim tkivima i ćelijama hidrogelovi koji se implantiraju u organizam moraju posedovati

dobru biokompatibilnost. Proučavanje biokompatibilnosti hidrogelova počelo je 1960. godine kada

su Wichterle i Lim otkrili izvanredna svojstva poli(2-hidroksietil-metiakrilata) (pHEMA) i iskoristili

ovaj polimer za dobijanje kontaktnih sočiva [168].

Biokompatibilnost podrazumeva reakciju tela i reakciju materijala. Biološka reakcija se

odnosi na reakciju krvi, imunu reakciju i reakciju tkiva. Reakcija materijala se pokazuje kao promena

fizičkih i hemijskih svojstava materijala. Rozenblut (Rozenbluth) i saradnici prvi su primenili

eksperiment citotoksičnosti koristeći kulture fibroblasta miša [169]. U kasnijim ispitivanjima se za

test citotoksičnosti najviše koristi soj L-ćelija, izolovanih iz potkožnog tkiva miša [170]. Drugi tip

ćelija koji se danas više koristi su ćelije sluzokože materice izolovane iz humanih tumora materice

32

[171]. Zahvaljujući prednosti da brzo prolaze i brzo se reprodukuju, pod uslovima sličnim onima u

organizmu, i lakoći čuvanja u in vitro uslovima, ove dve vrste ćelija se koriste za određivanje

citotoksičnosti mnogih materijala. Američko društvo za kvalitet (American Society for Quality

(ASQ)) je 1982. godine preporučilo L929 ćelije i HeLa ćelije kao standardne ćelije za ispitivanje

toksičnosti [172].

Da bi se izbegla druga operacija potrebna za uklanjanje implanta hiruškim putem neophodno

je da polimerni materijali budu biodegradabilni, tj. da su podložni degradaciji ili metaboličkim

procesima u živim organizmima [173]. Osim toga, degradabilni hidrogelovi sa unetim lekom mogu

ostati u organizmu više dana ili nedelja što omogućava otpuštanje leka u dovoljnoj količini sporom

degradacijom hidrogela uz smanjene sporedne efekte leka [174]. Biodegradabilni materijali koji se

danas najčešće koriste su natrijum-alginat, celuloza, poli(mlečna kiselina), poli(aminokiseline), i

sintetički mikroorganizmi [172]. Parcijalnom degradacijom polimernih biomaterijala u tkivu može

doći do stvaranja toksičnih proizvoda degradacije kao što su monomeri ili oligomeri, koji mogu imati

štetan uticaj na pojedine organe, zbog čega je neophodno proizvode izolovati i utvrditi njihovu

toksičnost [175].

2.4.3. Mehanizam otpuštanja leka

Izbor polimera i tip naprave koji će se koristiti u sistemima za kontrolisano otpuštanje zavisi

od željenog mehanizma otpuštanja, fizičko-hemijskih svojstava leka i načina unošenja u organizam.

Polimerni lanci mogu imati funkcionalne grupe ili druga mesta za vezivanje lekova, koja se mogu

podesiti u toku sinteze, izborom monomera ili njihovom modifikacijom različitim fizičkim i

hemijskim metodama. Fizičke interakcije hidrogel/lek su poželjne, jer se upotreba toksičnih

rastvarača svodi na minimum. Karakteristike mreže dizajnirane za određenu primenu su takođe vrlo

važne za primenu sistema za otpuštanje lekova. Veličinu pora u polimernoj mreži, ali i druge

karakteristike na nivou molekula ili atoma, moguće je podešavati nezavisno od makroskopskih

karakteristika. Iako najveći broj sistema ima specifične karakteristike, u potpunosti prilagođene

određenoj primeni, svi sistemi moraju biti osmišljeni na način da sačuvaju bioaktivnost leka u toku

celog procesa rukovanja i čuvanja, kao i da održe hemijsku i fizičku stabilnost leka i hidrogela. Za

ishod lečenja je vrlo važan način otpuštanja leka, vremenski period otpuštanja i profil otpuštanja u

zavisnosti od specifične primene. Da bi se izbeglo hiruško uklanjanje hidrogela nakon otpuštanja

leka, on mora biti podložan potpunoj degradaciji u fiziološkim uslovima ili osposobljen za ponovno

otpuštanje nakon dopunjavanja leka.

2.4.3.1. Sistemi koje kontroliše difuzija

Difuzija je najčešći mehanizam kontrole otpuštanja u sistemima za otpuštanje lekova.

Neželjeni efekat ovog mehanizma je brzo otpuštanje dobrorastvorljivih lekova iz matrice. Da bi se

kontrolisalo otpuštanje leka važno je da se u toku sinteze hidrogela vodi računa o tipu umreženja i

optimalnoj gustini umreženja trodimenzionalne mreže. Veći stepen umreženja hidrogelova uzrokuje

bolje doziranje leka. Sistemi za otpuštanje leka koje kontroliše difuzija omogućavaju otpuštanje leka

difuzijom kroz pore koje su ispunjene vodom, a naprave mogu biti u vidu rezervoara ili matrice.

33

Slika 16. Šematski prikaz otpuštanja leka kontrolisanog difuzijom iz polimerne matrice

Sistem tipa rezervoara se sastoji od jezgra koje sadrži lek oko kojeg se nalazi membrana

hidrogela. Da bi se postigla konstantna brzina otpuštanja koncentracija leka je veća u sredini sistema.

Brzina otpuštanja leka se može kontrolisati svojstvima polimera (kao što su sastav ili molarna masa),

debljinom membrane, kao i fizičko-hemijskim svojstvima leka (rastvorljivost, veličina čestica i

molarna masa leka) [176].

U sistemima tipa matrice lek je dispergovan ili ravnomerno rastvoren u trodimenzionalnoj

strukturi hidrogela (Slika 16). Otpuštanje leka postiže se kroz pore hidrogela, s tim da je početna

brzina otpuštanja proporcionalna kvadratnom korenu vremena, a nije konstantna i nezavisna od

vremena kao u slučaju sistema tipa rezervoara [177].

2.4.3.2. Sistemi koje kontroliše bubrenje

Ovaj naziv se u praksi odnosi na sisteme kod kojih su, osim bubrenja kao najvažnijeg procesa,

zastupljeni i drugi procesi prenosa mase, kao što su rastvaranje i difuzija leka, i degradacija polimera.

Ovi sistemi se zasnivaju na hidrofilnim polimerima koji u kontaktu sa vodom bubre, pri čemu dolazi

do relaksacije polimernih lanaca odnosno pokretljivosti polimernih lanaca. Usled relaksacije

polimernih lanaca tokom procesa bubrenja dolazi do sniženja temperature prelaza u staklasto stanje

(Tg), tako da lek difunduje kroz nabubrelu gumoliku oblast polimera. Usled bubrenja polimer se širi

izvan prvobitnih dimenzija.

Slika 17. Šematski prikaz otpuštanja leka kontrolisanog bubrenjem iz polimerne matrice

Ovaj proces se takođe naziva Slučaj II transporta i pokazuje konstantnu kinetiku otpuštanja

nezavisnu od vremena. Taj slučaj se naziva i „anomalni transport“, jer predstavlja kombinaciju

34

otpuštanja difuzijom i bubrenjem. Gradijent koji postoji između leka dispergovanog u hidrogelu i

okolini koja ga okružuje dovodi do difuzije leka iz oblasti veće u oblast manje koncentracije [178].

2.4.3.3. Sistemi osetljivi na spoljne uticaje

Mehanizam otpuštanja leka korišćenjem spoljnih uticaja omogućen je specifičnim tipom

polimera koji imaju svojstvo da na promenu uslova spoljne sredine drastično menjaju svoja fizičko-

hemijska svojstva ili fazno stanje. Oni se nazivaju još i „polimeri osetljivi na spoljne stimulanse“ ili

„inteligentni polimeri“ koje karakteriše sposobnost prelaza faza na normalnoj temperaturi tela i/ili

intenzivan odgovor na male promene spoljnih uslova. Stimulansi na koje reaguju ovi polimeri

fizičkim ili hemijskim promenama su: fizički stimulansi (svetlost, temperatura, magnetno i električno

polje, ultrazvuk i mehaničke sile); hemijski stimulansi (pH vrednost, jonska sila, rastvarač) [179] i

biološki stimulansi (biomolekuli koji su u stanju da prepoznaju ciljane molekule kao što su enzimi,

peptidi, nukleinske kiseline, glukoza ili molekularno obeleženi polimeri) [180].

Jedna od najvažnijih primena polimera osetljivih na spoljne stimulanse je svakako u sistemima

za kontrolisano otpuštanje lekova. Lekovi se ugrađuju u polimerne nosače specifičnih struktura i

veličina. Najčešće morfologije su sferične micele i porozni nosači, unutar kojih lek može da bude

kovalentno ili nekovalentno vezan za polimer. Navedeni polimeri mogu da posluže kao inteligentni

nosači za kontrolisan i/ili ciljan transport i otpuštanje leka [181].

2.4.3.4. Biodegradabilni sistemi hidrogelova za kontrolisano otpuštanje lekova

Biodegradabilni polimeri predstavljaju važnu klasu materijala za biomedicinske primene.

Najvažnije primene ovih polimerima su u sistemima za kontrolisano otpuštanje lekova i u

inženjerstvu tkiva.

U sistemima koji se zasnivaju na degradaciji polimera lek se otpušta kombinacijom procesa

difuzije leka i degradacije matrice ili nanogelova u kojima je dispergovan lek. U prvoj fazi lek se

otpušta difuzijom da bi potom, prilikom degradacije hidrogela, došlo i do dodatnog otpuštanja.

Polimeri se mogu raspadati procesom degradacije ili erozije. U toku degradacije može doći do

raskidanja kovalentnih veza u osnovnom lancu polimera hemijskom reakcijom, hidrolitičkim

raskidanjem ili raskidanjem pod dejstvom enzima, dok se erozijom gube delovi fragmenata lanca iz

osnovnog polimera. Da bi se proces erozije odigrao polimer mora da absorbuje vodeni rastvor koji

ga okružuje i da reaguje sa njim [182]. Degradacija i erozija se mogu dešavati na površini ili u masi

polimera. U toku degradacije na površini gubi se samo polimerni materijal sa površine sistema kada

dolazi do smanjenja zapremine uz očuvanje prvobitnog geometrijskog oblika. Kod degradacije u masi

raspadanje i erozija odvijaju se u unutrašnjosti sistema tako da veličina naprave ostaje konstantna

određeno vreme nakon unošenja. Prednost polimera koji podležu eroziji je da se ovaj proces može

predvideti, tako da se proces otpuštanja lekova može korelisati sa brzinom erozije [183].

Na Slici 18 su prikazani najčešći mehanizmi otpuštanja leka karakteristični za hidrogelove,

dok su odgovarajući kinetički profili prikazani kao procenat otpuštenog leka u funkciji vremena. Iako

se prilikom istraživanja ulažu veliki napori kako bi se kontrolisalo otpuštanje leka, većina sistema na

bazi hidrogelova prati anomalnu kinetiku otpuštanja, koja predstavlja kombinaciju mehanizma

relaksacije polimernih lanaca i difuzije leka.

35

Slika 18. Mehanizmi otpuštanja leka iz hidrogelova i njihovi odgovarajući

kinetički profili kada je mehanizam koji upravlja procesom: a) difuzija leka,

b) degradacija polimerne matrice i c) bubrenje hidrogela [184]

2.4.3.5. Kvantitativno određivanje otpuštanja leka

U cilju boljeg razumevanja fenomena otpuštanja leka predložen je veliki broj matematičkih

modela za kvantitativno određivanje otpuštanja leka. U navedene modele se mogu uklopiti

eksperimentalni podaci koji predstavljaju profile otpuštanja u vidu funkcije udela otpuštenog leka od

vremena [185]. Među modele koji se najčešće koriste spadaju: kinetički model nultog reda u kojem

se otpuštanje leka dešava po linearnoj zavisnosti udela otpuštenog leka od vremena, kinetički model

prvog reda, koji nije povezan sa nekim biološkim ili fizičko-hemijskim fenomenom, Higučijev

(Higuchi) model koji je izveden iz Fikovog (Fick) prvog zakona difuzije i koji se može primeniti na

niz različitih farmaceutskih formi za doziranje lekova [186]. Korsmajer–Pepas (Korsmeyer–Peppas)

model se odnosi na kombinaciju nekoliko mehanizama otpuštanja leka, ali Fikov transport i

relaksacija polimernih lanaca usled prelaza iz staklastog u fleksibilnije stanje (Slučaj II transporta)

preovlađuju [187]. Da bi se kvantifikovao relativni doprinos Fikovog transporta i relaksacije

polimernih lanaca, Korsmajer–Pepasov model je inkorporiran u Pepas–Salinov (Peppas–Sahlin)

model uvođenjem konstanti koje određuju relativni doprinos svakog mehanizma, da bi se mogao

kvantifikovati svaki pojedinačni parametar [188]. Ostali, ređe korišćeni modeli su Hofenbergov

(Hopfenberg) model za tumaćenje otpuštanja iz sistema različitih geometrija koji erodiraju, a sadrže

lek na površini, i Bejker–Lonsdejl (Baker–Lonsdale) model koji se zasniva na Higuči modelu i

opisuje otpuštanje leka iz sfernih matrica [189]. Poznavanje mehanizma otpuštanja leka iz polimernih

sistema dovelo je do značajnih poboljšanja kada su primenjeni matematički modeli.

36

2.4.4. Inženjerstvo tkiva

Inženjerstvo tkiva je multidisciplinarna naučna oblast koja povezuje biologiju, biohemiju i

fizičku hemiju. Lorencin (Laurencin) je 2010. godine definisao inžinjerstvo tkiva u smislu

regenerativnog inženjeringa kao “integraciju nauke o materijalima i inžinjerstva tkiva sa biološkim

naukama i regenerativnom medicinom u cilju regeneracije kompleksnih tkiva i organa“ [190]. U toku

protekle dve decenije je učinjen veliki napredak u pogledu razvoja biomaterijala koji se koriste u

inžinjerstvu tkiva i regenerativnoj medicini za obnovu i lečenje tkiva, kao što su hrskavica, kosti,

koža i krvni sudovi. Za navedene primene su ispitani različiti materijali - metali, keramika i polimeri.

Polimeri spadaju u najznačajnije materijale, jer trodimenzionalne polimerne mreže hidrogelova

predstavljaju sisteme po strukturi veoma slične sa ECM tkiva sisara. Polimerni skafoldi su prvi put

počeli da se koriste od 1980. u oblasti regeneracije tkiva i od tada imaju konstantnu primenu kao jedni

od vodećih materijala u inžinjerstvu tkiva [191].

Polimernim skafoldima moguće je precizno podesiti odgovarajuća fizička, biološka i

mehanička svojstva, kao i važne faktore za dizajn skafolda: biodegradabilnost, arhitekturu,

mehanička svojstva i fizičku stabilnost [192].

ECM su ne-ćelijske komponente tkiva koje služe kao matrica za fizičku potporu pri rastu

ćelija. Proučavanja su pokazala da ECM, osim potporne uloge, obezbeđuju biohemijske i biofizičke

centre koji su neophodni za morfogenezu i homeostazu tkiva [193]. Stoga se u novijim studijama

vodi računa o ulozi skafolda u obezbeđivanju različitih fizičko-hemijskih signala slično prirodnim

ECM [194]. Prirodni biomaterijali, kao kolagen ili želatin, već imaju biohemijske centre bitne za

različite ćelijske funkcije, kao što su vezivanje, rast i migracija. Poželjno je da se sintetički

hidrogelovi, koji najčešće nemaju bioaktivne centre, modifikuju bioaktivnim molekulima, na primer

proteinima ili peptidima, koji su neophodni za vezivanje i razvoj ćelija [195]. Svojstva hidrogela, kao

što su mehanička jačina, sposobnost da utiče na rast ćelija, mogućnost da dovede do imunogenih

reakcija i citotoksičnosti direktno zavise od strukture polimerne matrice. Stoga je izbor polimera za

datu primenu veoma važan.

Veliki broj prirodnih i sintetičkih polimera se danas koriste u inžinjerstvu tkiva i

regenerativnoj medicini. Trodimenzionalne polimerne mreže hidrogelova predstavljaju sisteme koji

su po strukturi, i zahvaljujući velikom sadržaju vode, veoma slični sa prirodnim ECM tkiva sisara i

koriste se za dobijanje veštačkih ECM. Među najvažnije prirodne polimere koji se koriste u ove svrhe

spadaju kolagen, želatin, elastin, hitozan, fibroin svile i hijaluronska kiselina. Mnogi prirodni polimeri

su bolje prihvaćeni od bioloških sistema u odnosu na sintetičke, jer mogu podleći metabolitičkom

procesuiranju uobičajenim putem. Međutim, prirodni polimerni biomaterijali imaju određene

nedostatke kao što su imunogenost, kompleksnost strukture i slaba mehanička svojstva. Sa druge

strane, sintetički polimeri se mogu lako obraditi u oblike koji su pogodni za primene u inženjerstvu

tkiva. Struktura sintetičkih polimera se može prilagoditi datoj primeni, dok je brzinu degradacije

moguće lako kontrolisati. Da bi se uspešno koristili kao skafoldi navedeni materijali treba da

obezbede mehanički jaku trodimenzionalnu strukturu kao potporu za tkivo i interakciju sa ćelijama u

cilju kontrole njihove funkcije i diferenciranja. Među najvažnije sintetičke polimere koji se danas

koriste u inžinjerstvu tkiva i regenerativnoj medicini spadaju: PLA, PGA, poli(mlečna-ko-glikolna

kiselina) (PLGA), pHEMA, PCL, poliuretani, polifosfazeni, polianhidridi, poliacetali, poli(propilen-

fumarat) i PEG [196].

37

Slika 19. Šematski prikaz ekstracelularne matrice [197]

Osim toga, za određene kliničke primene retko da samo jedan polimer može da ispuni sve

uslove. Dizajn hidrogelova koji kombinuju povoljna svojstva jednog polimera sa polimerom koji ima

komplementarna svojstva, je uobičajena procedura kao u slučajevima kada se dobra mehanička

svojstva sintetičkih polimera kombinuju sa onim koja imaju prirodni polimeri (dobra adhezija za

ćelije, povoljni uslovi za njihov rast i razmnožavanje i biodegradabilnost) [198]. Iako mešanje dva

polimera može da dovede do velikih poboljšanja svojstava ovim pristupom se retko postižu nova

svojstva koja nisu prisutna u polaznim komponentama. Najčešće svojstva ovih sistema predstavljaju

kombinaciju svojstava osnovnih komponenata tako da, na primer, kombinacija mehanički jakog i

slabog polimera za rezultat ima hidrogel srednje mehaničke jačine. Kada se kombinuju materijali

mora se pažljivo dizajnirati eksperiment i izvesti studija optimalnog sastava novog hidrogela

proučavanjem svih faktora koji utiču na njegova svojstva [199]. Skafold mora da poseduje sposobnost

da obezbedi veću interakciju između materijala od kojeg je napravljen i ćelija kako bi se poboljšala

adhezija ćelija i proliferacija, kao i obezbedio transfer gasova, hranljivih supstanci i faktora rasta

nephodnih za razvoj ćelija. Odgovarajuća razmena hranljivih supstanci i faktora rasta je moguća ako

skafold ima odgovarajuću poroznost i povezanost pora tako da morfologija skafolda ima ključnu

ulogu u regeneraciji tkiva. Vrlo je važno i da se brzina degradacije materijala usaglasi sa brzinom

regeneracija tkiva.

Ukratko, dizajniranje hidrogela za određenu kliničku primenu koja objedinjuje potrebnu

mehaničku jačinu, adheziju za ćelije i biodegradabilnost u relevantnom vremenskom periodu je veliki

izazov. Dizajn hibridnih i kompozitnih materijala koji predstavljaju kombinaciju povoljnih svojstava

jednog polimera sa komplementarnim polimerom je uobičajena procedura, kao što je učinjeno kod

kombinacije bioaktivne hijaluronske kiseline sa kovalentno umreženim poli-D,L-mlečna

kiselina/polietilen-glikol/poli-D,L-mlečna kiselina kopolimerom [198].

38

3. EKSPERIMENTALNI DEO

3.1. Sinteza poli(β-amino)estara (PBAE)

3.1.1. Materijali

Za sintezu PBAE kao diakrilatne komponente korišćeni su:

• Dietilen-glikol-diakrilat (DEGDA, 75%, Sigma Aldrich), bruto formule jedinjenja C10H14O5,

molarne mase 214,22 g mol–1; providna viskozna tečnost, gustine 1,118 g cm–3 (na 25 °C), sa tačkom

ključanja od 162 °C. Strukturna formula dietilen-glikol-diakrilata je prikazana na Slici 20.

Slika 20. Strukturna formula dietilen-glikol-diakrilata

• 1,6-Heksametilen-diakrilat (HDDA, 80%, Sigma Aldrich), bruto formule jedinjenja

C12H18O4, molarne mase 226,27 g mol–1; providna viskozna tečnost, gustine 1,01 g cm–3 (na 25 °C),

sa tačkom ključanja od 107 °C. Rastvara se u organskim rastvaračima. Strukturna formula

1,6-heksametilen-diakrilata je prikazana na Slici 21.

Slika 21. Strukturna formula 1,6-Heksametilen-diakrilata

Kao amino komponente za sintezu PBAE korišćeni su:

• Piperazin (Sigma Aldrich, 99%), bruto formule jedinjenja C4H10N2, molarne mase 86,14 g

mol–1; prah kristalno bele boje, sa tačkom topljenja u opsegu 109-112 °C i tačkom ključanja u opsegu

145-146 °C. Rastvara se u organskim rastvaračima, dok je u vodi slabo rastvoran. Strukturna formula

piperazina je prikazana na Slici 22.

Slika 22. Strukturna formula piperazina

39

• Glicin (Gly, Sigma Aldrich, ≥99%), bruto formule jedinjenja C2H5NO2, molarne mase 75,07

g mol–1; prah kristalno bele boje, sa tačkom topljenja od 240 °C. Rastvara se u organskim

rastvaračima, dok je u vodi slabo rastvoran. Konstanta disocijacije karboksilne grupe u molekulu

glicina je pKa1 = 2,34, dok je konstanta disocijacije amino grupe pKa2 = 9,60. Strukturna formula

glicina je prikazana na Slici 23.

Slika 23. Strukturna formula glicina

Kao monomer za sintezu hidrogelova korišćen je:

• 2-Hidroksietil-metakrilat (HEMA, Sigma Aldrich, 98%), bruto formule jedinjenja C5H8O3,

molarne mase 130,14 g mol–1. To je providna viskozna tečnost, gustine 1,073 g mL–1 (na 25 °C), sa

tačkom ključanja od 250 °C. Rastvara se u organskim rastvaračima. Strukturna formula 2-

hidroksietil-metakrilata je prikazana na Slici 24.

Slika 24. Strukturna formula 2-hidroksietil-metakrilata

Prilikom sinteze hidrogelova na bazi HEMA kao umreživač, pored PBAE, korišćen je:

• Poli(etilen-glikol-diakrilat) (PEGDA 400, Sigma Aldrich, 75%), srednje molarne mase 400

g mol–1, koji sadrži približno 9 etilen-glikolskih ponavljajućih jedinica. To je providna viskozna

tečnost, gustine 1,117 g mL–1 (na 25 °C). Rastvara se u organskim rastvaračima, dok je u vodi slabo

rastvoran. Strukturna formula poli(etilen-glikol-diakrilata) je prikazana na Slici 25.

Slika 25. Strukturna formula poli(etilen-glikol-diakrilata)

Za reakcije slobodnoradikalske polimerizacije kao inicijator korišćeni su:

• kalijum-persulfat (KPS, Sigma Aldrich, 99,0%), bruto formule jedinjenja K2S2O8, molarne

mase 270,32 g mol–1; prah kristalno bele boje. Rastvara se u vodi. Strukturna formula kalijum-

persulfata je prikazana na Slici 26.

40

Slika 26. Strukturna formula kalijum-persulfata

• amonijum-persulfat (APS, Sigma Aldrich, 98,0%), bruto formule jedinjenja N2H8S2O8,

molarne mase 228,20 g mol–1; prah kristalno bele boje. Rastvara se u vodi. Strukturna formula

amonijum-persulfata je prikazana na Slici 27.

Slika 27. Strukturna formula amonijum-persulfata

Kao ubrzivač za reakcije slobodnoradikalske polimerizacije korišćen je:

• N,N,N',N'–tetrametiletilendiamin (TEMED, Aldrich, 99%), bruto formule jedinjenja

C6H16N2, molarne mase 116,20 g mol–1; tečnost žute boje, gustine 0,775 g cm–3 (na 25 °C), sa tačkom

ključanja u opsegu 120-122 °C. Rastvara se u vodi i organskim rastvaračima. Strukturna formula

N,N,N',N'–tetrametiletilenadiamina je prikazana na Slici 28.

Slika 28. Strukturna formula N,N,N',N'–tetrametiletilenadiamina.

Za sintezu hidrogelova pored HEMA korišćen je i želatin (Sigma Aldrich, Tip A, svinjskog porekla,

snage gela 300), za čije umrežavanje je korišćen:

• Glutaraldehid (Sigma Aldrich), bruto formule C5H8O2, molarne mase 86,14 g mol–1, 50% vodeni

rastvor gustine gustine 1,106 g cm–3. Strukturna formula glutaraldehida je prikazana na Slici 29.

Slika 29. Strukturna formula glutaraldehida.

Kao aktivna supstanca za ispitivanje otpuštanja lekova korišćen je:

41

• Cefaleksin monohidrat (CEX, Sigma Aldrich), bruto formule C16H17N3O4· H2O, molarne

mase 347,39 g mol–1 (u anhidrovanom obliku). Strukturna formula CEX je prikazana na Slici 30.

Slika 30. Strukturna formula cefaleksin hidrata.

3.1.2. Sinteza cviterjonskih PBAE (P1–P3)

PBAE makromeri sintetisani su reakcijom Majklove adicije diakrilatne komponente sa amino

komponentom. Serija cviterjonskih PBAE makromera sintetisana je korišćenjem aminokiseline

gilicina kao amino komponente, i DEGDA kao diakrilatne komponente. Glicin je aminokiselina koju

odlikuju niska cena, rastvorljivost u vodi i kompaktna struktura, gde je primarna amino grupa lako

dostupna za reakciju Majklove adicije. Za razliku od polarnih aminokiselina, poput cisteina i lizina,

čije nukleofilne grupe iz bočnih lanaca mogu reagovati u reakciji Majklove adicije pri čemu kao

proizvodi nastaju razgranati PBAE, glicin će dati linearan PBAE makromer. Variranjem odnosa

DEGDA dobijena su 3 makromera P1, P2 i P3 različite srednje molarne mase.

PBAE makromeri P1, P2 i P3 sintetisani su dodavanjem glicina (1,00 g) u 20 cm3 rastvora

DEGDA (5,32 g za P1, 6,08 g za P2, 6,84 g za P3) u smeši voda/etanol (1/3), zagrejan na 75 °C uz

intenzivno mešanje. Mešanje na povišenoj temperaturi nastavljeno je tokom narednih 48 h. Potom je

rastvarač uklonjem korišćenjem vakuum uparivača, a sirovi proizvod je ispran heksanom (3 x 2 cm3)

i hladnom dejonizovanom vodom (2 cm3). Dobijeno je viskozno ulje tamnonarandžaste boje. Sinteza

makromera P1, P2 i P3 prikazana je na Slici 31.

Slika 31. Sinteza makromera P1-P3

3.1.3. Sinteza PBAE (P4–P6)

U sintezi druge serije PBAE makromera etilen-glikol-diakrilat i 1,6-heksametilen-diakrilatF

korišćeni su u svojstvu diakrilatne komponente, dok su kao amino komponenta korišćeni piperazin i

42

aminokiselina glicin. Variranjem odnosa diakrilatne i amino komponente u reakciji Majklove adicije

sintetisane su dve serije PBAE makromera sa različitim srednjim molarnim masama. PBAE

makromeri sintetisani su korišenjem piperazina kao amino komponente i DEGDA (za sintezu

makromera P4 i P5), prema ranije opisanoj proceduri [200], ili HDDA (za sintezu makromera P6)

kao diakrilatne komponente.

PBAE makromer P4 sintetisan je dodavanjem rastvora piperazina (0,622 g u 3  cm3 CHCl3)

rastvoru DEGDA (3 cm3 u 3  cm3 CHCl3) uz intenzivno mešanje na temperaturi od 25 °C. Molarni

odnos diakrilata prema piperazinu bio je 1,8/1. Piperazin je dodat u 3 ekvivalentne porcije, na početku

reakcije, posle 12 h i posle 24 h. Mešanje je nastavljeno tokom naredna 24 h. Potom je rastvarač

uklonjem korišćenjem vakuum uparivača, i dobijeni proizvod je ispiran heksanom (3 x 1 cm3) kako

bi se uklonile sve neizreagovane supstance. Dobijeno je viskozno ulje svetložute boje.

PBAE makromer P5 sintetisan je dodavanjem rastvora piperazina (3,685 g u 5  cm3 CHCl3)

rastvoru DEGDA (10  cm3 u 5 cm3 CHCl3) uz intenzivno mešanje na temperaturi od 25 °C. Molarni

odnos diakrilata prema piperazinu bio je 1,2/1. Mešanje je nastavljeno tokom narednih 6 h. Potom je

uklonjen rastvarač korišćenjem vakuum uparivača, i dobijeni proizvod je ispiran heksanom (3 x 2,5

cm3) kako bi se uklonile sve neizreagovane supstance. Dobijeno je viskozno ulje tamnožute boje.

Reakciona šema sinteze makromera P4 i P5 prikazana je na Slici 32.

Slika 32. Sinteza makromera P4 i P5

PBAE makromer P6 sintetisan je dodavanjem rastvora piperazina (1,24 g u 6 cm3 CHCl3)

rastvoru HDDA (7,30 g u 6 cm3 CHCl3) uz intenzivno mešanje na temperaturi od 50 °C. Molarni

odnos diakrilata prema piperazinu bio je 1,8/1. Piperazin je dodat u 3 ekvivalentne porcije (0,41 g u

2 cm3 CHCl3), na početku reakcije, posle 12 h i posle 24 h. Mešanje na povišenoj temperaturi

nastavljeno je tokom narednih 36 h. Potom je rastvarač uklonjen korišćenjem vakuum uparivača.

Dobijeno je viskozno ulje svetložute boje. Reakciona šema sinteze makromera P6 prikazana je na

Slici 33.

Slika 33. Sinteza makromera P6

43

3.2. Karakterizacija PBAE makromera

3.2.1. Karakterizacija strukture PBAE

Hemijska struktura PBAE makromera određena je pomoću 1H NMR spektara, snimljenih na

Bruker Ultrashield Advance III spektrometru (na 500 MHz), korišćenjem CD3Cl3 i D2O kao

rastvarača i TSP-d4 i TMS kao internog standarda.

3.3. Sinteza hidrogelova na bazi PBAE, pHEMA i želatina

3.3.1. Sinteza hidrogelova na bazi PBAE sa glicinom

Hidrogelovi na bazi PBAE makromera (P1, P2 i P3) sintetisani su reakcijom slobodno-

radikalske polimerizacije, dodavanjem rastvora inicijatora APS (0,015 g u 100 µL H2O) u vodeni

rastvor makromera (1,00 g u 4 cm3 smeše EtOH/H2O (3/1)). Smeša je potom degazirana u atmosferi

azota tokom 20 minuta. Nakon što je dodat ubrzivač TEMED (30 mm3), reakciona smeša je izlivena

između 2 staklene ploče, odvojene silikonskim gajtanom (debljine 4 mm), i zagrevana na 50 °C u

periodu od 24 h. Posle završene reakcije polimerizacije, hidrogelovi su isečeni na diskove (prečnika

8 mm), i isprani pomoću hloroforma radi uklanjanja neizreagovanih supstanci. Sintetisani diskovi

hidrogelova osušeni su pomoću liofilizatora (na temperaturi od -50 °C tokom 24 h).

3.3.2. Sinteza kriogelova na bazi pHEMA (bez želatina)

Svi kriogelovi na bazi pHEMA, sa i bez želatina, sintetisani su reakcijom slobodno-radikalske

polimerizacije na kriogenim temperaturama (-20 °C).

Rastvoru HEMA (1,29 g, 9,8 mmol u 5 cm3 dejonizovane vode), dodat je umreživač (PBAE

makromer (P3, P4, P5 ili P6) ili PEGDA, 10% u odnosu na ukupnu masu monomera) i APS (0,02 g

u 0,10 cm3 H2O). Smeša je potom degazirana u atmosferi azota tokom 15 minuta. Nakon što je dodat

ubrzivač TEMED (30 µL), reakciona smeša je izlivena u petri šolju (prečnika 5 cm, visine 0,5 cm), i

ohlađena na -20 °C u periodu od 24 h. Posle odmrzavanja na sobnoj temperaturi, hidrogelovi su

isečeni na diskove (prečnika 8 mm), i isprani pomoću dejonizovane vode tokom 7 dana radi

uklanjanja neizreagovanih supstanci. Voda je menjana svežom na svaka 24 h. Sintetisani diskovi

kriogelova osušeni su pomoću liofilizatora (na temperaturi od -50 °C tokom 24 h).

3.3.3. Sinteza kriogelova na bazi pHEMA (sa želatinom)

Rastvoru HEMA (1,29g, 9,8 mmol u 5 cm3 dejonizovane vode), dodat je umreživač (PBAE

makromer (P3, P4, P5 ili P6) ili PEGDA, 10% u odnosu na ukupnu masu monomera), želatin (0,30

g) i APS (0,02 g u 0,10 cm3 H2O), i smeša je mešana na 40 °C, do potpunog rastvaranja svih

44

komponenata. Potom je smeša degazirana u atmosferi azota 15 minuta. Nakon dodavanja ubrzivača

TEMED (30 mm3), reakciona smeša je izlivena u petri šolju (prečnika 5 cm, visine 0,5 cm), i ohlađena

na -20 °C u periodu od 24 h. Posle odmrzavanja na sobnoj temperaturi, kriogelovi su isečeni na

diskove (prečnika 8 mm), i potopljeni u 4% vodeni rastvor glutardehida preko noći, radi umrežavanja

želatina. Zatim su diskovi ispirani pomoću dejonizovane vode tokom 7 dana, radi uklanjanja

neizreagovanih supstanci. Dejonizovana voda menjana je svežom na svaka 24 h. Sintetisani diskovi

hidrogelova osušeni su pomoću liofilizatora (na temperaturi od -50 °C tokom 24 h).

3.4. Karakterizacija hidrogelova

3.4.1. Ispitivanje bubrenja hidrogelova

Stepen bubrenja (qe) za sintetisane hidrogelove određen je pomoću gravimetrijske metode.

Suvi diskovi hidrogelova potapani su u 0,5 mol dm-3 rastvore pufera (fosfatni pufer pH = 7,40) na 37

°C. Diskovi su periodično vađeni iz puferskih rastvora, sušeni pažljivim brisanjem pomoću filter-

papira i potom izmereni na analitičkoj vagi. Stepen bubrenja izračunat je pomoću formule:

𝑞𝑒 = 𝑚𝑡 − 𝑚0

𝑚0

gde je m0 početna masa suvog hidrogela, a mt masa nabubrelog hidrogela u vreme merenja.

Svi eksperimenti bubrenja izvedeni su u triplikatu. Stepen bubrenja prikazan je u funkciji vremena.

3.4.2. Ispitivanje pH-osetljivosti hidrogelova prilikom bubrenja

Za ispitivanje zavisnosti bubrenja od vrednosti pH, praćen je proces bubrenja hidrogelova u

rastvorima pufera različitih pH vrednosti, u opsegu fizioloških pH vrednosti (2,20, 3,85, 4,50, 5,50,

6,00, 7,40, i 8,00) na 37 °C. Poređenjem vrednosti stepena bubrenja, ispitan je uticaj hemijske

strukture sintetisanih hidrogelova na pH-osetljivost.

3.4.3. Karakterizacija strukture hidrogelova i kriogelova

Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIC) korišćena je za strukturnu

analizu uzoraka hidrogelova. Apsorpcioni spektri snimljeni su na Thermo-Scientific Nicolet 6700

FTIC dijamantsko kristalnom spektrometru tehnikom prigušene totalne refleksije (ATR) u opsegu

talasnih brojeva od 4000 do 500 cm–1.

45

3.4.4. Mehanička svojstva kriogelova

Mehaničke karakteristike skafolda izmerene su korišćenjem univerzalne mašine za testiranje

(Galdabini Quasar 50, Italy) upotrebom uniaksijalne kompresije sa 100-N ćelijom opterećenja na

sobnoj temperaturi. Jangov modul (E) je izračunat iz linearnog dela krive stres/naprezanje i

predstavlja prosečnu vrednost tri merenja.

3.4.5. Morfologija kriogelova

Za morfološku analizu sintetisanih kriogelova na bazi HEMA korišćena je skenirajuća

elektronska mikroskopija (SEM). Za analizu je korišćen uređaj Jeol JSM-7600 F. Kako bi se izbegle

deformacije morfologije uzoraka prilikom lomljenja, diskovi hidrogelova potapani su u tečni azot i

lomljeni u zamrznutom stanju. Potom su uzorci fiksirani za nosač pomoću karbonske trake,

naparavani tankim slojem zlata (korišćenjem BAL-TEC SCD 005) isušeni liofilizacijom (liofilizator

VC 50 SalvisLab Vacucenter). Za analizu je korišćen poprečni presek uzoraka kriogelova.

3.4.6. Ispitivanje poroznosti kriogelova

Poroznost hidrogelova na bazi HEMA određena je metodom zamene rastvarača. Kao medijum

za kvašenje korišćen je glicerol (ρ = 1,2038 gcm-3). Suvi hidrogelovi su potopljeni u glicerol 24 h, i

nakon uklanjanja viška glicerola sa površine hidrogela, mereni na analitičkoj vagi. Za određivanje

poroznosti korišćena je formula:

𝑃𝑜𝑟𝑜𝑧𝑛𝑜𝑠𝑡 = 𝑚𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 − 𝑚𝑖

𝜌𝑉∗ 100

gde je mi masa suvog hidrogela, mglicerol masa hidrogela sa glicerolom, ρ je gustina glicerola,

a V zapremina uzorka hidrogela.

3.4.7. Ispitivanje degradacije hidrogelova i kriogelova

Ispitivanje in vitro degradacije hidrogelova na bazi HEMA izvođeno je potapanjem uzoraka

hidrogelova, u 20 cm-3 rastvora fosfatnog pufera (0,5 mol dm-3) pH vrednosti 7,40 na 37 °C. Uzorci

kriogelova su vađeni iz rastvora na svake dve nedelje, a uzorci hidrogelova svaki dan, sušeni na 40 °C

do konstantne mase, i mereni na analitičkoj vagi. Rastvor pufera menjan je svežim na svakih 24 h.

Degradacija je prikazana kao funkcija procenata preostale mase hidrogela u funkciji vremena:

% 𝑝𝑟𝑒𝑜𝑠𝑡𝑎𝑙𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑔𝑒𝑙𝑎 = 𝑚𝑖

𝑚𝑡∗ 100

46

gde je mi početna masa suvog hidrogela, dok je mt masa suvog hidrogela u vreme merenja.

Svi eksperimenti degradacije izvedeni su u triplikatu.

3.4.7.1. Ispitivanje pH-osetljivosti hidrogelova prilikom degradacije

Ispitivanje zavisnosti in vitro degradacije od vrednosti pH za uzorke hidrogelova na bazi

cviterjonskih PBAE, vršeno je potapanjem uzorka u 20 cm-3 rastvora pufera različitih pH vrednosti,

u opsegu fizioloških pH vrednosti (2,20, 3,85, 4,50, 5,50, 6,00, 7,40, i 8,00) na 37 °C. Uzorci su

vađeni iz rastvora na svakih 24 h, sušeni na 40 °C do konstantne mase, i mereni na analitičkoj vagi.

Rastvor pufera menjan je svežim na svakih 24 h. Svi eksperimenti degradacije izvedeni su u triplikatu.

Poređenjem vrednosti degradacije na različitim vrednostima pH, ispitan je uticaj hemijske strukture

sintetisanih hidrogelova na pH-osetljivost.

3.4.8. Ugradnja i in vitro otpuštanje cefaleksina iz hidrogelova

Zbog degradacije hidrogelova na bazi cviterjonskih PBAE, aktivna supstanca cefaleksin

monohidrat, ugrađivana je u hidrogel prilikom sinteze. Cefaleksin monohidrat (2% aktivne supstance

u odnosu na masu monomera) dodat je u rastvor PBAE makromera pre dodatka inicijatora i smeša je

mešana na magnetnoj mešalici do potpunog rastvaranja antibiotika. Eksperimenti in vitro otpuštanja

aktivne supstance cefaleksin monohidrata iz hidrogelova na bazi PBAE izvedeni su stavljanjem suvog

diska hidrogela u rotirajuću korpicu i uranjanjem u 15 cm–3 medijuma za otpuštanje na 37 ± 0,1 °C.

Brzina mešanja medijuma bila je 50 obrtaja/minuti. Kako bi se ispitala zavisnost brzine otpuštanja od

pH vrednosti, kao medijum su korišćeni rastvori pufera pH vrednosti 2,20, 5,50 i 7,40. Količina

otpuštene aktivne supstance cefaleksin monohidrata iz hidrogelova na bazi PBAE merena je pomoću

UV spektrofotometra (Shimadzu UV-1800, Japan). Apsorbancija rastvora merena je u konstantnim

vremenskim intervalima na talasnoj dužini λ= 212 nm, specifičnoj za cefaleksin. Koncentracija

otpuštene aktivne supstance je izračunata korišćenjem kalibracione krive, koja je dobijena merenjem

apsorbancije rastvora poznatih koncentracija cefaleksina. Svi eksperimenti otpuštanja cefaleksina

izvedeni su u triplikatu.

3.4.8.1. Ispitivanje mehanizma transporta aktivne supstance

Matematičko modelovanje za sisteme za otpuštanje lekova koristi se da bi se predvideli

mehanizmi transporta aktivne supstance. U cilju određivanja mehanizma otpuštanja cefaleksina iz

hidrogelova na bazi PBAE korišćena su četiri različita kinetička modela za analizu otpuštanja prvih

60% aktivne supstance.

Model 1 je Higuči model, koji opisuje otpuštanje aktivne supstance iz sistema matrica [201].

Prvobitno konstruisan za planarne sisteme, proširen je da bi obuhvatio sisteme različitih geometrija i

poroznosti [202]:

𝑀𝑡

𝑀𝑖= 𝑘𝐻 ∙ 𝑡

1

2 (1)

gde Mt/Mi predstavljaju frakciju otpuštene aktivne supstance, kH je Higuči kinetička konstanta

rastvaranja, i t je vreme otpuštanja.

47

Model 2 je Ritger–Pepas jednačina [203]:

𝑀𝑡

𝑀𝑒= 𝑘𝑅𝑃 ∙ 𝑡𝑛 (2)

gde je Mt/Me odnos otpuštanja leka u vremenu t i ravnotežnom stepenu bubrenja. Konstanta kRP

određuje brzinu otpuštanja i geometrijske parametre karakteristične za sisteme lek-polimer, kao i

efekte hemijske funkcionalnosti nosača na sistem za otpuštanje leka. Eksponent n predstavlja

difuzioni eksponent vezan za transportni mehanizam rastvarača i rastvorene supstance. Konstante kRP

i n se mogu izračunati iz nagiba i odsečka sa grafika funkcije zavisnosti ln(Mt/Me) od ln(t). U literaturi

su opisani slučajevi gde za sistem za otpuštanje lekova oblika ploče vrednosti n < 0,50 ukazuju da je

penetracija rastvarača u hidrogel kontrolisana difuzijom (Fikov proces). Za vrednosti 0,50 < n< 1,00

(ne-Fikov proces), tokom otpuštanja leka dolazi do istovremene difuzije i relaksacije polimernih

lanaca. Za vrednosti n > 1 transport leka odvija se po kompletno ne-Fikovom procesu ili mehanizmu

transporta Tipa II [188].

Model 3 zasnovan je na Pepas–Salin jednačini [188]:

𝑀𝑡

𝑀𝑖= 𝑘1 ∙ 𝑡𝑚 + 𝑘2 ∙ 𝑡2𝑚 (3)

Model 3 zasnovan je na Pepas–Salin jednačini kada je m = 0,5:

𝑀𝑡

𝑀𝑖= 𝑘1 ∙ 𝑡

1

2 + 𝑘2 ∙ 𝑡 (4)

gde Mt/Mi predstavljaju frakciju otpuštene aktivne supstance, k1 i k2 su kinetičke konstante, dok je t

vreme otpuštanja. Pepas–Salin (jednačina (4)) model uzima u obzir spregnute efekte doprinosa

Fikove difuzije i relaksacije polimera. Odnos doprinosa relaksacije (R) i Fikove difuzije (F) R/F može

se izračunati korišćenjem parametara k1 i k2, dobijenih fitovanjem eksperimentalnih podataka

otpuštanja korišćenjem Pepas–Sahlin jednačine:

𝑅

𝐹=

𝑘1

𝑘2 ∙ 𝑡𝑚 (5)

Doprinos difuzije dominira za vrednosti R/F < 1, dok je za R/F > 1 dominantan doprinos

relaksacije. Za vrednost R/F = 1, mehanizam otpuštanja sadrži jednake doprinose erozije i difuzije.

Svi matematički modeli validni su samo za otpuštanje prvih 60% leka iz svih uzoraka. Suma

najmanjih kvadrata (RSS) izračunata je radi određivanja najboljeg modela fitovanja. Minimalna

vrednost RSS dobijena je korišćenjem najboljeg modela za fitovanje eksperimentalnih podataka

[204]. Međutim, pošto ukupan broj parametara u jednačini utiče na vrednost RSS, neophodno je

koristiti diskriminativan kriterijum nezavisan od broja parametara u matematičkom modelu. Stoga je

korišćen Akaike Informacioni Kriterijum (AIC) [205]:

𝐴𝐼𝐶 = 𝑁 ∙ ln(𝑅𝑆𝑆) + 2 ∙ 𝑝 (6)

gde je N broj eksperimentalnih podataka, p je broj parametara u predviđenom modelu, dok je RSS

suma najmanjih kvadrata. Model sa najmanjom vrednošću AIC smatra se najoptimalnijim za

opisivanje mehanizma otpuštanja leka. Eksperimentalni podaci su statistički analizirani metodom

nelinearne regresije najmanjih kvadrata. Vrednosti SSR i AIC izračunate su za svaki model otpuštanja,

gde su niže vrednosti ukazivale na bolje fitovanje eksperimentalnih podataka za dati model.

3.4.9. Ispitivanje citotoksičnosti hidrogelova u in vitro uslovima

48

Citotoksičnost (antiproliferativna aktivnost) hidrogelova na bazi cviterjonskih PBAE izmerena je

korišćenjem standardnog MTT eseja i metoda pogodnih za testiranje sintetisanih materijala [206].

Ukratko, ćelije MRC5 (fibroblast ljudskih pluća, dobijenim iz Američke Kolekekcije Kultura (ATCC))

postavljene su u bunarčićima mikrotitar ploče sa ravnim dnom (sa 96 oglednih bunarčića) u koncentraciji

od 1 ×104 ćelija po bunarčiću, gajene su u atmosferi 95% vazduha i 5% CO2 na 37 °C, i održavane kao

monosloj kultura u RPMI-1640 medijumu sa dodatkom 100 μg cm–3 streptomicina, 100 U cm–3

penicillina, i 10% v/v fetalnog kravljeg seruma (FBS). Ćelije MRC5 su tretirane sa 100%, 50%, 25% i

12,5% v/v ekstraktom materijala i inkubirane tokom 48 h. Kontrolne kulture su tretirane samo

medijumom za rast, koji se nalazio i u praznim bunarčićima u zapremini 200 μL. Proliferacija ćelija

određivana je MTT redukcionim esejom, spektrofotometrijskim merenjem apsorbancije na 540 nm na

Tecan Infinite 200 Pro multiplate čitaču (Tecan Group, Männedorf, Švajcarska). Rezultati eksperimenta

MTT eseja prikazani su kao procenat kontrolnih (netretiranih) ćelija, proizvoljno određen kao 100%, i

predstavljaju srednju vrednost nezavisnih eksperimenata sprovedenih u triplikatu.

3.4.10. Ispitivanje citotoksičnosti kriogelova u in vitro uslovima

Biokompatibilnost hidrogelova na bazi HEMA i PBAE, sa i bez želatina, ispitivana je pomoću

eseja na normalnim ćelijama ljudskog fibroblasta, MRC5. Uzorci hidrogelova su kultivisani u medijumu

ćelijskih kultura u mikrotitar pločama (sa 24 ogledna bunarčića) tokom 24 h. Nakon perioda inkubacije,

supernatanti su centrifugirani i upotrebljeni za esej biokompatibilnosti. MRC5 ćelije suspendovane su u

Dulbecco modifikovanom Eagle medijumu suplementiranom dodatkom 10% v/v FBS. Ćelije su gajene

u bocama sa dodatim medijumom, potom su zasejane u bunaričićima mikrotitar ploče sa ravnim dnom

(sa 96 oglednih bunarčića) i gajene u atmosferi 95% vazduha i 5% CO2 na 37 °C tokom 24 h. Nakon toga,

MRC5 ćelije su inkubirane sa i bez pripremljenih supernatanata hidrogelova i upotrebljene u

modifikovanoj MTT metodi za određivanje ćelijske vijabilnosti/proliferacije [202]. Modifikovana metoda

se zasniva na obojenoj reakciji mitohondrijalne dehidrogenaze iz živih ćelija sa MTT. Zapremina od 10

μL rastvora MTT (5 mg cm–3) dodata je u svaki bunarčić sa tretiranim ćelijama i inkubacija je

nastavljena 3 h na 37 °C. Formazan nastao kao proizvod reakcije rastvoren je u mešavini natrijum-dodecil-

sulfata i HM (10% SDS u 0,01 mol dm-3 HM) i apsorbancija je merena spektrofotometrijski na dvostrukoj

talasnoj dužini od 570/650 nm. MTT eseja prikazani su kao procenat kontrolnih (netretiranih) ćelija,

proizvoljno određen kao 100%, i predstavljaju srednju vrednost nezavisnih eksperimenata sprovedenih u

triplikatu.

3.4.11. Ispitivanje toksičnosti hidrogelova u in vivo uslovima - embrioni zebra ribica

Ispitivanje toksičnosti za uzorke hidrogelova na bazi cviterjonskih PBAE na modelu zebra ribica

izvedeno je prema opštim pravilima Organizacije za ekonomsku saradnju i razvoj (OECD) za tesitranje

hemikalija [207, 208]. Svi ogledi sa zebra ribicama izvedeni su uz poštovanje Evropske direktive

2010/63/EU i etičkih uputstava za negu i korišćenje laboratorijskih životinja sa Instituta za molekularnu

genetiku i genetsko inžinjerstvo, Univerziteta u Beogradu. Embrioni divljeg tipa zebra ribice (Danio

rerio), dostavljeni od dr Ane Cvejić (Institut Wellcome Trust Sanger, Krembridž, Ujedinjeno

Kraljevstvo), gajeni su do stadijuma zrelosti u postrojenju za odgajanje zebra ribica, sa kontrolisanom

temperaturom od 28 °C i standardnim 14/10 h fotoperiodom svetlo-tama, i regularno hranjeni

komercijalnom suvom hranom u vidu pahuljica (TetraMin pahuljice, Tetra Melle, Nemačka) dva puta

dnevno i Artemianauplii jednom dnevno. Embrioni zebra ribica proizvedeni su razmnožavanjem u

parovima, sakupljeni i distribuirani u pločama (sa 24 ogledna bunarčića), gde svaki bunarčić sadrži po 10

embriona i 1 cm–3 vode za embrione (0,2 g dm–3 instant soli iz okeana u destilovanoj vodi) i gajene na 28

49

°C. Za ispitivanje smrtnosti, razvojno-mentalne toksičnosti, i kardiotoksičnosti ispitivani uzorci

hidrogelova su inkubirani u vodi za embrione (0,2 g dm–3 instant soli iz okeana u destilovanoj vodi) tokom

72 h na 37 °C i 180 rpm, posle čega su embrioni u stadijumu od 6 h nakon oplodnje (hpf) izloženi

različitim koncentracijama ekstrakta hidrogelova (rastvori 12,5%, 25%, 50% i 100%, v/v) i preostali deo

diska testiranih hidrogelova (200, 100, i 50 μg cm–3). Voda za embrione korišćena je kao negativna

kontrola. Eksperimenti su izvedeni tri puta sa 30 embriona po koncentraciji. Apialne krajnje tačke za

određivanje toksičnosti snimljene su na 24, 25, 72, 96 i 120 hpf korišćenjem invertovanog mikroskopa

(CKX41; Olympus, Tokio, Japan). Mrtvi embrioni su prebrojani i odbačeni na svakih 24 h. Na 96 hpf,

emprioni su pregledani da bi se ustanovili otkucaji srca, anestezirani dodavanjem 0,1% w/v rastvora

trikana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), fotografisani i ubijeni zamrzavanjem na −20 °C u periodu ≥ 24

h.

Tabela 5. Letalni i teratogeni efekti posmatrani u embrionima zebra ribica (Danio rerio) u

različitim satima nakon oplodnje (hpf).

Kategorija

Završne faze razvoja Vreme izlaganja (hpf)

24 48 72 96/120

Letalni efekti Koagulisana jaja ● ● ● ●

Nedostatak otkucaja srca ● ● ● ●

Teratogeni efekti Malformacija glave ● ● ● ●

Malformacija očiju ● ● ● ●

Malformacija sakulusa/otolita ● ● ● ●

Malformacija horde ● ● ● ●

Malformacija repa ● ● ● ●

Skolioza ● ● ● ●

Edem žumanca ● ● ● ●

Malformacija žumanca ● ● ● ●

Retardacija rasta ● ● ●

Izleganje ● ●

Kardiotoksičnost Perikardni edem ● ● ●

Morfologija srca ● ●

Brzina otkucaja srca (otkucaji/min) ●

a Nisu primećene jasne organske strukture. b Malformacija očiju snimljena je za retardaciju u razvoju oka i abnormalnost u obliku i veličini. c Prisustvo nijednog, jednog ili više od dva otolita po sakulusu, kao i redukcija ili povećanje otolita

i/ili sakulusa (otic vesiMes). d Malformacija repa je zabeležena kada je rep bio savijen, uvijen ili kraći u poređenju sa kontrolnim

embrionima. e Retardacija rasta je zabeležena poređenjem dužine tela sa kontrolnim embrionima (nakon izleganja,

do i nakon 72 hpf) korišćenjem optičke komparacije upotrebom invertovanog mikroskopa (CKX41;

Olympus, Tokio, Japan).

50

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Sinteza i karakterizacija novih cviterjonskih hidrogelova na bazi

poli(β-aminoestara) za otpuštanje lekova na ciljano mesto

Novi „inteligentni“ hidrogelovi poli(β-aminoestara) (PBAE) na bazi di(etilen-glikol)-

diakrilata i glicina su sintetizovani i okarakterisani. U prvoj fazi su dobijeni makromeri sa različitim

hemijskim strukturama, koji su zatim polimerizovani korišćenjem slobodno-radikalske

polimerizacije.

4.1.1. Sinteza cviterjonskih PBAE makromera (P1–P3)

PBAE makromeri su sintetisani reakcijom Majklove adicije diakrilatne i amino komponente.

Ova reakcija se jednostavno izvodi, a dodatna prednost je što prečišćavanje proizvoda uglavnom nije

potrebno. Menjanjem stehiometrijskog odnosa diakrilat/amin, pri čemu je on uvek bio veći od 1,

dobijeni su uzorci makromera koji imaju akrilatne grupe na oba kraja, sposobne za sintezu umreženih

struktura reakcijom slobodno-radikalske polimerizacije. Odnos diakrilat/amin je menjan da bi se

ispitao uticaj promene sastava na krajnja svojstva dobijenih proizvoda.

4.1.2. Strukturna svojstva cviterjonskih PBAE makromera

1H NMR spektri su potvrdili da sintetisani PBAE makromeri poseduju akrilatne grupe na

krajevima lanaca, kao i da su dobijeni bez sporednih proizvoda, te stoga nije bilo potrebe za dodatnim

prečišćavanjem. Poređenjem integrisanih vrednosti signala protona vinil grupe (a, a' i b na 5,85–6,40

ppm) sa signalima protona etilenske grupe iz di(etilenglikola) (c i d na 3,80–4,40 ppm), izračunata je

srednja molarna masa makromera. Na Slici 34 je prikazan 1H NMR spektar PBAE makromera P3.

Srednje molarne mase dobijenih PBAE makromera su prikazane u Tabeli 6.

Slika 34. 1H-NMR spektar makromera P3

51

Tabela 6. Molski odnos glicin/DEGDA i srednje molarne mase (Mn) cviterjonskih PBAE makromera

Uzorak Glicin DEGDA Mn (g/mol)

P1 1 1.4 1610.3

P2 1 1.6 798.6

P3 1 1.8 506.2

4.1.3. Sinteza cviterjonskih hidrogelova na bazi PBAE

Niz hidrogelova na bazi cviterjonskih PBAE, sa glicinom kao amino komponentom, je

uspešno sintetisan reakcijom slobodno-radikalske polimerizacije, u vodenom rastvoru makromera

P1-P3 sa inicijatorom APS i ubrzivačem TEMED na 50 °C u periodu od 24 h.

Slika 35. Šematski prikaz sinteze hidrogelova H1-3 iz makromera P1-3

4.1.4. Strukturna svojstva hidrogelova

Slika 36. Poređenje FTIC spektara makromera

PBAE (P1-P3) sa spektrima analognih hidrogelova (H1-H3).

FTIC spektroskopska analiza je korišćena kako bi se utvrdila hemijska struktura sintetisanih

makromera i hidrogelova, kao i priroda nagrađenih veza. U FTIC spektrima PBAE makromera i

52

hidrogelova prikazani su sledeći karakteristični signali: signal u vidu široke trake karakterističan za

OH grupu na 3436 cm-1 (C–O istezanje), alifatske trake na 2953 i 2878 cm-1 (C–H istezanje) i

karbonilna traka iz estarske grupe na 1729 cm-1 (C=O istezanje). Dve trake karakteristične za

dvostruku vezu ugljenik-ugljenik iz akrilatne grupe na 1636 i 818 cm-1, koje su zapažene u svim

spektrima cviterjonskih PBAE makromera, nisu prisutne u spektrima kriogelova, što ukazuje na

odsustvo akrilatnih grupa, odnosno njihovo nestajanje usled reakcije polimerizacije (Slika 36).

4.1.5. Ispitivanje bubrenja hidrogelova

Bubrenje hidrogelova je praćeno gravimetrijskom metodom u funkciji vremena u opsegu

fizioloških vrednosti pH i temperature (pH u opsegu 2,20–8,00 i na konstantnoj temperaturi od

37 °C). Ravnotežni stepen bubrenja (qe) prikazan je kao funkcija pH na Slici 37.

2.2 3 3.85 4.5 5.5 6 6.8 7.4 80

2

4

6

8

10

pH

Ra

vn

ote

žn

i s

tep

en

bu

bre

nja

(q

e) H1

H2

H3

Slika 37. Ravnotežni stepen bubrenja za uzorke hidrogelva H1, H2 i H3

na različitim vrednostima pH i temperaturi 37 oC.

Izrazita zavisnosti ravnotežnog stepena bubrenja od pH potiče od cviterjonskog karaktera

hidrogelova a razlike u stepenu bubrenja potiču od različitih sastava ispitivanih hidrogelova.

Očigledno je da uzorci sa većim sadržajem glicina više bubre. Sa Slike 37 se može uočiti oblast pH

za koje je cviterjonski oblik molekula dominantan. IT tačka za hidrogelove na bazi glicina je oko

5,50. Sa variranjem pH vrednosti rastvora različiti elektrostatički efekti u hidrogelovima dolaze do

izražaja – jedan je elektrostatičko odbijanje između funkcionalnih grupa sa istim naelektrisanjem, a

drugi je elektrostatičko privlačenje između pozitivno i negativno naelektrisanih funkcionalnih grupa.

U opsegu pH za koji je cviterjonski oblik molekula dominantan najveći broj funkcionalnih grupa se

nalazi u obliku cviterjona, gde Kulonova elektrostatička privlačenja između negativnih i pozitivnih

naelektrisanja dominantno utiču na kolaps polimerne mreže, čemu doprinose i van der Waals-ove i

hidrofobne interakcije. Elektrostatička odbijanja takođe su prisutna i na pH vrednostima blizu IT

između istovetno naelektrisanih grupa, ali nemaju veći značaj za vrednosti bubrenja hidrogelova. Na

vrednostima pH nižim ili višim od 5,50, ponašanje polimernih mreža određuju preovlađujuće

pozitivno (na baznijim vrednostima pH) ili negativno (na kiselijim vrednostima pH) naelektrisane

grupe koje proizvode osmotski pritisak unutar mreže, usled odbijanja funkcionalnih grupa sa

istovetnim naeletrisanjem, i doprinose procesu bubrenja. Efekat odbijanja pozitivno naelektrisanih

grupa u kiseloj sredini se povećava sa povećanjem kiselosti sredine, dok se u baznoj sredini odbijanje

negativno naelektrisanih grupa povećava sa povećanjem baznosti sredine. Efekat istovetnih

53

naelektrisanja i povećanje odbijajućih elektrostatičkih sila između polimernih lanaca, daleko je

izraženije u baznoj nego u kiseloj sredini, usled smanjene reaktivnosti sterno zaštićenih tercijarnih

amino grupa u polimernim lancima i inhibirane jonizacije karboksilnih grupa [209, 210]. Pored toga,

nejonizovane karboksilne grupe mogu formirati vodonične veze između sebe, koje su jače od

vodoničnih veza sa molekulima vode, što onemogućava prodiranje molekula vode unutar hidrogela,

i utiče na skupljanje polimerne mreže [211]. Šematski prikaz bubrenja hidrogelova u funkciji od pH

prikazan je na Slici 38. Hidrogelovi na bazi glicina pokazuju visok stepen zavisnosti bubrenja od

sastava.

Slika 38. Ponašanje cviterjonskih hidrogelova pri bubrenju i kontrakciji u funkciji pH

4.1.6. Degradacija hidrogelova

Polimerni lanci poli(β-aminoestara) sadrže estarske grupe zbog čega su podložni hidrolitičkoj

degradaciji u vodenim rastvorima. Mehanizmi hidrolize PBAE uključuju napad slobodnog

hidroksidnog jona, anti-Majklovu adiciju i intramolekularni napad nukleofilnih amina. Teorijski

proizvodi degradacije koji nastaju pri hidrolizi PBAE hidrogelova prikazani su na Slici 39.

Slika 39. Teorijski proizvodi degradacije pri hidrolizi PBAE hidrogelova

Mehanizam intramolekularnog napada nukleofilnih amina je manje značajan za degradaciju

PBAE u poređenju sa ostalim mehanizmima usled smanjene reaktivnosti sterno zaštićenih tercijarnih

amina u polimernom lancu [211].

Svi uzorci hidrogelova na bazi glicina pokazuju isti trend zavisnosti dana potrebnih za potpunu

degradaciju od pH vrednosti puferskog rastvora. Zavisnost pokazuje maksimum na vrednosti pH koja

odgovara IT hidrogelova (pH ~ 5,50), što se poklapa i sa najmanjim stepenom bubrenja (na Slici 37).

54

Sa porastom ili smanjenjem pH vrednosti u odnosu na IT povećava se i stepen bubrenja hidrogelova,

što za posledicu ima porast brzine degradacije hidrogelova.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

20

40

60

80

100 H1

H2

H3

Pre

os

tala

ma

sa

hid

rog

elo

va

(%

)

Vreme degradacije (dani)

Slika 40. Procenat preostale mase hidrogelova u funkciji

od vremena za uzorke H1–H3 na pH 7,40 na 37 oC

Brzina degradacije u zavisnosti od pH vrednosti puferskog rasvora, prikazana kao broj dana

potrebnih za potpunu degradaciju uzorka od pH na 37°C, pokazuje veliku zavisnost od pH vrednosti

i sastava hidrogelova (Slike 40 i 41).

2.2 3 3.85 4.5 5.5 6 6.8 7.4 80

5

10

15

20

25

30

35

Da

ni

do

po

tpu

ne

de

gra

da

cij

e u

zo

rka

pH

H1

H2

H3

Slika 41. Broj dana do potpune degradacije uzoraka hidrogelova

H1, H2 i H3 u zavisnosti od pH na 37 °C.

Brzina degradacije veća je pri baznim vrednostima pH u poređenju sa kiselim, zbog sterne

zaštićenosti pozitivno naelektrisanih tercijarnih amina. Uzorci sa najvećim udelom glicina (H1)

degradiraju najbrže, dok uzorci sa najmanjim udelom glicina (H3) degradiraju najsporije, na kiselim

i baznim vrednostima pH. Na brzinu degradacije PBAE utiču, između ostalog, difuzija i hidroliza

unutar mase polimera [212]. Dobijeni rezultati odgovaraju ranije potvrđenom znanju da estarske

funkcionalne grupe podležu hidrolizi koja je katalizovana u baznoj ili kiseloj sredini.

55

4.1.7. Ispitivanje in vitro citotoksičnosti hidrogelova

Za određivanje citotoksičnosti korišćen je indirektni test usled činjenice da materijali nisu

mogli da budu na jednostavan način uniformno sprašeni i u tom obliku budu korišćeni sa ćelijama.

Zdravi ljudski fibroblasti (MRC5) tretirani su 100%, 50%, 25% i 12,5% (v/v) ekstraktom hidrogelova

tokom 48 h. Ekstrakti materijala dobijeni su dugotrajnim mućkanjem i inkubacijom na 37 °C tokom

3 dana, posle čega nisu u potpunosti degradirali, što odgovara podacima o brzini degradacije. Nijedan

od testiranih uzoraka nije pokazao citotoksičnost u in vitro uslovima testiranja, takođe, ekstrakti su

indukovali visok stepen proliferacije u MRC5 ćelijama (u poređenju sa netretiranom kontrolom, gde

je stepen ćelijske vijabilnosti 100%). Stimulativni efekat ekstrakta hidrogelova na proliferaciju ćelija

najviše je izražen kod ekstrakta H2 i može se pripisati proizvodima degradacije koji sadrže ostatke

amino-kiseline glicina i nalaze se u ekstraktu materijala. Hidrogelovi bazirani na amino-kiselinama i

peptidima pokazuju povećanu proliferaciju MRC5 ćelija [213]. Navedeni rezultati pokazuju da

sintetisani materijali nisu toksični po humane fibroblaste.

H1 H2 H30

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Vij

ab

iln

os

t ć

eli

ja (

%)

Uzorci hidrogelova

200 L

100 L

50 L

25 L

Slika 42. Procenat vijabilnosti MRC5 ćelija posle 48 h tretiranja sa ekstraktom materijala hidrogelova

H1, H2 i H3 na 4 koncentracije ekstrakta (25, 50, 100 i 200 µL, što odgovara 12,5, 25, 50 i 100% v/v).

Netretirane ćelije (kontrola) podešene su na 100% rasta.

4.1.8. Ispitivanje in vivo toksičnosti hidrogelova

Da bi se utvrdilo da li je moguće primeniti hidrogelove H1, H2 i H3 na bazi cviterjonskih PBAE

u medicini, određena je njihova in vivo toksičnost korišćenjem modela zebra ribica, kao animalnog

model sistema. Ovaj model je prihvaćen kao važeća alternativa modelima na sisarima za određivanje

toksičnosti i biokompatibilnosti novih biomaterijala, nanomaterijala i nosača lekova usled velike

molekulske, genetske, fiziološke i imunološke sličnosti sa ljudskim uzorcima, kao i zbog dobre

korelacije u odnosu na uticaj farmaceutskih i bioaktivnih jedinjenja [208, 214]. Na ovaj način se

uprošćava put do kliničkih proba i smanjuje neuspeh u kasnijim fazama testiranja [214]. Prema do sada

objavljenim podacima, ovo je prva studija u kojoj su određivani hidrogelovi na bazi PBAE preko

modela zebra ribica.

56

Poznato je da su živi organizmi u fazi embriona osetljiviji na dejstvo hemijski sintetisanih

jedinjenja nego kao odrasli. Embrioni zebra ribica u šestom stadijumu hpf faze su izloženi fino

usitnjenom materijalu hidrogelova (200 µg cm-3) i ekstraktu materijala u vodi embriona (fino

usitnjen materijal je ektsrahovan u toku 72 h na 37° C na 180 rpm i upotrebljen je kao 100%, 50%,

25% i 10% v/v rastvor) u toku pet dana. Dobijeni rezultati su pokazali da uzorci H3 u koncentraciji

od 200 µg cm-3 kao i H1 i H2 u koncentraciji od 150 µg cm-3 nisu bili toksični za embrione zebra

ribica, jer njihovo tretiranje sa ovim ekstraktima hidrogelova nije prouzrokovalo smrt, razvijanje

abnormalnosti, kardiovaskularne poremećaje (promenu morfologije srca, pojavu perkardi jalnog

edema, smanjenu brzinu otkucaja srca) ili znaci hepatotoksičnosti (nekroze jetre) i smanjenje

resorpcije žumanceta) (Slika 43B).

Sa druge strane, hidrogelovi H1 i H2 pokazali su slabu hepatotoksičnost u koncentraciji od

200 µg cm-3, koja se pokazala u vidu neznatno tamnije jetre i manje resorpcije žumanceta u

poređenju sa netretiranim embrionima, dok pri manjim dozama ovi efekti nisu zapaženi. Kako ovi

efekti nisu detektovani pri izlaganju materijalu H3, koji sadrži manje glicina nego H1 i H2,

zapažena toksičnost hidrogelova H1 i H2 može biti usled većeg prisustva ostataka glicina u

proizvodima degradacije. Osim toga, hidrogelovi na bazi PBAE i proizvodi njihove degradacije

sadrže azot, koji se u metabolizmu zebra ribica pretvara u amonijak i može izazvati lokalna

oštećenja u organizmu [215]. Pošto uzorak H3 sadrži najmanju količinu ostataka glicina, on ne

izaziva oštećenja jetre, čak ni pri najvišim koncentracijama ekstrakta (200 µg/ cm-3). Važno je

napomenuti da rezultati dobijeni in vivo nisu u suprotnosti sa in vitro probama, pošto ispitani

kompleksi nisu imali štetan uticaj na površinu kože i peraja zebra ribica, koji se uglavnom sastoje

od fibroblasta, što ih čini interesntnim kandidatima za ispitivanje in vivo za terapije lečenja rana.

Slika 43. Preživljavanje i teratogeni efekti (A) i morfologija (B) 120 hpf starih embriona izloženih

ekstraktima hidrogelova; embrioni izloženi uzorku H3 razvili su se bez znakova toksičnosti,

dok su embrioni izloženi uzorcima H1 i H2 pokazali tamnu jetru (strelica) i slabo

resorbovano žumance (zvezdica), što ukazuje na hepatotoksične efekte.

4.1.9. Ispitivanje in vitro otpuštanja cefaleksina

Pošto je potvrđena biokompatibilnost PBAE hidrogelova na bazi glicina, u sintetisane

hidrogelove ugrađena je aktivna supstanca cefaleksin monohidrat (CEX), kao model lek. CEX je član

prve generacije polusintetičkih cefalosporinskih antibiotika. Od 2008. godine cefaleksin je

najpopularniji cefalosporinski antibiotik u SAD, gde je do sada prepisan za terapiju 25 miliona puta

57

(sa približnom vrednošću od 255 miliona dolara) [216]. CEX ima odlična Gram-negativna i Gram-

pozitivna antimikrobna dejstva. Proizvodi se u vidu želatinskih kapsula i prema podacima

Nacionalnog udruženja za podatake o zdravlju (National Data Corporation Health) svrstan je među

„vrhunskih 200 lekova“ koji se najviše prepisuju u SAD [216]. Ovo jedinjenje je po strukturi

cviterjon, sa pKa vrednostima 2,3 i 7,1, i vrednosti IT u vodi između 4,50 i 5,00 [217]. Izoelektrična

tačka PBAE hidrogelova na bazi glicina je oko 5,50, tako da se može reći da su IT vrednosti

hidrogelova i leka u ovome sistemu bliske [218].

Ispitivano je in vitro otpuštanje leka na različitim pH vrednostima (2,20, 5,50 i 7,40), koje su

karakteristične za kisele i alkalne pH oblasti u ljudskom telu, radi određivanja uticaja sastava

hidrogela na pH-osetljivost pri otpuštanju CEX iz uzoraka hidrogelova [219]. Na taj način je moguće

utvrditi da li se odabrani sistem može primeniti za pH-osetljivo otpuštanje aktivirano specifičnim

fiziološkim uslovima. Profili otpuštanja cefaleksina iz hidrogelova H1, H2 i H3 pri različitim pH

vrednostima rastvora prikazani su na Slici 44.

Na samom početku otpuštanja leka dolazi do takozvanog efekta praska (burst) i u kiseloj i u

baznoj sredini, koji je zatim praćen blagim porastom, a zatim skoro konstantnim otpuštanjem

cefaleksina iz hidrogelova koje je praćeno u toku 48 časova. Nagli skok koji se dešava na početku

otpuštanja može da se pripiše otpuštanju leka koji je ugrađen blizu površine hidrogela. Sa Slike 44 se

vidi da je otpuštanje leka veće na pH 7,40 i 2,20 koje su bliske pKa vrednostima leka (2,3 i 7,1). Lek

se iz matrice hidrogela otpušta kao rezultat promene zapremine hidrogela i elektrostatičkih efekata

između hidrogela i leka. Sa Slika 37 i 44 se može uočiti i da je udeo otpuštenog leka direktno

proporcionalan stepenu bubrenja hidrogela, što znači da veći stepen bubrenja hidrogela stvara veću

površinu kroz koju lek difunduje. Sa promenom pH vrednosti naelektisanja na gelu i leku se takođe

menjaju. Takođe je potrebno istaći da promena jonizacionog stanja CEX utiče i na njegovu

rastvorljivost.

0 10 20 30 40 50 60

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

pH 5,50

pH 7,40

pH 2,20

Vreme (h)

H1

H2

H3

Mt/M

e

Slika 44. Profili otpuštanja cefaleksina iz uzoraka H1–H3

na različitim pH vrednostima.

U literaturi su navedeni podaci o rastvorljivosti na određenim vrednostima pH (koje su bliske

vrednostima na kojima je praćeno otpuštanje za uzorke H1–H3) i oni iznose: 17,98 mg cm-3 na pH

7,2, 16,12 mg cm-3 na pH 2,1, i 12,41 mg cm-3 na pH vrednosti 5,3 [220]. Navedeni podaci

odgovaraju dobijenim rezultatima i potvrđuju da je aktivna supstanca bila u potpunosti rastvorena na

datim vrednostima pH.

58

Otpuštanje leka iz matrice kontroliše jedan ili više fenomena kao što su difuzija, degradacija,

erozija i bubrenje ali se u većini slučajeva radi o kombinaciji nekoliko mehanizama koji utiču na

otpuštanje leka u zavisnosti od vrste leka i polimera [219]. Kao što se vidi iz profila otpuštanja

uzoraka H1–H3, brzina otpuštanja CEX-a u velikoj meri zavisi od pH rastvora i sastava polimera.

Najveća brzina otpuštanja je na pH 7,40, a najsporije otpuštanje je na pH 5,50. Poređenjem

vremena otpuštanja leka i vremena za koje se odigra degradacija, može se zaključiti da uzorci vrlo

malo degradiraju u toku vremena za koje se lek otpusti, tako da otpuštanje leka procesom degradacije

gela praktično može da se zanemari za slučaj otpuštanja cefaleksina. Osim toga, sa Slike 44 se vidi

da je količina leka koja se otpusti na pH 7,40 u toku 10 h oko 90%, koja je i maksimalna vrednost

količine leka koji se otpusti na svim relevantnim pH vrednostima koje su posmatrane. Pošto su

vrednosti izoelektrične tačke leka bliske i nalaze se na pH oko 4,5–5 za lek i na pH oko 5,5 za hidrogel,

jasno je da pri otpuštanju leka na pH vrednosti rastvora od 7,40 preovlađuju negativno naelektrisane

funkcionalne grupe i u hidrogelu i u leku, što indukuje jake sile odbijanja između polimernih lanaca

hidrogela i molekula leka, i dovodi do velike brzine otpuštanja leka.

Međutim, kada je pH vrednost rastvora 2,20, vrlo blizu pKa vrednosti karboksilne grupe,

ukupno naelektrisanje molekula CEX je pozitivno. Sa druge strane, izoelektrična tačka hidrogela je

oko 5,50, tako da na pH 2,20 i hidrogel ima uglavnom pozitivno naelektrisane grupe, što takođe

uslovljava otpuštanje leka usled odbijanja istoimeno naelektrisanih grupa. Na vrednosti pH 2,20

dolazi do otpuštanja manje količina leka nego na pH 7,40, usled činjenice da su elektrostatičke sile

međusobnog odbijanja istovetno naelektrisanih grupa, na polimernim lanacima i leku, mnogo

izraženije u alkalnoj nego u kiseloj sredini, usled otežane reaktivnosti tercijarnih amina u osnovnom

lancu polimera u kiseloj sredini.

Najmanja količina leka je otpuštena na pH 5,50, i posle 10 časova iznosi oko 20%. Na ovoj

vrednosti pH se i hidrogel i lek nalaze blizu ili na pH vrednosti koja odgovara vrednosti izoelektrične

tačke. Ukupno naelektrisanje funkcionalnih grupa na polimernom lancu hidrogela i u leku tada je

približno jednako nuli, tako da se otpuštanje leka odigrava uglavnom usled difuzije i kolapsa

hidrogela.

4.1.9.1. Matematička analiza procesa mehanizma transporta leka

Analiza otpuštanja leka iz polimerne matrice je od dominantnog interesa za farmaceutsko

inženjerstvo. Razvijeni su mnogobrojni matematički modeli koji imaju za cilj da procene

mehanizam otpuštanja leka. Ovi modeli predstavljaju profile otpuštanja koji su dobijeni iz

zavisnosti udela otpuštenog leka od vremena. Svi kinetički modeli važe u oblasti prvih 60% krive

otpuštanja leka [204].

Da bi se procenio mehanizam in vitro otpuštanja cefaleksina iz hidrogelova H1–H3 dobijeni

eksperimentalni podaci otpuštanja 60% leka su analizirani primenom različitih modela, kao što su Higučijev

(jednačina 1), Ritger-Pepas (jednačina 2), Pepas-Salin (jednačina 3) i Pepas-Salin model kada je m = 0,5

(jednačina 4) u medijumima pH vrednosti 2,20, 5,50 i 7,40, na 37 °C. Parametri k1 i k2, izračunati unošenjem

eksperimentalnih podataka u jednačinu 3, omogućuju da se izračuna odnos R/F doprinosa relaksacije

polimernih lanaca (R) i difuzije koja prati Fikov zakon (F), korišćenjem jednačine 5.

Eksperimentalni podaci analizirani su statistički nelinearnom regresijom metodom najmanjih

kvadrata. Suma najmanjih kvadrata (Sum of the squered residuals, SSR) i Akaike informacioni

kriterijum (Akaike Information Criterion, AIC), kriterijum koji ne zavisi od broja parametara, su

izračunati primenom navedenih modela na podatke dobijene ispitivanjem otpuštanja aktivne

supstance iz sintetisanih hidrogelova. Model za koji su dobijene najmanje vrednosti AIC najbolje

opisuje mehanizam otpuštanja aktivne supstance iz sintetisanih hidrogelova [204].

59

Profili otpuštanja cefaleksina iz hidrogelova H1, H2 i H3 na tri različite vrednosti pH (7,40,

2,20 i 5,50) prikazani su na Slikama 45, 46 i 47. U Tabeli 7 prikazani su kinetički parametri otpuštanja

cefaleksina iz H1, H2 i H3 hidrogelova dobijeni primenom Higuči, Ritger-Pepas, Pepas-Salin i Pepas-

Salin (m = 0,5) modela na dobijene eksperimentalne podatke in vitro otpuštanja leka.

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min)

pH 7.40 a)

Higuči model

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

b)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min) Ritger-Pepas model

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

c)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min) Pepas-Salin model

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

d)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min) Pepas-Salin (m = 0,5) model

Fig. 45. Podaci otpuštanja cefaleksina iz H1–H3 hidrogelova na pH 7,40 u funkciji vremena.

Eksperimentalni podaci fitovani prema a) Higuči, b) Ritger-Pepas,

c) Pepas-Salin i d) Pepas-Salin (m = 0,5) modelima

Higuči model zasniva se na pretpostavci da je kumulativno otpuštanje leka proporcionalno

kvadratnom korenu vremena, što ukazuje da se radi o sistemu u kojem je otpuštanje leka kontrolisano

difuzijom [201]. Iako ovaj model nije predviđen za sisteme koji bubre, može da se koristi i u tim

slučajevima kao indikator da je otpuštanje leka kontrolisano difuzijom [202]. Da bi se obezbedila

veća tačnost, kinetika otpuštanja leka kontrolisana difuzijom prema Higuči modelu, mora se potvrditi

još nekim drugim modelom, kao što je model Ritger-Pepas-a. Razlika između ova dva modela je u

eksponentu n. Prema Higuči modelu n ima vrednost 0,5, tako da bi se primenom Ritger-Pepas modela

morala dobiti ista vrednost ovoga eksponenta. Sa druge strane, konstanta otpuštanja leka kRP, u Ritger-

Pepas modelu direktno je proporcionalna konstanti difuzije, zavisi od fizičkih i strukturnih svojstava,

kako leka tako i polimerne matrice, i direktno je proporcionalna brzini otpuštanja leka [203]. U Tabeli

7 su prikazane vrednosti koeficijenta difuzije (n) i konstante otpuštanja (kRP) cefaleksina iz uzoraka

H1–H3 na različitim vrednostima pH.

60

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

pH 2.20 a)M

t /

Me

H1

H2

H3

Vreme (min) Higuči model

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

b)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min) Ritger-Pepas model

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

c)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min) Pepas-Salin model

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

d)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min) Pepas-Salin (m = 0,5) model

Fig. 46. Podaci otpuštanja cefaleksina iz H1–H3 hidrogelova na pH 2,20 u funkciji vremena.

Eksperimentalni podaci fitovani prema a) Higuči, b) Ritger-Pepas,

c) Pepas-Salin i d) Pepas-Salin (m = 0,5) modelima

Kao što se može zapaziti, eksperimentalni podaci za otpuštanje cefaleksina ne slažu se u

potpunosti sa Higuči modelom za sve uzorke; prema Ritger-Pepas modelu vrednosti n su bliske 0,5

za uzorke na pH 7,40 i 2,20, ali za uzorke na pH 5,50 vrednosti n su u opsegu 0,36-0,41 (Tabela 7).

Međutim, konstanta kRP ima najveću vrednost na pH 7,40, a najmanju na pH 5,50 što je u skadu sa

eksperimentalnim podacima (Slike 45 i 47). Ako mehanizam transporta leka nije u potpunosti Fikova

difuzija, različiti procesi osim difuzije mogu da imaju udela u transportu leka. Do navedenog

fenomena može doći zbog dodatnog bubrenja hidrogela, usled otpuštanja određene količine leka iz

matrice, što doprinosi većoj difuziji. Elektrostatičke interakcije između polimera i leka takođe mogu

da utiču na mehanizam transporta; jako elektrostatičko odbijanje između istovetno naelektrisanih

grupa dovodi do bržeg otpuštanja leka. Ovaj fenomen se odražava kroz nešto veće vrednosti kRP na

pH 7,40 i 2,20 nego na 5,50, što je u skladu sa brojem isto naelektrisanih funkcionalnih grupa.

61

0 200 400 600 800 1000

0.0

0.1

0.2

0.3a)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min)

Higuči model

0 200 400 600 800 1000

0.0

0.1

0.2

0.3b)

Mt

/ M

e

Vreme (min)

H1

H2

H3

Ritger-Pepas model

0 200 400 600 800 1000

0.0

0.1

0.2

0.3c)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min)

Pepas-Salin model

0 200 400 600 800 1000

0.0

0.1

0.2

0.3 d)

Mt

/ M

e

H1

H2

H3

Vreme (min)

Pepas-Salin (m = 0,5) model

Fig. 47. Podaci otpuštanja cefaleksina iz H1–H3 hidrogelova na pH 5,50 u funkciji vremena.

Eksperimentalni podaci fitovani prema a) Higuči, b) Ritger-Pepas,

c) Pepas-Salin i d) Pepas-Salin (m = 0,5) modelima

Elektrostatičko odbijanje između grupa sa istim naelektrisanjem u hidrogelu i leku su ključni

faktor koji dovodi do bržeg otpuštanja leka na pH 7,40 i 2,20, pri čemu je taj efekat veći na pH 7,40

usled ranije pomenutog efekta smanjene reaktivnosti tercijarnih amina u kiseloj sredini. Prema

modelu Ritger-Pepas za vrednosti n ≤ 0,50 mehanizam otpuštanja leka je Fikova difuzija, dok za

0,50 ≤ n < 1 mehanizam otpuštanja leka je anomalni (ne Fikov) transport [203]. Može se zaključiti,

prema navedenim kriterijumima koji važe za Ritger i Pepas model i rezultatima koji su prikazani u

Tabeli 7, da je Fikova difuzija dominantan mehanizam transporta leka za hidrogelove H1–H3.

Da bi se odredio tačan mehanizam otpuštanja leka, podaci su fitovani i prema modelu Pepas-

Salin, koji je predložen za matrice koje bubre, računanjem približnog udela mehanizma Filkove

difuzije i relaksacije polimernih lanaca u procesu otpuštanja leka. Iz parametara proračunatih

fitovanjem eksperimentalnih rezultata otpuštanja na pH vrednostima 7,40, 5,50 i 2,20 preko modela

Pepas-Salin (prikazanih u Tabeli 7), vidi se da ovaj model daje veće vrednosti difuzione konstante

u odnosu na konstantu relaksacije. U slučaju PBAE hidrogelova na bazi glicina su vrednosti k1 veće

od k2 što potvrđuje preovlađujući uticaj mehanizma Fikove difuzije u odnosu na relaksaciju, te

stoga predstavlja osnovni mehanizam otpuštanja leka za navedene uzorke. Osim toga, vrlo male

62

vrednosti, kao i negativne vrednosti konstante k2, ukazuju na neznatan uticaj ne-Fikove difuzije,

odnosno relaksacije polimernih lanaca.

U Tabeli 7 prikazani su AIC parametri koji omogućavaju određivanje modela koji najbolje

opisuje eksperimentalne podatke za svaki uzorak i na svim pH vrednostima, odnosno ima najmanju

vrednost parametra AIC. Upoređivanjem vrednosti parametra AIC je utvrđeno da Pepas-Salin

model najoptimalnije opisuje fenomen otpuštanja molekula cefaleksina iz hidrogelova H1, H2 i H3

na pH 2,20 i pH 7,40, a Ritger-Pepas na pH vrednosti 5,50. Da je Fikova difuzija osnovni

mehanizam za proces otpuštanja leka potvrđeno je iz vrednosti odnosa relaksacije i difuzije (R/F),

koji ukazuje na pojedinačne doprinose mehanizma relaksacije i difuzije procesu opuštanja leka.

Vrednosti R/F su vrlo male i imaju negativnu vrednost, što takođe potvrđuje dominantni doprinos

Fikove difuzije u odnosu na doprinos relaksacije polimernih lanaca. Mehanizam difuzije aktivne

supstance kroz polimernu mrežu može se analizirati i na osnovu vrednosti parametra n izračunatog

primenom Ritger-Pepas modela. Dobijene vrednosti n (0,36 do 0,51) ukazuju da je mehanizam

transporta molekula CEX iz hidrogelova H1–H3 Fikova difuzija. Prema prikazanim rezultatima u

slučaju otpuštanja CEX, Fikova difuzija je dominantan proces u odnosu na relaksaciju za sve

uzorke, jer je doprinos difuzije daleko veći.

Tabela 7. Parametri izračunati obradom podataka za otpuštanje CEX iz hidrogelova H1–H3

na pH = 2,20, 5,50 i 7,40 prema različitim kinetičkim modelima.

pH 2,20 pH 5,50 pH 7,40

H1 H2 H3 H1 H2 H3 H1 H2 H3

Higuči

kN 0,0469 0,0374 0,0297 0,0100 0,0083 0,0059 0,0786 0,0666 0,0514

R2 0,9969 0,9942 0,9923 0,9624 0,9135 0,8842 0,9855 0,9905 0,9912

SSR 8,4E-5 1,1E-4 1,1E-4 3,24E-4 4,41E-4 2,94E-4 7,32E-4 4,57E-4 3,50E-4

AIC -91,85 -97,88 -107,81 -126,52 -121,60 -128,11 -48,53 -67,21 -93,46

Ritger-

Pepas

kRP 0,0443 0,0295 0,0216 0,0141 0,0197 0,0170 0,0597 0,0576 0,0437

n 0,50 0,48 0,51 0,36 0,36 0,41 0,50 0,51 0,49

R2 0,9968 0,9978 0,9986 0,9800 0,9740 0,9435 0,9938 0,9899 0,9903

SSR 8,6E-5 4,3E-5 1,9E-5 1,73E-4 1,32E-4 1,43E-4 4,36E-4 4,17E-4 3,00E-4

AIC -89,57 -106,68 -126,49 -140,58 -138,87 -137,59 -50,15 -66,02 -93,34

Pepas-

Salin

k1 0,0371 0,0264 0,0212 0,0096 0,0107 0,0077 0,0471 0,0437 0,0361

k2 -5,8E-4 1,5E-4 -8,8E-5 -7,8E-5 -1,2E-4 -8,5E-5 -7,4E-4 -6,6E-4 -4,0E-4

m 0,62 0,59 0,56 0,56 0,52 0,51 0,72 0,67 0,63

R2 0,9978 0,9977 0,9951 0,9848 0,9682 0,9504 0,9975 0,9978 0,9967

SSR 5,5E-5 4,4E-5 7,1E-5 1,31E-4 1,62E-4 1,51E-4 1,27E-4 1,07E-4 1,33E-4

AIC -111,72 -108,36 -127,60 -137,05 -133,65 -134,73 -58,31 -78,63 -112,95

Pepas-

Salin

m = 0.5

k1 0,0462 0,0327 0,0247 0,0129 0,0118 0,0081 0,0661 0,0625 0,0482

k2 8,6E-5 4,9E-4 5,1E-4 -1,1E-4 -1,4E-4 -9,2E-5 0,0019 5,23E-4 3,36E-4

R2 0,9966 0,9976 0,9986 0,9849 0,9708 0,9281 0,9889 0,9900 0,9912

SSR 9,25E-5 4,69E-5 1,91E-5 1,30E-4 1,49E-4 1,82E-4 5,60E-4 4,79E-4 3,50E-4

AIC -88,87 -105,63 -126,37 -139,14 -136,96 -133,72 48,41 -64,79 -91,48

Svi analizirani modeli odnose se na period do 60% otpuštanja leka, u kome su degradacija i

drugi prateći procesi zanemarljivi. Kao što je ranije pomenuto uzorci PBAE hidrogelova na bazi

glicina vrlo malo degradiraju u toku vremena za koje se lek otpusti.

63

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

-0.2

-0.1

0.0

0.1

pH 7,40 H1

H2

H3

Od

no

s r

ela

ksacije i d

ifu

zije (

R/F

)

Frakcija otpustenog CEX

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-0.2

-0.1

0.0

0.1

pH 2,20

Frakcija otpustenog CEX

Od

no

s r

ela

ks

ac

ije

i d

ifu

zije

(R

/F) H1

H2

H3

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

pH 5,50

Od

no

s r

ela

ks

ac

ije

i d

ifu

zije

(R

/F)

Frakcija otpustenog CEX

H1

H2

H3

Slika 48. Zavisnost frakcije otpuštenog cefaleksina iz hidrogelova H1–H3 od odnosa doprinosa

otpuštanja leka usled relaksacije polimernih lanaca (R) i difuzije koja prati Fikov zakon (F)

na različitim vrednostima pH

4.2. Biokompatibilni i biodegradabilni skafoldi na bazi 2-hidroksietil-

metakrilata umreženi poli(β-aminoestrima), sa i bez želatina

4.2.1. Sinteza PBAE makromera (P4–P6)

Biodegradabilni i biokompatibilni materijali na bazi PBAE makromera sintetisani su

reakcijom Majklove adicije diakrilata i amina. Reakcija adicije je veoma jednostavna i ne zahteva

dodatne korake za prešćavanje dobijenih proizvoda. U cilju ispitivanja uticaja sastava PBAE

makromera na njihove karakteristike varirane su različite amino komponente, diakrilatne komponente

i njihov međusobni odnos u sintezi. Kao amino komponente korišćen je piperazin, dok su kao

diakrilatne komponente korišćeni DEGDA i HDDA. Variranjem komponenti za sintezu PBAE

dobijeni su makromeri različite hidrofilnosti. Hidrofilnost utiče u velikoj meri na bubrenje i

degradaciju hidrogela u vodenim sredinama, tako da se ovo svojstvo može da koristi za fino

podešavanje brzine degradacije promenom hidrofobnog dela u molekulu PBAE. Različiti makromeri

PBAE su dobijeni reakcijom iste komponente amina, piperazina, sa dva različita diakrilata, dietilen-

glikol-diakrilata i 1,6-heksandiol-diakrilata. Odnos diakrilata prema aminu bio je u svim uzorcima

64

>1, ali je variran udeo DEGDA, u odnosu na udeo piperazina, da bi se utvrdio uticaj sastava na

degradaciju kriogelova u koje se ovi makromeri ugrađuju kao umreživači.

4.2.2. Strukturna svojstva PBAE makromera (P4–P6)

Snimanjem 1H NMR spektra uzoraka poli(β-aminoestara) potvrđeno je da su ovi uzorci čisti

kao i da imaju akrilatne grupe na krajevima lanca koje su sposobne da reaguju slobodnoradikalskom

polimerizacijom i umreže lance HEMA. Na Slikama 49 i 50 prikazani su 1H NMR spektri za uzorke

P4 i P6.

Slika 49. 1H NMR spektar makromera P4

Molarne mase makromera PBAE su određene upoređivanjem integralnih vrednosti

terminalnih akrilatnih grupa (vinilni protoni akrilatnih grupa – ukupno 6 protona na obe terminalne

vinil grupe) sa karakterističnim protonima na ponavljajućim jedinicama monomera (pikovi etilenskih

protona iz fragmenata etilenglikola u DEGDA, odnosno HDDA) [5].

Slika 50. 1H NMR spektar makromera P6

65

Poređenjem integralne vrednosti pikova vinilnih protona (5,7–6,5 ppm) sa pikovima

etilenskih protona (3,5–4,4 ppm) iz fragmenata etilen-glikola, za P4 i P5 i pikova etilenskih protona

(4,0–4,2 ppm) za P6, izračunata je srednja molarna masa dobijenih makromera PBAE (Tabela 8).

Tabela 8. Molski odnos piperazina/diakrilata i srednje molarne mase (Mn) PBAE makromera

Uzorak Piperazin Diakrilat (količina i tip) Mn (g/mol)

P4 1 1,8 DEGDA 583

P5 1 1,2 DEGDA 2944

P6 1 1,8 HDDA 603

4.2.3. Sinteza kriogelova na bazi pHEMA i PBAE, sa i bez želatina

Dva niza superporoznih mreža kriogelova umreženih pomoču PBAE su uspešno sintetisana, i

to: niz jednostavnih mreža pHEMA i niz interpenetrirajućih mreža pHEMA/želatin. Monomer

2-hidroksietil-metakrilat je izabran zbog njegove detaljne ispitanosti usled opsežne primene u

biomedicini i farmaciji, odlične biokompatibilnosti i dobrih mehaničkih osobina.

Niz jednostavnih mreža na bazi HEMA je sintetisan reakcijom slobodno-radikalske

polimerizacije/umrežavanja u kriogenim uslovima, korišćenjem sistema inicijator/ubrzivač

(APS/TEMED), pri čemu je u oba slučaja umrežavanje pHEMA izvedeno korišćenjem PBAE

makromera: na bazi piperazina i DEGDA (C1, C2), piperazina i HDDA (C3), dok je za uzorak C4

radi poređenja korišćen umreživač PEGDA.

Slika 51. Šematski prikaz sinteze kriogelova na bazi HEMA i želatina.

Niz interpenetrirajućih mreža pHEMA/želatin je obrazovan u dve faze (Slika 51). U prvoj fazi

su dobijene semi-IPM pHEMA/želatin, na isti način kao i jednostavne mreže, korišćenjem sistema

inicijator/ubrzivač (APS/TEMED), pri čemu je umrežavanje 2-hidroksietil-metakrilata izvedeno

korišćenjem PBAE na bazi piperazina sa DEGDA (CG1 i CG2) i HDDA (CG3), osim za uzorke CG4

kod kojih je radi poređenja korišćen umreživač PEGDA. Slobodno-radikalska polimerizacija je

izvedena u prisustvu želatina u kriogenim uslovima. U drugoj fazi sinteze želatin je umrežen pomoću

glutaraldehida, da bi se dobile interpenetrirajuće mreze pHEMA/želatin.

Uzorci kriogelova C5 (bez želatina) i CG5 (sa želatinom) su sintetisani sa cviterjonskim PBAE

umreživačem P3 na bazi glicina i DEGDA (čija je sinteza prikazana na strani 50), radi poređenja

66

uticaja promene sastava umreživača na svojstva kriogela. Komponente koje su korišćene za sintezu

oba niza kriogelova (sa i bez želatina) i njihovi nazivi prikazani su u Tabeli 9.

Za jednostavni niz mreža kriogelova na bazi pHEMA je u svim uzorcima količina monomera

ista. U slučaju IPM odnos pHEMA/želatin je isti za sve uzorke, ali je u obe serije menjana struktura

i molarna masa PBAE umreživača da bi se utvrdio uticaj tih promena na svojstva kriogelova koja su

najbitnija za njihovu primenu u inenjerstvu tkiva.

Tabela 9. Komponente u reakcionoj smeši i vrsta umreživača pri sintezi kriogelova na bazi HEMA,

sa i bez želatina.

Kriogel Monomer(i) Umreživač

C1 HEMA P4

C2 HEMA P5

C3 HEMA P6

C4 HEMA PEGDA

C5 HEMA P3

CG1 HEMA, želatin P4

CG2 HEMA, želatin P5

CG3 HEMA, želatin P6

CG4 HEMA, želatin PEGDA

CG5 HEMA, želatin P3

4.2.4. Strukturna svojstva kriogelova

Upoređivanjem FTIC spektara PBAE makromera P4 i kriogelova C1 i CG1 (Slika 52) u čijoj

sintezi je korišćen kao umreživač, može se primetiti odsustvo dve karakteristične akrilatne trake iz

spektra makromera P4 (C=C istezanje na 812 cm−1 i 1635 cm−1) u spektrima oba uzorka kriogela

[221]. Ovo ukazuje da su sve vinil grupe na kraju lanca PBAE makromera reakcijom slobodno-

radikalske polimerizacije prevedene u zasićene etilenske grupe.

Slika 52. Poređenje FTIC spektara umreživača P4 i kriogelova C1 i CG1.

67

Trake koje se mogu zapaziti u spektru C1 kriogela su na – 3415 cm−1 za O–H istezanje, 2944

cm−1 za C–H istezanje alkil i na 1722 cm−1 za C=O istezanje estarske karbonilne grupe. U spektru

CG1 kriogela zapažaju se trake na 3324 cm−1 za O–H and N–H istezanje, 2944 cm−1 za C–H istezanje

alkil grupe, 1722 cm−1 za C=O istezanje estarske karbonilne grupe, kao i dva signala koja ukazuju na

prisustvo amidnih grupa, na talasnim dužinama 1653 cm−1 za C=O istezanje amidne grupe (amid I) i

1549 cm−1 za N–H vibracije savijanja amidne groupe želatina (amid II), što potvrđuje prisustvo

želatina u kriogelu CG1 [222].

4.2.5. Ispitivanje bubrenja kriogelova

Kapacitet bubranja hidrolitički degradabilnih biomaterijala je vrlo značajan i tesno povezan

sa degradacijom, jer ulazak vode unutar polimerne matrice predstavlja prvi stupanj u procesu

hidrolitičke degradacije koja potom dovodi i do njihove erozije. Studija bubrenja svih kriogelova je

izvedena u rastvoru fosfatnog pufera pH 7,40 na 37 °C da bi se simulirali fiziološki uslovi. Ravnotežni

stepen bubrenja jednostavnih i IP mreža je prikazan u funkciji vremena (Slike 53 i 54).

0 100 200 300 400 500 600

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

C1

C2

C3

C4

Ste

pen

bu

bre

nja

(q

)

Vreme (min)

0

1.6

2.0

2.4

2.8

3.2

Slika 53. Bubrenje u funkciji vremena za kriogelove bez želatina (C1–C4)

Usled superporozne strukture kriogelova za manje od 10 minuta nakon uranjanja u fosfatni

pufer došlo je do naglog povećanja mase svih kriogelova dok je ravnoteža postignuta posle oko 3h.

Profili bubrenja uzoraka C1, C2 i C3, koji su umreženi sa PBAE na bazi piperazina i DEGDA (C1,

C2), odnosno piperazina i HDDA (C3) i uzorak C4 umrežen sa PEGDA prikazani su na Slici 53.

Posle 10 minuta masa uzorka C1 povećala se za 145%, C2 za 160% a za C3 povećanje je bilo 89%,

dok se masa kriogela C5 sa cviterjonskim PBAE makromerom povećala za 153% (Slika 54). Svi

uzorci kriogelova bez želatina dostigli su plato bubrenja posle 4 h. Redosled masa nabubrelih

kriogelova je zavisio od njihovog stepena hidrofilnosti i superporozne strukture, pri čemu je

ravnotežni stepen bubrenja bio: C1 = 2,88 ± 0,04; C2 = 3,38 ± 0,04; C3 = 2,38 ± 0,03; C4 = 2,18 ±

0,03 i C5 = 3,16 ± 0,03.

68

0 100 200 300 400 500 600

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50

C1

C2

C5

Ste

pen

bu

bre

nja

(q

)

Vreme (min)

Slika 54. Bubrenje u funkciji vremena za kriogelove bez želatina (C1, C2 i C5)

umrežene pomoću PBAE P4, P5 i P3

Uzorak C2 apsorbovao je najveću količinu puferskog rastvora usled jako izražene

hidrofilnosti i najveće molarne mase P5 umreživača. Osim toga, kako je svim uzorcima dodata ista

količina (15% w/w) 2-hidroksietil-metakrilata, najmanji molski udeo P5 umreživača je u uzorku C2

pa mu je stoga i najmanja gustina umreženja, što takođe doprinosi većem stepenu bubrenja u odnosu

na ostale uzorke. Umreživač P4 ima skoro identičnu hemijsku strukturu kao P5, ali ima manju

molarnu masu, što je za rezultat imalo veći stepen umreženja i manji stepen bubrenja kriogela C1 u

poređenju sa kriogelom C2. Usled hidrofobne prirode heksilenske grupe, C3 ima manju brzinu

bubrenja u odnosu na C1 i C2. Uzorak C4, kod kojeg je kao umreživač korišćen PEGDA, ima manji

stepen bubrenja u poređenju sa uzorcima umreženim pomoću PBAE makromera. To se može

objasniti prisustvom pozitivno naelektrisanog azota u strukturi PBAE i njegove velike težnje da gradi

vodonične veze sa molekulima vode, što ga čini hidrofilnijim od PEGDA. Uzorak C5, umrežen

pomoću cviterjonskog PBAE makromera P3, imao je veći stepen bubrenja u odnosu na uzorak C1.

Molarna masa cviterjonskog umreživača P3 je nešto manja u poređenju sa umreživačem P4

korišćenim u sintezi C1, ali je verovatno nešto hidrofilniji karakter umreživača P3 uticao da C5 više

bubri, što se može videti na Slici 54.

Svi kriogelovi sa želatinom dostigli su plato bubrenja posle 5,5 h, dok su ravnotežni

stepeni bubrenja bili za: CG1 = 4,95 ± 0,10; CG2 = 5,92 ± 0,06; CG3 = 4,22 ± 0,08; CG4 = 3,55

± 0,07 i CG5 = 5,53 ± 0,09.

Kao što se vidi sa Slika 55 i 56, uzorci koji sadrže ugrađen želatin (CG1–CG5) bubre više

od onih bez želatina (C1–C5). To se moglo i pretpostaviti na osnovu odigravanja polimerizacije

i umrežavanja 2-hidroksietil-metakrilata u prisustvu želatina kada nastaju semi-IP mreže.

Zahvaljujući velikoj hidrofilnosti želatina molekuli želatina i vode ostaju zarobljeni između

lanaca 2-hidroksietil-metakrilata i odigravanjem procesa krioželiranja stvara se velika kiličina

kristala vode koja dovodi do formiranja vrlo velikih pora. U drugoj fazi se odigrava reakcija

umrežavanja želatina sa glutaraldehidom i nastaju IPM tako da se pore smanjuju, ali i pored toga

mreže koji sadrže želatin (CG1–CG5) imaju veće pore i više bubre od jednostavnih mreža (C1-

C5). SEM mikrografije (Slika 57) su potvrda da se u uzorcima koji su sintetisani u prisustvu

želatina formiraju veće pore u poređenju sa uzorcima koji su dobijeni bez želatina.

Može se zaključiti da u slučaju IP mreža na bazi pHEMA/želatin kapacitet bubrenja zavisi od

hidrofilnosti, dužine lanca i hemijskog sastava makromera PBAE, gustine umreženja i poroznosti.

69

0 100 200 300 400 500 600 700

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

Ste

pe

n b

ub

ren

ja (

q)

Vreme (min)

CG1

CG2

CG3

CG4

Slika 55. Bubrenje u funkciji vremena za kriogelove sa želatinom (CG1–CG4)

0 100 200 300 400 500 600 700

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

Ste

pen

bu

bre

nja

(q

)

Vreme (min)

CG1

CG2

CG5

Slika 56. Bubrenje u funkciji vremena za kriogelove sa želatinom (CG1, CG2 i CG5)

4.2.6. Morfologija kriogelova

Morfologija sintetisanih kriogelova ispitivana je skenirajućom elektronskom

mikroskopijom. Dobijeni mikrografi pokazali su postojanje međusobno povezanih izduženih pora

polihedralnog oblika sa manjim porama koje su okružene debljim zidovima makropora. Uzorci

C1 i C3, dobijeni upotrebom makromera P4 i P6, koji se malo razlikuju po srednjoj molarnoj

masi, pokazuju sličan raspored pora, ali su pore kod uzorka C3 manje što se može pripisati većoj

hidrofobnosti HDDA u poređenju sa DEGDA. Mikrografi za uzorke C1 i C3 u oba slučaja

pokazuju male pore međusobno povezane velikim kanalima. Uzorak C2 ima najveće pore pošto

su lanci P5 makromera duži nego u slučaju C1 i C3. Uzorak C4, umrežen pomoću PEGDA,

poseduje najmanje pore usled manje hidrofilnosti i najmanje srednje molarne mase ovoga

umreživača u odnosu na PBAE. Uzorci koji ne sadrže želatin (Slika 57 levo) imaju manje pore

nego njima analogni uzorci sa želatinom (Slika 57 desno), ali generalno oba niza uzoraka prate

isti trend što se tiče veličina pora što je očigledno posledica njihove strukture i vrste umreživača.

70

Kod uzoraka koji su umreženi sa PBAE najveći uticaj na veličinu pora ima hidrofilnost i srednja

molarna masa PBAE tako da se njihovom promenom može fino regulisati veličina pora.

4.2.7. Poroznost kriogelova

Poroznost ima vrlo važnu ulogu u inženjerstvu tkiva kod dobijanja skafolda. Skafoldi moraju

imati odgovarajuću poroznost da bi naprava bila pogodna za uspešno zasejavanje ćelija. Da bi se u

skafoldima postigla adhezija, preživljavanje, proliferacija i migracija ćelija kao i protok hranljivih

supstanci i izlazak štetnih metabolitičkih produkata, potrebno je da se obezbedi odgovarajuća veličina

pora, njihova raspodela i međusobna povezanost [223]. Osim toga, poroznost ima veliki uticaj na

mehanička svojstva skafolda, jer sa povećanjem poroznosti opada mehanička jačina [224] te je

neophodno naći balans između navednih svojstava da bi se postiglo optimalno rešenje. Na osnovu

velikog iskustva koje je do sada stečeno u oblasti inženjerstva tkiva zaključeno je da relativno velika

poroznost (80–90%) predstavlja uslov da bi se ostvarila optimalna sredina za rast i razvoj ćelija [225].

Merenje poroznosti uzoraka kriogelova pokazalo je da je optimalna poroznost (u opsegu 80,21–

87,04%) ostvarena kod uzoraka koji sadrže želatin (CG1–CG5) u odnosu na uzorke bez želatina (C1–

C5) kod kojih su ove vrednosti nešto niže (Tabela 10). Kriogel C2 koji je umrežen sa umreživačem

P5, sa najvećom molarnom masom, ima najveću poroznost usled najmanjeg stepena umreženja.

4.2.8. Mehanička svojstva kriogelova

Modul elastičnosti skafolda predstavlja važno fizičko svojstvo koje određuje otpornost

materijala prema deformaciji i stoga predstavlja jedan od najvažnijih kriterijuma za primenu skafolda

u biomedicini. Mehanička svojstva hidrogelova zavise od različitih uslova kao što su: vrsta

monomera, uslovi pod kojima se izvodi polimerizacija, gustina umreženja, stepen bubrenja i tip

medijuma u kojem hidrogel bubri. U idealnom slučaju skafold treba da poseduje modul elastičnosti

koji se podudara sa modulom tkiva u živom organizmu u koji je implantiran i dovoljnu jačinu da

podnese hirurško rukovanje u toku implantacije [226]. Mehanička jačina svih dobijenih uzoraka

zavisi i od tipa umreživača, koji određuje između ostalog stepen umreženja i veličinu pora kao i stepen

bubrenja.

Vrednosti modula ispitivanih uzoraka kriogelova kreću se u opsegu 3,24–4,76 MPa i prikazani

su u Tabeli 10. Iz rezultata merenja Jangovog (Young) modula za uzorke sa i bez želatina se može

zaključiti da vrednost modula raste sa povećanjem stepena umreženja.

71

Slika 57. SEM mikrografi kriogelova bez želatina (C1-C5, levo)

i sa želatinom (CG1-CG5, desno) (skala – 200 μm)

Kako Jangov modul zavisi i od poroznosti mreža, IP mreže pokazuju nešto niže vrednosti

modula koje su u granicama 3,24–4,52 MPa, usled nešto veće poroznosti i veličine pora u odnosu na

uzorke bez želatina kod kojih se vrednosti za Jangov modul kreću u opsegu 3,51–4,76 MPa. Uzorak

72

C4, umrežen pomoću PEGDA, koji ima najmanju molarnu masu, ima najveću vrednost Jangovog

modula, dok uzorci C2 (bez želatina) i CG2 (sa želatinom) imaju najniže vrednosti u odgovarajućim

grupama. Vrednosti modula opadaju sa povećanjem srednje molarne mase PBAE umreživača i u

skladu su sa stepenom bubrenja, pokazujući uzajamni uticaj molarne mase umreživača i njegove

hidrofilne/hidrofobne prirode. Vrednosti izduženja pri kidanju prate sličan trend kao vrednosti

modula i one su u opsegu 22,85–28,24% za kriogelove bez želatina, odnosno u opsegu 20,26–26,17%

za kriogelove sa želatinom. Ponovo se moze zaključiti da su vrednosti izduženja pri kidanju malo

manje kod uzoraka sa želatinom.

Literaturni podaci za vrednosti Jangovog modula za hidrogelove na bazi želatina modifikovanog

metakrilamidom i poli(etilen-glikola) [226] ili na bazi želatina modifikovanog metakrilamidom i

pHEMA [227], kreću se u opsegu 4,4–327,7 kPa dok su za nemodifikovani želatin dobijene još niže

vrednosti [228]. Može se zaključiti da se mehanička svojstva dobijenih kriogelova mogu podesiti

promenom strukture PBAE umreživača, kao i da su kod novih IPM želatin/HEMA, umreženih pomoću

PBAE, vrednosti Jangovog modula poboljšane u odnosu na slične hibridne biomaterijale navedene u

literaturi. Iako želatin ima slaba mehanička svojstva, može se zaključiti da je obrazovanjem IP mreža

HEMA/želatin postignuto da su mehanička svojstva kriogelova u vrlo malo meri pogoršana u odnosu

na kriogelove sa HEMA, ali su sa druge strane poboljšane vrednosti poroznosti i stepena bubrenja koje

povoljno utiču na rast ćelija. Dobijene vrednosti Jangovog modula odgovaraju vrednostima vezivnog

tkiva i hrskavice u ljudskom organizmu [68], zbog čega novi materijali pokazuju veliki potencijal za

upotrebu kao skafoldi u inženjerstvu tkiva.

4.2.9. Degradacija kriogelova

Hidrolitička degradacija polimernih mreža je u opštem slučaju kompleksna. Na ovaj proces

utiču mnogi faktori od kojih su najvažniji: gustina umreženja i veličina pora, hidrofilnost/hidrofobnost,

kapaciti bubrenja, naelektrisanja na površini i topografija, debljina uzorka, pH i jonska sila rastvora kao

i interakcija između dve mreže hidrogela kao u slučaju IP mreža. Osim toga, važne su i relativne

koncentracije komponenata u toku polimerizacije [229]. Bitan parametar koji utiče na hidrolitičku

degradaciju ispitivanih IPM pHEMA/želatin i pHEMA polimernih mreža je tip PBAE makromera koji

je korišćen kao umreživač. Fino podešavanje strukture PBAE makromera omogućava dobijanje

uzoraka kriogelova, sa i bez želatina, koji degradiraju različitim brzinama, sa željenim profilima

degradacije za primenu u biomedicini (Slika 58).

Uzorak C3 pokazuje najmanju brzinu degradacije od svih kriogelova sa PBAE umreživačima,

verovatno usled hidrofobnog karaktera heksametilenske grupe u strukturi umreživača P6. PBAE

umreživači korišćeni u sintezi uzoraka C1 i C2 imaju pretežno hidrofilni karakter zahvaljujući

DEGDA akrilatnoj komponenti u umreživačima. To omogućava ulazak veće kolićine vode u mrežu

kriogela što dovodi do brže degradacije. Kriogel C5, čiji umreživač P3 sadrži glicin, degradira više

od kriogela C1 umreženog pomoću P4. Ovo ukazuje na to da iako umreživač P3 ima manju molarnu

masu od P4, njegov cviterjonski karakter ima bitan uticaj na bubrenje i degradaciju kriogelova na pH

vrednosti 7,40. Kod kriogelova C5 i CG5 vrednosti brzine degradacije su između onih za C2 i C1,

odnosno za CG2 i CG1. Uzorak C2 ima najveću brzinu degradacije sa gubitkom mase od (32,71 ±

1,65)% posle 16 nedelja. Brzine degradacije uzoraka C1, C3 i C5 bile su nešto manje tako da je

gubitak mase iznosio: C1 = (25,95 ± 1,58)%; C3 = (21,4 ± 1,60)% i C5 = (28,31 ± 1,61)% posle 16

nedelja. Profil degradacije za uzorak C4 je pokazao da je za isto vreme ona iznosila manje od 8%

(Slika 58). Bitan parametar koji utiče na hidrolitičku degradaciju ispitivanih IPM pHEMA/želatin i

pHEMA polimernih mreža je tip PBAE makromera koji su korišćeni kao umreživači. Fino

podešavanje strukture PBAE makromera omogućava dobijanje uzoraka kriogelova, sa i bez želatina,

koji degradiraju različitim brzinama sa željenim profilima degradacije.

73

Slika 58. Procenat gubitka mase za kriogelove bez (C1–C5, plavi)

i sa želatinom (CG1–CG5, crveni) tokom 16 nedelja

U istim uslovima ispitan je niz uzoraka analognih sa C1–C5 kojima je dodat želatin (20% w/w

u odnosu na masu HEMA). Dodatak želatina usporio je brzinu hidrolitičke degradacije kriogelova,

ali se pretpostavlja da bi pod uticajem enzima u in vivo uslovima brzina degradacije kriogelova sa

želatinom bila veća. Tako je uzorak CG2, analog kriogela C2, pokazao najveću brzinu degradacije sa

gubitkom mase od (26,54 ± 0,67)% posle perioda od 16 nedelja. Prilikom degradacije uzorka CG1

gubitak mase je iznosio (20,87 ± 0,94)%, dok je za CG3 on bio samo (15,95 ± 0,76)% u periodu od

16 nedelja. U istom periodu uzorak CG4 izgubio je manje od 5% mase.

Tabela 10. Ravnotežni stepen bubrenja, Jangov modul elastičnosti, poroznost i procenat degradacije

i izduženja pri kidanju za uzorke kriogelova sa i bez želatina.

Kriogel Ravnotežni stepen

bubrenja

Jangov modul

elastičnosti (MPa)

Poroznost

(%)

Procenat

izgubljene mase

Izduženje pri

kidanju

C1 2,88 ± 0,04 4,38 ± 0,25 73,85 25,95 ± 1,58 24,42

C2 3,38 ± 0,04 2,99 ± 0,21 79,60 32,71 ± 1,65 22,85

C3 2,38 ± 0,04 4,21 ± 0,22 72,49 21,4 ± 1,60 27,73

C4 2,18 ± 0,04 4,66 ± 0,22 66,93 7,14 ± 0,096 28,24

C5 3,16 ± 0,03 3,95 ± 0,20 75,11 28,31 ± 1,61 24,25

CG1 4,95 ± 0,10 3,76 ± 0,20 81,93 20,87 ± 0,94 23,51

CG2 5,92 ± 0,06 2,54 ± 0,18 87,04 26,54 ± 0,67 20,26

CG3 4,22 ± 0,08 3,50 ± 0,20 82,79 15,95 ± 0,76 25,69

CG4 3,55 ± 0,07 3,82 ± 0,24 80,21 4,38 ± 0,81 26,17

CG5 5,53 ± 0,09 3,41 ± 0,23 82,15 22,16 ± 0,04 22,78

0

5

10

15

20

25

30

35

C1 C2 C3 C4 C5 CG1 CG2 CG3 CG4 CG5

Gu

bit

ak

ma

se

(%

)

74

4.2.10. Biokompatibilnost kriogelova

Biokompatibilnost uzoraka isptana je korišćenjem normalnih humanih ćelija fibroblasta,

MRC5 (Slika 59). Vijabilnost je prikazana kao procenat ćelija normalnog humanog fibroblasta koji

je preživeo nakon tretiranja ćelija ekstraktom kriogelova u toku 24 časa. Rezultati su pokazali

zadovoljavajuću vijabilnost za sve uzorke, ali i da je vijabilnost znatno poboljšana uvođenjem

želatina, kao druge komponente koja obrazuje IPM, što je i bio jedan od razloga uvođenja te

komponente.Vijabilnost MRC5 ćelija posle tretiranja ekstraktom kriogela bila je veća od 90% za sve

analizirane uzorke koji sadrže želatin (CG1–CG5), pri čemu je za više od 20% povećana viabilnost u

odnosu na uzorke bez želatina (C1–C5). Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri merenja

viabilnosti ćelija nakon 24 h tretiranja estraktom kriogela.

Slika 59. Efekti supernatanta kultivisanih kriogelova bez (C1–C5, plavi) i sa želatinom (CG1–CG5,

crveni), na vijabilnost normalnih ljudskih fibroblasta (MRC5 ćelijska linija).

Podešavanjem strukture i molarne mase PBAE umreživača za sintezu kriogelova, sa i bez

želatina, je omogućeno da se fino podese različita svojstva koja su u radu ispitana: stepen bubrenja,

morfološke karakteristike, poroznost, brzina degradacije i mehanička jačina.

0

20

40

60

80

100

120

kontrola C1 C2 C3 C4 C5 CG1 CG2 CG3 CG4 CG5

Vija

biln

os

t M

RC

5 ć

eli

ja (

%)

75

5. ZAKLJUČAK

U okviru ove doktorske disertacije su po prvi put sintetisani novi biodegradabilni polimerni

hidrogelovi na bazi biodegradabilnih makromera poli(β-aminoestara), 2-hidroksietil-metakrilata i

želatina za potencijalne primene u inženjerstvu tkiva i otpuštanju lekova.

Primenom reakcije Majklove adicije iz diakrilata i amino komponente uspešno su sintetisani

PBAE makromeri. Prednost sinteze putem Majklove adicije je u vrlo jednostavnoj reakciji koja se

izvodi u jednom stupnju, kao i činjenici da pri ovoj reakciji nije došlo do obrazovanja sporednih

proizvoda te stoga ne zahteva komplikovane metode prečišćavanja. Osim toga, promenom tipa

reaktanata i odnosa diakrilat/amin dobijeni su makromeri različitih struktura i molarnih masa, što je

od velike važnosti za primenu u biomedicini i farmaciji. Terminalne akrilatne grupe linearnih PBAE

lako stupaju u reakciju polimerizacije preko slobodnih radikala i kao dvofunkcionalni makromeri

mogu imati ulogu i umreživača i monomera. Stoga je primena sintetisanih makromera PBAE uspešno

ostvarena tako što su korišćena oba svojstva ovih jedinjenja: u jednom slučaju su korišćeni kao

monomeri za dobijanje cviterjonskih hidrogelova jer su makromeri učestvovali u reakciji

polimerizacije i umrežavanja, dok su u drugom pravcu istraživanja PBAE makromeri korišćeni kao

umreživači pri polimerizaciji HEMA monomera, radi uvođenja degradabilnih estarskih veza

podložnih hidrolitičkoj degradaciji.

Po prvi put su sintetisani biodegradabilni cviterjonski makromeri poli(β-aminoestri) (P1-P3)

reakcijom Majklove adicije iz prirodne aminokiseline glicina i dietilen-glikol-diakrilata, različitih

srednjih molarnih masa, i hidrogelovi (H1–H3) dobijeni slobodnoradikalskom polimerizacijom

PBAE makromera. Utvrđeno je pH-osetljivo ponašanje sintetisanih hidrogelova tipično za cviterjone,

u okviru fiziološkog opsega pH vrednosti i na temperaturi od 37 °C, kao i da važna svojstva

hidrogelova, poput bubrenja i degradacije, u velikoj meri zavise od njihovog sastava i pH vrednosti

sredine. In vitro ispitivanjem citotoksičnosti utvrđeno je da svi uzorci pokazuju povećanu

proliferaciju MRC5 ćelija, bez tragova toksičnosti, što ukazuje na dobru citokompatibilnost

sintetisanih hidrogelova. In vivo probe za ispitivanje PBAE hidrogelova su po prvi put urađene

korišćenjem modela embriona zebra ribica i pokazale su dobru biološku bezbednost, bez letalnih i

teratogenih efekata, za uzorak H3 sa manjim sadržajem glicina. Studija in vitro otpuštanja cefaleksina

pokazala je da se profil otpuštanja, specifičan za cviterjonske hidrogelove, može efikasno kontrolisati

promenom sastava hidrogela i vrednosti pH. Prema dobijenim rezultatima za otpuštanje CEX,

utvrđeno je da uzorak sa najvećim sadržajem glicina, H1, najbrže otpušta aktivnu supstance na svim

ispitivanim pH vrednostima, da je otpuštanje najbrže na pH 7,40, sporije na pH 2,20, dok je na pH

5,50 veoma sporo. Takođe se može zaključiti da je Fikova difuzija dominantan mehanizam u procesu

otpuštanja CEX kod svih uzorka hidrogelova. Na osnovu dobijenih rezultata pokazano je da su

cviterjonski hidrogelovi vrlo interesantni materijali koji mogu da se primene kao matrice za

otpuštanje lekova zbog mogućnosti finog podešavanja brzine i mesta otpuštanja, pri čemu je za

njihovo dobijanje primenjena jednostavna sintetička metoda.

Reakcijom slobodnoradikalske polimerizacije u kriogenim uslovima uspešno su sintetisane i

ispitane dve serije kriogelova da bi se pokazale prednosti kombinovanja prirodnog polimera, želatina,

sa sintetičkim polimerom na bazi pHEMA umreženog PBAE makromerima. Radi poređenja jedna

serija je sintetisana bez želatina (C1-C5), kao serija jednostavnih mreža, a druga sa želatinom (CG1-

CG5) primenom tehnike interpenetrirajućih polimernih mreža. PBAE makromeri su korišćeni kao

umreživači za uvođenje degradabilnih veza u pHEMA, čime se omogućila hidrolitička degradacija

ovog sintetičkog polimera. Obe serije su karakterisane ispitivanjem sastava, morfologije, poroznosti,

profila bubrenja i degradacije, kao i biokompatibilnosti, izražene kroz vijabilnost MRC5 ćelija posle

tretiranja ekstraktom kriogela. Struktura sintetisanih kriogelova je potvrđena pomoću FTIR spektara,

gde se može uočiti odsustvo traka koje su karakteristične za akrilatnu grupu (C=C istezanje na 812

cm−1 i 1635 cm−1), kao i prisustvo traka koje potvrđuju prisustvo želatina u kriogelovima (amidna

76

grupa želatina uočena kao C=O istezanje amidne grupe na 1653 cm−1, i N–H vibracije savijanja

amidne grupe 1549 cm−1). Uvođenjem želatina u strukturu kriogelova ostvarena je optimalna

morfologija međusobno povezanih velikih pora u kojima su mnogobrojne manje pore, kao i željena

poroznost (u opsegu 80,21–87,04%) koja omogućava povoljan rast i razvoj ćelija. Vrednosti

Jangovog modula u opsegu 3,24–4,76 MPa su uvođenjem želatina neznatno smanjene, tako da je

očuvana mehanička jačina koja je ostvarena prisustvom pHEMA polimera. Ovi rezultati

predstavljaju znatno poboljšanje u odnosu na biomaterijale na bazi želatina navedene u literaturi.

Postignuta je i spora degradacija sintetisanih materijala, koja je poželjna u sistemima za regeneraciju

tkiva, koja omogućava da se proizvodi degradacije odvode pre nego što dođe do akumuliranja

toksične koncentracije ovih proizvoda. Svi kriogelovi sa želatinom su pokazali odličnu

biokompatibilnost, veću od 90%, prilikom in vitro ispitivanja na MRC5 ćelijama. Utvrđeno je da

svojstva kod oba niza sintetisanih hidrogelova u velikoj meri zavise od strukture i molarne mase

umreživača PBAE. Može se zaključiti da su korišćenjem želatina kao interpenetranta u sintezi

hibridnih IPM uspešno inkoroporirani biohemijski i biofizički centri, neophodni za morfogenezu i

homeostazu tkiva, dok je uvođenje pHEMA ostvarena odgovarajuća mehanička jačina mreža.

Dobijeni rezultati su potvrdili prednosti kombinacije prirodnog i sintetičkog polimera u hibridnim

IPM radi postizanja povoljnijih svojstava kao što su biokompatibilnost, biodegradabilnost i porozna

trodimenzionalna struktura sa međusobno povezanim porama, koja je analogna ECM hrskavice i

vezivnih tkiva, tako da imaju potencijala za primenu u oblasti inžinjerstva tkiva.

77

6. LITERATURA

[1] A.L. Lakes, R. Peyyala, J.L. Ebersole, D.A. Puleo, J.Z. Hilt, T.D. Dziubla, Synthesis and Characterization

of an Antibacterial Hydrogel Containing Covalently Bound Vancomycin, Biomacromolecules, 15 (2014)

3009-3018.

[2] S.A. Meenach, C.G. Otu, K.W. Anderson, J.Z. Hilt, Controlled synergistic delivery of paclitaxel and heat

from poly(β-amino ester)/iron oxide-based hydrogel nanocomposites, International Journal of Pharmaceutics,

427 (2012) 177-184.

[3] A.L. Lakes, C.T. Jordan, P. Gupta, D.A. Puleo, J.Z. Hilt, T.D. Dziubla, Reducible disulfide poly(beta-

amino ester) hydrogels for antioxidant delivery, Acta Biomaterialia, 68 (2018) 178-189.

[4] S. Santra, J.M. Perez, Selective N-Alkylation of β-Alanine Facilitates the Synthesis of a Poly(amino acid)-

Based Theranostic Nanoagent, Biomacromolecules, 12 (2011) 3917-3927.

[5] D.M. Brey, I. Erickson, J.A. Burdick, Influence of macromer molecular weight and chemistry on poly(beta-

amino ester) network properties and initial cell interactions, Journal of biomedical materials research. Part A,

85 (2008) 731-741.

[6] K. Bauri, M. Nandi, P. De, Amino acid-derived stimuli-responsive polymers and their applications,

Polymer Chemistry, 9 (2018) 1257-1287.

[7] N.E. Kurland, R.B. Ragland, A. Zhang, M.E. Moustafa, S.C. Kundu, V.K. Yadavalli, pH responsive poly

amino-acid hydrogels formed via silk sericin templating, International Journal of Biological Macromolecules,

70 (2014) 565-571.

[8] Z. Zhang, T. Chao, L. Liu, G. Cheng, B.D. Ratner, S. Jiang, Zwitterionic Hydrogels: an in Vivo

Implantation Study, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 20 (2009) 1845-1859.

[9] F. Khan, M. Tanaka, S.R. Ahmad, Fabrication of polymeric biomaterials: a strategy for tissue engineering

and medical devices, Journal of Materials Chemistry B, 3 (2015) 8224-8249.

[10] E.M. Ahmed, Hydrogel: Preparation, characterization, and applications: A review, Journal of Advanced

Research, 6 (2015) 105-121.

[11] W. Hu, Z. Wang, Y. Xiao, S. Zhang, J. Wang, Advances in crosslinking strategies of biomedical

hydrogels, Biomaterials Science, 7 (2019) 843-855.

[12] N. Bölgen, I. Vargel, P. Korkusuz, E. Güzel, F. Plieva, I. Galaev, B. Matiasson, E. Pişkin, Tissue responses

to novel tissue engineering biodegradable cryogel scaffolds: An animal model, Journal of Biomedical

Materials Research Part A, 91A (2009) 60-68.

[13] J. Li, D.J. Mooney, Designing hydrogels for controlled drug delivery, Nat Rev Mater, 1 (2016) 16071.

[14] H.J. van der Linden, S. Herber, W. Olthuis, P. Bergveld, Stimulus-sensitive hydrogels and their

applications in chemical (micro)analysis, Analyst, 128 (2003) 325-331.

[15] A.C. Jen, M.C. Wake, A.G. Mikos, Review: Hydrogels for cell immobilization, Biotechnology and

Bioengineering, 50 (2000) 357-364.

[16] K.L. Wang, J.H. Burban, E.L. Cussler, Hydrogels as separation agents, in: K. Dušek (Ed.) Responsive

Gels: Volume Transitions II, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, 1993, pp. 67-79.

[17] S.L. Bennett, D.A. Melanson, D.F. Torchiana, D.M. Wiseman, A.S. Sawhney, Next-generation hydrogel

films as tissue sealants and adhesion barriers, Journal of cardiac surgery, 18 (2003) 494-499.

[18] B.J. Casey, A.M. Behrens, Z.I. Tsinas, J.R. Hess, Z.J. Wu, B.P. Griffith, P. Kofinas, In vitro and in vivo

evaluation of polymer hydrogels for hemorrhage control, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition,

24 (2013) 1781-1793.

[19] N. Bhattarai, J. Gunn, M. Zhang, Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery,

Advanced drug delivery reviews, 62 (2010) 83-99.

[20] K. Sackheim, T.S. De Araujo, R.S. Kirsner, Compression modalities and dressings: their use in venous

ulcers, Dermatologic therapy, 19 (2006) 338-347.

[21] M.R. Singh, S. Patel, D. Singh, Natural polymer-based hydrogels as scaffolds for tissue engineering,

(2016) 231-260.

[22] J. Zhu, R.E. Marchant, Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds, Expert review of

medical devices, 8 (2011) 607-626.

[23] J.D. Ehrick, S.K. Deo, T.W. Browning, L.G. Bachas, M.J. Madou, S. Daunert, Genetically engineered

protein in hydrogels tailors stimuli-responsive characteristics, Nature materials, 4 (2005) 298-302.

[24] M.C. Lensen, M. Diez, V.A. Schulte, Cell Adhesion and Spreading on an Intrinsically Anti-Adhesive

PEG Biomaterial, INTECH Open Access Publisher (2011).

78

[25] F. Ullah, M.B.H. Othman, F. Javed, Z. Ahmad, H.M. Akil, Classification, processing and application of

hydrogels: A review, Materials Science and Engineering: C, 57 (2015) 414-433.

[26] J.M. Rosiak, F. Yoshii, Hydrogels and their medical applications, Nuclear Instruments and Methods in

Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms, 151 (1999) 56-64.

[27] N.A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations,

European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur

Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V, 50 (2000) 27-46.

[28] K.R. Kamath, K. Park, Biodegradable hydrogels in drug delivery, Advanced drug delivery reviews, 11

(1993) 59-84.

[29] M. Rizwan, R. Yahya, A. Hassan, M. Yar, A.D. Azzahari, V. Selvanathan, F. Sonsudin, C.N. Abouloula,

pH Sensitive Hydrogels in Drug Delivery: Brief History, Properties, Swelling, and Release Mechanism,

Material Selection and Applications, Polymers (Basel), 9 (2017).

[30] A.D. Drozdov, J. deClaville Christiansen, The effects of pH and ionic strength on equilibrium swelling of

polyampholyte gels, International Journal of Solids and Structures, 110-111 (2017) 192-208.

[31] L. Ferreira, M.M. Vidal, M.H. Gil, Evaluation of poly(2-hydroxyethyl methacrylate) gels as drug delivery

systems at different pH values, International Journal of Pharmaceutics, 194 (2000) 169-180.

[32] A.S. Hoffman, Stimuli-responsive polymers: Biomedical applications and challenges for clinical

translation, Advanced drug delivery reviews, 65 (2013) 10-16.

[33] N. Chirani, L. Yahia, L. Gritsch, F.L. Motta, S. Chirani, S. Fare, History and Applications of Hydrogels,

Journal of Biomedical Sciencies, 04 (2015).

[34] M.C. Koetting, J.T. Peters, S.D. Steichen, N.A. Peppas, Stimulus-responsive hydrogels: Theory, modern

advances, and applications, Materials science & engineering. R, Reports : a review journal, 93 (2015) 1-49.

[35] H. Khan, J.P. Chaudhary, R. Meena, Anionic carboxymethylagarose-based pH-responsive smart

superabsorbent hydrogels for controlled release of anticancer drug, International Journal of Biological

Macromolecules, 124 (2019) 1220-1229.

[36] L.A. Sharpe, A.M. Daily, S.D. Horava, N.A. Peppas, Therapeutic applications of hydrogels in oral drug

delivery, Expert opinion on drug delivery, 11 (2014) 901-915.

[37] T. T., K. J., pH-Responsive Hydrogels: Swelling Model, Biomaterials, (Eds.) Hasirci N., Hasirci V.,

Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 553, Springer, Boston, MA2004.

[38] G.R. Deen, X.J. Loh, Stimuli-Responsive Cationic Hydrogels in Drug Delivery Applications, Gels (Basel,

Switzerland), 4 (2018) 13.

[39] L.D. Blackman, P.A. Gunatillake, P. Cass, K.E.S. Locock, An introduction to zwitterionic polymer

behavior and applications in solution and at surfaces, Chemical Society Reviews, 48 (2019) 757-770.

[40] G.S. Georgiev, E.B. Kamenska, E.D. Vassileva, I.P. Kamenova, V.T. Georgieva, S.B. Iliev, I.A. Ivanov,

Self-Assembly, Antipolyelectrolyte Effect, and Nonbiofouling Properties of Polyzwitterions,

Biomacromolecules, 7 (2006) 1329-1334.

[41] S. Krishnan, C.J. Weinman, C.K. Ober, Advances in polymers for anti-biofouling surfaces, Journal of

Materials Chemistry, 18 (2008) 3405-3413.

[42] Y. Zhang, Y. Liu, B. Ren, D. Zhang, S. Xie, Y. Chang, J. Yang, J. Wu, L. Xu, J. Zheng, Fundamentals

and applications of zwitterionic antifouling polymers, Journal of Physics D: Applied Physics, 52 (2019)

403001.

[43] B.D. Ratner, S.J. Bryant, Biomaterials: Where We Have Been and Where We Are Going, Annual Review

of Biomedical Engineering, 6 (2004) 41-75.

[44] Y.M. Mohan, K.E. Geckeler, Polyampholytic hydrogels: Poly(N-isopropylacrylamide)-based stimuli-

responsive networks with poly(ethyleneimine), Reactive and Functional Polymers, 67 (2007) 144-155.

[45] I. Kamenova, M. Harrass, B. Lehmann, K. Friedrich, I. Ivanov, G. Georgiev, Swelling of the Zwitterionic

Copolymer Networks and Dehydration of their Hydrogels, Macromolecular Symposia, 254 (2007) 122-127.

[46] M. Gao, K. Gawel, B.T. Stokke, Polyelectrolyte and antipolyelectrolyte effects in swelling of

polyampholyte and polyzwitterionic charge balanced and charge offset hydrogels, European Polymer Journal,

53 (2014) 65-74.

[47] Y. Kim, S. Binauld, M.H. Stenzel, Zwitterionic Guanidine-Based Oligomers Mimicking Cell-Penetrating

Peptides as a Nontoxic Alternative to Cationic Polymers to Enhance the Cellular Uptake of Micelles,

Biomacromolecules, 13 (2012) 3418-3426.

[48] L. Chen, T. Chen, W. Fang, Y. Wen, S. Lin, J. Lin, C. Cai, Synthesis and pH-Responsive “Schizophrenic”

Aggregation of a Linear-Dendron-Like Polyampholyte Based on Oppositely Charged Polypeptides,

Biomacromolecules, 14 (2013) 4320-4330.

79

[49] D.M. Eckmann, R.J. Composto, A. Tsourkas, V.R. Muzykantov, Nanogel carrier design for targeted drug

delivery, Journal of Materials Chemistry B, 2 (2014) 8085-8097.

[50] H. Shen, T. Akagi, M. Akashi, Polyampholyte Nanoparticles Prepared by Self-Complexation of

Cationized Poly(γ-glutamic acid) for Protein Carriers, Macromolecular Bioscience, 12 (2012) 1100-1105.

[51] S. Ahmed, F. Hayashi, T. Nagashima, K. Matsumura, Protein cytoplasmic delivery using polyampholyte

nanoparticles and freeze concentration, Biomaterials, 35 (2014) 6508-6518.

[52] S. Srivastava, P. Panda, D. Vishwakarma, N. Verma, J. Nayak, Formulation and evaluation of herbal

tablets containing Agaricus bisporus powder, International Journal of Advances in Pharmaceutics, 6 (2017)

63-69.

[53] W.E. Hennink, C.F. van Nostrum, Novel crosslinking methods to design hydrogels, Advanced drug

delivery reviews, 54 (2002) 13-36.

[54] J. Maitra, V.K. Shukla, Cross-linking in Hydrogels - A Review, American Journal of Polymer Science, 4

(2014) 25-31.

[55] S. Sheth, E. Jain, A. Karadaghy, S. Syed, H. Stevenson, S.P. Zustiak, UV Dose Governs UV-Polymerized

Polyacrylamide Hydrogel Modulus, International Journal of Polymer Science, 2017 (2017) 1-9.

[56] J.M. Rosiak, P. Ulański, Synthesis of hydrogels by irradiation of polymers in aqueous solution, Radiation

Physics and Chemistry, 55 (1999) 139-151.

[57] A.D. Jenkins, P. Kratochvíl, R.F.T. Stepto, U.W. Suter, Glossary of basic terms in polymer science

(IUPAC Recommendations 1996), Pure and Applied Chemistry, 1996, pp. 2287.

[58] T. Ghosh, N. Karak, Tough interpenetrating polymer network of silicone containing polyurethane and

polystyrene with self-healing, shape memory and self-cleaning attributes, RSC Advances, 8 (2018) 17044-

17055.

[59] T. Miyata, N. Asami, K. Okawa, T. Uragami, Rapid response of a poly(acrylamide) hydrogel having a

semi-interpenetrating polymer network structure, Polymers for Advanced Technologies, 17 (2006) 794-797.

[60] X. Tong, F. Yang, Engineering interpenetrating network hydrogels as biomimetic cell niche with

independently tunable biochemical and mechanical properties, Biomaterials, 35 (2014) 1807-1815.

[61] Y. Guo, T. Yuan, Z. Xiao, P. Tang, Y. Xiao, Y. Fan, X. Zhang, Hydrogels of collagen/chondroitin

sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering, Journal of Materials

Science: Materials in Medicine, 23 (2012) 2267-2279.

[62] J. Wang, J. Li, One-pot Synthesis of IPN Hydrogels with Enhanced Mechanical Strength for Synergistic

Adsorption of Basic Dyes, Soft Materials, 13 (2015) 160-166.

[63] O. Gsib, J.-L. Duval, M. Goczkowski, M. Deneufchatel, O. Fichet, V. Larreta-Garde, S.A. Bencherif, C.

Egles, Evaluation of Fibrin-Based Interpenetrating Polymer Networks as Potential Biomaterials for Tissue

Engineering, Nanomaterials (Basel, Switzerland), 7 (2017) 436.

[64] L.L. Zheng, V. Vanchinathan, R. Dalal, J. Noolandi, D.J. Waters, L. Hartmann, J.R. Cochran, C.W. Frank,

C.Q. Yu, C.N. Ta, Biocompatibility of poly(ethylene glycol) and poly(acrylic acid) interpenetrating network

hydrogel by intrastromal implantation in rabbit cornea, Journal of biomedical materials research. Part A, 103

(2015) 3157-3165.

[65] D. Myung, D. Waters, M. Wiseman, P.-E. Duhamel, J. Noolandi, C.N. Ta, C.W. Frank, Progress in the

development of interpenetrating polymer network hydrogels, Polymers for Advanced Technologies, 19 (2008)

647-657.

[66] J.P. Gong, Why are double network hydrogels so tough?, Soft Matter, 6 (2010) 2583-2590.

[67] L.S. Moreira Teixeira, S. Bijl, V.V. Pully, C. Otto, R. Jin, J. Feijen, C.A. van Blitterswijk, P.J. Dijkstra,

M. Karperien, Self-attaching and cell-attracting in-situ forming dextran-tyramine conjugates hydrogels for

arthroscopic cartilage repair, Biomaterials, 33 (2012) 3164-3174.

[68] M. Guvendiren, H.D. Lu, J.A. Burdick, Shear-thinning hydrogels for biomedical applications, Soft Matter,

8 (2012) 260-272.

[69] C.B. Rodell, N.N. Dusaj, C.B. Highley, J.A. Burdick, Injectable and Cytocompatible Tough Double-

Network Hydrogels through Tandem Supramolecular and Covalent Crosslinking, Advanced Materials, 28

(2016) 8419-8424.

[70] P. Matricardi, C. Di Meo, T. Coviello, W.E. Hennink, F. Alhaique, Interpenetrating Polymer Networks

polysaccharide hydrogels for drug delivery and tissue engineering, Advanced drug delivery reviews, 65 (2013)

1172-1187.

[71] M.W. Tibbitt, K.S. Anseth, Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture, Biotechnology

and Bioengineering, 103 (2009) 655-663.

80

[72] A. Bracalello, V. Santopietro, M. Vassalli, G. Marletta, R. Del Gaudio, B. Bochicchio, A. Pepe, Design

and Production of a Chimeric Resilin-, Elastin-, and Collagen-Like Engineered Polypeptide,

Biomacromolecules, 12 (2011) 2957-2965.

[73] S.L. Vega, M.Y. Kwon, J.A. Burdick, Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering,

European cells & materials, 33 (2017) 59-75.

[74] M. Mehrali, A. Thakur, C.P. Pennisi, S. Talebian, A. Arpanaei, M. Nikkhah, A. Dolatshahi-Pirouz,

Nanoreinforced Hydrogels for Tissue Engineering: Biomaterials that are Compatible with Load-Bearing and

Electroactive Tissues, Advanced Materials, 29 (2017) 1603612.

[75] S. Nemir, J.L. West, Synthetic Materials in the Study of Cell Response to Substrate Rigidity, Annals of

Biomedical Engineering, 38 (2010) 2-20.

[76] Y. Gan, P. Li, L. Wang, X. Mo, L. Song, Y. Xu, C. Zhao, B. Ouyang, B. Tu, L. Luo, L. Zhu, S. Dong, F.

Li, Q. Zhou, An interpenetrating network-strengthened and toughened hydrogel that supports cell-based

nucleus pulposus regeneration, Biomaterials, 136 (2017) 12-28.

[77] D. Kai, M.P. Prabhakaran, B. Stahl, M. Eblenkamp, E. Wintermantel, S. Ramakrishna, Mechanical

properties and in vitro behavior of nanofiber-hydrogel composites for tissue engineering applications,

Nanotechnology, 23 (2012) 095705.

[78] D. Dyondi, T.J. Webster, R. Banerjee, A nanoparticulate injectable hydrogel as a tissue engineering

scaffold for multiple growth factor delivery for bone regeneration, International journal of nanomedicine, 8

(2013) 47-59.

[79] S.H. Kim, K.L. Kiick, Cell-mediated Delivery and Targeted Erosion of Vascular Endothelial Growth

Factor-Crosslinked Hydrogels, Macromolecular rapid communications, 31 (2010) 1231-1240.

[80] L.A.S. Callahan, A.M. Ganios, D.L. McBurney, M.F. Dilisio, S.D. Weiner, W.E. Horton, Jr., M.L. Becker,

ECM production of primary human and bovine chondrocytes in hybrid PEG hydrogels containing type I

collagen and hyaluronic acid, Biomacromolecules, 13 (2012) 1625-1631.

[81] R.M. Boehler, J.G. Graham, L.D. Shea, Tissue engineering tools for modulation of the immune response,

BioTechniques, 51 (2011) 239-passim.

[82] A. Schroeder, D.A. Heller, M.M. Winslow, J.E. Dahlman, G.W. Pratt, R. Langer, T. Jacks, D.G.

Anderson, Treating metastatic cancer with nanotechnology, Nature Reviews Cancer, 12 (2012) 39-50.

[83] J. Heo, R.H. Koh, W. Shim, H.D. Kim, H.-G. Yim, N.S. Hwang, Riboflavin-induced photo-crosslinking

of collagen hydrogel and its application in meniscus tissue engineering, Drug Delivery and Translational

Research, 6 (2016) 148-158.

[84] X. Zhao, Q. Lang, L. Yildirimer, Z.Y. Lin, W. Cui, N. Annabi, K.W. Ng, M.R. Dokmeci, A.M.

Ghaemmaghami, A. Khademhosseini, Photocrosslinkable Gelatin Hydrogel for Epidermal Tissue

Engineering, Advanced Healthcare Materials, 5 (2016) 108-118.

[85] D. Fan, U. Staufer, A. Accardo, Engineered 3D Polymer and Hydrogel Microenvironments for Cell

Culture Applications, Bioengineering (Basel, Switzerland), 6 (2019) 113.

[86] N. Annabi, J.W. Nichol, X. Zhong, C. Ji, S. Koshy, A. Khademhosseini, F. Dehghani, Controlling the

porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering, Tissue engineering. Part B, Reviews, 16

(2010) 371-383.

[87] V. Lozinsky, I. Galaev, F. Plieva, I. Savina, H. Jungvid, B. Mattiasson, Polymeric cryogels as promising

materials of biotechnological interest, Trends in biotechnology, 21 (2003) 445-451.

[88] T.M.A. Henderson, K. Ladewig, D.N. Haylock, K.M. McLean, A.J. O'Connor, Cryogels for biomedical

applications, Journal of Materials Chemistry B, 1 (2013) 2682-2695.

[89] V.I. Lozinsky, Cryogels on the basis of natural and synthetic polymers: preparation, properties and

application, Russian Chemical Reviews, 71 (2002) 489-511.

[90] F.M. Plieva, E. De Seta, I.Y. Galaev, B. Mattiasson, Macroporous elastic polyacrylamide monolith

columns: processing under compression and scale-up, Separation and Purification Technology, 65 (2009) 110-

116.

[91] T.K. Kim, J.J. Yoon, D.S. Lee, T.G. Park, Gas foamed open porous biodegradable polymeric

microspheres, Biomaterials, 27 (2006) 152-159.

[92] A. Barbetta, G. Rizzitelli, R. Bedini, R. Pecci, M. Dentini, Porous gelatin hydrogels by gas-in-liquid foam

templating, Soft Matter, 6 (2010) 1785-1792.

[93] L. Elowsson, H. Kirsebom, V. Carmignac, B. Mattiasson, M. Durbeej, Evaluation of macroporous blood

and plasma scaffolds for skeletal muscle tissue engineering, Biomaterials Science, 1 (2013) 402-410.

[94] M. Rezaeeyazdi, T. Colombani, A. Memic, S.A. Bencherif, Injectable Hyaluronic Acid-co-Gelatin

Cryogels for Tissue-Engineering Applications, Materials (Basel), 11 (2018) 1374.

81

[95] A. Memic, T. Colombani, L.J. Eggermont, M. Rezaeeyazdi, J. Steingold, Z.J. Rogers, K.J. Navare, H.S.

Mohammed, S.A. Bencherif, Latest Advances in Cryogel Technology for Biomedical Applications, Advanced

Therapeutics, 2 (2019) 1800114.

[96] A. Srivastava, A. Kumar, Thermoresponsive poly(N-vinylcaprolactam) cryogels: synthesis and its

biophysical evaluation for tissue engineering applications, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,

21 (2010) 2937-2945.

[97] J. Kumari, A. Kumar, Development of polymer based cryogel matrix for transportation and storage of

mammalian cells, Scientific Reports, 7 (2017) 41551.

[98] F.M. Plieva, I.N. Savina, S. Deraz, J. Andersson, I.Y. Galaev, B. Mattiasson, Characterization of

supermacroporous monolithic polyacrylamide based matrices designed for chromatography of bioparticles,

Journal of Chromatography B, 807 (2004) 129-137.

[99] E.S. Dragan, A.I. Cocarta, M. Gierszewska, Designing novel macroporous composite hydrogels based on

methacrylic acid copolymers and chitosan and in vitro assessment of lysozyme controlled delivery, Colloids

and Surfaces B: Biointerfaces, 139 (2016) 33-41.

[100] N. Bölgen, P. Korkusuz, İ. Vargel, E. Kılıç, E. Güzel, T. Çavuşoğlu, D. Uçkan, E. Pişkin, Stem cell

suspension injected HEMA-lactate-dextran cryogels for regeneration of critical sized bone defects, Artificial

Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 42 (2014) 70-77.

[101] Y. Liang, L. Li, R.A. Scott, K.L. Kiick, Polymeric Biomaterials: Diverse Functions Enabled by Advances

in Macromolecular Chemistry, Macromolecules, 50 (2017) 483-502.

[102] D. Lynn, D. Anderson, A. Akinc, R. Langer, Deagradable poly (β-amino ester)s for gene delivery,

Polymeric gene delivery, Ed. M. Amiji, 1st ed. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 2005.

[103] Y. Liu, Y. Li, D. Keskin, L. Shi, Poly(β-Amino Esters): Synthesis, Formulations, and Their Biomedical

Applications, Advanced Healthcare Materials, 8 (2019) 1801359.

[104] A. Akinc, D.M. Lynn, D.G. Anderson, R. Langer, Parallel Synthesis and Biophysical Characterization

of a Degradable Polymer Library for Gene Delivery, Journal of the American Chemical Society, 125 (2003)

5316-5323.

[105] A. Akinc, R. Langer, Measuring the pH environment of DNA delivered using nonviral vectors:

Implications for lysosomal trafficking, Biotechnology and Bioengineering, 78 (2002) 503-508.

[106] S.R. Little, D.M. Lynn, Q. Ge, D.G. Anderson, S.V. Puram, J. Chen, H.N. Eisen, R. Langer, Poly-beta

amino ester-containing microparticles enhance the activity of nonviral genetic vaccines, Proc Natl Acad Sci U

S A, 101 (2004) 9534-9539.

[107] D.M. Lynn, D.G. Anderson, D. Putnam, R. Langer, Accelerated Discovery of Synthetic Transfection

Vectors:  Parallel Synthesis and Screening of a Degradable Polymer Library, Journal of the American

Chemical Society, 123 (2001) 8155-8156.

[108] H. Gao, T. Cheng, J. Liu, J. Liu, C. Yang, L. Chu, Y. Zhang, R. Ma, L. Shi, Self-Regulated

Multifunctional Collaboration of Targeted Nanocarriers for Enhanced Tumor Therapy, Biomacromolecules,

15 (2014) 3634-3642.

[109] J. Kim, J.G. Shamul, S.R. Shah, A. Shin, B.J. Lee, A. Quinones-Hinojosa, J.J. Green, Verteporfin-

Loaded Poly(ethylene glycol)-Poly(beta-amino ester)-Poly(ethylene glycol) Triblock Micelles for Cancer

Therapy, Biomacromolecules, 19 (2018) 3361-3370.

[110] P.D. Fisher, P. Palomino, T.A. Milbrandt, J.Z. Hilt, D.A. Puleo, Improved small molecule drug release

from in situ forming poly(lactic-co-glycolic acid) scaffolds incorporating poly(β-amino ester) and

hydroxyapatite microparticles, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 25 (2014) 1174-1193.

[111] X.-j. Lu, X.-y. Yang, Y. Meng, S.-z. Li, Temperature and pH dually-responsive poly(β-amino ester)

nanoparticles for drug delivery, Chinese Journal of Polymer Science, 35 (2017) 534-546.

[112] D.M. Lynn, R. Langer, Degradable Poly(β-amino esters):  Synthesis, Characterization, and Self-

Assembly with Plasmid DNA, Journal of the American Chemical Society, 122 (2000) 10761-10768.

[113] B. Newland, P. Wolff, D. Zhou, W. Wang, H. Zhang, A. Rosser, W. Wang, C. Werner, Synthesis of

ROS scavenging microspheres from a dopamine containing poly(β-amino ester) for applications for

neurodegenerative disorders, Biomaterials Science, 4 (2016) 400-404.

[114] S. Liu, Z. Sun, D. Zhou, T. Guo, Alkylated branched poly(β-amino esters) demonstrate strong DNA

encapsulation, high nanoparticle stability and robust gene transfection efficacy, Journal of Materials Chemistry

B, 5 (2017) 5307-5310.

[115] D.G. Anderson, C.A. Tweedie, N. Hossain, S.M. Navarro, D.M. Brey, K.J. Van Vliet, R. Langer, J.A.

Burdick, A Combinatorial Library of Photocrosslinkable and Degradable Materials, Advanced Materials, 18

(2006) 2614-2618.

82

[116] C.G. Zamboni, K.L. Kozielski, H.J. Vaughan, M.M. Nakata, J. Kim, L.J. Higgins, M.G. Pomper, J.J.

Green, Polymeric nanoparticles as cancer-specific DNA delivery vectors to human hepatocellular carcinoma,

Journal of Controlled Release, 263 (2017) 18-28.

[117] N. Kamaly, B. Yameen, J. Wu, O.C. Farokhzad, Degradable Controlled-Release Polymers and

Polymeric Nanoparticles: Mechanisms of Controlling Drug Release, Chemical Reviews, 116 (2016) 2602-

2663.

[118] F.J. O'Brien, Biomaterials & scaffolds for tissue engineering, Materials Today, 14 (2011) 88-95.

[119] M. Prakasam, J. Locs, K. Salma-Ancane, D. Loca, A. Largeteau, L. Berzina-Cimdina, Biodegradable

Materials and Metallic Implants-A Review, Journal of functional biomaterials, 8 (2017) 44.

[120] S. Doppalapudi, S. Katiyar, A.J. Domb, W. Khan, Biodegradable Natural Polymers, in: F. Puoci (Ed.)

Advanced Polymers in Medicine, Springer International Publishing, Cham, 2015, pp. 33-66.

[121] K. Sevim, J. Pan, A model for hydrolytic degradation and erosion of biodegradable polymers, Acta

Biomaterialia, 66 (2018) 192-199.

[122] A. Göpferich, Mechanisms of polymer degradation and erosion, Biomaterials, 17 (1996) 103-114.

[123] S. Lyu, D. Untereker, Degradability of polymers for implantable biomedical devices, Int J Mol Sci, 10

(2009) 4033-4065.

[124] B. van Bochove, D.W. Grijpma, Photo-crosslinked synthetic biodegradable polymer networks for

biomedical applications, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 30 (2019) 77-106.

[125] P.A. Gunatillake, R. Adhikari, Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering, European cells

& materials, 5 (2003) 1-16; discussion 16.

[126] J.P.G. Urban, S. Smith, J.C.T. Fairbank, Nutrition of the Intervertebral Disc, Spine, 29 (2004) 2700-

2709.

[127] B.T. Ulery, R.A. Hicklin, J. Buscaglia, M.A. Roberts, Accuracy and reliability of forensic latent

fingerprint decisions, Proc Natl Acad Sci U S A, 108 (2011) 7733-7738.

[128] J.A. Sanz-Herrera, E. Reina-Romo, Cell-biomaterial mechanical interaction in the framework of tissue

engineering: insights, computational modeling and perspectives, Int J Mol Sci, 12 (2011) 8217-8244.

[129] C. Engineer, J. Parikh, A. Raval, Review on Hydrolytic Degradation Behavior of Biodegradable

Polymers from Controlled Drug Delivery System, Trends in Biomaterials and Artificial Organs, 25 (2011).

[130] D.F. Williams, On the mechanisms of biocompatibility, Biomaterials, 29 (2008) 2941-2953.

[131] B.D. Ratner, The Biocompatibility Manifesto: Biocompatibility for the Twenty-first Century, Journal of

Cardiovascular Translational Research, 4 (2011) 523-527.

[132] D.S. Kohane, R. Langer, Biocompatibility and drug delivery systems, Chemical Science, 1 (2010) 441-

446.

[133] M.T. Lam, J.C. Wu, Biomaterial applications in cardiovascular tissue repair and regeneration, Expert

review of cardiovascular therapy, 10 (2012) 1039-1049.

[134] E. Mariani, G. Lisignoli, R.M. Borzì, L. Pulsatelli, Biomaterials: Foreign Bodies or Tuners for the

Immune Response?, Int J Mol Sci, 20 (2019) 636.

[135] S. Naahidi, M. Jafari, M. Logan, Y. Wang, Y. Yuan, H. Bae, B. Dixon, P. Chen, Biocompatibility of

hydrogel-based scaffolds for tissue engineering applications, Biotechnology Advances, 35 (2017) 530-544.

[136] J. Anderson, S. Jiang, Implications of the Acute and Chronic Inflammatory Response and the Foreign

Body Reaction to the Immune Response of Implanted Biomaterials, in: B. Corradetti (Ed.), Switzerland:

Springer International Publishing AG 2017, pp. 15-36.

[137] W. Li, J. Zhou, Y. Xu, Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices, Biomedical reports,

3 (2015) 617-620.

[138] U. Müller, In vitro biocompatibility testing of biomaterials and medical devices, Medical device

technology, 19 (2008) 30, 32-34.

[139] C.P. Constantin, M. Aflori, R.F. Damian, R.D. Rusu, Biocompatibility of Polyimides: A Mini-Review,

Materials (Basel), 12 (2019) 3166.

[140] J. Xiao, Y. Zhang, J. Wang, W. Yu, W. Wang, X. Ma, Monitoring of Cell Viability and Proliferation in

Hydrogel-Encapsulated System by Resazurin Assay, Applied Biochemistry and Biotechnology, 162 (2010)

1996-2007.

[141] C. Hirsch, S. Schildknecht, In Vitro Research Reproducibility: Keeping Up High Standards, Frontiers in

Pharmacology, 10 (2019).

[142] B. Drasler, P. Sayre, K.G. Steinhäuser, A. Petri-Fink, B. Rothen-Rutishauser, In vitro approaches to

assess the hazard of nanomaterials, NanoImpact, 8 (2017) 99-116.

[143] H. Abdel-Baset, Do We have a Satisfactory Cell Viability Assay? Review of the Currently

Commercially-available Assays, Current Drug Discovery Technologies, 15 (2018) 1-20.

83

[144] J. Van Meerloo, G. Kaspers, J. Cloos, Cell sensitivity assays: The MTT assay, Methods in molecular

biology (Clifton, N.J.), 731 (2011) 237-245.

[145] D. Sladowski, S.J. Steer, R.H. Clothier, M. Balls, An improved MIT assay, Journal of Immunological

Methods, 157 (1993) 203-207.

[146] J.S. Liu, Z.J. Gartner, Directing the assembly of spatially organized multicomponent tissues from the

bottom up, Trends Cell Biol, 22 (2012) 683-691.

[147] M. Sharif-Alhoseini, M. Khormali, M. Rezaei, M. Safdarian, A. Hajighadery, M.M. Khalatbari, M.

Safdarian, S. Meknatkhah, M. Rezvan, M. Chalangari, P. Derakhshan, V. Rahimi-Movaghar, Animal models

of spinal cord injury: a systematic review, Spinal Cord, 55 (2017) 714-721.

[148] R.B.M. de Vries, K.E. Wever, M.T. Avey, M.L. Stephens, E.S. Sena, M. Leenaars, The usefulness of

systematic reviews of animal experiments for the design of preclinical and clinical studies, ILAR journal, 55

(2014) 427-437.

[149] P.A. Flecknell, Replacement, reduction and refinement, ALTEX, 19 (2002) 73-78.

[150] E. Törnqvist, A. Annas, B. Granath, E. Jalkesten, I. Cotgreave, M. Öberg, Strategic focus on 3R

principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing, PloS one, 9 (2014)

e101638-e101638.

[151] S.K. Doke, S.C. Dhawale, Alternatives to animal testing: A review, Saudi Pharmaceutical Journal, 23

(2015) 223-229.

[152] T.S.P. Rothenbücher, J. Ledin, D. Gibbs, H. Engqvist, C. Persson, G. Hulsart-Billström, Zebrafish

embryo as a replacement model for initial biocompatibility studies of biomaterials and drug delivery systems,

Acta Biomaterialia, 100 (2019) 235-243.

[153] K. Astell, D. Sieger, Zebrafish In Vivo Models of Cancer and Metastasis, Cold Spring Harbor

Perspectives in Medicine, (2019) a037077.

[154] S. Ferstl, B. Metscher, M. Müller, S. Allner, M. Dierolf, M. Busse, K. Achterhold, B. Gleich, F. Pfeiffer,

Laboratory-based X-ray NanoCT Explores Morphology of a Zebrafish Embryo, Microscopy and

Microanalysis, 24 (2018) 186-187.

[155] A.M. Vacaru, G. Unlu, M. Spitzner, M. Mione, E.W. Knapik, K.C. Sadler, In vivo cell biology in

zebrafish – providing insights into vertebrate development and disease, Journal of Cell Science, 127 (2014)

485.

[156] Y. Li, X. Yang, Z. Chen, B. Zhang, J. Pan, X. Li, F. Yang, D. Sun, Comparative toxicity of lead (Pb(2+)),

copper (Cu(2+)), and mixtures of lead and copper to zebrafish embryos on a microfluidic chip,

Biomicrofluidics, 9 (2015) 024105-024105.

[157] K.K. Jain, Drug delivery systems - an overview, Methods in Molecular Biology, 437 (2008) 1-50.

[158] K.E. Uhrich, S.M. Cannizzaro, R.S. Langer, K.M. Shakesheff, Polymeric systems for controlled drug

release, Chemical Reviews, 99 (1999) 3181-3198.

[159] E. Perez-Herrero, A. Fernandez-Medarde, Advanced targeted therapies in cancer: Drug nanocarriers, the

future of chemotherapy, European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of

Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V, 93 (2015) 52-79.

[160] C.M. Dawidczyk, C. Kim, J.H. Park, L.M. Russell, K.H. Lee, M.G. Pomper, P.C. Searson, State-of-the-

art in design rules for drug delivery platforms: lessons learned from FDA-approved nanomedicines, Journal of

Controlled Release, 187 (2014) 133-144.

[161] S. Maiti, K.K. Sen, Introductory Chapter: Drug Delivery Concepts, Advanced Technology for Delivering

Therapeutics, 2017.

[162] T.R. Hoare, D.S. Kohane, Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges, Polymer (Guildf), 49

(2008) 1993-2007.

[163] R. Narayanaswamy, V.P. Torchilin, Hydrogels and Their Applications in Targeted Drug Delivery,

Molecules, 24 (2019) 603.

[164] R.S. Langer, Drug Delivery and Targeting, Nature, (1998) 5-10.

[165] A. Prasannan, H.-C. Tsai, G.-H. Hsiue, Formulation and evaluation of epinephrine-loaded poly(acrylic

acid-co-N-isopropylacrylamide) gel for sustained ophthalmic drug delivery, Reactive and Functional

Polymers, 124 (2018) 40-47.

[166] S. Yu, X. Zhang, G. Tan, L. Tian, D. Liu, Y. Liu, X. Yang, W. Pan, A novel pH-induced thermosensitive

hydrogel composed of carboxymethyl chitosan and poloxamer cross-linked by glutaraldehyde for ophthalmic

drug delivery, Carbohydrate Polymers, 155 (2017) 208-217.

[167] Y. Yoo, S.-J. Yoon, S.Y. Kim, D.-W. Lee, S. Um, H. Hyun, S.O. Hong, D.H. Yang, A local drug delivery

system based on visible light-cured glycol chitosan and doxorubicin⋅hydrochloride for thyroid cancer treatment

in vitro and in vivo, Drug Delivery, 25 (2018) 1664-1671.

84

[168] O. Wichterle, D. Lim, Hydrophilic Gels for Biological Use, Nature, 185 (1960) 117-118.

[169] S. Srivastava, S. D. Gorham, J. M. Courtney, Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive film test,

Biomaterials, 11 (1990) 133-137.

[170] K.K. Sanford, W.R. Earle, G.D. Likely, The Growth in Vitro of Single Isolated Tissue Cells, JNCI:

Journal of the National Cancer Institute, 9 (1948) 229-246.

[171] W.F. Scherer, J.T. Syverton, G.O. Gey, STUDIES ON THE PROPAGATION IN VITRO OF

POLIOMYELITIS VIRUSES : IV. VIRAL MULTIPLICATION IN A STABLE STRAIN OF HUMAN

MALIGNANT EPITHELIAL CELLS (STRAIN HELA) DERIVED FROM AN EPIDERMOID

CARCINOMA OF THE CERVIX, Journal of Experimental Medicine, 97 (1953) 695-710.

[172] G. Chen, W. Tang, X. Wang, X. Zhao, C. Chen, Z. Zhu, Applications of Hydrogels with Special Physical

Properties in Biomedicine, Polymers (Basel), 11 (2019).

[173] S. Tang, C. Zhou, H. Zou, Progress in biomaterials, Journal of Jinan University(Natural Science), 21

(2000) 122-125.

[174] J. Hu, Y. Chen, Y. Li, Z. Zhou, Y. Cheng, A thermo-degradable hydrogel with light-tunable degradation

and drug release, Biomaterials, 112 (2017) 133-140.

[175] P. Mukhopadhyay, N. Eid, M.A. Abdelmegeed, A. Sen, - Interplay of Oxidative Stress, Inflammation,

and Autophagy: Their Role in Tissue Injury of the Heart, Liver, and Kidney, (2018).

[176] S. Freiberg, X.X. Zhu, Polymer microspheres for controlled drug release, International Journal of

Pharmaceutics, 282 (2004) 1-18.

[177] E. Caló, V.V. Khutoryanskiy, Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial

products, European Polymer Journal, 65 (2015) 252-267.

[178] N. Peppas, A. Lowman, Hydrogels, Encyclopedia of controlled drug delivery Wiley, New York, 1999.

[179] J. Jagur-Grodzinski, Polymeric gels and hydrogels for biomedical and pharmaceutical applications,

Polymers for Advanced Technologies, 21 (2010) 27-47.

[180] M.-M. Xu, R.-J. Liu, Q. Yan, Biological Stimuli-responsive Polymer Systems: Design, Construction and

Controlled Self-assembly, Chinese Journal of Polymer Science, 36 (2018) 347-365.

[181] V.P. Torchilin, Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery, Nature

Reviews Drug Discovery, 13 (2014) 813-827.

[182] J.A. Tamada, R. Langer, Erosion kinetics of hydrolytically degradable polymers, Proc Natl Acad Sci U

S A, 90 (1993) 552-556.

[183] A. Göpferich, R. Langer, Modeling of polymer erosion in three dimensions: Rotationally symmetric

devices, AIChE Journal, 41 (1995) 2292-2299.

[184] D. Rocha-García, A. Guerra-Contreras, S. Rosales-Mendoza, G. Palestino, Role of porous

silicon/hydrogel composites on drug delivery, Open Material Sciences, 2016.

[185] P. Costa, J.M. Sousa Lobo, Modeling and comparison of dissolution profiles, European Journal of

Pharmaceutical Sciences, 13 (2001) 123-133.

[186] W.I. Higuchi, Diffusional models useful in biopharmaceutics. Drug release rate processes, Journal of

Pharmaceutical Sciences, 56 (1967) 315-324.

[187] R.W. Korsmeyer, R. Gurny, E. Doelker, P. Buri, N.A. Peppas, Mechanisms of solute release from porous

hydrophilic polymers, International Journal of Pharmaceutics, 15 (1983) 25-35.

[188] N.A. Peppas, J.J. Sahlin, A simple equation for the description of solute release. III. Coupling of diffusion

and relaxation, International Journal of Pharmaceutics, 57 (1989) 169-172.

[189] R. Baker, H. Lonsdale, Controlled release: mechanisms and rates, Controlled release of biologically

active agents, Plenum, New York, 1974.

[190] C.T. Laurencin, Y. Khan, Regenerative Engineering, Science Translational Medicine, 4 (2012)

160ed169.

[191] K.A. Athanasiou, C.F. Zhu, D.R. Lanctot, C.M. Agrawal, X. Wang, Fundamentals of Biomechanics in

Tissue Engineering of Bone, Tissue Engineering, 6 (2000) 361-381.

[192] S. Pina, V.P. Ribeiro, C.F. Marques, F.R. Maia, T.H. Silva, R.L. Reis, J.M. Oliveira, Scaffolding

Strategies for Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications, Materials (Basel), 12 (2019) 1824.

[193] E.C. Gonzalez-Diaz, S. Varghese, Hydrogels as Extracellular Matrix Analogs, Gels, 2 (2016).

[194] C.D. Spicer, Hydrogel scaffolds for tissue engineering: the importance of polymer choice, Polymer

Chemistry, 11 (2020) 184-219.

[195] S. Musah, S.A. Morin, P.J. Wrighton, D.B. Zwick, S. Jin, L.L. Kiessling, Glycosaminoglycan-binding

hydrogels enable mechanical control of human pluripotent stem cell self-renewal, ACS Nano, 6 (2012) 10168-

10177.

[196] D.W. Hutmacher, Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage, Biomaterials, 21 (2000) 2529-2543.

85

[197] C.A. Erickson, Chapter 3 - Organization of Cells Into Higher Ordered Structures, in: R.P. Lanza, R.

Langer, J. Vacanti (Eds.) Principles of Tissue Engineering (Second Edition), Academic Press, San Diego,

2000, pp. 19-31.

[198] A.X. Sun, H. Lin, A.M. Beck, E.J. Kilroy, R.S. Tuan, Projection Stereolithographic Fabrication of

Human Adipose Stem Cell-Incorporated Biodegradable Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering, Front

Bioeng Biotechnol, 3 (2015) 115-115.

[199] N.J. Kaiser, R.J. Kant, A.J. Minor, K.L.K. Coulombe, Optimizing Blended Collagen-Fibrin Hydrogels

for Cardiac Tissue Engineering with Human iPSC-derived Cardiomyocytes, ACS Biomaterials Science &

Engineering, 5 (2019) 887-899.

[200] R.A. McBath, D.A. Shipp, Swelling and degradation of hydrogels synthesized with degradable poly(β-

amino ester) crosslinkers, Polymer Chemistry, 1 (2010) 860-865.

[201] T. Higuchi, Mechanism of sustained-action medication. Theoretical analysis of rate of release of solid

drugs dispersed in solid matrices, Journal of Pharmaceutical Sciences, 52 (1963) 1145-1149.

[202] M. Grassi, G. Grassi, Mathematical modelling and controlled drug delivery: matrix systems, Current

drug delivery, 2 (2005) 97-116.

[203] P.L. Ritger, N.A. Peppas, A simple equation for description of solute release II. Fickian and anomalous

release from swellable devices, Journal of Controlled Release, 5 (1987) 37-42.

[204] L. Serra, J. Doménech, N.A. Peppas, Drug transport mechanisms and release kinetics from molecularly

designed poly(acrylic acid-g-ethylene glycol) hydrogels, Biomaterials, 27 (2006) 5440-5451.

[205] K. Yamaoka, T. Nakagawa, T. Uno, Application of Akaike's information criterion (AIC) in the

evaluation of linear pharmacokinetic equations, Journal of pharmacokinetics and biopharmaceutics, 6 (1978)

165-175.

[206] M.B. Hansen, S.E. Nielsen, K. Berg, Re-examination and further development of a precise and rapid dye

method for measuring cell growth/cell kill, Journal of Immunological Methods, 119 (1989) 203-210.

[207] OECD, Test No. 236: Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test, 2013.

[208] G.J. Lieschke, P.D. Currie, Animal models of human disease: zebrafish swim into view, Nature Reviews

Genetics, 8 (2007) 353-367.

[209] Y.-b. Lim, C.-h. Kim, K. Kim, S.W. Kim, J.-s. Park, Development of a Safe Gene Delivery System

Using Biodegradable Polymer, Poly[α-(4-aminobutyl)-l-glycolic acid], Journal of the American Chemical

Society, 122 (2000) 6524-6525.

[210] M. Mackiewicz, J. Romanski, M. Karbarz, New ampholytic microgels based on N-isopropylacrylamide

and α-amino acid: changes in swelling behavior as a function of temperature, pH and divalent cation

concentration, RSC Advances, 4 (2014) 48905-48911.

[211] D.L. Safranski, M.A. Lesniewski, B.S. Caspersen, V.M. Uriarte, K. Gall, The effect of chemistry on the

polymerization, thermo-mechanical properties and degradation rate of poly(β-amino ester) networks, Polymer

(Guildf), 51 (2010) 3130-3138.

[212] K.C. Wood, J.Q. Boedicker, D.M. Lynn, P.T. Hammond, Tunable Drug Release from Hydrolytically

Degradable Layer-by-Layer Thin Films, Langmuir, 21 (2005) 1603-1609.

[213] M.A. Mariggiò, A. Cassano, A. Vinella, A. Vincenti, R. Fumarulo, L.L. Muzio, E. Maiorano, D. Ribatti,

G. Favia, Enhancement of Fibroblast Proliferation, Collagen Biosynthesis and Production of Growth Factors

as a Result of Combining Sodium Hyaluronate and Aminoacids, International Journal of Immunopathology

and Pharmacology, 22 (2009) 485-492.

[214] C.A. MacRae, R.T. Peterson, Zebrafish as tools for drug discovery, Nature Reviews Drug Discovery, 14

(2015) 721-731.

[215] B. Feldman, M. Tuchman, L. Caldovic, A zebrafish model of hyperammonemia, Molecular genetics and

metabolism, 113 (2014) 142-147.

[216] A.V. Fuentes, M.D. Pineda, K.C.N. Venkata, Comprehension of Top 200 Prescribed Drugs in the US as

a Resource for Pharmacy Teaching, Training and Practice, Pharmacy (Basel), 6 (2018).

[217] U. Gbureck, E. Vorndran, J.E. Barralet, Modeling vancomycin release kinetics from microporous

calcium phosphate ceramics comparing static and dynamic immersion conditions, Acta Biomaterialia, 4 (2008)

1480-1486.

[218] A.T.A.T. Florence, D. Attwood, Physicochemical principles of pharmacy, 4th ed ed., Pharmaceutical

Press2006.

[219] J. Siepmann, R.A. Siegel, M.J. Rathbone, Fundamentals and applications of controlled release drug

delivery, Springer US2012.

[220] P. Lokhande, S. Gite, D.M. Sakarkar, Dissolution Method Development For Gastro Retentive Controlled

Release Cephalaxin Tablet, International Research Journal of Pharmacy, 3 (2012) 247.

86

[221] P. Espeel, F. Goethals, F. Driessen, L.-T.T. Nguyen, F.E. Du Prez, One-pot, additive-free preparation of

functionalized polyurethanes via amine–thiol–ene conjugation, Polymer Chemistry, 4 (2013) 2449-2456.

[222] B. Gaihre, M.S. Khil, D.R. Lee, H.Y. Kim, Gelatin-coated magnetic iron oxide nanoparticles as carrier

system: Drug loading and in vitro drug release study, International Journal of Pharmaceutics, 365 (2009) 180-

189.

[223] D.G. Barrett, M.N. Yousaf, Design and applications of biodegradable polyester tissue scaffolds based

on endogenous monomers found in human metabolism, Molecules, 14 (2009) 4022-4050.

[224] H.J. Kim, U.-J. Kim, G. Vunjak-Novakovic, B.-H. Min, D.L. Kaplan, Influence of macroporous protein

scaffolds on bone tissue engineering from bone marrow stem cells, Biomaterials, 26 (2005) 4442-4452.

[225] M.R. Dias, J.M. Guedes, C.L. Flanagan, S.J. Hollister, P.R. Fernandes, Optimization of scaffold design

for bone tissue engineering: A computational and experimental study, Med Eng Phys, 36 (2014) 448-457.

[226] S. Cartmell, Controlled release scaffolds for bone tissue engineering, Journal of Pharmaceutical

Sciences, 98 (2009) 430-441.

[227] A.I. Van Den Bulcke, B. Bogdanov, N. De Rooze, E.H. Schacht, M. Cornelissen, H. Berghmans,

Structural and Rheological Properties of Methacrylamide Modified Gelatin Hydrogels, Biomacromolecules, 1

(2000) 31-38.

[228] M. Sadat-Shojai, M.-T. Khorasani, A. Jamshidi, 3-Dimensional cell-laden nano-hydroxyapatite/protein

hydrogels for bone regeneration applications, Materials Science and Engineering: C, 49 (2015) 835-843.

[229] E. Bressan, V. Favero, C. Gardin, L. Ferroni, L. Iacobellis, L. Favero, V. Vindigni, M. Berengo, S.

Sivolella, B. Zavan, Biopolymers for Hard and Soft Engineered Tissues: Application in Odontoiatric and

Plastic Surgery Field, Polymers, 3 (2011) 509-526.

87

Biografija autora

Vuk (Vojislav) Filipović, istraživač saradnik Naučne ustanove Instituta za hemiju, tehnologiju

i metalurgiju, Univerziteta u Beogradu, rođen je 08. jula 1987. godine u Beogradu. Osnovnu i srednju

školu završio je u Beogradu. Diplomirao je na Hemijskom fakultetu (smer – diplomirani hemičar)

Univerziteta u Beogradu, 2011. god. sa prosečnom ocenom 8.19/10.00 i ocenom 10/10 na završnom

radu. Master rad je odbranio na Hemijskom fakultetu, Univerziteta u Beogradu, 2012. god. sa

prosečnom ocenom 9.25/10 i ocenom 10/10 na master radu. U toku izrade završnog rada, kao i master

rada, Vuk Filipović pokazao je i opredeljenost ka naučno-istraživačkom radu i stručnim

usavršavanjima. Doktorske studije upisao je školske 2012/13. god. na Hemijskom fakultetu,

Univerziteta u Beogradu, na smeru Hemija. Кandidat je učestvovao u izvođenju nastave na

Hemijskom fakultetu Univerziteta u Beogradu iz predmeta Organska Hemija, školske 2012/2013 i

2013/2014. Od 1. maja 2014. godine zaposlen je u Naučnoj ustanovi IHTM, Univerziteta u Beogradu,

u Centru za ekologiju i tehnoekonomiku, na projektu ON 176018 „Geološka i ekotoksikološka

istraživanja u identifikaciji geopatogenih zona toksičnih elemenata u akumulacijama vode za piće –

istraživanje metoda i postupaka smanjivanja uticaja biogeohemijskih anomalija”, Ministarstva

prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije. Od septembra 2014.godine je u zvanju

istraživač saradnik. Takođe, kandidat je u periodu od septembra 2014. do septembra 2017. godine bio

angažovan kao istraživač na međunarodnom projektu “Intelligent scaffolds as a tool for advanced

tissue regeneration” (IZ73Z0_152327).

Кoautor je 4 naučna rada iz kategorije M21 jednog naučnog rada iz kategorije M23. Takođe

je autor više saopštenja na međunarodnim i domaćim naučnim skupovima.

Član je Srpskog hemijskog društva i član upravnog odbora Kluba mladih hemičara Srbije.

88

Изјава о ауторству

Потписанa Вук В. Филиповић

број индекса ДХ32/2012

Изјављујем

да је докторска дисертација под насловом

„ Синтеза и карактеризација хидрогелова на бази 2-хидроксиетил-метакрилата и

поли(β-аминоестара) за примену у медицини и фармацији”

• резултат сопственог истраживачког рада,

• да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за

добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских

установа,

• да су резултати коректно наведени и

• да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других

лица.

Потпис докторанда

У Београду, _________________

_________________________

89

Изјава o истоветности штампане и електронске верзије

докторског рада

Име и презиме аутора Вук В. Филиповић

Број индекса ДХ32/2012

Студијски програм Доктор хемијских наука

Наслов рада „Синтеза и карактеризација хидрогелова на бази 2-

хидроксиетил-метакрилата и поли(β-аминоестара) за примену у

медицини и фармацији”

Ментор Проф. др Душанка Милојковић-Опсеница, редовни професор

Хемијског факултета, Универзитета у Београду

Проф. др Симонида Томић, редовни професор Технолошко-

металуршког факултета, Универзитета у Београду

Потписан Вук В. Филиповић

Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју

сам предао/ла ради похрањена у Дигиталном репозиторијуму Универзитета у Београду.

Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског назива доктора

наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада.

Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у

електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду.

Потпис аутора

У Београду, ________________________

________________________

90

Изјава о коришћењу

Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум

Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом:

„Синтеза и карактеризација хидрогелова на бази 2-хидроксиетил-метакрилата и

поли(β-аминоестара) за примену у медицини и фармацији”

која је моје ауторско дело.

Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно

архивирање.

Моју докторску дисертацију похрањену у Дигиталном репозиторијуму Универзитета у

Београду и доступну у отвореном приступу могу да користе сви који поштују одредбе

садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се

одлучио/ла.

1. Ауторство (CC BY)

2. Ауторство – некомерцијално (CC BY-NC)

3. Ауторство – некомерцијално – без прерада (CC BY-NC-ND)

4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима (CC BY-NC-SA)

5. Ауторство – без прерада (CC BY-ND)

6. Ауторство – делити под истим условима (CC BY-SA)

(Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци.

Кратак опис лиценци је саставни део ове изјаве).

Потпис аутора

У Београду, ________________________

____________________

91

1. Ауторство. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и

прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак

и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци.

2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно

саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или

даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела.

3. Ауторство – некомерцијално – без прерада. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију

и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се

наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не

дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се

ограничава највећи обим права коришћења дела.

4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате

умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на

начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом

или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5.

Ауторство – без прерада. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела,

без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин

одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну

употребу дела.

6. Ауторство – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно

саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или

даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца

дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно

лиценцама отвореног кода.