Síntesis, caracterización y aluación microbiológica ev de compuestos Espiro -β-...

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    INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

    Escuela Superior de Medicina

    “Síntesis, caracterización y aluación microbiológica ev de compuestos Espiro -β- lactámicos”

    T E S I S

    QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

    MAESTRA EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN

    FARMACOLOGÍA

    P :R E S E N T A

    QQ..FF..BB.. IIoo SSt t eepphhaanniiee ZZaammuuddiioo VVeeggaa

    MÉXICO D.F. JUNIO DEL 2009

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    Proyecto dirigido por el Dr. José G. Trujillo Ferrara del laboratorio de

    bioquímica de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico

    Nacional, con el apoyo de los proyectos SIP‐20070652 y SIP‐20080433.

    La parte

    de

    síntesis

    química

    se

    llevó

    a cabo

    en

    el

    Laboratorio

    de

    Química

    Orgánica del Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología

    Avanzada. Unidad legaría del Instituto Politécnico Nacional, con apoyo de los

    proyectos SIP‐20080495 y SIP‐20090322; bajo la dirección de la Dra. Delia

    Quintana Zavala

    La parte

    microbiológica

    se

    llevó

    a cabo

    en

    el

    Laboratorio

    de

    Microbiología

    general del Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de

    Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección de la

    Dra. Ma. Lourdes Villa Tanaca

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    AGRADECIMIENTOS

    Al Dr. Trujillo por su confianza al darme este proyecto, por sus consejos, su apoyo a lo largo de la

    maestría y por ser una gran persona.

    A la Dra. Delia por que como investigadora su ética es inmensa, su amor y dedicación a su trabajo

    es loable y su temple ante cualquier adversidad es alabable. Como persona su grandeza habla por sí

    misma, y para quien no la conoce su apoyo, su confianza, su tiempo, su paciencia, y su guía me

    ayudaron a lo largo de la maestría; pero sobre todo su amistad fue y es muy valiosa.

    A la Dra, Ma. Lourdes Villa Tanaca por su apoyo, su tiempo y su guía a lo largo del desarrollo de

    este trabajo. Gracias a que me permitió trabajar a su lado, conocí varias personas maravillosas

    como: el Dr. César, Maru, Emma, Bere, Mariela, y todas aquellas personas que siempre me

    apoyaron, orientaron y me brindaron su amistad.

    Al Dra Eduardo Ramírez San Juan, porque me enseñó que la grandeza de una persona no está en

    cuanto sabe, sino en su manera de conducirse y su manera de comportarse. Gracias por sus

    enseñanzas, que no fueron fáciles pero fueron muy grandes y gratificantes. Me ayudó a motivarme

    para continuar en el camino de la investigación, aún cuando el camino a veces se ve casi imposible

    de cruzar.

    Al Dr. Correa por su apoyo en el desarrollo de este trabajo y por su paciencia a través de este

    mismo.

    A Maru por su tiempo, dedicación, amistad y sus enseñanzas que me permitieron concluir con este

    trabajo de manera exitosa.

    A mis amigos y más grandes hermanos Alberto Guevara y Olivier por su amistad, su tiempo, su

    guía, y por escucharme completamente. Pero sobre todo por aceptarme desde el primer momento

    como era y como soy, y permitirme entrar a sus vidas a través de la amistad. Su apoyo

    incondicional fue y es una de mis fortalezas que me ha permitido levantarme cuando más me sentía

    derrotada a nivel personal y profesional.

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    A mis amigos de la maestría Arianna, Iris, Carlos y Marvin por todos esos momentos de alegría, por

    haberme permitido conocerlos y por que dejaron una huella en mi corazón. Que nuestra amistad

    perdure mas allá de cualquier ideología, sendero tomado o incluso de nosotros mismos.

    A Félix por su amistad, su alegría y su apoyo en la Maestría. Y aunque empecé a conocerlo hace poco tiempo, encontré a una gran persona en él.

    A todas aquellas personas que me ayudaron a cerrar un ciclo más en mi vida.

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    DEDICATORIA

    Este trabajo lo dedico con todo mi corazón a mi esposo que desde antes de iniciar con este proyecto

    me ha brindado su apoyo incondicional a través de su amor, paciencia, cariño, comprensión y

    dedicación a nuestra relación. El tiempo no marca la grandeza de una relación, lo que la hace

    grande es la pureza con que se entrega el corazón y la convicción de que tal vez no haya un mañana

    pero si un ahora.

    A mi hija Isilien Ahtziri “luna-sol” que es mi mayor tesoro en la vida, con este trabajo te regalo un

    gran tesoro: el conocimiento del saber.

    A mi abuelita Chelito que siempre está conmigo. Hoy cierro otra etapa de mi vida y le doy gracias a

    Dios de que te sigue dando vida para compartirlo a tu lado.

    A mi abuelo Chavita que siempre está cuidando de mi familia, pero sobre todo que el mi ángel

    guardián.

    A mi madre porque una vez más cumplimos un sueño juntas. Tú que eres mi pilar y mi vida te

    dedico con todo mi corazón este trabajo.

    A Adolfo Morales “PP” por apoyarme en todo momento y formar parte de mi familia.

    A mi tía Luna “Myrna” porque siempre me acompaña en mi corazón y me guía para ser mejor cada

    día.

    A mi tío Juanito Vera porque gracias a él, estoy en el momento y lugar adecuado. A través de tu

    apoyo comprendí que cada quien decide cómo vivir tranquilo y en paz.

    A mi familia Zamudio por compartir esta etapa de mi vida a mi lado, pero sobre todo porque son

    parte de mi alma.

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    La crítica convertida en sistema es la negación del conocimiento

    y de la verdadera estimación de las cosas

    Henri Fréderic Amiel

    El carácter consiste ante todo en no dar importancia al ultraje

    o al abandono de quienes están con nosotros

    André Malraux

    http://www.pensamientos.com/autor.php?autor=239http://www.pensamientos.com/autor.php?autor=891http://www.pensamientos.com/autor.php?autor=891http://www.pensamientos.com/autor.php?autor=239

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    CONTENIDO

    CAPÍTULO PÁG.

    ÍndicesÍndice general iÍndice de tablas vÍndice de imágenes vi

    Abreviaturas viiiSummaryResumenMaleamidas sintetizadas

    ixxixiii

    Isomaleamidas sintetizadas xiv N -aril-espiro-β-lactamas sintetizadas xv

    I. INTRODUCCIÓN 1II. ANTECEDENTES 3

    II.1. Estructura bacterianaII.2. Clasificación de las bacteriasII.3. Pared Celular

    II.3.1. Biosíntesis del peptidoglicano

    II.3.2. Acción de los antibióticos sobre los procesos de síntesis de loscomponentes de la pared

    II.4. AntibióticosII.4.1. ConceptoII.4.2. HistoriaII.4.3. ClasificaciónII.4.4. Mecanismo de acción de los antibióticosII.4.5. Estructura química de los compuestosβ-lactámicos

    II.4.6. Mecanismos de acciónII.4.7. Descubrimiento y obtención de nuevos antibióticosII.4.8. Relación estructura-actividad (SAR)

    II.5. Resistencia bacterianaII.5.1. OrigenII.5.2. Introducción a la genética de la resistencia

    34610

    11121213141517

    192224252629

    i

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    II.5.2.1. Evolución verticalII.5.2.1. Evolución horizontal

    II.5.3. Mecanismos de resistenciaII.6. Enzimasβ -lactamasas

    II.6.1. β -lactamasas en bacterias Gram- y en bacterias Gram+II.6.2. Origen de lasβ -lactamasasII.6.3. Mecanismos de acciónII.6.4. Clasificación de lasβ -lactamasasII.6.5. Patogenicidad directa e indirecta de las bacterias productorasde lasβ -lactamasas

    II.7. Inhibidores de lasβ -lactamasasII.7.1. Estructura química y clasificación

    II.7.2. Mecanismo de acciónII.7.3. Resistencia

    II.8 Aspectos químicosII.8.1. Ácidos carboxílicos y sus derivados.II.8.2. AmidasII.8.3. Imidas cíclicasII.8.4. IsomaleimidasII.8.5.β-lactamas

    II.8.5.1. Métodos para la síntesis deβ -lactamasII.8.5.2. Síntesis asimétrica deβ -lactamas

    29303133

    35353838

    434546

    4750505152535455

    5659

    III. JUSTIFICACIÓN 62IV. HIPÓTESIS 63V. OBJETIVOS 64

    V.1. Objetivo generalV.2. Objetivos particulares

    6464

    VI. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 66

    VI.1. InstrumentaciónVI.2. Reactivos

    VI.2.1. QuímicosVI.2.2. Microbiológicos

    VI.3. SíntesisVI.3.1. Destilación del disolvente Tetrahidrofurano (THF)

    666767686868

    ii

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    VI.3.2. Destilación del disolvente Diclorometano (CH2Cl2)VI.3.3. Reacción No. 1. Síntesis de Vinil amidas para sustituídasVI.3.4. Reacción No. 2. Síntesis de Aril-isomaleimidas para sustituídasVI.3.5. Reacción No. 3. Síntesis de N -aril-espiro-β-lactamas

    VI.4. Optimización mediante cálculos teóricos de la N - p-F-fenil-espiro-β-lactama (3c)

    VI.5. Pruebas microbiológicasVI.5.1. Protocolo generalVI.5.2. Obtención y recuperación de cepas

    VI.5.2.1. Manejo y conservación de cepasVI.5.3. Evaluación de la producción deβ -lactamasas

    A) Fundamento de la prueba

    B) Procedimiento de la pruebaVI.5.4. Determinación de la actividad potencial antibiótica de lasespiro-β -lactamas: Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana

    A) Fundamento de la pruebaB) Procedimiento de la prueba

    VI.5.5. Pruebas de sinergismoA) Fundamento de la pruebaB) Procedimiento de la prueba

    68696970

    71727272737374

    76

    767676787879

    VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 80

    VII.1. Síntesis de las N -aril-espiro-β-lactamasasVII.1.1. Características de los ácidos p-X-fenilmaleámicos. (1a-1e)VII.1.2. Caracterización de las p-X-fenilisomaleimidas.(2a-2e)VII.1.3. Caracterización de las espiro- p-R-fenil-β-lactamas. (3a-3d)VII.1.4. Estudio de difracción de rayos X para la N - p-F-fenil-espiro-β-

    lactama 3cVII.2. Optimización geométricaVII.3. Pruebas Microbiológicas

    VII.3.1. Evaluación de la producción deβ-lactamasasVII.3.2. Evaluación de la actividad potencial antibiótica de las espiro-

    β-lactamasVII.3.3. Prueba de sinergismo

    80818486

    90919393

    9495

    iii

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    VIII. CONCLUSIONES 97IX. BIBLIOGRAFÍA 99X. ANEXOS 108

    X.1. Espectros 108

    X.2. Fotos 134

    iv

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    Índice de Tablas

    NO. DE TABLA PÁG.

    1 Antibióticos β-lactámicos frecuentemente empleados enclínica.

    18

    2 PBPs con actividad Transglucosidasa o Transpeptidasa. 213 Antibióticos obtenidos de forma natural. 234 Clasificación deβ-lactamasas por Bush, Kacoby y Madeiros. 405 Resultados de los compuestos sintetizados. 806 Identificación por espectroscopía de IR de los ácidos p-X-

    fenilmaleámicos.81

    7 Desplazamientos químicos (ppm) RMN de1

    H y13

    C para losácidos p-X-fenilmaleámicos en DMSO d 6 (270 MHz).

    82

    8 Identificación por espectroscopía de IR de las p-X-fenilisomaleimidas.

    85

    9 Identificación por espectroscopía de IR de las espiro- p-R-fenil-β-lactamas.

    87

    10 Desplazamientos químicos (ppm) RMN de1H para las p-X-fenilisomaleimidas y espiro- p-R-fenil-β-lactamas .

    87

    11 Desplazamientos químicos (ppm) RMN de13

    H para las p-X-fenilisomaleimidas y espiro- p-R-fenil-β-lactamas .

    88

    12 Ángulos diedros de la p-espiro-F-β-lactama.Grados [°]

    91

    13 Distancias de enlaces de la p-espiro-F-β-lactama. (3c)Amstrongs[Å]

    92

    14 Prueba Cefinasa: identificación de microorganismosproductores deβ-lactamasa.

    93

    15 Criterios establecidos por la CLSI para las pruebas desusceptibilidad en medio líquido. 94

    16 Comparación de los desplazamientos químicos de las N - p-espiro-β-lactamas en diferentes solventes.

    96

    v

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    Índice de Figuras

    NO. DEFIGURA PÁG.

    1 Estructura bacteriana. 32 Clasificación de las bacterias de acuerdo a la tinción Gram. 43 Diferencias estructurales entre las bacterias Gram+ y Gram-. 64 Representación del esqueleto de la pared celular bacteriana;

    constituída por el peptidoglicano mureína.7

    5 Aminoácidos característicos que conforman la estructura básica dela pared celular.

    8

    6 Diferencia en las conexiones entre las unidades peptídicas y las deglicano durante la formación de la lámina de peptidoglicano, de lasbacterias: a) Gram- y b) Gram+.

    9

    7 Estructura de los ácidos teicoicos de la pared celular. 108 Proceso general de la biosíntesis del peptidoglicano. 11

    9Semejanza estructural entre los compuestosβ lactámicos y la D-alanil-D-alanina terminal.

    12

    10 Modos de acción de los agentes antimicrobianos. 1511 Estructura de lasβ-lactamas (2-azetidinonas). 1712 Estructura de los núcleos de los antibióticosβ-lactámicos. 1813 Reacción enzimática de las serin proteasas con diversos sustratos. 2014 Descubrimiento y desarrollo de nuevos antibióticos. 2215 Estructura química del Lorabid. 2416 Estructura química del Tribactam. 2517 Estructura química del a) inhibidor de la proteasa de

    citomegalovirus humano y del b) inhibidor de absorción delcolesterol.

    25

    18 Ciclo de adquisición de genes de resistencia por la bacteria, enrespuesta a la presión selectiva debido al uso de los antibióticos.

    28

    19 Mecanismos de transferencia genética, de la resistencia bacteriana.a) Conjugación, b) Transducción, y c) Transformación.

    31

    20 Diversos mecanismos de resistencia bacteriana. 32

    vi

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    21 Enzimas que pueden actuar sobre los antibióticosβ-lactámicos. 3422 Interacciones claves en el sitio de unión de las serín-β -lactamasas de

    clase A.36

    23 Alineamiento entre: a) laβ-lactamasa de clase A, b) laβ-lactamasa

    de clase C, c) la Transpeptidasa (PBP2).37

    24 Diagrama que muestra la posible unión entre a) el péptido L-Lys-D-Ala-D-Ala con la transpeptidasa y b) el antibiótico penicilina conuna β-lactamasa de clase A.

    37

    25 Inhibidoresβ-lactámicos, más usados en el área clínica. 4626 Blancos enzimáticos de lasβ-lactamas: a) Actividad de la penicilina

    sobre las transpeptidasas, b) hidrólisis de la penicilina por lasSerin-β-lactamasas, e c) inhibición de las Serin-β-lactamasas por el

    ácido clavulánico.

    48

    27 Mecanismos de inhibición de lasβ-lactamasas de clase A por elÁcido clavulánico.

    49

    28 Mecanismos de inhibición de lasβ-lactamasas de clase A por elsulbactam.

    49

    29 Estructura química de a) ácido acético, b) prostaglandina y c) ácidoacetilsalicílico.

    51

    30 Estructura química de los derivados de ácido carboxílico. 52

    31 Deslocalización electrónica de la formamida. 5232 Obtención de una isomaleimida. 5433 Mecanismos de formación de una isomaleimida. 5534 Antibióticosβ-lactámicos. 5635 Métodos para la formación del anilloβ-lactámico. 5736 Mecanismo alterno de cicloadición. 5837 Reactividad del núcleo 2-azetidinona. 6038 Fragmentación de la N - p-F-fenil-espiro-β-lactama por EM. 89

    39 Fragmentación de la espiro- p-Cl-fenil-β-lactama por EM. 90

    vii

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    viii

    ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

    (NCCl)3 Cloruro cianúrico° Ángulo dihedro6-APA 6 aminopenicilánicoADN Ácido desoxirribonucleicoAla AlaninaAMP AmpicilinaAMX AmoxicilinaARN Ácido ribonucleicoATCC ( American Type Culture Collection).Colección americana de cultivos celularesATP Adenosín trifosfatoBLEE´sβ-lactamasas de espectro extendidoc.c.f.cromatografía en capa finaCAZ CeftazidimaCDCl3 Cloroformo deuteradoCI50 Concentración inhibidora 50CLSI Clinical and Laboratory Standards

    InstituteCMI Concentración mínima inhibidoraCOOEt Benzoato de etiloCP Clavulanato de potasioCTX CefotaximaDAP Ácido meso-diaminopimélicoDCC DiciclohexilcarbodimidaDCU Diciclohexilurea

    DMSO-D6 Dimetil sulfóxido deuteradoEDTA Ácido etilendiaminotetraacéticoEM Espectro de masas ESMIS Espectrometría de masas deionización por electrospray

    FEUM Farmacopea de los Estados UnidosMexicanosGlcNAc N-acetilglucosaminaGly GlicinaGram- Bacterias Gram negativasGtam+ Bacterias Gram positivasHF Hartree-FockI.P.N. Instituto Politécnico NacionalIR Espectroscopia de Infrarrojo

    kcat Constante de CatálisisK M Constante de Michaelis MentenLys LisinaMHA Mueller Hinton AgarMHB Mueller Hinton BrothMurNAc N-acetilmuramatoNEt3 TrietilaminaOMe O-metilo

    OXA Oxacilinap.f. Punto de fusiónPADAC piridina 2-azo-p-dimetil-alininacromóforoPBP´sProteínas de unión a penicilinapCMB p-cloromercuribenzoatoRMN 13C Resonancia magnética nuclear decarbono 13

    RMN 1H Resonancia magnética nuclear de protónTEM TemoeiraTHF TetrahidrofuranoUDP Uridina difosfatoUV-VIS Ultravioleta-visible

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    SUMMARYFrom the coming of penicillin, and its primary biological target; the penicillin binding protein(PBP´s) anchored in the cellular membrane bacterial and ordered of the final step of the biosynthesis of the cellular wall, It determine the way of action of these drugs. Nevertheless theindiscriminate use of suchβ-lactams antibiotics as penicillins and cephalosporines has been in theincrease of the number of resistant bacterial strains to the present quimioterapeutic by the production ofβ-lactamases. Like a strategy to this mechanism of resistance of the bacteria, to newmolecules with activity on PBP´s and/orβ-lactamases have been developed. A proposal in this workis the synthesis of N -aryl-β-lactams, for which the reaction of Staudinguer was used, and consists ofa cycle reaction addition [2+2] between a ketene and imine.The synthesis of four N -aryl-β-lactams sustituited (3a-3d) was taken by the addition of the ketene(2-Cloroetenone) generatedin situ, to the corresponding ones isomaleimides to -78ºC and undernitrogen atmosphere, with greater yields of 60% after its purification. All the compounds obtainedin the synthesis of these N -aryl-β-lactams were characterized by Infrared Spectroscopy (IR), Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of proton and carbon thirteen (RMN1H and 13C), aswell as, Mass Spectrometry (GC-MS). Additionally the structure of these compounds wascorroborated by mean of a study of x-rays diffraction of N - aril-β-lactam3c, being observed anadjustment almost coplanar between theβ-lactam ring and the aromatic ring of -51.8°. For theoptimization of the geometry of the compound3c Spartan Pro ´06 V102 program at level of HF/6-31G was used and the most stable conformer with the structure obtained by x-rays diffraction wascompared, being very similar.To the strains used in this work, the production of theβ-lactamase enzyme was determined by thecefinace test. Following the standards of the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) thetests of antimicrobial susceptibility in microplates were developed as much as in agar, using asantibiotic of reference to the ampicilline within the concentration interval from 0,5 to 256 µg/mL,determined that the minimal inhibitory concentration (MIC) was of 4µg/mL for the bacteria E.coli ATCC 35198 and E.coli ATCC 25922, and of 32µg/mL for the bacteriumK. pneumoniae ATCC700603, which corroborated that indeed both strains of E.coli are sensible to the ampicilline and thestrain of K. pneumoniae is resistant. In the sinergism study the reference combinations usedcefotaxime /acid clavulanic and ceftazidime/acid clavulanic (30/10µg); being observed thatK.

    pneumoniae (producing ofβ-lactamase) it was sensitized with this combination.

    ix

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    Under that conditions previously described were evaluated the four compound N -aryl-β-lactamicssynthesized, obtaining that no of them showed activity neither as inhibitors of the PBP´s (antibioticactivity), nor as inhibitors ofβ-lactamases.

    x

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    RESUMENCon el descubrimiento de la penicilina, y su blanco biológico primario; la proteína de unión a penicilina (PBP´s) anclada en la membrana celular bacteriana y encargada del paso final de la biosíntesis de la pared celular, se determino el modo de acción de estos fármacos. Sin embargo eluso indiscriminado de tales antibióticosβ-lactámicos como penicilinas y cefalosporinas ha resultadoen el incremento del número de cepas bacterianas resistentes a la quimioterapéutica actual por la producción deβ-lactamasas. Como una estrategia a este mecanismo de resistencia de las bacterias,se han desarrollado nuevas moléculas con actividad sobre PBP´s y/oβ-lactamasas. Una propuestaen este trabajo es la síntesis de espiroβ-lactamas, para lo cual se utilizó la reacción de Staudinguerque consiste en una reacción de ciclo adición [2+2] entre una cetena y una imina.La síntesis de cuatro N -aril-espiro-β-lactamas sustituidas (3a-3d) se llevó a cabo mediante laadición de la cetena (2-Cloroetenona) generadain situ, a las correspondientes isomaleimidas a -78ºC y bajo atmósfera de nitrógeno, con rendimientos mayores del 60% después de su purificación.Todos los compuestos obtenidos en la síntesis de estas espiro-β-lactamas se caracterizaron porespectroscopía de Infrarrojo (IR), espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protón ycarbono trece (RMN1H y 13C), así como, espectrometría de masas (GC-MS). Adicionalmente secorroboró la estructura de estos compuestos mediante un estudio de difracción de rayos X de la N -aril-espiro-β-lactama3c, observándose un arreglo casi coplanar entre el anilloβ-lactámico y elanillo aromático de-51.80°. Para la optimización de la geometría del compuesto3c se utilizó el programa Spartan Pro ´06 V102 a nivel de HF/6-31G y se comparó el confórmero más estable conla estructura obtenida por difracción de rayos X, siendo muy semejantes.

    A las cepas utilizadas en este trabajo, se les determinó la producción de la enzimaβ-lactamasa, através, de la prueba de cefinace. Siguiendo los lineamientos de la CLSI (Clinical and LaboratoryStandards Institute) se desarrollaron las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana tanto enmicroplacas como en agar, usando como antibiótico de referencia a la ampicilina dentro delintervalo de concentración de 0,5-256 µg/mL, se determinó que la concentración mínima inhibitoria(CMI) fué de 4µg/mL para las bacterias E.coli ATCC 35198 y E.coli 25922, y de 32µg/mL para la bacteriaK. pneumoniae 700603, lo que corroboró que efectivamente ambas cepas de E.coli sonsensibles a la ampicilina y la cepa deK. pneumoniae es resistente. En el estudio de sinergismo seutilizó de referencia la combinación de cefotaxima/ácido clavulánico y ceftazidima/ácido

    xi

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    clavulánico (30/10µg); observándose queK. pneumoniae (productora deβ-lactamasa) se sensibilizócon esta combinación.

    Bajo las condicione descritas anteriormente se evaluaron los cuatro compuestos N -aril-espiro-β-

    lactámicos sintetizados, obteniéndose que ninguno de ellos mostró actividad ni como inhibidores delas PBP´s (actividad antibiótica), ni como inhibidores de lasβ-lactamasas.

    xii

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    Maleamidas sintetizadas

    NHO

    O

    OH

    O

    NHO

    O

    OH

    F

    NHO

    O

    OH

    Cl

    NHO

    O

    OH

    NO 2

    NHO

    O

    OH

    p -OMe-fenilmaleamida

    (1a)

    Fenilmaleamida

    (1b)

    p -F-fenilmaleamida(1c)

    p -Cl-fenilmaleamida(1d)

    p -NO 2-fenilmaleamida(1e)

    xiii

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    Isomaleimidas sintetizadas

    N

    F

    O

    O

    p -OMe-fenilisomaleimida

    (2a)

    N O

    O

    O

    N O

    O

    N

    Cl

    O

    O

    N

    NO 2

    O

    O

    Fenilisomaleimida

    (2b)

    p -F-fenilisomaleimida(2c)

    p -Cl-fenilisomaleimida(2d)

    p -NO 2-fenilisomaleimida(2e)

    xiv

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    N‐aril‐espiro‐β ‐lactamas sintetizadas

    espiro- p -OMe-fenil- -lactama(3a)

    espiro-fenil- -lactama(3b)

    O

    N

    H

    OO

    ClO

    N

    O

    H

    O

    ClO

    F

    N

    O

    H

    OCl

    O

    Cl

    N

    O

    H

    OCl

    O

    espiro- p -F-fenil- -lactama(3c)

    espiro- p -Cl-fenil- -lactama(3d)

    xv

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    INTRODUCCIÓNEn la segunda mitad del siglo pasado se creía que las enfermedades infecciosas habían dejado de ser la

    principal causa global de mortalidad en los países desarrollados; sin embargo, durante los últimostreinta años surgieron una serie de hechos que no permitieron seguir manteniendo la ideología de una‘batalla definitiva” contra las bacterias: algunas infecciones extra hospitalarias no sólo han aumentado,sino que han sufrido una auténtica metamorfosis que las hace más variadas y de diagnóstico másdifícil, ciertas infecciones nosocomiales, producidas por auténticos “acorazados microbianos”, estánen aumento y la aparición incesante de cepas resistentes, como consecuencia del uso masivo eindiscriminado de los antibióticos, ha adquirido ya proporciones alarmantes en muchos casos.

    Durante los últimos la búsqueda y desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos ha ido en aumento; locual se refleja en las largas listas de nuevas penicilinas, cefalosporinas y quinolonas, que no estabandisponibles en 1965. Esto se debe a la gran cantidad de investigaciones y descubrimientos en lasdiferentes áreas tanto de la química como de la medicina. Una revisión detallada, sugiere que eldesarrollo de las diferentes clases estructurales de los antibióticos es cercanamente interdependiente.Por ejemplo, los avances en el estudio de la química de la penicilina impulsaron el rápido desarrollo delas cefalosporinas y otrasβ-lactamas; así mismo, los avances en la comprensión de la fisiología

    bacteriana han permitido establecer una relación estructura-actividad (SAR ∗), usada para controlar las

    modificaciones químicas de los antibióticos con el propósito de mejorar su actividad antimicrobiana, yasí combatir a las bacterias que han adquirido resistencia a los antimicrobianos anteriores.

    El proceso de desarrollo de nuevos antibióticos involucra estudios exhaustivos que permitencaracterizar su mecanismo de acción y garantizar su seguridad y eficacia tanto en animales como enhumanos. Este proceso puede llevar hasta 8 años para llegar a su etapa final y representar una graninversión (hablando de remuneración económica), principalmente para la industria farmacéutica. Dadala inversión y el recurrente ambiente competitivo; en el cual, cada vez son más los agentesantimicrobianos en el mercado, es conveniente encontrar nuevos compuestos que demuestren ventajassobre las terapias antimicrobianas1 ya existentes. Por otro lado, la urgencia de encontrar nuevoscompuestos nace de la necesidad de erradicar aquellas enfermedades infecciosas causadas por agentes patógenos resistentes a la terapia antimicrobiana preexistente y que causan estragos tanto a nivel socialcomo económico.

    ∗ Del Inglés Structure-activity relationships

    1

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    Este trabajo tiene relación con la industria farmacéutica especificamente en el área de laquimioterapéutica bacteriana, y con el objetivo de aportar conocimiento en este campo, se propone lasíntesis de dos nuevos compuestos spiro-β-lactámicos y dos previamente reportados, así como realizar

    su evaluación microbiológica. Para ello, se debe estudiar la estructura y clasificación de las bacterias,su participación en los procesos patogénicos de las enfermedades infecciosas y los mecanismos y procesos evolutivos por los cuales ha logrado sobrevivir a los agentes antimicrobianos; así mismo, sedebe conocer las estructuras químicas que conforman a la familia de lasβ-lactamas, su actividad comoantibióticos o inhibidores de lasβ-lactamasas, y sus moléculas dianas que permiten establecer larelación estructura-actividad, y que favorecerán el desarrollo de nuevas moléculas.

    2

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    I. ANTECEDENTES

    II.1. Estructura Bacteriana.

    Las bacterias son células procarióticas, por lo que carecen de orgánulos especializadoscomo: el núcleo,mitocondrias, cloroplastos, entre otros. Las células microbianas generalmente son muy pequeñas, presentan tamaños que van desde 0,1 a 0,2μm de ancho a más de 50μm de largo. Por otro lado,mantienen una estructura superficial compleja que consta de: cilios o flagelos, membranacitoplasmática, cápsula, y pared celular.Véase Figura 1, cada componente lleva a cabo funcionesvitales definidas:

    Figura 1. Estructura bacteriana3.

    a. La cápsula es una capa gelatinomucosa de tamaño variable, con una composición de polisacáridos o proteínas que rodean a la bacteria. Y juega un papel importante en las bacterias patógenas.

    b. Los cilios, o flagelos, no existen más que en ciertas especies, y son órganos de locomoción,filamentosos y de longitud variable. Según las especies, pueden estar implantados en uno o enlos dos polos de la bacteria o en todo su entorno. Constituyen el soporte de los antígenos "H".

    En algunos bacilos gramnegativos se encuentran pili , que son apéndices más pequeños que loscilios y que tienen un papel fundamental engenética bacteriana.

    c. La membrana citoplasmática, situada debajo de la pared, tiene permeabilidad selectiva frentea las sustancias que entran y salen de la bacteria. Es soporte de numerosasenzimas, en particular las respiratorias.

    3

    http://www.monografias.com/trabajos5/recicla/recicla.shtml#papelhttp://www.monografias.com/trabajos5/recicla/recicla.shtml#papelhttp://www.monografias.com/trabajos/genetica/genetica.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos5/enzimo/enzimo.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos5/enzimo/enzimo.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos/genetica/genetica.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos5/recicla/recicla.shtml#papelhttp://www.monografias.com/trabajos5/recicla/recicla.shtml#papel

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    d. La pared es la responsable de la forma, rigidez y de la resistencia a la presión del medio querodea a la bacteria. Su originalidad reside en lanaturaleza química del compuestomacromolecular que le confiere su rigidez, este mucopéptido, está formado por cadenas deacetilglucosamina y de ácido murámico sobre las que se fijan tetrapéptidos de composición

    variable. Las cadenas están unidas por puentes peptídicos.

    Además de la pared, las bacterias dependen de las características taxonómicas como su morfología,sus propiedades antígenas específicas en que se basa su clasificación, su composición química y lasinteracciones entre los microorganismos patógenos y su hospedante2a.

    II.2. Clasificación de las Bacterias.

    Las paredes celulares de las bacterias permiten resistir a la presión de turgencia; consecuencia de laconcentración de solutos disueltos dentro de la célula, además son las responsables de la formay rigidez de la célula. Las diferencias que existen en la estructura de las paredes celulares, permite distinguir a las bacterias en Gram positivas (Gram+) o Gram negativas (Gram-)

    mediante una tinción diferencial denominadatinción de Gram ∗ . Véase Figura 2

    Figura 2. Clasificación de las bacterias de acuerdo a la tinción Gram2b.

    En dicha tinción se forma dentro de las células un complejo cristal insoluble violeta-yodo que en elcaso de las Gram- puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram+. El alcohol deshidrata las bacterias Gram+ que poseen una pared celular muy grues con varias capas de peptidoglicano. Esto

    ∗ Técnica desarrollada por el bacteriólogo Christian Gram en 1884.

    4

    http://www.monografias.com/trabajos7/filo/filo.shtmlhttp://www.monografias.com/Quimica/index.shtmlhttp://www.monografias.com/Quimica/index.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos7/filo/filo.shtml

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    provoca el cierre de los poros de la pared impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las bacterias Gram-, el alcohol penetra rápidamente en la capa externa que es rica en lípidos y la fina capade peptidoglicano no impide el paso del disolvente, por lo que el complejo se extrae fácilmente.

    La clasificación de estos dos grupos de bacterias se debe a la complejidad de las estructuras de las bacterias Gram-, que presentan tres capas principales: a)La membrana citoplasmática, que rodea elcitoplasma de la célula y contiene proteínas y fosfolípidos. La membrana citoplasmática sirve comouna barrera de permeabilidad selectiva para las substancias que entran o salen de la célula, también seconsidera el sitio donde se produce la energía de la célula. Dentro del citoplasma celular también seencuentran los cromosomas, ribosomas y otras estructuras internas, b)El peptidoglicano, es un polímero relativamente delgado que consiste de ácido N-acetil murámico y N-acetil glucosaminaentrelazados; esta se conoce con frecuencia como la capa de mureína o pared celular, y es responsable

    de mantener la forma del organismo, y está localizada dentro del espacio periplásmico. El espacio periplásmico, localizado entre la membrana externa y la membrana citoplasmática contiene proteínas periplásmaticas que incluyen: proteínas de enlace para sustratos específicos, enzimas hidrolíticas yenzimas detoxificantes, y c)La capa externa o capa L (Lipopolisacárido), representa una segunda bicapa lipídica; sin embargo, hay que destacar que no consta solamente de fosfolípidos como lamembrana citoplasmática, sino que contiene polisacáridos y proteínas, lo que justifica su nombre.También sirve como una barrera de permeabilidad de la célula, ya que ayuda a retener proteínas en elespacio periplasmático. Contiene proteínas embebidas, llamadas porinas, estos canales llenos de agua

    facilitan el transporte de nutrientes y sustancias de bajo peso molecular dentro de la célula, incluyendoagentes antimicrobianos. Las bacterias varían en el número y tipo de porinas que contienen2c. Los polisacáridos; localizados en la superficie de la célula, son los componentes esenciales de lasendotoxinas (Estos contribuyen a la capacidad de la bacteria para causar enfermedad), y son la causade la carga neta de las bacterias Gram-. Las familias representativas de este grupo de bacterias son:

    Enterobacteriaceae , No Enterobacteriaceae , Haemophilus spp , Neisseria/Moraxella y Anaerobios

    Por otro lado, las bacterias Gram+ son menos complejas debido a que únicamente contienen dos

    capas: la membrana citoplasmática y la capa de peptidoglicano. La membrana citoplasmática, elcitoplasma, y otros componentes internos son similares tanto en bacterias Gram+ como en bacteriasGram-. Sin embargo, la capa de péptidoglicano o capa de mureína es mucho más gruesa que la de las bacterias Gram-, y es la responsable de mantener la forma del organismo; por lo que se conoce como la pared celular. Dentro de la capa de mureína se encuentran los ácidos teicoicos, que son polímeros queestán entrelazados en la capa de péptidoglicano y se extiende en forma de cilios más allá de la

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    superficie de las células Gram+. Estos son también antígenos importantes de superficie en aquellosorganismos que los poseen4a. Las familias representativas de este grupo de bacterias son:

    Staphylococcus , Enterococcus spp., yStreptococcus spp.Véase Figura 3

    Figura 3. Diferencia estructural entre las bacterias Gram+ y Gram-4b.

    II.3. Pared celular.

    Debido a la importancia que tiene la pared celular en la célula, es necesario explicar su constitución.La pared celular se encuentra formada por peptidoglicán (también llamado glucopéptido omucopéptido o mureína); en las bacterias Gram+ representa hasta el 90% de la pared, aunque otra clasede componentes, los ácidos teicoicos, también suelen estar presentes; los cuales se hallan unidas deforma covalente a la superficie externa de la célula. Por otro lado en las bacterias Gram- la cantidad deeste compuesto es mínimo (10% de la pared) y no se observa la presencia del ácido teicoico. La

    estructura básica del peptidoglicán es prácticamente similar en todas las bacterias, y consiste en una pequeña cantidad de aminoácidos (algunos de configuración D) y 2 azúcares, la N-acetilglucosamina(GlcNAc) y el N-acetilmuramato (MurNAc). Este esqueleto se encuentra formado por: a) residuosalternos de MurNAc y GlcNAc, unidos por enlaces glicosídicos:β-1-4, b) un tetrapéptido formado porresiduos D y L también alternos, y c) un enlace peptídico que une al grupo carboxilo terminal de un

    6

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    tetrapéptido (posición 4) con un grupo NH2 o COOH libre en uno de los tetrapéptidos vecinos.VéaseFigura 4

    N-Acetilglucosamina N-Acetilmurámico

    L-Alanina

    D-Glutámico

    m-Diaminopimélico

    b-1,4O

    HH

    HH

    OHOH

    H NH-COCH3

    CH2OH

    O

    HH

    H

    NH-COCH3

    OH

    CH2OH

    O

    O

    CH3NH

    NH

    O

    H

    CH3

    O

    HOOC

    H

    O

    NH

    NH O

    COOHCH3

    H

    D-Alanina

    NH2

    R

    O

    Figura 4. Representación del esqueleto de la pared celular bacteriana; constituída por el peptidoglicanomureína4c.

    7

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    Cuando los elementos del esqueleto se unen forman una cadena recta y no ramificada, que constituyela estructura básica de la pared celular ("backbone "). Entre los aminoácidos típicos de esta cadena seencuentran la L-alanina, ácido D-glutámico, ácido m-diaminopimélico o la L-lisina o D-alanina. Cabedestacar, que las bacterias Gram- contienen únicamente ácido meso-diaminopimélico (DAP) en su

    peptidoglicano, y las bacterias Gram+ poseen lisina u otros aminoácidos en lugar del DAP.VéaseFigura 5

    Figura 5. Aminoácidos característicos que conforman la estructura básica de la pared celular3.

    Los enlaces glucosídicos que unen a las cadenas lineales son fuertes, pero no confieren rigidez en todaslas direcciones; de tal forma que, las cadenas al entrecruzarse por puentes peptídicos, confieren larigidez característica de la pared. Estas estrcuturas entrecruzadas forman una estructura bidimensionalunida covalentemente y en forma de saco (sáculo de mureína). El número de puentes peptídicos no esigual en todas las especies de bacterias, y las paredes con mayor número de puentes intercatenarios, sonmás rígidos. Cabe mencionar que existen aminoácidos que nunca están presentes en los puentes

    interpeptídicos como los ramificados, aromáticos, azufrados, Histidina, Arginina o Prolina4a. En las bacterias Gram-, la pared celular está compuesta por varias capas y es bastante compleja; ya que los puentes intercatenarios se establecen por lo general, mediante enlace peptídico directo del grupo aminodel diaminopimélico al grupo carboxilo de la D-alanina terminal.Véase Figura 6.a.En las bacteriasGram+, la pared celular está formada fundamentalmente por un solo tipo de molécula y suele ser másancha. De tal forma que el enlace se establece con frecuencia a modo de puente interpeptídico mediante

    8

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    varios aminoácidos, cuyo número y tipo dependen del tipo de microorganismo.Véase Figura 6.b.Muchas de las bacterias Gram+ presentan embebidos en su pared polisacáridos ácidos, denominados

    ácidos teicoicos . Este término se refiere a los polímeros de la pared de la membrana o de la cápsula quecontienen unidades de glicerolfosfato o de ribitolfosfato. Estos polialcoholes están unidos por ésteres de

    fosfato y a menudo presentan unidos otros azúcares y D-alanina. Debido a su carga negativa, los ácidosteicoicos, son en parte responsables de la carga negativa neta de la superficie de las células y puedeintervenir en el paso de iones a través de la pared celular. Debido a su asociación con lípidos, estosácidos también se le denominanácidos lipoteicoicos. Vease Figura 7

    G M G

    L-Ala

    D-Glu

    DAP

    D-Ala

    D-Ala

    DAP

    D-Glu

    L-Ala

    G M G

    G M G

    L-Ala

    D-Glu-NH2L-Lys

    D-AlaGlyGlyGlyGlyGly

    D-Ala

    DAPD-Glu

    L-Ala

    G M G

    Puente intercatenarintermedio

    a) Pared celular de bacteriasGram-

    b) Pared celular de bacteriasGram+

    Figura 6. Diferencia en las conexiones entre las unidades peptídicas y las de glicano durante la formación

    de la lámina de peptidoglicano, de las bacterias: a) Gram-

    y b) Gram+3

    .

    9

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    Figura7. Estructura de los ácidos teicoicos de la pared celular4d.

    II.3.1. Biosíntesis del peptidoglicano.

    La secuencia del proceso de biosíntesis del peptidoglicano se determinó gracias a los estudiosenzimáticos realizadosin vitro por Strominger (1950)5a. Y en el cual se describe el proceso en cuatro

    etapas:1. Síntesis de precursores hidrosolubles en el citosol.

    2. Unión a un lípido de membrana.

    3. Formación de polímeros lineales en la superficie externa de la membrana.

    4. Formación de enlaces cruzados entre estos polímeros.

    Durante el crecimiento celular la síntesis del nuevo peptidoglicano supone el corte controlado del peptidoglicano preexistente por las autolisinas y la inserción simultánea de precursores. En este

    proceso interviene un lípido transportador; el bactoprenol o undecaprenol (C55), un alcohol muyhidrofóbico, el cual transfiere las unidades estructurales a través de la membrana, convirtiendo a los precursores lo suficientemente hidrofóbicos para atravesarla. Una vez en el periplasma; se lleva a cabola transpeptidación, en el cual el bactoprenol conecta con enzimas los precursores en el punto decrecimiento de la pared celular y catalizan la formación de los enlaces glucosídicos. Al final de este proceso de polimerización, el undecaprenol-PP liberado se dirige hacia la superficie interna de la

    10

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    membrana. El paso final, consiste en la formación de enlaces cruzados entre las cadenas laterales delos polipéptidos, este proceso se produce en el exterior de la membrana celular, por lo que no puedeutilizar directamente el ATP intracelular para establecer los enlaces peptídicos.Véase Figura 8 Laenergía utilizada proviene del mismo pentapétido; así, el enlace cruzado se produce gracias a una

    reacción de transpeptidación, que es neutra desde el punto de vista energético. La transpetidaciónconsiste en el desplazamiento de una D-alanina terminal por un radical de NH2 libre, liberando dichoresiduo y formando un puente con la D-alanina subterminal6.

    Figura 8. Proceso general de la biosíntesis del peptidoglicano5b.

    II.3.2. Acción de los antibióticos sobre los procesos de síntesis de los componentesde la pared.

    Hasta ahora se han identificado diversos puntos específicos de inhibición. De acuerdo con Stromingery cols., los antibióticosβ-lactámicos inhiben la última etapa de la síntesis del peptidoglicano,impidiendo la reacción de transpeptidación. Por ejemplo la penicilina fue identificada como un agentelítico, el cual bloquea la formación de enlaces cruzados en el peptidoglicano. La semejanza estructuralde la penicilina con el análogo de la D-alanil-D-alanina se puede observar mediante la construccion de

    11

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    modelos atómicos, donde el enlace peptídico situado en el anilloβ-lactámico es el que se rompedurante la reacción de transpeptidación.Véase Figura 9.

    D-alanil-D-alanina Ampicilina

    Figura 9. Semejanza estructural entre los compuestosβ-lactámicos y la D-alanil-D-alanina terminal7a.

    Debido a esta relación estructural la penicilina inhibe irreversiblemente la reacción que da lugar a laformación de enlaces cruzados, mediante la formación de una enzima peniciloil estable, en lugar de la

    enzima normal de tipo peptidil, la cual es transitoria. Los agentesβ-lactámicos pueden penetrarfácilmente en las bacterias Gram+, mientras que en las bacterias Gram- lo hacen a través de porinas lascuales se encuentran ubicadas en la bicapa lipídica externa7b. El grupo COOH-terminal de la D-alaninay el grupo NH2-terminal de la glicina son los sitios participantes en la transpeptidación, en donde participan las proteínas de unión a pencilina (PBP´s*); como catalizadores de esta reacción. Las PBP´sson un grupo de enzimas involucradas en la síntesis de la capa de peptidoglucanos de la pared bacteriana, y cumplen funciones como transpeptidasas, transglucosilasas, endopeptidasas, ocarboxipeptidasas, y se localizan en la superficie de la membrana citoplasmática8.

    II.4. Antibióticos.

    II.4.1. Concepto.

    Tradicionalmente se definen como compuestos de bajo peso molecular producidos pormicroorganismos que matan o inhiben el desarrollo de otros microorganismos y pueden ser ingeridos oinyectados dentro del cuerpo humano. Se han descubierto un gran número de antibióticos; sinembargo, algunos han sufrido modificaciones químicas para ser más efectivos en los tratamientos yson llamados antibióticos semisintéticos o sintéticos. Sin embargo, la susceptibilidad natural de los

    * Del inglés Penicillin Binding Protein

    12

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    microorganismos a los antibióticos varía de especie a especie. Las bacterias Gram+ generalmente sonmás susceptibles a los antibióticos en comparación con las Gram- Un antibiótico que actúa en ambos tipos de bacteria se conoce como un antibiótico de amplio espectro,el cual tiene un uso terapéutico más extenso. Es posible que en la naturaleza surgiesen los antibióticos

    como un medio para que un microorganismo eliminase de su alrededor a otros que competían con él por los nutrientes. Actualmente se incluyen los antibióticos y los quimioterápicos (moléculasobtenidas por síntesis) dentro del concepto de antimicrobianos. El término agente quimioterápico hasido empleado para referirse a agentes antimicrobianos y también se refiere a agentes que actúancontra células humanas como inmunomoduladores y fármacos antitumorales.

    II.4.2. Historia.

    El afán del hombre por encontrar un mecanismo con el fin de combatir y controlar las infecciones,data desde la misma época en que el hombre se constituye como tal. A lo largo de los años, y eldesarrollo de la ciencia han dado paso a la terapéutica como la conocemos hoy en día.

    Uno de los primeros científicos que revolucionó la era de los microorganismos fue Anton vanLeeuwenhoek en 1683, quien observó la bacteria por primera vez. En 1828 el científico C. Ehrenberg;dió la primera descripción precisa de las bacterias (nombre derivado del griego “bakter”bastón ).

    Posteriormente, Louis Pasteur (1822-1895) y Robert Koch (1843-1910) describieron el papel de la bacteria como causa de enfermedades9. Gracias a estos avances, comenzó la era de los quimioterápicoscon los trabajos del médico alemán Paul Ehrlich (1854-1915), quién pensaba que para protegerse delas infecciones, la toxicidad de algunas sustancias podría ser aprovechada en función a unadeterminada dosis y a su selectividad. Y dedicó parte de su vida a la búsqueda de lo que denominó "la bala mágica", a través del estudio del salvarsán. El buscaba una molécula con capacidad de unirseespecíficamente a un blanco determinado (agentes productores de la enfermedad), para destruirlo. Sinembargo, este objetivó se alcanzó cuando el científico P. Gelmo hubo sintetizado la sulfanilamida un

    par de años antes de que Paul Ehrlich anunciara el descubrimiento del salvarsán. Un avanceimportante en esta área fue, el descubrimiento de la penicilina por A. Fleming (1881-1955), y su purificación posterior y uso comercial, por H. Florey (1988-1968) y E. Chain (1906-1979), que juntocon el descubrimiento, años después por S. Waksman, de la estreptomicina abrirían un nuevo caminoen la lucha contra la enfermedad y el descubrimiento de los quimioterápicos y el desarrollo de nuevosfármacos más potentes que han venido transformando la medicina moderna y la calidad de vida

    13

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    humana. Aunque el término quimioterapia parece en la actualidad dirigido al uso de los fármacosempleados en el tratamiento oncológico (de los diferentes cánceres); es mucho más amplio, ya queengloba sustancias que poseen una afinidad especial por ciertos microorganismos y/o estructurasmoleculares, capaces de destruir o neutralizar a los agentes productores de las infecciones. Por lo tanto

    se originó el término quimioterapia o quimioterapéutica, es decir, el tratamiento por fármacos con unaalta afinidad por las estructuras bioquímicas de los microorganismos, sin dañar los tejidos u órganosdel huésped10, 11.

    II.4.3. Clasificación.

    El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente no es con frecuencia suficiente para

    establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los agentesantimicrobianos. Ya que no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus a losagentes antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada patógeno a estos fármacos, pudiéndose elegir entonces el agente apropiado (el más activo contra el patógeno, el menos tóxico para el huésped, con las características farmacológicas apropiadas y el máseconómico), que proporciona mayores posibilidades de una evolución favorable. Por supuesto, elresultado terapéutico final depende de muchas otras variables, como la enfermedad que subyace ycondición clínica del huésped, las propiedades farmacológicas del agente antimicrobiano, la

    administración de otros agentes terapéuticos adicionales y otros factores ejercerán una fuerteinfluencia sobre el desenlace final. En líneas generales y en función del resultado final sobre losmicroorganismos, los antibióticos se dividen en dos grandes grupos:

    • Los antibióticosbactericidas, los cuales no solo inhiben el crecimiento bacteriano, sino quedesencadenan mecanismos dentro de la célula que conducen a la muerte celular. Su acción, por lo tanto es letal e irreversible sobre las bacterias (ej. Vancomicina,β-Lactámicos,Aminoglucósidos, etc.)

    • Los antibióticosbacteriostáticos, que inhiben el crecimiento y multiplicación de las bacterias, pero no matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas del huésped puedeneliminar a las bacterias. Sin embargo, si el agente es retirado, las células vuelven amultiplicarse (ej. Tetraciclina, Cloranfenicol, Sulfonamidas, Clindamicina, Macrólidos, etc.)12

    14

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    II.4.4. Mecanismo de Acción de los Antimicrobianos.

    Los fármacos antimicrobianos se clasifican de acuerdo a su estructura química (β-lactámicos,aminoglucósidos, quinolonas, etc.), mecanismo de acción (inhibidores de la síntesis de la pared

    celular, inhibidores de la replicación del ADN, etc.), u actividad contra tipos particulares demicroorganismos (bactericidas, fungicidas, antivirales, etc.).

    Figura 10. Modos de acción de los agentes antimicrobianos13a.

    Como se observa en lafigura 10, existen diversas familias de antibióticos; las cuales, cada una tieneun blanco específico (mecanismo de acción). Dentro de esta clasificación se encuentran:

    a) Las quinolonas: inhiben aquellas enzimas bacterianas involucradas en la replicación del ADN. b) La Rifampicina: inhibe la transcripción, al unirse a la ARN polimerasa de la bacteria.c) Macrólidos, tetraciclinas y aminoglucósidos: inhiben la función del ribosoma 70S; por lo tanto,inhiben la síntesis de proteínas.d) Vancomicina yβ-lactámicos: inhiben la síntesis de la pared celular a diferente nivel cada una.(mureína y peptidoglicano, respectivamente)13b.

    Los agentes antimicrobianos que interfieren con la síntesis de la pared celular bloquean la síntesis del péptidoglicano, y para que estos agentes muestren su máxima eficacia, se requiere que las bacterias seencuentren en proliferación activa; de otra manera su efecto sería escaso o nulo, por lo tanto son

    15

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    activos contra bacterias en crecimiento. Los agentes antimicrobianos que interfieren con la síntesis dela pared celular son bactericidas. Los miembros más importantes de este grupo son los antibióticosβ-lactámicos, así llamados por que contienen en su estructura el anilloβ-lactámico,(Véase Figura 8) indispensable para su actividad; los cuales, son uno de los grupos de antibióticos más usados en la

    práctica médica, y el enfoque principal de este proyecto. Poseen una gran eficacia terapéutica; ademásactúan bloqueando las enzimas biosintéticas de una estructura como el peptidoglicano, que solo seencuentra en las células bacterianas, y no tienen homólogo en las células animales; ambascaracterísticas hacen de estos antibióticos una de los mejores grupos terapéuticos bacterianos.

    Los antimicrobianosβ-lactámicos en bacterias Gram-, entran a la célula a través de los canales porínicos de la membrana externa. En las células susceptibles, las moléculasβ-lactámicas inactivanuna serie de transpeptidasas, localizadas en la superficie de la membrana citoplásmica y que catalizan

    el último paso de la formación del peptidoglicano. Debido a su similitud estructural de lasβ-lactamascon el sustrato natural D-alanil-D-alanina, se forma un complejo peniciloil-enzima análogo a laenzima acilada transitoria formada durante la transpeptidación normal. Las transpeptidasas sondifíciles de purificar y son mejor conocidas como proteínas de unión de penicilina (PBPs), la bacteria posee múltiples PBP´s, las cuales tienen diferentes funciones durante la síntesis del peptidoglicano delciclo celular 14.

    La unión de los antibióticosβ-lactámicos a las PBP´s produce paredes celulares debilitadas o

    defectuosas, seguido de lisis celular por activación de enzimas autolíticas, que conducen a la muertecelular. Puesto que las bacterias Gram+ no poseen una membrana externa, los antimicrobianosβ-lactámicos actúan directamente sobre el peptidoglicano, y los siguientes pasos son similares a los delas bacterias Gram- 15.

    16

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    II.4.5. Estructura Química de los Compuestosβ-lactámicos.

    La presencia de un anilloβ-lactámico define químicamente a esta familia de antibióticos, de la que se

    han originado diversos grupos: penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, monobactamas e

    inhibidores de lasβ-lactamasas. Estos agentesβ-lactámicos son derivados cíclicos de losβ-aminoácidos, aunque en productos naturales también encontramos a sus análogosα. Por otro lado, losβ-aminoácidos se encuentran presentes en la naturaleza, como componentes de péptidos biológicamente activos16, y su incorporación como péptidos tienen un interés farmacológico. La 2-azetidinona (Véase Figura 11); también llamadaβ-lactama, es una amida cíclica de cuatro miembros;la cual, fue sintetizada por primera vez por Staudinger en 190717. Posteriormente, el descubrimiento dela penicilina en 1929 por Fleming, la elucidación de su estructura por cristalografía de rayos X18 y su purificación por Chain y Florey19, permitieron la síntesis de nuevos compuestosβ-lactámicos de

    interés farmacológico. Lo cual, en la actualidad sigue siendo un campo interesante; además de suimportancia biológica lasβ-lactamas en forma enatioméricamente puras, son indispensables para lasíntesis de una gran variedad de productos naturales, tales como losβ-aminoácidos, oligopéptidos, péptidos y azetidinas20.

    NR1 O

    R3R2

    Sitio de desdoblamientopor beta lactamasas o

    por ácido

    Figura 11. Estructura de lasβ-lactamas (2-azetidinona)20.

    En los últimos años, se han descubierto un gran número de antibióticos útiles en el tratamiento deenfermedades infecciosas, sin embargo algunos han sufrido modificaciones químicas para ser másefectivos en los tratamientos. Todos las estructuras de los antibióticosβ-lactámicos se puedenconsiderar derivados de un núcleo químico, que es el anilloβ-lactámico el cual esta fusionado a otroheterociclo (S, O) ya sea de cinco o seis miembros21. Véase Figura 12.

    17

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    N

    S

    ON

    S

    ON

    S

    O

    N

    O

    ON

    O

    O

    NO

    NO

    N

    S

    O

    N

    O

    ON

    O

    O

    NO

    NO

    Penam Penem Cefam Cefem

    Clavam Clavem Oxacefam Oxacefem

    Carbapenam Carbapenem Carbacefam Carbacefem

    N

    NHCO

    R

    O SO3HMonobactam

    Figura 12. Estructura de los núcleos de los antibióticosβ-lactámicos22.

    Los antibioticosβ-lactámicos presentan escasa toxicidad, tienen un amplio margen de seguridad y seclasifican en: penicilinas, cefalosporinas, carbapenems y monobactamas22b. VéaseTabla 1.

    C

    N

    SCH3

    CH3

    COOH

    NHR

    O

    OBA

    A. Beta lactámico

    B. Anillo tiazolidínico

    C. Fragmento procedente de L-cisteína

    D. Fragmento precedente de D-valina

    E. Grupo acilo

    E

    D

    Tabla 1. Antibióticosβ-lactámicosfrecuentemente empleados en clínica22.

    PENICILINASBencilpenicilina

    IsoxazolilpenicilinasAminopenicilinasCarboxipenicilinas

    AcilureidopenicilinasTemocilina

    Penicilina GOxacilina

    Ampicilina, amoxicilinaCarbenicilina, ticarcilinaAzlocilina, mezlocilina

    TemocilinaCEFALOSPORINAS

    1ª Generación2ª Generación3ª Generación4ª Generación

    Cefazolina, cefalotinaCefoxitina, cefuroxima

    Cefotaxima, ceftazidimaCefpiroma, cefepime

    CARBAPENEMASImipenem, meropenemMONOBACTAMAS

    Aztreonam, carumonam

    18

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    a) La penicilinas poseen una estructura bicíclica, el ácido 6 aminopenicilánico (6-APA), undipéptido cerrado en forma de ciclo que se forma por la condensación de L-cisteína y D-valina, resultando en un anilloβ-lactámico y un anillo tiazolidínico.

    b) Las cefalosporinas, tienen un núcleo que es derivado de los mismos aminoácidos que el 6-

    APA, pero una de los grupos metilo de la valina se incorpora al anillo tiazolidínico, por lo queeste contiene seis elementos, en lugar de cinco. A este se le denomina ácido 7-aminocefalosporánico.

    c) Los carbapenems, se diferencian de las penicilinas por que existe una substitución de un átomode carbono (CH2) por un átomo de sulfuro del anillo tiazolidínico.

    d) Los monobactámicos, que son compuestos monocíclicos donde un grupo de ácido sulfónico,en lugar de un anillo fusionado, permite que el anilloβ-lactámico sea activo.

    II.4.6. Mecanismo de acción.

    Se han descrito dos mecanismos que intervienen de una manera más o menos directa en la acciónantibiótica de losβ-lactámicos. El primero es la inhibición directa de las proteínas de unión a penicilina (PBPs) de la membrana citoplasmática. El segundo mecanismo, inductor de la lisis celular,viene determinado por la acción concomitante de las autolisinas. Las proteínas PBPs son la diana porexcelencia de los antibióticosβ-lactámicos a las que se unen por el residuo de serina análogamente a

    como lo haría el sustrato natural de las PBPs, los residuos acil-D-alanil-D-alanina del peptidoglicano;como resultado de esta inhibición, los péptidos UDP-acetilmuramil-L-Ala-D-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Alase acumulan. La figura 13 muestra el mecanismo de acción de las transpeptidasas con diversosligandos y la obtención de sus respectivos productos, propuesto en 1965 por Tipper y Strominger 23.

    19

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    I)

    H

    O N

    H

    HOOCH

    CH3

    NHR

    CH3

    NH2

    CH3 H

    COOH

    ENZ-XH

    H

    OX

    ENZ

    NHR

    CH3

    R ́- N H 2

    H 2 O

    2a

    2b

    RNH NH

    CH3

    R1

    O

    RNH

    OH

    O

    CH3

    +

    ENZ-XH

    +

    ENZ-XH

    II) N

    S

    O

    NH

    R

    COOH

    H CH3

    CH3

    N

    S

    O

    NH

    R

    COOH

    H CH3

    CH3

    X-ENZ

    ENZ-XHI´

    I

    R ́- N H 2

    H 2 O

    2a´

    2b´

    HN

    S

    O

    NHR

    COOH

    H CH3

    CH3

    OH+

    ENZ-XH

    III)ENZ-XH

    R ́- N H 2

    H 2 O

    2a´

    2b´

    O

    NHCO

    H

    OH

    S

    NHCH3

    CO2-

    R

    +

    ENZ-XH

    NO

    NH

    CO

    HS

    R

    CH3CH3

    O

    NHCO

    H

    OH

    S

    NHCH2

    R

    CO2+

    ENZ-XH

    O

    NH

    CO

    H

    X-ENZ

    S

    CH3CH3

    R

    Dipéptido D-ala-D-ala

    Penicilina

    Cafalosporina

    Figura 13. Reacción enzimática de las serin proteasas con diversos sustratos23.

    20

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    En la literatura se ha reportado hasta 12 tipos diferentes de PBP´s (PBP 1- PBP12), y dentro dealgunas existen subfamilias (PBP1a, PBP2b, etc.). El número de PBP varía con el tipo demicroorganismo y la variación de estas moléculas confiere resistencia al microorganismo (ej.Staphylococcus aureus resistente a meticilina, un derivado de la penicilina).Véase tabla 2

    Tabla 2. PBPs con actividad Transglucosidasa o Transpeptidasa23.

    PBP´s Función Accción al añadirpenicilina

    PBP 1a y PBP 1b Elongación del cilindro celular Lisis rápida

    PBP 2 Condiciona la forma de la célula La célula se redondea ymuerePBP 3 Formación del septo transversal Filamentación y muerte

    PBPs con actividad D-Dcarboxipeptidasa (endopeptidasa) Función natural Acción penicilina

    PBP 4, PBP 5, PBP 6 Eliminan la D-ala terminal del pentapéptido (maduración PG) No letal

    Algunosβ-lactámicos actúan inhibiendo específicamente a una sola de estas PBPs (Principalmente lasPBPs de la1 a la3, que son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las penicilinas que explicanla actividad bactericida), pero la mayoría inhiben a varias de ellas con una afinidad variable siguiendoel siguiente modelo cinético:

    PBP

    +

    Penicilina

    k 1

    k 2

    k 3 k 4PBP-Penicilina Peniciloil-PBPPBP

    +

    Penicilinadegradada

    En la primera reacción de carácter reversible, la enzima (PBP) reconoce al sustrato (el antibióticoβ-lactámico) produciéndose una serie de cambios conformacionales en la enzima que terminan formandoun complejo no covalente (interacciones débiles). En una segunda reacción, que ocurre de una manerarápida, el sustrato acila un residuo de serina del centro activo de la enzima uniendo covalentemente elantibiótico a la enzima mediante un enlace tipo éster. La reacción final de desacilación libera laenzima y un producto resultante de la inactivación del antibiótico. Un antibióticoβ-lactámico seráconsiderado mejor, cuanto más rápidamente se una de forma covalente a la enzima (k 3 alta), y permanezca unido el mayor tiempo posible (k 4 pequeña) bloqueando y saturando las enzimas24. Tippery Strominger plantearon que lasβ-lactamasas podrían haber evolucionado a partir de enzimas

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    Tabla 3. Antibióticos obtenidos de forma natural1.

    Antibiótico Microorganismo(s) productor(es)

    Penicilina GPenicilina V

    Cefalosporina CÁcido clavulánico

    VancomicinaEritromicina

    EstreptomicinaClorafenicolTetraciclina

    P. notatum, P. chysogenum P. chysogenumC.acremoniumS. clavuligerus

    S. orientalisS. erythreusS. griseus

    S. venezuelaeS. viridifaciens, S. aureofaciens

    En la literatura se han descrito tres metodologías, utilizadas para obtener nuevos antibióticos defuentes naturales: 1) Aislamiento directo de microorganismos marinos y del subsuelo, 2) Modificacióngenética de microorganismos productores de antibióticos ya conocidos, para inducir la producción denuevos metabolitos, y 3) Diversificación de las rutas metabólicas de los microorganismos productoresde antibióticos, a través de la introducción de sustratos precursores dentro del sistema de fermentación.

    La purificación de moléculas con potencial actividad a partir de microorganismos marinos y delsubsuelo requiere de grandes esfuerzos, como la aplicación de múltiples técnicas cromatográficas yensayos biológicos que permiten seguir la actividad antibiótica de éstos. En un estudio se estimó quede 21, 830 fermentos bacterianos estudiados, 6,464 eran productores de antibióticos; de los cuales, 490 poseían ciertas actividades de interés y únicamente 6 se les determinó su estructura, de los cuales sólodos fue posible aislarlos1.

    Cabe mencionar que primero se requiere detectar la actividad que pudiera haber en cada fermento, para posteriormente identificar la fuente química de aquellos fermentos que producen antibióticos yaconocidos, las cantidades obtenidas de nuevos agentes antibacterianos son del orden de picogramos (ρ)a microgramos (μ). Otra forma de obtención de nuevos agentes antimicrobianos es el uso de latecnología de ADN recombinante; con la que se obtienen resultados poco favorables, ya que seobtuvieron antibióticos con pocas modificaciones estructurales de los ya conocidos. Finalmente; latercera metodología tiene como fin, bloquear completamente la vía sintética involucrada en la producción de antibióticos ya conocidos, dentro de la bacteria, con el propósito de forzar a la bacteriaa usar otra vía metabólica, usando diferentes grupos estructurales y funcionales para producir nuevos

    23

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    antibióticos. Este procedimiento permitió descubrir algunos aminoglucósidos, macrólidos yβ-lactamas. Sin embargo, la cantidad obtenida es aún tan pequeña, como para una producción masiva.

    II.4.8. Relación estructura actividad (SAR).

    Una forma de búsqueda de nuevos compuestos que pudieran tener actividad es el estudio de la relaciónestructura-actividad (SAR) a partir de moléculas líderes. El objetivo de estudio de esta relación, esdeterminar qué tipo de sustituciones o modificaciones en la molécula líder pueden realizarse paramejorar su actividad. Es decir se puede llegar a desarrollar de una manera racional y dirigida la síntesisde compuestos con potencial actividad biológica. Entre los antibióticos biciclicos naturales, la penicilina y cefalosporina son los más importantes. El estudio detallado de la relación estructura-

    actividad permitió entender que el éxito de un antibiótico para producir la muerte celular se relacionacon su tamaño, carga eléctrica e hidrofobicidad. Sin embargo, debido a la presencia de diversosmecanismos de resistencia en la bacteria, la eficacia terapéutica de los agentesβ-lactámicos se ha vistodisminuido. Es por esto que la quimioterapéutica se ha vuelto un campo atractivo de estudio, tanto enel área clínica como farmacéutica30. Algunos de los desarrollos recientes en el campo de losantibióticosβ-lactámicos son los que se describen a continuación:

    a) Los carbacefems; que tienen la característica de ser más estables que las cefalosporinas y

    pueden ser fácilmente sustituidos en la posición 3 del anilloβ-lactámico, un ejemplo claro esel loracarbef (lorabid) de uso clínico31. Véase Figura 15

    Figura 15. Estructura química del Lorabid31

    .

    b) Los β-lactámicos tricíclicos; mejor conocidos como trienems. Son una nueva clase decarbapenems tricíclicos, que tienen la característica de ser potentes, y son antibacterianos deamplio espectro32, efectivos contra bacterias Gram+, Gram-, y bacterias patógenas anaeróbicas;

    como el GV 104326.Véase Figura 16

    24

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    Figura 16. Estructura química del Tribactam32.

    c) Los nuevos compuestosβ-lactámicos trombin33, inhibidores de la proteasa de citomegalovirushumano34, inhibidores de absorción del colesterol35, son el resultado de estudios exhaustivosde la relación estructura actividad de la penicilina.Véase Figura 17

    Figura 17. Estructura química del a) inhibidor de la proteasa de citomegalovirus humano y del b)inhibidor de absorción del colesterol34, 35.

    II.5. Resistencia bacteriana.

    En 1940 se inicia el uso de antibióticos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas; sinembargo, es hasta 6 años después de la introducción de la bencilpenicilina, que se observó un aumentoen la frecuencia de resistencia de los estafilococos en los hospitales, y un aumento del 10% hasta un 60% a nivel mundial. A través del uso de diversos antibióticos, han emergido cantidades crecientes de bacterias de diversas especies resistentes a estos fármacos; lo que pone en evidencia la enorme presiónselectiva que ejercen los antimicrobianos para promover la selección de cepas resistentes y latransferencia del material genético. La resistencia bacteriana se define como el crecimiento bacteriano

    a la concentración máxima (del orden deμg) de un antibiótico tolerada por el hospedante. Esteconcepto fue propuesto por Ehrlich (1854-1915), quién en su trabajo con protozoos, permitió entenderla rápida adaptabilidad de los microorganismos frente a los antibióticos y la necesidad de acelerar lainvestigación química y médica, para mantener el mismo nivel terapéutico. En esta parte del escrito se propone revisar el origen de la resistencia, el medio por el cual los procesos de resistencia se han

    25

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    diseminado en la población microbiana, y los mecanismos por los cuales los antibióticos pueden sereliminados36.

    II.5.1. Origen.

    Para entender la base molecular del estudio antimicrobiano, primero es necesario plantearnos lasiguiente pregunta -¿las bacterias ya contenían la resistencia o la adquirieron por una necesidad deadaptación al medio?- Entre el año de 1800 y 1859 esta pregunta fue respondida, por Jean-BaptisteLamark y Charles Darwin con sus respectivas teorías que revolucionaron el pensamientoevolucionista. Cabe mencionar que en esa época todavía no se conocía la estructura del ADN, por loque sus teorías se basaron en el simple estudio fenotípico (término todavía no acuñado en esa época)

    de la especies. Pero se puede decir que ¿la corriente Lamarckista se opone a la corriente Darwinista?

    La teoría de Lamark (predecesor de Darwin), explica que la adaptación de los microorganismos almedio se debe, no sólo al impulso vital que los empuja hacia una creciente perfección; sino a unmecanismo específico de ajuste al medio:la herencia de los caracteres adquiridos . Por otro lado, lateoría de Darwin explica que la diversidad biológica deriva de una única forma de vida ancestral, a partir de la cual la vida evolucionó a lo largo de múltiples y sucesivas vías divergentes; en donde elmecanismo fundamental es la selección natural. Debe entenderse, que Darwin concibió a la evolucióncomo un proceso de descendencia con modificación (mutaciones al azar); el cual es lento y se da de

    forma gradual.

    Darwin explicaba dentro de su teoría que la evolución se basada en factores y procesos puramentemecánicos o materiales, de tal manera que no sólo comprendía toda la diversidad biológica, sino queaceptaba aquellas propuestas de Lamarck; sobre los mecanismos que producen la evolución, siempreque fuesen puramente materiales; es decir, aceptó la herencia de los caracteres adquiridos (un

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    mecanismo por el que pueden explicarse ciertas adaptaciones puntuales a las circunstancias), perorechazó el vitalismo Lamarckiano37.. Hoy en día, existen diversas hipótesis que explican el origen dela resistencia bacteriana. Todos ellos siguen una corriente Darwiniana.

    Una hipótesis indica que el origen de los determinantes (genes) de la resistencia antibióticaencontrados en varias bacterias, son los propios microorganismos productores de antibióticos(principalmente Actinomicetos), debido a que los usan como un medio de protección ante sus propiosmetabolitos. Esta hipótesis se basa en la comparación de secuencias de aminoácidos y ácido nucléicoscomo determinantes de la resistencia de aminoglucósidos, tanto en microorganismos productores deantibióticos como de bacterias aisladas en el área clínica. Aunque la evidencia es consistente en cuantoa la transferencia de genes entre los Actinomicetos y otras bacterias, no es posible conocer cuál esdonador y cual es receptor, o si los nuevos genes de resistencia adquiridos se encuentran codificados

    en cromosoma o en plásmidos. Sin embargo, los organismos productores de antibióticos no son laúnica fuente de los mecanismos de resistencia antimicrobiana, las micobacterias participan en unintercambio de genes inter-específicos por conjugación, con otro género bacteriano, lo queejemplificaría el primer paso de diseminación de los genes de resistencia con otras especies bacterianas en la naturaleza (o el ambiente). Por otro lado la adquisición exógena de estos genesresistentes por micobacterias patógenas, es de gran consideración; ya que la presencia de elementos deresistencia en aislados clínicos de micobacteria, se asocian generalmente a una mutación38. VéaseFigura 18

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    Figura 18. Ciclo de adquisición de genes de resistencia por la bacteria, en respuesta a la presión selectivadebido al uso de los antibióticos. La piscina de genes que codifican para la resistencia a antibióticos

    representa todas las fuentes potenciales del ADN (que codifica para los determinantes de la resistencia) en el ambiente; incluyendo hospitales, granjas, y otros microambientes donde los antibióticos son usados para el control del crecimiento bacteriano. Después de la absorción de una cadena sencilla o doble de ADN por la bacteria huésped, la incorporación de los genes resistentes dentro de replicones estables (elementos del ADN capaces de replicarse autónomamente) que pudieron seguir diferentes vías; las cuales todavía no se han definido. La participación de integrones; como se muestra aquí, ha sido demostrado por una gran clase deelementos transponibles (pedazos de ADN que se mueven de un sitio a otro en el cromosoma) en las

    Enterobacterias. Los plásmidos resultantes resistentes pudieron existir en forma lineal o circular en las bacterias huésped. Finalmente el último paso en el ciclo –diseminación- se lleva a cabo por uno o varios de

    los mecanismos de transferencia de genes, discutidos más adelante 38

    .

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    II.5.2. Introducción a la genética de la resistencia.

    Como ya se mencionó la resistencia a los antimicrobianos está determinado por el genomamicrobiano, el cual se encuentra en la célula en tres tipos de elementos genéticos: el cromosoma, los

    plásmidos y los bacteriófagos lisógenos. La resistencia puede ser intrínseca o adquirida.

    La resistencia intrínseca es la resistencia natural que poseen algunas especies bacterianas; unmecanismo es la presencia de enzimas inactivantes. Por otro lado, la resistencia adquirida se produce por alguno de los mismos mecanismos por los que tiene lugar la resistencia natural y se adquieren por:1) mutación y selección (evolución vertical); 2) transferencia de fragmentos de ADN que codifican laresistencia entre cepas y especies (evolución horizontal) 39.

    La variabilidad genética es esencial para que la evolución microbiana pueda ocurrir. Debido a que losagentes antimicrobianos ejercen una presión selectiva sobre las poblaciones bacterianas, favoreciendoaquellos microorganismos capaces de sobrevivir a ellos, cada vez son más las bacterias que responden,según su estrategia, seleccionando individuos que poseen mecanismos de resistencia40.

    II.5.2.1. Evolución vertical.

    Esta evolución se produce bajo una selección característica de la evolución Darwiniana, es decir porun principio de selección natural: una mutación espontánea en el cromosoma bacteriano puede conferirresistencia a uno o varios antimicrobianos en al menos un miembro de la población bacteriana. Estasmutaciones generalmente involucran substituciones, delecciones, o adiciones de al menos un par de bases. Tales errores se dan al azar y espontáneamente, y son independientes de la presencia o ausenciade un antibiótico en particular 41.

    En el cromosoma bacteriano las mutaciones son el resultado de errores en el proceso de replicación del

    ADN y pueden ocurrir con una frecuencia de aproximadamente 10-8 por división celular. La mayoríade las mutaciones son reparadas sin que la célula tenga un cambio; pero cuando se produce estecambio, pueden alcanzar una densidad poblacional de células muy grande, y cada mutante puede serdesarrollado en una sola generación en pocos minutos de crecimiento bacteriano. Sin presión selectivaes muy difícil que se fije una mutación en la población, pero la sola influencia del antibiótico tiende a

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    seleccionar al mutante resistente, con la cual la cepa sensible será eliminada, mientras que las mutantessobrevivirán y proliferarán hasta llegar a ser el tipo predominante42.

    II.5.2.2. Evolución horizontal.

    Esta evolución refiere a la adquisición de genes de resistencia a partir de otro microorganismo no parental. El mecanismo por el cual se establece este tipo de resistencia es variado, pero con frecuencialas bacterias con genes de resistencia donan estos genes a otras bacterias a través de varios procesos deintercambio genético propios de las bacterias. Estos genes se pueden transmitir fuera del propio linaje(intercambio genético con diferente especie y/o género)43. Esta adquisición de ADN externo se debe a los plásmidos, bacteriófagos, secuencias de ADN libre o

    elementos genéticos transponibles como los transposones. Los mecanismos responsables de estaadquisición son44, 45a:

    a. Conjugación: trasferencia del ADN plasmídico de una bacteria dónate a una bacteria receptora por contacto entre célula y célula.

    b. Transformación: intercambio genético producido cuando una bacteria es capaz de captarfragmentos de ADN; de una bacteria lisada, que se encuentran dispersos en el medio dondevive.

    c. Transducción: la transferencia de ADN de una bacteria a otra, se realiza a través de unvirusbacteriófago , que se comporta como unvector intermediario entre las dos bacterias.VéaseFigura 19.

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    Figura 19. Mecanismos de transferencia genética, de la resistencia bacteriana. a) Conjugación, b)Transducción, y c) Transformación45b.

    II.5.3. Mecanismos de resistencia.

    La resistencia a diversos antibióticos se debe a mutaciones genómicas o por adquisición vertical u

    horizontal del material genético que contiene determinantes de resistencia. Esta resistencia puede seractiva (como resultado de una presión específica evolutiva, que adapta un mecanismo de contra ataquecontra un antibiótico o varias clases de antibióticos), o pasiva (donde la resistencia es unaconsecuencia de un proceso adaptativo general, que no necesariamente está ligado a una claseespecífica de antibióticos).

    La bacteria alcanza una resistencia antimicrobiana activa a través de 4 mecanismos:

    A. Presencia de un sistema de flujo de salida que bombea el fármaco hacia fuera, las bombas son proteínas embebidas en la membrana plasmática.

    B. Menor capacidad de penetración del fármaco por disminución de la permeabilidad.C. Ausencia de un sitio efector o alteración del mismo; sobre el cual actúa el antibiótico,

    debida a una mutación.

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    D. Presencia de enzimas inactivadoras; como lasβ-lactamasas, las cuales destruyen penicilinas y cefalosporinas principalmente46. Véase Figura 20

    Figura 20. Diversos mecanismos de resistencia bacteriana46.

    Estos mecanismos requieren de un programa genético dentro de la célula en respuesta a un ambienteestresante; de tal manera que la presencia de los antibióticos o su acción regulan genéticamente laexpresión de genes resistentes. Por lo tanto, las bacterias gastan una gran energía y espacio genético para resistir activamente a los antibióticos. Incluso en cepas bacterianas aisladas en hospitales se haencontrado que presentan una combinación de varios mecanismos de resistencia.

    En 1940, Abraham y Chain identificaron una enzima capaz de hidrolizar el anilloβ-lactámico de estafamilia de antibióticos, lo cual interfería con la terapia de la penicilina. Observaciones experimentalesen el laboratorio con Enterobacterias , tales como Escherichia coli o Salmonella typhimurium ;encontraron que la frecuencia para observar bacterias mutantes espontáneas resistentes es de 10-9 omenos por generación. Es por esto, que los genetistas bacterianos de hoy en día sugieren que eldesarrollo de la resistencia bacteriana debida a la terapia es improbable, ya que la frecuencia de lasmutaciones que dan la resistencia bacteriana es demasiado baja47.

    Entre los mecanismos de resistencia identificados, la inactivación enzimática es uno de los procesos bioquímicos más comunes, que confieren resistencia a una amplia variedad de antibióticos en las

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    bacterias. Es sorprendente que los mecanismos de inactivación de antibióticos han sido importantes enla determinación de la resistencia bacteriana; ya que son consecuencia de diversas mutaciones; aunquealgunos determinantes para la inactivación enzimática de los antibióticos en aislados clínicos, puedendeberse a la herencia de funciones exógenas (genes). No por esto, se menosprecia a las mutaciones

    como un factor influyente en el desarrollo y evolución de la resistencia antimicrobiana en