SIEROPROTEINE · - La VES aumenta alla fine della prima settimana di malattia e nelle gammopatie...

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SIEROPROTEINE

ELETTROFORESI

Le proteine del siero ammontano in totale a 6-8 g/dl; nel neonato 5 g/dl.

Aumento delle proteine totali: - disidratazione

- cambiamenti posturali

- epatopatie (accumulo di γglobuline)

- tumore delle plasmacellule

- infezione cronica (aumento Ig)

- anemia (aumento transferrina)

Diminuzione delle proteine totali: - iperidratazione (ad es. nella gravidanza)

- malnutrizione

- dieta non equilibrata

- malattie renali

- epatopatie

- enteropatie protido-disperdenti

- malassorbimento

- ustioni

- eccessivo catabolismo

L’elettroforesi viene eseguito sul siero (ciò che rimane del plasma dopo l’evento coagulativo); non

sul plasma il quale è ricco di fibrinogeno che si annida tra le γglobuline e C3 (posizione occupata di

solito dalla componente monoclonale)

A pH 7,4 prevale la dissociazione tra gli amminoacidi (gruppi COO¯). Le cariche si spostano verso

il polo positivo (anodo) di elettroforesi.

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L’elettroforesi permette di evidenziare 5 bande.

1) Banda A corrispondente all’albumina (ALB)

2) Banda α1 corrispondente ad α1antitripsina (AAT) ; α1antichimotripsina (AAC);

α1glicoproteina acida (AAG); α-fetoproteina

3) Banda α2 corrispondente ad aptoglobina (HPT); α2macroglobulina (AMG); ceruloplasmina

(CER)

4) Banda β corrispondente a transferrina (TRF) (nella parte anodica) e C3 (nella parte catodica)

5) Banda γ corrispondente alla maggior parte delle immunoglobuline

1) - Prealbumina

- La prealbumina è un ottimo indicatore di nutrizione perché ha una emivita t1/2=48 h

- La prealbumina trasporta gli ormoni tiroidei e partecipa all’equilibrio tra frazione libera e frazione

legata; trasporta RBP (retinol binding protein), indicatore nutrizionale e nelle urine di sofferenza

renale

- PROTEINE DI FASE ACUTA

La diminuzione di prealbumina (proteina che occupa la parte più anodica della banda A) può

indicare uno squilibrio nutrizionale o la presenza di una malattia infettiva o un’infiammazione

acuta. Bisogna fare gli indicatori di fase acuta (FASE RATTIVA ACUTA: risposta aspecifica con

aumento della sintesi di alcune siero proteine).

- proteina C reattiva (CRP)

- velocità di eritrosedimentazione (VES)

- In fase acuta ↑VES riflette ↑[FIB]

- In fase cronica ↑VES riflette ↑[FIB]; ↑[Ig](indicano il passaggio a infiammazione cronica);

↑anemia (se non c’è microcitosi)

- La VES aumenta alla fine della prima settimana di malattia e nelle gammopatie monoclonali da

IgM, IgA, IgG.

Intervalli di riferimento VES

Età <60 anni Età >60 anni

MASCHI 2-13 mm/h 2-24 mm/h

Età <40 anni Età >40 anni

FEMMMINE 2-16 mm/h 2-35 mm/h

FEGATO

(sintesi di proteine di

fase acuta) CERVELLO

(febbre, sonno)

IL-1

IL-6

FAGOCITI TESSUTI

(stimolazione di proteolisi

IL-1

IL-6

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muscolare, fibtoblasti, calore)

- CRP è la più precoce e sensibile proteina di fase acuta

- A volte è associato ↑SAA (infiammazione acuta)

- Cascata delle proteine di fase acuta

- PRECOCI: ……………….CRP e AAC

- INTERMEDIE: …………..HPT, AAG, AAT, C4, FIB

- TARDIVE: ……………….C3, CER

RISPOSTA di FASE ACUTA

Figura 1: PCR = proteina C reattiva (precoce); PFAN = proteine di fase acuta negativa

Nell’epatopatico e parzialmente nel nefropatico la reazione di fase acuta è soppressa.

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5

CRP

PFAN

INTERMEDIE

TARDIVE

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- ALB (albumina)

Figura 2: rappresentazione di una molecola di albumina con siti di legame per molecole e ioni trasportati

-Proteina di 580 aa; sintetizzata dal fegato (ne basta il 25%)

-Livello ematico normale: 3,5-5,0 g/dl

-Indicatore di stato nutrizionale (ma t1/2=15-19gg)

-Carrier di anioni, soprattutto bilirubina (che nei neonati può ledere i nuclei della base); acidi grassi

liberi; ormoni steroidei; cationi (Ca2+; Cu+/2+)

-Sorgente di aa per i tessuti periferici

-Agisce come tampone

-Proteina di fase acuta negativa (diminuisce nella flogosi)

Acidi grassi liberi si formano nel digiuno. l’albumina li porta al fegato che sintetizza nuovi

trigliceridi e li lega alle VLDL (utili per il miocardio).

Ci sono analbuminemie congenite senza edema (la sintesi di altre globuline plasmatiche mantiene la

pressione oncotica) ma con alterazione del metabolismo dei grassi.

Ca2+: 10 mg/% o 5 mEq/l legati per metà all’albumina. Questa metà è in effettiva; importante è la

componente libera. Il rapporto tra Ca2+ libero e legato dipende dal pH. Alterazioni dell’equilibrio

acido-base possono far associare Ca2+ e albumina portando ipocalcemia.

Cu+: 80 mg/l legato per il 10% all’albumina e per il 90% alla cerulo plasmina. Si lega a residui di

istidina (Hys). Dalla velocità di legame e dall’affinità dipende la biodisponibilità.

Iperalbuminemia, rara, dovuta a disidratazione

Ipoalbuminemia: (<3,2 g/dl) -epatopatie croniche

-malnutrizione

-edema (<2,5g/dl), ascite

-perdite intestinali

-malattie renali

-malattie cutanee secernenti

-ustioni

Bisalbuminemia: banda dell’albumina sdoppiata.

-Il paziente può averla parchè il fegato produce il 50% dell’albumina con 1aa diverso

(alloalbuminemia)

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-Può essere indotta da farmaci in caso di superdosaggio o da patologie quali ipotiroidismo e

pseudo cisti pancreatica.

2) zona elettroforicamente poco rilevante

- AAT (α1antitripsina)

- Responsabile del picco delle α1.

- E’ un inibitore delle proteasi seriche: - collagenasi ed elastasi nei processi infiammatori del

polmone (si può arrivare anche all’enfisema); funzione

primaria

- fattori della coagulazione; funzione secondaria

- Se il picco delle α1 è basso si richiede l’esame per sapere se c’è una mancanza congenita di AAT

(omozigosi per allele Z); α1antitripsina inferiore a 15% del normale.

- Livello ematico normale: 0,8-2 g/l

- ↑ in situazioni di flogosi causate da infezioni e necrosi dei tessuti.

- AAG (α1glicoproteina acida)

- Costituita per il 50% da glucidi e per il 50% da aa; particolarissima

- Non si conosce la sua esatta funzione.

- E’ un indicatore di fase acuta: - ↑ nei processi infiammatori, pare a causa della proliferazione

cellulare

- ↑ anche in gravidanza e nei tumori, non è un indice molto

sensibile

- è ↑ dai glucocorticoidi, nelle neoplasie, nelle flogosi, nello

stress chirurgico

- ↓ nelle epatopatie, nelle malattie renali, estrogeni

- AAC (α1antichimotripsina)

- Proteina che aumenta precocemente nelle reazioni di fase acuta

- α-fetoproteina

- Presente nel feto, diminuisce notevolmente dopo la nascita

- ↑Aumenta - in gravidanza, nell’epatocarcinoma e nel teratoma testicolare

- nel liquido amniotico e nel siero materno in caso di anencefalia e spina bifida

-↓Diminuisce - nel siero della madre se c’è trisomia 21 (Down)

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3) - HPT (aptoglobina)

- E’ una proteina di fase acuta

- ↑ nelle infiammazioni acute e croniche, nelle neoplasie e nelle nefrosi (per aumentata sintesi del

genotipo di HPT z-z che non passa il filtro renale)

- La sua principale funzione è però legare l’emoglobina libera a seguito di emolisi intravasale

(processo patologico) formando un complesso che non viene filtrato a livello glomerulare (in

corrispondenza del tubulo contorto distale e dotto collettore dove il pH si abbassa precipiterebbe

formando dei cilindri che possono danneggiare il rene). Il complesso HPT-Hb viene captato dal

fegato. se l’emolisi è eccessiva intervengono nell’ordine l’emopessina (si lega all’eme) e l’albumina

(metalbumina).

- ↓ in crisi emolitica, anemia, avvelenamento, valvole cardiache che lisano i globuli rossi.

- AMG (α2macroglobulina)

- E’ una proteina ad alto peso molecolare (fino a 1000000 Da)

- E’ un inibitore delle proteasi e controlla il C’

- Importante ad es. nella gestosi gravidica = ipertensione arteriosa in gravidanza. Renina- proteasi:

se non c’è più un inibitore la pressione arteriosa sale.

- ↑ nella sindrome nefrosica

- ↓ nella risposta di fase acuta, nelle pancreatiti, nel carcinoma della prostata.

- CER (ceruloplasmina)

- Proteina azzurra, se purificata, perché trasportatore di rame e responsabile della cupremia. Una

molecola lega 8 atomi di Cu (4Cu2+ o 4 Cu+).

- Ossida il ferro ferroso Fe2+ a ferro ferrico Fe3+ e altre molecole come ad es. neurotrasmettitori

(amine biologiche); è uno “scavenger” dell’O2¯.

- ↑ in gravidanza (bersaglio di estrogeni); nelle infiammazioni; neoplasie e leucemie come linfoma

di Hodgkin

- ↓ nel morbo di Wilson (alterazione del metabolismo del Cu con suo accumulo in rene, fegato,

cervello e degenerazione epatolenticolare) e in cirrosi giovanile.

- Se la cupremia è 30 mg/l (e CER è quindi nei limiti della norma) richiedere la cupruria (ricerca di

Cu nelle urine)

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4) - TRF (transferrina)

- METABOLISMO DEL FERRO:

Il ferro è introdotto con la dieta sotto forma di Fe alimentare.

Si lega a una FERRITINA intestinale (1 apoferritina lega 8 atomi di Fe) che lo trasporta

nell’eritrocita.

Sulla membrana basolaterale dell’eritrocita si trova la TRANSFERRINA, una proteina

abbondante (240 – 250 mg/dl).

Il Fe3+ lega la transferrina saturandola; essa lo trasporta nel torrente ematico.

In questi passaggi il ferro cambia valenza da Fe2+ a Fe3+.

- La ceruloplasmina ossida il ferro e permette che venga legato alla transferrina.

TRF + 2 atomi di Fe3+ → TRF diferrica (1/3 delle molecole)

TRF + 1 atomo di Fe3+ → TRF monoferrica (2/3 delle molecole)

TRF diferrica ha maggior attività nei confronti dei recettori periferici.

Tramite la circolazione sanguigna il ferro giunge al fegato.

- Nel fegato c’è lo scambio di Fe tra transferrina e ferritina epatica (di deposito); essa è responsabile

del mantenimento del 30% di saturazione della TRF, perché cede o acquista Fe a seconda che il

livello di saturazione sia minore o maggiore del 30%.

- Il midollo osseo è il principale bersaglio del ferro

- Tutte le cellule necessitano ferro per la sintesi di DNA e RNA (enzima ributile reduttasi riduce il

ribosio a desossiribosio)

- I recettori della TRF, presenti su tutte le cellule, captano il Fe ed entrano nella cellula dove

liberano il Fe per poi tornare al loro posto sulla membrana.

- Esiste a questo livello un meccanismo a feedback:

- Se nella cellula c’è poco ferro viene sintetizzato più recettore; i componenti del recettore

vanno in circolo e con gli esami si dimostra carenza di ferro

- se c’è troppo ferro il recettore è più lento nel trasportarlo all’interno della cellula.

- Sideremia normale: 50-100μg/dl

- Eritrociti anomali, diminuzione della sideremia, aumento della transferrina (con saturazione

<30%); verificare la ferritina circolante che rispecchia il livello di ferritina di deposito

- La ferritina si alza quando c’è un’infezione (come proteina di fase acuta); perciò si procede al

dosaggio dei recettori solubili della transferrina.

- Nelle malattie infettive la transferrina tende a diminuire

ANEMIA: condizione che si verifica quando:

- ↓ sideremia → < 30 – 40 μg/dl

- ↓ [Hb] di un globulo rosso → piccolo con volume < 80 MCV (volume corpuscolare medio)

- ↓ [Hb] totale del sangue

La situazione opposta è l’emosiderosi e si verifica se la sideremia è > 150 μg/dl.

La principale causa di anemia è la carenza di ferro; in questo caso si ha: - ↓ sideremia

- ↑ TRF

- ↓ saturazione TRF %

Non è però l’unica causa, anche infezioni croniche e neoplasia possono dare anemia, senza che ci

sia carenza di ferro: - ↓ sideremia

- ↓ TRF

- ↓ saturazione di TRF %

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Per verificare se ci sia un’anemia ci sono 3 livelli di indagine:

-1- Valutare TRF - TFR aumenta in stati ferrocarenziali, in gravidanza, nella terapia estro-

progestinica, anemia metaemorragica

- TFR diminuisce nelle sindromi protido-disperdenti, nelle anemie delle

malattie croniche (processi infiammatori e neoplastici), nelle epatopatie (per

diminuita sintesi epatica), malnutrizione, atransferrinemia congenita

-2- Valutare la [C] della ferritina circolante che rispecchia la [C] della ferritina di deposito. Se è

diminuita c’è anemia. Tuttavia essendo una proteina di fase acuta essa sarà

aumentata se c’è un’infiammazione, anche questa è accompagnata da anemia

-3- Ricercare i recettori solubili della TRF. Essi consentono di valutare il deficit di ferro a livello

cellulare. Riflettono il numero dei recettori cellulari. E’ un indice precoce

dello sviluppo di deficit funzionale di ferro rispetto ad altri indici quali la

ferritina. A differenza di quest’ultima si mantiene normale (3 -9 μg/l) nei

pazienti con infiammazioni, neoplasie e epatopatie ed è quindi un buon indice

di discriminazione tra anemia sideropenia e anemia delle condizioni croniche.

ANEMIA EMOLITICA: abnorme distruzione dei globuli rossi con:

- ↑ sideremia,

- ↓ TFR,

- ↑ % saturazione di TRF (tutta la TRF si satura)

C’è un sovraccarico di ferro e emosiderosi

SATURAZIONE TRF

Saturazione % = (ferro μg/dl / max[Fe] trasportabile dalle proteine) x 100

- 1 mg di transferrina lega 1,26 μg di ferro (total iron binding capacity)

- 300 mg TFR lega 375 μg di Fe (bisogna vedere la percentuale di saturazione)

- Valori di riferimento: 2-3,5 g/l

- Hb: definisce il grado di anemia e esprime a posteriori una misura quantitativa della gravità

della sideropenia. da solo è un dato poco specifico

- Sideremia: rappresenta il Fe3+ legato alla TRF. Indice sensibile negli stati di lieve

sideropenia 8deplezione totale delle riserve senza però ancora anemia). Ha però ritmo circadiano e

alta variabilità individuale (maschi: 70 – 200 μg/dl; femmine: 50 - 170 μg/dl)

↑ sideremia: condizioni iperemolitiche, epatopatie con citolisi, anemia sideroblastica,

siderocromatosi ereditaria

↓ sideremia: aumentata perdita (es. mestruazioni), diminuito apporto o assorbimento.

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- C’ (complemento)

- Il complemento è un sistema di diverse proteine di cui 9 sono le principali

- La frazione più abbondante è C3

- Il complemento si attiva per 2 vie: - classica: Ag+Ab+C1→C4+C2→C3(amplificazione)

↓

C5C6C7(MAC)

↓

C9(lisi cellulare)

- alternativa: parte dal C3b (con partecipazione di fattori B e D)

- Esami: - diminuzione di C3 e diminuzione di C4 → via classica

- diminuzione di C3 ma C4 normale → via alternativa

- Per attivare il C’ ci vogliono 2 IgG o 1 IgM;

CASCATA del COMPLEMENTO:

C1 si lega al complesso immune e si attiva (C1s) ad esterasi; scinde C4 in C4a (inattivo) e C4b che

lega C2 facendolo diventare substrato di C1s che lo scinde in C2b (inattivo) e C2a. Il complesso

C4b2a è l’enzima C3 convertasi (esterasi) che scinde C3 in C3a (talvolta dosato come espressione

di scissione di C3) e C3b che unito alle precedenti frazioni dà vita all’enzima C5- convertasi della

via classica (C4b2a3b). La C5-convertasi scinde C5 in C5a (inattiva) e C5b.

Il complesso C4b2a3b5b per via non enzimatica lega in successione C6, C7 con passaggio del

complesso da stato idrofilo a idrofobo rendendolo adatto a inserirsi nel doppio strato lipidico della

membrana cellulare. L’ingresso di C8 e C9 permette la formazione del poro sulla membrana e

successiva lisi cellulare.

- La concentrazione del terzo componente del complemento (C3), determinata nel siero, è

considerata un indicatore di rischio dell’infarto del miocardio; infatti, esso si correla positivamente

con il colesterolo-LDL ed è prodotto dai macrofagi probabilmente durante la captazione di

lipoproteine LDL ossidate.

- C3 aumenta per blocco del suo catabolismo (blocco C3 e C3b); nella cirrosi biliare primitiva e

nelle colestasi gravi; in reazione di fase acuta

- C3 e C4 diminuisce (per attivazione del C’ per via classica) in lupus eritematoso sistemico;

poliartrite cronica primaria; anemie emolitiche autoimmuni; gastrite atrofica; glomerulonefrite

membranosa

- C3 diminuisce e C4 normale (C’ attivato per via alternativa) indice di malattie infettive

- Valori di riferimento: C3: 0,90-1,80g/l

C4: 0,10-0,40g/l

- Nell’elettroforesi su plasma tra β e γ si forma la banda del fibrinogeno;

nell’elettroforesi su siero no.

- FIB (fibrinogeno)

- molecola complessa costituita da 2 coppie di 3 catene α, β, γ.

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- implicata nell’emostasi

5) - Ig (immunoglobuline)

- Le immunoglobuline sono un gruppo di proteine eterogenee, che migrano principalmente nella

zona γ, ma anche nella zona β e più raramente nella zona α; costituiscono gli anticorpi umorali,

prodotti dalle plasmacellule che derivano dai linfociti B attivati.

- Esistono 5 classi di immunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) con struttura molecolare simile: 2

catene pesanti (γ,α,μ,ε,δ) e 2 catene leggere (κ,λ). - Le IgG sono quelle a maggiore concentrazione nel siero

- IgG: 0,6 – 1,8 g/dl

- IgA: 0,08 – 1,9 g/dl

- IgM: 0,09 – 0,4 g/dl

- Se sono aumentate le IgM l’infezione è in atto o recente

- Se sono aumentate le IgG l’infezione è pregressa (cicatrice sierologica)

- Le IgM sono pentameri; le IgA dimeri (uniche Ig secretorie, presenti nel latte, nella saliva, nel

muco, nelle secrezioni intestinali); le IgG sono le uniche Ig che passano dalla madre al feto

attraverso la placenta (il bambino nasce con le IgG materne e assume le IgA del latte); le IgE sono

usate per quantizzare le allergie di I tipo (ipersensibilità di tipo I): il frammento Fc delle IgE si lega

alle mastcellule piene di granuli di istamina.

Esistono 3 principali tipi di allergia: - allergie alimentari

- allergie da contatto (polline, via cutanea)

- allergie ai farmaci (es. alla lidocaina - anestetico – non

prevedibile)

- Test che identificano prima le IgE generali, poi le IgE specifiche.

- Dalla ventesima settimana c’è un brusco aumento delle IgG materne che passano la barriera

placentare.

Comincia la sintesi da parte del feto delle IgM.

Al momento del parto le IgG materne diminuiscono e scompaiono all’ottavo mese.

Aumentano le IgM, IgG e IgA del bambino, ma fondamentali sono le IgA materne trasmesse con il

latte.

Se c’è infezione intrauterina le IgM alla nascita sono elevate.

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Figura 3: sviluppo sistema immunitario dal concepimento a 6 mesi di vita

- In condizioni normali la proporzione nella produzione di catena pesante e leggera è 1:1.

- Nel mieloma la plasmacellula sintetizza più catene leggere di quelle pesanti; catene leggere libere

in forma dimerica→proteinuria dio Bence-Jones (catene leggere-140aa-di IgG precipita a 60°-80°)

- γ-patie policlonali: l’aumento delle proteine della zona γ si estende a tutto il tratto della zona

- epatopatie

- malattie del collageno

- infezioni

- γ-patie monoclonali: si osserva un picco ristretto nella zona γ

QUADRI CLINICI TIPICI:

- LES (Lupus Eritematoso Sistemico), malattia autoimmune

-↓C3,C4; ↑PCR; γ-patia policlonale

- IMMUNODEFICIENZA

-alta la banda α1 e α2 basse o in tracce IgG, IgA, IgM

- SINDROME NEFROSICA

-alta la α-macroglobulina

La terapia sostitutiva con estrogeni (sia terapeutica che anticoncezionale) simula una reazione di

fase acuta: -↑TFR, HPT, α1, α2, AAT, CER.

-MIELOMA MULTIPLO

-es. ↑IgG e soppressione di IgM e IgA γ-patia monoclonale

- Il siero del neonato ha elevati livelli di PCR, α-macroglobulina, α-antitripsina; se sono elevate

anche IgM e IgA è in corso un’infezione.

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10

20

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40

50

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70

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90

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30

IgG materne

IgM fetali

IgG fetali

IgAs meterne

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INDICAZIONI allo STUDIO delle PLASMAPROTEINE

1- Presenza componenti monoclonali

2- Presenza e severità di un processo flogistico (se ↑ PCR)

3- Aumento turnover eritrocitario (vedere TRF, saturazione, HPT- anemia emolitica)

4- Attivazione del complemento (dosare C3 e C4 → malattie autoimmuni)

5- Perché la VES è aumentata (associata a ↑ FIB o ↑ proteine di fase acuta)

6- Stato nutrizionale (se l’albumina scende c’è un grave carente stato nutrizionale, doso ALB,

pre-ALB, RBP, TRF))

7- Patologie da deficit di proteine specifiche (AAT → enfisema, CER → morbo di Wilson)

8- Follow-up e controllo dell’efficacia della terapia

Capitolo 1.1

COMPONENTE

MONOCLONALE

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COMPONENTE MONOCLONALE

Picco γ causato da:

- iperproliferazione di un clone di plasmacellule

- sintesi di Ig omogenee per struttura e specificità

- deficit a carico delle altre Ig

Più del 95% dei soggetti ha una componente monoclonale <15 g/l

Il 92% dei soggetti ha una componente monoclonale <10 g/l

Il rischio di progressione è strettamente associato con la componente monoclonale.

CONDIZIONI ANOMALE ASSOCIAT E alle Ig

- MGUS: gammopatia monoclonale di incerto significato

Benigno. Si ha nel 99% dei casi (IgM, IgG, IgA o IgD)

- MIELOMA MULTIPLO: riguarda IgA e IgG. Nel MM il rapporto tra catene H e L è >1:1.

Ci sono catene L singole o dimeriche libere nel sangue. Nelle urine si ritrovano le proteine

di Bence-Jones. Il clone invade il midollo osseo provocando anemia, leucopenia e difficoltà

alla coagulazione.

- MACROGLOBULINEMIA di WALDENSTRÖM: linfoma che riguarda le IgM

MALATTIE CAUSATE da Ig

- CRIOGLOBULINEMIA I e II: sono Ig che precipitano ad una temperatura compresa tra 4

e 37 °C. Possono essere costituite da Ig singole monoclonali, Ig monoclonali con attività

anticorpale verso Ig policlonali, Ig policlonali miste. causa della precipitabilità: forse

contenuto ridotto in carboidrati.

- AMILOIDOSI: deposizione

IMMUNODEFICIENZE

- AIDS è la più comune

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STIMOLAZIONE CRONICA

- Malattie autoimmuni (LES, artrite reumatoide)

- Infezioni croniche

TRANSIENTI

- Infezioni pediatriche

- Passaggi neonatali dalla madre

- Infezioni virali

- A seguito di un trapianto di midollo

- Ipersensibilità ai farmaci (soprattutto sulfamidici)

- MGUS è l’unica condizione benigna; come differenziarla dalle altre e specialmente dal MM

(mieloma multiplo)?

3 parametri: - % di plasmacellule nel midollo

- proteine circolanti nel siero

- manifestazioni cliniche

MGUS MIELOMA

MULTIPLO

MACROGLOB. di

WALDENSTRÖM

AMILOIDOSI

PRIMARIA

% plasmacellule <10 ≥10 ≥10 <10

% proteine <3 ≥3 ≥3 <3

sintomatico NO SI SI SI

Secondo uno studio americano i soggetti con MGUS sono a rischio per lo sviluppo del mieloma.

Qual è il rischio reale?

L’unico fattore di rischio accertato per la progressione di MGUS a MM è la [C] di CM:

↑ CM → ↑ rischio

Sospetto di MGUS; TEST RACCOMANDATI:

- Visita

- Emocromo

- Siero, calcio, creatinina

- Elettroforesi del siero → proteine totali

- Elettroforesi delle urine → secrezione proteine nelle urine delle 24h

- Immunofissazione del siero e delle urine → per discriminare CM

- Catene L (κ e λ); non è un esame standard

- Esame del midollo osseo Non si eseguono se CM<1,5 g/dl perché troppo invasivi

- Biopsia dello scheletro

Se la componente monoclonale è >15 g/l si proceda con: → biopsia ossea

→ radiografia dello scheletro

PATOLOGIA INCIDENZA

MGUS (> o = 50 anni) 3,2%

Mieloma multiplo 40 /(milione di persone per anno)

AL amiloidosi 8,9 /(milione di persone per anno)

Waldenström (maschi) 3,4 /(milione di persone per anno)

Waldenström (femmine) 1,7 /(milione di persone per anno)

Per diagnosticare mieloma: - CM in siero e/o urine + plasmacellule nel midollo

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e uno dei seguenti:

- Calcium elevation

- Renal insufficiency

- Anemia

- Bone desease

- MIELOMA MULTIPLO (MM)

Massa clonale Citochine Componente M - anemia - anemia - rene da mieloma

- citopenia - distruzione osso - iperviscosità

- plasmocitoma - reazione di fase acuta - immunodeficienza

- immunodeficienza - immunodeficienza

Il soggetto con mieloma deve essere trattato solo se sintomatico

AMILOIDOSI

- Clone molto piccolo che produce una proteina molto tossica.

- Amiloidosi: deposito extracellulare di proteine autologhe che si riuniscono in fibrille con struttura

a foglietto β causando un danno funzionale e strutturale dell’organo coinvolto. Le proteine tendono

ad aggregare perché nella struttura β sono termodinamicamente meno stabili rispetto alle proteine

normali. Stimoli principali: T°C, pH, ioni metallici, ossidazione.

- Amiloidosi più diffusa è l’Alzheimer

- L’amiloidosi deriva dall’azione proteolitica su un precursore che nel caso delle gammopatie sono

le catene L prodotte dalle plasmacellule

CAUSA BASILARE:

- La amiloidosi si basa sul fatto che una proteina può assumere 2 conformazioni diverse: una ad α

elica (non tossica) e una a β foglietto ripiegato (tossica); la quale provoca una malattia simile a

quella dei prioni (PrP) per eziologia.

- Birifrangenza verde mela con luce polarizzata dopo colorazione rosso congo; fibre non ramificate

con diametro di 10 nm

- Alcune forme di amiloidosi sono localizzate, altre sistemiche. si classificano sulla base della

proteina coinvolta:

- Proteine amiloidi: - β → Alzheimer

- PrP → encefalopatie spongiformi

- L (catene leggere immunoglobuline monoclonali) → sistemica

- Nell’80% dei casi catene libere leggere λ che si depositano nei tessuti tranne il cervello

- Macroglossia (12% dei pazienti con amiloidosi)

- Porpora periorbitaria (6%); aspetto tipo procione (lesione periorbitaria, rottura di piccoli vasi)

- Pseudoipertrofia muscolare (<1%)

- Lesioni alle unghie (2-3%)

- Shoulder pad

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DIAGNOSI

- Aspirato in regione periombelicale con ago sottile e colorazione.

- Identificare e caratterizzare CM con elettroforesi ad alta definizione su agarosio o capillare

associata a immunofissazione.

Nel 56% dei pazienti con AL non si vede niente sul tracciato elettroforetico. L’immunofissazione

aumenta di 10 volte la sensibilità dell’elettroforesi

PROTEINA di BENCE-JONES (BJ)

Proteina costituita da catene leggere libere monoclonali secrete da cellule B. E’ stato il primo

marcatore di neoplasia scoperto. Il clone può essere sia maligno (solitamente associato a MM) che

benigno (associato a MGUS)

Cenni storici. La proteina di BJ fu osservata per la prima volta da un medico inglese (Watson) in

urine riscaldate. Il calore denatura le proteine le quali precipitano. L’ALB forma un precipitato che

non si scioglie mai; la proteina di BJ ha, invece, un comportamento particolare: verso la

temperatura di 60°C sii forma il precipitato, che però si scioglie se continuiamo a riscaldare

(T≈90°C) per poi riformarsi nuovamente durante il raffreddamento. Il dottore parlò di questa sua

scoperta al dr Bence-Jones che se ne attribuì il merito in una pubblicazione.

Le catene leggere possono essere di tipo κ o λ. si ritrovano entrambe in queste proporzioni 2/3 di

catene κ e 1/3 di catene λ. Le catene λ formano dei dimeri che filtrano meno facilmente dei cloni κ

nelle urine. Come risultato si avrà - una % maggiore di cloni λ nel siero

- una % maggiore di cloni κ nelle urine

Tutti gli individui producono catene leggere in eccesso. Si ha quindi una perdita giornaliera

fisiologica di catene libere policlonali (PELC) di circa 5-10 mg/die. Esse formano piccole bande

oligoclonali sul tracciato elettroforetico delle urine. Si parla anche di tracciato a scala.

MALATTIE ASSOCIATE a BJ-P

- Comuni: - mieloma multiplo

- amiloidosi AL

- morbo di Waldenström

- malattia da deposito

- Rare - linfoma

- leucemia linfatica cronica

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- idiopatie (benigne o di incerto significato)

Le proteine di BJ vanno ricercate nelle seconde urine del mattino tramite un’elettroforesi seguita da

immunofissazione. Gli antisieri utilizzati sono anti-κ, anti-λ totali con l’aggiunta dell’antisiero anti-

CH della CM.

Da 3 anni esiste un test, chiamato FREELITE, che consente di valutare il rapporto κ/λ delle catene

leggere libere nel siero. E’ un test di routine per pazienti con gammopatie monoclonali.

TEST da SCORAGGIARE (inadatti per la ricerca di proteine di BJ)

- proteine totali nelle urine (precipitazione, legame col colorante [dye binding]; test poco

sensibile)

- stick delle urine (sostanza che cambia colore in presenza di proteine acide come l’ALB e

non “vede” le proteine di BJ)

- test al calore (heat test); poco sensibile e poco specifico.

Sensibilità dei diversi metodi

- IFE: 1 proteina su 102- 10

3 ← STANDARD

- citogenetica e southern blot: 1 su 102

- FISH in interfase: 1-5 su 103

- citofluorimetria: 1-5 su 103 - 10

4

- PCR: 1 su 105- 10

6

Capitolo 1.2

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18

TECNICHE

ELETTROFORETICHE

ELETTROFORESI

L’elettroforesi consiste nella migrazione di particelle elettricamente cariche in un campo elettrico E.

Nel plasma a pH 7,4 le proteine che hanno punto isoelettrico minore del pH fisiologico si

dissociano come anioni. Poste in E migrano verso il polo + con velocità che dipende:

- dalla carica elettrica direttamente proporzionali alla v di

- dalla forza di E migrazione

- dimensione e forma della molecola

- proprietà del mezzo di supporto inversamente proporzionali alla

v di migrazione

TIPI di SUPPORTO: sono vari; i principali sono agarosio, gel di poliacrilamide o soluzioni.

Permettono la separazione in base a carica e dimensione. Spesso si aggiunge un detergente carico

negativamente (sodio dodecilsolfato) che eguaglia le cariche di superficie e consente la separazione

solo sulla base della dimensione molecolare.

Dopo la separazione le proteine vengono evidenziate con opportune colorazioni.

Un particolare tipo di elettroforesi è l’ELETTROFORESI CAPILLARE. In essa la separazione

elettroforetica avviene in un tubo di silice fusa lungo 30-50 cm e diametro compreso tra 10 e 75 μm.

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19

Il tubo è riempito con una soluzione tampone. Le due estremità del capillare sono immerse in due

provette contenenti lo stesso tampone. la separazione avviene in seguito all’applicazione di una

differenza di potenziale tra le due estremità. La v delle particelle è in funzione del rapporto

carica/massa. Le proteine cariche negativamente sono attratte dall’anodo (+). Tuttavia all’interno

del capillare si sviluppa anche un flusso del tampone in direzione del catodo (‒ ). Tale fenomeno è

chiamato ELETTROENDOSMOSI. Esso è dovuto alla presenza di gruppi carichi negativamente

sulla superficie del capillare (neutralizzati da una “nuvola” di cariche positive. Quando si applica

una d.d.p. ioni positivi sono attratti dal catodo e, migrando, trascinano con sé la soluzione in cui

sono immersi.

- il capillare è in silice e ha cariche negative che vengono neutralizzate da ioni positivi

- applicando una differenza di potenziale (V) gli ioni vanno verso il catodo (flusso osmotico,

trasporto di acqua) e le proteine verso l’anodo

- Il flusso endosmotico vince sulla forza elettroforetica perciò tutte le proteine vanno verso il catodo

(negativo)

- Ig → carica + migrano verso il catodo

- ALB → carica ‒ trascinata dal flusso endosmotico verso il catodo

VANTAGGI: è un metodo automatizzabile; limite CM>0,5 g/l; utile nel monitoraggio dopo una

terapia.

SVANTAGGI: non consente l’immunofissazione; la CM può scomparire perché interagisce col

capillare. E’ un’eventualità rara, ma possibile, che può portare a una diagnosi totalmente errata.

Ricordare che CM può migrare fino a zona α2 (IgA)

Al posto dell’immunofissazione, dopo elettroforesi capillare è possibile applicare il metodo

dell’immunosottrazione (IF-ES) che permette di valutare il contributo di ciascuna Ig al picco γ:

classi e tipi di Ig sono rimossi dal campione usando Ab anti-Ig specifici per IgG, IgA, IgM, λ e κ.

Dopo l’aggiunta di ogni Ab si ripete l’elettroforesi per valutare come si è modificato il tracciato.

Campione da testare → aggiungo Ab-anti-IgG Figura 4: immunosottrazione (IF-ES)

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4

IgG

IgM

IgA

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20

Campione senza IgG +

precipitato IgG-anti-IgG

IMMUNOFISSAZIONE (IFE): rende 10 volte più sensibile l’elettroforesi (perché aumenta la

quantità di proteina presente). tecnica usata per caratterizzare e quantificare una proteina.

Procedimento: - elettroforesi

- aggiunta di un Ab specifico per un CM, incubazione

- eseguire ripetuti lavaggi delle proteine che non hanno reagito

- evidenziare la banda di immunoprecipitazione con opportuna colorazione

La quantificazione della banda è eseguita con tecniche di densiometria

Capitolo 2

0

0,5

1

1,5

0 1 2 3 4

IgM

IgA

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21

LIPIDI SIERICI

LIPIDI SIERICI E RISCHIO ATEROSCLEROSI

Attualmente la principale causa di mortalità nei paesi sviluppati sono le malattie cardiovascolari.

Esse sono un disordine generalizzato delle arterie caratterizzato dalla formazione e progressivo

accrescimento di placche ateromasiche culminanti con l’occlusione parziale o totale del lume

vasale.

A seguito dell’occlusione si forma un danno ischemico la cui gravità è proporzionale alla natura

dell’arteria coinvolta.

I distretti più frequentemente coinvolti sono: - le coronarie

- le carotidi e il circolo cerebrale

- arterie degli arti inferiori

L’aterosclerosi interessa l’intima e la media delle arterie e consiste in accumulo vascolare di lipidi,

danno e attivazione endoteliale, attivazione e adesione piastrinica, infiltrazione infiammatoria,

proliferazione di cellule muscolari lisce e loro degenerazione in “cellule schiumose” (cappello

fibroso + core lipido-necrotico) e sovrapposizione di complicanze trombotico-occlusive. C’è una

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22

correlazione tra il fenomeno infiammatorio (quantificato dosando la CRP) e l’infarto. La placca da

sola è asintomatica.

I lipidi sierici - aumentano nelle patologie degenerative (neoplasie e aterosclerosi)

- sono diminuiti ma stanno riaumentando nelle patologie infettive

ATEROSCLEROSI: - angina pectoris

- morte cardiaca acuta

- infarto del miocardio

FATTORI di RISCHIO:

- MAGGIORI- -PREDISPONENTI- -CONDIZIONALI-

- iperlipidemia - sovrappeso - ipertrigliceridemia

- fumo di sigaretta - inattività fisica - elevati livelli di Lp(a)

- ipertensione - storia familiare - elevati livelli di

- diabete omocisteina

-età avanzata - elevati livelli di

- gotta e iperuricemia fibrinogeno

- marcatori infiammatori

LIPIDI di INTERESSE CLINICO

--COLESTEROLO TOTALE

≤200 mg/dl ; se colesterolo >240 mg/dl → rischio elevato

se colesterolo <150 mg/dl è basso; > 350 mg/dl è aterogeno

per valori compresi tra 150 e 350 il rischio è determinato dalla quantità di HDL

disponibile (importante per sequestrare il colesterolo trasportato dalle LDL)

--HDL

La [HDL] plasmatica è inversamente correlata all’insorgenza di malattie cardiovascolari.

HDL ha un ruolo nel trasporto retrogrado del colesterolo, forse ha proprietà antiossidanti e

antiinfiammatorie.

VALORI di HDL

basso medio alto

maschi <35 35-55 >55

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femmine <45 45-65 >65

Nelle donne la stimolazione da parte degli estrogeni promuove un aumento delle lipoproteine HDL;

effetto analogo è dato dall’assunzione di livelli moderati di vino rosso (paradosso francese)

--LDL

Elevate concentrazioni di colesterolo LDL producono un aggravamento del rischio cardiovascolare.

- LDL > 130 mg/dl → valore di ALLARME

- LDL < 100 mg/dl → se ci sono già stati problemi coronarici

Valori molto elevati di LDL si riscontrano nelle varie forme di iperlipidemia, ipercolesterolemia

familiare, ipotiroidismo, sindrome nefrosica, ostruzione biliare, gravidanza.

Esistono due differenti forme di LDL che hanno potenzialità aterogene diverse.

- Fenotipo A: lipoproteine grandi e poco dense

- Fenotipo B: lipoproteine piccole e dense

Il fenotipo B ha un rischio aterogeno 3 volte superiore al fenotipo A.

la predominanza del fenotipo B è ereditaria ed è una condizione denominata

PROFILO LIPOPROTEICO ATEROGENO (PLA); è un quadro caratterizzato da:

- LDL a fenotipo B che si accumulano più facilmente delle A nell’intima delle arterie

- LDL più ricche in fosfolipasi AL e più suscettibili all’ossidazione

- ridotta concentrazione di HDL soprattutto fenotipo 2b, che sono le più efficienti nel

trasporto inverso del colesterolo

- ridotto potenziale fibrinolitico

- maggiore incidenza di diabete di tipo 2

- ipertrigliceridemia

Questo quadro è presente almeno nel 50% dei soggetti con malattie cardiovascolari.

La valutazione del fenotipo LDL non è un esame esteso a tutta la popolazione e non è eseguibile in

tutti i laboratori, ma solo in centri altamente specializzati.

--TRIGLICERIDI

Tra ipertrigliceridemia e rischio di malattie cardiovascolari esiste un’associazione; tuttavia non è

chiaro se essa è imputabile ai trigliceridi stessi e alle lipoproteine che li trasportano o ai disordini

metabolici associati all’ipertrigliceridemia.

- trigliceridi > 150 mg/dl → soglia di rischio (spia di altre alterazioni metaboliche

potenzialmente aterogene come ↑ LDL

- trigliceridi > 200 mg/dl → rischio indipendente

Esiste un dimorfismo sessuale nella concentrazione dei trigliceridi:

- fino ai 20 anni uguale nei 2 sessi

- nella vita adulta è superiore nell’uomo

- dopo la menopausa uomo e donna tornano ad avere gli stessi valori

L’ipertrigliceridemia è presente più facilmente in obesi, sedentari, iperlipidemie familiari,

pancreatiti, diabete di tipo 2, insufficienza renale cronica, abuso di alcool, fumo di sigaretta,

gravidanza.

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24

Capitolo 2.1

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LIPOPROTEINE

e

DISLIPIDEMIE

METABOLISMO e STRUTTURA delle LIPOPROTEINE

I lipidi sono sostanze apolari, non solubili nel plasma. Vengono trasportati dalle lipoproteine,

molecole sferiche che presentano un involucro esterno composto da fosfolipidi (bipolari),

apoproteine e colesterolo libero (dà stabilità alla struttura). La struttura delle lipoproteine ricorda

quella della membrana cellulare. Il core della molecola è costituito da colesterolo esterificato e

trigliceridi. Esistono differenti classi di lipoproteine suddivise in base alla composizione chemica e

alla densità.

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- CHILOMICRONI: lipoproteine sintetizzate nella mucosa intestinale costituite da una

piccola frazione proteica di apoB48, apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII. trasporta trigliceridi

alimentari e vitamine liposolubili.

la proteina ApoB (proteina principale del metabolismo lipidico) consta di due isoforme:

- ApoB48: di origine intestinale per trasporto di lipidi di provenienza alimentare

- ApoB100: sintetizzata nel fegato, si trova nelle LDL per trasporto dei lipidi

endogeni

Derivano dalla trascrizione di un singolo gene, per modificazione post-trascrizionale si

differenziano.

dal lume intestinale i chilomicroni passano nel sistema linfatico e da qui nella circolazione

sanguigna tramite il dotto toracico. Così facendo assicurano la disponibilità di grassi ai tessuti

periferici.

in circolo subiscono due modificazioni principali:

-1-IDROLISI dei trigliceridi ad acidi grassi e glicerolo (gli ac. grassi sono la forma in cui i

lipidi sono ceduti ai tessuti) ad opera della lipoproteinlipasi (LPL) endoteliale.

-2-SCAMBIO di alcune apolipoproteine: rilasciano apoAI e apoAIV e si arricchiscono di

apoC e apoE

Il complessivo impoverimento di trigliceridi dei chilomicroni si associa a una serie di

trasformazioni biochimiche che portano a due prodotti di degradazione:

-1-RENMANTS: molecole con core centrale di natura lipidica captati e distrutti dal fegato

(recettore per le LDL legato ad apoE del chilomicrone)

-2-HDL NASCENTI: precursori delle HDL plasmatiche

- VLDL, IDL, LDL: le VLDL sono precursori di tutte le lipoproteine a bassa densità

circolanti. Sono sintetizzate dal fegato e costituite principalmente da trigliceridi e colesterolo

endogeno. il dominio proteico è quasi esclusivamente rappresentato da ApoB100. Se si squilibra il

processo di idrolisi dei chilomicroni e sintesi delle VLDL si ha la steatosi. le VLDL sono secrete nel

torrente ematico dove subiscono due modifiche:

-1-azione dell’enzima CEPT (proteina di trasporto specifica per il colesterolo esterificato)

che catalizza il trasferimento dei trigliceridi alle HDL in scambio con colesterolo

esterificato. VLDL si trasformano in particelle più piccole e dense.

-2-scambio di apolipoproteine: ApoE e ApoC sono trasferite alle VLDL dalle HDL. ApoCII

attiva la LPL che idrolizza i trigliceridi ancora presenti trasformando le VLDL in molecole

più dense, le IDL (intermediate density lipoproteins)

Le IDL sono molecole molto instabili; per questo motivo devono essere presenti in quantità molto

bassa e rapidamente convertite in LDL. Il processo di conversione in LDL coinvolge CEPT o in

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27

alternativa l’enzima LIPASI EPATCA, che eliminano i trigliceridi rimasti e la cessione di ApoE e

ApoC alle HDL2.

Le LDL sono quindi lipoproteine contenenti colesterolo esterificato e con un dominio proteico

costituito prevalentemente da ApoB100. Le LDL hanno un recettore periferico che al legame con

LDL la interna lizza e prende il colesterolo in essa contenuto (che viene esterificato;

contemporaneamente si blocca la sintesi di colesterolo endogeno e dei recettori per le LDL). Se le

LDL sono troppe esse si legano anche a recettori non specifici (scavenger) e nella cellula si

accumula colesterolo (cellula schiumosa)

- LPL: la sua attività è dipendente da ApoCII (fegato, endotelio, muscolo, tessuto

adiposo)

- LIPASI EPATICA: la sua attività è indipendente da ApoCII (fegato, surrene, ovaie)

- HDL: complesso costituito da un eterogeneo gruppo di particelle adibite al trasporto di

colesterolo libero, esteri del colesterolo e trigliceridi. Presentano apolipoproteine interscambiabili

(tipi A, C, D, E).

Ci sono due classi principali suddivise sulla base della componente apolipoproteica:

- HDL2: contengono ApoAI e ApoAII

- HDL3: contengono ApoAI

Sono sintetizzate prevalentemente nel fegato e nell’intestino. La loro funzione fondamentale è

opposta a quella delle LDL: trasportano lipidi dalla periferia al fegato.

Esse si legano alla superficie cellulare tramite un recettore scavenger (non specifico) che interagisce

con ApoAI e assumono il colesterolo in eccesso nella cellula.

Ci sono due enzimi fondamentali nel metabolismo delle HDL:

- LCAT (lecitina-colesterolo-acil-transferasi): trasferisce un gruppo acilico

(ac.grasso) dalla lecitina sierica al colesterolo con formazione di lisolecitina e esteri

del colesterolo

- CEPT: trasferisce esteri del colesterolo da HDL2 a VLDL in cambio di trigliceridi,

con contemporanea cessione di ApoC e ApoE alle VLDL

L’azione di questi due enzimi è responsabile di un metabolismo delle HDL che assume una forma

ciclica:

pre-β-HDL

(proteina nascente)

CEPT LCAT

HDL2 HDL3

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28

LCAT

L’HDL nascente è sottoforma di pre-β-HDL di forma discoidale; LCAT, favorendo l’ingresso di

colesterolo esterificato nella molecola, ne permette l’accrescimento (abbandono della struttura

discoidale per quella sferica) con trasformazione in HDL3 e HDL2. CEPT, invece, rimuovendo

colesterolo fa assumere a HDL2 una struttura più simile a quella delle pre-β-HDL.

Il fegato capta il colesterolo delle HDL in tre modi:

- capta le VLDL; è il colesterolo che esse hanno assunto dalle HDL2

- capta le HDL tramite recettori specifici

- capta le HDL che contengono ApoE per la stessa via dei chilomicroni

E’ importante studiare il rapporto HDL/LDL e in particolare ApoAI/ApoB100 per quantizzare il

flusso di colesterolo in ingresso e in uscita dalla cellula

-ApoAI = 20 mg persona normale

-ApoB100 = 80 mg persona a rischio

Tabella riassuntiva

PROTEINA DOVE SI TROVA FUNZIONE

ApoAI HDL Attiva LCAT

ApoAII HDL

ApoB48 Chilomicroni

ApoB100 VLDL, IDL, LDL

ApoCI Chilomicroni, VLDL, HDL Attiva LPL

ApoCII Chilomicroni, VLDL, HDL Attiva LPL

ApoCIII Chilomicroni, VLDL Attiva LPL

ApoD HDL, VLDL

ApoE Chilomicroni, VLDL, LDL,

HDL

- Lipoproteina (a) [Lp(a)]: variante genetica delle LDL da cui differisce per la presenza di

una molecola denomina apolipoproteina(a) (apo-a) legata mediante un ponte disolfuro al dominio

proteico della ApoB100. E’ prodotta dal fegato e immessa nel circolo ematico. A causa di apo-a la

sua affinità per il recettore delle LDL è pari al 25% e quindi rimane in circolo più a lungo rispetto

alle LDL con maggiore probabilità di:

- essere ossidata

- essere captata da recettori scavenger (i più pericolosi nella

patogenesi dell’aterosclerosi perché non regolati)

La Lp(a) può indurre danno endoteliale, favorisce l’accumulo di colesterolo, promuove

complicanze trombotiche nella placca poichè ha un’azione anti-fibrinolitica in quanto è un analogo

strutturale del plasminogeno e compete con quast’ultimo per i recettori sulla fibrina.

-Lp(a) = 25-30 mg/dl soggetto normale

-Lp(a) > 30 mg/dl soggetto a rischio

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Pare che la [Lp(a)] sia geneticamente determinata e poco modificabile con interventi dietetici e

farmacologici.

Non consigliato lo screening di massa, ma il dosaggio è raccomandato per i pazienti ad alto rischio,

in modo tale da impostare una terapia più aggressiva nei confronti di altri fattori di rischio

modificabili con un trattamento.

OSSIDAZIONE LDL

Le LDL in circolo possono subire una reazione di ossidazione da parte di MIELOOSSIDASI

circolanti o CERULOPLASMINA. La LDL ossidata ha un elevatissimo potenziale aterosclerotico

in quanto si lega unicamente ai recettori scavenger (che non hanno il meccanismo a feedback di

regolazione). E’ un meccanismo privo di controllo, che non può essere arginato dalle HDL. Il

laboratorio ancora non dosa le LDL ossidate.

- OMOCISTEINA: è un amminoacido contenente zolfo derivante dal metabolismo della

metionina. Elevati livelli di omocisteina nel sangue sono correlati positivamente con un’incidenza

maggiore di eventi cardiovascolari precoci. Essa infatti è in grado di promuovere danno endoteliale,

proliferazione della componente cellulare del vaso, innalzamento del potere aterogeno delle

lipoproteine (specialmente Lp(a)).

I principali determinanti della [omocisteina] nel sangue sono la VITAMINA B e i FOLATI, enzimi

indispensabili nel suo metabolismo. Particolare attenzione meritano quindi gli stati di carenza.

-[omocisteina] < 10 μmol/l soggetto normale

-[omocisteina] tra 16 e 30 μmol/l moderata iperomocisteinemia

-[omocisteina] tra 31 e 100 μmol/l intermedia iperomocisteinemia

-[omocisteina] > 100 μmol/l severa iperomocisteinemia

- FIBRIONGENO: Elevati livelli di fibrinogeno nel sangue sono correlati positivamente

con un aumento di rischio di malattie cardiovascolari. Molteplici le cause: maggiore è il fibrinogeno

presente, maggiori le dimensioni del trombo; il fibrinogeno inoltre promuove la proliferazione della

componente cellulare dei vasi, l’accumulo di lipoproteine nella sede del danno endoteliale,

l’aggregazione piastrinica. Ci sono perplessità nell’uso del fibrinogeno quale indicatore di danno

cardiovascolare.

-fibrinogeno compreso tra 150 e 400 mg/dl normale

DISLIPIDEMIE

Le dislipidemie possono essere di 5 tipi:

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30

- I tipo: caratterizzato da ↑ trigliceridi, colesterolo normale perché i chilomicroni non sono

idrolizzati. I pazienti si questo tipo non sono ad alto rischio.

- II tipo: dislipoproteinemia

- tipo 2a: ↑↑colesterolo; trigliceridi normali

- tipo 2b: ↑↑colesterolo; ↑ trigliceridi

Sono pazienti ad alto rischio

- III tipo: ↑colesterolo; ↑trigliceridi; mancanza o malfunzionamento dei recettori per le

ApoE. Parziale demolizione delle VLDL con formazione delle IDL.

Pazienti ad alto rischio

- IV tipo: colesterolo normale; ↑↑trigliceridi; accumulo di trigliceridi dovuto alle VLDL.

Sono pazienti che solitamente diventano diabetici. Nella terapia togliere i carboidrati

Importante distinguere tra tipo I e tipo IV

-V tipo: ↑ o normalità colesterolo; ↑↑↑trigliceridi; somma dei difetti I e IV = accumulo di

chilomicroni e VLDL. La dieta deve coinvolgere sia i lipidi che i carboidrati.

ELETTROFORESI delle LIPOPROTEINE

E’ possibile avere un tracciato elettroforetico delle lipoproteine che permette di distinguere le

dislipidemie di tipo I, IV e V.

Capitolo 3

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31

ENZIMI

nella

DIAGNOSTICA

ENZIMI NELLA DIAGNOSTICA

Alcuni enzimi sono importanti segnali di malattia. Essi hanno, in condizioni normali, una precisa

ubicazione all’interno della cellula: - enzimi mitocondriali (es. GLDH)

- enzimi citoplasmatici (es. GPT, LDH)

- enzimi ubiquitari (es. GOT, MDH)

La perdita di enzimi dalla cellula e il loro riversamento nel torrente circolatorio possono essere

causate da due situazioni:

- lisi cellulare conseguente a necrosi (ad es. in epatiti e pancreatiti e infarti del

miocardio)

- epatite: ↑transaminasi

- pancreatite: ↑amilasi

- infarto: ↑creatina fosfochinasi

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32

- forme lievi e reversibili di danno cellulare (ipossia, alterazione del pH) che alterano

la permeabilità della membrana.

Ogni enzima ha una propria vita media e un certo andamento in circolo. Solitamente più è severo il

processo patologico, più i livelli enzimatici sono elevati. Ciò però non vale per tutti gli enzimi:

- enzimi tipo A: sono gli enzimi della coagulazione, la pseudo colinesterasi e altri; essi

diminuiscono la loro attività in caso di patologia. Li troveremo quindi ↓ che nella norma.

- enzimi tipo B: sono lipasi, amilasi e gli altri enzimi del tratto digestivo. Essi aumentano in

caso di patologia.

Altre situazioni importanti da verificare sono:

- escrezione urinaria di enzimi: è un processo che riguarda solo alcuni enzimi, come

l’amilasi, che passano attraverso la barriera renale per le loro caratteristiche

molecolari

- carenze congenite di enzimi.

ASPETTO ENZIMATICO DEI VARI TESSUTI

- GPT = glutammico-piruvico-transaminasi

o

ALT = alanina-transaminasi

ORGANO ENZIMA (unita/grammo d’organo)

fegato 35

muscolo 3,5

Enzima specifico per il fegato.

E’ il miglior indice di citolisi epatica. E’ più alto nell’uomo e varia con l’età.

↑GPT: epatite virale acuta, necrosi epatica su base tossica, epatite autoimmune

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33

↑GPT di minore entità: cirrosi epatica, ittero colestatico, stasi epatica da insufficienza cardiaca,

mononucleosi infettiva

- GOT = glutammico-ossalacetico-transaminasi

o

AST = aspartato-transaminasi

ORGANO ENZIMA (U/gr. organo)

fegato 59

cuore 52

muscolo 36

cervello 15

rene 10

pancreas 3

polmone 1

Enzima di citolisi aspecifico.

Enzima presente in molti tessuti sia a livello citoplasmatico che mitocondriale.

↑GOT marcato: fisiologico nel neonato, epatite virale acuta, necrosi epatica su base tossica, infarto

del miocardio, traumi muscolari, ipossia tissutale, epatite autoimmune

↑GOT moderato: cirrosi epatica, ittero colestatico, carcinoma epatico, insufficienza cardiaca,

mononucleosi infettiva, malattie muscolari, emolisi

- GLDH = glutammato-deidrogenasi


fegato 38

rene 4,4

cervello 3,2

polmone 2,5

Enzima specifico per il fegato. Enzima di citolisi specifico come il GPT.

Il rapporto ALT/AST è importante per la diagnosi di alcune malattie:

Danno lieve del fegato

(lesa la membrana) GPT>GOT>GLDH epatiti acute e quasi tutte le

patologie epatiche

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34

Danno severo del fegato

(lesi i mitocondri) GOT>GPT>GLDH epatite alcolica, sindrome di

Reye

Solitamente GPT>GOT perché GOT è inattivata più rapidamente (t1/2 minore) e GPT (contenuto nel

citoplasma diffonde più velocemente di GOT.

- LDH = lattico-deidrogenasi


muscolo scheletrico 147

fegato 145

cuore 124

rene 106

linfonodi 83

pancreas 50

globuli rossi 36

polmone 27

Enzima della glicolisi che si libera dopo necrosi cellulare.

Enzima aspecifico di citolisi.

↑LDH: anemie emolitiche, epatopatie, infarto del miocardio (tardivamente), neoplasie, distrofie

muscolari.

L’enzima è costituito da quattro catene polipeptidi che di due tipi:

- H (heart) la loro combinazione dà origine a 5 isoenzimi (LD-1→LD-5)

- M (muscle) H4 M4

LD1 e LD2 → isoenzimi cardiaci → non totalmente specifici però

LD4 e LD5 → isoenzimi epatici

Nell’infarto LDH serve per monitorarne il decorso:

se ↓LDH l’infarto sta guarendo → ciò ha oggi perso molta importanza clinica perché si usano le

troponine

Nelle neoplasie aumentano tutti gli isoenzimi con extrabande

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35

- ALD = aldolasi


muscolo 48

fegato 5,7

cuore 4,9

muscolo liscio 2,6

rene 1,1

globuli rossi 1

Indice non totalmente specifico del muscolo

↑ALD: miopatie, epatite acuta, infarto del miocardio

- CPK o CK = creatin-fosfochinasi

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 5 10 15 20 25

BANDA

EXTRABANDA

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36


muscolo 2030

cervello 670

cuore 350

muscolo liscio 12

rene 2

fegato 0,7

Enzima non specifico

L’enzima è costituito da due subunità:

- M (muscle) la loro combinazione dà origine a 3 isoenzimi

- B (brain) MM - MB - BB

(muscolo) (cuore) (cervello)

↓

(5-30% dell’attività

totale della CK)

↑CK: distrofia muscolare, polimiositi, infarto del miocardio, esercizio fisico intenso, ictus,…

In caso di infarto si dosa l’isoenzima CK-MB in prima giornata.

Ci possono essere 2 tipi di misurazione:

- CK-MB/CK(%) → misura l’attività di CKMB rispetto a quella di CKtot.

In condizioni normali è <6%

↑ in caso di infarto. Non è attendibile però se oltre all’infarto di sono dei danni muscolari

MISURA DEI CK-MB FUNZIONANTI

- CK-MB massa → misura la concentrazione di massa dell’enzima. Importante per diagnosi

precoce

MISURA DEL N° DI CK-MB

- ALP = fosfatasi-alcalina

enzima aspecifico

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37

Viene prodotto da molte cellule, ma principalmente da:

- epatociti e cellule dei dotti biliari

- osteoblasti

- epitelio intestinale

↑ALP fisiologico: durante la crescita, nel 3° trimestre di gravidanza, negli anziani (specialmente le

donne)

↑ALP patologico: - malattie ossee (fratture, rachitismo, tumori degli osteoblasti, morbo di Paget)

- malattie epatiche: il fegato ha 2 isoenzimi L1 e L2. Se ↑L1 (compare in

elettroforesi) ci sono malattie epatiche maligne come sarcoidosi, tumori,

metastasi, malattie granulomatose. Se ↑L2 può essere un’epatite complicata

da colestasi o una colestasi cronica (colangite, colica biliare).

Se l’ALP è di origine epatica solitamente è accompagnato da ↑γGT

-FOSFATASI ACIDA = enzima che idrolizza un estere fosforico liberando Pi (fosfato inorganico)

a pH = 4 o 5. MARKER ASPECIFICO di CARCINOMA PROSTATICO

E’ prodotto dalla prostata e dall’osso (principalmente) ma anche da rene, piastrine, stomaco e fegato

↑patologico: carcinoma della prostata, ipertrofia prostatica, malattie ossee specialmente pediatriche,

morbo di Paget.

L’enzima è presente in 2 frazioni: 5a e 5b

↓ ↓

prostata solo nell’osso

La frazione 5b è inibita dall’1-tartrato. Aggiungendolo si può isolare la frazione prostatica. Non è

un test molto specifico e rivela il carcinoma solo quando è in fase già avanzata. Sono preferibili altri

test.

- γGT = gamma-glutamil-transpeptidasi → usa cisteinil-glicina come substrato a cui attacca il

glutatione. Importante per recupero aminoacidi

Mai trascurarlo se > 40

Enzima prodotto specialmente dal fegato, ma presente in quantità più modeste anche in rene e

pancreas.

E’ localizzato a livello dei microsomi e dei dotti biliari.

↑γGT: disturbo enterobiliare con microstasi, somministrazione di farmaci (benzodiazepine,

antidepressivi e tranquillanti), abuso di alcool, pancreatiti (acuta e alcolica), tumori, colecistiti,

cirrosi, ittero ostruttivo intraepatico, metastasi, insufficienza cardiaca (cuore dx →stasi epatica)

E’ un indice di microstasi e di intossicazione epatica. E’ specifico ma bisogna stare attenti perché è

inibito da estrogeni (gravidanza, contraccettivi orali) e dalla bilirubina.

- AMY = amilasi

Enzima che idrolizza amido e glicogeno rompendo i legami 1-4α-glicosidici.

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38

enzima aspecifico

E’ prodotto da pancreas, ghiandole salivari e tube di falloppio.

↑AMY: pancreatite acuta e cronica, occlusione intestinale alta, coliche biliari, ulcera, neoplasia

pancreatica, appendicite e interessamento peritoneale, parotite, gravidanza extrauterina,

insufficienza renale, macroamilasemia (nella macroamilasemia l’amilasi si lega a una IgG formando

un complesso ad alto peso molecolare che no filtra nelle urine (↑amilasemia e ↓amilasuria))

Se è ↑amilasuria significa che c’è anche un’amilasemia patologica. Importante quindi un suo

dosaggio

↑AMY: può essere indice di un’insufficienza renale in stadio molto avanzato.

Importante di stinguere tra gli isoenzimi P3 e S

↓ ↓

pancreas ghiandole salivari e tube

- LIPASI, TRIPSINA, CHIMOTRIPSINA

La lipasi pare essere un segno più specifico dell’amilasi per la diagnosi di pancreatite acuta.

La chimotripsina misura la funzione pancreatica esogena ed è importante per la diagnosi di

pancreatite cronica.

- CHE = colinesterasi (4 isoforme) o pseudocolinesterasi (11 isoforme)

Enzima che idrolizza la colina e i suoi esteri tra cui la succinilcolina che è responsabile della

trasmissione sinaptica. E’ in circolo in quantità abbastanza elevate in quanto indice dell’attività di

sintesi proteica del fegato.

↓CHE: epatopatie di secrezione (epatite, neoplasia), condizioni in cui l’ALB è bassa,

avvelenamento da esteri fosforici.

↑CHE: tireotossicosi, sindrome nefrosica.

Esiste 2 forme genetiche di CHE: - normale

- atipica (omozigote recessiva)

Gli individui con CHE atipica non sono in grado di idrolizzare alcune anestetici (come la

succinilcolina) che bloccano la respirazione. Perciò si svilupperà un’apnea prolungata.

Inoltre la CHE atipica non è inibita dalla dibucaina perché il legame ha un’affinità minore del 50-

100% rispetto a CHE normale.

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39

Capitolo 3.1

INFARTO

del

MIOCARDIO

INFARTO DEL MIOCARDIO

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40

Nel corso degli ultimi 20 anni l’aumento dei fattori di rischio e l’allungamento della vita media

hanno causato un aumento del numero di patologie cardiache legate a ischemia coronarica.

La principale causa di eventi ischemici cardiaci è l’aterosclerosi coronarica, malattia che porta

progressivamente all’occlusione parziale o totale delle arterie con conseguente ischemia. In questo

contesto i quadri anatomopatologici dei vari pazienti sono molto diversi tra loro a seconda

dell’estensione dell’infarto (transmurale o subendocardico). Analogamente le manifestazioni

cliniche spaziano dall’angina da sforzo, all’angina instabile, all’infarto con o senza

sottoslivellamento del tratto ST.

Principali parametri da cui dipende la comparsa di danni:

- n° di vasi occlusi

- sede dell’occlusione

- presenza di circoli collaterali

- durata dell’evento occlusivo

-1- <20 min: generalmente la riperfusione non comporta necrosi del

tessuto o danni permanenti, ma solo una modesta alterazione funzionale

-2- >20 min: danni da riperfusione permanenti con necrosi, edema,

rigonfiamento cellulare, deposizione di Ca2+

Come si è visto le lesioni maggiori compaiono a seguito della RIPERFUSIONE del tessuto, non

durante l’ischemia vera e propria.

Le principali cause del danno da riperfusione sono:

- l’ossigeno, che porta alla formazione di radicali liberi (ROS) che interagiscono con la

membrana cellulare determinando un danno ossidativo;

- l’alterazione dell’omeostasi del Ca2+ intracellulare con suo accumulo citoplasmatico (a ciò

consegue la morte cellulare perché Ca2+ attiva proteasi e endonucleasi);

- l’alterazione endoteliale con formazione di un essudato infiammatorio (accumulo di

neutrofili, attivazione C’…).

A seguito di questi eventi le cellule lesionate liberano in circolo una serie di molecole che possono

assumere il ruolo di MARCATORI più o meno specifici dell’evento. In generale: quanto più il

marcatore è specifico, tanto più tardivamente compare in circolo.

DIAGNOSI

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41

La diagnosi di infarto del miocardio acuto (IMA) presenta delle problematiche ancora irrisolte.

IMA: necrosi di cellule miocardiche a seguito di ischemia prolungata.

Nel passato la diagnosi di IMA presupponeva il riscontro contemporaneo di almeno 2 delle seguenti

condizioni: - angina

- alterazione ECG triade

- ↑enzimi marcatori di danno miocardico

Questo permette di diagnosticare solo le lesioni maggiori, non tutti gli eventi che caratterizzano la

progressione della sindrome coronarica acuta. Con le moderne tecniche è possibile identificare aree

di necrosi inferiori a 1g di tessuto (con ECG normale) ciò è importante perché piccoli infarti

possono dare origine ad aritmie con gravi conseguenze. la diagnosi di IMA oggi si fa dosando

l’aumento della [C] in circolo di marcatori specifici e sensibili di danno miocardico.

Un marcatore ideale di danno miocardico deve avere le seguenti caratteristiche:

- essere presente solo nel tessuto miocardico in elevata concentrazione

- essere indosabile nel sangue in assenza di danno miocardico

- essere rilasciato rapidamente e in quantità rilevante in presenza di danno miocardico

- aumentare proporzionalmente all’entità del danno

- persistere in circolo per un periodo di tempo sufficiente per consentire la diagnosi

(BUONA FINESTRA DIAGNOSTICA)

- essere dosato con metodi rapidi, accurati, precisi, efficienti ed economici.

Secondo le più recenti linee-guida i migliori marcatori sono il complesso delle troponine e la

CK-MB massa.

Sono sconsigliati i dosaggi di alcuni enzimi tradizionali quali CKtot, LDH, GPT, GOT per la

considerevole specificità nella localizzazione tissutale.

Figura 5: Prima di 4-8h non si alza nessuno degli enzimi tradizionali.

HBDH: α-butinato-deidrogenasi →esprime l’attività di LD1 e LD2 in quanto aggiungendo

α-butinato come substrato LD1 lo ossida.

- LDH si normalizza in 7-15gg

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6 7

LDH

HBDH

CPKtot

GOT

GPT

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42

- HBDH si normalizza dopo 10-20gg

- CPK e GOT dopo 3-6gg

L’utilizzo dei marcatori di danno miocardico può portare a 2 strategie diagnostiche alternative:

-1-dosaggio di 2 marcatori diversi, uno molto precoce e aspecifico e uno tardivo e altamente

specifico: - enzima precoce: MIOGLOBINA (aumenta entro 2-3h) alto valore predittivo

negativo

- enzima tardivo: TROPONINE

-2-dosaggio di un solo enzima specifico (TROPONINA). Si usa se la prevalenza di malattia

coronarica è significativamente più elevata.

- MIOGLOBINA <110μg/l normale

Presente nel muscolo cardiaco e scheletrico. E’ un marker precoce in quanto ↑entro 1-2h

dall’esordio del dolore.

E’ importante per: - escludere dalle prime ore la presenza di infarto (valore predittivo

negativo>95%)

- valutare se la riperfusione del tessuto è stata ottenuta

- valutare la comparsa di reinfarti (la troponina rimane elevata a lungo

mascherando i reinfarti).

E’ un marcatore aspecifico perché aumenta anche in caso di danno muscolare, traumi e

insufficienza renale.

-CK-MB massa <5μg/l normale

Misura la concentrazione della proteina CK-MB con Ab monoclonali specifici.

GRAFICO

CK-MM + Ab monoclonale → si blocca

CK-MB + Ab monoclonale → non si blocca

Entro 3 h dall’infarto la CK-MB massa aumenta significativamente nel 50% dei pazienti. Entro 6h

nell’80-100% dei pazienti. Ritorna normale in 48-72 h. Un valore normale di CK-MB dopo 6-8 h

dai sintomi ha un valore predittivo negativo del 95%.

In più la CK-MB è utile per: - valutare la riperfusione

- valutare eventuali reinfarti

E’ un marcatore non completamente specifico perché aumenta nelle malattie e nei traumi muscolari

e ha scarsa sensibilità per danni miocardici minimi ( rilevati dalle troponine)

La CK-MB ha 2 isoforme:

- MB1: forma sierica si ottengono a partire da un precursore proteico comune che

- MB2: forma tissutale subisce diverse modificazioni post-traduzionali.

MB2 ha una Lys in più di MB1.

MB2/MB1 = 1 situazione normale oggi non più molto utilizzato

MB2/MB1 ≥ 1,5 probabile infarto in atto

- TROPONINE

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43

Il complesso delle troponine ha 3 componenti:

- troponina C → lega Ca2+ non specifica

- troponina I → inibisce l’attività ATPasica dell’acto-miosina

- troponina T → lega la tropo miosina

- TROPONINA I

E’ cardiospecifica: localizzata per il 95% nelle miofibrille e la restante parte nel citosol.

E’ molto importante per la diagnosi di IMA senza modificazione dell’ECG: in questi pazienti c’è

una fluttuazione della [TnI] che, dosata, permette di stabilire quali pazienti sono più a rischio per

eventi cardivascolari a breve termine.

La TnI aumenta dopo 6 h dall’infarto (valore predittivo positivo del 95%) e resta alta per 7-10 gg.

Possono quindi sfuggire eventuali reinfarti.

Valori: - <0,1 μg/l soggetto normale

- >0,1 e <1,5 μg/l danno cardiaco minimo (non aumenta CK-MB) 1°livello decisionale

- >1,5 μg/l INFARTO 2°livello decisionale

- TROPONINA T <0,01 μg/l

Presente nel cuore e nel muscolo scheletrico cronicamente stressato che riesprime proteine fetali.

Oggi si usano Ab specifici con selettività per la sequenza aminoacidica del TnT cardiaco, che ne

fanno quindi un ottimo marcatore di infarto.

Il rilascio di TnT mostra un quadro bifasico con un picco maggiore a 14 h e uno minore a 3-5 gg

dall’infarto. Ciò è probabilmente dovuto alla compartimentalizzazione intracellulare della proteina.

TnT resta elevato fino a 2 settimane dopo l’esordio. Aumenta fino a 100 volte rispetto al valore

normale e mostra una sensibilità del 100% da 10 h a 5 gg dall’infarto. Come la TnI è importante per

valutare il rischio di infarto nei pazienti con angina instabile e infarto senza sottoslivellamento del

tratto ST.

Esistono oggi 3 livelli decisionali a cui corrispondono considerazioni diagnostiche e terapeutiche

differenti:

I° livello: serve a escludere la presenza di sofferenza o danno miocardico di qualsiasi natura.

E’ il valore inferiore dell’intervallo di riferimento che si ottiene integrando la [Tn] corrispondente al

99° percentile del sistema di analisi e il livello di imprecisione analitica corrispondente.

Valore prossimo allo zero ↓

si esprime come coefficiente

di variazione ed <10%

II° livello: consente di separare il danno miocardico minimo dall’IMA vero e proprio.

III° livello: consente di distinguere i danni miocardici di minore entità dai più severi

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44

Figura 6: andamento markers IMA

PRINCIPALI

MARCATORI

AUMENTO

INIZIALE

PICCO RITORNO ALLA

NORMA

mioglobina 1-4 h 4-12 h 12-24 h

CK-MB massa 2-6 h 12-24 h 72 h

TnI 3-12 h 12-24 h 7-10 gg

TnT 3-12 h 12-48 h I°picco

3-5 gg II°picco

10-14 gg

Il quadro clinico dello shock simula quello dell’infarto. ↑CPK totale, ↑GOT, ↑GPT, ↑HBDH, ↑LDH

Tuttavia CK-MB non si alza e poi livelli di CPK pari a 5000 U/l sono troppo elevati per pensare a

un infarto

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 1 2 3 4 5 6 7 8

TnI

TnT

CK-MB massa

mioglobina

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45

RIASSUNTO

Dolore al petto da<6h

ECG

positivo negativo

fare isoforme CK-MB

IMA positivo negativo

ripetere dopo 6h

ricovero positivo negativo

storia di precedenti nessun precedente

terapia medicina generale

VALUTAZIONE DELLA FUNZIONALITA’ CARDIACA

Si dosano gli ormoni natriuretici (ANP, BNP, CNP)

I più noti sono: -ANP: di origine atriale → è prodotto dalle fibrocellule cardiache e immesso

in circolo

- BNP: di origine ventricolare

Stiramento dell’atrio: ANP (tanto) e BNP (poco)

Stiramento del ventricolo: ANP(poco) e BNP (tanto)

- ANP: ↓P arteriosa, ↑diuresi e natriuresi; azione anti ipertrofica

- BNP:

↑BNP nello scompenso cardiaco: risposta adattativa per mantenere gettata cardiaca e P venosa

danno cardiaco disfunzionale→attivazione del sistema neuroendocrino→ipertrofia→↑BNP-↑ANP

contrasto

Anche lo stress distende il cuore.

Utile il dosaggio di BNP e NT-proBNP per seguire i pazienti con scompenso cardiaco nel follow-

up, per classificarli e screenarli e sono considerabili come indicatori prognostici (anche nei test da

pronto soccorso)

NT-proBNP: t1/2>60min [C] = 41 μg/ml

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46

ENZIMI MUSCOLO SCHELETRICO

Degenerazione neuromuscolare → Aldolasi più bassa che nella distrofia

Test elettromiografici e aldolasi utile solo nella fase iniziale perché poi le fibre si distruggono e

sono sostituite da connettivo

Sarcoidosi ACE (↑P art.)

Quadro radiologico come TBC o neoplasia. Se progredisce c’è dispnea gravissima

ENZIMI PANCREAS

-1- Pancreatite acuta

Patologia che esordisce con addome acuto, ulcera perforante.

La diagnosi di pancreatite acuta si fa dosando alcuni enzimi:

- amilasi totale (non specifico) → sangue+amido+I →reazione

- se sangue normale la soluzione è blu

- se c’è amilasi il blu scompare

- isoamilasi pancreatica

- lipasi → lipasi+colipasi specifica

- tripsina

- elastasi

- fosfolipasi A2

Nelle urine si trovano: -amilasi

- elastasi

- chimotripsina

-2- Pancreatite cronica

E’ di difficile diagnosi mentre è in corso di formazione. Talvolta è definita dispepsia, cattiva

digestione, …

Inutile il dosaggio di amilasi e lipasi per diagnosi a meno che non ci sia una fase di attivazione.

Si dosa la CHIMOTRIPSINA nelle feci perché non è demolita dalle proteasi e dalla flora batterica

intestinale. Le feci sono trattate con spettrofotometro a infrarossi (ne valuta la composizione).

L’aspetto è untuoso con gocce di grasso e fibrocellule muscolari. L’esame è un po’ in disuso.

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47

Capitolo 4

FUNZIONALITA’

EPATICA

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48

FEGATO

Il fegato è il principale organo metabolico del nostro organismo. Interviene in numerosi processi per

cui per valutarne la perfetta funzionalità bisogna eseguire test diversi:

- test di escrezione

- test di sintesi e capacità metabolica

- test di danno cellulare

- TEST di ESCREZIONE

Bilirubina → più noto test di escrezione E’ un prodotto catabolico del metabolismo dell’EME. Proviene per la maggior parte dai globuli

rossi invecchiati, ma anche da mioglobina, emeproteine (citocromi) e eritropoiesi inefficace.

Ogni giorno sono gestiti circa 7 g di bilirubina.

globina

Emoglobina

apertura della proto porfirina IX

EME

ferrobiliverdina → biliverdina → bilirubina

La bilirubina viene trasportata nel sangue legata all’albumina. E’ captata dal fegato dove subisce

una reazione di glucoronazione ad opera dell’enzima UDP-glucoronil-transferasi e secreta con la

bile nell’intestino. Qui è modificata dalla flora batterica (STERCOBILINA) e in parte riassorbita

attraverso il circolo entero-epatico (UROBILINOGENO).

La bilirubina si trova in 2 forme principali:

- indiretta: non coniugata con acido glucuronico

- diretta: coniugata con acido glucuronico

BILIRUBINA TOTALE: 1 mg/dl è il valor normale

di cui

- 75% indiretta 0,1-1 mg/dl

- 25% diretta <0,3 mg/dl

Le due forme si mettono in evidenza con la

REAZIONE PRONTA: SIERO+REATTIVO → COLORAZIONE VIOLA (diretta)

SIERO+REATTIVO+SOLVENTE → COLRAZIONE VIOLA (indiretta)

Se bilirubina >2 mg/dl si parla di ITTERO

L’aumento di bilirubina non deve comunque superare ilo valore di 18-20 mg/dl, altrimenti passa la

barriera emato-encefalica e possono svilupparsi lesioni ai nuclei della base.

Importante in caso di ittero valutare sia la BILIRUBINA TOTALE che la BILIRUBINA

INDIRETTA.

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49

Esistono diverse cause di ittero:

1) ITTERO PREEPATICO→↑bilirubina indiretta

da iperproduzione di bilirubina (emolisi, eritropoiesi inefficace, incompatibilità Rh)

2) ITTERO EPATICO→↑bilirubina diretta e indiretta (rigurgito di bile)

- da difetto di captazione (sindrome di Gilbert = valori di bilirubina totale da 1,5 a 6 mg/dl

con bilirubina indiretta fino a 5 mg/dl senza altri segni di alterazione epatica)

- da difetto di coniugazione (sindrome di Crigger-Najal, ittero fisiologico del neonato, ittero

da epatite o congenito grave) ↑bilirubina indiretta

- da difetto di eliminazione (sindrome di Dubin-Johnson) ↑bilirubina diretta

- da deficit della pompa della via biliare (ittero farmacologico dovuto al fatto che un farmaco

compete con la bilirubina per un recettore; nei neonati si può verificare durante

l’allattamento)

3) ITTERO POSTEPATICO→↑bilirubina diretta

- da stasi biliare ( epatiti, colangiti, colangioliti, cirrosi biliare, calcolosi della via biliare,

neoplasie di fegato e pancreas)

INDICATORI di COLESTASI → ALP, γGT

- ALP: aumenta sensibilmente in caso di ostruzione intraepatica ed extraepatica delle vie biliari

ALP<455 U/l femmine da 0 a 12 anni; maschi da 0 a 15 anni

ALP 34-104 U/l femmine valori normali

ALP 45-130 U/l maschi valori normali

- γGT: aumenta a seguito di varie patologie epatiche (microstasi, epatite, neoplasie, induzione

alcolica e altre patologie non epatiche). Si considera poco specifica per malattia epatica

γGT 11-97 U/l neonati

γGT <33 U/l femmine

γGT <50 U/l maschi

-ACIDI BILIARI: prodotti dal fegato, demolendo il colesterolo, sono l’acido colico e l’acido

chenodesossicolico poi coniugati con taurina e glicina. Sono secreti con la bile e riassorbiti per il

90% nel circolo entero-portale. ↑nel sangue in seguito a colestasi (valutano quindi la funzionalità

escretrice del fegato).

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50

- TEST di SINTESI

a) INDICI FUNZIONALI di SINTESI PROTEICA

La maggior parte delle proteine del sangue, ad eccezione delle Ig, alcuni fattori del C’ e alcune

lipoproteine, è sintetizzata dal fegato. Il loro dosaggio è informativo dell’attività sintetica del fegato.

Le principali proteine studiate sono:

- ALB: un suo livello ridotto, escludendo altre cause come malnutrizione, malassorbimento,

perdita urinaria, è indice di insufficienza epatica. Se ↓ALB il fegato è compromesso per 2/3.

- pre-ALB, TRF: proteine preferite all’albumina perché hanno emivita minore, a volte si usa

anche AAG (↓in caso di epatopatie, avvelenamenti, ↑se flogosi o dialisi)

- fattori della coagulazione: hanno t1/2 <ALB e sono quindi un indice più fedele di

insufficienza epatica. Importante il dosaggio del FATTORE VII in caso di epatite

fulminante (t1/2 =2h).

- tempo di protrombina (TP): misura il tempo di coagulazione del plasma. Valuta la funzione

della via estrinseca (fattori X, VII, II prodotti dal fegato). Si ha un TP allungato nelle epatiti

tossiche, nelle cirrosi e se il fegato produce una molecola di fibrinogeno abnorme che non

polimerizza (sifibrinogenemia).

- CHE: è un indice di protidi poiesi ormai no molto usato per la scarsa sensibilità di risposta

b) INDICI FUNZIONALI di SINTESI LIPIDICA

Colesterolo: valutazione della sua formazione ed esterificazione. Prima si calcolava il rapporto tra

colesterolo libero e quello esterificato.

c) INDICI FUNZIONALI di SINTESI GLUCIDICA

Galattosio: nel fegato c’è l’enzima Gal1 fosfo-uridil-transferasi che converte il Gal in Glc. Se

manca si sviluppa una malattia grave nel neonato → GALATTOSEMIA.

per valutare la funzione di Gal-1-PUT si fa una prova da carico, si somministrano 40g di galattosio

e lo si dosa nelle urine emesse 5 h dopo. Quantità di Gal >3g sono patologiche.

- TEST di DANNO CELLULARE

Valutano l’incremento di alcuni enzimi, specialmente GPT e GOT a seguito di un danno cellulare

epatico

GPT >GOT epatopatie di tipo citolitico

GOT>GPT epatopatie alcoliche

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51

EPATOPATIE ACUTE

Le epatopatie acute sono caratterizzate da un aumento delle transaminasi con:

SENSIBILITA’ SPECIFICITA’

ALT (GPT) >300 U/l 96 94

AST (GOT) >200 U/l 91 95

↑di bilirubina, γGT, GLDH, LDH, ALP

EPATITE A: si avvia

verso la guarigione

quando ALP e γGT si

abbassano.

Scompare CHE.

Ittero nel 70% dei casi.

EPATITE B:

complicata= con

componente occlusiva.

La forma più grave ha

ALP e γGT alte.

Scompare CHE.

Ittero nel 30-50% dei

casi.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 sett 01-set 02-set 03-set 04-set 05-set 06-set

GPT

GOT

ALP

γ GT

0

50

100

150

200

250

300

0 sett 01-set 02-set 03-set 04-set 05-set 06-set

GPT

GOT

ALP

γGT

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52

EPATITE ALCOLICA

γGT e ALP alte.

GPT e GOT nono

superano mai più di 10

volte i valori normali.

Ittero nel 60-70% dei

casi.

AVVELENAMENTO

da FUNGO

Scompare CHE

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0sett 01-set 02-set 03-set 04-set 05-set 06-set 07-set

GPT

GOT

ALP

γGT

CHE

0

100

200

300

400

500

600

0sett 01-set 02-set 03-set 04-set 05-set 06-set

GPT

GOT

LDH

GLDH

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53

AVVELENAMENTO

da SOLVENTI

Caratterizzato da LDH

altissima e GOT > GPT

MORBO di WEIL:

leptospirosi emorragica

GPT > GOT

Caratterizzata da ittero

e ematuria. Diversa

dalle epatiti perché

prima si alza la

bilirubina e poi le

transaminasi (nelle

epatiti è il contrario).

GOT/GPT = quoziente di De Ritis

In condizioni normali il quoziente di De Ritis > 1.

Se > 1 (conversione del quoziente) ci può essere: epatite acuta, epatite tossica, mononucleosi,

steatosi.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0set 01-set 02-set 03-set 04-set 05-set 06-set

GPT

GOT

LDH

GLDH

0

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100

150

200

250

300

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450

500

0set 01-set02-set03-set04-set05-set06-set07-set08-set

GPT

GOT

bilirubina

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54

EPATOPATIE CRONICHE

Alcune forme di epatite acuta come l’epatite B e la C tendono a cronicizzare.

Ciò avviene quando: - γGT dopo un mese dall’esordio acuto > 150 U/l

- transaminasi sono alte con GOT > GPT di circa 100 U/l

- ↑bilirubina

- ↓ALB

Ci son altre 2 forme principali di epatite cronica:

- PERSISTENTE: in cui GPT > GOT. E’ abbastanza benigna

- FORMA CRONICA: con GPT ≈ GOT, ↑γGT e CHE↓

Per la diagnosi di epatite cronica bisogna verificare una delle seguenti condizioni:

-1-↑ALT per più di 6 mesi dopo un’epatite acuta

-2-↑ALT in più di un’occasione su un periodo di 6 mesi senza un’altra spiegazione

ATTENZIONE! Non in tutti i pazienti con epatite cronica c’è ↑ALT perché le cellule del fegato

distrutte non lo producono più. Ricercare i marker di infettività.

Screening di epatopatia cronica va sempre condotto dosando ALT perché ilo test è più sensibile di

AST.

Monitoraggio nelle infezioni da HBV e HCV bisogna valutare la scomparsa dei marker virali per

monitorare l’evoluzione della malattia.

L’epatite cronica può evolvere verso la cirrosi o il carcinoma epatocellulare (HCV).

CIRROSI

Consiste nella sostituzione del tessuto epatico con fasci fibrosi e perdita della funzionalità epatica,

ipertensione portale, ascite. Può essere causata da HBV, HCV, alcol

- Da HBV, HCV: CHE bassa, modesto movimento delle transaminasi con GOT>GPT (non più di 2-

3 volte la norma) e γGT lievemente mossa.

- Da alcol: stesso quadro con γGT molto alta.

Per valutare l’entità della fibrosi si possono eseguire alcuni test:

-1-quoziente di De Rizis CHE diventa >1 (era <1 nell’epatite cronica non alcolica)

-2-conta piastrinica

-3-tempo di protrombina

-4-ALB →marker di gravità della compromissione protidosintetica

-5-AFP (alfafetoproteina): ↑col progredire della fibrosi (ha un buon valore predittivo

positivo).

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55

EPATOMA

Complicanza dell’epatopatia cronica da HBV e HCV. Si raccomanda lo screening dei portatori

cronici di HbsAg ogni 6 mesi con AFP (ma valore predittivo basso → 10-30%) e con ecografia e

AFP nei pazienti con cirrosi e storia familiare di carcinoma. Oltre alle prove funzionali ci sono dei

test che riguardano alcuni aspetti immunologici delle malattie epatiche. Si tratta della valutazione

della [Ig] nel sangue.

IgG: aumentano nell’epatite cronica aggressiva e nella cirrosi. Nella prima sono oligoclonali, nella

seconda policlonali con ponte β-γ.

IgA: aumentano nelle patologie da alcool perché sono associate a una patologia del primo tratto

digerente dove sono prodotte.

IgM: aumentano precocemente nell’epatite acuta e sono elevate nella cirrosi biliare primitiva.

METASTASI EPATICHE

Quadro con ↑ transaminasi con GOT>GPT, ↑γGT, ↑ALP, ↑LDH isoenzimi 1 e 2.

Diagnosi eseguita con TAC ed ecografia

EMIVITA dei PRINCIPALI ENZIMI di FEGATO E PANCREAS

GOT 17±5h ALP 3-7gg

GPT 47±10h γGT 3-4gg

GLDH 18±1h CHE 10gg

LDH1 113±60h AMY 3-6h

LDH5 10±2h lipasi 3-6h

CPK 15h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

epatite acuta epatite cronica aggressiva

cirrosi biliare primaria cirrosi alcolica

IgG

IgA

IgM

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56

Capitolo 5

FUNZIONALITA’

RENALE

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57

RENE

I test di laboratorio che possono essere fatti sul rene si suddividono in varie categorie:

- test che valutano la funzionalità glomerulare

- test che valutano la funzionalità tubulare

- test che valutano l’insufficienza renale acuta e cronica

- test che valutano le glomerulo nefriti

- TEST per la FUNZIONALITA’ GLOMERULARE

-1-CLEARANCE della CREATININA

Per valutare l’efficienza della funzionalità renale si misura VFG=velocità di filtrazione glomerulare

che dipende: - dalla P di filtrazione Pf=P ‒ (π+Pc)

- dalla superficie filtrante (numero glomeruli funzionanti)

- dalla struttura della membrana filtrante

VFG = volume di plasma (ml) filtrato in 1 minuto dai 2 reni

VFG = 125ml/min normale riferita a una superficie corporea di 1,73m2.

La VFG è pari alla CLEARANCE se la sostanza impiegata è completamente filtrata e non viene ne

riassorbita, ne secreta dal tubulo, ma è completamente escreta con le urine.

CLEARANCE = volume di plasma depurato da una sostanza X nell’unità di tempo.

Ux = [x] nelle urine

Px = [x] nel sangue

V = flusso urinario

Nell’uso clinico la sostanza che viene utilizzata è la CREATININA, un catabolita endogeno di

origine muscolare derivante dalla creatina.

- Cl creat. = 95-140 ml/min nei maschi

- Cl creat. = 75-110 ml/min nelle femmine

Diminuisce con l’età perché ↓ il numero dei glomeruli funzionanti.

Fare attenzione al fatto che la quantità di creatinina dipende dalla massa muscolare.

La misura della Cl è però spesso inaccurata e soggetta a errore (tra 10-30%) per imprecisioni

compiute nella raccolta delle urine e nelle misure analitiche.

più spesso l’efficienza della funzionalità glomerulare è valutata con la sola CREATININEMIA,

più affidabile.

- 1 mg/dl creatinine mia normale

- 0,8-1,3 mg/dl nei maschi

- 0,6-1,1 mg/dl nelle femmine

- 0,3-0,7 mg/dl bambini<12 anni

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58

La concentrazione plasmatica della creatinina è in rapporto inversamente proporzionale con la

clearance (curva iperbolica). La VFG può diminuire del 50% prima che si verifichi un ↑della

creatinina. Quando però questo si verifica è sicuro un difetto della funzionalità renale.

creatininemia

Cl%

Una nefropatia è curabile e reversibile fino a che non supera il 50% di compromissione della

funzionalità renale

E’ una formula che permette un calcolo rapido della VFG (e volume di plasma filtrato)

↑creat.: riduzione della filtrazione glomerulare, malattie del parenchima renale, nefropatie vascolari,

aumento della massa muscolare, acromegalia, traumi.

-2-CISTATINA C

E’ una proteina inibitrice di alcune cisteine-proteasi prodotte da tutte le cellule. Essa è totalmente

filtrata dal glomerulo e catabolizzata dalle cellule del tubulo prossimale (non viene perciò

riassorbita)

0,4-1,2 mg/l intervallo di riferimento normale (maschio, femmina, bambino)

E’ un marker ideale della VFG (non risente di riassorbimento, secrezione e imprecisione nella

raccolta delle urine) e inoltre è un indice più precoce dei compromissione renale rispetto alla

creatinina in quanti rileva anche LIEVI ALTERAZIONI della FUNZIONALITA’

GLOMERULARE. Purtroppo ha una grande variabilità interindividuale e ↑in alcune neoplasie e

nell’infezione da HIV.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 20 40 60 80 100 120

creatinina mg/dl

creatinina mg/dl

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59

-3-UREA

Urea plasmatica = azotemia in italia

L’urea è una molecola prodotta dal fegato, contenente NH3 derivante dal catabolismo degli

aminoacidi. Ogni giorno sono eliminati con le urine fino a 30 g di urea. In media 15-20 g.

L’urea viene utilizzata come indice di funzionalità glomerulare, ma la sua utilità clinica è inferiore a

quella della creatinina perché viene riassorbita per il 40% nel TP ed è influenzata dall’apporto

alimentare azotato, dallo stato di idratazione del paziente, dalla diuresi e dal catabolismo proteico.

- adulti 20-50 mg/dl

- bambini 10-50 mg/dl valori normali AZOTEMIA

Iperazotemia è comunque da considerare perché può avere molteplici cause (anche non renali):

- pre-renale: dieta ricca di proteine, emorragia gastrointestinale, febbre, compromissione

del FER (shock, ipotensione). Di solito la creatinina è normale.

Rapporto azotemia/creatininemia>20:1

- renale: malattie glomerulari, nefropatie croniche e acute.

Rapporto azotemia/creatininemia<20:1

- post-renale: legata a impedito flusso urinario per calcoli, neoplasie, stenosi ureterali,

ipertrofia prostatica.

IPERAZOTEMIA ≠ IPERAMMONIEMIA

↓ ↓

accumulo di urea nel sangue accumulo di NH3 nel sangue

NH3

Deriva dalla deaminazione degli aminoacidi ed è convertita in urea nel fegato

↑NH3: insufficienza epatica grave, encefalopatie di origine epatica, leucemia acuta, trasfusioni,

trapianti, esercizio fisico intenso, emorragie intestinali, alcuni farmaci.

- NH3 50-80

20-60 μg/dl valori normali

- NH3 >150μg/dl coma epatico

C’è una correlazione positiva tra NH3 e gravità del coma epatico. Ilo coma da insufficienza renale,

invece è iperuremico, ma non iperammoniemico.

NH3 è tossico per il cervello perché sottrae ac. chetoglutarico dal ciclo di Krebs per convertirlo in

glutammato e glutammina.

AMMINOACIDI

Oltre all’urea e all’ NH3 nel sangue sono presenti altri composti azotati: gli aa (si valuta la presenza

di una quantità di –NH2 pari a 5 g). Essi sono di origine alimentare o derivanti dalla demolizione

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60

delle proteine. L’AMINOACIDEMIA non ha grandi implicazioni diagnostiche. Si calcola quando si

sospettano difetti nella sintesi proteica.

↑aa insufficienza epatica quasi terminale.

DIFETTI nella SINTESI PROTEICA:

- Metabolismo della Phe: difetto più comune è la mancanza dell’enzima Phe idrossilasi che

catalizza la conversione della Phe in Tyr. L’accumulo di Phe è tossico per il cervello e nel bambino

non ne permette un completo sviluppo con conseguente ritardo mentale. E’ una condizione nota

come OLIGOFRENIA FENILPIRUVICA o FENILCHOTONURIA (malattia a carattere

autosomico recessivo). Fondamentale è una diagnosi precoce affinché al bambino sia prescritta una

dieta priva di Phe. Si fa tramite il TEST di GUTHRIE (screening su tutti i neonati) che consiste

nell’aggiungere il siero del neonato in una coltura di B.Subtilis. La crescita dei bacilli è inibita dalla

presenza di β-2-tienilalanina (antagonista della Phe). Se nel siero aggiunto è presente un accumulo

di Phe i batteri crescono; valutando la crescita batterica si può porre diagnosi di fenilchetonuria.

Più importante è la valutazione della AMINOACIDURIA. Associata al dosaggio dei fosfati e del

glucosio può essere utile per valutare la SINDROME di FANCONI. E’ una malattia autosomica

recessiva caratterizzata da una progressiva pan citopenia associata a aumentata predisposizione per

le malattie neoplastiche e a diverse anomalie congenite tra cui alcune a carico dello scheletro

(RACHITISMO resistente a Vit.D) e altre del rene (disfunzione del TP con conseguente glicosuria,

iperfosfaturia e ipofosfatemia, aminoaciduria, iperururicuria e ipouricemia, ipocaliemia).

ACIDO URICO

E’ il prodotto terminale del catabolismo delle purine. in condizioni normali ha questi valori nel

sangue: 5-6 mg% nelle femmine

5-7 mg% nei maschi

L’aumento dell’uricemia porta a una patologia che prende il nome di GOTTA. Le cause sono

principalmente 3:

-1- DIFETTO di ESCREZIONE RENALE

In condizioni normali l’acido urico è parzialmente filtrato dal glomerulo con una clearance molto

bassa ( 9 ml/min). E’ secreto nella porzione finale del TP e riassorbito per il 98-100% nel TD.

Viene escreta circa il 6-12% della quota filtrata.

↑uricemia: insufficienza renale, acido lattico e chetoacidi bloccano la secrezione tubulare di acido

urico (in caso di diabete, dislipidemia, intossicazione alcolica, digiuno, esercizio faticoso). anche

alcuni farmaci possono inibire la secrezione di acido urico.

-2- SOVRAPPRODUZIONE di ACIDO URICO

- ↑produzione dell’enzima PRPP (fosfo-ribosil-pirofosfato-sintetasi) enzima essenziale per la sintesi

dei nucleotidi.

- Difetto enzimatico di HGPRT (ipoxantina-guanina-fosfo-ribosil-transferasi)

Sindrome di Lesch-Nyhan: è una malattia ereditaria X-linked che ha come difetto più evidente

l’iperuricemia associata a ritardo mentale, atassia, automutilazioni, aggressività, iperuricuria e

[HGPRT] diminuita in eritrociti e fibroblasti.

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-3- AUMENTATO TURNOVER degli ACIDI NUCLEICI

L’aumento della sintesi e della demolizione di purine è tipica di alcune malattie, come le leucemie,

caratterizzate da disordini mieloproliferativi. Durante la chemioterapia vengono distrutte molte

cellule con liberazione di DNA (e quindi purine).

Capitolo 5.1

ESAME URINE

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ESAME DELLE URINE

L’analisi delle urine comprende:

-esame chimico-fisico

-esame microscopico

-1- ESAME CHIMICO-FISICO

Si esegue con lo stick urinario che mette in evidenza la presenza di varie molecole grazie a reazioni

enzimatiche. L’esame considera diversi parametri:

- COLORE: può variare entro questa gamma:

- giallo paglierino: urine normali

- giallo arancio intenso: urina concentrata con pigmenti biliari e uroblilinogeno in

eccesso

- marsala: presenza di bilirubina

- rosso limpido: emoglobina e mioglobina

- rosso torbido: presenza di sangue

- verde: presenza di biliverdina o infezioni batteriche

- nerastra: alcaptonuria, melanina, derivati della Tyr

- trasparente: urina molto diluita (es. nel diabete insipido)

- ASPETTO:

- limpido: urina normale

- torbido: presenza di fosfati, carbonati, acido urico, proteine (leucociti, batteri,

spermatozoi)

- lattescente: piuria, lipuria (nefrosi o traumi), cellule vaginali molto abbondanti

- presenza di precipitati: nelle urine mentre il principale precipitato è il fosfato

amorfo, nelle acide l’urato di ammonio, nelle alcaline il fosfato triplo o, se

flocculento, muco, leucociti, batteri e lieviti

- PESO SPECIFICO: rapporto tra il peso in grammi di 1 ml di urina e 1 ml di acqua.

E’ sempre > 1. Misura la capacità del rene di diluire o concentrare le urine

- ps = 1003-1028 adulto normale

- ps > 10023 = normale capacità di concentrazione

Il peso specifico è calcolato con lo stick urinario (ma metodo poco accurato e poco specifico) o con

un REFRATTOMETRO. Il campione viene attraversato da un raggio di luce che viene rifratto.

L’angolo di rifrazione è α alla [soluti] nell’urina.

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- ↑ps: disidratazione, glicosuria, proteinuria, ipersecrezione di ADH

- ↓ps: diabete insipido, glomerulonefrite, pielonefrite, insufficienza renale

- OSMOLALITA’ URINARIA: numero di particelle osmoticamente attive/Kg di solvente

100-1200 mOsm/Kg soggetto normale

Non sempre coincide con il ps. Il valore dell’osmolalità dipende dallo stato di idratazione del

paziente; non c’è quindi un “valore normale”. il principale determinante dell’osmolalità urinaria è la

quantità di H2O riassorbita dal TD e DC in risposta all’ADH. E’ la misura più esatta della capacità

del rene di concentrare le urine. Si misura con l’OSMOMETRO, strumento che valuta le variazioni

del punto di congelamento dell’urina rispetto al solvente puro.

↑osmolarità: morbo di Addison, scompenso cardiaco, shock

↓osmolarità: iperaldosteronismo, diabete insipido, eccessivo itroito di acqua, necrosi

tubulare

- pH: il rene elimina giornalmente 80-100 mmol/l di ioni H+ tramite l’acidità titolabile

(tamponi urinari) e l’ammoniogenesi (NH4+ eliminato: 30 mmol/24h)

pH 5,5-6,5 normale

pH 4,5-8 massima variabilità

↑pH: infezioni batteriche, dieta vegetariana

↓pH: durante la notte per acidosi respiratoria, dieta a base di amido, proteine, alcol e

zucchero.

pH importante nelle calcolosi (urine alcaline → calcoli di fosfato di Ca, CaCO3, NH4PO4; urine

acide → calcoli di acido urico); nelle infezioni urinarie, nelle alterazioni dell’eq. acido-base,

nell’insufficienza renale

- GLUCOSIO:

glc < 150 mg/l normale

↑glicosuria: iperglicemia o con glicemia normale in gravidanza, tubulopatie

ereditarie (es. sindrome di Fanconi), tubulopatie da sostanze tossiche (Pb, Hg,

tetracicline), da ipossia, malattie infiammatorie.

La glicosuria si misura con le strisce reattive che sfruttano una reazione basata sulla

GLUCOSIO-OSSIDASI

Glu + O2 →glucosio ossidasi→ H2O2 + cromogeno →perossidasi→ cromogeno ossidato + H2O

- CORPI CHETONICI: non sono normalmente presenti nelle urine; la loro presenza indica

un aumento del metabolismo degli acidi grassi.

↑corpi chetonici: digiuno, diabete (associati a glicosuria), gravidanza, febbre,

ipoglicemia, stress, esercizio fisico intenso

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- PROTEINE:

< 150 mg/24h proteinuria normale

La proteinuria normale è costituita dal 30% di ALB, 30% mucoproteina di Tamm-Horsfall, RBP

(retinol binding protein), β2microglobulina, catene L, IgA di secrezione.

La proteinuria patologica riflette un danno renale.

Può essere di 3 tipi:

1)PROTEINURIA GLOMERULARE

Causata da un aumento di permeabilità del glomerulo (varia l’eziologia: glomerulonefriti,

alterazione dell’emodinamica glomerulare, stenosi dell’arteria renale). Compaiono nelle urine:

ALB, TNF, le α1 e le α2, poche IgG.

La proteinuria può essere:

- REVERSIBILE

- IRREVERSIBILE

- SELETTIVIA con l’aggravarsi dell’alterazione della barriera

- NON SELETTIVA (sempre irreversibile) di filtrazione si perdono proteine con pH sempre

maggiore fino alla perdita completa della selettività

Per distinguere una proteinuria glomerulare selettiva da una non selettiva è utile calcolare

l’INDICE di CAMERON: < 0,2 → proteinuria selettiva

2)PROTEINURIA TUBULARE

Causata da un inadeguato riassorbimento tubulare di proteine a basso pH (normalmente filtrate e

riassorbite). Si ritrovano nelle urine: α1 microglobulina, β2 microglobulina, RBP, α1

glicoproteinaacida, catene L.

Le principali cause del danno tubulare sono: necrosi tubulare acuta, tossicità da farmaci e metalli

pesanti, trapianti, sindrome di Fanconi.

3)PROTEINURIA DA IPERAFFLUSSO

Causata dall’eccessiva produzione di proteine a basso pH che filtrano nel glomerulo e non sono

totalmente riassorbite per l’elevata quantità. Provocano gravi danni renali. Le principali sono: BJ

(MM), lisozima (leucemia monocitica), amilasi (pancreatite), mioglobulina, Hb (emolisi

intravascolare).

Nelle urine si ritrovano anche numerosi enzimi il cui dosaggio non può però essere standardizzato

dal momento che alcuni si bloccano nell’ambiente urinario. Ciò non vale ad esempio per:

- NAG→N-acetilβ D-glucosamminidasi

- α1 microglobulina

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Esistono anche proteinurie benigne intermittenti come:

- ALBUMINURIA ORTOSTATICA: persistente, ma presente solo nella posizione

eretta.

- ALBUMINURIA da SFORZO

- PROTEINURIA da FEBBRE

Per evidenziare la proteinuria si usano le strisce reattive. Reazione semiquantitativa specifica, ma

poco sensibile. Si basa sul seguente principio: ALB a pH fisiologico sono dissociate come anioni.

Sulla striscia c’è un tampone che contiene un indicatore specifico per l’ALB, giallo a pH = 3 e blu

se pH > 4,2 (per farlo virare bastano 15mg/dl di ALB). La [ALB] è valutata sulla base dell’intensità

di colore.

- EMOGLOBINA:

La rilevazione di Hb si basa sulla seguente reazione

eme

↓

H2O2 + cromogeno → cromogeno ossidato + H2O

Hb ha una attività perossidasica che porta al viraggio del colore del cromogeno.

- UROBILINOGENO:

Presente normalmente in tracce fino a 0,5-4 mg/24h.

L’urobilinogeno è prodotto dalla flora intestinale a partire dalla bilirubina ed è in parte escreto con

le feci, in parte riassorbito dal fegato e in parte passa nel circolo sistemico ed è escreto per via

renale. La quota di urobilinogeno urinario dipende dalla quantità di bilirubina immessa

nell’intestino e dalla quota riassorbita dal fegato.

↑urobilinogeno: emolisi, stipsi (↑tempo di transito nell’intestino), ↑crescita della

flora batterica, pH urinario alcalino (si trova in forma ionizzata a cui l’epitelio è

impermeabile).

↓urobilinogeno: ostruzione biliare, antibiotici, diminuito transito intestinale, pH

urinario molto acido, ridotta funzionalità renale.

- BILIRUBINA: è normalmente assente nelle urine; se presente è sempre in forma

coniugata. La sua presenza indica un ostacolo intra o extraepatico al passaggio della bile. Per

misurarla si dosa la AZOBILIRUBINA composto che si forma per la reazione della bilirubina con

l’ac. sulfanilico-diazotato.

- NITRITI: si formano dai nitrati nel metabolismo batterico.

- LEUCOCITI: è possibile rilevarne la presenza con lo stick.

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-2- ESAME MICROSCOPICO

E’ possibile rilevare la presenza di globuli rossi, leucociti, cilindri, cristalli, occasionalmente batteri,

cellule epiteliali di sfaldamento, calcoli.

- EMATURIA: può essere:

- macroscopica: visibile a occhio nudo

- microscopica: presenza di più di 2 emazie per campo (400x).

E’ possibile distinguere al sedimento la microematuria di origine glomerulare da quella avente altre

cause. Infatti nel primo caso si osservano emazie piccole, dismorfiche, o tipicamente deformate con

attaccate piccole spicole (ACANTOCITI). Nel secondo caso le emazie sono uniformi a disco

biconcavo.

- Cause ematuria:

- microematuria glomerulare: nefropatia da IgA, ispessimento della membrana basale,

glomerulonefriti

- microematuria non glomerulare: pielonefrite, nefrolitiasi, infezioni, neoplasie vescicali o

della prostata.

- LEUCOCITURIA: costituita prevalentemente da polimorfonucleati. E’ espressione di un

processo infiammatorio acuto in atto.

- Cause: cistiti, prostatiti, uretriti, neoplasie vescicali, calcolosi, tubercolosi renale, pielonefriti.

- CILINDRI: derivano da proteine (tipo Tamm-Horsfall) che prendono la forma del tubulo,

precipitando a causa del pH urinario acido. All’interno dei cilindri possono rimanere intrappolati

cellule tubulari desquamate, leucociti, emazie per cui si distinguono cilindri IALINI,

GRANULOSI, LEUCOCITARI, EMATICI. Pochi cilindri ialini isolati non sono un reperto

patologico.

Cilindri ialini + granulosi→indice di sofferenza renale

- CELLULE EPITELIALI:

Provengono dallo sfaldamento della mucosa del tratto urinario.

- CRISTALLI:

La loro presenza è significativa solo se si trovano in quantità consistente. La precipitazione e il tipo

di cristallo dipendono dal volume e dal pH urinari:

- pH alcalino→sali di CaPO4

- pH acido→cristalli di acido urico.

I cristalli di fosfato di NH4+ indicano la presenza di GRAM‒ produttori di ureasi.

CONTA di ADDIS

Vengono eliminati con le urine nelle 24h

- fino a 1000000 di GR

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- fino a 2000000 di globuli bianchi

- fino a 10000 cilindri

Capitolo 6

EMOSTASI

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EMOSTASI

EMOSTASI: processo che arresta l’emorragia

- reazione infiammatoria locale fattori locali

- reazione vascolare: vasocostrizione per

emostasi primaria trombossano A2, serotonina, Epi,

NA dalle piastrine attivate

- formazione tappo emostatico: legame con endotelio danneggiato

1) Attivazione piastrinica -1-adesione delle piastrine

-2-aggregazione delle piastrine

legame con altre

piastrine

ADESIONE: interazione tra un recettore di membrana della piastrina e un ligando espresso

dall’endotelio danneggito (fattore di von Willebrand)

LIGANDI RECETTORI

fattore di von Willebrand complesso glicoproteico Ib-IX

collageno complesso glicoproteico Ia-IIa

ADP

trombina

trombossano A2

adrenalina

fattore di attivazione piastrinico

il LEGAME PORTA all’EMISSIONE di PSEUDOPODI UTILI per AGGREGAZIONE

AGGREGAZIONE: interazione tra glicoproteine IIb e IIIa e fibrinogeno e fibronectina, altra

glicoproteina, e trombospondina e fibrinogeno

Ia, IIa, IIIa, Ib, IIb → INTEGRINE

2) Reazione di rilascio

Degranulazione piastrine con rilascio di serotonina, ADP, istamina, ATP, Ca2+, fattore

piastrinico-4, fattore di crescita derivato dalle piastrine, proteine della coagulazione,

proteine di adesione (fibrinogeno, trombospondina, fattore di von Willebrand).

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69

3) Coagulazione [3) e 4) → emostasi secondaria]

Cascata di reazioni che portano alla conversione del fibrinogeno in fibrina

2 modalità di attivazione:

INTRINSECA → contatto con superfici e precallicreina FATTORE TISSUTALE

ESTRINSECA → danno tissutale o processo infiammatorio promuove coagulazione

4) Retrazione del coagulo

Stabilizzazione del coagulo tramite contrazione (stimolazione trombina) degli pseudopodi

di actina e miosina delle piastrine

5) Fibrinolisi → emostasi terziaria

Dissoluzione del coagulo per ripristinare il flusso sanguigno. Promossa da PLASMINA

Degrada fibrina → FRAMMENTI di FIBRINOGENO → azione anticoagulante

Degrada alcuni fattori della coagulazione 1.blocca fattore tissutale

2.ostacola aggregazione piastrinica

3.inibisce formazione fibrina

PLASMINOGENO

tipo t e tipo u

attivato dall’endotelio, inibito da endotelio PAI1),

fattore XII fibroblasti (PAI1), monociti,

fattore di Hageman placenta (PAI2), epatociti (PAI3)

Collageno e LPS

Fattore XII fibrinolisi

chinine C’ coagulazione

attivano C’ induce danno

tissutale e quindi attiva

coagulazione e fibrinolisi

più fagociti

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70

produce IL-1, TNFα, ROS

e fattore tissutale

MECCANISMI CHE BLOCCANO L’EMOSTASI

1 plasmina

2 EPARANSOLFATO-ANTITROMBINA III

- inattiva fattori serinproteasici della coagulazione

- lega trombina all’endotelio → trombina diventa anticoagulante dopo legame con

antitrombina

L’eparina accelera la reazione di 2000 volte.

3 MECCANISMO PROTEINA C- PROTEINA S

Si attiva se la quantità di trombina supera la capacità inibitoria dell’antitrombina III → interviene

TROMBOMODULINA.

La trombina si lega alla trombomodulina → attivazione PROTEINA C

Proteina C si lega alla proteina S, a sua volta legata all’endotelio

Complesso proteinaC-proteinaS → DEGRADAZIONE FATTORI SERINPROTEASICI Va

e VIIa

4 WARFARINA

Inibisce vitamina K → no sintesi fattori coagulazione.

3) Coagulazione: la cascata delle proteasi attiva la trombina che a sua volta attiva le piastrine

legandosi a recettori specifici della loro membrana. Dopo il legame le piastrine espongono

fosfolipidi a carica negativa e recettori come l’integrina αIIb, β3 per il legame con il fibrinogeno.

TF lega VII e VIIa (forma attivata)

TF-VII TF-VIIa ← attivato per danno tissutale

attivano

Xa, IXa, VIIa

X, IX

retro attivazione con amplificazione

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71

MOLECOLA DEL FIBRINOGENO

Molecola simmetrica costituita da 3 catene α, β, γ avvolte in una struttura ad α-elica, un dominio

centrale E e da 2domini laterali D

γ α α γ

D E D

β β

La trombina agisce sul dominio E e stacca 2 peptidi: FIBRINOPEPTIDI A e B. Tale distacco

porta alla perdita di equilibrio nella molecola e a un successivo riarrangiamento che coinvolge più

molecole di fibrinogeno che si aggregano tra loro secondo una geometria ben precisa:

D D E D D E

E D D E D D

Come ultima tappa nella stabilizzazione del complesso venutosi a formare, intervengono fattore

XIII e Ca2+

che formano legami crociati tra le subunità D

D D E D D E

E D D E D D

RIASSUNTO:

molecola fibrinogeno

proteolisi

polimerizzazione (legami semplici tra le subunità) D D

solubilizzazione (fattore XIII fa legami crociati tra le subunità) D D

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72

TEST CHE VALUTANO IL RISCHIO EMORRAGICO

1- CONTA PIASTRINICA

2- TEMPO di EMORRAGIA

E’ un indicatore dell’emostasi primaria (vasocostrizione e formazione del tappo piastrinico). E’ un

test che ha un’utilità clinica limitata perché è a bassa sensibilità, specificità e riproducibilità.

Esistono diversi metodi per riprodurlo:

-bucare il lobo dell’orecchio e asciugare le gocce di sangue, cronometrando in quanto

tempo si blocca l’emorragia

-disinfettare la cute dell’avambraccio con etere, attendendo la vasocostrizione.

Applicare lo sfigmomanometro al braccio e mantenerlo alla pressione di 40 mmHg.

Incidere la cute e cronometrare il tempo che intercorre fino all’arresto del

sanguinamento.

Intervalli di riferimento:

- 1-7 minuti normale

- >10 minuti patologico → sospetta piastrinopenia

- 8-10 minuti da chiarire (fare prova di tolleranza all’aspirina)

3- TEMPO di QUICK o TEMPO di PROTROMBINA (PT)

Test che valuta la via estrinseca: è sensibile all’attività dei fattori V, VII, X, II, ma non il IX. Il test

si basa sul cronometraggio del tempo di coagulazione del plasma dopo l’aggiunta di

TROMBOPLASTINA CALCICA.

- TROMBOPLASTINA: miscela di proteine e fosfolipidi estratta da vari tessuti (cervello,

polmone, placenta) che contiene molto fattore tissutale e fosfolipidi.

- CALCICA: presenza di ioni Ca2+ che si legano al citrato, facendolo precipitare come

citrato di Ca2+ e riattivando la coagulazione.

La velocità di formazione della fibrina in queste condizioni è direttamente proporzionale (α) alla

[VII] e dei fattori della via comune. Il PT è utile per 2 scopi:

-1-monitoraggio della terapia anticoagulante orale TAO

-2-diagnosi di anomalie della coagulazione o epatopatie.

Metodica per eseguire il test:

- Prelievo: prelevare il sangue usando citrato di Na+ come anticoagulante in un rapporto

citrato/sangue = 1:10. Solitamente 4,5 ml di sangue e 0,5 ml di citrato (provette già calibrate).

Agitare al provetta e centrifugare. I test di coagulazione si eseguono sul plasma.

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73

- Test: aggiungere la tromboplastina calcica. Inclinare continuamente la provetta fino alla

formazione del coagulo di fibrina e registrare il tempo.

- ≈ 13 sec. TEMPO NORMALE

Il test deve essere standardizzato affinché sia possibile un confronto tra i vari risultati ottenuti. Il

problema è che ogni laboratorio ha delle tromboplastine con sensibilità diversa. Oggi esiste una

tromboplastina con PREPARAZIONE INTERNAZIONALE di RIFERIMENTO (IRP) da

utilizzare per calibrare le altre tromboplastine in modo tale

che: ottenuto con una tromboplastina qualsiasi possa

essere convertito in una scala comune

1) eseguo il test con la tromboplastina del mio laboratorio

2) rapporto i sec del mio pz con i secondi del valore medio normale (IRP)

3) ottengo ISI = indice di sensibilità internazionale

4) converto il rapporto ottenuto con la mia tromboplastina nel RAPPORTO

INTERNAZIONALE NORMALIZZATO (INR) = rapporto che si sarebbe ottenuto se il

PT fosse stato eseguito con la tromboplastina IRP

- INR = 1 VALORE NORMALE

- INR = 2-3 PZ in TAO

4- TEMPO di TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (APTT)

Test che valuta la via intrinseca. Si basa sul cronometraggio del tempo di coagulazione del plasma,

con le stesse modalità del PT, dopo l’aggiunta di un attivatore (CaCl2) che attiva i fattori della fase

di contatto e la tromboplastina parziale.

- TROMBOPLASTINA PARZIALE = non contiene TF

Limite del test: impossibile la standardizzazione. Si esegue principalmente per 3 ragioni:

-1-screening dei disordini della coagulazione (es. emofilia)

-2-monitoraggio della terapia anticoagulante con eparina

-3-individuazione di inibitori dei fattori della coagulazione

34-36 sec TEMPO NORMALE

ANOMALIE di TP e APTT

- Allungamento APTT: deficit di un fattore della via intrinseca: precallicreina, chininogeno, fattore

XII, XI, IX e VIII

- Allungamento TP: deficit del fattore VII

- Allungamento di entrambi: deficit di un fattore della via comune: fattore X, V, II o fibrinogeno.

In caso di allungamento di APTT eseguire il TEST della MISCELA per valutare se la causa è il

deficit di un fattore della coagulazione o la presenza di un inibitore di qualche fattore. Nel primo

caso eseguire:

DOSAGGIO dei FATTORI Fattori II, V, X, VII sono dosati determinando l’abilità del plasma del pz di correggere il PT di un

plasma carente del fattore che deve essere dosato. I fattori XII, XI, IX e VIII usano invece APTT.

ITER DIAGNOSTICO - test globali → tempo di emorragia

↓

- test settoriali → TP, APTT

↓

- test fattoriali → dosaggio dei fattori

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74

TROMBOSI

La trombosi ha un’incidenza > dell’emorragia. Si manifesta prevalentemente come trombosi venosa

profonda che può portare a embolia polmonare.

tendenza tendenza

all’emorragia alla trombosi

CAUSE di EMORRAGIA CAUSE di TROMBOSI

trombocitopenia carenza di inibitori della coagulazione AT-III,

prot. C, prot. S

trombocitopatia attivazione della coagulazione (lesione tissutale,

superfici estranee, turbolenza, tossine, chinine,

stasi, neoplasie)

carenza di fattori della coagulazione aumento della viscosità del sangue

carenza di α2-antiplasmina (iperfibrinolisi)

formazione di inibitori o Ab

Fattori di rischio trombotico:

- diabete

- placche aterosclerotiche

- malattie virali

- protesi artificiali

- tumori

- traumi e ingessature

- fattori attivanti la coagulazione (danno vasale – contatto – adesione – aggregazione

reversibile – aggregazione irreversibile – modificazioni morfologiche - release – trombo bianco

RELEASE: ADP e TXA2 → aggreganti e vasocostrittori

equilibrio

emostatico

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75

TEST che VALUTANO il RISCHIO TROMBOTICO

1- ANTIROMBINA

Esiste un difetto congenito di antitrombina-III che può presentarsi in 2 forme:

- tipo I: riduzione [AT]

- tipo II: [AT] normale e attività ridotta

Per il dosaggio di AT si utilizza il metodo cromogenico: prendere plasma pz, aggiungere trombina

ed eparina; la trombina non inibita, misurata con un substrato cromo genico sensibile è

proporzionale all’AT presente nel plasma.

2- PROTEINA C- PROTEINA S

Esistono dei difetti congeniti delle proteine C ed S. Altra causa di deficit sono le epatopatie. i

metodi dosaggio sono coagulativi.

3- FATTORE V di LEIDEN

E’ possibile il verificarsi una resistenza alla proteina C attivata a causa di una mutazione puntiforme

del gene del fattore V geneticamente trasmissibile. Ne consegue uno stato di ipercoagulabilità.

L’APC-R è evidenziata con il rapporto tra:

La conferma è data dalla biologia molecolare.

4- DOSAGGIO del DIMERO-D

L’azione della plasmina sulla fibrina porta alla formazione di 2 prodotti terminali: i monomeri E e i

dimeri D (non può scindere i legami crociati). Il dosaggio del dimero-D può escludere una TEV

recente se sono basse le concentrazioni. Il dosaggio avviene tramite l’utilizzo di anticorpi

monoclonali e tecniche immunoenzimatiche (ELISA).

D D dimero-D

TROMBINA

proteolisi 2 peptidi A

2 peptidi B

↓

monomeri di fibrina

↓

fibrina polimerizzata

↓ ← XIII

coagulo

PLASMINA

2 peptidi A, 2 peptidi B, 2 peptidi C

↓

FDPX

↓

FDPY + FDPD

↓

FDPE + FDPD

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76

FDP = prodotti di degradazione del fibrinogeno

5- FRAMMENTO di PROTROMBINA e FIBRINOPEPTIDE A

Al fine di valutare il rischio trombotico individuale è importante dosare nel plasma del pz anche i

marcatori di attivazione. I più importanti sono il frammento di protrombina (valuta la quantità di

trombina formata) e il fibrinopeptide A.

ALTRE RARE CAUSE di TROMBOFILIA

- anticoagulante lupico (LA): Ab che agisce contro le proteine plasmatiche con alta affinità per i

fosfolipidi (protrombina, chininogeni, proteina C, proteina S)

- iperomocisteinemia: causata da una mutazione al gene MTHFR e correlata positivamente col

rischio di trombosi

- eccessivi livelli plasmatici di F-VIII

- antagonisti della vitamina K: anticoagulanti orali

- inibitori della trombina EMOFILIA

- inibitori del fattore Xa

COAGULAZIONE INTRAVASALE DISSEMINATA (CID)

Sindrome acquisita, caratterizzata da un’attivazione incontrollata della coagulazione nel

microcircolo che, da una parte, porta alla formazione di trombi, e dall’altra ha manifestazioni

emorragiche causate dal consumo dei fattori della coagulazione e dal calo delle piastrine.

La CID è sempre una manifestazione clinica secondaria; le principali cause scatenanti sono

infezioni batteriche, traumi e neoplasie. Indipendentemente dalla causa, il fattore scatenante della

coagulazione è l’esposizione del TF, accompagnato dall’inibizione della fibrinolisi.

In caso di CID il laboratorio documenta:

- Allungamento di PT e APTT

- Trombocitopenia

- Diminuzione degli inibitori della coagulazione AT-III, prot. C e prot. S

- Aumento del D-dimero

FIBRINOGENO

Il dosaggio del fibrinogeno è richiesto in numerose situazioni (è proteina di fase acuta, è correlato

con le cardiopatie ischemiche e le emorragie). Esistono vari sistemi per il dosaggio. I principali

sono 2:

- METODO VON CLAUSS: aggiungere al plasma un eccesso di trombina, il tempo

necessario per la formazione del coagulo è inversamente proporzionale al contenuto in fibrinogeno.

- DOSAGGIO FIB PT-DERIVATO: disegno la curva di coagulazione di un campione di

plasma. Essa riflette la differenza tra il campione prima e dopo la trasformazione del fibrinogeno in

fibrina → correlato con [FIB]

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77

300-400 mg/dl NORMALE

Capitolo 7

SCREENING

e

MONITORAGGIO

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78

TEST di SCREENING per NEONATI

1- TEST per FENILCHETONURIA (PKU)

2- TEST per IPOTIROIDISMO CONGENITO (CH)

3- TEST per IPERPLASIA SURRENALE CONGENITA

Test di screening per PKU e CH sono diffusi in tutti i paesi occidentali. Analisi costo-beneficio

hanno dimostrato che portano a un risparmio di 215000 euro per paziente.

1) IPERFENILALANINEMIE

Derivano dalla mancata o ridotta conversione di Phe in Tyr. La forma più comune è la PKU

caratterizzata dalla ridotta attività della Phe-idrossilasi. Sono note più di 200 mutazioni nel gene di

questo enzima, diverse nei vari gruppi etnici. La mutazione R408W è associata a un severo quadro

clinico e richiede un’attenta restrizione dietetica della Phe, mentre la mutazione I65T è associata a

un quadro più lieve. E’ autosomica recessiva in 1/10000 nati (1:5400 in Irlanda, 1:16000 in

Svizzera)

Clinica: progressivo deficit mentale, microcefalia, iperattività, convulsioni, ritardo mentale. La

restrizione dietetica deve avvenire entro le prime 3 settimane.

DIAGNOSI

- screening di tutti i neonati con il test di Guthrie: si basa sull’impiego di un antagonista

della Phe, la β-L-tienilalanina che aggiunta a un terreno di coltura, impedisce la crescita di Bacillus

Subtilis. Tale inibizione è rimossa dalla Phe ([C] di almeno 4 mg/dl) e la crescita del batterio è tanto

più rigogliosa quanto più è alta la [C] di Phe

- altri metodi di dosaggio: fluorimetrico, GLC

- diagnosi di portatore: carico di 100 mg/kg di Phe

9 mg/dl a 1 h NORMALE

5 mg/dl a 4 h

19 mg/dl a 1 h PORTATORE

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79

2) TIROSINEMIA e CONDIZIONI CORRELATE

- albinismo oculo-cutaneo: dovuto a una ridotta sintesi della melanina, nella maggior parte di questi

casi l’attività della tirosinasi risulta assente o ridotta.

- tirosinemia-I (tirosinosi): ridotta attività della fumarilacetoacetato-idrolasi e della acido idrossi-

fenil-piruvico ossidasi con aumentata [C] plasmatica della tiroxina e dei suoi metaboliti (DOPA) e

della Met. Risulta in un danno epatico (epatite acuta infantile, cirrosi nell’adulto), danno tubulare

renale (sindrome di Fanconi).

- tirosinemia-II: deficit dell’enzima epatico tirosina-amino-transferasi. Risulta in danni oculari

(erosioni corneali) e lesioni alla cute del palmo delle mani e dei piedi (formazione di cristalli di Tyr

intracellulari), a volte ritardo mentale.

- tirosinemia transitoria del neonato: dovuta a immaturità epatica. La Tyr accumulata inibisce la

Phe-idrossilasi (false diagnosi di PKU).

- alcaptonuria: dovuta a deficit di acido-omogentisico (HGA)-ossidasi. HGA si accumula e lega al

collagene. Risulta in artrite e pigmentazione (acronosi).

AMINOACIDURIA

Danno TP. SE associata a rachitismo: sindrome di Fanconi (autosomica recessiva con depositi

intracellulari di Cys). Il difetto è un ostacolato efflusso di Cys dai lisosomi. Nel bambino la causa

più comune è la cistinosi.

Sindrome di Fanconi: disfunzione generalizzata del TP

- iperfosfaturia e ipofosfatemia

- glicosuria

- aminoaciduria

- ipourirecemia

- ipocaliemia

- rachitismo resistente a Vit.D

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80

MONITORAGGIO dei FARMACI

BIODISPONIBILITA’: rapporto tra sostanza somministrata/dose assorbita

[CONC] STAZIONARIA: si ottiene quando la velocità di eliminazione è uguale alla velocità di

assorbimento.

Il monitoraggio dei farmaci è particolarmente importante per i farmaci con indice terapeutico

ristretto ([C] ottimale terapeutica e [C] tossica molto vicine).

FARMACI SOTTOPOSTI a MONITORAGGIO

anticonvulsivanti (fenobarbital) cardioattivi (amiodarone)

immunosoppressori (ciclosporina) antipsicotici (litio)

antibiotici (vancomicina) antiretrovirali (ritonavir)

antitumorali (metotrexate) antivirali (ganciclovir)

FARMACOGENETICA e FARMACOGENOMICA

FARMACOGENETICA: studio della relazione tra le varianti di un singolo gene e gli effetti di un

farmaco.

FARMACOGENOMICA: studio della relazione tra le varianti di vari geni, fino all’intero genoma,

e gli effetti di un farmaco.

geneticamente

predisposti

seri effetti collaterali

risposta inadeguata

pazienti in trattamento

All’interno di ogni popolazione esiste un sottogruppo di individui geneticamente predisposti a

soffrire per effetti collaterali di un farmaco o a rispondere in modo inadeguato. Ciò rimarrà celato

fino a che essi non sono esposti al farmaco. Quindi solo l’esposizione al farmaco o test eseguiti a

priori riveleranno la predisposizione genetica.

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81

La FAMIGLIA del CITOCROMO P-450

Famiglia di citocromi che assorbe la luce a 450 nm con aggiunta di CO. Ci sono 10 famiglie di CYP

che comprendono più di 100 geni. Sono enzimi localizzati nel reticolo endoplasmatico

dell’epatocita. Importante per la detossificazione degli xenobiotici (es. idrossilazione del

fenobarbitale ne facilita l’escrezione). Una delle funzioni più rilevanti del citP450 è il suo ruolo nel

metabolismo dei farmaci.

gene deleto MUTAZIONE PUNTIFORME duplicazione del gene

no enzima enzima enzima alterata alti livelli di enzima

instabile normale specificità

no metabolismo ridotto normale possibilità di aumentato

metabolismo metabolismo nuovo metabolismo metabolismo

Test in clinica:

CYP2D6 → per antidepressivi, antipsicotici, antiaritmici, β-bloccanti, antiipertensivi.

↓

si richiede la ricerca di mutazioni (frequenza 30% nella popolazione) per evitare episodi di tossicità.

Esempio: ISONIAZIDE (anti TBC) può dare epatite fulminante se è mutato l’N-acetil-transferasi-II.

Iniziare con una dose bassa e monitorare l’attività epatica.

2 modalità di diagnosi

DOSAGGIO ATTIVITA’

ENZIMATICA

TEST GENETICO

potenzialmente evidenzia tutti i

difetti (sensibilità 100%)

facile e veloce VANTAGGI

consumo di tempo, non è

automatizzato, richiede

esperienza, falsi negativi dopo

trsfusione

sensibilità limitata (≈75%),

costoso e richiede tempo

SVANTAGGI

SNP: ogni individuo può avere un nucleotide o una base diversa dagli altri in una data locazione o

su un cromosoma.

Esistono delle mappe degli SNP che possono essere usate per predire la risposta a un trattamento: si

classificano i genotipi verso cui il farmaco è efficace e quelli verso cui non lo è.

ANALISI FARMACOLOGICA

- FARMACOLOGIA - studi di farmacocinetica

- studi clinici

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82

- BIOCHIMICA - attività enzimatica, funzione recettoriale, funzione dei trasportatori

- GENETICA - analisi SNP

- sequenziamento genico

TEST GENETICO

malattie genetiche farmaco genetica

rare mendeliane comuni geni del profili SNP

(geni causali) (suscettibilità genica) metabolismo dei per

farmaci metabolismo

dei farmaci

OTTIMA RISPOSTA

RISCHI: implicazioni etiche, legali e sociali.

ORIENTAMENTO della TECNOLOGIA nella CLINICA di LABORATORIO

-TEST GENETICI: con il mappaggio del genoma umano, il campo della diagnostica

molecolare, che include i test genetici, crescerà molto rapidamente.

-FARMACOGENOMICA: studio delle basi genetiche della differenza nella risposta ai

farmaci.

-PROTEOMICA: analisi sistematica delle proteine espresse da una cellula o un tessuto

usando una sensibile, veloce e accurata tecnica di separazione delle proteine e metodi

quantitativi e strumenti di identificazione e caratterizzazione.

- MICRODEVICES BIOMEDICI, NANOTECNOLOGIA, e BIOSENSORI: i micro e nano

devices, con componenti da centinai di micron a pochi nanometri, hanno un potenziale uso

nella diagnosi, prevenzione e trattamento delle malattie.

MEDICINA PERSONALIZZATA: UNA SFIDA PER IL LABORATORIO

L’uso di marker nella diagnosi e terapie bersaglio derivati da un profilo molecolare

individuale rivoluzionerà la cura del paziente.

Principi e conoscenze scientifiche richiesti: - accuratezza dei test e comparabilità dei

risultati tra i laboratori

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83

- attenta selezione, in accordo con i colleghi, di

test che contribuiscono alla decisione clinica

- perdita di fiducia nei confronti di test

sostitutivi

- markers di superficie cellulare e sistemi di

trasduzione

- genomica del paziente, genomica della

patologia, proteo mica e farmaco genomica

- sviluppo della bioinformatica e di sistemi di

informazione medica

CITOMETRIA A FLUSSO

Capacità di misurare le proprietà delle cellule in un flusso.

SORTING o FLUORESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING (FACS)

Capacità di separare le cellule sulla base delle loro proprietà misurate in un flusso.

ANALISI CELLULARE

CLASSICA MICROSCOPIA CITOMETRIA a FLUSSO

- 100 o 1000 cellule/saggio - 10000 o 1000000 di cellule

- + di 5 min/campione - ‒ di 1 min/campione

- risultati soggettivi - risultati oggettivi

- risultati positivi-negativi - risultati numerici

- bassa riproducibilità - alta riproducibilità

- lavoro intensivo - pienamente automatizzato

- non c’è controllo di qualità - controllo di qualità

BASI della CITOMETRIA A FLUSSO

- Parte fluidica cellule in sospensione

fluiscono in singole file attraverso

- Parte ottica un volume illuminato dove loro

spargono la luce e emettono una fluorescenza

che è raccolta, filtrata e

- Parte elettronica convertita i valori digitali

che sono fissati su un computer

Le cellule sono iniettate in una camera in cui è stato creato un flusso laminare che le spinge in un

capillare una alla volta. Qui sono colpite da un laser. Se la cellula è marcata a fluorescenza i raggi

che emette sono catturati da sensori.

la luce è emessa principalmente in 2 direzioni:

FORWARD ANGLE LIGHT SCATTER (FSC) → in avanti

laser sensore

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84

90° LIGHT SCATTER (SSC): → angolo di deviazione

laser sensore

sensore

La luce catturata a FSC è proporzionale alla dimensione delle cellule.

L’entità di SSC è proporzionale alla rugosità cellulare e alle proprietà antigeniche.

Con SSC e FSC nel sangue distinguiamo:

LINFOCITI MONOCITI GRANULOCITI

piccoli e lisci medi e media rugosità grandi e rugosi

Essi sono rappresentati con un istogramma o in DOT PLOT.

Le cellule possono essere marcate con vari fluorocromi. La fluorescenza emessa da ciascuno è

solitamente rilevata in un unico CANALE di FLUORESCENZA. La specificità della rilevazione è

controllata dalla selettività della lunghezza d’onda (λ) dei filtri ottici e degli specchi.

Ogni marcatore rileva una caratteristica diversa

florocromo PROCEDURA

2 POSITIVO POSITIVO -prendere campione biologico

FL2 FL1 e FL2 -Ab monoclonali

-metterlo in soluzione

-analizzarlo

NEGATIVO POSITIVO

FL1 e FL2 FL1

per sangue, urine, CSF, lavaggio

bronco-alveolare, liquido sinoviale.

Bastano 200 μl di materiale.

SORTING: allarga il campo della citometria a flusso con la capacità di dividere e raccogliere le

cellule che esibiscono un set di caratteristiche identificabile sia meccanicamente che tramite

strumenti elettrici. Le caratteristiche da trovare le programma l’operatore. Es: le cellule sono

caricate con un determinato Ag. Sotto ci sono 2 piastre (+/‒ ). Le cellule + entrano nella provetta

sotto la piastra ‒ e viceversa. Si possono isolare cellule presenti in circolo per l’1% con una

purezza del 95%.

APPLICAZIONI della CITOMETRIA A FLUSSO

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- determinazione eterogeneità cellulare - attività dei fagociti

- analisi multiparametrica - metabolismo ossidativo

- dimensione cellulare e struttura interna - contenuto totale DNA e RNA

- Ag di superficie cellulare - composizione del DNA

- studio dell’attività cellulare - apoptosi

- attività enzimi e localizzazione - sorting

- citochine intracellulari

CICLO CELLULARE

Il sorting permette di valutare quante cellule sono in duplicazione. Per rilevare in quale fase del

ciclo sono si utilizza il DNA:

- cellule G0-G1 → euploidi – diploidi

- cellule G2-M → tetraploidi

- cellule ≠ G0 e G1 → aneuploidi

n° cellule

G0-G1 G2-M

S

contenuto DNA

Il sorting può essere utilizzato anche per ricerca di cellule non frequenti (es. eritroblasti fetali dopo

un mese) o per valutare come un soggetto risponde a terapia (leucemie).

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EMOCROMO

Può essere determinato con tecniche manuali (microscopio) o automatizzate (10 volte più sensibili)

ERRORE

CELLULE CONTATE TECNICHE MANUALI TECNICHE

AUTOMATIZZATE

eritrociti ±11% ±1%

globuli bianchi ±16% ±1,5%

piastrine ±22% ±2%

reticolociti ±33,9% ±5%

Emocromo Valori di riferimento

M F

n° degli eritrociti (1012

/litro) 4,6-6,2 4,2-5,4

Hb(cianmetaemoglobina)(g/dl) 13,5-18 12-16

leucociti (109/litro) 4,3-10,8 4,3-10,8

piastrine (109/litro) 130-400 130-400

Hct (ematocrito) 0,42-0,5 0,35-0,45→sempre<50%

MCV (femtolitri)

HCT(%)/RBC(x108/μL)x10

80-98 81-99

MASSA ERITROCITARIA ← MHC (Hb corpuscolare media) pg (10‒ 12

g) valori: 26-32

MCHC (concentrazione Hb corpuscolare) g/dl valori: 32-36

N.B. Importante perché le 2 anemie più diffuse sono la sideropenia e la talassemica

INDICE di ANISOCITOSI ← RDW (ampiezza di distribuzione del volume dei globuli rossi)

valori: 11,5-14,5

Sapere anche il valore degli elettroliti

Neutrofili 0,5x109/litro

TALASSEMIA ETEROZIGOTE: RDW normale; ↓MCV

SIDEROPENIA: ↑RDW; MCV basso-normale

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Falso ↑MCV: agglutinine fredde, iperglicemia (già attiva nella cellula la soluzione del flusso

durante l’esame)

Falso ↑MCH: iperlipidemia.

Per la conta delle cellule a mano si usa il reticolo di Burker

METODI AUTOMATICI

PRELIEVO: minimizzare l’impiego del laccio per minimizzare l’emoconcentrazione; mescolare

bene con l’anticoagulante.

DILUIZIONE: il tipo di fluido e l’entità della diluizione dipendono dal tipo di cellula da valutare.

CONTEGGIO: sistema ad impedenza, sistema ottico, sistema misto

IMPEDENZA = resistenza

elettrodi

Se non ci sono cellule la corrente

passa tranquillamente.

flusso→ → → Se ci sono si calcola la resistenza.

apertura

Oggi un potente strumento per l’analisi delle cellule del sangue (specialmente globuli bianchi e

reticolociti) è COULTER 3D-VCS tecnology che mostra elevata sensibilità, specificità ed efficienza

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APOPTOSI

Programma di morte cellulare energia-dipendente.

APOPTOSI NECROSI

processo attivo processo passivo

shrinkage cellulare rigonfiamento cellulare

condensazione nucleare

membrana intatta rottura membrana

non flogosi reazione flogistica

L’apoptosi gioca un ruolo attivo nella regolazione della risposta immune e probabilmente nella

patogenesi di alcune malattie autoimmuni (molti autoAg sono substrati per le caspasi).

Caratteristica principale è l’autodigestione controllata della cellula per mezzo dell’attivazione di

proteasi endogene (caspasi). Queste causano la distruzione del citoscheletro (BLEBBING) con

esposizione sulla superficie cellulare esterna della FOSFATIDILSERINA, segnale per i macrofagi.

L’attivazione delle endonucleasi provoca la frammentazione del DNA con condensazione del

nucleo. La perdita della funzione mitocondriale è un evento iniziale e irreversibile.

CASPASI (almeno 10 note)

Proteasi cisteiniche aspartato-specifiche intracellulari. I proenzimi sono attivati dalla rimozione

proteolitica di un frammento N-terminale e dalla formazione di 2 subunità.

Substrati: - proteine coinvolte nella riparazione cellulare

- proteine coinvolte nel controllo del ciclo cellulare

- proteine coinvolte nella trasduzione del segnale

- proteine coinvolte nell’integrità strutturale della cellula

PROTEINE DELLA FAMIGLIA BCL-2

Importanti regolatrici della sopravvivenza cellulare.

La famiglia comprende sia proteine anti-apoptotiche (BCL-2) sia pro-apoptotiche (BID).

Modificano la soglia di suscettibilità della cellula all’apoptosi. Possiedono una regione C-terminale

idrofobca che permette l’ancoraggio alla membrana del RE, del mitocondrio e del nucleo ( di cui

regolano la permeabilità). → impediscono il rigonfiamento del mitocondrio con fuoriuscita del cytC

Legano inoltre APAF-1, proteina coinvolta nell’attivazione delle caspasi.

CITOCROMO C

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Normalmente localizzato nello spazio intermembrana mitocondriale. Nelle fasi precoci

dell’apoptosi esce nel citosol. Si lega a APAF attivando la caspasi 9.

PROTEINA FAS TNF RECETTORE-RELATA→ SEGNALE ESTERNO

Il ligando FAS è una proteina trimerica, che legando al suo recettore lo trimerizza (è omotrimero),

attivandolo. Ciò porta al reclutamento della proteina FADD che contiene un dominio della morte in

grado di attivare le caspasi 8, per clivaggio autocatalitico. La caspasi 8 attivata determina

l’attivazione a cascara delle altre caspasi. Questo processo può essere modulato da proteine della

famiglia BCL-2.

METODI di STUDIO dell’APOPTOSI

1- Metodo più chiaro e indiscusso: microscopia elettronica

2- Valutazione della frammentazione della cromatina nucleare mediante:

-elettroforesi del DNA estratto produce una scala caratteristica di frammenti

di oligonucleosomi

-metodi di citometria a flusso che combinano la frammentazione specifica del

DNA e l’integrità della membrana cellulare per distinguere l’apoptosi dalla

necrosi

TUNEL: tecnica che rileva le rotture del DNA marcando l’estremità 3’OH con nucleotidi coniugati

a fluorocromi o a biotina per mezzo di una reazione catalizzata da DNA-polimerasi. Può dare però

risultati falsamente positivi in cellule che sono andate incontro a rotture del DNA non apoptotiche.

Metodo complesso e difficilmente automatizzabile.

3- Annexina V (metodo semplice e robusto, probabilmente il migliore). Durante le fasi precoci

dell’apoptosi la fosfatidilserina (PS) è esposta sulla membrana cellulare esterna. L’annessina

V è una proteina legante i fosfolipidi in presenza di Ca2+ con alta affinità per la PS (è

unasonda sensibile per l’apoptosi). Si usa citometria a flusso con doppia colorazione e 2

markers:

- FITC-annessina V

- ioduro di propidio che colora le cellule necrotiche (valuta integrità cellulare)

ioduro di

propidio NESSUNA CELLULE

CELLULA NECROTICHE

CELLULE CELLULE

SANE APOPTOTICHE

annessina V

4- Metodo dell’Apo2.7

L’Ab apo2.7 riconosce una proteina di membrana mitocondriale che è esposta nelle cellule

nelle prime fasi dell’apoptosi. E’ possibile valutare questo Ag in citofluorimetria.

5- Determinazione dell’attività delle caspasi

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Utilizzo di un substrato caspasi-sensibile e misurazione fluorimetrica

Capitolo 8

EQUILIBRIO

ACIDO-BASE

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EQUILIBRIO ACIDO-BASE

ACIDO: sostanza in grado di cedere protoni

BASE: sostanza in grado di accettare protoni

Il pH del sangue arterioso è determinato dal rapporto tra la [HCO3‒

] e la pCO2

Il rapporto intercorrente tra queste variabili è espresso dall’equazione di Henderson-Hasselbach

HCO3‒

]/[H2CO3]

Ricordando l’equilibrio tra queste reazioni:

CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3‒

L’equazione può essere espresso in questo modo:

pH = pK + Log [HCO3‒

]/(pCO2⋅0,03)

- [HCO3‒

] = 24 mMoli/L [HCO3‒

]/pCO2 = 20

- pCO2 = 40 mmHg

-pK = 6,1 per il sistema tampone H2CO3/ HCO3‒

Da qui si ricava che

pH(sangue) = 6,1 + Log 20 = 7,4

pH 7,35-7,45 → normale

6,8-7,8 → compatibile con la vita

pCO2: componente respiratoria dell’equilibrio acido-base. Il suo valore dipende dalla funzione

polmonare.

HCO3‒

: componente metabolico dell’equilibrio acido-base. Il suo valore

dipende dalla funzionalità renale e da quella epatica ( la produzione di urea avviene a partire da

NH4+ e HCO3‒

).

Il controllo della ventilazione è effettuato dal centro respiratorio bulbare che è attivato dall’↑ di

pCO2.

Il rene rigenera HCO3‒

con 3 meccanismi principali:

- riassorbimento di HCO3‒

nel TD e DC con il sodio

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- scambio di HCO3‒

con H+ (acido titolabile)

- formazione di HCO3‒

ex novo a partire dalla glutammina.

Le cause che modificano il pH sono:

METABOLICHE → compenso respiratorio (rapido 3-6 h)

RESPIRATORIE → compenso metabolico (lento, anche giorni).

1. ACIDOSI METABOLICA

Causa dell’acidosi è l’aumento degli ioni H+, che vebgono tamponati da HCO3-, la cui [C]↓

nel plasma. La base HCO3- è sostituita da Cl- (acidosi IPERCLOREMICHE) o con anioni

patologici quali ac. lattico, corpi chetonici (es. cheto acidosi diabetica) (acidosi

IPOCLOREMICHE con ALTO GAP ANIONICO). Compenso respiratorio (↑VP con

↓pCO2) e infine compenso renale con escrezione di ioni H+

- CARATTERISTICHE PRINCIPALI

- ↓pH - ↑H+

- ↓pCO2

- ↓HCO3-

- ↑Cl o normale

2. ALCALOSI METABOLICA

Causa dell’alcalosi è l’↑ [HCO3-] nel plasma per vomito prolungato, somministrazione di

mezzi di contrasto,… Il compenso è respiratorio (↓VP con ↑pCO2); in seguito si attiva il

compenso renale che ↑ l’escrezione di HCO3-.


- ↑pH - ↓H+

- ↑HCO3-

- ↑pCO2

3. ACIDOSI RESPIRATORIA

Causata da ↑pCO2 per difficoltà di ventilazione, insufficienza respiratoria, asma, grave

broncopatia ostruttiva che impedisce l’eliminazione della CO2. Il compenso è renale con

↑HCO3-


- ↓pH - ↑H+

- ↑pCO2

- ↑HCO3-

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4. ALCALOSI RESPIRATORIA

Causata da ↓pCO2 legata ad aumento dell’attività respiratoria (febbre, anemia, stati d’ansia).

Compenso renale che trattiene H+ ed elimina HCO3-


- ↑pH - ↓H+

- ↓pCO2

- ↓HCO3-

GAP ANIONICO

E’ una valutazione di ioni plasmatici non misurati che si ottiene sottraendo dalla somma dei cationi

(Na+ e K+) la somma degli anioni (HCO3- e Cl-)

G.A. = Na+ + K

+ ‒ Cl

‒ ‒ HCO3

‒

G.A. = 8 ‒ 12 μmol/L VALORI MEDI

G.A. > 17 μmol/L PATOLOGICO

Il GA è utile nella diagnosi differenziale di acidosi metabolica, dal momento che molte sono

caratterizzate dal tipo di anione che aumenta (ac. lattico, corpi chetonici,…)

MIDALITA’ di PRELIEVO EMOGASANALISI

Il prelievo arterioso si esegue sull’arteria radiale. Sono indispensabili stretta anaerobiosi,

conservazione in ghiaccio e processazione rapida.

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Capitolo 9

MARCATORI

TUMORALI

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MARCATORI TUMORALI

La diagnosi definitiva di tumore si compone di 3 fasi: - 1 – diagnostica per immagini - 2 – indagini sierologiche - 3 – indagini anatomo-patologiche Approccio del laboratorio di analisi alla malattia tumorale: analisi del prelievo ematico per giungere a una diagnosi legata al fatto che il tumore rilascia in circolo molecole che lo rappresentano. La trasformazione neoplastica è infatti associata all’espressione di proteine anomale che poi vanno in circolo (situazione ideale). In realtà: 1) solo una piccola parte delle proteine è implicata nella trasformazione neoplastica; 2) sono rilasciate in piccole quantità Per questo la biopsia è più sicura per una diagnosi. Breve storia dei marcatori tumorali. 1846: proteina di BJ 1928: sindrome ormone ectopico 1930: hCG (tumori placentari) 1932: ACTH 1949: delezione Ag gruppi sanguigni 1959: isoenzimi 1963: AFP (α-feto-proteina) 1965: CEA (Ag carcino-embrionale) 1969: oncogeni 1975: Ab monoclonali (utili come reagenti per evidenziare markers) 1980: 1985: geni oncosoppressori Potenziale uso dei markers tumoral. - screening della popolazione - diagnosi differenziali su pz.

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- valutazione stadio clinico del tumore - stima del volume del tumore - indicatore prognostico di progressione - radioimmunolocalizzazione della massa tumorale - valutazione successo del trattamento - valutazione eventuale recidiva - monitoraggio risposta alla terapia - determinazione direzione di immunoterapia Nella diagnostica più comune l’uso del marker è valutare il successo della terapia e le eventuali ricadute.

ENZIMI COME MARKERS ALT: fegato LDH: fegato ALP: osso, fegato (isoenzima L1), leucemia, sarcoma AFP: Ag oncofetale (presente nella vita fetale, è riespresso in caso di tumore). Utile nella

diagnostica del carcinoma epatocellulare (ATTENZIONE! non tutti lo secernono). E’ come ALB col 4% di glicosilazione.

CEA: 160 aa, differentemente glicosilato. Presenta grande eterogeneità e quindi è di difficile

standardizzazione. Associato a tumore del pancreas, colon, stomaco, polmone, mammella.

PROTEINE COME MARKERS FERRITINA: aumenta in caso di neoplasia del fegato Ag CELLULO-SQUAMOSO: cervice, pelle, polmone, faringe Ag TISSUTALI: riconducibili a frammenti di citocheratine 8- 18- 19 (sono elementi

del citoscheletro). Il più famoso è SARIFA (da citocheratina 19). Associati a tumore della mammella, ovaio, colecisti, colon, vescica.

MUCINE COME MARKERS

Oligosaccaridi complessi legati a proteina transmembranaria. Composti da 50-80% carboidrati e acido sialico. Danno viscosità alla soluzione in cui sono identificate. Le mucine compaiono a seguito di un’alterazione della glucosiltransferasi che altera a sua volta la struttura cellulare. La cellula perde così la sua polarità e le mucine vanno in circolo. Esse vengono indicate con la sigla CA (Carboidrato Ag) + numero corrispondente all’Ab monoclonale che mette in evidenza l’Ag.

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CA 15.3: proteina MUC-1 con dominio centrale e un numero variabile di tandem repeat

(VNTR). Tumore della mammella MCA: tumore della mammella (non si usa più) CA 125: oligosaccaride, aumenta nel tumore dell’ovaio DU-PAN Z: per il pancreas, ma non si usa più CA 19.9: costituito da un epitopo glucidico sialilato denominato SIALIL……..

Pancreas, colon, retto

ALTRI MARKERS RECETTORI per ESTROGENI e PROGESTERONE: mammella METABOLITI CATECOLAMINE: nelle urine. Neuroblastoma (si forma nel cranio e nei gangli

addominali) e feocromocitoma IDROSSIPROLINA: per metastasi ossee

ONCOGENI TROVATI in TUMORI UMANI

FUNZIONE PRODOTTI TUMORE

mutazione proteina RAS

trasduzione del segnale

GTP/GDP binding protein

leucemia, neuroblastoma,

linfoma

traslocazione C. myc

regolazione della

trascrizione

lega DNA linfoma cellule B e T,

carcinoma polmone a

piccole cellule

amplificazione C. erb B2

recettore per EGF

tirosina-chinasi mammella, ovaio, intestino

Non sono specifici dei tessuti

GENI ONCOSOPPRESSORI mutazione p53: mammella, colon, vescica, polmone, rene, sarcoma, colecisti mutazione APC: colon, retto

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Obiettivo clinico - diagnosi differenziale (distinguere tumore benigno da maligno) - bilancio di base - risposta al trattamento primario - riconoscimento della progressione della malattia - monitoraggio della malattia avanzata ATTENZIONE!!! Molte condizioni benigne ↑ i markers

CONDIZIONE MARCATORI - abitudini voluttuarie

-fumo CEA, TPA (antigene polipeptidico tissutale) -alcol CEA, TPA - condizioni fisiologiche -allattamento MCA -ciclo mestruale CA 125 -gravidanza AFP, βhCG, TPA, CEA, CA 125, MCA - patologie non neoplastiche -ittero CA 125, CA 19.9, TPA -pancreatite CA 125, CA 19.9 -nefropatia cronica CEA, TPA, β2microglobulina -ipertrofia prostatica PSA, PAP -endometriosi CA 125 -epatite cronica CEA, TPA, AFP, CA 19.9, CA 125, CA 15.3 -polmonite CEA, TPA -malattie reumatiche CA 19.9

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MARCATORI di EVIDENTE UTILITA’ CLINICA

AFP epatocarcinoma, tumore germinale di testicolo e ovaio

CA 15.3 mammella

CA 125 ovaio

CA 19.9 pancreas, stomaco, colon

CEA colon-retto, fasi avanzate di tutti i tumori

HER 2 (rec. EGF) mammella

NSE (enolasi neuro-specifica) carcinoma micro cellulare del polmone e tutti quelli che derivano dalla cresta

neuronale

PSA (Ag prostatico specifico) prostata

fPSA (frazione libera) prostata

hCT calcitonina carcinoma midollare della tiroide

hTC tireoglobulina carcinoma differenziato della tiroide

catecolamine carcinoide, tumore neuroendocrino

Ag cellulo-squamoso collo dell’utero

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hCG vescica, corio-carcinoma, ovaio, testicolo

CM-BJ Mieloma Multiplo

CgA (cromogranina A) tumori neuroendocrini

CARATTERISTICHE dei PRINCIPALI MARKERS - CEA - t1/2 = 6-8 gg ↓CEA: intervento chirurgico, successo terapia ↑CEA: patologia benigna del tratto gastroenterico, fegato, polmone, insufficienza renale cronica Se[CEA] è costante per lungo tempo probabilmente la patologia è maligna - AFP - t1/2 = 5-6 gg ↑ gravidanza, epatopatia cronica - CA 15.3 e CYFRA 21.1 - t1/2 non noto ↑epatopatie - NSE - ↑ emolisi campione - CT - t1/2 = 2-15 minuti → utile fare più prelievi per valutare l’operazione già in sede intraoperatoria ↑ insufficienza renale cronica, iperparatiroidismo, morbo di Paget - TPS - ↑ patologia benigna del tratto gastrointestinale - PSA - marker tumorale callicreina. Membro delle proteasi a callicreina, è prodotto dalle cellule epiteliali secretorie della prostata. Si trova nel liquido seminale (mg/dl) in cui ha la funzione di proteasi (semelogelina e fibronectina) per aumentare la mobilità degli spermatozoi. Nel siero la [C] è nell’ordine dei ng/ml. ↑ a seconda del numero delle cellule tumorali

colon-retto I^ scelta: CEA (bilancio di base) II^ scelta: CA 19.9, TPA

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stomaco CA 19.9, CA 72.4, CEA

fegato AFP, ferritina

ovaio AFP (germinale), hCG

prostata PSA totale e lbero

polmone NSE (microcitoma), CYFRA (spino cellulare), CEA (adenocarcinoma=origine epiteliale)

Capitolo 10

MALATTIE

AUTOIMMUNI

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MALATTIE AUTOIMMUNI

Causa: errore del sistema immunitario che produce anticorpi diretti contro Ag-self

Si distinguono in - malattie sistemiche: LES, artrite reumatoide

- malattie d’organo: tiroidite di Hashimoto, malattie renali, epatiti, cirrosi

biliare, colite ulcerosa, gastrite atrofica, piastrinopenie, anemia emolitica,

malattie emorragiche (Ab contro fattori della coagulazione)

MALATTIE SISTEMICHE

Nelle malattie autoimmuni si ricercano gli Ab autoimmuni con tecniche immunoenzimatiche,

immunofluorescenti e radioimmunologiche.

Gli Ab possono avere vari bersagli:

- Ab anti-nucleo (ANA o FAN)

Si utilizzano vetrini con cellule a cui viene aggiunto il siero del pz. Se ci sono Ab anti-

nucleo questi si legano alle cellule. Si aggiunge un Ab anti-Ig marcato con fluoro

cromo. Osservare con microscopio a fluorescenza.

ENA: sottoclasse degli Ab anti-nucleo. Ab diretti contro strutture nucleari estraibili

con fisiologica (ribinucleoprotine)→ pattern centromerico.

Per identificare gli ENA si usa CRITHIDIA LUCILIAE, un parassita dotato di un nucleo e

di un flagello con DNA a doppia elica e presenza di DNA a singola elica nel nucleo.

- Ab contro nucleoli (RNA, non DNA)

- Ab anti topo-isomerasi

- Ab anti-mitocondriali

Dosare poi il titolo anticorpale

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- LES: - ANA anti ds-DNA (double strand), tranne nel caso di LES farmacologico → (Ab

anti-istone)

- ENA

- SCLEROSI SITEMICA: - ANA

- ENA

- Ab anti-topoisomerasi I

- ARTRITE REUMATOIDE: - Ab antinucleo negativi

- IgM anti-IgG = fattore reumatoide (FR) NON SPECIFICO

- Ab anti-peptide citrulli nato

- SCLERODERMIA CUTANEA: - Ab anti SCL-70

- Ab anti-actina

- Ab anti-mitocondriali

MALATTIE d’ORGANO

- TIROIDITE: - Ab anti-tireoglobulina

- Ab anti-perossidasi

(da richiedere per diagnosi e monitoraggio)

- IPERTIROIDISMO AUTOIMMUNE (morbo di Graves): - Ab anti recettore del TSH (si legano al

recettore e lo attivano)

- MORBO CELIACO: - IgA anti-glutine → NON SPECIFICI

Per diagnosi ricercare: - Ab anti-transglutaminasi

- Ab anti-endomisio

- DIABETE TIPO 1: - Ab anti-isole

- Ab anti-recettore insulina

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Capitolo 11

EMOGLOBINOPATIE

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EMOGLOBINOPATIE

Le emoglobinopatie si distinguono in qualitative e quantitative.

- QUANTITATIVE: riduzione dell’espressione di una o più catene globiniche → TALASSEMIA

- QUALITATIVA: derivano dall’alterazione strutturale della molecola che causa falcizzazione

(HbS), alterazione dell’affinità per O2, ecc…

Struttura dell’Hb

L’Hb è una proteina tetramerica contenente 4 gruppi eme, uno per ogni subunità. HbA1 (normale,

dell’adulto) contiene 2 tipi di globina: 2 catene α e 2 catene β. L’eme, costituito dalla proto

porfirina IX e da Fe2+, è situato in una tasca costituita a sua volta da Leucina, isoleucina e altri

amminoacidi idrofobi che impediscono l’ingresso di H2O e l’ossidazione del ferro. Il gruppo eme è

legato alla globina da 2 residui di istidina distale e prossimale.

Nell’adulto sono presenti, in condizioni normali 3 tipi di Hb:

- 97% HbA1 costituita da 2 catene α e 2 catene β

- 2,5-3,2% HbA2 costituita da 2 catene α e 2 catene δ

- HbF in una minima quota costituita da 2 catene α e 2 catene γ

Il 5-6% di HbA1 è glicata (HbA1c). La catena β è più soggetta a mutazioni, rispetto alla catena α e ciò trova spiegazione a livello evoluzionistico: l’Hb nei primi organismi viventi si è differenziata dalla mioglobina e si è specializzata nel trasporto di O2 nella forma tetramerica α2β2. Da questa forma si è costituita HbF (α2γ2) che ha la caratteristica di avere un’affinità > per O2 e infine, per ulteriore evoluzione si è costituita la catena δ. La α è rimasta invariata e quindi è più facile riscontrare una patologia a carico della β.

PRINCIPALI VARIANTI dell’Hb - HbS: dovuta alla sostituzione nella catena β di un Glu con Val. Ciò comporta l’assunzione della caratteristica forma a falce dell’eritrocita a basse concentrazioni di O2 e polimerizzazione in lunghe file

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- HbE: dovuta alla sostituzione nella catena β di Glu con Lys. HbE è sintetizzata in quantità ridotta perché la sostituzione crea un sito di splicing alternativo in un esone. Pertanto l’individuo con HbE mostra caratteristiche della talassemia β - HbC: dovuta alla sostituzione nella catena β di un Glu con una Lys. I soggetti eterozigoti sono asintomatici, gli individui omozigoti presentano emolisi associata a splenomegalia, litiasi biliare - HbM: divuta alla sostituzione di Ist con Tyr. L’Hb non è più in grado di legarsi all’O2 e si stabilizza in metaemoglobina (Fe3+). Porta a cianosi

TALASSEMIA E’ causata da una mutazione genetica delle catene globiniche dell’Hb. I difetti possono essere molti e a vari livelli della molecola. Principalmente comunque le talassemie sono suddivise in: - β-talassemia o anemia mediterranea. è la più frequente. L’individuo eterozigote è asintomatico, ma possiede globuli rossi in numero maggiore, più piccoli (MICROCITEMIA) e poveri di Hb. Gli omozigoti hanno microcitemia, anemia e povertà di Hb più marcate. Devono subire trasfusioni ogni 15-20 gg che portano però ad un accumulo di Fe in organi quali cuore, gh. endocrine, fegato compromettendone la funzione. Necessario somministrare Fe-chelanti. La malattia può avere diversi gradi di gravità: la sintesi della catena β può essere annullata o rallentata. In entrambi i casi per compenso ↑ la produzione di HbA2 e HbF. Nella forma più lieve aumenta solo HbA2 (da 3 a 5%), nelle forme più gravi anche HbF. - α-talassemia. causata dalla sintesi rallentata o annullata della catena α. Per compenso si ha nell’adulto un accumulo di catene β e nel feto di catene γ. Ciò porta alla formazione di emoglobine patologiche: - HbH → β4 nell’adulto - Hb di BART → γ4 nel bambino Se γ4 e β4 > 20% INCOMPATIBILI con la VITA

METODI di STUDIO

Punto di partenza dell’indagine di laboratorio: ANEMIA riscontrata con un emocromo. L’indagine comincia con l’ELETTROFORESI dell’Hb. Viene eseguita su emolisati ottenuti lavando i GR con fisiologica e emolizzandoli. Vengono poi sottoposti a centrifuga per allontanare le membrane. Per visualizzare le emoglobinopatie correttamente è utile eseguire 2 elettroforesi una a pH basico e una a pH acido. ……………………………… ………………………………..

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……………………………….. ……………………………. ………………………………. - CROMATOGRAFIA HPCL (cromatografia liquida ad alta selezione) Esame che permette di valutare le differenze aa delle varianti di Hb in aggiunta a elettroforesi e FINGER PRINTING. E’ un sistema che permette il confronto di frammenti di Hb tagliati a livello di Arg (emolisato + tripsina)

ANEMIE EMOLITICHE Sono causate da Ab diretti contro gli Ag eritrocitari (malattia autoimmune). Varie le cause (es. incompatibilità Rh tra medre e feto, farmaci …). Per la diagnosi esistono test diretti e indiretti per evidenziare Ab sul globulo rosso.

ENZIMOPATIE ERITROCITARIE Gli eritrociti non possiedono mitocondri; perciò le principali vie metaboliche sono: - glicolisi anaerobia 90% - via del pentoso-fosfato 10% - produzione del 2,3-BPG E’ possibile dosare l’attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo eritrocitario. I principali sono: - G6PD = glucoso-6-fosfato-deidrogenasi: enzima eritrocitario chiave della via dei pentoso-fosfati. L’enzima riduce un NADP a NADPH, che la cellula usa per ridurre Fe3+ a Fe2+ (enzima METAHb REDUTTASI). Se non funzione G6PD il soggetto mostra particolare sensibilità a sostanze e farmaci che hanno potenziale ossidativo (es. FAVISMO → anemia emolitica dopo l’ingestione di legumi; malattia X-linked). L’attività della G6PD è valutata basandosi sulla riduzione del NADP in un emolisato con aggiunta di G6PD - PK = piruvato chinasi (ENZIMA GLICOLITICO) Catalizza la reazione: fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP La cellula non riesce a produrre sufficiente ATP e muore

PORFIRIE PORFIRIA: malattia di origine genetica che interessa il metabolismo delle porfirine PORFIRINURIA: alterazione biometabolica associata con un’escrezione anomala di sostanze tetrapirroliche, ma indotta da altre condizioni (es. intossicazione da Pb)

METABOLISMO dell’EME SuccinilCoA + glicina → ac. δ-aminolevulanico (ALA) → porfobilinogeno (PBG) → →protoporfirina IX e copro porfirina

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Le porfirie possono essere di tipo eritropoietico o epatico, a seconda che l’alterazione metabolica risieda nel midollo osseo o nel fegato. Sono dovute a difetti parziali di attività enzimatiche che comportano l’accumulo di uno o più metaboliti (ALA e porfobilinogeno) nei tessuti e la loro escrezione con le urine. La porfiria più diffusa è di tipo epatico (PORFIRIA ACURA INTERMITTENTE) caratterizzata da fotosensibilità (che porta a fotodermatosi), anemia, coliche addominali intervallate da periodi di benessere. L’alterazione biochimica è il deficit della uroporfirinogeno sintasi che induce l’ALA sintetasi con accumulo di ALA e porfobilinogeno. Dosare le porfirine urinarie. Avvolgere il contenitore in un panno perché le porfirine sono sensibili alla luce. - 5-10 mg/die valori normali

PORFIRINURIE Sono le malattie in cui un’aumentata escrezione di porfirine nelle urine non costituisce la manifestazione più saliente della patologia. In questi casi il dosaggio delle porfirine urinarie è utile per la diagnosi. - Avvelenamento da Pb: inibisce alcuni enzimi del metabolismo dell’eme.

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SIEROPROTEINE · - La VES aumenta alla fine della prima settimana di malattia e nelle gammopatie...

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