1

Περιεχόμενα

1. Εισαγωγή…………………………………………………………………………..3

2. Συνδυαστική βιοσύνθεση………………………………………………………….4

2.1. Στρατηγικές και μοριακά εργαλεία στη υπηρεσία της Συνδυαστικής

Βιοσύνθεσης……………………………………………………………5

3. Φυσικά προϊόντα με σημαντική βιοτεχνολογική σημασία………………………..5

3.1. Πολυκετίδια…………………………………………………………….6

3.1.1. Βιοσύνθεση πολυκετιδίων……………………………………………..6

3.1.2. Κατηγορίες συνθασών των πολυκετιδίων……………………………..7

3.1.2.1. Οι συνθάσες PKs τύπου Ι……………………………………...8

3.1.2.2. Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙ…………………………………....13

3.1.2.3. Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙΙ…………………………………..15

3.2. Πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων…………………....16

3.2.1. Βιοσύνθεση των NRPs……………………………………………….17

3.3. Υβριδικοί πεπτίδο-πολυκετιδικοί μεταβολίτες………………………..20

4. Χημική σύνθεση φυσικών προϊόντων και νέων φυσικών προϊόντων……………22

5. Χημειο-βιολογικές προσεγγίσεις για τη βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων...24

5.1. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vitro…………………………………….24

5.1.1. Η in vivo χήμειο-ενζυμική σύνθεση γλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών..24

5.1.2. Γλυκοζυλίωση………………………………………………….…….25

5.2. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vivo………………………..……………27

5.2.1. Βιοσύνθεση κατευθυνόμενη από τoν πρόδρομο μεταβολίτη……..….27

5.2.2. Μεταλλαξιογόνος βιοσύνθεση……………………………….………27

5.2.3. Χήμειο-βιοσύνθεση………………………………………………..…29

5.2.4. Βιοκατάλυση σε άθικτα κύτταρα………………………………….…30

5.2.5. Κατασκευή συνθετικών γονιδίων και Χήμειο-ενζυμική σύνθεση

αναλόγων των πολυκετιδίων……………………………………………31

6. Νέες Τεχνολογίες του Ανασυνδυασμένου DNA για τη βιοσύνθεση φυσικών

προϊόντων………………………………………………...………………………32

7. Εργαλεία για την ανεύρεση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των

φυσικών προϊόντων και εντοπισμός νέων φυσικών προϊόντων………………….35

7.1. Προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση των σιωπηλών μεταβολικών

μονοπατιών………………………………………………………….…38

2

7.1.1. Διερεύνηση ολόκληρων γονιδιωμάτων…………………...………….38

7.1.2. Στρατηγική του PCR…………………………………………………39

7.1.3. Σάρωση του γονιδιώματος……………………………………….…..39

7.1.4. Πρόβλεψη με βάση τη βιοπληροφορική ανάλυση και τις

φυσικοχημικές ή τις φαρμακολογικές ιδιότητες του τελικού προϊόντος.40

7.1.5. Συνδυασμός απενεργοποίησης γονιδίου και συγκριτική ανάλυση των

φυσικών προϊόντων……………………………………………….…….42

7.1.6. Συνδυασμός ετερόλογης έκφρασης και συγκριτικής ανάλυσης των

παραγομένων φυσικών προϊόντων…………………………………...…44

7.1.7. Γονίδιο-ισοτοπική προσέγγιση………………………………….…....44

7.1.8. Ενεργοποίηση του σιωπηλού μονοπατιού…………………….…..….45

7.1.9. Προσεγγιση της μεταγοδιωματικής…………………………………..47

8. Ετερόλογη έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για μονοπάτια βιοσύνθεσης

φυσικών προϊόντων……………………………………...…………………...…..47

8.1. Γενικά θέματα που αφορούν στην ετερόλογη έκφραση των μονοπατιών

βιοσύνθεσης των πολυκετιδίων…………………………………….…48

8.2. Απευθείας μεταφορά του αποσυνθετικού συμπλέγματος γονιδίων, που

κωδικοποιούν για πολυκετίδια, σε γενετικά παρόμοιο παρένθετο

μικροοργανισμό……………………………………………...………..49

8.3. Ετερόλογη έκφραση, σε γενετικά παρόμοιους παρένθετους

οργανισμούς, μεταβολικών μονοπατιών, τα οποία κωδικοποιούνται από

συμπλέγματα γονίδιων, που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA.….49

8.4. Ετερόλογη έκφραση σε γενετικά ανόμοιους, παρένθετους οργανισμούς,

μεταβολικών μονοπατιών, τα οποία κωδικοποιούνται από συμπλέγματα

γονίδιων, που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA…………..……...51

8.5. Η ετερόλογη έκφραση, σε συνδυασμό με τη συνδυαστική βιοσύνθεση,

αποτελεί τη βάση για βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων…………52

8.5.1. Συν-έκφραση ενός ή περισσότερων γονίδιων………………...…...…52

8.5.2. Πολλαπλό σύστημα πλασμιδίων για τη συν-έκφραση στο E.coli…....53

8.5.3. Κλωνοποίηση και τροποποίηση των γονίδιων, των μεταβολικών

μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων, με τη χρήση της τεχνικής

της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού………………..…………….53

3

Συνδυαστική Βιοσύνθεση βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών

1. Εισαγωγή

Οι οργανισμοί έχουν την ικανότητα βιοσύνθεσης απλών ή πολύπλοκων

χημικών ενώσεων (μεταβολίτες). Οι μεταβολίτες διαχωρίζονται σε δυο κατηγορίες,

στους πρωτογενείς και στους δευτερογενείς μεταβολίτες. Οι πρωτογενείς

μεταβολίτες απαντώνται σε όλους του οργανισμούς και περιλαμβάνουν βιομόρια που

ανήκουν στις κατηγορίες των σακχάρων, νουκλεοτιδίων, αμινοξέων και λιπαρών

οξέων. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν και μεταβολίτες που απαιτούνται για την

ανάπτυξη και διαφοροποίηση των οργανισμών. Οι δευτερογενείς μεταβολίτες

παρουσιάζουν εξειδίκευση ανάλογα με το είδος του οργανισμού και επιδεικνύουν μια

τεραστία δομική και χημική ποικιλότητα. Ο αριθμός τους ξεπερνά αυτόν των

πρωτογενών μεταβολιτών και πλησιάζει τους 250.000. Πολλοί δευτερογενείς

μεταβολίτες παρουσιάζουν βιοδραστικές ιδιότητες.

Οι δευτερογενείς μεταβολίτες που παρουσιάζουν βιοδραστικές ιδιότητες

συχνά αναφέρονται με τον όρο φυσικά προϊόντα. Οι μικροοργανισμοί και τα φυτά

βιοσυνθέτουν ένα σημαντικό αριθμό (περίπου 43.000) φυσικών προϊόντων. Στις

περισσότερες περιπτώσεις, ο βιολογικός τους ρόλος στους παραγωγούς οργανισμούς,

δεν είναι ξεκάθαρος. Οι βιοδραστικές ιδιότητες των δευτερογενών μεταβολιτών

βρίσκουν κυρίως εφαρμογές στη υγεία ως φάρμακα (αντι-ιϊκα, -βακτηριακά, -

καρκινικά και αντι-μυκητιακά), στη βιομηχανία και στη γεωργία. Το 45-50% των

χημικών ενώσεων που χρησιμοποιούνται σε κλινικές δοκιμές προέρχονται από

φυσικά προϊόντα. Τα πολυκετίδια (polyketides, PKs) και τα πεπτίδια που συντίθενται

εκτός ριβοσωμάτων (non-ribosomal proteins, NRPs) αποτελούν μερικά από τα πλέον

σημαντικά φυσικά προϊόντα.

Η αξιοποίηση των φυσικών προϊόντων όπως τα PKs και NRPs περιορίζεται

είτε λόγω της περιορισμένης παραγωγή τους από τους παραγωγούς οργανισμούς είτε

λόγω αδυναμίας καλλιέργειας του οργανισμού είτε της πολύπλοκης χημικής δομής

τους. Ως εκ τούτου, η αύξηση της παραγωγής τους, η διεύρυνση της ποικιλότητας της

χημικής δομής τους ώστε να διευρύνεται και η βιολογική τους δράση και η ανεύρεση

νέων φυσικών προϊόντων αποτελούν στόχους της Συνδυαστικής Βιοσύνθεσης

(Combinatorial Βiosynthesis), ενός κλάδου της Μεταβολικής Μηχανικής.

4

2. Συνδυαστική Βιοσύνθεση

Η Συνδυαστική Βιοσύνθεση είναι γνωστή ως η μεταβολική μηχανική των

μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων. Ως Συνδυαστική Βιοσύνθεση, υπό

την στενή έννοια, ορίζεται η κατασκευή ενός μεταβολικού μονοπατιού, μέσω της

συναρμολόγησης γονίδιων από διαφορετικούς οργανισμούς, με σκοπό τη βιοσύνθεση

νέων φυσικών προϊόντων. Ωστόσο, υπό την ευρεία έννοια, η συνδυαστική

βιοσύνθεση είναι η in vivo ή η in vitro βιοσύνθεση οποιασδήποτε χημικής ένωσης, η

οποία παρουσιάζει κάποια βιοδραστική ιδιότητα. Ωστόσο, οι προοπτικές που

προσφέρει η συνδυαστική βιοσύνθεση περιορίζονται από βιολογικά και τεχνικά

προβλήματα.

Κατά αρχήν, δεν υπάρχουν κανόνες επιλογής των γονιδίων από τους

διάφορους οργανισμούς. Η στρατηγική της τυχαίας επιλογής γονιδίων αποτελεί

βασικό πρόβλημα, διότι με αυτόν τον τρόπο δε λαμβάνονται υπόψη τόσο οι

αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών, οι οποίες επιτρέπουν τη ροή των ενδιαμέσων

μεταβολιτών όσο και η εξειδικευμένη δραστηριότητα των ένζυμων, η οποία τα

καθιστά ανενεργά ή μερικώς ενεργά για πολλά υποστρώματα.

Επιπλέον, η απόδοση πολλών παραγωγών μικροοργανισμών είναι εξαιρετικά

χαμηλή και οι οργανισμοί αυτοί δεν είναι δεκτικοί σε γενετικές επεμβάσεις. Ως εκ

τούτου, είναι απαραίτητη η μεταφορά και έκφραση των συμπλεγμάτων γονιδίων που

κωδικοποιούν το μεταβολικό μονοπάτι σε διάφορους ξενιστές ώστε να βελτιωθεί η

παραγωγή του.

Η μεταφορά σε νέο ξενιστή δημιουργεί νέα προβλήματα, όπως την κατασκευή

κατάλληλων φορέων μεταφοράς, διότι τα συμπλέγματα γονιδίων (π.χ. PKs και NRPs)

έχουν τεράστιο μέγεθος (30-250kb). Επίσης, το μεγάλο μέγεθος των συμπλεγμάτων

γονιδίων απαιτεί νέες προσεγγίσεις, ώστε να είναι δυνατόν να πραγματοποιηθούν

γενετικές επεμβάσεις που αποσκοπούν στην απενεργοποίηση ή/και τροποποίηση των

υπαρχόντων γονιδίων ή την ενσωμάτωση νέων γονιδίων στο υπάρχον σύμπλεγμα.

Επίσης, μερικά από τα αναμενόμενα προβλήματα, είναι η επάρκεια

πρωτογενών μεταβολιτών καθώς και η ρύθμιση του μεταβολικού μονοπατιού στο

ξενιστή. Σημαντικό πρόβλημα, επίσης, είναι το γεγονός ότι πολλά γονίδια δεν

εκφράζονται επαρκώς στον ξενιστή ή τα προϊόντα δεν είναι λειτουργικά.

5

Η ανάπτυξη της Συνδυαστικής Βιοσύνθεσης (Σ.Β.) των φυσικών προϊόντων

και ιδιαίτερα των πολυκετιδίων, απαιτεί την ανάπτυξη νέων τεχνολογιών και

στρατηγικών.

2.1. Στρατηγικές και μοριακά εργαλεία στη υπηρεσία της Συνδυαστικής

Βιοσύνθεσης

Η στρατηγική που ακολουθείται έχει δυο άξονες. Ο πρώτος άξονας αφορά

στην επιλογή του βιοδραστικού προϊόντος και ο δεύτερος αφορά στις τεχνολογικές

δυνατότητες βιοσύνθεσης νέων φυσικών προϊόντων με διευρυμένη ή/και ενισχυμένη

φαρμακολογική δράση.

Η επίτευξη αυτών των στρατηγικών στόχων προϋποθέτει την ανάπτυξη νέων

μοριακών εργαλείων ιδιαίτερα στην περίπτωση των πολυκετιδίων (Polyketides, PKs)

και των πεπτιδίων που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων (Nonribosomal proteins,

NPRs). Μερικά από τα πιο σημαντικά μοριακά εργαλεία είναι τα εξής:

1. ο εντοπισμός νέων φυσικών προϊόντων και η ανεύρεση των μεταβολικών

μονοπατιών βιοσύνθεσής τους

2. η ανάπτυξη νέων μεθόδων κλωνοποίησης και τροποποίησης μικρών ή

μεγάλων τμημάτων DNA

3. η έκφραση εξαιρετικά μεγάλων τμημάτων DNA,

4. η χημική σύνθεση των φυσικών προϊόντων ή προδρόμων τους και η

τροποποίησή τους μέσω βιολογικών προσεγγίσεων

5. η σάρωση δεκάδων χιλιάδων νέων φυσικών προϊόντων για βιολογική δράση.

3. Φυσικά προϊόντα με σημαντική βιοτεχνολογική σημασία

Τα πολυκετίδια και τα πεπτιδία που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων

κατέχουν προνομιούχο θέση μεταξύ των άλλων φυσικών προϊόντων σε ότι αφορά την

βιοτεχνολογική τους σημασία διότι αποτελούν φυσικά προϊόντα με εξαιρετικά

σημαντική φαρμακολογική δράση. Για παράδειγμα, οι πωλήσεις του πολυκετιδίου

lovastatin το 2007 ξεπέρασαν τα 5δις δολάρια.

6

3.1. Πολυκετίδια

Τα πολυκετίδια (polyketides, PKs) είναι μια ομάδα δευτερογενών

μεταβολιτών με εξαιρετική ποικιλότητα σε ότι αφορά τη δομή και τις βιολογικές τους

ιδιότητες. Ένας σημαντικός αριθμός PKs έχει δοκιμασθεί σε κλινικές μελέτες και

χρησιμοποιούνται ως φάρμακα ενάντια σε πολλές μικροβιακές ή ιολογικές μολύνσεις,

καταστολή καρκινικών κυττάρων, καρδιακές νόσους και φλεγμονές. Το ευρύ φάσμα

βιοδραστικών ιδιοτήτων των PKs έχει καταστήσει αυτά τα μόρια το επίκεντρο

διερεύνησης τόσο σε ότι αφορά τις δυνατότητες υπερπαραγωγής τους όσο και της

επέκτασης της δομικής τους πολυπλοκότητας. Περίπου το 60% των βιοδραστικών

PKs προέρχονται από ακτινοβακτήρια. Άλλες μικροβιακές πηγές παραγωγής PKs

αποτελούν τα μυξοβακτήρια και ορισμένοι μύκητες. Επιπλέον, PKs έχουν εντοπισθεί

και χαρακτηρισθεί σε φυτά, σπόγγους, μαλάκια και έντομα. Ο φυσιολογικός ρόλος

των PKs σε αυτούς τους οργανισμούς δεν είναι ακόμα γνωστός.

3.1.1. Βιοσύνθεση πολυκετιδίων

Η διαδικασία βιοσύνθεσης των PKs είναι παρόμοια με αυτή των λιπαρών

οξέων, στα βακτήρια και στα ζώα. Οι συνθάσες των λιπαρών οξέων (Fatty acid

synthases, FASs) χρησιμοποιούν σχεδόν αποκλειστικά το ακέτυλο-CoA, ως

υπόστρωμα έναρξης και το μηλονύλο-CoA, ως υπόστρωμα επιμήκυνσης της

ανθρακικής αλυσίδας. Αντίθετα, οι συνθάσες των πολυκετιδίων (PKSs) αξιοποιούν

ένα πλήθος ακυλο-ομάδων ως υπόστρωμα έναρξης και επιμήκυνσης (Εικόνα 1).

7

Εικόνα 1. Υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στη βιοσύνθεση πολυκετίδιων (PKS) και των λιπαρών

οξέων (FAS).

3.1.2. Κατηγορίες συνθασών των πολυκετιδίων

Οι συνθάσες των πολυκετιδίων (PKSs) είναι μια ομάδα ενζύμων ή

συμπλεγμάτων ενζύμων εξαιρετικά μεγάλου μοριακού βάρους. Τα γονίδια που

κωδικοποιούν τις PKSs συνήθως οργανώνονται σε oπερόνια (βακτήρια) ή

συμπλέγματα γονίδιων (ευκαρυωτικά).

Οι PKSs, με βάση την αρχιτεκτονική των δομικών (λειτουργικών) περιοχών

(domains), ομαδοποιούνται σε 3 τύπους: τύπου Ι, τύπου ΙΙ και τύπου ΙΙΙ. Στις

συνθάσες τύπου ΙΙ οι δομικές περιοχές αποτελούν διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες

και κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα έχει συγκεκριμένη ενζυμική δράση ενώ στις

συνθάσες τύπου Ι οι δομικές περιοχές συντήκονται και απαρτίζουν μια πολυπεπτιδική

αλυσίδα, η οποία αναφέρεται ως άρθρωμα (module) (Εικόνα 2, Εικόνα 6). Τα

αρθρώματα ενώνονται και σχηματίζουν μια γραμμή παραγωγής. Οι PKSs Τύπου Ι

μοιάζουν τη συνθάση των λιπαρών των βακτηρίων ενώ οι Τυπου ΙΙ μοιάζουν με τη

συνθάση των λιπαρών των θηλαστικών. Οι συνθάσες Τύπου ΙΙΙ είναι απλούστερες

και μοιάζουν με τη συνθάση της χαλκόνης των φυτών.

8

Εικόνα 2. Συνθάσες των πολυκετιδίων Τύπου Ι (Β) και Τύπου ΙΙ (Α).

3.1.2.1. Οι συνθάσες PKs τύπου Ι

Οι συνθάσες PKs τύπου Ι ομαδοποιούνται σε δυο κατηγορίες. Στην πρώτη

κατηγορία ανήκουν οι αρθρωτές Τύπου Ι PKS, οι οποίες είναι οργανωμένες σε

αρθρώματα (Εικονα 6). Κάθε άρθρωμα φέρει τις βασικές λειτουργικές (δομικές)

περιοχές, οι οποίες είναι: η άκυλο-μεταφοράση (ΑΤ), η άκυλο μεταφέρουσα

πρωτεΐνη (Τ ή ACP) και η β-κέτο-άκυλο-συνθάση (KS). Η ΑΤ καταλύει είτε την

επιλογή του μορίου έναρξης είτε του μορίου επέκτασης και τη μεταφορά του στη

δομική περιοχή ACP, η οποία συγκρατεί την αναπτυσσομένη πολυκετιδική αλυσίδα

μέσω ενός θειοστερικού δεσμού. Όλες οι ACP δομικές περιοχές φέρουν ένα

συντηρημένο κατάλοιπο σερίνης, στο οποίο προσδένεται μέτα-μεταφραστικά μια

φωσφοπαντεθεΐνη. Η πρόσδεση της φωσφοπαντεθεΐνης στη σερίνη καταλύεται από

μεταφοράσες της φωσφοπαντεθεΐνης (PPTases). Συνήθως οι PPTases

κωδικοποιούνται από γονίδια που εδράζονται κοντά στο σύμπλεγμα των PKSs. Η β-

κέτο-άκυλο-συνθάση (KS) καταλύει τη δημιουργία C-C δεσμών και την επιμήκυνση

της ανθρακικής αλυσίδας (Εικόνα 3).

9

Εικόνα 3. Διαδικασίες έναρξης και επιμήκυνσης της πολυκετιδικής αλυσίδας. (c) Μονάδα

φόρτωσης/έναρξης (φέρει τις δομικές περιοχές AT και ACP) . Κατά την έναρξη της διαδικασίας η ΑΤ

επιλέγει το υπόστρωμα (π.χ. προπιονύλο-CοΑ) το ενεργοποιεί και μεταφέρει την ενεργοποιημένη

προπιονύλο-ομάδα στη φωσφοοπαντεθεΐνη της γειτονικής ΑCP. (b) Βασική μονάδα (φέρει τις δομικές

περιοχές AT, ACP και KS). H ανωφερική ΑCP μεταφέρει την προπιονύλο-ομάδα σε ένα συντηρημένο

κατάλοιπο σερίνης (αναπαρίσταται ως SH) της ΚS. Η KS αποκαρβοξυλιώνει το ενεργοποιημένο

υπόστρωμα (π.χ. μηλονύλο ή μέθυλο-μηλονύλο θειοεστέρα) που έχει εκφορτωθεί στην κατωφερική

ΑCP, δημιουργώντας ένα καρβανιόν (το καρβανιόν αναπαρίσταται ως μια ομάδα με αρνητικό

πρόσημο) και καταλύει τη συμπύκνωση του με τον ενεργοποιημένο μηλονύλο-θειοεστέρα. Η

συμπύκνωση έχει ως αποτέλεσμα την επιμήκυνση της πολυκετιδικής αλυσίδας.

Κάθε άρθρωμα, συνήθως, φέρει και επιπρόσθετες λειτουργικές δομικές

περιοχές που καταλύουν άλλες αντιδράσεις. Οι δομικές περιοχές που συνήθως

απαντώνται στα διάφορα αρθρώματα περιλαμβάνουν μια β-κέτο-αναγωγάση (KR), η

οποία καταλύει την αναγωγή των κέτο-ομάδων προς αλκοολικές, μια αφυδατάση,

(DH) η οποία καταλύει την απομάκρυνση ενός μορίου νερού και δίδει ακόρεστους

θειοεστέρες ή/και μια ενόυλο-αναγωγάση (ER), η οποία καταλύει την τελική

αναγωγή για τον πλήρη κορεσμό του μορίου των πολυκετιδίων. Οι δομικές περιοχές

KR, DH και ER λειτουργούν διαδοχικά και ολοκληρώνουν τη διαδικασία

επιμήκυνσης, η οποία άρχισε με την ΑΤ και την ΚS (Εικόνα 4 ).

Εικόνα 4. Αντιδράσεις που καταλύονται από τις KR, DH και ER.

10

Το τελικό άρθρωμα της γραμμής παραγωγής των Tύπου Ι PKS, πέραν των

βασικών και των επιπρόσθετων δομικών περιοχών, φέρει μια δομική περιοχή, η οποία

έχει δράση θειοεστεράσης (ΤΕ) και η οποία καταλύει την υδρόλυση του

θειοεστερικού δεσμού και απελευθέρωση της μακρολιδικής αλυσίδας (Εικόνα 5Α) ή

μια ενδομοριακή αντίδραση, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση και κυκλοποίηση της

πολυκετιδικής αλυσίδας προς μακρολακτόνη (Εικόνα 5Β).

Εικόνα 5. Η δράση της ΤΕ που εδράζεται στο τελικό άρθρωμα.

Στις αρθρωτές PKS, οι διαφορετικές δομικές περιοχές συνδέονται μεταξύ του

με συνδέσμους (αλληλουχίες 17-21 αμινοξέων). Έχουν προταθεί δυο κατηγορίες

συνδέσμων. Οι σύνδεσμοι, οι οποίοι συνδέουν ομοιοπολικά αρθρώματα, τα οποία

ανήκουν στην ίδια πολυπεπτιδική αλυσίδα και οι σύνδεσμοι οι οποίοι συνδέουν

αρθρώματα, τα οποία εδράζονται σε διαφορετικές πολυπεπτιδικες αλυσίδες. Επίσης,

έχει προταθεί η ύπαρξη συνδέσμων μεταξύ των δομικών περιοχών.

Η βιοσύνθεση της ερυθρομυκίνης (erythromycin) αποτελεί ένα κλασικό

παράδειγμα της λειτουργίας την αρθρωτών συνθασών των πολυκετιδίων (Εικόνα 6).

Η συνθάση της DEBS καταλύει το σχηματισμό της 6-deoxyerythronolide B (6-dEB),

11

ενδιάμεσου μεταβολίτη στη διαδικασία βιοσύνθεσης της ερυθρομυκίνης. Η γραμμή

παραγωγής (assembly line) της 6-dEB περιέχει 7 αρθρώματα, τα οποία κατανέμονται

σε τρεις πρωτεΐνες (DEBS1, 2 και 3). Κάθε μια από τις DEBS φέρει δύο αρθρώματα,

όπου εδράζονται οι καταλυτικές δραστηριότητες της συμπύκνωσης. H DEBS1 φέρει

το αρχικό άρθρωμα φόρτωσης (loading). Οι δομικές περιοχές AT και ACP του

αρθρώματος φόρτωσης φορτώνουν το προπιονύλο-CoA (μόριο έναρξης) στην KS του

αρθρώματος 1 ενώ η AT δομική περιοχή του αρθρώματος 1 φορτώνει το μέθυλο-

μηλονύλο (μόριο επέκτασης) στην ACP δομική περιοχή του αρθρώματος 1. Η

αντίδραση της συμπύκνωσης καταλύεται από την KS του αρθρώματος 1. Στη

συνεχεία, μια αναγωγική δομική περιοχή καταλύει την αναγωγή της κετονικής

ομάδας. Η αναπτυσσόμενη πολυκετιδική αλυσίδα μεταφέρεται από την ACP του

αρθρώματος 2 στην KS του επόμενου αρθρώματος. Με αυτό τον τρόπο και

προοδευτικά, επεκτείνεται το μήκος της πολυκετιδικής αλυσίδας (χρησιμοποιείται

κάθε φορά ένα μόριο μέθυλο-μηλονύλο-CoA). Μετά από κάθε επέκταση της

αλυσίδας γίνεται η αναγωγή της κετονο-ομάδας. Στο τέλος της διαδικασίας, η ώριμη

πολυκετιδική αλυσίδα απελευθερώνεται (release) και κυκλοποιείται μέσω της δράσης

μιας θειοεστεράσης (TE). Η 6-dEB, σε αυτήν τη φάση, δεν έχει αντιβιοτική δράση. Η

6-dEB γλυκοσυλιώνεται (tailoring steps) προκειμένου να σχηματισθεί η βιοδραστική

erythromycin.

12

Εικόνα 6. Δομή και οργάνωση της συνθάσης της deoxyerythronolide B (DEBS) και διαδικασίες

βιοσύνθεσης της ερυθρομυκίνης.

Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι επαναλαμβανόμενες (iterative type I

PKS), οι οποίες λειτουργούν κατά ένα επαναληπτικό τρόπο. Δηλαδή, το ίδιο

πολυενζυμικό σύστημα χρησιμοποιείται πολλές φορές. Οι μύκητες διαθέτουν τρεις

υπο-κατηγορίες τύπου Ι PKS (Εικόνα 7).

13

Εικόνα 7 . Διάταξη των γονίδιων στις PKS των μυκήτων. Α. Μερικά αναγωγική PKS από το

Penicillium patulum. Β. Μη-αναγωγική PKS. C. Αναγωγική PKS από το Aspergillus terreus. D.

Αναγωγική PKS-NRPS. Αρθρωμα φόρτωσης (loading), άρθρωμα επέκτασης (extension), τελικό

άρθρωμα (processing).

3.1.2.2. Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙ

Οι PKSs Τύπου ΙΙ λειτουργούν με ένα επαναληπτικό τρόπο (iterative

fashion) και καταλύουν τη βιοσύνθεση αρωματικών πολυκετιδίων. Μια τυπική τύπου

ΙΙ PKS αποτελείται από τρεις πρωτεΐνες, οι οποίες συνιστούν τη «βασική μονάδα»

(Εικόνα 8): α) ένα ετεροδιμερές της κετοσυνθάσης a (KSa) και της κετοσυνθάσης b

(KSb ή CLF). H KSb συχνά αναφέρεται ως παράγοντας επιμήκυνσης (CLF), β) μια

ακυλο-μεταφοράση (ΑΤ) και γ) μια ακυλο-μεταφέρουσα πρωτεΐνη (ACP η Τ). H

KSa καταλύει την αντίδραση της συμπύκνωσης ενώ η KSb δε φέρει την ενεργό

κυστεΐνη (απαραίτητη για τη δραστηριότητα της συμπύκνωσης) και καταλύει την

αποκαβοξυλίωση του μηλονύλο-ACP προς ακέτυλο-ACP, κατά την έναρξη της

σύνθεσης των πολυκετιδίων. Στη συγκροτημένη τύπου ΙΙ ΡKS υπάρχει μόνο μια Τ

δομική περιοχή, μια ΑΤ δομική περιοχή και μια δομική περιοχή KS για τα βήματα

που αφορούν την επιμήκυνση της πολυκετιδικής αλυσίδας.

Η αναπτυσσόμενη πολυκετιδική αλυσίδα επιμηκύνεται κατά δύο ή τρία άτομα

άνθρακα σε κάθε κύκλο αλλά παραμένει συνδεδεμένη στην ίδια Τ δομική περιοχή

ενώ η KS και η ΑΤ δρουν επαναληπτικά (Εικόνα 8). Επιπρόσθετες ενζυμικές

υπομονάδες, όπως κετοαναγωγάσες (KR), κυκλάσες (CY) και αρωματάσες (ARO)

συνεργάζονται με τη «βασική μονάδα» για την ολοκλήρωση της βιοσύνθεσης του

πολυκετιδίου.

14

Εικόνα 8. Η ΑΤ καταλύει το φόρτωμα μιας άκυλο-ομάδας (1ης

) στην Τ. Στη συνεχεία, η 1η άκυλο-

ομάδα μεταφέρεται στην περιοχή KS. Η ΑΤ καταλύει το φόρτωμα μια 2ης

άκυλο-ομάδας στην περιοχή

Τ. Η KS καταλύει τη συμπύκνωση της 1ης

και της 2ης

άκυλο-ομάδας.

Ένα τυπικό παράδειγμα της Τύπου ΙΙ PKS αποτελεί η συνθάση της

δοξορουβικίνης (doxorubicin), η οποία καταλύει την επαναλαμβανόμενη

συμπύκνωση ενός προπιονύλο-CoA και εννέα μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό

του τετρακυκλικού ανθρακικού σκελετού του αντιβιοτικού δοξορουβικίνη (Εικόνα

9). Η δοξορουβικίνη αλληλεπιδρά με το DNA και αναστέλλει τη βιοσύνθεσή της.

Εικόνα 9. Βιοσύνθεση της δοξορουβικίνης. Κατά την έναρξη της διαδικασίας, μια ΑΤ δομική περιοχή

καταλύει το φόρτωμα του προπιονύλο-CoA και στη συνέχεια του μηλονύλο-CoA. Η KS καταλύει το

σχηματισμό ενός κετοβαλερύλο-CoA, το οποίο παραμένει συνδεδεμένο στην ΚS. Στη συνεχεία, η Τ

μεταφέρει ένα μηλονύλο-CoA στην ΚS και έχουμε μια νέα συμπύκνωση του κετοβαλερύλο-CoA με το

μηλονύλο-CoA. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται 8 φορές χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το

προηγούμενο ολιγοκετίδιο, μέσω της διαδοχικής προσθήκης του μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό

ενός δεκακετιδίου (ανθρακυκλινικός δακτύλιος). Μια δομική περιοχή (KR δραστηριότητα) ανάγει την

πολυκετιδική αλυσίδα και μια άλλη δομική περιοχή (δράση κυκλάσης) κυκλοποιεί την πολυκετιδική

αλυσίδα.

15

3.1.2.3. Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙΙ

Οι συνθάσες τύπου ΙΙΙ περιλαμβάνουν τις φυτικές συνθάσες της χαλκόνης, τις

συνθάσες του στιλβενίου και τις συνθάσες της ρεσβερατόλης. Οι φυτικές συνθάσες

τύπου ΙΙΙ είναι ομοδιμερή, ανήκουν στις επαναλαμβανόμενες PKSs και φέρουν δυο

ενεργές περιοχές, οι οποίες καταλύουν μία ή διαδοχικές αντιδράσεις της

συμπύκνωσης. Οι αλληλουχίες αμινοξέων αυτών συνθασών δεν παρουσιάζουν

σημαντικές ομολογίες, ωστόσο ανάλυση της κρυσταλλικής δομής μέσω περίθλασης

ακτίνων Χ έδειξε ότι διαθέτουν κοινές δομές με τις άλλες συνθάσες των PΚs. Οι

συνθάσες τύπου ΙΙΙ, αντίθετα με όλες τις άλλες συνθάσες των PΚs, χρησιμοποιούν τo

υπόστρωμά τους (μηλονύλο-CoA) χωρίς την παρέμβαση μιας άκυλο-μεταφέρουσας

πρωτεΐνης ( ACP ). Στην ομάδα των τύπου ΙΙ συνθασών ανήκουν και βακτηριακής

προέλευσης συνθάσες, όπως είναι οι συνθάσες που καταλύουν τη βιοσύνθεση

φυσικών προϊόντων, όπως το αντιβιοτικό βανκομικίνη (vancomycin). Ένα

παράδειγμα συνθάσης Τύπου ΙΙΙ αποτελεί η συνθάση ΤΗΝ, η οποία καταλύει τη

συμπύκνωση πέντε μορίων μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό ενός πεντακετιδίου

και την κυκλοποίησή του προς τετραυδροξυναφθαλένιο (ΤΗΝ) (Εικόνα 10 ).

Εικόνα 10. Διαδικασίες βιοσύνθεσης της ναπυραδιομυκίνης (napyradiomycin). Η THN συνθάση των

πολυκετιδίων (RppA) καταλύει τη συμπύκνωση πέντε μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό ενός

πεντακετιδίου, το οποίο, στη συνεχεία, κυκλοποιείται προς τέτρα-υδρξυναφθαλένιο (ΤΗΝ). Το ΤΗΝ

αποτελεί ένα ενδιάμεσο μεταβολίτη στη βιοσύνθεση του αντιβιοτικού napyradiomycin.

16

3.2 Πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων

Ο όρος πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων (NonRibosomal

Peptides, NRPs) αναφέρεται σε γραμμικά, κυκλικά ή διακλαδιζόμενα πεπτίδια,

αποτελούμενα από λιγότερα από 20 κατάλοιπα αμινοξέων, των οποίων η βιοσύνθεση

δεν πραγματοποιείται στα ριβοσώματα. Τα αμινοξέα που χρησιμοποιούνται για τη

βιοσύνθεση των NRP ανήκουν είτε στην κατηγορία των πρωτεΐνογενών (απαντώνται

σε πρωτεΐνες) είτε στην κατηγορία των μη-πρωτεΐνογενών (δεν απαντώνται σε

πρωτεΐνες) είτε είναι άρυλo-οξέα (aryl acids) (Εικόνα 11). Τα αμινοξέα ενός NRP

μπορεί να υποστούν τροποποιήσεις, όπως γλυκουιλίωση, ακυλίωση, αλογόνωση και

υδροξυλίωση.

Εικόνα 11. Αμινοξέα που απαντώνται στα NRP

Τα NRPs που έχουν απομονωθεί από διάφορους μικροοργανισμούς (βακτήρια

και μύκητες), παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα βιοδραστικών ιδιοτήτων (π.χ.

ανοσοκατασταλτικά, κυτταροστατικά, αντιβακτηριακά) (Εικόνα 12).

17

Εικόνα 12. Η δομή αντιπροσωπευτικών NRPs και οι βιοδραστικές τους ιδιότητες. Η κυκλοσπορίνη

έχει ανοσοκατασταλτική δράση, η μπλεομυκίνη έχει αντικαρκινική δράση, η αντεροβακτίνη έχει

δράση σιδεροφόρου και η γραμισιδίνη έχει δράση αντιβιοτικού.

3.2.1. Βιοσύνθεση των NRPs

Η βιοσύνθεση των NRPs πραγματοποιείται από μια κατηγορία

πολυλειτουργικών πρωτεϊνών, τις NRP συνθετάσες (NRPSs), οι οποίες καταλύουν

τη βιοσύνθεση ολιγοπεπτιδίων χωρίς τη συμμετοχή ριβοσωμάτων. Οι NRPSs

οργανώνονται σε αρθρώματα και κάθε άρθρωμα φέρει όλες εκείνες τις λειτουργίες

που απαιτούνται για την ενσωμάτωση και τροποποίηση ενός αμινοξέος. Ο αριθμός

και η σειρά των αρθρωμάτων, καθώς και ο τύπος των δομικών περιοχών κάθε

αρθρώματος, προσδιορίζει τη δομική ποικιλότητα κάθε ενός από τα NRPs που

παράγονται από τις διάφορες NRPSs, διότι καθορίζει τόσο τη σειρά όσο και το είδος

του αμινοξεος που θα ενσωματωθεί, καθώς και τις τροποποιήσεις που θα γίνουν. Ένα

τυπικό άρθρωμα NRPS αποτελείται από τις δομικές περιοχές Α, Τ και C. H δομική

περιοχή αδενυλίωσης (A) είναι υπεύθυνη για την επιλογή και ενεργοποίηση του

υποστρώματος προς ένα ΑΜΡ-εστέρα καθώς και την πρόσδεση του θειοεστέρα στη

φωσφοπαντεθεΐνη της δομικής περιοχής Τ (συχνα αναφέρεται ως PCP) με την

ταυτόχρονη κατανάλωση ΑΤΡ (Εικόνα 13Α). Τη δομική περιοχή συμπύκνωσης C, η

οποία καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού μεταξύ του άμινο-άκυλο ή

18

πεπτιδύλο-S-PCP από το ανωφερικό άρθρωμα και του άμινο-άκυλο κατάλοιπου που

είναι προσδεδεμένο στη Τ δομική περιοχή του κατωφερικού αρθρώματος (Εικόνα

13Β). Το αποτέλεσμα είναι η επιμήκυνση κατά ένα κατάλοιπο αμινοξέος. Το

διπεπτίδιο παραμένει προσδεδεμένο στη Τ δομική περιοχή του κατωφερικού

αρθρώματος.

Εικόνα 13. Διαδικασίες έναρξης και επέκτασης, συμπύκνωσης και μετατόπισης της αναπτυσσόμενης

ολιγοπεπτιδικής αλυσίδας. (Α) Η δομική περιοχή Α καταλύει την αδενυλίωση του αμινοξέος καθώς

και την ακυλίωσή του στη δομική περιοχή Τ. (Β) Η δομική περιοχή C καταλύει το σχηματισμό του

δεσμού C-N μεταξύ του ανωφερικού πεπτιδύλο-Τ και του κατωφερικού άμινο-άκυλο Τ.

Το άρθρωμα έναρξης των NRPSs, συνήθως, αποτελείται από δύο δομικές

περιοχές, την A και την Τ. Η λειτουργία του αφορά στην επιλογή του αμινοξέος και

τη σύνδεσή του στη δομική περιοχή Τ. Η ολιγοπεπτιδική αλυσίδα επιμηκύνεται

διατηρώντας μια ελεύθερη αμινομάδα στο Ν-άμινο αμινοξύ. Στο τελικό άρθρωμα των

NRPSs, οι δομικές περιοχές έχουν την ακόλουθη διάταξη: C-A-Τ. H TE δομική

περιοχή, όπως και στις συνθάσες των PKs, καταλύει την απομάκρυνση ή την

κυκλοποίηση της ολιγοπεπτιδικής αλυσίδας (Εικόνα 5Α).

Τα αρθρώματα μπορεί να φέρουν επιπλέον δομικές περιοχές, οι οποίες

καταλύουν τον επιμερισμό (Ε) ενος L-αμινοξέος προς D-αμινοξύ (Εικόνα 13), τη

δομική περιοχή της μεθυλομεταφοράσης (ΜΤ), η οποία καταλύει τη μεταφορά μιας

μέθυλο ομάδας από τη S-αδενόσυλο-μεθειονίνη σε μια αμινομάδα (Ν-μεθυλίωση)

(Εικόνα 14), τη δομική περιοχή κυκλοποίησης (Cy), η οποία καταλύει το σχηματισμό

ετεροκυκλικων δακτυλίων, τη δομική περιοχή αναγωγής (R) και τη δομική περιοχή

οξείδωσης (Ox).

19

Εικόνα 14. Διαδικασίες επιμερισμού των αμινοξέων που απαντώνται στα NRPs

Εικόνα 15. Διαδικασίες Ν-μεθυλίωσης των αμινοξέων, που απαντώνται στα NRPSs. Πολλά NRPs

φέρουν κατάλοιπα Ν-μεθυλιωμένων αμινοξέων. Για παράδειγμα, 7 από τα 11 κατάλοιπα στην

κυκλοσπορίνη είναι μεθυλιωμένα.

Η βιοσύνθεση της σουρφακτίνης (surfactin) αποτελεί ένα κλασικό παράδειγμα

της λειτουργίας των αρθρωτών NRP συνθασών (Εικόνα 16).

Εικόνα 16. Οργάνωση της NRP συνθετάσης της σουρφακτίνης (surfactin), που εμπλέκεται στη

βιοσύνθεση του κυκλικού λιποπεπτιδίου σουρφακτίνη. Η σουρφακτίνη αποτελείται από επτά αμινοξέα

σε κυκλικό σχηματισμό και ένα λιπαρό οξύ με 13-15 άτομα άνθρακα, το όποιο είναι συνδεδεμένο με

ένα από τα αμινοξέα. Το αντιβιοτικό αυτό έχει την ικανότητα να διαπερνά τη μεμβράνη των Gram-

αρνητικών και των Gram-θετικών βακτηρίων.

20

3.3. Υβριδικοί πεπτίδο-πολυκετιδικοί μεταβολίτες

Ως υβριδικοί πεπτίδο-πολυκετιδικοί μεταβολίτες (NPR-PK) θεωρούνται τα

φυσικά προϊόντα, τα οποία προέρχονται βιοσυνθετικά από αμινοξέα και μικρού

μήκους ανθρακικής αλυσίδας καρβοξυλικά οξέα. Μερικά παραδείγματα των

υβριδικών πεπτίδο-πολυκετιδικών φυσικών προϊόντων, με βιοδραστικές ιδιότητες,

δίδονται στην εικόνα 17.

Εικόνα 17. Παραδείγματα υβριδικών πεπτίδο-πολυκετιδικών φυσικών προϊόντων. Οι σκιασμένες

περιοχές προσδιορίζουν τα σημεία σύνδεσης του πεπτιδικού και του πολυκετιδικού τμήματος.

21

Η βιοσύνθεση των NRP-PKs δεν προϋποθέτει την άμεση λειτουργική σχέση

μεταξύ των NRPSs και PKSs. Με βάση το μηχανισμό βιοσύνθεσής τους, τα υβριδικά

NRP-PKs διαχωρίζονται σε δυο κατηγορίες. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα

NRP-PKs, τα οποία βιοσυντίθενται από φυσικά συνδεδεμένα συμπλέγματα γονίδιων,

που κωδικοποιούν NRPS-PKS (Εικονα 18Α) ενώ στη δεύτερη κατηγορία τα

συμπλέγματα γονίδιων που κωδικοποιούν NRPS και PKS δεν είναι συνδεδεμένα. Στη

δεύτερη κατηγορία, το πολυκετιδικό τμήμα συντίθεται ανεξάρτητα από το πεπτιδικό

και στη συνέχεια συνδέονται με τη δράση μιας λιγάσης. Στην πρώτη κατηγορία, η

υβριδική NRPS-PKS καταλύει την άμεση μεταφορά ενός NRPS-προσδεμένου

πεπτιδύλο-ενδιάμεσου σε άρθρωμα της PKS. Τα περισσότερα φυσικά προϊόντα

βιοσυντίθενται από ενζυμικά συστήματα της πρώτης κατηγορίας.

Ένα τυπικό παράδειγμα βιοσύνθεσης υβριδικού πεπτίδο-πολυκετιδικού

φυσικού προϊόντος δίδεται στην εικόνα 18Β.

Α

Β

Εικόνα 18. Οργάνωση της υβριδικής συνθάσης της μπλεομυκίνης (bleomycin). (Α) Η συνθάση της

μπλεομυκίνης αποτελείται από 10 αρθρώματα NRPS και 1 άρθρωμα PKS. (Β) Το μονοπάτι

βιοσύνθεσης της μπλεομυκίνης. Οι αριθμοί, 18, 19 και 20 αναφέρονται σε ενδιάμεσους μεταβολίτες

του μονοπατιού, που έχουν απομονωθεί από καλλιέργειες του παραγωγού οργανισμού S.verticillus και

ο αριθμός 7 αναφέρεται στη μπλεομυκίνη.

22

4. Χημική σύνθεση φυσικών προϊόντων και νέων φυσικών προϊόντων

Ένας σημαντικός αριθμός φυσικών προϊόντων έχει κατασκευασθεί μέσω

ολικής χημικής σύνθεσης (total chemical synthesis) από απλές πρώτες ύλες. Η

δυνατότητα σύνθεσης της βασικής χημικής δομής του φυσικού προϊόντος διευκόλυνε

τη διεύρυνση της πολυπλοκότητάς τους μέσω της σύνθεσης αναλόγων ορισμένων

φυσικών προϊόντων. Ωστόσο, η πολυπλοκότητα της χημικής δομής των

περισσοτέρων φυσικών προϊόντων καθιστά την ολική χημική σύνθεσή τους είτε

αναποτελεσματική και με μεγάλο κόστος είτε ανέφικτη. Εναλλακτικά, μπορεί να

χρησιμοποιηθεί η χημική διαδικασία της ημι-σύνθεσης (semi-synthesis). Η

διαδικασία αυτή είναι τύπος χημικής σύνθεσης, μόνο που σε αυτήν τη περίπτωση, η

πρώτη ύλη είναι ένα απομονωμένο φυσικό προϊόν, το οποίο παράγεται από

διάφορους οργανισμούς. Η ημι-σύνθεση χρησιμοποιείται όταν το φυσικό προϊόν έχει

πολύπλοκη χημική δομή και η ολική χημική σύνθεσή του είναι αναποτελεσματική.

Συχνά, η ημι-συνθετική διαδικασία είναι απαραίτητη, διότι το παράγωγο του φυσικού

προϊόντος, το οποίο προκύπτει, είναι σταθερότερο, φαρμακολογικά πιο ενεργό και

ασφαλέστερο του πρωτογενούς φυσικού προϊόντος. Η διαδικασία της ημι-σύνθεσης

για την τροποποίηση φυσικών προϊόντων έχει βρει εφαρμογές στη

φαρμακοβιομηχανία. Για παράδειγμα, τα αντιβιοτικά της β-λακτάμης (π.χ.

methicillin, ο αρωματικός δακτύλιος φέρει δυο μεθυλομάδες), όταν τροποποιηθούν

μέσω της ημι-σύνθεσης (amoxillin, ο αρωματικός δακτύλιος φέρει μια

υδροξυλομάδα), παρουσιάζουν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στις β-λακταμάσες

(πενικιλινάσες). Η ημι-σύνθεση έχει δώσει αποτελέσματα και στην περίπτωση πιο

πολύπλοκων ενώσεων, όπως είναι τα πολυκετίδια. Για παράδειγμα, η lovastatin είναι

ένα πολυκετίδιο, το όποιο παρουσιάζει σημαντική φαρμακολογική δράση, διότι

μειώνει τα επίπεδα χοληστερόλης και βιοσυντίθεται στο μύκητα Aspergillus terreus.

Η simvastatin είναι μια ημισυνθετική ένωση, η οποία προέρχεται από χημική

παρέμβαση στη δομή της lovastatin (Εικόνα 17Α) και παρουσιάζει πιο

αποτελεσματική δράση σε σύγκριση με τη lovastatin.

23

Εικόνα 19. Οι διαδικασίες ημι-σύνθεσης της simvastatin με πρώτη ύλη το φυσικό προϊόν lovastatin.

Στην πρώτη διαδικασία (5) έχουμε υδρόλυση της lovastatin προς το σχηματισμό της mononacolin J, η

όποια υπόκειται σε χημικές επεμβάσεις, που αποσκοπούν στην προστασία των C11 και C13

υδροξυομάδων. Η «προστατευμένη» mononacolin J μεθυλιώνεται και σχηματίζεται η

«προστατευμένη» simvastatin, από την οποία, στη συνεχεία, η ομάδες προστασίας απομακρύνονται

ώστε να προκύψει η simvastatin

Η ανάπτυξη της οργανικής σύνθεσης και της προσομοίωσης μέσω

πληροφορικής επέτρεψε την ταυτόχρονη σύνθεση μεγάλων αριθμών χημικών

ενώσεων με διαφορετική δομή. Για παράδειγμα, η χημική ένωση Α αντιδρά με τη

χημική ένωση Β και δίδει ως προϊόν το ΑΒ, το οποίο απομονώνεται μέσω

κρυστάλλωσης, απόσταξης ή χρωματογραφίας.

Αντίθετα, η συνδυαστική χημεία προσφέρει τη δυνατότητα να κατασκευασθεί

κάθε πιθανός συνδυασμός των ενώσεων Α1-Βn, B1-Αn.

Η τεχνολογία αυτή αναφέρεται ως συνδυαστική χημεία (combinatorial chemistry).

24

5. Χήμειο-βιολογικές προσεγγίσεις για τη βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων

Η ραγδαία ανάπτυξη της οργανικής χημείας επέτρεψε τη σύνθεση

πολύπλοκων χημικών ενώσεων, όπως είναι τα πολυκετίδια. Επίσης, επέτρεψε τη

σύνθεση και μαζική παραγωγή χημικών ενώσεων μικρού μοριακού βάρους, με

επιθυμητή δομή. Οι δυνατότητες που παρείχε η οργανική χημικών ενώσεων

αξιοποιήθηκαν, μέσω βιολογικών προσεγγίσεων, στην παραγωγή νέων φυσικών

προϊόντων.

5.1. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vitro

Ο συνδυασμός της σύνθεσης χημικών ενώσεων επιθυμητής δομής και της in

vitro τροποποίησής τους μέσω της χρήσης ανασυνδυασμένων ενζύμων, αναφέρεται

ως χήμειο-ενζυμική σύνθεση. Σε αυτήν τη περίπτωση, η χημική σύνθεση παρέχει τη

δυνατότητα κατασκευής ποσοτήτων πρώτης ύλης (πρόδρομου του φυσικού

προϊόντος) και η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA την παραγωγή σε ποσότητα

του ενζύμου. Για την καλύτερη κατανόηση της χήμειο-ενζυμικής προσέγγισης,

παραθέτονται δυο παραδείγματα.

5.1.1. Η in vitro χήμειο-ενζυμική σύνθεση γλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών

Η tyrοcidine (Tyc) είναι ένα δεκαπεπτίδιο της κατηγορίας των NRPs και

παρουσιάζει αντιβιοτική δραστηριότητα, διότι προκαλεί λύση της εξωτερικής

μεμβράνης των βακτηρίων. Η πιθανότητα ανάπτυξης ανθεκτικότητας των βακτηρίων

σε αυτή την ομάδα αντιβιοτικών είναι σπάνια, διότι δεν έχει ανευρεθεί κάποια

βακτηριακή πρωτεΐνη, η οποία να απενεργοποιεί το συγκεκριμένο αντιβιοτικό.

Ωστόσο, η χρησιμοποίηση της Tyc έχει ένα σημαντικό μειονέκτημα, διότι προκαλεί

λύση της κυτταρικής μεμβράνης των ερυθροκυττάρων, με αποτέλεσμα να μειώνεται

η θεραπευτική της δράση. Η τροποποίηση της δομής της Tyc μπορεί να βελτιώσει το

θεραπευτικό της δείκτη (therapeutic index, η ελάχιστη ποσότητα αντιβιοτικού η

οποία προκαλεί την ελάχιστη λύση των αιμοσφαιρίων και τη μέγιστη αναστολή

ανάπτυξης των βακτηρίων).

Μια τροποποίηση που μπορεί να πραγματοποιηθεί στη Tyc, είναι η προσθήκη

γλυκοζύλο ομάδων (Εικόνα 20). Η χημική σύνθεση επιτρέπει την κατασκευή ενός

γραμμικού ολιγοπεπτιδίου, με αλληλουχία αμινοξέων πανομοιότυπη με αυτήν της

25

Tyc. Το σύμπλεγμα γονιδίων που κωδικοποιεί για τη συνθάση της Tyc έχει

κλωνοποιηθεί και χαρακτηρισθεί και γνωρίζουμε ότι στο τελικό άρθρωμα φέρει το

γονίδιο που κωδικοποιεί μια θειοεστεράση (ΤΕ). Η θειοεστεράση αυτή καταλύει την

αποκοπή του γραμμικού ολιγοπεπτιδίου της Tyc από τη συνθάση της Tyc και την

κυκλοποίηση του ολιγοπεπτιδίου προς το βιοδραστικό κυκλικό μόριο της Tyc. Η

ετερόλογη έκφραση του γονιδίου ΤΕ επέτρεψε την απομόνωση σημαντικών

ποσοτήτων δραστικού ενζύμου. Το γεγονός αυτό επέτρεψε την in vitro κυκλοποίηση

του συνθετικού ολιγοπεπτιδίου. Η εξειδίκευση της ΤΕ για το υπόστρωμα (το

ολιγοπεπτίδιο) είναι σχετικά χαλαρή, δηλαδή μπορεί να καταλύει την κυκλοποίηση

ολιγοπεπτιδίων μολονότι αυτά φέρουν τροποποιημένα αμινοξέα. Ως εκ τούτου, τα

αμινοξέα του συνθετικού ολιγοπεπτιδίου μπορούν να φέρουν τροποποιήσεις, οι

οποίες επιτρέπουν τη σύζευξή τους με σάκχαρα (Εικόνα 20). Σε αυτήν την

περίπτωση, είναι δυνατή η σύζευξη σακχάρων στο κυκλικό ολιγοπεπτίδιο, μεσω ημι-

σύνθεσης (Εικόνα 20).

Εικόνα 20. Χήμειο-ενζυμική προσέγγιση στη βιοσύνθεση γλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών. Η χημική

σύνθεση γραμμικών ολιγοπεπτιδίων επιθυμητής αλληλουχίας αμινοξικών καταλοίπων, είναι μια

σχετικά απλή διαδικασία στη οργανική σύνθεση. Ένα συνθετικό ολιγοπεπτίδιο, το οποίο φέρει στο

καρβόξυ-τελικό άκρο του ένα συμπαράγοντα (N-acetylcysteamin, SNAC), ο οποίος μιμείται τις

φυσιολογικές συνθήκες, όπου η ώριμη ολιγοπεπτιδική αλυσίδα είναι συνδεδεμένη στο ένζυμο μέσω

του φωσφοπαντοθενικού. Το γραμμικό ολιγοπεπτίδιο κυκλοποιείται μέσω της δράσης μιας

ανασυνδυασμένης θειοεστεράσης, της συνθετάσης της τυροσιδίνης (ΤΕ) και έτσι σχηματίζεται ένα

ανάλογο της τυροσιδίνης (propargylglycine-substituted tyrocidine analog). Το ανάλογο της

τυροσιδίνης, μετά από χημική επεξεργασία, γλυκοζυλιώνεται προς το σχηματισμό ενός

γλυκοπεπτιδικού αντιβιοτικού.

5.1.2. Γλυκοζυλίωση

Πολλά φυσικά προϊόντα φέρουν δεόξυ-σάκχαρα. Η προσθήκη της γλυκοζύλο-

ομάδας, σε μια αγλυκονική πολύπλοκη ένωση, είναι απαραίτητη για τη βιολογική

δράση πολλών φυσικών προϊόντων. Η προσθήκη των σακχάρων, στον αγλυκονικό

26

κορμό της χημικής ένωσης, καταλύεται από γλυκοζύλο-μεταφοράσες (GTs). Η

προσθήκη της γλυκοζύλο-ομάδας, σε μια συγκεκριμένη θέση της αγλυκονικής

ένωσης, μέσω ημι-σύνθεσης, είναι προς το παρόν εξαιρετικά δύσκολη. Το πρόβλημα

αυτό επιλύθηκε με τη χρήση ένζυμων. Επιπλέον, οι GTs δε παρουσιάζουν μεγάλη

εκλεκτικότητα ως προς τα υποστρώματα που μεταφέρουν. Ως εκ τούτου, είναι δυνατή

η προσθήκη ενός τροποποιημένου δεόξυ-σακχάρου, γεγονός το οποίο παρέχει τη

δυνατότητα διεύρυνσης της βιολογικής δράσης του αρχικού φυσικού προϊόντος. Οι

συνθετικές δυνατότητες των GTs στην κατάλυση της ανταλλαγής σακχάρων, μεταξύ

δομικά ανόμοιων φυσικών προϊόντων, δίνεται στη εικόνα 21.

Εικόνα 21. Αξιοποίηση των γλυκοζύλο-μεταφορασών στην ανταλλαγή σακχάρων, μεταξύ δομικά

ανόμοιων φυσικών προϊόντων. Η γλυκοζύλο-μεταφοράση CalG1 καταλύει την ανταλλαγή σακχάρων

μεταξύ της calicheamicin και της TDP (νουκλεοτιδο-σάκχαρα). Η συνδυασμένη δράση της CalG1 και

της γλυκοζύλο-μεταφοράσης GtfE καταλύει την ανταλλαγή σακχάρων μεταξύ της calicheamicin και

της vancomycin. Η calicheamicin ανήκει στα πολυκετίδια και η vancomycin είναι ένα γλυκοζυλιωμένο

NPR (εξαπεπτίδιο). Αμφότερα παρουσιάζουν αντιβιοτική δράση για βακτήρια και οι παραγωγοί

οργανισμοί Micromonospora echinospora (calicheamicin) και Amycolatopsis orientalis (vancomycin)

έχουν απομονωθεί και καλλιεργηθεί. Τα γονίδια που εμπλέκονται στα μονοπάτια βιοσύνθεσής τους

είναι γνωστά.

27

5.2. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vivo

5.2.1. Βιοσύνθεση κατευθυνόμενη από τoν πρόδρομο μεταβολίτη

Η διαδικασία της βιοσύνθεσης κατευθυνόμενης από τον πρόδρομο μεταβολίτη

(Precursor Directed Biosytnthesis, PDB) θεωρείται η πρώτη εφαρμογή της χημικής

σύνθεσης στη βιοσύνθεση νέων βιο-δραστικών ενώσεων. Στην πιο απλουστευμένη

της μορφή, αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει την προσθήκη στο θρεπτικό μέσο του

παραγωγού μικροοργανισμού (βακτήρια, μύκητες), ενός συνθετικού μεταβολίτη, ο

οποίος δεν έχει εντοπιστεί μέχρι τώρα στη φύση (unnatural precursor) και ο οποίος

αναγνωρίζεται ως υπόστρωμα από τα ένζυμα του μεταβολικού μονοπατιού και

ενσωματώνεται στο τελικό προϊόν της μεταβολικής διαδικασίας (Εικόνα 22). Η

προσέγγιση αυτή έχει δώσει θεαματικά αποτελέσματα όσον αφορά στην παραγωγή

αναλόγων διαφόρων φυσικών προϊόντων. Για παράδειγμα, η προσθήκη φαινόξυ-

οξικού οξέος στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας του Penicillium chrysogenum, είχε ως

αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση ενός αναλόγου της πενικιλίνης, της φαινόξυ-μέθυλο-

πενικιλίνης (Penicillin V). Ωστόσο, σε αυτήν τη διαδικασία υπάρχουν μειονεκτήματα,

διότι βιοσυντίθεται ένα μείγμα φυσικών και μη-φυσικών προϊόντων με παρόμοιες

φυσικές ιδιότητες. Ως εκ τούτου, απαιτείται η προσθήκη υψηλής συγκέντρωσης του

συνθετικού μεταβολίτη, ώστε να ανταγωνίζεται με το φυσικό μεταβολίτη.

5.2.2. Μεταλλαξιογόνος βιοσύνθεση

Η μεταλλαξιογόνος βιοσύνθεση (Mutational biosynthesis, Mutasynthesis)

βασίζεται στη διαδικασία PDB, ωστόσο στη μεταλλαξιογόνο βιοσύνθεση

χρησιμοποιούνται μικροοργανισμοί, οι οποίοι φέρουν ένα απενεργοποιημένο γονίδιο

(λόγω μετάλλαξης), το οποίο κωδικοποιεί για ένα ένζυμο, το οποίο εμπλέκεται στο

μεταβολικό μονοπάτι βιοσύνθεσης του επιθυμητού τελικού προϊόντος (π.χ.

αντιβιοτικού). Σε αυτήν την περίπτωση, στο θρεπτικό μέσο του μεταλλαγμένου

παραγωγού μικροοργανισμού, προστίθεται ένας συνθετικός μεταβολίτης, ο οποίος

έχει χημική δομή ανάλογη με αυτήν του φυσικού ενδιάμεσου μεταβολίτη

(μεταλλάξο-μεταβολίτης, mutasynthons). Ως εκ τούτου, ο παραγωγός

μικροοργανισμός δεν έχει εναλλακτικές λύσεις και χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα το

μεταλλαξο-μεταβολίτη, για τη βιοσύνθεση του τελικού προϊόντος. Με αυτόν τον

28

τρόπο, το τελικό προϊόν που παράγεται, δεν περιέχει προσμίξεις και απομονώνεται

σχετικά εύκολα και σε ποσότητα (Εικόνα 22δ).

Μία από τις πρώτες εφαρμογές της μεταλλαξιογόνου βιοσύνθεσης ήταν η

βιοσύνθεση αναλογών της νεομυκίνης (neomycin). Στην περίπτωση αυτή, ο

παραγωγός μικροοργανισμός, Streptomyces fradiae, υπέστη τυχαίες μεταλλάξεις, με

τη χρήση του μεταλλαξογόνου ΜΝΝG (προκαλεί σημειακές μεταλλάξεις στο DNA)

και επελέγησαν μεταλλαγμένα στελέχη, τα οποία δεν παράγουν neomycin. Όταν στο

θρεπτικό μέσο καλλιέργειας, του μεταλλαγμένου στελέχους, προστέθηκε ένα

συνθετικό ανάλογο (στρεπταμίνη) του φυσιολογικού ενδιαμέσου μεταβολίτη

(δεοξυστρεπταμίνη), τότε ο συνθετικός μεταβολίτης χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα

και το τελικό προϊόν ήταν ένα ανάλογο της neomycin.

Εικόνα 22. Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας της βιοσύνθεσης κατευθυνόμενης από τον

πρόδρομο μεταβολίτη και της διαδικασίας της μεταλλαξιογόνου-βιοσύνθεσης. (α) Η διαδικασία

βιοσύνθεσης ενός φυσικού προϊόντος από το αγρίου-τύπου στέλεχος (παραγωγός μικροοργανισμός).

(β) Η διαδικασία βιοσύνθεσης του φυσικού προϊόντος όταν έχει προκληθεί μια συγκεκριμένη

μετάλλαξη στον παραγωγό μικροοργανισμό, σε κάποιο σημαντικό βήμα της πορείας βιοσύνθεσης του

φυσικού προϊόντος. (γ) Η βιοσύνθεση κατευθυνόμενη από τον πρόδρομο μεταβολίτη. Σε αυτήν τη

διαδικασία, στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας προστίθεται ένα ανάλογο του φυσιολογικού ενδιάμεσου

μεταβολίτη (μεταλλαξο-μεταβολίτης), το οποίο ανταγωνίζεται με το φυσιολογικό υπόστρωμα. (δ) Η

μεταλλαξιογόνο-βιοσύνθεση. Σε αυτήν τη διαδικασία χρησιμοποιείται ένα μεταλλαγμένο στέλεχος του

παραγωγού μικροοργανισμού και στο θρεπτικό μέσο προστίθεται ένας μεταλλαξο-μεταβολίτης

(mutasynthon).

29

Εικόνα 23. Μεταλλαξιογόνο-βιοσύνθεση του αντιβιοτικού νεομυκίνη. Καλλιέργεια του

μεταλλαγμένου παραγωγού μικροοργανισμού (Streptomyces fradiae) εμβολιάζεται με το μεταλλάξο-

μεταβολίτη (streptamine). Ο μεταλλάξο-μεταβολίτης ενσωματώνεται στο τελικό προϊόν και έτσι

παράγεται ένα ανάλογο της νεομυκίνης (neomycin).

5.2.3. Χήμειο-βιοσύνθεση

Η μελέτη της ενζυμολογίας και της μοριακής βιολογίας των αρθρωτών

συνθασών των πολυκετιδίων, έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας νέας προσέγγισης

της μεταλλαξιογόνου βιοσύνθεσης, της χήμειο-βιοσύνθεσης (Chemobiosynthesis).

H χήμειο-βιοσύνθεση βασίζεται στη συνδυασμένη απενεργοποίηση μιας δομικής

περιοχής του γονιδίου στόχου (π.χ. το πολυλειτουργικό σύμπλεγμα της PKS) και της

παροχής συνθετικών αναλόγων στο μεταλλαγμένο μικροοργανισμό. Η προσέγγιση

αυτή χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στη βιοσύνθεση αναλόγων της ερυθρομικίνης

(erythromycin). H ερυθρομικίνη έχει παρόμοιο φάσμα αντιβιοτικής δράσης με αυτό

της πενικιλίνης και ως εκ τούτου αποτελεί μια εναλλακτική λύση για ασθενείς που

παρουσιάζουν αλλεργία στην πενικιλίνη. Ο παραγωγός μικροοργανισμός είναι η

Saccharopolyspora erythrae. Στη φυσιολογική πορεία βιοσύνθεσης, η

αναπτυσσόμενη πολυκετιδική αλυσίδα μεταφέρεται από άρθρωμα σε άρθρωμα και

παραμένει προσδεδεμένη στο ενζυμικό σύστημα, μέσω ενός θειοεστερικού

συνδέσμου (Εικόνα 24). Εάν απενεργοποιηθεί το γονίδιο ΚS, του αρθρώματος 1, τότε

παύει η λειτουργία αυτής της κετοσυνθάσης της DEBS1. Με βάση τα παραπάνω,

κατασκευάστηκε ένα στέλεχος, όπου το γονίδιο που κωδικοποιεί την ΚS του

αρθρώματος 1 είναι απενεργοποιημένο. Είναι γνωστό ότι το φυσιολογικό υπόστρωμα

του αρθρώματος 2 είναι ένα δικετίδιο, το οποίο είναι συνδεδεμένο με το ένζυμο μέσω

ενός θειοεστερικού δεσμού. Ως εκ τούτου, εάν στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας του

μεταλλαγμένου στελέχους προστεθεί ένα συνθετικό δικετίδιο, με χημική δομή

30

ανάλογη του φυσιολογικού δικετιδίου, τότε η βιοσυνθετική διαδικασία θα

προχωρήσει και το τελικό προϊόν θα είναι ένα ανάλογο της erythromycin (Εικόνα 24).

Εικόνα 24. Η χήμειο-βιοσυνθετική διαδικασία παραγωγής αναλόγου του 6-EB. Μια σημειακή

μετάλλαξη στο γονίδιο της KS καθιστά ανενεργή την κετοσυνθάση της DEBS1.

5.2.4. Βιοκατάλυση σε άθικτα κύτταρα

Η ανάπτυξη της σύνθεσης συνθετικών πρόδρομων των φυσικών προϊόντων σε

συνδυασμό με την ανάπτυξη της Τεχνολογίας του Ανασυνδυασμένου DNA, επιτρέπει

την in vitro ή την in vivo χρήση των ενζύμων για την παράγωγη νέων φυσικών

προϊόντων. Για παράδειγμα, το σύμπλεγμα γονίδιων που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση

της lovastatin έχει χαρακτηριστεί. Το γονίδιο LovD κωδικοποιεί για μια στέρεο-

εξειδικευμένη ακυλομεταφοράση, η οποία καταλύει τη μεταφορά μιας μέθυλο-

βουτυρύλο ομάδας στο monacolin, προς το σχηματισμό της lovastatin. Ενδελεχής

έλεγχος της εξειδίκευσης της LovD έδειξε, ότι το ένζυμο δέχεται πολλά

υποστρώματα με παρόμοια δομή. Η έκφραση της LovD στην E.coli με την

ταυτόχρονη πρoσθήκη στο θρεπτικό της monacolin J καθώς και της κατάλληλα

31

τροποποιημένης άκυλο-ομάδας, έχει ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση της simvastatin

(Εικόνα 17A). Η απόδοση της διαδικασίας αυτής βελτιώνεται με τη χρήση

μεταλλαγμένων στελεχών του E.coli, τα οποία παρουσιάζουν μια σχετικά καλύτερη

διαπερατότητα της μεμβράνης στους προστιθέμενους συνθετικούς μεταβολίτες.

5.2.5. Κατασκευή συνθετικών γονιδίων και Χήμειο-ενζυμική σύνθεση αναλόγων

των πολυκετιδίων

H χημική σύνθεση επέτρεψε την κατασκευή τμημάτων DNA επιθυμητής

αλληλουχίας, με μήκος 500bp, τα οποία συνδέθηκαν προειμένου να σχηματισθούν

τμήματα DNA μήκους 5kb. Στη συνεχεία, αυτά τα τμήματα DNA συγκροτηθήκαν,

μέσω κλωνοποίησης, σε μεγαλύτερα έως και 32kb. Η τεχνολογία αυτή επέτρεψε την

έκφραση γονιδίων, τα οποία προέρχονται από παραγωγούς οργανισμούς, οι οποίοι

διαθέτουν γένωμα με υψηλό περιεχόμενο σε GC, σε ετερόλογο ξενιστή. Επίσης,

παρείχε τη δυνατότητα κατασκευής συγκεκριμένων αθρωμάτων και δομικών

περιοχών, οι οποίες μπορούν να κλωνοποιηθούν. Το γεγονός αυτό επέτρεψε το

συνδυασμό αθρωμάτων και δομικών περιοχών από τις ίδιες ή διάφορες PKSs και

NRPSs και τη βιοσύνθεση πολυκετιδίων, τα οποία δεν παράγονται στη φύση από

τους παραγωγούς οργανισμούς (μη-φυσικά προϊόντα) (Εικόνα 25).

Εικόνα 25. Κατασκευή συνθετικών γονιδίων, συνδυαστική συναρμολόγηση των αρθρωμάτων της PKS

και χρησιμοποίησή τους στη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. Διαγραμματική απεικόνιση των

συνθετικά κατασκευασμένων γονιδίων, που κωδικοποιούν για το άρθρωμα φόρτωσης (ΑΤ, ACP), το

διαπεπτιδικό σύνδεσμο (LI), τον ενδοπεπτιδικό σύνδεσμο (LN), τον ενδοπεπτιδικό σύνδεσμο (LC), τη

θειοεστεράση (ΤΕ), το άρθρωμα δότη (KS, AT, KR, ACP), το άρθρωμα δέκτη (KS, AT, KR, ACP). Τα

γονίδια αυτά κλωνοποιήθηκαν σε τέσσερις διαφορετικούς πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης και τα

ανασυνδυασμένα πλασμίδια μεταφέρθηκαν στο E.coli. Η τελική διευθέτηση των πρωτεϊνών, που

παράγονται μετά την έκφραση των συνθετικών γονιδίων στο E.coli. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν

χώρα και η χημική δομή του τελικού προϊόντος (ΤLΚ).

32

6. Νέες Τεχνολογίες του Ανασυνδυασμένου DNA για τη βιοσύνθεση φυσικών

προϊόντων

Η γενετική μηχανική των PKS γονιδίων, στον παραγωγό οργανισμό

(οργανισμός, ο οποίος τυπικά βιοσυνθέτει το φυσικό προϊόν), είναι γενικά δύσκολη.

Για παράδειγμα, η προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή της πρώτης

βιβλιοθήκης αναλόγων της ερυθρομυκίνης, προσεγγίστηκε με τη διαδοχική

κλωνοποίηση σε ένα πλασμίδιο, των τριών αρθρωμάτων DEBS1, 2 και 3, οι οποίες

είχαν υποστεί μεταλλάξεις είτε στη δομική περιοχή Α είτε στη KR. Οι αλλαγές στις

δομικές περιοχές είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας μεταλλαγμένης PKS,

DEBS1, 2 και 3. Έκφραση των μεταλλαγμένων γονιδίων στο Streptomyces coelicolor

είχε ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση περίπου 50 νέων πολυκετιδίων (Eικόνα 26).

Eικόνα 26. Συνδυαστική βιοσύνθεση της DEBS. Οι μεταλλάξεις έγιναν σε κάθε ένα από τα

αρθρώματα DEBS1, 2 και 3. Στη DEBS1 αντικαταστήθηκε η περιοχή KR του αρθρώματος 2 με τις

DH/ER/KR από το άρθρωμα 2 της συνθάσης της ραπαμικίνης (rapamycin). Στην DEBS2

απομακρύνθηκε ένα τμήμα της δομικής περιοχής KR του αρθρώματος 5 και στην DEBS3

αντικαταστάθηκε η ειδική δομική περιοχή ΑΤ του αρθρώματος 6 με μια αντίστοιχη περιοχή του

αρθρώματος 2 της συνθάσης της rapamycin.

Η προσέγγιση αυτή βελτιώθηκε, με την ταυτόχρονη έκφραση στο

Streptomyces αρθρωμάτων των PKS, μετά από κλωνοποίησή τους σε δύο ή τρία

συμβατά πλασμίδια. Τα πλεονεκτήματα που προσφέρει αυτή η προσέγγιση, γίνονται

33

κατανοητά στο παράδειγμα της εικόνας 27. Τα γονίδια που εμπλέκονται στη

βιοσύνθεση πολυκετιδίων, στα φυτά, εντοπίζονται διασκορπισμένα στο γονιδίωμα.

Την τελευταία πενταετία έχει κατασκευαστεί μια σειρά φορέων έκφρασης, οι όποιοι

έχουν τη δυνατότητα να συνεκφράζονται στο E.coli (διαθέτουν διαφορετική θέση

έναρξης αντιγραφής και διαφορετικά γονίδια επιλογής) και κάθε φορέας φέρει δύο

προς έκφραση γονίδια. Δηλαδή, μπορούν να εκφραστούν ταυτόχρονα οκτώ γονίδια

(Εικόνα 27). Για παράδειγμα, η βιοσύνθεση φυτικών πολυκετιδίων, όπως είναι τα

φλαβονοειδή και τα στιλβένια, στο E.coli, έχει επιτευχθεί με την κλωνοποίηση 8

cDNA σε 4 συμβατά πλασμίδια (Εικόνα 27).

Εικόνα 27. Βιοσυνθετική οδός των πολυκετιδίων στα φυτά (Α) και το ανασυνδυασμένο E.coli. (B). Η

κατασκευή της τεχνητής βιοσυνθετικής οδού στο ανασυνδυασμένο E.coli διαχωρίζεται σε τρία στάδια.

Στο πρώτο στάδιο πραγματοποιείται η βιοσύνθεση των υποστρωμάτων (μαλόνυλο-CoA και εστέρες

του CoA) μέσω της δράσης των ενζύμων 4CL-1, στο δεύτερο στάδιο πραγματοποιείται η βιοσύνθεση

του πολυπεπτιδίου από τα ένζυμα CHS/CHI και στο τρίτο η τροποποίησή του από τα ενζυμα FNS και

F3H/FLS. Στο τεχνητό μεταβολικό μονοπάτι βιοσύνθεσης, τα καρβοξυλικά οξέα που παρέχονται ως

υπόστρωμα, μπορεί να έχουν μια πρωτότυπη δομή (κατασκευή μέσω χημικής σύνθεσης), γεγονός που

επιτρέπει τη βιοσύνθεση νέων πολυκετιδίων. Οι διαφορετικοί πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης, pDuet-

1, φέρουν cDNA ή DNA από διαφορετικούς οργανισμούς.

34

Το μεγάλο μέγεθος των συμπλεγμάτων γονιδίων, συχνά, προκαλεί τεχνικά

προβλήματα, διότι δεν είναι εύκολο να πραγματοποιηθούν γενετικές παρεμβάσεις,

όπως για παράδειγμα η απομάκρυνση ενός γονιδίου ή τμήματός του ή η

αντικατάσταση με ένα άλλο ή η προσθήκη ενός επιθυμητού τμήματος DNA. Μια

εναλλακτική λύση στο πρόβλημα προσφέρεται μέσω μιας νέας προσέγγισης

τροποποίησης, απομάκρυνσης ή ενσωμάτωσης τμημάτων DNA, οποιουδήποτε

μεγέθους, η οποία αναφέρεται ως κλωνοποίηση μέσω ανασυνδυασμού (Red/ET

recombineering). Η προσέγγιση αυτή επιτρέπει μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού σε

στελέχη του E.coli, τα οποία εκφράζουν τα ζεύγη πρωτεϊνών RecE/RecT ή

Redα/Redβ του προφάγου Rac ή του φάγου λ, αντίστοιχα, την κλωνοποίηση

οποιουδήποτε τμήματος DNA (Εικόνα 28). Bασικό βήμα της παραπάνω διαδικασίας

αποτελεί ο ανασυνδυασμός μεταξύ της κατασκευής, η οποία φέρει το γονίδιο και τους

βραχίονες ομολογίας (hm), με το φορέα-στόχο, ο οποίος μπορεί να είναι είτε ένα

πλασμίδιο είτε ένα κοσμίδιο είτε ένα τεχνητό βακτηριακό χρωμόσωμα (BAC)

(Εικόνα 28).

Εικόνα 28. Διαδικασίες ένθεσης ενός τμήματος DNA στο φορέα στόχο ή στο βακτηριακό χρωμόσωμα.

Κατασκευή του προς ένθεση τμήματος DNA (marker), το όποιο φέρει, εκατέρωθεν, τις επιθυμητές

ομόλογες αλληλουχίες ανασυνδυασμού (hm). Αυτό το τμήμα DNA εισάγεται στο E.coli, το οποίο

φέρει το DNA στόχο (target). Το τμήμα DNA στόχος μπορεί να εδράζεται σε έναν οποιονδήποτε

φορέα ή στο χρωμόσωμα του βακτηρίου. Το πλασμίδιο pRed/ET φέρει τα γονίδια που κωδικοποιούν

για τις RecE/RecT ή Redα/Redβ, οι οποίες καταλύουν τις διαδικασίες ανασυνδυασμού. Τα ενζυμα

αυτά επιτρέπoυν την εισαγωγή του επιθυμητού τμήματος DNA στον DNA στόχο.

35

Η τεχνολογία της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού (Red/ET

Recombineering) επιτρέπει την ένθεση (insertion), αντικατάσταση (replacement) ή

απομάκρυνση (deletion) οποιουδήποτε τμήματος DNA ή την προσθήκη ή την

απομάκρυνση μίας και μόνο βάσης (point motations) από το DNA στόχο (Εικόνα 29).

Εικόνα 29. Σχηματιστική αναπαράσταση των γενετικών επεμβάσεων που πραγματοποιούνται με τη

χρήση της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού.

7. Εργαλεία για την ανεύρεση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των

φυσικών προϊόντων και εντοπισμός νέων φυσικών προϊόντων

Η ανεύρεση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των φυσικών

προϊόντων βασίζεται σε δυο προσεγγίσεις. Η πρώτη προσέγγιση αφορά στην

απομόνωση και το χαρακτηρισμό της χημικής δομής και βιολογικής δράσης των

διαφόρων φυσικών προϊόντων. Ο συνδυασμός τεχνικών διαχωρισμού, όπως η

χρωματογραφία υψηλής πίεσης, η εκχύλιση στερεής φάσης, η φασματοσκοπία μάζας

και ο πυρηνικός παραμαγνητικός συντονισμός, έχουν σημαντική επίδραση στην

ελάττωση του χρόνου που απαιτείται για τη δομική ανάλυση των φυσικών προϊόντων.

Ο παραδοσιακός τρόπος εξέτασης της βιολογικής δράσης των φυσικών προϊόντων

τείνει να αντικατασταθεί με αυτοματοποιημένες μεθόδους σάρωσης μεσαίας ή

υψηλής αποδοτικότητας (Medium or High-throuput screening, MST or HST). Οι

36

μέθοδοι αυτές επιτρέπουν τη σάρωση χιλιάδων δειγμάτων ημερήσια. Γενικά, ο

έλεγχος περιλαμβάνει τη δράση των φυσικών προϊόντων σε κατάλληλες σειρές

καλλιεργούμενων ευκαρυωτικών κυττάρων (κύτταρα-δείκτες) ή ακόμη και σε

κύτταρα που απομονώνονται από ανθρώπους, για αναστολή ή διέγερση των

κυτταροδιαιρέσεων, αντί-ιική δράση, αντί-φλεγμονώδη δράση και άλλα. Παρόμοιες

μελέτες πραγματοποιούνται με βακτήρια. Ένα από τα σημαντικά εργαλεία των

βιολογικών δοκιμών, είναι το δοχείο μίκρο-τιτλοδότησης, το οποίο φέρει 96-3456

πηγαδάκια δοκιμής. Τα φυσικά προϊόντα, μετά το διαχωρισμό τους, διατηρούνται σε

δοχεία μικρο-τιτλοδότησης (stock plates). Τα δοχεία μικρο-τιτλοδότησης δε

χρησιμοποιούνται για τα πειράματα αλλά αποτελούν τις αποθήκες των

διαχωρισμένων φυσικών προϊόντων. Κατά την έναρξη του πειράματος, το προς

εξέταση βιολογικό δείγμα (π.χ. κύτταρα, πρωτεΐνες) κατανέμεται σε δοχεία μίκρο-

τιτλοδότησης δοκιμής (assay plates), τα οποία επωάζονται υπό κατάλληλες συνθήκες

και στη συνέχεια μικρή ποσότητα (nanoliters) του φυσικού προϊόντος (σε υγρή

μορφή) μεταγγίζεται σε κάθε πηγαδάκι. Σημειώνεται, ότι όλες οι παραπάνω

διεργασίες (π.χ. δειγματοληψία, μετρήσεις ανάπτυξης των κυττάρων)

πραγματοποιούνται με αυτοματοποιημένα συστήματα. Συχνά, όμως, είναι αναγκαίο,

οι μετρήσεις να γίνονται χειρονακτικά, από τον ίδιο τον ερευνητή. Για παράδειγμα,

όταν το βιολογικό δείγμα είναι ένα έμβρυο και απαιτείται μικροσκοπική

παρακολούθηση ώστε να διαπιστωθούν εμβρυακές αναπτυξιακές ανωμαλίες. Στη

εικόνα 30, δίδεται διαγραμματικά, ένα παράδειγμα σάρωσης μεσαίας αποδοτικότητας

της παρουσίας βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών.

37

Εικόνα 30. Διαγραμματική απεικόνιση σάρωσης βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών. Μια

μεταγονιδιωματική βιβλιοθήκη κατασκευάστηκε από DNA της μικροχλωρίδας του λεπτού εντέρου,

από υγιείς ανθρώπους και από ασθενείς με τη νόσο Grohns. Οι κλώνοι (40kb) εκφραστήκαν στο E.coli

σε δοχεία μικροτιτλοδότησης. Ακλούθησε η εκχύλιση της καλλιέργειες και το υπερκείμενο

μεταφέρθηκε σε ένα δοχείο μικροτιτλοδότησης (master plate). Αραιωμένο δείγμα του υπερκείμενου

(1:30 v/v) μεταφέρθηκε σε δοχεία μικροτιτλοδότησης δοκιμής (assay plates), στα οποία προηγουμένως

είχε εναποτεθεί δείγμα κυττάρων CV-1 (κύτταρα-δείκτης). Μετά από επώαση παρατηρήθηκε, ότι

ορισμένα από τα εκχυλίσματα προκάλεσαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενώ άλλα την

αναστολή του πολλαπλασιασμού τους. Σε ένα δεύτερο βήμα, εξετάστηκε η επίδραση των

εκχυλισμάτων που έδωσαν σε συνθήκες υψηλής ή χαμηλής συγκέντρωσης κυττάρων δείκτες. Σε όλα

τα πειράματα υπήρχαν σημεία ελέγχου δηλαδή εκχυλίσματα από βακτηριακά κύτταρα, τα οποία δεν

έφεραν κανένα κλωνοποιημένο τμήμα DNA.

Η δεύτερη προσέγγιση αξιοποιεί το δυναμικό της χημικής ποικιλότητας που

κωδικοποιείται από το γονιδίωμα. Είναι δυνατό να υπολογίσουμε το βιοσυνθετικό

δυναμικό ενός παραγωγού οργανισμού, διερευνώντας το γένωμά του για πιθανά

μεταβολικά μονοπάτια, που οδηγούν στη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. Τούτο

είναι δυνατό, διότι τα πλέον σημαντικά φυσικά προϊόντα, PKs και NRPs,

βιοσυντίθενται από PKSs και των NRPSs, οι οποίες κατά κανόνα κωδικοποιούνται

από συμπλέγματα γονιδίων. Ανάλυση του γονιδιώματος έδειξε, ότι το βιοσυνθετικό

38

δυναμικό των μικροοργανισμών, για παραγωγή φυσικών προϊόντων, φαίνεται να

είναι μεγαλύτερο, σε σύγκριση με τα φυσικά προϊόντα που έχουν ήδη απομονωθεί

από αυτόν τον μικροοργανισμό. Πιθανά, οι άλλες άλλες συνθάσες (PKSs και NRPSs)

δεν εκφράζονται στις συγκεκριμένες εργαστηριακές συνθήκες (σιωπηλό σύμπλεγμα

βιοσυνθετικών γονιδίων, silent biosynthetic gene cluster) ή παράγεται ένα φυσικό

προϊόν, το οποίο δεν εντοπίζεται μέσω της διαθέσιμης τεχνολογίας. Στη περίπτωση

κατά την οποία το πιθανό προϊόν είναι άγνωστο τα γονίδια που εμπλέκονται στην

βιοσύνθεση του αναφέρονται ως ορφανό σύμπλεγμα βιοσυνθετικών γονιδίων

(orphan biosynthetic gene cluster).+

7.1. Προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση των σιωπηλών μεταβολικών μονοπατιών

Οι προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση των σιωπηλών μεταβολικών

μονοπατιών βασίζονται σε διεπιστημονικά πεδία, όπως η γονιδιωματική

(αλληλούχιση εκατοντάδων γονιδιωμάτων βακτηρίων), η βιοπληροφορική, η

αναλυτική βιοτεχνολογία, η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και το γεγονός

ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν για τη βιοσύνθεση των PKs και NRPs οργανώνονται

στο γονιδίωμα ως ένα σύμπλεγμα γονιδίων.

7.1.1. Διερεύνηση ολοκλήρων γονιδιωμάτων

Η προσέγγιση της διερεύνησης ολόκληρων γονιδιωμάτων, βασίζεται στην in

silico σάρωση γονιδιωμάτων, των οποίων έχει προσδιοριστεί η αλληλουχία, για

συναινετικά μοτίβα αμινοξικών αλληλουχιών. Έχει προσδιοριστεί η αλληλουχία του

γονιδιώματος τουλάχιστον 700 μικροοργανισμών και έχει καταχωρηθεί στις δημόσιες

βάσεις δεδομένων. Η πιθανή λειτουργία των γονιδίων έχει προσδιοριστεί με

αυτοματοποιημένες μεθόδους βιοπληροφορικής (π.χ. σύγκριση ανά ζεύγη των

αμινοξικών αλληλουχιών). Το πρώτο συμπέρασμα, μετά από μια γρήγορη ανάλυση

των πληροφοριών, καταδεικνύει ότι ο αριθμός συμπλεγμάτων γονιδίων, που πιθανά

εμπλέκονται στη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων, ξεπερνά κατά πολύ τους γνωστούς

δευτερογενείς μεταβολίτες. Για παράδειγμα, το γονιδίωμα του κυανοβακτηρίου

Nostoc punctioforme περιέχει 22 συμπλέγματα γονίδιων, τα οποία κωδικοποιούν

πιθανές PKSs ή NRPSs, ωστόσο, μόνο μία από αυτές τις συνθάσες φαίνεται να έχει

σχέση με τη βιοσύνθεση ενός δευτερογενούς μεταβολίτη (nostopeptolide). Το

γονιδίωμα 13 ακτινοβακτηρίων, της μεγαλύτερης ομάδας οργανισμών που παράγουν

39

αντιβιοτικά, παρουσιάζει παρόμοιες τάσεις. Αξιολόγηση 11 παραγωγών

ακτινοβακτηρίων, συμπεριλαμβανομένων του Streptomyces coelicor (το πλέον

χαρακτηρισμένο στέλεχος των ακτινοβακτηρίων) και του Streptomyces avermitis

(στέλεχος που χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανική παραγωγή αντιβιοτικών),

αποκάλυψε την παρουσία 118 συμπλεγμάτων PKS ή NRPS γονιδίων. Ωστόσο, μόνο

14 αντιστοιχούν σε συμπλέγματα PKS ή NRPS, τα οποία παράγουν γνωστά φυσικά

προϊόντα.

7.1.2. Στρατηγική του PCR

Σε πολλές περιπτώσεις, η αλληλουχία του γονιδιώματος του μικροοργανισμού

δεν είναι στη διάθεση μας. Τότε, μπορούμε να διερευνήσουμε το γένωμα του

μικροοργανισμού, για την παρουσία συμπλεγμάτων PKS και NPRS γονιδίων, μέσω

της προσέγγισης PCR. Συγκεκριμένα, αρχικά, επιλέγονται τα γονίδια στόχοι. Στη

συνέχεια, μέσω πολλαπλής σύγκρισης των αμινοξικών αλληλουχιών πολυπεπτιδίων,

που κωδικοποιούν για γνωστά γονίδια, τα οποία ομοιάζουν με τα γονίδια στόχους,

προσδιορίζονται συντηρημένες αμινοξικές περιοχές και κατασκευάζονται

εκφυλισμένοι εκκινητές. Οι εκκινητές αυτοί χρησιμοποιούνται σε αντιδράσεις PCR,

με μήτρα το DNA από τον άγνωστο μικροοργανισμό. Τα προϊόντα της PCR

αντίδρασης χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές, για τη σάρωση γονιδιωματικών

βιβλιοθηκών, από τον άγνωστο οργανισμό. Για την πιο έγκυρη διάγνωση του

συμπλέγματος γονιδίων, ενδείκνυται να επανεξετάζονται οι θετικοί γονιδιωματικοί

κλώνοι της πρώτης σάρωσης, με ανιχνευτή ένα προϊόν PCR από ένα δεύτερο γονίδιο-

στόχο, το οποίο πιθανά εμπλέκεται στο μεταβολικό μονοπάτι.

7.1.3. Σάρωση του γονιδιώματος

Η προσέγγιση αυτή βασίζεται στο γεγονός, ότι τα γονίδια που εμπλέκονται

στη βιοσύνθεση των PKs ή των NRPs συγκροτούνται σε ένα σύμπλεγμα (η

αλληλουχία του γονιδιώματος του παραγωγού οργανισμού δεν είναι γνωστή).,

Καταρχήν, κατασκευάζονται δυο γονιδιωματικές βιβλιοθήκες από τον άγνωστο

οργανισμό. Η μια βιβλιοθήκη φέρει μεγάλα τμήματα DNA (40-80kb) ενώ η δεύτερη

φέρει μικρά (0.6-0.8kb) τμήματα DNA (αναφέρονται ως genome sequence tags,

GSTs). Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η αλληλουχία βάσεων μερικών εκατοντάδες

κλώνων (shot gun sequencing) από τη δεύτερη βιβλιοθήκη (genome sequence tags,

40

GSTs). Αναμένεται, ότι μετά την ανάλυση των αλληλουχιών, οποιοδήποτε

σύμπλεγμα γονιδίων θα εκπροσωπείται στα GSTs. Τα GSTs που περιέχουν

αλληλουχίες γονιδίων, οι οποίες εμπλέκονται στο δευτερογενή μεταβολισμό,

επιλέγονται και χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές, για τη σάρωση της πρώτης

βιβλιοθήκης (BAC κλώνοι). Τα συμπλέγματα γονιδίων που προκύπτουν, αναλύονται

με μεθόδους, οι οποίες περιγράφονται παρακάτω.

7.1.4. Πρόβλεψη με βάση τη βιοπληροφορική ανάλυση και τις φυσικοχημικές ή

τις φαρμακολογικές ιδιότητες του τελικού προϊόντος

Σε περίπτωση που η αλληλουχία των προς διερεύνηση συμπλεγμάτων των

γονιδίων (σιωπηλό μονοπάτι) είναι γνωστή είτε μέσω αλληλούχισης ολόκληρου του

γονιδιώματος ή τμήματός του, είναι δυνατή η in silico πρόβλεψη της χημικής δομής

του φυσικού προϊόντος, το οποίο κωδικοποιείται από το σιωπηλό σύμπλεγμα

γονιδίων. Με βάση αυτές τις προβλέψεις, υπολογίζονται, με κάποια ακρίβεια, οι

φυσικοχημικές ιδιότητες (π.χ. φάσμα απορρόφησης στο UV, πολικότητα, μάζα) του

τελικού προϊόντος. Ως εκ τούτου, οι διαδικασίες εκχύλισης και κλασμάτωσης

μπορούν να βελτιστοποιηθούν, σε ό,τι αφορά τους οργανικούς διαλυτές, τις

χρωματογραφικες μεθόδους και ιδιαιτέρα τις μεθόδους προσδιορισμού (MS, UV,

ELSD). Στις περιπτώσεις που η προβλεπόμενη χημική δομή, του φυσικού προϊόντος,

παρουσιάζει ομοιότητες με φαρμακολογικά δραστικές ομάδες ενώσεων, τότε οι

πιθανές βιολογικές δράσεις του μπορεί να αξιοποιηθούν για τον προσδιορισμό του.

Η αποτελεσματικότητα αυτής της προσέγγισης έχει βρει εφαρμογές στην

απομόνωση βιοδραστικών ενώσεων. Για παράδειγμα, ανάλυση του γονιδιώματος του

παραγωγού αντιβιοτικών ενώσεων μικροοργανισμού Streptomyces sp.Eco86 έδειξε,

ότι αυτό το στέλεχος φέρει μερικά συμπλέγματα γονιδίων. Ένα από αυτά τα

συμπλέγματα φαίνεται να κωδικοποιεί μια τύπου Ι συνθάση των πολυκετιδίων, με

σχετικά μικρό αριθμό συνοδών γονιδίων, που έχουν τη δυνατότητα κωδικοποίησης

τροποποιητικών ενζύμων, όπως μια ασυνήθη μονοοξυγονάση (Εικόνα 31). Ανάλυση

αυτού του συμπλέγματος γονιδίων επιτεύχθη με τη χρήση μίας βάσης δεδομένων, η

οποία περιείχε πάνω από 1600 γνωστά συμπλέγματα γονιδίων, τα οποία εμπλέκονται

στη βιοσύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών, από διαφορετικούς μικροοργανισμούς.

Η συσχέτιση των επί μέρους γονιδίων, του αγνώστου συμπλέγματος, με τα γνωστά,

επέτρεψε την πρόβλεψη της πιθανής χημικής δομής του τελικού προϊόντος, του

41

αγνώστου συμπλέγματος γονιδίων. Για παράδειγμα, για να προσδιορισθεί εάν η δομή

του πολυκετιδίου είναι γραμμική ή κυκλική, εξετάστηκε η θειοεστεράση (ΤΕ) του

τελικού αθρώματος (άρθρωμα 9, Εικόνα 31) του άγνωστου συμπλέγματος γονιδίων.

Η σύγκριση των αμινοξικων αλληλουχιών της ΤΕ με άλλες ΤΕ κατέδειξε, ότι η

τελική δομή της μακρολακτόνης είναι γραμμική. Επιπλέον, φαίνεται ότι σχηματίζεται

μια δομή πυρανόνης. Η πυρανόνη αυτή φαίνεται να αποτελεί υπόστρωμα για δύο

τύπους οξειδοαναγωγασών, της OXRC και της HOXC. Τα γονίδια που κωδικοποιούν

για αυτές τις οξειδοαναγωγάσες, εδράζονται στον κοινό γενετικό τόπο (Εικόνα 25).

Φυλογενετική ανάλυση των OXRCs έδειξε, ότι όλα αυτά τα ένζυμα μπορούν να

υδροξυλιώσουν το πέμπτο άτομο άνθρακα της πυρανόνης. Ιδιαιτέρα, η υδροξυλάση

που κωδικοποιείται από το ORF14, παρουσιάζει εξαιρετική ομοιότητα με την

αμινοξική αλληλουχία ενζύμων, που υδροξυλιώνουν μακρολίδες. Μια πιθανή θέση

δράσης αυτού ενζύμου είναι η αιθυλική ομάδα της πυρανόνης. Φυλογενετική

ανάλυση της HOXC αποκάλυψε σημαντική ομολογία αμινοξέων με γνωστές

οξυγονάσες, οι οποίες καταλύουν το σχηματισμό μιας κυκλικής δομής με 7 άτομα

άνθρακα. Η τελευταία χημική ένωση υπόκειται σε αυτόματη υδρόλυση και έτσι

σχηματίζεται μια αλκένυλ-φουρανόνη. Με βάση τις παραπάνω προβλέψεις, ο

παραγωγός μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε διάφορα θρεπτικά μέσα καλλιέργειας

και το υπερκείμενο κάθε καλλιέργειας εξετάστηκε για την ύπαρξη τελικών

προϊόντων, των οποίων η χημική δομή να μοιάζει με αλκένυλ-φουρανόνη.

42

Εικόνα 31. Σύμπλεγμα γονιδίων του Streptomyces sp.Eco86, τα οποία πιθανά κωδικοποιούν για τη

σύνθεση ενός φυσικού προϊόντος και το προβλεπόμενο μεταβολικό μονοπάτι για τη βιοσύνθεση ενός

φυσικού προϊόντος. Ο γενετικός τόπος του συμπλέγματος γονιδίων είναι 65kb. Αποτελείται από 16

ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης. Η συνθάση του πολυκετιδίου αποτελείται από 4 ανοικτά πλαίσια

ανάγνωσης και περιέχει συνολικά 9 αρθρώματα.

Πράγματι, το τελικό προϊόν που ανευρέθηκε στο υπερκείμενο, περιείχε

σημαντικές ποσότητες αλκένυλ-φουρανόνης. Οι βιοδραστικές ιδιότητες της αλκένυλ-

φουρανόνης εξετάστηκαν και έχει δειχθεί ότι παρουσιάζει εντομοκτόνο δράση.

7.1.5. Συνδυασμός απενεργοποίησης γονιδίου και συγκριτική ανάλυση των

φυσικών προϊόντων

Μία εναλλακτική μέθοδος, από τις μεθόδους που προαναφερθήκαν, αφορά

στην απενεργοποίηση γονιδίων του σιωπηλού μονοπατιού. Σε αυτήν τη μέθοδο,

πρώτα αναγνωρίζεται το πιθανό σιωπηλό μονοπάτι μέσω βιοπληροφορικής ή άλλων

στρατηγικών και στη συνέχεια, ένα από τα γονίδια του συμπλέγματος

απενεργοποιείται (η αλληλουχία του συμπλέγματος γονιδίων είναι γνωστή). Ανάλυση

του φάσματος των δευτερογενών μεταβολιτών στο αγρίου τύπου στέλεχος και στο

μεταλλαγμένο, προσδιορίζει την ύπαρξη κάποιου δευτερογενή μεταβολίτη (Εικόνα

32). Συνήθως, στην ανάλυση αυτή χρησιμοποιούνται τεχνικές όπως υγρή

χρωματογραφία συνδεδεμένη με ανιχνευτή μάζας (LC/MS) και υγρή χρωματογραφία

με ανιχνευτή πολλαπλών διόδων (DAD-HPLC).

Εικόνα 32. Διαγραμματική αναπαράσταση της διαδικασίας της απενεργοποίησης γονιδίου και

συγκριτική ανάλυση των φυσικών προϊόντων.

Για την καλύτερη κατανόηση της μεθόδου, παρατίθεται ένα παράδειγμα Τα

μυξοβακτήρια παράγουν πολλούς δευτερογενείς μεταβολίτες, με βιοδραστικές

43

ιδιότητες, όπως τα mixalamids (αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων). Ανάλυση (HPLC)

του υπερκείμενου καλλιέργειας τους στελέχους Stigmatella aurantiaca Sg15 (CBS38)

έδειξε, ότι το στέλεχος αυτό παράγει myxalamide (υβριδικό PKS-NRPS) (Εικόνα 33).

Οι μεταβολίτες αυτοί βιοσυντίθενται από διάφορες υβριδικές PKS-NRPSs. Στη

συνέχεια. το γονιδίωμα του βακτηρίου χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή μιας

βιβλιοθήκης κοσμιδίων. Η βιβλιοθήκη αυτή σαρώθηκε με εκφυλισμένα προϊόντα

PCR για γονίδια των PKSs ή NRPSs και απομονώθηκαν αλληλοεπικαλυπτόμενα

κοσμίδια. Ανάλυση της αλληλουχίας των γονιδιωματικών κλώνων έδειξε, ότι

κωδικοποιείται μια υβριδική PKS-NRPS. Τα περισσότερα μυξοβακτήρια είναι

δεκτικά σε γενετικές παρεμβάσεις. Έτσι, το γονίδιο που φαίνεται ότι κωδικοποιεί την

NRPS (myxA) απενεργοποιήθηκε. Σύγκριση του πρότυπου δευτερογενών

μεταβολιτών του αγρίου τύπου στελέχους (CBS38) και του μεταλλαγμένου (CBS39)

έδειξε, ότι δεν παράγεται myxalamid (Εικόνα 33).

44

Εικόνα 33. Σύγκριση του πρότυπου δευτερογενών μεταβολιτών του αγρίου τύπου στελέχους

S.aurantiaca (CBS38) και του μεταλλαγμένου (CBS39). M-A, myxalamid A; M-B, myxalamid B; M-

C, myxalamid C, M-D, myxalamid D, άγνωστο myxalamid; MS, myxochromid S; Χημική δομή των

myxalamid.

7.1.6. Συνδυασμός ετερόλογης έκφρασης και συγκριτικής ανάλυσης των

παραγόμενων φυσικών προϊόντων

Μία άλλη στρατηγική που ακολουθείται για τον προσδιορισμό του τελικού

προϊόντος, που κωδικοποιείται από σιωπηλά συμπλέγματα γονιδίων, είναι η έκφρασή

τους σε ετερόλογους ξενιστές. Σε αυτήν την προσέγγιση, το σύμπλεγμα γονιδίων που

συχνά εδράζεται σε έναν κλώνο BAC ή σε ένα κοσμίδιο, μεταφέρεται στον

ετερόλογο ξενιστή, όπου και εκφράζεται. Τα πιθανά φυσικά προϊόντα απομονώνονται

από το υπερκείμενο της καλλιέργειας ή μετά από εκχύλιση του παραγωγού ξενιστή.

Το πρότυπο της ανάλυσής τους συγκρίνεται με αυτό του ξενιστή, που δε φέρει το

επιλεγμένο BAC. Εαν το σιωπηλό μονοπάτι εκφράζεται, τότε παρατηρούνται

σημαντικές διαφορές (Εικόνα 34).

Εικόνα 34. Διαγραμματική αναπαράσταση της διαδικασίας ετερόλογης έκφρασης και συγκριτικής

ανάλυσης των παραγόμενων φυσικών προϊόντων.

7.1.7. Γονίδιο-ισοτοπική προσέγγιση

Η γονίδιο-ισοτοπική (GI) προσέγγιση (μέθοδος) σχεδιάστηκε για τον

προσδιορισμό σιωπηλών μονοπατιών, τα οποία μετέχουν στη βιοσύνθεση NRPs ή

υβριδικών NRP-PKs. Σε αυτήν την περίπτωση, πρώτα εντοπίζεται το σύμπλεγμα

γονιδίων, που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση NRPs ή υβριδικών NRP-PKs. Στη

συνέχεια, ακολουθεί σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας των συνθασών των

45

δομικών περιοχών Α, με άλλες γνωστές δομικές περιοχές Α. Η ανάλυση αυτή παρέχει

ενδείξεις, για τουλάχιστον ένα αμινοξύ, το οποίο πρόκειται να ενσωματωθεί στο

τελικό προϊόν. Το προβλεπόμενο πρόδρομο μόριο (το αμινοξυ) προστίθεται στο μέσο

καλλιέργειας του παραγωγού οργανισμού ως σημασμένο σταθερό ισότοπο και τα

φυσικά προϊόντα, που είναι σημασμένα, αναλύονται μέσω NMR. Για την καλύτερη

κατανόηση της μεθόδου, παρατίθεται ένα παράδειγμα (Εικόνα 35).

Εικόνα 35. Ανάλυση του γονιδιώματος του Pseudomonas fluorescens Pf-5 έδειξε, ότι υπάρχουν τρία

συμπλέγματα γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν για διαφορετικά σιωπηλά μονοπάτια. Ένα από τα

σιωπηλά μονοπάτια φαίνεται να κωδικοποιεί για ένα κυκλικό NRP, το οποίο φέρει ένα λιπαρό οξύ,

κυκλικό λιποπεπτίδιο (cyclic lipopeptide, CLP). Στη συνέχεια, έγινε πρόβλεψη για τη σύσταση των

αμινοξέων του CLP, με βάση τις αμινοξικές αλληλουχίες της δομικής περιοχής Α. Ο παραγωγός

οργανισμός καλλιεργήθηκε σε διαφορετικές συνθήκες και εξετάστηκε σε ποια από αυτές εκφράζεται

το ορφανό (orphan) μονοπάτι. Στη συνεχεία, ο παραγωγός οργανισμός καλλιεργήθηκε υπό επιλεγμένες

συνθήκες και στο θρεπτικό μέσο προστέθηκε ένα από τα προβλεφθέντα αμινοξέα (σημασμένο με ένα

σταθερό ισότοπο). Το υπερκείμενο της καλλιέργειας εκχυλίστηκε και ο διαχωρισμός του

πραγματοποιήθηκε με διαφορετικές μεθόδους. Τα διάφορα κλάσματα εξεταστήκαν με NMR για την

παρουσία του φυσικού προϊόντος, γεγονός που επέτρεψε την καλύτερη κλασμάτωσή του. Επιπλέον,

ανάλυση έδειξε, ότι το ολιγοπεπτίδιο ήταν κυκλικό και έφερε ένα λιπαρό οξύ. Το αντιβιοτικό

ονομάστηκε orfamides και παρουσιάζει αντιμυκητιακή δράση. Η γονίδιο-ισοτοπική (GI) προσέγγιση

συγκρίνεται με μια παλαιότερη μέθοδο, η οποία βασίζεται στην ανάπτυξη ενός πρωτόκολλου, όπου

εξετάζεται η δραστηριότητα του τελικού προϊόντος (assay-guided approach).

7.1.8. Ενεργοποίηση του σιωπηλού μονοπατιού

46

Σε ορισμένες περιπτώσεις, το σιωπηλό μεταβολικό μονοπάτι δεν εκφράζεται

κατά την καλλιέργεια του παραγωγού μικροοργανισμού, ούτε και στον ετερόλογο

ξενιστή. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός, ότι η βιοσύνθεση του δευτερογενούς

μεταβολίτη απαιτεί τη διέγερση κάποιου ειδικού σήματος. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η

καλλιέργεια υπόκειται σε διάφορες επεμβάσεις, όπως εξέταση διαφορετικών

θρεπτικών μέσων, μεταβολή του pH, έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία, ρυθμός

οξυγόνωσης. Στην περίπτωση κατά την οποία, το μονοπάτι παραμένει σιωπηλό

(δηλαδή δεν εντοπίζεται κάποιος δευτερογενής μεταβολίτης), τότε το πρόβλημα

προσεγγίζεται με γενετικές μεθόδους. Δύο προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί και

εφαρμόστηκαν για τον προσδιορισμό των προϊόντων σιωπηλών μονοπατιών στον

Aspergilus nidulans.

α. Η πρώτη προσέγγιση περιλαμβάνει την εξέταση της έκφρασης των

γονιδίων στο αγρίου τύπου παραγωγό στέλεχος και σε ένα μεταλλαγμένο στέλεχος.

Στο μεταλλαγμένο στέλεχος έχει απενεργοποιηθεί ένας ρυθμιστής του δευτερογενούς

μεταβολισμού, laeA (μια πρωτεΐνη που εδράζεται στον πυρήνα και ρυθμίζει τη

μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στο δευτερογενή μεταβολισμό). Η

υπερέκφραση του laeA έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της μεταγραφής γονιδίων,

τα οποία εμπλέκονται στο δευτερογενή μεταβολισμό. Έτσι, προσδιορίζονται τα

γονίδια, τα οποία παρουσιάζουν μεταβολές στην έκφρασή τους και πιθανά ανήκουν

σε συμπλέγματα γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν σιωπηλά μονοπάτια.

β. Η δεύτερη προσέγγιση περιλαμβάνει την έκφραση ενός πιθανού

ενεργοποιητή γονιδίων, ο οποίος εδράζεται κοντά στο σύμπλεγμα γονιδίων, που

εμπλέκεται στη βιοσύνθεση του φυσικού προϊόντος. Ανάλυση του γονιδιώματος του

A.nidulans προέβλεψε την ύπαρξη ενός συμπλέγματος γονιδίων, που κωδικοποιεί για

υβριδικές NRPS-PKSs. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε η παραγωγή κάποιου μεταβολίτη

στο υπερκείμενο καλλιεργειών, οι οποίες είχαν καλλιεργηθεί υπό διαφορετικές

συνθήκες καλλιέργειας. Διερεύνηση των ανωφερικών και κατωφερικών αλληλουχιών

του συμπλέγματος, έδειξε την παρουσία ενός γονιδίου, το οποίο κωδικοποιεί ένα

ενεργοποιητή (apdR). Το γονίδιο apdR κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα έκφρασης και

μεταφέρθηκε στον A.nidulanς. Χημική επαγωγή της καλλιέργειας των

μετασχηματισμένων κυττάρων, είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή ενός νέου φυσικού

προϊόντος, της aspyridone (Εικόνα 36).

47

Εικόνα 36. Εξέταση του υπερκείμενου καλλιέργειας του στελέχους αγρίου τύπου (WT) και αυτού που

εκφράζει το apdR (SB4.1). Πιθανή πορεία βιοσύνθεσης της aspyridone.

7.1.9. Προσεγγιση της μεταγονιδιωματικής

Η ανάπτυξη της μεταγονιδιωματικής έδωσε μια τεράστια δεξαμενή

αλληλουχιών DNA, τα οποία μπορεί να εμπλέκονται στη βιοσύνθεση φυσικών

προϊόντων. Η μεταγονιδιωματική βασίζεται στην απομόνωση DΝΑ από διαφορετικά

περιβάλλοντα (π.χ. έδαφος, νερό, αέρας, στόμαχος μυρηκαστικών και ανθρώπου) και

την κλωνοποίησή του σε φορείς, όπως είναι τα κοσμίδια η τα BAC. Ως εκ τούτου,

μικροοργανισμοί που δεν είναι δυνατόν να καλλιεργηθούν, εκπροσωπούνται στους

κλώνους της βιβλιοθήκης. Η αξιοποίηση αυτών των κλώνων βρίσκεται σε ανάπτυξη,

με αξιόλογες προοπτικές στην αναγνώριση νέων φυσικών προϊόντων (Εικόνα 30).

8. Ετερόλογη έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για μονοπάτια βιοσύνθεσης

φυσικών προϊόντων

Η ετερόλογη έκφραση γονιδίων, που κωδικοποιούν για ένζυμα, τα οποία

εμπλέκονται στα μονοπάτια βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων, επέτρεψε τόσο την

υπερπαραγωγή τους όσο και τη σύνθεση αναλόγων των προϊόντων, μέσω της

Συνδυαστικής Βιοσύνθεσης. Επίσης, η ετερόλογη έκφραση σιωπηλών βιοσυνθετικών

μονοπατιών σε ξενιστές (παρένθετους) μικροοργανισμούς παρείχε δυνατότητες

βιοσύνθεσης νέων (ανθρωπογενών) φυσικών προϊόντων, με πιθανές βιοδραστικές

ιδιότητες.

48

8.1. Γενικά θέματα που αφορούν στην ετερόλογη έκφραση των μονοπατιών

βιοσύνθεσης των πολυκετιδίων

Οι προσεγγίσεις που ακολουθούνται στην ετερόλογη έκφραση μεταβολικών

μονοπατιών βιοσύνθεσης δευτερογενών μεταβολιτών ποικίλουν - από την απευθείας

μεταφορά μικρών συμπλεγμάτων γονιδίων σε παρένθετους μικροοργανισμούς,

γενετικά παρόμοιους με τους παραγωγούς οργανισμούς έως τη μεταφορά

τροποποιημένων μεγάλων μεταβολικών μονοπατιών, σε παρένθετους

μικροοργανισμούς, γενετικά ανόμοιους με τους παραγωγούς οργανισμούς. Ωστόσο, η

ανασύσταση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων, σε

παρένθετους μικροοργανισμούς προϋποθέτει, ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν για τα

ένζυμα, που εμπλέκονται στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων, πρέπει

να εκφράζονται και οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες να αναδιπλώνονται, έτσι ώστε να

προκύπτουν λειτουργικά ένζυμα. Μερικοί από τους παράγοντες, που επηρεάζουν την

επιτυχή ετερόλογη έκφραση των πολυκετιδίων, αναφέρονται παρακάτω:

1. Ο παρένθετος μικροοργανισμός (ξενιστής) πρέπει να καλλιεργείται εύκολα στο

εργαστήριο και να έχουν αναπτυχθεί, για αυτόν το μικροοργανισμό, τα

κατάλληλα γενετικά εργαλεία, που να επιτρέπουν τις γενετικές παρεμβάσεις.

2. Η χρήση κωδικονίων είναι συνήθως σημαντικός παράγοντας για την απόδοση της

έκφρασης σε παρένθετο μικροοργανισμό. Συνήθως το DNA των

μικροοργανισμών, που παράγουν πολυκετίδια, παρουσιάζει υψηλή

περιεκτικότητα σε περιεχόμενο GC. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό το GC

περιεχόμενο του παρένθετου οργανισμού να είναι παρόμοιο με το GC

περιεχόμενο του ξένου γονιδίου.

3. Η λειτουργικότητα των ρυθμιστικών στοιχείων και η δομή των προαγωγέων

καθώς και η σταθερότητα του mRNA, λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή του

παρένθετου μικροοργανισμού.

4. Τα γονίδια, που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των πολυκετιδίων, έχουν μεγάλο

μέγεθος. Ως εκ τούτου, οι γενετικές τροποποιήσεις στα γονίδια αλλά και η

μεταφορά τους στον παρένθετο μικροοργανισμό, προϋποθέτουν νέες

προσεγγίσεις.

5. Ο παρένθετος μικροοργανισμός πρέπει να έχει τους μηχανισμούς τροποποίησης

των παραγόμενων πολυπεπτιδίων, όπως για παράδειγμα των PKSs και των

NRPSs.

49

6. Πρέπει να λαμβάνεται υπόψη, η δυνατότητα του παρένθετου οργανισμού σε ότι

αφορά την παραγωγή κατάλληλων πρόδρομων ενώσεων (π.χ. μη-πρωτεϊνογενή

αμινοξέα ή CoA-ενεργοποιημένα καρβοξυλικα οξέα με μικρού μήκους ανθρακική

αλυσίδα), που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων όπως τα

πολυκετίδια ή πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων.

7. Στην περίπτωση που το παραγόμενο επιθυμητό προϊόν έχει αντιμικροβιακη δράση

ή είναι τοξικό για τον παρένθετο μικροοργανισμό, τότε παράλληλα με τη

μεταφορά του μεταβολικού μονοπατιού, είναι αναγκαίο να μεταφερθεί και να

εκφραστεί στον παρένθετο μικροοργανισμό, το κατάλληλο γονίδιο

ανθεκτικότητας. Εναλλακτικά, η έκφραση των ξένων γονιδίων μπορεί να

υπόκεινται σε έλεγχο, μέσω ενός επαγόμενου προαγωγέα, ο οποίος μπορεί να

διεγείρεται, όταν ο παρένθετος μικροοργανισμός βρίσκεται στη φάση

στασιμότητας.

8.2. Απευθείας μεταφορά του αποσυνθετικού συμπλέγματος γονιδίων, που

κωδικοποιούν για πολυκετίδια, σε γενετικά παρόμοιο παρένθετο μικροοργανισμό

Το γονιδίωμα των ακτινοβακτηρίων έχει υψηλό περιεχόμενο σε GC και

στελέχη τους αποτελούν τους καλύτερους παραγωγούς δευτερογενών μεταβολιτών,

με σημαντικές βιοδραστικές ιδιότητες. Διαφορά μέλη αυτής της ομάδας βακτηριών,

Streptomyces, αποτελούν τους καλύτερους παραγωγούς φυσικών προϊόντων, όπως

είναι οι τα πολυκετίδια. Επίσης, έχουν αναπτυχθεί γενετικά εργαλεία, για αυτούς τους

μικροοργανισμούς. Τα χαρακτηριστικά αυτά κατέστησαν τους Streptomyces από πιο

καταλλήλους οργανισμούς για την ετερόλογη έκφραση μεταβολικών μονοπατιών

βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων, με χαρακτηριστικούς αντιπρόσωπους τους

S.lividans και S.coelicolor.

8.3. Ετερόλογη έκφραση, σε γενετικά παρόμοιους παρένθετους οργανισμούς,

μεταβολικών μονοπατιών, τα οποία κωδικοποιούνται από συμπλέγματα

γονίδιων, που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA

Έχουν απομονωθεί, από διάφορα οικοσυστήματα, στελέχη Streptomyces, τα

οποία παράγουν πολυκετίδια με βιολογική δράση αλλά τα επίπεδα παραγωγής τους

είναι πολύ χαμηλά. Ανάλυση των γονιδίων, που κωδικοποιούν τα ένζυμα

βιοσύνθεσης αυτών των πολυκετιδίων έδειξε, ότι ολόκληρο το μεταβολικό μονοπάτι

50

εδράζεται σε ένα τμήμα DNA 30-35kb και ως εκ τούτου, μπορεί να κλωνοποιηθεί σε

ένα φορέα, όπως είναι τα κοσμίδια. Συνήθως, σε αυτές τις περιπτώσεις, ο φορέας

(integrative or replicative E.coli- Streptomyces shuttle vectors) περιέχει τα κατάλληλα

γενετικά στοιχεία, που επιτρέπουν τη μεταφορά του (π.χ. oriT) και την ενσωμάτωσή

του (phage attachment site) στο γονιδίωμα του παρένθετου μικροοργανισμού (π.χ. S.

lividans ή S.coelicolor). Η ετερόλογη έκφραση επιτυγχάνεται με τη χρήση του

προαγωγέα και των ρυθμιστικών στοιχείων, που προέρχονται από τον παραγωγό

οργανισμό. Για παράδειγμα, η griseorhodin A είναι ένα πολυκετίδιο, που

απομονώθηκε από το θαλάσσιο Streptomyces sp. JP95. Η griseorhodin Α αποτελεί

αναστολέα της δράσης της ανθρώπινης τελομεράσης και της ανάστροφης

μεταγραφάσης των ρετροϊών. Τα γονίδια, που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της

griseorhodin A, καλύπτουν 34.2kb του γονιδιώματος του παραγωγού

μικροοργανισμού. Η ετερόλογη έκφραση αυτών των γονιδίων στον S.lividans έχει ως

αποτέλεσμα τη βελτίωση της griseorhodin A (Εικόνα 37)

Εικονα 37. PC-ESI-MS ανάλυση εκχυλισμάτων του αγρίου τύπου στελέχους Streptomyces sp. JP95,

που βιοσυνθέτει griseorhodin Α και του S.lividans ZX1 (pMP31a). Ο φορέας pMP31a φέρει ολόκληρο

το σύμπλεγμα γονίδιων, που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση της clyseorhodin Α.

Στην περίπτωση που τα μεταβολικά μονοπάτια κωδικοποιούνται από

μεγαλύτερα τμήματα DNA (π.χ. το σύμπλεγμα γονίδιων που απαιτείται για τη

βιοσύνθεση της daptomycin, στον Streptomyces roseosporus, έχει μέγεθος περίπου

128kb), τότε ολόκληρο το τμήμα DNA κλωνοποιείται σε ένα φορέα, όπως είναι το

BAC (τεχνητό βακτηριακό χρωμόσωμα). Για παράδειγμα, η μεταφορά ολόκληρου

του συμπλέγματος γονίδιων που απαιτείται για τη βιοσύνθεση της daptomycin (NRP,

το όποιο φέρει λιπίδιο), στο S.lividans είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή 18mg/lt του

51

λιποπεπτιδίου. Εναλλακτικά, μπορεί να επιτευχθεί η ετερόλογη έκφραση ενός

μεταβολικού μονοπατιού μεσω της συν-έκφρασης δυο κοσμιδίων. Σε αυτήν την

περίπτωση, το ένα κοσμίδιο φέρει όλα τα βιοσυνθετικά γονίδια και το άλλο φέρει όλα

τα απαιτούμενα ρυθμιστικά στοιχεία.

8.4. Ετερόλογη έκφραση σε γενετικά ανόμοιους, παρένθετους οργανισμούς,

μεταβολικών μονοπατιών, τα οποία κωδικοποιούνται από συμπλέγματα

γονίδιων, που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA

Η πραγματοποίηση της ετερόλογης έκφρασης κλωνοποιημένων

συμπλεγμάτων γονίδιων, σε γενετικά ανόμοιους, παρένθετους οργανισμούς, όπως το

E.coli, είναι εφικτή. Για παράδειγμα, η yersiniabactin είναι ένα σιδεροφόρο

(PKS/NRPS), το οποίο βιοσυντίθεται από το βακτήριο Yersinia pestis, που προκαλεί

τη βουβωνική πανώλη) (Εικόνα 38). Τμήματα του γονιδιακού συμπλέγματος

κλωνοποιήθηκαν σε δύο κοσμίδια. Ωστόσο, για την επιτυχή έκφραση των γονίδιων

στο E.coli, απαιτούνται τεχνητοί προαγωγείς και για την επιτυχή παράγωγη του

φυσικού προϊόντος ήταν απαραίτητη η προσθήκη σαλικυλικού διότι το E.coli δε

βιοσυνθέτει σαλικυλικό.

Εικόνα 38. Οργάνωση της συνθετασης της Ybt και μεταβολίτες που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση

της Ybt στο E.coli.

52

8.5. Η ετερόλογη έκφραση, σε συνδυασμό με τη συνδυαστική βιοσύνθεση,

αποτελεί τη βάση για βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων

Η μεταλλαξιογένεση μεταβολικών μονοπατιών, μέσω επεμβάσεων στο

γένωμα των παραγωγών οργανισμών, είναι τεχνικά δύσκολη και σε πολλές

περιπτώσεις ανέφικτη. Ως εκ τούτου, η in-vivo σύνθεση νέων φυσικών προϊόντων,

μέσω ΣΒ, αποτελεί βασική στρατηγική για τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων, με

διευρυμένες ή νέες βιολογικές δράσεις. Για την καλύτερη κατανόηση του θέματος, θα

δοθούν μερικά παραδείγματα.

8.5.1. Συν-έκφραση ενός ή περισσότερων γονίδιων

Η mithramycin, landomycin και urdamycin είναι μία ομάδα

γλυκοζυλιωμένων, αρωματικών πολυκετιδίων, με αντικαρκινική δράση, τα οποία

φέρουν διαφορετικές γλυκοζύλο-ομαδες. Η προσθήκη της γλυκοζύλο-ομάδας στον

πολυκετιδικό σκελετό καταλύεται από τις γλυκοζύλ-τρανφεράσες. Ο Streptomyces

argillaceus παράγει μόνο mithramycin ενώ άλλα στελέχη στρεπτοβακτηρίων

παράγουν είτε landomycin είτε urdamycin. Τα γονίδια, που εμπλέκονται στη

βιοσύνθεση των παραπάνω πολυκετιδίων, έχουν χαρακτηριστεί. Το ερώτημα που

τίθεται είναι το εάν μπορούμε να παράγουμε υβριδικά πολυκετιδια, τα οποία να

περιέχουν διαφορετική γλυκοζύλο-ομάδα. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις

γλυκοζύλ-μεταφοράσες έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί. Στη βιοσύνθεση της

mithramycin, landomycin και urdamycin μετέχουν τα γονιδιακά συμπλέγματα

γλυκοζύλ-μεταφορασών MtmGIV, urdGT2 και lanGT4. Τα γονίδια urdGT2 και

lanGT4 κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα έκφρασης και στη συνέχεια

μεταφέρθηκαν σε ένα μεταλλαγμένο στέλεχος του S.argillaceus (έχει

απενεργοποιηθεί το MtmGIV), το όποιο βιοσυνθέτει μόνο τον πολυκετιδικό σκελετό

της mithramycin, την premithramycinone. Η συνδυασμένη έκφραση του urdGT2 και

του lanGT4 είχε ως αποτέλεσμα,τη βιοσύνθεση ενός υβριδικού μορίου (Εικόνα 39).

53

Εικόνα 39. Η συν-έκφραση των γλυκοζυλομεταγορασών urdGT2 και lanGT4 στον Streptomyces

argillaceus mutant έχει ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση ενός νέου γλυκοζυλιωμένου πολυκετιδίου.

8.5.2. Πολλαπλό σύστημα πλασμιδίων για τη συν-έκφραση στο E.coli

Η βιοσύνθεση πολύπλοκων βιβλιοθηκών ή νέων φυσικών προϊόντων

προϋποθέτει τη δυνατότητα συν-έκφρασης, σε ένα παρένθετο οργανισμό, γονίδιων,

τα οποία είναι τμήματα μεταβολικών μονοπατιών διαφορετικών οργανισμών. Η

προσέγγιση αυτή πραγματοποιείται μέσω της κλωνοποίησης, σε 3-4 συμβατά

πλασμίδια, ενός ή δύο γονίδιων. Με αυτόν τον τρόπο, αποφεύγεται η κατασκευή ενός

τμήματος DNA, το όποιο να φέρει όλα τα διαφορετικά γονίδια.

8.5.3. Κλωνοποίηση και τροποποίηση των γονίδιων, των μεταβολικών

μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων, με τη χρήση της τεχνικής της

κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού

Η εφαρμογή αυτής προσέγγισης πραγματοποιήθηκε με την ετερόλογη

έκφραση του μονοπατιού βιοσύνθεσης της myxochromide S στο Pseudomonas

putida. Η myxochromide S, είναι ένα κυκλικό πεπτίδιο, συνδεδεμένο με ένα

πολυκετίδιο και βιοσυντίθεται από το μυξοβακτήριο Stigmatella aurantiaca. Ο

παρένθετος ξενιστής έχει παρόμοια προσόντα με αυτά του E.coli και επιπλέον

διαθέτει γονιδίωμα με υψηλό περιεχόμενο σε GC και προτίμηση για τα σωστά

κωδικόνια Επίσης, το βακτήριο διαθέτει μια μεταφοράση της φωσφοαντοθεεΐνης

(Ppant), η οποία δέχεται ένα ευρύ φάσμα υποστρωμάτων. Ο παραγωγός

μικροοργανισμός αποδίδει 8mg/lt myxochromide S ενώ η απόδοση του

ανασυνδυασμένου Pseudomonas putida πλησιάζει τα 32mg/lt. Η στρατηγική που

εφαρμόζεται, για την κλωνοποίηση και την ετερόλογη έκφραση συμπλεγμάτων

54

γονίδιων, τα οποία απαιτούνται για τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων,

αναπαριστάται σχηματικά στην εικόνα 40.

Εικόνα 40. Σχηματική αναπαράσταση της στρατηγικής, που εφαρμόζεται για την ετερόλογη έκφραση

μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων, με τη χρήση της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού.

Το γενωματικό DNA (genomic DNA) του παραγωγού οργανισμού, χρησιμοποιήθηκε για την

κατασκευή μιας βιβλιοθήκης γονίδιων, σε κοσμιδιακό φορέα. Το κατάλληλο κοσμίδιο μεταφέρεται

στο E.coli, όπου μέσω Red/ET recombineering υφίσταται την οποιαδήποτε επιθυμητή τροποποίηση

και στη συνέχεια, μεταφέρεται στον κατάλληλο ξενιστή. Η έκφραση των γονίδιων οδηγεί στη

βιοσύνθεση των φυσικών προϊόντων, των οποίων η χημική δομή αναλύεται, μέσω πολλαπλών

αναλυτικών μεθόδων.