Réponses aux questions de Biophysique I et II.

Question n° 1.1 :Poly-L-leucine in an organic solvent such as dioxane is α-helical whereas poly-Lisoleucine is not. Why do these amino acids with the same number and links of atoms have different helix-forming tendecies?

The methyl group attached to the β-carbon atom of isoleucine sterically interferes with α-helix formation. In leucine, this methyl group is attached to the χ-carbon atom, which is farther from the main chain and hence does not interfere.

Question n° 1.2 :Why do the amino acids proline and glycine have in proteins helix-breaking properties and often occur in -turn structures?

La praline et la glycine appartiennent avec la cystéine au groupe des acides aminés spéciaux.La proline possède une chaîne latérale aliphatique, mais diffère des autres 20 acides aminés par le fait que sa chaîne latérale est liée à la fois à l'atome d'azote et à l'atome de carbone alpha. Sa structure cyclique la rend donc plus limitée du point de vue conformationnel que les autres aminoacides. Les liaisons X-Pro n'ont par exemple plus de préférences marquées pour une liaison peptidique trans ou cis, alors que les autres liaisons préfèrent la forme trans. Ceci est dû à l'encombrement stérique de la partie cyclique.La glycine est quant à elle le seul acide aminé achiral.Leur récurrence dans les coudes peut se comprendre par le fait que la proline manque d'un groupe NH et que sa structure cyclique limite les valeurs de l'angle phi. Pour la glycine, elle peut s'insérer dans toutes les structures. Sa présence ne favorise donc pas la formation d'une hélice, ce qui n'est pas le cas de beaucoup d'autres acides aminés qui seront plus présents (puisque favorisant la structure) dans l'hélice.

Question n° 1.3 :Describe major chemical and structural properties of a peptide bond and the consequences for regular protein strcure formatoin.

La liaison peptide est planaire. Si deux acides aminés sont liés par une liaison peptide, 6 atomes sont dans un même plan : le Cα, le CO (1er acide aminé), le NH et le Cα du 2ème acide aminé. La liaison peptide possède en plus un caractère de liaison double fort, ce qui empêche la rotation autour de cette liaison. Cette inaptitude à tourner va exercer des contraintes sur la conformation du peptide, expliquer son caractère planaire, et donner une distance bien spécifique aux liaisons.

Finalement, la liaison peptidique n’est pas chargée, ce qui permet aux peptides de former des structures globulaires compactes.Presque toutes les liaisons peptides sont en configuration trans, car la configuration cis provoque des encombrements stériques. La liaison entre le groupe amine et le Cα et la liaison entre le Cα et le groupe carbonyle sont libres de tourner, ce qui va permettre à la protéine de se plier de nombreuses manières. Ces rotations sont déterminées par les angles phi et psi. La rigidité de la liaison peptidique alliée aux angles phi et psi permis limitent le nombre de structures accessibles.

La chaîne polypeptidique peut se plier en plusieurs structures régulières : hélice α, feuillet β. Deux autres structures secondaires existent : β turn et Ω loop.Le diagramme de Ramachandrean indique deux sortes d’hélices α : les hélices α droites (sens des aiguilles d’une montre) et les hélices α gauches (sens contraire aux aiguilles d’une montre). Néanmoins, les hélices α droites sont énergétiquement plus favorables à cause du nombre moins important d’encombrement stérique entre les chaînes latérales et le squelette de la protéine. Pratiquement toutes les hélices α des protéines sont droites.Les feuillets β sont plus diversifiés que les hélices α.Les loops ne possèdent pas une structure régulière, périodique, elles sont souvent rigides et bien définies

Question n° 1.4 :Identify the groups in a protein that can form hydrogen bonds with an arginine side chain at pH 7.

Le groupe carboxylate de l’aspartate et du glutamate forment des liaisons hydrogènes avec le groupe guanidinium (NH2-C-NH2). En plus, ce groupe guanidinium peut jouer le rôle de donneur dans la liaison hydrogène avec le groupe carboxylique de la glutamine et de l’asparagine, le groupe carboxylate de l’aspartate et du glutamate, l’alcool de la sérine et de la thréonine ainsi qu’avec le groupe carbonyle de la chaine principale.

Question n° 1.5 :On ne peut pas determiner les concentrations mais les rapports entre les concentrations :En utilisant l’équation de Hasselbach:

7 = 3 + log([AH]/[AH2+])

7 = 8 + log([A-]/[AH])

7 = ½(11 + log([A-]/[AH2+])

([AH]/[AH2+]) = 104 ([A-]/[AH]) = 0.1 ([A-]/[AH2

+]) = 103

Voir la question similaire dans la série 1 d’exos.

Question n° 1.6 :J’ai utilisé le spectre en ref 3 page 395.

tryptophane : = 5700 M-1cm-1

tyrosine : = 1500

La concentration du protein corespond à une sixième de la concentration du tyrosine et à un tiers de la concentrarion du tryptophane.

Il faut appliquer la loi du Lambert Beer :A=bcA=0,15

L’absorbance mesuré est due à labsorbance du tyrosine plus l’absorbance du tryptophane :

A=b(trctr+tyrctyr)

ctyr=6C (C=concentration d protéine)

ctr=3C

A=bC(3tr+6tyr)

C=5,747*10-6 mol/l

si le protein a une masse de 100kDa

on peut exprimer cette concentration comme : 5,747mg/ml

Question n° 1.7 :Describe major energetic contributions for protein folding into regular structures.

Hydrogen bonding:Hydrogen bonds are formed between hydrogen donors and hydrogen acceptors.

Electrostatic interaction:Electrostatic interaction between ions of opposite charge (Coulomb’s law):

Van der Waals:Van der Waals interactions are caused by transient dipoles.Balance between attractive and repulsive forces:Attraction: Short lived fluctuations in electron distribution in one atom generate

temporary dipoles which in turn induces temporary dipoles in neighboring atom (dipole – induced dipole attraction).

Repulsion: At shorter distances repulsive forces act which arise mainly from repulsion of electrons and to lesser extent from nuclear repulsion.

The balance between attraction and repulsion is treated as a single van der Waals potential (Lennard-Jones potential):

A and B are constants that describe the magnitude of interactions.

Hydrophobic Effect:The hydrophobic effect causes nonpolar molecules to adhere to one another (for more details, see question 1.8)

Question n° 1.8 :a) Explain the hydrophobic effect.

Les molécules en solution aqueuse interagissent avec les molécules d’eau au moyen d’interactions ioniques et de liaisons H. Les molécules non polaires ne peuvent cependant pas participer à ces interactions. Les interactions entre les molécules non polaires et les molécules d’eau ne sont pas aussi favorables que les interactions entre les molécules d’eau elles-mêmes. Les molécules d’eau en contact avec ces surfaces non polaires forment des cages autour de ces molécules non, le système devient ainsi plus ordonné que pour des molécules d’eau libres en solution. Ceci a pour effet de faire diminuer l’entropie. Lorsque deux molécules non polaires se rencontrent, quelques molécules d’eau sont relâchées et elles peuvent interagir librement avec d’autres molécules d’eau. Les molécules non polaires ont tendance à s’agréger dans l’eau car l’entropie de l’eau est augmentée lorsque les molécules d’eau sont relâchées. C’est ce phénomène que l’on appelle effet hydrophobe.

B) Explain in this context the so-called hydropythy index, how this index is established, and how it can be used for predicting protein folding into regular structures.

La plupart des protéines sont amphipathiques c’est-à-dire qu’elles contiennent aussi bien des acides aminés hydrophiles que hydrophobes. Les aa hydrophobes ont tendance à éviter l’eau en résidant à l’intérieur de protéines globulaires ou membranaires. Les résidus hydrophiles préfèrent rester hydratés. Cette partition des aa entre un environnement aqueux et non aqueux conduit à l’effet hydrophobe qui actionne le pliage des protéines. Pour quantifier la contribution de chaque aa à l’effet hydrophobe (l’hydropathie d’un acide aminé), il est possible de mesurer la partition de molécules entre l’eau et un solvant organique. Pour cette mesure, un aa est placé dans un système contenant deux solvants avec les phases organiques et aqueuses séparées. L’hydropathie de l’aa est représentée par le coefficient de partage P, qui est mesuré comme la fraction de molécules dans la phase aqueuse χaq par rapport à la fraction dans la phase organique χnonaq à l’équilibre :

P = χaq / χnonaq

P pour chaque aa reflète l’hydropathie de chaque type d’acide aminé (cf table 1.6 de référence 3). On constate que les aa ayant des chaînes latérales non polaires ont une hydropathie positive et les aa avec des chaînes latérales polaires ou chargées ont une hydropathie négative.

Pas complet…c) Explain the differences of protein folding between water-soluble and membrane proteins.

Dans un environnement aqueux, le pliage d’une protéine est actionné par la forte tendance qu’ont les résidus hydrophobes à être exclus de l’eau. Un système est thermodynamiquement plus stable lorsque les groupes hydrophobes sont enfermés au lieu d’être étendus dans l’environnement aqueux. La chaîne polypeptidique se plie de façon à ce que les chaînes latérales hydrophobes soient cachées et les chaînes polaires ou chargées soient à la surface.

Les protéines se trouvant dans les membranes ont une distribution différente des aa hydrophiles et hydrophobes. Le centre de la protéine contient des aa chargés et polaires qui entoure un canal rempli d’eau traversant la protéine. L’extérieur est quant à lui composé de résidus hydrophobes qui interagissent avec les chaînes alcanes avoisinantes des phospholipides.

d) What are the major structural determinants for regular structures in the bilayer spanning segments of membrane proteins ?? Je n’ai pas compris la question…

Question n° 2.1 :What is the largest possible value for the diffusion coefficient that a molecule of M = 50000 dalton can have at 20 oC (viscosity = 0.01 poise, partial molar volume = 0.73 mL/g)

On peut considérer une particule sphérique et utiliser dans ce cas l’équation de Stokes-Einstein :

Sachant que le volume d’une sphère vaut :

On a :

Avec : k = 1.38·10-23 m2 kg s-2 K-1

T = 20°C = 293.15 Kη = 0.01 poise = 0.001 kg m-1 s-1

Calcul du volume:

M = 50000 Da · 1.66·10-27 kg Da-1 = 8.3·10-23 kgν = 0.73 mL g-1 =0.73·10-3 m3 kg-1

D = 8.8·10-11 m2 s-1

Question n° 2.2 :Centrifugation experiment: The data in the table below describe the variation of the sedimentation coefficient s, and the diffusion coefficient D for a protein as a function of pH. Explain what happens to the protein at low and high pH, assuming that it is in its native state between pH 5-7.

pH s x 1013 [sec] D x 107 [cm2/sec] s/D x 106 [sec2/cm2]

2 2.93 7.91 0.373 3.02 8.00 0.384 3.89 8.00 0.495 4.41 5.90 0.756 4.40 5.92 0.747 4.15 5.61 0.748 3.60 4.86 0.749 2.25 3.08 0.73

10 2.20 2.97 0.74

(1) (2)

Le coefficient de sédimentation ne peut pas, à lui tout seul, fournir une valeur précise sur le poids moléculaire. Ceci à cause de la présence dans l’équation (1) du coefficient de friction, qui dépend de la taille, de la forme et de l’hydratation de la molécule. Néanmoins il est possible d’éliminer f en utilisant le coefficient de diffusion. Si on divise l’équation (1) par la (2) on obtient :

A pH élevé, à la fois s et D diminuent mais leur rapport reste constant, indiquant que m est inchangé. Ceci doit refléter un changement de conformation dans laquelle la protéine adopte une conformation plus étendue.

A pH bas, le rapport s/D montre qu’un type de dissociation a eu lieu. Probablement en deux sous unités, puisque le rapport s/D diminue de moitié.

Question n° 2.3 :a) A protein with partial molar volume of 0.72 Ml/g is studied by sucrose density gradient centrifugation at 5 [°C]. If the gradient runs from 10 to 30% sucrose, by what percent will the sedimentation coefficient decrease as the protein proceeds from the meniscus to the bottom of the tube? The following data for sucrose solution at 5 [°C] are required:

% sucrose density [g/mL]

10 1.040630 1.1315

viscosity η [centipoise]

2.0734.422

b) If the meniscus is 8 cm and the bottom of the tube is 16 cm from the center of rotation, by what percentage will the velocity of sedimentation change in traversing the tube?

A) Le coefficient de sédimentation, noté s et exprimé en secondes ou en Svedberg (1 [S] = 10 -13 [s]), est défini comme :

Avec :M : masse molaire

 : volume spécifique partielρ : masse volumique (en anglais : density)Na : nombre d’Avogadrof : coefficient de friction

Au niveau du ménisque la concentration en sucrose est de 10 % et selon les données se trouvant sur le tableau et de l’énoncé on trouve que :

De la même manière au fond du tube ou la concentration en sucrose est passé à 30% on a :

Ainsi on trouve qu’en passant du ménisque au fond du tube le coefficient de sédimentation diminue de :

b) Le coefficient de sédimentation peut également être défini par :

Avec :v : vitesse de sédimentationω : vitesse angulaire de rotationr : distance du centre de rotation

Ainsi au niveau du ménisque on trouve que :

De même au fond du tube on a :

Soit :

Ainsi en traversant le tube du ménisque vers le fond du tube la vitesse de sédimentation change de 70%.

Question n° 2.4 :Le β-mercaptoéthanol permet de réduire les liaisons disulfures. Or nous avons un doublet de protéines à 10cm et 10.6cm, qui est remplacé par des bandes à 10 et 5.6cm en absence de β-mercaptoéthanol. On peut donc supposer que la bande à 10cm, qui reste intacte avec ou sans β-mercaptoéthanol, correspond à un fragment de protéine qui n’est pas lié à une autre chaîne par un pont disulfure. Au contraire, la bande à 5.6cm devient une bande à 10.6cm lorsque les ponts -S-S- sont réduits en –SH HS- ; on peut donc supposer que nous avons deux chaînes polypeptidiques identiques liées par un pont -S-S-. Ces deux chaînes migrent peu lorsqu’elles sont liées car nous avons un gros fragment (bande de 5.6cm), mais dès que le pont est réduit, la masse du fragment est divisée par 2 et les deux chaînes migrent plus loin (10.6cm). Enfin, on ne peut pas donner, à partir des migrations uniquement, les proportions des deux types de chaînes car les intensités des bandes ne sont pas précisées.

Avec les données de l’énoncé, on peut tracer sur un graphique la distance parcourue en fonction du logarithme de la masse. En linéarisant la courbe, on obtient une droite d’équation y = -14.369*x + 71.068. On peut alors trouver la masse correspondant aux distances 5.6, 10 et 10.6cm (cf. tableau ci-dessous).

M [g/mol] log(M) d [cm]

94000 4.97312785 0.567000 4.8260748 1.143000 4.63346846 3.930000 4.47712125 6.620100 4.30319606 9.314400 4.15836249 11.7

     35975 4.556 5.617783 4.25 1016144 4.208 10.6

On peut

vérifier notre hypothèse concernant les bandes à 5.6 et 10.6cm :-on a 2*16144=32388, alors que normalement la bande à 5.6 donne m=35975 g/mol...-par contre 2*17783=35566 ce qui correspond mieux à la bande à 5.6cm ! Ceci est surprenant puisque la bande à 10cm ne change pas en absence et en présence de β-mercaptoéthanol, et ne peut pas contenir 2 fragments qui vont se séparer... 

On peut tout de même conclure que la protéine se compose des types de chaînes suivants: (les valeurs ne sont en effet qu’approximatives !)-un de 17783 g/mol-deux identiques de 16144 g/mol, liés par un pont S-S.

Cependant, il peut y avoir plus que 3 sous-unités dans la protéine.

Grâce aux données de l’énoncé, nous pouvons calculer la masse molaire de la protéine native, sans dénaturation, et sans séparation des chaînes (en effet, le SDS dénature les protéines et séparent toutes les sous-unités non liées par des ponts disulfures). Les données de l’énoncé ont été prises dans l’eau et correspondent à la protéine « entière », avec toutes ses sous-unités.

On peut tout d’abord calculer le rayon de la protéine « invertebrate hemoglobin » formée de plusieurs sous-unités :

le coefficient de diffusion est donné par si on fait l’approximation d’une protéine globulaire

sphérique. Avec D=6.10-11 m2/s, k=1.38 10-23 J/K, T=293K, et η=0.01poise = 10-3 kg/(m.s), on trouve r=3.58 10-9 m.On a alors le volume de la protéine, avec V=4/3 . π . r3 soit V=1.92 10-25 m3.On a aussi la densité ρ=1/ν soit avec le volume molaire partiel ν=7.3 10-4 m3/kg , on trouve ρ=1369 kg/m3.On peut ainsi calculer la masse molaire de la protéine : M= ρ.V.Navogadro et on trouve M=158000 g/mol.

y = -14.369x + 71.068R2 = 0.9832

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

4 4.5 5 5.5

log(M)

d [c

m]

Distanceparcourue enfonction dulogarithme de lamasseLinéaire (Distanceparcourue enfonction dulogarithme de lamasse)

Avec les données trouvées à partir des distances sur le gel, on voit clairement que la protéine se compose de plusieurs sous-unités (9.3 sous unités si on considère la masse moyenne d’un fragment : 16964 [=(17783+16144)/2]). Par tâtonnement, on peut supposer qu’il y a 7 sous-unités de 17783g/mol et deux de 16144g/mol. On trouve en effet une somme de 156769g/mol.On obtient un meilleur résultat pour 8 sous-unités à 17783 et 1 à 16144 (on trouve 158408), mais ceci est en contradiction avec les données du SDS-PAGE ci-dessus.

En conclusion nous avons donc un oligomère avec probablement 7 sous-unités de 17783g/mol, et 2 de 16144, ces deux dernières étant liées par un pont disulfure.

Remarque : la donnée s=4.4 10-13s  n’est pas utilisée !!!

Question n° 2.5 :

SDS-PAGE electrophoresis

Une molécule chargée va se déplacer dans un champ électrique avec une vitesse dépendant de la force E du champ, de sa charge net z et du coefficient de friction f selon l’équation suivante :

La force électrique Ez qui conduit la molécule chargée vers l’électrode de charge opposée est opposée à la force de friction fv. Pour une sphère de rayon r, le coefficient de friction est donné par :

où η est la viscosité du milieu.En électrophorèse, on utilise des supports en gel afin de séparer les molécules chargées selon leur taille. Les molécules petites par rapport à la taille des pores du gel vont se déplacer facilement à travers le gel alors que les molécules plus grosses que les pores vont avancer beaucoup plus difficilement. Les molécules de tailles intermédiaires se déplacent avec des degrés de facilités variés.Les gels PAGE (polyacrylamide gels) sont formés facilement par polymérisation de l’acrylamide et du methylènebisacrylamide et sont chimiquement inertes.

Le mélange de protéine à séparer est dissous dans une solution de SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate), qui détruit tout les interactions non-covalente native, puis on ajoute du mercaptoethanol pour reduite les liaisons disulfides. Les anions de SDS se lie alors à la chaine principale de la protéine (1 SDS pour 2 résidus) afin de former un complexe SDS - protéine dénaturée portant une charge négative largement plus

forte que la charge de la protéine native. Cette nouvelle charge dépend alors aussi de la taille de la protéine suivant le nombre d’anions SDS portés par celle-ci.

Anions SDS :

En effectuant alors maintenant l’électrophorèse, on sépare les protéines suivant leur taille.

Isoelectric Focusing

Les protéines peuvent aussi être séparée par électrophorèse par rapport à la quantité de résidus acide et basique qu’elles contiennent. Le point isoélectrique pI d’une protéine est le pH à auquel sa charge net z est zéro. A ce pH, sa mobilité électrophorétique est aussi zéro (équation ci-dessus). Pour séparer un mélange de protéines avec des pI différents, on fait une électrophorèse sur un gel avec gradient de pH (pas SDS le gel !) : Chaque protéine va se déplacer dans le champ jusqu’à la position ou le pH du gel est égal à son pI ou elle restera immobile.Cette méthode suivant laquelle on sépare les protéines suivant leur pI est appelée focalisation isoélectrique. (Résolution : 0,01 pI)

Two-dimensional Electrophoresis

La focalisation isoélectrique peut être combinée ave SDS – PAGE pour obtenir une séparation à forte résolution. On effectue tout d’abord sur l’échantillon une focalisation isoélectrique sur une dimension pour séparer les protéines suivant leur pI. On place alors le gel au somment d’un support SDS - PAGE et on sépare alors les protéines qui ont le même pI suivant leur taille dans une deuxième dimension perpendiculaire à la première.

MALDI-TOF, 2D electrophoresis

La méthode MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation) permet de déterminer précisément la masse d’une protéine par spectrométrie de masse en dispersant un mélange de protéines ionisées en phase gazeuse.

Une matrice chimique solide dans laquelle on a implanté des macromolécules peut fournir suffisamment d’énergie pour conduire à leur ionisation et à leur désorption en phase gazeuse sans qu’elles subissent de dégradation. La meilleure voie pour que les macromolécules puissent pomper leur énergie est d’utiliser un laser et de choisir une matrice qui absorbe fortement à la longueur d’onde de ce dernier.

Les protéines ionisées sont accélérés dans un champ électrique puis voyage à travers un « tube de vol » vers le détecteur. Le temps de vol TOF (Time Of Flight) dans le champ électrique est dépendant de la masse de la protéine ionisée (plus précisément du rapport Masse/charge et est déterminé par un détecteur. Les ions les plus légers se déplacent plus rapidement et arrivent en premier au détecteur. Les résultats sont obtenus par un spectre de masse classique (intensité en fonction de M/z).

Cette technique d’identification des protéines a fortement augmentée l’utilité des électrophorèse 2D dans le sens ou il est possible de réaliser une MALDI-TOF sur chaque échantillon recueilli sur le gel 2D et d’identifier la protéine en comparant son spectre à une base de donnée comme avec un spectre MS de composé organique inconnu.

Question n° 2.6 :Quelles sont les principales techniques permettant de déterminer la structure 3D de macromolécules (protéines, acides nucléiques) à haute résolution ?

Il est important de connaître la structure 3D précise des protéines car la structure détermine la fonction, par exemple la spécificité des sites de liaison des protéines dépend de leur structure 3D.Puisqu’on demande les techniques déterminant la structure à haute résolution, les techniques de microscopie électronique peuvent être éliminées directement (précision d’environ 10Å).Les deux techniques principales sont la RMN et la cristallographie par rayons X.

RMNContrairement à la cristallographie par rayons X, la RMN permet de révéler la structure de macromolécules en solution. Mais il faut des solutions très concentrées.Petit rappel de RMNPar exemple, le proton possède un moment magnétique et a 2 états de spin quand un champ magnétique est appliqué. La différence d’énergie entre les 2 états dépend de la force du champ.Si on applique un « radio-frequency pulse » dont la fréquence correspond à la différence d’énergie entre les 2 états de spin, l’état de spin change, on dit qu’il y a résonance. Un spectre peut être mesuré en variant la fréquence du « RF pulse » et gardant constant le champ magnétique, ou l’inverse.Le flux d’é autour d’un noyau magnétique génère un champ magnétique local opposé au champ appliqué  : ainsi, selon l’environnement chimique du noyau étudié, un déplacement chimique différent est observé.RMN à 1DLes déplacements chimiques de la plupart des protons des protéines sont entre 0 et 9 ppm. Grâce à l’identification de ces protons sur le spectre, on peut déduire un changement conformationnel d’une structure « random » à une structure hélicoïdale après un changement de pH par exemple.RMN à 2DPlus d’informations peuvent être tirées de spectres 2D, le but étant d’évaluer comment les spins de différents protons affectent leurs voisins. NOESY = nuclear overhauser enhancement spectroscopy, qui donne graphiquement quelles paires de protons sont proches.

Cette spectroscopie se fonde sur l’effet nucléaire d’Overhauser : l’interaction entre 2 noyaux est proportionnelle à 1/r6, r étant la distance entre les 2 noyaux. Le « RF pulse » induit une magnétisation qui est transférée d’un noyau excité à un autre non excité s’il est à moins de 5Å.La diagonale d’un spectre NOESY correspond au spectre RMN 1D. Les pics hors diagonale correspondent aux paires de protons proches. Idéalement, si un nombre suffisant de contraintes de distance est repéré, la structure 3D unique peut être déterminée. Mais en pratique on trouve seulement une famille de structures pour 3 raisons : pas assez de contraintes de distances, distances approchées (non exactes), spectre fait sur un ensemble de molécules en solution et non 1 seule donc elle peuvent avoir des structures légèrement différentes à chaque instant.

Avantage :- structure déterminée en solution, contrairement à la cristallographie par rayons X

Inconvénients : - famille de structures trouvées et non 1 seule- la technique est appliquée sur un ensemble de molécules et non 1 seule- structure déterminée seulement pour de petites protéines, <40kd

Cristallographie par rayons XMaille cristalline = plus petit volume possible qui, une fois répété, est représentatif du cristal entier.Comment obtenir les cristauxOn peut lentement ajouter du sulfate d’ammonium dans une solution concentrée, ce qui réduit sa solubilité et aide à former des cristaux. Par exemple, la myoglobin cristallise à 3M de sulfate d’ammonium.A part ça, une théorie propose de commencer par former et faire croître qq cristaux dans une solution hautement sursaturée, puis de laisser croître les cristaux formés dans une solution légèrement sursaturée. Méthode « vapor diffusion » : une goutte de solution protéique est suspendue au-dessus d’un réservoir contenant un buffer et un précipitant (la goutte et le liquide sont en contact). L’eau diffuse de la goutte à la solution, laissant la goutte dans des conditions optimales de croissance cristalline.Principe de la cristallographieOn envoie de la lumière sur un cristal (arrête d’environ 0.1-0.3mm) et on regarde comment il la diffracte. Rayons X car longueur d’onde correspondant à l’ordre de grandeur des liaisons interatomiques. Puisque les rayons X ne font pas partie de la lumière visible, il est nécessaire d’utiliser un cristal pour créer un motif (« pattern ») de diffraction : les rayons X diffractés sont détectés par un film dont l’émulsion noircit proportionnellement à l’intensité de rayons diffractés. Plus l’atome sur lequel arrive le rayon X possède d’électrons, plus l’amplitude de l’onde diffractée est importante. De plus, les ondes diffractées se recombinent différemment selon qu’elles sont en phase ou non, et cela dépend uniquement de l’arrangement atomique. Pour obtenir la 3eD, le cristal tourne sur lui-même pendant qu’un détecteur produit des « réflexions » associées à chaque degré de rotation. Puis la transformée de Fourier convertit les « pattern » de diffraction en cartes de densité électronique, ce qui permet de localiser les atomes (sauf H car seulement 1é).

Avantages : - révèle très précisément la structure 3D- valable pour n’importe quelle taille de protéines

Inconvénient :- cristallisation difficile car complexité de la protéine et faible quantité disponible- surexpression des protéines membranaires difficile

Ces informations ont été tirées principalement du Stryer, p.107-112.

Question n° 2.7 :

There are a number of spectroscopic techniques which deliver structural information about proteins such as Circular Dichroism spectroscopy and FTIR spectroscopy. Describe the basic principles of these techniques and the type of information one can obtain for determining the structure of proteins.

FTIR (Fourier Transform InfraRed Spectroscopy)

Rappel théorique :Les bandes d’absorption infrarouge correspondent à des transitions d’énergie de rotation et de vibration (allongement, déformation,...) moléculaires.

La spectroscopie infrarouge est possible parce que les liaisons chimiques ont des fréquences spécifiques auxquelles elles vibrent, correspondant aux niveaux énergétiques. Les fréquences résonantes ou fréquences vibrationnelles sont déterminées par la forme de la surface d’énergie potentielle moléculaire, les masses des atomes et, éventuellement par les couplages vibroniques associés.Pour qu’un mode vibrationnel soit actif en IR, il doit être associé à un changement du dipôle permanent. En particulier, dans les approximations de Born Oppenheimer et harmoniques, c’est-à-dire quand l’Hamiltonien correspondant à l’état fondamental électronique peut être approximé par un oscillateur harmonique dans le voisinage de la géométrie moléculaire d’équilibre, les fréquences résonantes sont déterminées par les modes normaux correspondant à la surface d’énergie potentielle de l’état fondamental moléculaire électronique.Néanmoins, les fréquences de résonance peuvent être en première approximation, liées à la force de la liaison, et la masse des atomes impliqués. Donc, la fréquence des vibrations peut être associée à un type particulier de liaison.

Afin de mesurer un échantillon, un faisceau de lumière infrarouge est passé à travers et la quantité d’énergie absorbée à chaque longueur d’onde est enregistrée. Cela peut être fait en scannant à travers le spectre à l’aide d’un faisceau monochromatique, qui change de longueur d’onde au cours du temps, ou en utilisant un instrument à transformée de Fourier pour mesurer toutes les longueurs d’onde à la fois. En faisant passer la lumière IR à travers un interféromètre. Cela nous donne un interférogramme, qui après une transformation de Fourier nous donne un spectre d’absorbance ou de transmittance, qui montre à quelle longueur d’onde l’échantillon absorbe et permet d’interpréter quelles liaisons sont présentes.

Détermination de la structure secondaire :Pour déterminer la structure secondaire d’une protéine, on s’intéresse aux fréquences du backbone du peptide, les liaisons amides :

La bande amide II est très faible La bande amide I et amide III sont fortes et dépendent de l’angle dièdre et

et donc de la structure secondaire

wavenumber range Band strength Secondary Structure

1665-1672 Amide I strong beta sheet1660-1670 Amide I strong random coil1645-1655 Amide I strong alpha helix1270-1300 Amide III weak alpha helix1243-1253 Amide III moderate random coil1229-1235 Amide III strong beta sheet

Un spectre IR peut fournir des informations qualitatives et quantitatives sur la structure secondaire des protéines. Les bandes les plus intéressantes sont l’amide I, II et III. L’amide I est la plus intense des bandes d’absorption des protéines. Elle consiste d’une vibration d’élongation de C=O (70-80%) et C-N (10-20%). La position exacte de la bande est dictée par la conformation du squelette et le schéma des liaisons hydrogène.L’amide II est plus complexe, gouvernée par le bending dans le plan de N-H (40-60%), et les élongations C-N (18-40%) et C-C (10%).L’amide III n’est pas très utile.La figure suivante montre la distribution des différentes structures secondaire des protéines :La plupart des structures feuillet-beta de la bande amide I sont normalement à 1629 cm -1 avec un minimum de 1615 cm-1. et un max à 1637 cm-1.Les hélices alpha sont à 1652 cm-1 environ. Une absorption près de 1680 cm-1 correspond au beta-turn.

Figure représentant la bande amide I

Pour trouver le pourcentage d’hélice alpha par exemple, on fait le rapport de la surface en bleu sur la surface totale du pic.

Autres informations :On obtient également des informations sur l’orientation d’une hélice transmembranaire par exemple. Si on immobilise une membrane sur une plaque de verre et qu’on illumine avec une lumière polarisée, on aura un pic amide uniquement lorsqu’on est dans l’axe de l’hélice alpha. (la lumière doit être polarisée linéairement avec l’axe de l’hélice. On peut donc déterminer son orientation par rapport à la membrane.Autre information encore, la structure des chaînes latérales : certaines bandes sont caractéristiques à certains groupes fonctionnels (carbonyle, amines,..), on peut aussi déterminer si un acide aminé est protonné ou déprotonné, observer les changements..

Avantages:

Besoin d’une petite quantité de protéines (1mM). Peut détecter les structures secondaire dans plusieurs états physiques (solide, vapeur, liquide, semi-solide) Facile à faire Assez sensible pour détecter des changements de conformation des protéines dus à la pression, humidité, chaleur, … Les dérivées première et seconde des spectres IR de l’amide I peuvent être utilisé pour voir les changements conformationnels dus au pH et à la température.

Désavantage : Moins précis que CD

Circular Dichroism Spectroscopy:

L’activité optique est mesurée par la différence d’absorption entre la lumière polarisée à gauche et à droite qui survient due à l’asymétrie structurelle.

La technique repose sur la capacité qu'ont les structures optiquement actives d'absorber de façon inégale la lumière polarisée circulairement à droite de la lumière polarisée circulairement à gauche.

Une structure irrégulière donne une intensité de CD de zéro, alors que lorsque la structure est ordrée, on obtient un spectre qui contient des signaux aussi bien positifs que négatifs.

A une certaine longueur d’onde,

Où A est la différence entre l’absorbance de lumière polarisée circulairement à gauche et à droite (c’est ce qui est normalement mesuré).

Les deux lumières obéissent à la loi de Lambert-Beer :

où sont les coefficients d’extinction molaire, c la concentration et l la longueur du chemin parcouru.

Pour des raisons historiques, on donne souvent le CD en degrés d’ellipticité :

[θ] = 3300 Δε.

Cette technique est intéressante pour : Déterminer si la protéine est repliée et ainsi caractériser sa structure secondaire (surtout) et tertiaire, et la famille de structure à laquelle elle appartient. analyser l'impact de mutations ponctuelles sur la structure d'une protéine ou comparer des protéines obtenues par une espèce et système d’expression pour juger de la stabilité de la structure face à des changements environnementaux (pH, salinité, stabilité face aux dénaturants, stabilité thermique, importance du solvant : pour trouver les conditions de solvant qui augmentent la température de fusion et/ou la réversibilité du « unfolding » déterminer si une interaction protéine-protéine altère la conformation des protéines : s’il y a des changements conformationnels, le spectre qui en résulte sera différent de la somme des spectres des deux protéines isolées.

Structure secondaireLa structure secondaire peut être déterminée par la spectroscopie CD dans le domaine de l’UV lointain (190-250 nm). A ces longueurs d’onde, le chromophore est la liaison peptidique et le signal apparaît lorsqu’elle se trouve dans un environnement replié et régulier.

Les structures en hélices-alpha, feuillets-beta et random coils donnent chacune un spectre CD de forme et de magnitude différence. Ceci est illustré par ce graphique, qui montre le spectre d’une poly-lysine dans ces trois différentes conformations.

On peut donc déterminer la fraction approximative de chaque conformation présente, ce qui permet de déduire des conformations secondaires possibles de la protéine.

On peut donc par exemple dire que 50% de la protéine a une conformation d’hélice alpha mais on ne saura pas précisément

quels résidus sont impliqués dans ces hélices. Malgré cela, le CD est

un outil important, surtout pour montrer des changements de conformation (en fonction de la température ou de la concentration en dénaturant).Cette technique permet donc d’obtenir des informations thermodynamiques sur la protéine.

Le CD a d’autres utilités que de connaître ces fractions.

On obtient des informations structurales moins spécifiques que la cristallographie par ray-X ou RMN, cependant le CD est une méthode rapide, qui ne demande par une grande quantité de protéine (moins que mg), ni de traitement de données compliqué. Le CD peut donc être utilisé pour tester un grand nombre de conditions de solvants, de température, de pH et de salinité ainsi que la présence de cofacteurs.

Le CD est normalement utilisé pour étudier des protéines en solution et est donc un complément aux méthode à l’état solide.

Stucture tertiaire:Le spectre CD d’une protéine dans la region d’UV proche (250-350 nm) peut être sensible à certains aspects de la structure tertiaire. A ces longueurs d’onde, les chromophores sont les acides aminés aromatiques et les liaisons disulfures, et les signaux CD qu’ils produisent sont sensibles à la structure tertiaire globale.

Les signaux dans la région de 250-270 nm sont attribuables aux résidus de phenylalanine, de 270-290 aux résidus de tryptophane. Les liaisons disulfures donnent des signaux faibles et larges dans tout le spectre UV proche.

Comparabilité des conformations:Il est souvent nécessaire de pouvoir démontrer que différentes protéines ont des conformations équivalentes et le CD est un bon outil pour ça.

Le graphique suivant montre que la forme d’une enzyme recombinante n’a pas la même structure secondaire

que la protéine naturelle (la protéine recombinante n’est pas correctement repliée)

Rappel sur les ondes:Une onde lumineuse d'une certaine amplitude voyage

dans une direction donnée avec une forme sinusoïdale. L'angle des pics de l'onde par rapport à l'axe de sa propagation peut avoir n'importe quelle valeur, mais il est possible de sélectionner un angle particulier grâce à un filtre polarisant (polaroïd). Consistant en de longues molécules alignées dans une direction précise, un tel filtre ne laisse passer que les oscillations d'une onde électromagnétique orientées de même façon (dans son axe de transmission).

Si nous combinons deux rayons lumineux polarisés à 90° l'un de l'autre mais se propageant dans la même direction. On obtiendra les ondes suivantes:

La résultante des deux ondes est une autre onde sinusoïdale située entre les deux premières. Chaque pic de l'une correspond au pic de l'autre, et chaque noeud de l'une arrive au même point que pour l'autre. Mais si notre filtre (un modulateur photoélastique), en plus de laisser passer ces deux ondes, les déphase d'une valeur de π/ 2, le résultat sera tout autre. La résultante sera une spirale.

Dans L'exemple ci-dessus, on a retardé l'onde verticale bleue d'un quart de longueur d'onde (λ / 4, ou encore π / 2 radiants) pour une résultante en hélice de pas droit. Si on avait plutôt avancé l'onde bleue de π / 2 par rapport à la rouge, on aurait obtenu une hélice de pas gauche. Les structures secondaires n'absorbent pas de façon égale la lumière polarisée circulairement vers la droite et la lumière polarisée circulairement vers la gauche. On raisonnera que l'absorption préférentielle de l'une de ces deux polarisations résultera en une déviation de la résultante (au lieu d'un cercle, le tracé de la résultante entre la spirale tournant à droite et la spirale tournant à gauche donnera une ellipse). Cette déviation est appelée dichroïsme circulaire.

Question n° 2.8 :Fig.1 show typical CD spectra of α-helix and β-sheet. Pick 3 wavelengths that would discriminate most sensitively among these forms. Describe how you might analyze the data for an unknown protein forms in terms of CD values at these three different wavelengths.

Fig. 1: spectre CD typique d’une α-helix (-), d’une antiparallel β-sheet (-.-.-.) et d’un β-turn (…….)

Une α-helix a toujours un spectre CD du type de la fig. 1. La partie négative à 222 nm est typique de cette dernière. Le couplet négatif et positif à environ 208 et 190 nm l’est aussi.

La taille de la bande négative à 222 nm est une bonne mesure de la quantité d’α-helix dans une protéine ou dans un peptide. Il y a en effet une relation quasi linéaire entre Δε = 0 à 222 nm correspondant à 0 % de α-helix et Δε = -10 à 222 nm correspondant à 100 % de α-helix.

Le spectre CD pour une β-sheet présente une bande négative à environ 215 nm et une bande positive à environ 198 nm, mais la position et l’intensité de ces deux bandes varient grandement avec les échantillons analysés.

Le spectre CD d’une protéine quelconque va donc dépendre de la fraction de chacune des structures secondaires formant cette protéine.

Exemple

Fig. 2 : spectre CD de l’hémoglobine (-), de EcoRI endonucléase (…..) et du facteur-α (- - -)

Par exemple, dans la Fig. 2, on peut voir le spectre CD de l’hémoglobine. Grâce à ce spectre, on peut remarquer que l’hémoglobine contient principalement des α-helix.

Si on regarde le spectre du facteur-α, on remarque que cette protéine ne contient pas d’ α-helix, mais contient une quantité considérable de β-sheet.

Quant à EcoRI, on constate que cette protéine contient les deux structures secondaires en même temps et à donc un spectre CD intermédiaire.

En résumé

222 nm: plus la bande est négative plus il y a de α-helix190 nm: un pic fortement positif indique la présence certaine d’α-helix215 nm: bande positive indique la présence de β-sheet.198 nm: bande négative indique la présence de β-sheet.

Question n° 2.9 :Méthode FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) et quelques applications

Méthode 

Pour pouvoir appliquer cette méthode, il faut travailler avec des chromophores (fluorophores). Les plus utilisés sont CFP (bleu) et YFP (jaune) qui sont des dérivés mutants de la GFP (verte). Ces molécules peuvent absorber de l’énergie lumineuse et la resituer sous forme de lumière fluorescente. Un des deux chromophores est un donneur et l’autre un accepteur. La méthode consiste à exciter le chromophore donneur. Si le chromophore accepteur se situe à une distance inférieure à 10 nm du donneur, c’est-à-dire que les électrons excités du donneur entrent en résonance avec l’accepteur, alors il y a transfert d’énergie du donneur à l’accepteur. Ce transfert d’énergie va déclencher la fluorescence de l’accepteur.Plus les spectres d’absorption du donneur et d’émission de l’accepteur se chevauchent, meilleur est le transfert. Pour cela, il y a un critère de distance : le rayon de Förster R0. Cela représente la distance entre le donneur et l’accepteur à laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50% (50% de l’énergie d’excitation est transférée). La distance d’interaction maximale est de 10nm.

Exemple de transfert d’énergie entre deux chromophores (CFP et YFP) fusionnés à deux protéines hôtes (Z et Y)

Applications 

Pour étudier les phénomènes de FRET, on fusionne le gêne encodant la protéine fluorescente à celui de la protéine hôte par mutagenèse.

Etude du mécanisme de la protéine G . La protéine G permet le transfert d’information à l’intérieur de la cellule et elle utilise l’échange de GDP en GTP pour déclencher ou inhiber des réactions biochimiques dans la cellule. Lors de l’arrivée d’un neurotransmetteur, il y a une perte d’intensité de l’émission jaune donc le FRET ne se fait plus et donc une partie de la protéine s’est détachée.

Etude de l’inhomogénéité de l’organisation des lipides dans la bicouche lipidique, formant les membranes, contenant du cholestérol. De tels domaines sont des lipid rafts (radeaux lipidiques).

Question n° 2.10 : A protein is labeled by 2 chromophores suited to erform FRET. The typical Förster distance is R=2.3nm. The measured FRET efficiecy is found to be 0.015. Estimate the distance between the 2 labels.

Données :-La distance de Förster R0 = 2.3nm-L’efficacité de FRET = 0.015-Distance entre les 2 labels = ?? = r

Réponse :r = ((R0

6/Eff) - R06)1/6 = ((2.36/0.015)-2.36)1/6 = 4.62nm

Le rayon de Förster R0 :Cette distance de Forster correspond à la distance entre le donneur et l’accepteur à laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50%, c'est-à-dire que 50% de l’énergie d’excitation absorbée par le donneur est transférée à l’accepteur. L’efficacité du transfert d’énergie diminue lorsque le donneur et l’accepteur s’éloignent. La distance d’interaction maximale est de 10nm.

L’efficacité du transfert d’énergie (Eff):

Question n° 2.11 :

a) Fluorescence anisotropy is used to study rapid motions of molecules in liquids. This technique measures fluorescence depolarization on the nanosecond and even sub- nanosecond time. The sample is excited with vertically polarized light and the fluorescence intensity is measured in two different directions: parallel (I //) and perpendicular (I ┴) to light source. The intensity of emitted fluorescence depends on the angle between light source and the dipole moment of the molecule. Fluorescence anisotropy is then defined by:

I // and I ┴ are fluorescence decays, function of time. On the spectrum they are represented by emission curves. We use this expression to avoid problems due to decrease of both intensities in time. The ratio r becomes thus independent of intensity decrease. If the molecule is motionless, anisotropy is constant, but if it is not, the anisotropy value changes in time due to different orientation of dipole and thus different intensity values. b) Application: we can use this technique to follow, for example, ligand binding on macromolecules. Small molecules rotate more quickly than the large ones (rotation time is small). The binding produces a decrease in rotation time (large molecules rotate slowly).

Question n° 2.12 :Une expérience de FRET est effectuée par rapport au mécanisme de contraction musculaire par glissement des filaments d’actine et de myosine.Il y a deux chromophores: CFP (=donneur) et GFP (=accepteur).Après hydrolyse de l’ATP, l’efficacité du FRET est de 33%, ce qui correspond à une distance de 3.8 nm entre les 2 chromophores. Avant l’hydrolyse de l’ATP, l’efficacité est de 0.082. Il s’agit de calculer la distance entre les 2 chromophores avant l’hydrolyse.

L’efficacité est donnée par :

Avec :E = efficacité du FRETR = distance entre le donneur et l’accepteurR0= distance (entre D et A) à laquelle 50% de l’énergie est transférée du D au A ; c’est la distance de Förster, où efficacité = 0.5 (50%).

Les données pour « après l’hydrolyse » permettent de calculer R0 :

On trouve donc R0 = 3.377 nm

On peut maintenant calculer R avant l’hydrolyse :

On trouve donc R = 5.05 nm

La distance relative est donc de 1.25nm.

Question n° 2.13 :Describe 3 different methods of labeling proteins with fluorophores and discuss the advantages/disadvantages of them when compared to each other.Le résumé de la réponse est en bleue       (Référence : le séminaire de Florent Beyrière le 8Mai,2006)

Les marqueurs fluorescents permettent la détection des interactionsmoléculaires, des déplacements et des changements conformationnels des protéines dansdes cellules vivantes avec une haute résolution de l’espace et du temps.

Marquage covalent liaison chimique

En général plusieurs groupes amines ou thiols par protéine.-marquage multiple et désordonné.Marquage sélectif: marquage à un seul a.a.Manipulations génétiques pour avoir plus qu’un Cys ou Lys:-Enlever toutes les Cys ou Lys-Insérer à un site spécifique une Lys ou Cys.

Attacher par laison chimique covalente un fluorophore à un groupe fonctionnel de la protéine. Les groupes les plus favorables à une telle modification sont les amines et les thiols. Les groupes carboxyliques et alcools peuvent également être des candidats.Exemples de réactions :Amine :

Thiol :

Selon la structure de la molécule cible, le marquage de la protéine peut être sélectif à unemplacement unique ou à des emplacements multiples. Le plus souvent, une protéinecontient plusieurs lysines (-NH2) ou cystéines (-SH) pouvant être marquées, on aura alorsun marquage multiple et désordonné. Cette technique de marquage covalent n’est utilisée que sur des protéines synthétiques invitro. En effet, son application sur des cellules vivantes est trop compliquée à cause dugrand nombre de groupes –SH ou –NH2 présent dans la cellule.

Marquage covalent par génie génétique

Marquage par acides aminés synthétiques : répresseurs tRNA

Marquage (intélligente) spécifique irreversible de la protéine. In vivo, In vitro. Permet d’utiliser différents fluorophores. Ne modifie ni la structure ni la fonction de la protéine

Inconvénient: tARN difficile à synthétiser

Cette méthode est basée sur l’incorporation par mutagenèse d’un acide aminé synthétiquefluorescent dans un emplacement spécifique d’une protéine.La stratégie de cette technique est de réprimer un codon stop avec un tRNA synthétiquespécialement désigné pour l’introduction d’un acide aminé synthétique lors de l’expression du gêne. Les codons stop ne correspondent à aucun tRNA et sont en conséquence les codons qui mettent fin à la traduction des protéines. Il existe uniquement trois codons stop dans le code génétique : UAG, UGA et UAA.Ainsi, un de ces codons stop inutilisés pour la traduction de la protéine est introduit pargénie génétique à des endroits précis de l’ADN encodant la protéine afin d’introduirespécifiquement un acide aminé synthétique dans cette protéine.En ajoutant à la cellule des tRNA de répression synthétique portant un acide aminésynthétique fluorescent et contenant l’anti-codon correspondant au codon stop on peutintroduire cet acide aminé fluorescent dans la séquence de la protéine.

Cette méthode permet ainsi de marquer de manière irréversible une protéine in vivo à unemplacement précis avec différents fluorophores et elle ne modifie ni pas la structure nila fonction des protéines. Elle est généralement utilisée pour l’analyse des relationsspatiales des protéines membranaires in vivo telles que des récepteurs ou des canaux.Cependant la synthèse des tARN répresseurs nécessite une chimie complexe qui rendcette technique difficile à appliquer.

Marquage par GFP – Green Fluorescent Proteins

Problème:La grande taille ces marqueurs GFP(~26 kDa) peut gêner le pliage de la protéine et modifier ainsi la stucture et la fonction de la protéine.

La GFP est une protéine provenant originellement de la méduse Aequorea victoria. Cetteprotéine est intrinsèquement fluorescente. La GFP est devenu un marqueurincontournable de l’expression de gênes et de protéines.L’expression du gêne de la GFP dans d’autres organisms crée une fluorescence verte. Ainsi le gêne contient toute l’information nécessaire pour la synthèse posttranslationnelle du chromophore.

Le but de ce marquage est de fusionner le gêne encodant la GFP à celui de la protéinehôte par mutagenèse. La protéine chimère résultante sera ensuite exprimée dans lacellule. Le résultat idéal est une protéine fusionnée qui maintien les fonctions et leslocalisations normales de la protéine hôte mais qui est maintenant fluorescente.En général, les fusions peuvent être atteintes soit sur les terminaisons amines soit sur lesterminaisons carboxyliques de la protéine hôte.

Marquage par l’Alkylguanine Transférase humaine (hAGT)

Marquage spécifique irreversible de la protéine In vivo, In vitro

Permet d’utiliser différents fluorophores. Ne modifie ni la structure ni la fonction de la protéine L’efficacité du marquage dépendra de la perméabilité du marqueur aux

cellules.

hAGT= Alkylguanine Transférase humaineCette protéine effectue un transfert irréversible du groupe alkyl de la O 6 -alkylguanine-DNA à un de ses propres résidu cystéine (-SH).Le but de cette technique est de modifier le code génétique de la cellule vivante enfusionnant le gêne codant de la hAGT à celui de la protéine hôte par génie génétique pourainsi créer une protéine de fusion qui comprend la protéine hôte ainsi que la hAGT. LeO 6 -Benzylguanine substitué en position 4 par un marqueur fluorophore est ajouté aumilieu nutritif de la cellule vivante. Le hAGT de la protéine de fusion va ensuitetransférer le cycle benzène substitué avec le fluorophore pour enfin obtenir le marquagecovalent de la protéine de fusion.

La hAGT a plusieurs propriétés qui la rendent approprié au marquage spécifique etcovalent des protéines de fusion in vivo. D'une manière primordiale, elle a une activitéélevée sur un substrat qui est autrement chimiquement inerte et qui peut être dérivé avecune grande variété de marqueurs notamment fluorescents sans affecter sensiblement letaux de la réaction du hAGT avec le substrat. En plus, étant donné que la hAGT est unepetite protéine, la fusion du hAGT à d'autres protéines est peu susceptible d'affecter leursstructures, et la fusion à leurs N ou C terminal ne devrait pas diminuer leurs activités.L'efficacité in vivo du marqueur pour un substrat donné dépendra principalement de saperméabilité à cellules.

Marquage sélectif réversibleMarquage par NTA-Polyhistidine

La liaison de la coordination n’est pas très stable, réversible. Les liaisons peuvent être rompues par l’EDTA.

La technique de marquage par NTA est une méthode générale pour marquersélectivement, rapidement et réversiblement les protéines in vivo avec de petitsmarqueurs. Ces marqueurs sont composés d’un chromophore et d’un ion métal chélatenitrilotriacétate (NTA). Ce métal chélate crée une liaison de coordination réversible avecdeux histidines d’une chaîne d’histidines.La liaison de coordination n’est pas très stable. Les liaisons peuvent être rompue par l’EDTA.L’avantage de cette liaison réversible, c’est que l’on peu réaliser du marquage séquentiel.Le marquage séquentiel permet d’avoir une continuité dans l’image. C’est-à-dire, lorsqueles chromophores ont été oxydés (photobleached), il est possible d’attendre que les

marqueurs se détachent ou les détacher simplement des protéines en ajoutant de l’EDTA.Après avoir nettoyé la cellule de l’EDTA et du marqueur, on ajoute un marqueur avec unchromophore d’une autre couleur pour à nouveau marquer la protéine.Cette nouvelle technique permet d’introduire spécifiquement et réversiblement in vivodifférents petits marqueurs qui ne perturbent pas la protéine. De par sa nature réversible,elle ouvre de nouvelles perspectives notamment dans l’étude des interactionsmoléculaires et des structures moléculaires par la méthode de ‘’Fluorescent ResonanceEnergy Transfert’’ (FRET).Question n° 2.14 :

Technique de surface sensible telle la résonance des plasmons de surface (SPR) et la fluorescence interne totale de réflexion pour la détermination des interactions moléculaires. Décrire les principes basiques de ces techniques et leurs principales applications.

Principe   :

Il s’agit de processus de reconnaissance moléculaire à la surface des cellules biologiques. Toutes les cellules doivent obtenir des informations de leur environnement afin de s’adapter de manière appropriée, en particulier un organisme composé de milliers de cellules ne fonctionne que s’il y a un échange mutuel des informations. Cette information est transmise souvent par des substances chimiques (hormone…).Une cellule est délimitée par une membrane biologique. Elle se compose pour la plupart de lipides, qui leur donnent la structure d’un « liquide 2-Dimensionnel », et de protéines, qui servent aux frontières spécifiques. D‘un côté la membrane présente une barrière qui entrave le libre passage de molécules ; de l’autre elle est bardée des protéines réceptrices qui reconnaissent spécifiquement la présence de certaines molécules à l’extérieur. Celles-ci peuvent à l’occasion déclencher une réponse cellulaire.Afin d’observer des phénomènes qui ont lieu à la surface d’une membrane biologique, il faut se rappeler qu’elles représentent des structures 2-dimensionelles des molécules auto-organisées, c’est-à-dire des bicouches d’une épaisseur de quelques nanomètres seulement. Les méthodes d’investigation de choix ici sont les « technique de surface - sensitives », comme les plasmons de surface. C’est une mesure de la liaison d’un ligand sur un récepteur adsorbé à la surface d’une couche métallique.Le système de détection est basé sur une variation de l’indice de l’interface quand le ligand se fixe aux récepteurs.

Voyons le principe :Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre deux milieux d'indice de réfraction différent, une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l'interface et l'autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface.

Plaque de verre

Air

Liquide

Lumière polarisée monochromatique

Lumière réfléchie

Lumière réfractée

Selon l'angle d'incidence du faisceau, toute la lumière peut être réfléchie. Lorsqu'il n'y a pas de réfraction, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l'onde évanescente, se propage perpendiculairement à l'interface sur une distance équivalente à sa longueur d'onde.

Si une couche fine de métal, riche en électrons libres est déposée à l'interface, ceux-ci entrent en résonance avec les photons du faisceau incident, ce phénomène est appelé résonance plasmonique de surface. Une conséquence énergétique de cette résonance est visible dans le faisceau réfléchi qui, analysé avec une barrette de diodes, présente une chute d'intensité à un angle défini. Cet angle d'intensité minimum est l'angle de résonance. Il varie en fonction de l'indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent.

On utilise un prisme recouvert d'une très mince surface métallique (argent ou or). Il existe des plasmons de surface qui sont des ondes oscillantes de densité surfacique de charge qui se déplacent à la surface du métal. Ces plasmons (non radiatif) sont excités par la lumière atteignant la surface du métal. L'amplitude du champ électromagnétique I(z) décroit exponentiellement quand on s'éloigne de la surface (en fonction de la

Air

Liquide

Lumière polarisée monochromatique

Lumière réfléchie

Onde évanescente

Air

Liquide

Lumière polarisée monochromatique

Onde évanescente

i

Film d’or

Barette de diodes

longueur d'onde de la lumière incidente). Ils ne peuvent en fait être excités que sous certains angles d'illumination (quand le vecteur d'onde de la lumière à la surface coïncide avec celui des plasmons de surface). Cela conduit à ce que la lumière réfléchie voit son intensité décroitre (ayant transféré de l'énergie aux plasmons). Il se forme donc un minimum profond dans l'intensité refléchie en fonction de l'angle d'incidence . Cet angle dépend très fortement du profil de l'indice de réfraction de la surface (nsurface) , dans l'épaisseur du champ évanescent proche de la surface. Le changement de la composition (adsorption ou desorption, fixation ou relargage) de l'interface change cet indice, ce qui conduit à un changement de l'angle de résonance. Des considérations théoriques montrent que est proportionnel à la concentration de macromolécules en surface jusqu'à une concentration surfacique élevée de 50 ng.mm-2.

Applications SPR   :

La résonance plasmonique de surface (SPR) classique est une technique très utilisée pour l'étude des molécules biologiques telles l'ADN, les protéines, les membranes lipidiques, etc. et leurs interactions sans marquage préalable (à l’inverse de la fluorescence). Cependant, l'utilisation de la SPR pour les solutions fortement diluées est limitée par la sensibilité de la méthode, qui est de l'ordre du nano-molaire (nM). L'amélioration de la sensibilité de SPR présente alors un intérêt majeur en biosciences, car elle devrait permettre l'utilisation de petites quantités de molécules biologiques et par conséquent réduire les coûts associés. L'amélioration de la sensibilité de SPR peut être rendue possible par la génération des plasmons localisés (LSPR). La détection en LSPR repose sur le fait que les nanoparticules métalliques (métaux nobles) présentent des bandes fortes d'extinction en UV-vis et génèrent des champs électriques élevés, qui sont extrêmement sensibles aux changements de la constante diélectrique aussi bien que l'épaisseur au voisinage de ces nanoparticules.

En plus :

Le Biacore a pour fonction de visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées dans un débit continu de tampon. Un des réactifs, le ligand, est retenu de manière spécifique sur une interface appelée sensor chip (biocapteur).

Le sensorgramme   :

L'analyte dilué dans un tampon circule à flux constant à la surface du biocapteur. Les changements de masse induits par l'association ou la dissociation des complexes modifient la réfringence du milieu et décalent la position de l'angle de résonance.L'enregistrement de la variation de l'angle de résonance permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur. Le signal de résonance est exprimé en unités de résonance (RU). L'enregistrement de ce signal s'appelle un sensorgramme.

Question n° 2.15 :“The R0 values for the fluorophores used in many biological FRET experiments are about 6 nm. Using this value: How far apart do the donor and acceptor have to be for the FRET efficiency to drop to 10% of its maximum value?”

On utilise la formule suivante: E = R06 / (R6 + R0

6)On veut la distance R, entre le donneur et l’accepteur, qui correspond au 10% de la valeur maximum, soit E = 0.1R0 = 6 [nm]

0.1 = 66 / (R6 + 66) (R6 + 66) * 0.1 = 66

R6 = (66 – 66 * 0.1) / 0.1 R = 8.65 [nm]

Question n° 2.16 :An RNA molecule that can exist in two different structural states: either in a compact, folded conformation or an open conformation. The two states are probed by singler molecule FRET measurements. For the fluorophore used, R0 = 6.5 nm.

(a) The efficiency of FRET is observed to fluctuate erratically between 0.9 and 0.2. Estimate the distances between the donor – acceptor pair for the two structural states.

(b) Data on « dwell time » in the high FRET efficiency (folded) state have been accumulated for long observation times on a number of molecules:

Average dwell time Number of events

0.1 330.2 230.5 180.6 140.9 91.1 61.2 4

Calculate the rate of unfolding from these data. Is it a first-order process?Hint: Plot number of events as function of dwell time, calculate relaxation time , the reaction rate constant k = 1/This exercise is quite instructive what you can learn from single molecule experiments which would be hidden in ensemble measurements

(a)

La formule à utilise rest la suivante: r = R0 • [(1/ET) - 1]1/6

Où ET est l’efficacité du transfert d’énergie. On nous donne R0, ce qui correspond à la distance pour laquelle l’efficacité est de 50%. On peut vérifier cela en remplaçant ET par 50% et R0 par 6.5 [nm]. On obtient r = 6.5 [nm] ce qui est correct.

Il est précisé qu’entre une efficacité de 0.9 et 0.2, l’efficacité varie de façon aléatoire. Par conséquent, 0.9 et 0.2 correspondent aux efficacités dans les deux états, folded et unfolded et qu’entre ces deux efficacités se trouve celle à 50%.

Par conséquent, on n’a qu’à remplacer ET par 0.9 et 0.2 pour obtenir les distances.

rfolded = 6.5 • [(1/0.9) - 1]1/6 = 4.5 [nm]runfolded = 6.5 • [(1/0.2) - 1]1/6 = 8.2 [nm]

On considère que la distance la plus courte est de la forme folded et inversément.

(b)

L’expérience a été la suivante : La molécule a été libre de changer de conformation entre folded et unfolded. On a observé quand est-ce qu’elle se trouvait en conformation folded. Le dwell time correspond au temps pendant lequel la molécule reste en conformation Folded avant de se défaire. D’après les résultats, elle est restée 33 fois pendant 0.1 secondes (ou plutôt nanosecondes, ce n’est pas précisé) en forme folded, 23 fois pendant 0.2 secondes avant de se redéfaire, 18 fois pendant 0.5 [s] et ainsi de suite. Ainsi il est possible de tracer un histogramme :

Chart Title

R2 = 0.99

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0.1 0.2 0.5 0.6 0.9 1.1 1.2

dwell time

n° o

f eve

nts

Calcul de la vitesse de unfolding :

La moyenne des temps pendant lesquels la molécule se trouve en conformation folded = inverse de la vitesse de defolding :

Il s’agit donc uniquement de calculer le temps moyen. Ce dernier est égal au temps fois la probabilité.

[s

]Ensuite, il est simple de déterminer la vitesse :

[s-1]

Pour la deuxième partie de la question, c’est un peu plus compliqué. Il s’agit de montrer que la décroissance est exponentielle, chose difficile à faire à l’examen sans excel  !! On voit que c’est exponnentiel avec un R2 de 0.99. Sinon, à l’examen il est possible de tracer le ln du nb events par rapport au temps et ce devrait donner une droite, peut être plus facile à réaliser.

Question n° 2.17 :Voici les techniques qui permettent d’étudier le comportement d’une seule molécule:

PSF (point sceen fluorescence) FRET (fluorescence resonnance energy transfert) Spectroscopie de polarisation SPT (single particle tracking)

PCF (plus d’information lire séminaire Régis)

Principe

Dans cette technique, une ou plusieurs protéines sont marquées avec des fluorophores. Ces fluorophores sont illuminés par des lasers pendant quelques milisecondes et sont localisés à des intervalles réguliers de dizaines de milisecondes grâce à une caméra CCD. Le fait que la longueur d’onde émise par le fluorophore est plus petite que sa propre taille permet d’obtenir un point lumineux.La prise successive d’images du fluorophore permet de tracer une carte des déplacements du fluorophore à 40 Angström près. A cause du photobleaching (décroissance de l’intensité de la fluorescence au cour du temps), cette méthode ne peut pas être utilisée pour étudier une molécule pendant une longue période.

Information

Cette méthode permet de suivre la trajectoire et la diffusion d’une macromolécule au sein d’une surface ou d’une couche (en 2 dimensions). Nous pouvons également étudier le comportement d’une protéine motrice. Cette technique permet de suivre des réactions telles que des absorptions sur des surfaces catalytiques et des interactions enzyme-substrat

FRET (plus d’information lire séminaire Régis)

Principe

Lorsque le spectre d‘émission d’un fluorophore A recouvre en partie le spectre d’absorption d’un autre fluorophore B, un transfert d’énergie est observé entre le fluorophore A dit donneur et le fluorophore B dit accepteur, sous forme d’énergie de résonance non radiative. Ce phénomène, appelé FRET, induit une diminution de la fluorescence du donneur et une apparition de la fluorescence de l’accepteur.L’efficacité du transfert dépend de la distance entre les deux molécules et sa mesure permet ainsi de pouvoir mesurer la distance entre les deux fluorophores avec une précision de 1 Angström.

Information

Grâce à cette méthode nous pouvons étudier des changements de conformation, des interactions substrat-enzyme et tout processus impliquant le rapprochement de 2 macromolécules.

Spectroscopie de polarisation (plus d’information lire séminaire Régis)

Principe

Les fluorophores possèdent généralement un moment dipolaire μ. Le fluorophore, bloqué dans la protéine, est alors excité avec une lumière polarisée plane. L’angle de la lumière polarisée par rapport au fluorophore est varié dans le temps et de manière périodique. Nous obtenons ainsi un graphe représentant l’intensité en fonction de l’angle varié. De ce graphe, nous pouvons obtenir l’orientation du dipôle du fluorophore.

Information

Cette méthode permet d’étudier des changements conformationnel.

SPT (séminaire Berit)

La technique du SPT est basée sur trois étapes :

1. Préparation de l’échantillon (choix des cellules et des particules)2. Marquage des particules d’intérêt 3. Enregistrement des trajectoires

Plusieurs techniques sont disponibles pour suivre les particules. Une technique est la Molecular Recognition Force Microscopy (MRFM). Dans cette technique, un microscope à force atomique est utilisé. La pointe du microscope contient des anticorps. L’interaction entre la particule d’intérêt et les anticorps produit un signal mesurable. Le problème de cette technique est qu’elle ne peut uniquement identifier la position d’une particule mais en aucun cas sa diffusion.

Une autre méthode pour suivre les particules est l’utilisation de billes. La bille est liée à la particule d’intérêt via une liaison antigène anticorps. La liaison est très stable et les billes peuvent être observées à l’aide d’une caméra spécialisée. L’avantage des billes est qu’elles sont stables, elles ne se dégradent pas au fil du temps. L’inconvénient est qu’elles ont une taille similaire à la particule d’intérêt.

Information

Nous pouvons observer la diffusion de particules dans une membrane biologique.

Toutes ces techniques mentionnées ci-dessus nécessitent des méthodes de marquage de particules. Voici différentes techniques de marquage:

Méthodes de marquage

Marquage covalent par liaison chimique Marquage covalent par génie génétique (GFP, hAGT, acides aminés synthétiques) Marquage réversible (NTA polyhistidine) Quantum dots

Question n° 2.18 :

IL ne l’a pas faite.

Question n° 3.1 :

Voir la question que je vous ai envoyé à part. merci

Question n° 3.2 :

L’approche de Hill est une approche semi-empirique. Elle fait une analogie à une coopérativité infinie, ainsi nous pouvons écrire:

avec la constante d’équilibre associée: .

Nous introduisons la constante υ qui représente le nombre de ligands associés par macromolécule M. Donc:

. Nous remplaçons [Mn] par Kn[M0][L]n et obtenons:

(*).

Nous voulons travailler avec des fractions de ligands associés, donc nous introduisons une nouvelle

variable y telle que: . Ainsi, l’équation (*) devient: .

Cependant nous nous trouvons dans un cas où tous les sites sont occupés, donc dans un cas où les n ligands occupes les n sites de la macromolécule M. Si nous ne voulons pas nous restreindre à ce cas, nous devons remplacer la valeur n par un coefficient α, appelé constante de Hill. Ce coefficient varie entre 1 (1 seul site

occupé) et n (tous les sites occupés). L’équation devient alors: (**). La forme générale

de cette équation est une sigmoïde.

Pour l’exercice, nous avons les valeurs suivantes:

p(O2) Saturation (%)1.13 0.35.55 1.337.72 1.92

10.72 3.5131.71 8.3771.87 18.96100.5 32.9123.3 47.8136.7 55.7166.8 67.3203.2 73.4262.2 79.4

327 83.4452.8 87.5566.9 89.2736.7 91.3

où p(O2) est en en quelque sorte la variable [L] de notre équation et Saturation [%] la variable y.

En plottant p(O2) vs Saturation [%], nous obtenons le graphique suivant:

qui est le graphique de Hill. Ce qu’il faudrait faire maintenant est un fit des points expérimentaux avec l’équation (**) et en tiré le coefficient α afin de déterminer le nombre de sites occupés par un ligand par molécule de macromolécule M. Excel ne le permet malheureusement pas, il faudrait utiliser un programme comme Igor. Il est important de noter que la saturation est en % et il faudrait la convertir en fraction (0 < y < 1).

Pour savoir si la liaison est coopérative, il faut se rappeler que cette approche par d’une théorie qui fait une analogie à une coopérativité infinie. Ainsi, plus le fit est difficile, plus la réaction sera non coopérative.