REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN · PDF fileSiklus litik atau lisogenik? ......

Suharsono.2005. BTK505. IPB

REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS

• Fage/virus memanfaatkan perangkat sel inang untuksintesis DNA/protein

• Strategi memanfaatkan sel inang mensintesis 4 makromolekul:

1. RNA polimerase baru khusus mentranskripsikromosom virus

2. Subunit RNA pol baru berasosiasi dengan polimerasesel inang, hanya mentranskripsi kromosom virus

3. Protein represor menghambat fungsi sel inang4. Protein aktivator mengatur ekspresi gen virus


Regulasi pada fage T7

2 kategori gen:Gen awal (early genes): KlasI diekspresikan pertamaGen lambat (late genes): Klas II dan Klas III diekspresikan bila produkgen awal tersedia


Regulasi pada fage T7

3 kelompok gen1.Produk gen awal

menghambat sintesis RNA inang

2.Produk gen metabolismeDNA (enzim untuk replikasikromosom virus & nukleaseuntuk degradasi kromosomsel inang nt bebas)

3.Produk gen akhir (mantel, ekor & protein pembungkuskromosom virus). Produkterakhir: lisozim lisis selinang + 250 fage


Ekspresi T7

1. Gen-gen klas I diekspresikan oleh RNA pol sel inangtranskrip panjang dipotong oleh RNaseIII dari selinang 5 mol mRNA translasi oleh ribosom dari selinangProduk:

• antirestriksi (0.3) melindungi kromosom virus daridegradasi oleh enzim restriksi sel inang

• protein kinase (0.7) modifikasi RNA pol sel inang, membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresigen klas II dan III

• RNA polimerase T7 (1) transkripsi klas II dan III (80% genom virus T7)

• Ligase (1.3) menyambung fragmen DNA2. Gen-gen klas II diekspresikan oleh RNA pol T7

-replikasi DNA virus3. Gen-gen klas III

-morfogenesis fage, pengemasan DNA, lisis sel inang


Siklus fage T7


Regulasi pada SPO1

• SPO1: virus besar, menginfeksi Bacillus subtilis

• 3 kelompok gen: early, middle, late1. Gen awal RNA pol sel inang (menghasilkan produk

gen 28)2. Gen tengah RNA pol sel Inang yang mengandung

produk gen 28 pada posisi faktor σ–Faktor σ mengenali –35: TTGACA dan -10: TATAAT pada gen awal SPO1–Produk gen 28 mengenali –35: AGGAGA dan -10: TTTTTT pada gen tengah SPO1–Menghasilkan produk gen 33 dan 34

3. Gen akhir RNA pol sel inang yang mengandungproduk gen 33 dan 34


Regulasi pada SPO1 (lanjutan)

Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gentengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA polimerase (melalui penggantian salah satu subunitnya, yaitu posisi faktor σ)


Regulasi pada λ

Setelah menginfeksi E.coli, λ menempuh:1.Siklus litik sel inang lisis 100 fage2.Siklus lisogenik kromosom fage menyisip kedalam

kromosom E.coli


Siklus litik atau lisogenik?

Protein-protein regulator yang disandi λ


Regulasi selama siklus litik λ

Fase litik meliputi 3 fase: • Fase Immediate-early• Fase Delayed-early• Fase Late

Fase Immediate-earlyKromosom λ masuk, transkripsioleh RNA pol sel inang. Inisiasitranskripsi dimulai dari PR(transkripsi ke kanan) gen crodan PL (transkripsi ke kiri) genN. Protein N diperlukan untuktransisi dari immediate-early kedelayed early (seperti produkgen 28 pada SPO1)


Regulasi selama siklus litik λ

Fase Delayed-earlyDimulai saat protein N menstimulasi transkripsi gen-gendelayed- early, mengekspresikangen cII dan cIII (relevan untuksiklus lisogenik), gen O, P (untukreplikasi kromosom λ) dan Q(untuk transisi dari delayed-early ke late, seperti produk gen 33dan 34 dari SPO1)

Fase LateDimulai saat protein Q menstimulasi transkripsi gen-genlate spt gen penyandi kepala, ekor dan faktor-faktor litik


Transkripsi gen-gen immediate-early

RNA polimerase sel inang:Kanan: PR croKiri: PL N


Transkripsi delayed-early

RNA polimerase sel inang (faktor δ diganti protein N)Kanan: PR cII, O, P, Q Kiri: PL CIII


Keadaan lisogeni

• Siklus lisogeni memerlukan:

1. Protein represor λ menghambat ekspresi gen-genuntuk siklus lisis– Disandi oleh gen cI di bawah kontrol PRE

(promoter for repressor establishment)

2. Protein Int λ integrasi ke kromosom E. coli– Disandi oleh gen Int di bawah promoter PINT

3. PRE dan PINT: sekuensi mirip, memerlukan protein cIIdan cIII supaya RNA polimerase mengenalinya cIIdan cIII diperlukan untuk siklus lisogeni


Keadaan lisogeni


Protein cII dan cIII

• Protein cII protein regulator (aktivator) seperti CAP mengikat daerah –35 dari PRE dan PINT

menstimulasi RNA pol menempel pada promoter sehingga kedua operon ditranskripsikan

• Protein cIII menonaktifkan protease yang dapatmendegradasi protein cII ( menjaga stabilitas cII)

• CII dan cIII memerlukan protein N


Mekanisme Lisogeni

• Represor λ mengikat operator (OL dan OR), mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol PR dan PL yaitu: gen N dan cro

• N dan CRO tidak stabil konsentrasi di dalam sel turun(rendah)

• N rendah menghambat transkripsi gen-gen delayed-early yang tergantung N, yaitu: O, P, Q

• Q rendah/tidak ada mencegah ekspresi gen-gen danlate tidak terjadi siklus lisis

• Protein Int perantara rekombinasi situs spesifikantara attP dan attB sehingga kromosom λ terintegrasikedalam kromosom E. coli


Strategi λ dalam memilih siklus

1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhipembacaan terminator lisis

2. Menghasilkan protein aktivator cII yang mengikatdaerah promoter dan memudahkan RNA pol menempelpada promoter lisogeni

3. Menghasilkan represor mengikat operator lisogeni


Interaksi represor-operator

• Mutasi gen cI plak jernih (WT plak keruh: lisis & lisogeni)

• Mutasi cII- dan cIII- plak jernih• Represor: stabil, 26 kDa, berinteraksi dengan operator

sebagai dimer• Mutan operator (OL

- dan OR-) virulen (represor normal

tapi tidak dapat mengikat operator tidak dapatmenempuh siklus lisogeni plak jernih (~lacOc)


• Operator mempunyai 3 situs penempelan (OL1, 2, 3; OR1, 2, 3)

• Operator tumpang tindih dengan promoter• Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan

yang lain oleh daerah kaya AT• Setiap mutasi pada situs penempelan virulen

= mutasi virulen

Operator


Lisis-Lisogeni

• Lisis/lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang berkompetisi, yaitu: N, Q, cII, cIII, cI, dan cro

• Protein cro (control of repressor and other things)– paling menentukan terjadinya siklus lisis atau

lisogeni– diekspresikan segera setelah infeksi λ– tidak memerlukan protein N– ada sebelum produk cI (represor), cII dan cIII ada

di dalam sel– represor, dapat mengikat OR dan OL seperti represor

cI (tapi kurang efisien dan kurang stabil) tidakdapat menghambat secara penuh ekspresi gen-genN dan cIII (dibawah PL) dan cro, cII, O, P, dan Q (dibawah PR)


Mekanisme Lisis-Lisogeni

• Lisogeni memerlukan ekspresi gen cI perlu cII dancIII untuk mengaktifkan PRE

• Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen perluantiterminator N dan Q

• Transkripsi cI lebih sensitif terhadap penurunan cII/cIIIdaripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalamsiklus lisis terhadap penurunan N dan Q

jika cro banyak menempel pada OR dan OL cIIdan cIII rendah cI tidak diekspresikan ekspresiseluruh gen λ siklus lisisjika cro sedikit tidak kuat menempel pada OR danOL ekspresi cII dan cIII normal cIdiekspresikan siklus lisogeni

– tingkat produksi cro temperatur, keadaanmetabolit sel inang, genotipe sel inang, genotipefage


Keadaan E. coli lisogeni

• Bakteri lisogenik untuk λ (E. coli (λ)) kebal terhadapsuperinfeksi (+λ)

• E. coli (λ) + λ DNA λ masuk tapi tidak terjadi lisispada bakteri

• Profage mensintesis represor cI pada tingkat rendahmenempel pada PROR dan PLOL pada profage (menjagakondisi lisogeni) dan PROR dan PLOL pada λ yang masuk(mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosom E. coli krn situs attB sudah ditempati) kromosom λberada di sitosol jumlahnya berkurang (hilang) bila E. coli mengalami pembelahan sel


• Transkripsi represor pada tingkat rendah di E. coli (λ) dikontrol oleh PRM (promoter for repressor maintenance) yang tidak memerlukan cII dan cIII (beda dengan PRE)

• Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein cI:Jika represor cI rendah PRM dirangsang transkripsicIJika represor cI tinggi transkripsi dari PRM dihambatoleh represor cI ( regulasi autogenous)


Induksi lisis dari keadaan profage

• Lisis terjadi karena protein represor cI tidak dapatmenghambat ekspresi operon dari profage λ

• Kehilangan secara spontan profage λ dari kromosomE. coli jarang terjadi


1. Induksi zigotik

• Sel donor lisogenik Hfr x sel resipien non lisogenik– Jika kromosom yang

mengandung profagemasuk ke sel resipientidak menemui protein represor transkripsidari PROR dan PLOL

siklus lisis– Tidak terjadi lisis jika sel

resipien adalah E. coli(λ)


2. Mutasi pada cI

• Mutan cI857 sintesis protein represor thermolabil(stabil pada 30oC, tidak aktif pada 42oC)

• E. coli (cI857) dipanaskan E. coli lisis


3. Perlakuan bakteri lisogenik yang dapatmerusak DNA (dengan irradiasi UV, mitomisin, sinar X)

• Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem SOS• Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan

replikasi, E. coli mensintesis protein RecAmemudahkan sintesis enzim SOS termasuk untukreplikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease yang dapat merusak represor LexA (menekan enzimsistem perbaikan kesalahan), dan represor λ dalam E. coli (λ).

• Jika DNA rusak sinyal untuk mensintesis protein RecA merusak represor λ profage terinduksiuntuk mengalami lisis


Regulasi SV40Produk gen early• Antigen t (15kD)• Antigen T (96 kD)

Transkrip sama, bedasplicing

Produk gen late• Protein kapsid (VP1, VP2,

VP3) beda splicing– mRNA late splicing:• 16S mRNA VP1• 19S mRNA:

•VP2•VP3

Krn 2 kodon AUGArah transkripsi gen-gen earlyberbeda dengan gen-gen late


Regulasi sintesis protein SV40

• Infeksi (8-10 jam) gen early (gen A penyandiantigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol danditranslasikan oleh ribosom sel inang

• Mutan tsA (antigen T thermolabile) tidak dapatmemulai replikasi kromosom virus & tidak dapatmemulai transkripsi gen-gen late untuk protein kapsid virus

Antigen T protein pengatur early yang esensial(~ protein N pada λ)


Promoter early (EI dan EII) dekatdengan ORI dan gen early ASitus penempelan antigen T (I, II, III) bebas transkripsi olehRNA pol dari EI

Melekatnya antigen T (tetramer) pada situs I Inisiasi transkripsidari situs EII

Penempelan antigen T pada situsII transkripsi gen A berhentiekspresi gen-gen late

Mekanisme


Kromosom SV40 menginfeksi sel inang: •RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsigenA sintesis antigen T

•Akumulasi antigen T (tetramer) mengikat situs I inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA polmenempel pada promoter EII untuk melakukan transkripsiantigen T jumlah antigen T banyak mengikat semuasitus I, dan II transkripsi gen early berhenti, danreplikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen late dimulai

Regulasi SV40


Kenapa terjadi early/late?

• Promoter EI dan EII jauh lebih kuat daripada promoter pada gen-gen late sehingga transkripsi oleh RNA polpada gen A sangat intensif produk antigen T banyak

• Antigen T menghambat ekspresi gen-gen early, sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen lateSintesis antigen T regulasi autogenous (~ represor λ~ trp)Mutan tsA antigen T thermolabile didegradasi (situs I dan II bebas) stimulasi 15x transkripsi gen early overproduksi protein mutan T

REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN · PDF fileSiklus litik atau lisogenik? ......

Documents

Transcript of REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN · PDF fileSiklus litik atau lisogenik? ......