UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Regulación de la expresión del Receptor Tipo Toll 4 (TLR4) por el Factor de Necrosis

Tumoral α y Glucocorticoides

Ramón Daniel Pérez Núñez Memoria para optar al título de Bioquímico

Profesor Patrocinante: Dr. Javier Puente Piccardo Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Universidad de Chile

Directora de Memoria: Dra. Marcela Hermoso Ramello Laboratorio de Inmunidad Innata Programa Disciplinario de Inmunología Facultad de Medicina Universidad de Chile

Santiago-Chile 2008

Esta memoria esta dedicada con todo mi cariño a mis padres, Ramón y María…

ii

AGRADECIMIENTOS

Creo que nunca voy a poder terminar de agradecer a todas aquellas personas

que estuvieron junto a mí, entregándome su apoyo y orientación en cada momento.

Por ello, la satisfacción de todo este trabajo lo quiero compartir con todos ustedes.

Agradeciendo en primer lugar a mi profesora guía, la Dra. Marcela Hermoso,

que me otorgó desde el principio la confianza y sabiduría necesaria para el buen

desarrollo de esta memoria.

De la misma manera agradecer a todos los que forman y formaron parte del

Laboratorio de Inmunidad Innata, lugar que me acogió y consideré como mi segundo

hogar, integrado por personas con las cuales compartí muy gratos momentos, que

conservaré por siempre, gracias…Rodrigo, Enzo, Frano, Alexis, Sergio, Bendelin,

Sofía, Alejandra, Lucía, Patricia, Paulina, Caroll, Salvador, David, José, Carolina,

María José, Luis, Benjamín…sin poder dejar de nombrar a una persona que considero

mucho y que me entregó permanentemente su amistad, bondad y energía, cuando

mas la necesitaba, gracias a Ud. Don Roli.

Al pilar fundamental que me ha sostenido toda la vida, mi familia, la cual nunca

se ha puesto limites para darme todo el apoyo y cariño que he necesitado, infinitas

gracias a mi papá, mi mamá y mis hermanitas Josefina, Ana y Gabriela…además de

una hermosa persona que considero parte de mi familia, que siempre está

entregándome su amor en la cosas mas simples de la vida, a mi niña linda,

Gabicienta…

iii

INDICE GENERAL

Página AGRADECIMIENTOS iii INDICE GENERAL iv INDICE DE FIGURAS vi ABREVIATURAS vii RESUMEN viii ABSTRACT ix 1. INTRODUCCION 1

1.1 Sistema Inmune 1 1.2 Receptores de Reconocimiento de Patógenos 2 1.3 Receptores Tipo Toll (TLRs) 3 1.4 Glucocorticoides y el Sistema Inmune 4 1.5 Regulación de la expresión de TLR4 por moléculas

pro- y anti-inflamatorias 6 2. HIPOTESIS 7

2.1 Objetivo General 7 2.2 Objetivos Específicos 7 2.3 Diseño Experimental 8

3. MATERIALES Y METODOS 10

3.1 Reactivos y Anticuerpos 10 3.2 Células 10 3.3 Transfección Transitoria y Plasmidios 11

3.4 PCR en Tiempo Real 12 3.5 Ensayo de Gen Reportero Luciferasa 13 3.6 Inmunoblot 14

iv

3.7 Citometría de Flujo 15 3.8 Estadística 16

4. RESULTADOS 17

4.1 Los glucocorticoides revierten la inducción de la expresión del mRNA de TLR4 inducido por TNFα 17

4.2 Los glucocorticoides modulan el efecto de TNFα sobre la actividad transcripcional del promotor del TLR4 21

4.2.1 Análisis bioinformático de los elementos de respuesta putativos del promotor de TLR4 murino 21

4.2.2 Glucocorticoides contrarrestan el efecto de TNFα sobre la actividad del promotor de TLR4 22 4.3 Los glucocorticoides revierten el aumento de la expresión

de TLR4 a nivel proteico inducida por TNFα 24

4.3.1 Dexametasona antagoniza la inducción de TLR4 mediada por TNFα a nivel de proteína total 24

4.3.2 Efecto de glucocorticoides sobre la expresión del TLR4 a nivel de superficie inducida por TNFα 26

5. DISCUSION 28

5.1 Efecto de TNFα y Dexametasona sobre la expresión del mRNA de TLR4 en células A549 28

5.2 Efecto de TNFα sobre la actividad transcripcional del promotor del TLR4 en presencia o ausencia de Dexametasona 29

5.3 Efecto de los glucocorticoides sobre la expresión de la proteína de TLR4 inducida por TNFα 30

5.4 Regulación de la expresión de TLR4 por glucocorticoides inducida por TNFα 31

6. CONCLUSIONES 33 7. REFERENCIAS 34

8. ANEXO 38

v

INDICE DE FIGURAS

Página Figura 1. Curva estándar de PCR en Tiempo Real para TLR4 y diagrama del plasmidio pCMV-Flag-hTLR4. 18 Figura 2. Curva estándar de PCR en Tiempo Real para G3DP. 19 Figura 3. Dexametasona revierte el efecto de TNFα sobre la expresión del mRNA de TLR4. 20

Figura 4. Promotor de TLR4 murino. 21 Figura 5. Actividad transcripcional del promotor de TLR4. 23 Figura 6. Curso temporal de la expresión de TLR4 inducido por TNFα. 25 Figura 7. Curso temporal de la expresión de TLR4 total en células expuestas a Dexametasona. 25 Figura 8. Los glucocorticoides revierten el efecto inductor de TNFα sobre a la expresión de la proteína de TLR4. 26

Figura 9. Expresión de TLR4 en la membrana plasmática de células epiteliales humanas. 27

Figura 10. Modelo de la regulación de la expresión de TLR4 por glucocorticoides inducida por TNFα. 32

vi

ABREVIATURAS A549: Línea celular, derivada de un adenocarcinoma de pulmón ACTH: Hormona adrenocorticotropina AP-1: Factor de transcripción Proteína activadora 1 CD14: Co-receptor de LPS C3H/HeJ y C57BL/10ScCr: Cepas Murinas Mutantes del gen de tlr4 Dex: Dexametasona DEPC: Dietilpirocarbonato DMEM: Medio de cultivo celular (Dulbecco´s modified Eagle´s médium) DNA: Acido desoxirribonucleico dNTPs: deoxinuleosidos trifosfatos mRNA: RNA mensajero DTT: Ditiotreitol EDTA: Acido dietilendiamintetraacetico ERK: Quinasa reguladas por señales extracelulares F12: Medio de cultivo celular FBS: Suero fetal bovino G3DP: Gliceraldehido-3-fosfo deshidrogenasa GCs: Glucocorticoides GR: Receptor de glucocorticoides GRE: Elemento de respuesta a glucocorticoides HPA: Eje Hipotálamo-Hipófisis-Glándula adrenal hsp: Proteínas de shock térmico IL-x: Interleuquinas INF-β: Interfreron β IκB: Proteína inhibidora κappa B LBP: Proteína de unión a LPS LDB: Tampón de baja concentración de detergente LPS: Lipopolisacarido LRRs: Repeticiones ricas en Leucina MD-2: Proteína de unión al dominio extracelular de TLR4 MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad MyD88: Proteína 88 de diferenciación mieloide NFκB: Factor nuclear κappa B Oligo(dT): Partidor inespecífico poli-T(15) PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos PCR: Reacción de polimerasa en cadena PBS: Tampón salino a base de fosfato phRL: Plasmidio control de transfección con el gen de Renilla pGL3: Plasmidio básico de clonamiento PRRs: Receptores de reconocimiento de patrones SDS: Dodecil sulfato de sodio STAT1: Factor transcripcional de la señal transductora y activadora transcripcional RLU: Unidad Relativa de Luciferasa RRU: Unidad Relativa de Renilla RT: Transcripción reversa TBS: Tampón salino a base de Tris TIRAP: Proteína adaptadora que contiene dominio TIR TIR: Dominio intracelular, homologo al receptor de IL-1 y de TLR TLRs: Receptores tipo Toll TNFα: Factor de necrosis tumoral α TRIF: Molécula Adaptadora que contiene un dominio TIR y que induce INF-β

vii

RESUMEN

Durante la inflamación de las mucosas, las células epiteliales y los macrófagos

expresan el receptor de tipo Toll 4 (TLR4) y secretan citoquinas, las que potencian el

cuadro. Sin embargo, hasta ahora existe escasa información acerca de la regulación

de la expresión de TLR4 por la combinación de moléculas pro-inflamatorias y anti-

inflamatorias.

Utilizando la línea celular de epitelio pulmonar, las células A549, se evaluó la

expresión del TLR4 a nivel de transcrito, proteína y actividad transcripcional de

mutantes con deleciones en la región promotora del receptor, posterior a la exposición

al factor de necrosis tumoral α (TNFα) en presencia o ausencia del glucocorticoide

sintético Dexametasona (Dex), mediante PCR en tiempo real, inmunoblot o citometría

de flujo, y ensayos del gen reportero luciferasa, respectivamente.

El aumento de la expresión de TLR4 inducido por TNFα, tanto a nivel del

mRNA como de la proteína, es revertido por la adición de Dex. La regulación de la

actividad transcripcional del promotor de TLR4 por estas moléculas fue similar a la

observada a nivel de proteína, y el efecto inhibitorio de Dex estaría comandado por al

menos un elemento de respuesta del receptor de glucocorticoides, GR (GRE).

En conjunto, estos resultados demuestran un efecto antagónico de

Dexametasona sobre la expresión de TLR4 inducida por TNFα, aparentemente por un

mecanismo que involucra al menos la regulación de GR a nivel del promotor de TLR4.

Se evidenció claramente en estas células los fuertes efectos antagónicos que ejercen

sobre la expresión de TLR4, moléculas pro-inflamatorias como es TNFα y anti-

inflamatorias como los glucocorticoides.

viii

ABSTRACT

“Regulation of The Toll-Like Receptor 4 expression by Tumor Necrosis Factor α and Dexamethasone”

During mucosal inflammation, epithelial cells and macrophages express TLR4

as well as cytokines that might induce its expression. Up to now, there is scarce

information about TLR4 regulation by the combination of pro-inflammatory and anti-

inflammatory molecules.

We used A549 cell line derived from lung epithelium treated with Tumor

necrosis factor alpha TNFα, in the presence or absence of the synthetic glucocorticoid

Dexamethasone (Dex). TLR4 expression was assessed at the transcript and protein

levels by real-time PCR, immuneblot or flow cytometry, respectively, as well as

evaluating the transcriptional activity of promoter deletion mutants by the luciferase

reporter assay.

The increase in TLR4 protein and mRNA levels upon TNFα exposure was

reverted by Dex. This effect may be mediated by the glucocortocoid receptor, GR.

Analysis of transcriptional activity indicate that at least one GR response element

(GRE) is required for the inhibitory effects of Dex over the TNFα response.

Taken together, these results indicate that there is an antagonist effect of TNFα

and Dex at the TLR4 expression. The strong effect of pro-inflammatory as TNFα and

anti-inflammatory as Dex is clearly evidenced in this cell line.

ix

1. INTRODUCCIÓN 1.1 Sistema Inmune El sistema inmune comprende la respuesta inmune innata y adquirida, ambas

integradas por un conjunto de células y moléculas con roles especializados en la

defensa contra infecciones provocadas por agentes patógenos, que difieren en cuanto

a su estructura y funcionalidad, respectivamente (1). El sistema inmune innato

corresponde a la primera barrera defensiva física, tal como la piel y las mucosas, y

está integrado por células, tales como basófilos, eosinófilos, y natural killer, y otras con

función fagocítica, tales como neutrófilos, monocitos y macrófagos, o de barrera física

como las células epiteliales. Estas células producen mediadores inflamatorios, como

las citoquinas que modulan la respuesta inmune innata (2), sumado a otros

componentes moleculares tales como el sistema del complemento (3).

Por otra parte, la respuesta inmune adaptativa esta constituida por dos clases

de células especializadas, los linfocitos T y los linfocitos B, que despliegan un único

receptor producido somáticamente durante el desarrollo celular, aportando una amplia

diversidad en su repertorio de reconocimiento de antígenos, a diferencia de la

inmunidad innata, mediada por receptores codificados por líneas germinales y de

especificidad predeterminada genéticamente (1, 4).

El sistema inmune innato es activado inmediatamente después de la invasión

de un patógeno, el cual interactúa posteriormente con el sistema inmune adaptativo,

para inducir una expansión clonal de sus tipos celulares (5).

1

Los receptores de los linfocitos reconocen a su ligando, mediado por células

presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas o macrófagos, las que

exponen péptidos derivados del patógeno previamente procesado, en el contexto del

complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), modulando y controlando la activación

de la respuesta inmune adaptativa (6).

En la fase inicial del reconocimiento de los patógenos participan receptores

especializados para censarlos, centrándose el trabajo de esta memoria en la

regulación de uno de los participantes este evento crucial de activación de la

respuesta inmune innata.

1.2 Receptores de Reconocimiento de Patógenos

Los receptores de reconocimiento de patrones (Pattern Recognition Receptors,

PRRs) identifican patrones moleculares asociados a patógenos (Pathogen-Associated

Molecular Patterns, PAMPs), los cuales corresponden a motivos conservados

esenciales para la sobrevida y patogenicidad del microorganismo (7).

Un tipo de PRRs son aquellos que activan vías de transducción intracelulares o

señalizadores, que conducen a la expresión de una variedad de genes de la respuesta

inmune, incluyendo citoquinas pro-inflamatorias. Destaca entre estos PRRs la familia

de los Receptores de tipo Toll (TLRs), homólogos a los Toll de Drosophila (8),

identificados a inicios de la década de los 90 y vinculados con el desarrollo

embrionario dorso-ventral y posteriormente por su papel determinante en la respuesta

inmune contra infecciones fúngicas (9).

2

1.3 Receptores Tipo Toll (TLRs)

Los TLRs son receptores de transmembrana de tipo I que juegan un papel

clave en la respuesta inmune innata (10), representando la primera línea de defensa

contra patógenos. Los TLRs poseen un dominio intracelular TIR (homólogo al del

receptor de IL-1, Toll/IL-1R), crucial en la activación de la vía de señalización, y un

dominio extracelular, que contiene repeticiones ricas en leucina (Leucine Rich

Repeats, LRR) involucradas en el reconocimiento de los PAMPs (11). Hasta el

momento, 11 TLRs han sido identificados en humanos y 13 en ratón los que, de

acuerdo al patógeno que reconocen, se pueden agrupar en dos categorías: TLRs de

PAMPs bacterianos (TLR2, 4 y 5) o virales (TLR3, 7/8 y 9), los que se localizan

principalmente en la superficie celular o requieren su internalización a compartimientos

endosomales, respectivamente (12).

Este trabajo se ha centrado en el estudio de la regulación de la expresión de un

integrante de esta familia de receptores, el TLR4, que reconoce el lipopolisacárido

(LPS), un componente glicolipídico de la membrana externa de bacterias gram-

negativas (13).

La resistencia al shock endotóxico que poseen los ratones C3H/HeJ y

C57BL/10ScCr es consecuencia de una mutación en el gen tlr4, que disminuye la

respuesta a LPS (14). Para la unión del ligando, el TLR4 requiere de otras moléculas

adicionales: inicialmente el LPS se une a una proteína presente en el suero (LBP;

Lipopolysaccharide-Binding Protein), y posteriormente son reconocidas por el receptor

CD14 que está anclado a la membrana por glucosilfosfatidilinositol. EL CD14 se

expresa en forma preferencial en monocitos, macrófagos y neutrófilos. Adicionalmente,

a este complejo se incorpora a la proteína secretada MD-2, que se asocia con la

porción extracelular del TLR4, estabilizando el complejo y la respuesta pro-inflamatoria

3

a LPS (15). La vía de señalización del receptor TLR4 se inicia en el dominio TIR, por la

asociación de moléculas adaptadoras, tales como: MyD88 (myeloid differentiation

primary response protein 88), TIRAP (TIR domain-contanining adaptor protein) y TRIF

(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β), activando factores de transcripción,

tales como NFκB (Factor Nuclear κappa B) (16), y conduciendo a la producción de

mediadores pro-inflamatorios, tales como TNFα (Factor de Necrosis Tumoral α), IL-12

(Interleuquina -12) (17; 18).

El TNFα, que en su forma soluble pesa 17 KDa, aumenta la expresión del gen

tlr4, mediante un mecanismo que involucra la unión a su receptor de membrana

plasmática, desencadenando una cascada de señales intracelulares que activan a

NFκB y la Proteína Activadora 1 (AP-1), aumentando la producción de citoquinas pro-

inflamatorias y de TLR4 (19).

1.4 Glucocorticoides y el Sistema Inmune

Las hormonas esteroidales han sido reconocidas como moléculas moduladoras

de diversos procesos celulares esenciales, tales como transducción de señales,

comunicación intercelular y metabolismo intermedio de carbohidratos, proteínas y

lípidos, regulando la glicemia, y el procesamiento de aminoácidos y ácidos grasos

libres, entre otros (20). Los glucocorticoides (GCs) son sintetizados en la zona

fasciculada/reticulada de la corteza adrenal y liberados a la circulación en respuesta a

estímulos estresantes. La secreción de los GCs es activada por el eje hipotálamo-

hipófisis-glándula adrenal (HPA), mediante la secreción hipotalámica de la hormona

liberadora de corticotropina (CRH), que activa la liberación de la hormona

adrenocorticotropina (ACTH) hipofisiaria, la cual finalmente, activa receptores

específicos en la glándula adrenal que inducen la secreción de cortisol (21).

4

Los GCs circulan en el plasma asociados a moléculas transportadoras, tales

como la globulina y la albúmina, que unen ligandos endógenos y/o sintéticos,

respectivamente (22). Los GCs regulan la función del sistema cardiovascular, tal como

la tensión vascular, y nervioso central, protegiendo al cerebro de las respuestas

inmune descontroladas, disminuyendo la expresión de moléculas de la inmunidad

adaptativa (23; 24).

Los GCs son moléculas lipofílicas que atraviesan la membrana celular

mediante difusión simple y se unen a un receptor citoplasmático (GR), translocándose

posteriormente al núcleo, donde el complejo hormona-receptor interacciona con una

región conservada dentro de promotores de determinados genes, los elemento de

respuesta a glucocorticoides (GRE) (25). Dependiendo de la composición de bases del

GRE, este puede ser activador o represor, y además del tipo celular en que se

encuentre, activa la expresión de genes, tales como el de IκB (proteína inhibidora IκB)

que inhibe la actividad transcripcional de NFκB. Mediante la interacción entre ambas

proteínas, IκB mantiene secuestrado a NFκB en el citoplasma, impidiendo su

translocación al núcleo (26). En ausencia de GCs, el GR se encuentra inactivo en el

citoplasma asociado a proteínas de shock térmico 56, 70 y 90 (hsp56, hsp70 y hsp90),

presentando una gran afinidad por el ligando (27).

Dada su propiedad anti-inflamatoria (28; 29), se han desarrollado GCs

sintéticos, tales como la Dexametasona (Dex), utilizados en el área clínica, para el

tratamiento de una amplia gama de patologías relacionadas con procesos

inflamatorios, tales como Lupus Eritematoso Sistémico, Enfermedad Inflamatoria

Intestinal, Psoriasis, Asma y Artritis Reumatoidea, entre otras (30).

5

1.5 Regulación de la expresión de TLR4 por moléculas pro- y anti-inflamatorias

La expresión de los TLRs puede ser modulada por diversos factores

involucrados en vías pro- o anti-inflamatorias, tales como citoquinas y GCs,

respectivamente. Estudios recientes con uno de los integrantes de la familia de los

TLRs, el TLR2, indican que el GC sintético Dexametasona, en combinación con TNFα,

aumenta sinérgicamente la expresión inducida por la citoquina, en células de epitelio

pulmonar (31). Estos resultados proponen mecanismos de acción de los GCs en la

respuesta inmune innata, que clásicamente han sido vinculados con la inhibición de la

expresión de moléculas de la inmunidad adaptativa (32).

Hasta la fecha, no existen evidencias sobre el efecto conjunto de los estímulos

antagónicos anteriormente citados, sobre la expresión y función del TLR4, tanto a nivel

genético como de la proteína. Por esta razón, en esta memoria se estudió el papel que

ejercen los GCs sobre la expresión de TLR4 inducida por TNFα.

Conociéndose los cambios en la expresión del gen tlr4, que ocurren en

respuesta a la combinación de TNFα y Dexametasona, se podrían estructurar mejores

tratamientos para diversas patologías que cursan con un cuadro inflamatorio en

respuesta a infecciones gram-negativas, tales como shock séptico (33; 34). En este

trabajo en particular, se utilizó el modelo celular de epitelio pulmonar humano (células

A549), que expresa tanto el TLR4 como el GR, como una aproximación experimental

al estudio de patologías respiratorias donde el componente bacteriano tienen un papel

central en ellas (35).

6

2. HIPÓTESIS

En base a los antecedentes indicados, surge el interés de evaluar la regulación

de la expresión del TLR4, dada su relevancia dentro del sistema inmune innato, por lo

que planteamos la siguiente hipótesis en esta memoria para optar al título de

Bioquímico:

“El Factor de Necrosis Tumoral α y los Glucocorticoides regulan

antagónicamente la expresión del Receptor Tipo Toll 4 en células de

epitelio pulmonar humano”

2.1 Objetivo General

Determinar el efecto del TNFα en presencia o ausencia de glucocorticoides

sobre la expresión del Receptor tipo Toll 4 (TLR4) en células de epitelio pulmonar.

2.2 Objetivos Específicos 1. Determinar el efecto de TNFα en presencia o ausencia del glucocorticoide

sintético Dexametasona, sobre la expresión del mRNA del TLR4 en una línea celular

de epitelio pulmonar humano, las células A549.

2. Evaluar el efecto de TNFα sobre la actividad transcripcional del promotor del

TLR4, en presencia o ausencia de Dexametasona, en células A549.

3. Determinar la expresión de la proteína total y de superficie del TLR4 en

células A549 expuestas a TNFα en presencia o ausencia de Dexametasona.

7

2.3 Diseño Experimental

Para desarrollar el objetivo específico 1: “Determinar el efecto de TNFα en

presencia o ausencia del glucocorticoide sintético Dexametasona (Dex), sobre la

expresión del mRNA del TLR4 en una línea celular de epitelio pulmonar humano,

las células A549”.

Se evaluó la expresión del transcrito de TLR4 por PCR en tiempo real, para lo

cual se confeccionó en primer lugar la curva estándar para TLR4, utilizando un

plasmidio que contiene la secuencia codificante para TLR4 humano (pCMV-Flag-

hTLR4). La expresión del mRNA de TLR4 se normalizó con el gen constitutivo

gliceraldehido 3-fosfo deshidrogenasa (G3DP). Para determinar la expresión del

transcrito de G3DP se generó una curva estándar con el producto amplificado a través

de una PCR convencional con partidores específicos. Para ello, se determinó la

concentración del amplicón de G3DP en un gel de agarosa mediante análisis

densitométrico de las bandas obtenidas en relación al estándar de peso molecular.

Posteriormente se determinó la expresión del mRNA de TLR4 y de G3DP con

los programas de PCR y partidores específicos, previamente definidas. Los resultados

del producto amplificado y su cuantificación se realizaron a través del programa

Opticon Monitor 3.

Para desarrollar el objetivo específico 2: “Evaluar el efecto de TNFα sobre la

actividad transcripcional del promotor del TLR4, en presencia o ausencia de

Dexametasona en células A549”.

Se abordó siguiendo las estrategias experimentales que se indican a

continuación:

8

a) Diseñar un diagrama teórico de los sitios de unión putativos de los factores

de transcripción presentes en la región del promotor del gen tlr4. Para ello, se

utilizaron los programas Genomatix y TFsearch de acceso en

http://www.genomatix.de/index.html y http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html,

respectivamente, que aplican algoritmos determinados con valores variables para

identificar cada uno de los elementos o dominios.

b) Expresar transitoriamente el vector pGL3 que posee el gen reportero

Luciferasa y el DNA del promotor de TLR4, de 2715 pb (pGL3-2715) o una serie de

deleciones del mismo (pGL3-1864, -1183, -336 y -144 bp) y el plasmidio control de

transfección con el gen de Renilla (phRL) en las células A549. Para ello, las células

fueron transfectadas con cada uno de estos constructos por separado y

posteriormente se estimularon con TNFα en presencia o ausencia de Dexametasona.

Posteriormente, se determinó la actividad de luciferasa (unidades relativas de

luciferasa, relative luciferase units; RLU) y renilla (unidades relativas de renilla, relative

renilla units; RRU), utilizando un Luminómetro de placa (TopCount NXT, PerkinElmer,

USA); la razón entre RLU/RRU fue proporcional a la actividad transcripcional de TLR4.

Para desarrollar el objetivo específico 3: “Determinar la expresión de la

proteína total y de superficie del TLR4 en células A549 expuestas a TNFα en

presencia o ausencia de Dexametasona”.

Se determinó la expresión de la proteína de TLR4 mediante inmunoblot de

extractos proteicos totales de células A549 expuestas a TNFα en presencia y ausencia

de Dexametasona.

Además, se determinó la expresión superficial de la proteína de TLR4, en

células expuestas a los estímulos de estudio, mediante citometría de flujo.

9

3. MATERIALES y MÉTODOS

3.1 Reactivos y Anticuerpos

TNFα recombinante humano proviene de R&D Systems; Dexametasona

obtenida de Steraloids (Wilton, NH, USA), SYBR Green I Platinum SYBER Green

qPCR SuperMix UDG proviene de Invitrogen. Las enzimas Taq polimerasa y

Transcriptasa Reversa provienen de Promega, DNasa (Ambion). Para los ensayos de

gen reportero luciferasa se utilizó el kit Dual-Luciferase® Reporter Assay System de

Promega, Reactivo de Bradford (BioRad) para la cuantificación de proteínas. Para los

inmunoblots se contó con el anticuerpo anti-TLR4 humano, en tanto que para la

citometría de flujo, con el anticuerpo conjugado anti-TLR4-PE, ambos producidos en

eBioscience (San Diego, CA, USA). Se usaron además anticuerpos secundarios

conjugados con peroxidasa y el reactivo quimio-luminiscente ECL, generados por la

empresa Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA).

3.2 Células

El modelo utilizado fue la línea celular A549 proveniente de un adenocarcinoma

pulmonar, las cuales expresan TLR4 y el receptor de GC (31). Las células se

cultivaron en medio DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium)/F12 (1:1)

suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB), 100 IU de penicilina por ml y 100

mg/ml de estreptomicina (Pen/Str), el que fue cambiado cada 48 horas. Los cultivos

celulares fueron mantenidos en una incubadora a 37ºC con 5% de CO2 y atmósfera

humedecida.

10

3.3 Transfección Transitoria y Plasmidios

Las transfecciones se realizaron con el reactivo Fugene® (lípido catiónico)

según especifica el fabricante (Roche, Indianapolis, IN, USA). En primer lugar, se

realizó una mezcla que incluyó: Optimen, el plasmidio conteniendo las diferentes

construcciones del promotor del TLR4, el plasmidio control de transfección con el gen

de Renilla (phRL) y Fugene, incubados por 40 min (para permitir la formación óptima

de las micelas con el lípido y los DNA). Luego se agregó la mezcla a las células,

estimulándolas a las 24 horas con TNFα en presencia o ausencia de Dex.

Finalmente, luego de 24 horas con los estímulos, los lisados celulares de cada

condición se exponen al sustrato de la luciferasa (luciferina), cuyo metabolito es

identificado con un Luminómetro de placa (TopCount NXT, PerkinElmer, USA).

Para estandarizar las condiciones de los ensayos de PCR en tiempo real, se

utilizó el plasmidio pCMV-Tag1 que contiene la secuencia codificante para TLR4

(TLR4-Flag; donado por el Dr. Mantovani) (36).

Para los experimentos de actividad transcripcional se contó con el plasmidio

pGL3-Vector Basic que contiene el gen reportero luciferasa, y donde se han insertado

las deleciones del promotor de TLR4 (pGL3-2715, -1864, -1183, -336y -144 bp),

donados por el Dr. Thierry Roger (Universidad de Vaudois, Suiza) (37). Como control

de transfección se utilizó el vector pGL3-hRL, que codifica para la enzima luciferasa de

Renilla reniformes (renilla reporter vectors; Promega Corp., Madison, WI).

Se utilizaron además plasmidios controles para cada estímulo, como el vector

3xMHC-Luc (que posee tres sitios de unión a NFκB, correspondiente al promotor del

complejo mayor de histocompatibilidad humano y que codifica para la enzima

luciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis) para determinar la actividad transcripcional

de NFκB, activada a través de TNFα. Además del vector MMTV-Luc (38), generado en

el laboratorio del Dr. J.A. Cidlowski, que posee elementos de respuesta a

11

glucocorticoides (GREs), con la finalidad de determinar la actividad del factor

transcripcional del GR, inducido por dexametasona (39).

3.4 PCR en Tiempo Real

Se determinó la expresión del mRNA de TLR4 y del gen constitutivo G3DP por

medio de la técnica PCR en Tiempo Real, donde la detección por fluorescencia mide

la cantidad de ADN sintetizado en cada momento de la reacción (40). La emisión de

fluorescencia producida en la reacción fue proporcional a la cantidad de ADN

amplificado. Como sistema de detección de fluorescencia se utilizó un agente

intercalante de ADN de doble hebra, denominado SYBR Green I Platinum SYBER

Green qPCR SuperMix UDG (SYBR Green I, 60 U/ml Platinum Taq DNA polymerase,

40 mM Tris-HCl pH 4.8 ,100 mM KCl, 6 mM MgCl2, 400 μM dGTP, 400 μM dATP, 400

μM dCTP, 400 μM dUTP, 40 U/ml UDG, and stabilizers) Invitrogen.

Para la obtención de RNA total de las células A549 se utilizó el método de

extracción de Trizol, de acuerdo a protocolos del fabricante. Las células se lisaron y

sometieron a centrifugación con cloroformo. Se recuperó la fase acuosa y el RNA se

precipitó con isopropanol. El precipitado de RNA obtenido de la centrifugación se lavó

con etanol y luego se resuspendió en 30 µl de agua tratada con dietilpirocarbonato

(DEPC). El RNA extraído fue tratado con DNasa y se determinó la concentración por

absorbancia a 260 nm.

En la trascripción reversa se utilizó 5 μg de RNA total, tampón transcriptasa

reversa 5X, partidor inespecífico oligo(dT) (500 μg/ml), deoxinucleosidos trifosfatos

(dNTP) 10 mM, 50 U de M-MLV Reverse Transcriptase. La denaturación inicial de las

estructuras secundarias del RNA se realizó a 72ºC por 10 minutos, seguido por el

12

alineamiento y transcripción del templado a 42ºC, durante 50 minutos. La temperatura

posteriormente se elevó a 72ºC por 10 minutos para inactivar la RT.

Cada reacción individual de PCR en tiempo real se realizó para un volumen

final de 25 μl, conteniendo 12,5 μl de Platinum SYBER Green qPCR SuperMix UDG, 1

μl de cada partidor específico (10 μM) tanto para TLR4 5`-TAC GTT TCC TTA TAA

GTG TCT GA-3` (sense) y 5`-TTA TCT GAA GGT GTT GCA CAT TCC-3` (antisense)

como para G3DP 5’-CGG ATT TGG TCG TAT TGG G-3’ (sense) y 5’-CAC AGT CTT

CTG GGT GGC-3’ (antisense), 8,5 μl de H2O y 2 μl de muestra.

El programa de PCR para TLR4 consiste en una primera etapa de activación a

95ºC por 10 minutos, luego a 94ºC por 15 segundos (denaturación), el alineamiento a

53ºC por 20 segundos y la elongación a 72ºC por 30 segundos, por 40 ciclos esta

primera etapa. Luego se realizó la curva de disociación, donde se incubó a 72ºC por

10 minutos, realizándose un gradiente de temperatura hasta los 92ºC, con una lectura

de la caída de la luminiscencia cada 0,2ºC, incubándose el producto restante a 20ºC,

lo mismo se hizo para el gen constitutivo G3DP donde el programa de PCR fue de 1

ciclo de 95ºC por 10 minutos, 40 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 59ºC por 30

segundos y 72ºC por 30 segundos, realizándose finalmente la respectiva curva de

disociación, utilizándose el termociclador Chromo4™ Multicolor Real-Time PCR

Detection System (MJ Research). El análisis de los resultados del producto

amplificado y su cuantificación se realizaron a través del programa Opticon Monitor 3.

3.5 Ensayo de Gen Reportero Luciferasa

Las transfecciones fueron realizadas con el reactivo Fugene® (Roche,

Indianapolis, IN, USA), donde en primer lugar, se subcultivaron células A549 hasta

obtener un 70% de confluencia. Al segundo día, se cambió el medio de mantención

13

DMEN/F12, 5% SFB, Pen/Str por el medio de transfección OPTIMEM (Life Sciences,

Inc., St. Petersburg, FL, USA).

La transfección se inicia con la preparación de la mezcla de 200 µl de

Optimen/ml de medio, 2 µg de DNA y 5 µl de Fugene®/1 µg de DNA, que se incubó

por 40 minutos a temperatura ambiente y se aplicó en los pocillos suavemente,

manteniéndose a 37ºC por 24 horas. Al tercer día, se repuso el medio de cultivo

DMEM/F12, 5%SFB, Pen/Str y se realizaron los respectivos tratamientos.

Para la determinación de la actividad transcripcional de TLR4, las células

fueron cultivadas y posteriormente transfectadas con alguno de los constructos del

promotor de TLR4-Luc y phRL (que contiene el gen reportero Renilla como control de

transfección). A las 24 horas siguientes a la estimulación con TNFα en presencia o

ausencia de Dexametasona, se determinó la actividad de luciferasa utilizando un

luminómetro de placa (TopCount NXT PerkinElmer, USA). Los resultados se

expresaron como la inducción/inhibición relativa de la actividad luciferasa, que

corresponde a la razón entre los valores absolutos de luciferasa y de renilla (phRL), y

estos normalizados a la condición control.

3.6 Inmunoblot

Para realizar los inmunoblots se utilizaron 1x106 células por ml, las que fueron

tratadas con TNFα, en presencia o ausencia de Dexametasona. Posteriormente, se

removió el medio y las células se lavaron con PBS 1% y se lisaron en un tampón LDB

(LDB: low detergent buffer, cuya composición en mM es: 20 Tris-HCl, pH 7.5, 2 EDTA,

150 NaCl, y 0.5% Triton X-100, tabletas de inhibidores de proteasas (Roche®) e

inhibidores de fosfatasas (100 nM de ortovanadato de sodio, pirofosfato de sodio y

14

fluoruro de sodio), para luego ser homogenizadas con un sonicador de vástago

(Microson) a 14 Watts por 10 segundos.

La concentración de proteínas fue determinada con el método de Bradford

utilizando el reactivo de Bio-Rad, siguiendo las especificaciones del fabricante (Bio-

Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). A una cantidad equivalente de proteínas

se le agregó tampón de muestra conteniendo SDS y β-mercaptoetanol, para luego ser

denaturadas por calor (5 minutos a 100ºC). Posteriormente, 80 μg de proteína de cada

muestra se cargaron y corrieron en un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) al

10%, utilizando la solución de tampones para la porción concentradora y separadora

del gel descrita por Laemmli (41). Las proteínas fueron transferidas a una membrana

de nitrocelulosa y, luego, teñidas con una solución de rojo Ponceau S al 1%. La

membrana se lavó con una solución de TBS-Tween-20 0,1% (5M NaCl, 1M Tris/HCl

pH 7,5 y 0,1% Tween-20) y fue bloqueada toda la noche con leche descremada al 5%

en TBS-Tween-20 al 0,1%. La membrana se incubó con los anticuerpos primarios y

secundarios diluidos en TBS-Tween-20 al 0,1% por 2 y 1 hora, respectivamente,

lavándose la membrana con TBS-Tween-20 0,1% por 30 minutos entre y después de

la incubación con los anticuerpos. Finalmente, se reveló la membrana con el reactivo

quimio-luminiscente ECL de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA). El

análisis densitométrico de las bandas inmunoreactivas fue realizado con el software

Gel Pro Analyzer 4.0 de MediaCybernetics, Inc.

3.7 Citometría de Flujo

Para determinar la expresión de TLR4 en la superficie de células A549

estimuladas con TNFα y Dexametasona, se utilizaron 5x105 células en placas de 6

15

cm. Las cuales fueron estimuladas durante 24 horas y posteriormente recuperadas

con una solución de EDTA 25 mM en PBS y recolectadas con PBS.

Las células se lavaron 2 veces con una solución de PBS y luego se incubaron

por 30 minutos con PBS conteniendo 10% suero de ratón (PBS/SR), con el propósito

de bloquear los sitios de unión inespecífica. Luego, las células se lavaron con PBS/SR

y se agregó el anticuerpo anti-TLR4-PE también diluido en PBS/SR, usando 40 µl por

cada 106 células y se incubó en oscuridad a 4ºC por una hora. Finalizada la

incubación, las células se lavaron dos veces con la solución de PBS. Luego de lavar,

las células se fijaron en p-formaldehído al 2% diluido en PBS.

Las muestras se adquirieron en un citómetro FACSort (Becton Dickinson) y se

analizaron usando el programa WinMD versión 2.9. Los análisis se realizaron con al

menos 10.000 eventos a partir de la población total y se determinó el porcentaje de

células que expresan TLR4 dentro de esta población. Todos lo datos fueron corregidos

por los controles de autofluorescencia y por la unión inespecífica de anticuerpos de

isotipo adecuados.

3.8 Estadística

Todos los pares de grupos tratados con ambos estímulos, en conjunto y por

separado, como también las células transfectadas con los distintos constructos fueron

comparados con Mann-Whitney test. Al menos tres experimentos independientes

fueron realizados y las muestras fueron significativas cuando *, p < 0,05. Los análisis

fueron realizados con el programa GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc).

16

4. RESULTADOS

4.1 Los glucocorticoides revierten la inducción de la expresión del mRNA de TLR4 inducido por TNFα

El efecto de TNFα en presencia o ausencia de Dexametasona sobre la

expresión del mRNA de TLR4 en células A549, se evaluó a través de PCR en tiempo

real. El sistema de detección utilizado comprende la medición de la fluorescencia

emitida por un fluoróforo que se intercala en el DNA de doble hebra, SYBR Green I,

que emite a una longitud de onda de 520 nm (42).

Para la estandarización de la PCR en tiempo real para TLR4 se confeccionó

una curva estándar, utilizando diluciones seriadas del plasmidio pCMV-Flag que

contiene la secuencia codificante para TLR4 (pCMV-Flag-hTLR4), entre 10 ng y 1 fg. A

partir del ensayo de PCR se obtuvo la ecuación y pendiente en base al Ct o ciclo

umbral de cada reacción (Figura 1). El Ct corresponde al punto de intersección de la

curva de amplificación de cada producto con la línea base de detección que fija el

propio programa, detectando con ello el ciclo donde se inicia el aumento significativo

de la fluorescencia, siendo esto inversamente proporcional a la cantidad de ADN inicial

de tenía cada muestra (43).

17

a) b)

y = -0,2944x + 5,7936R2 = 0,9956

0

1

2

3

4

5

6

3 6 9 12 15 18 2

C(t) Cycle

Log

Qua

ntity

1

Figura 1. Curva estándar de PCR en Tiempo Real para TLR4 y diagrama del plasmidio pCMV-Flag-hTLR4. (a) Curva estándar y ecuación de la recta para TLR4, donde se interpolaron los Ct de los tratamientos con los diferentes estímulos, determinando la concentración del mRNA de TLR4. (b) Estructura del plasmidio pCMV-Flag-hTLR4, que posee la secuencia codificante para TLR4, y fue el que se utilizó para realizar la curva estándar.

Para confeccionar la curva estándar de G3DP en PCR en tiempo real, se

realizó primero un PCR semicuantitativo con los partidores específicos y el producto

amplificado se corrió en un gel de agarosa. La banda del producto amplificado se

cuantificó por análisis densitométrico, y se determinó su concentración con respecto al

estándar de peso molecular y así obtener la curva estándar de G3DP (Figura 2).

Interpolando en ella los Ct de las diferentes condiciones, es posible determinar la

expresión del mRNA de G3DP y así normalizar los valores de expresión de TLR4 con

respecto a este gen.

18

y = -0,3288x + 8,5161R2 = 0,9993

01234567

8 11 14 17 20 23 26

C(t) Cycle

Log

Qua

ntity

Figura 2. Curva estándar de PCR en Tiempo Real para G3DP. Curva estándar y ecuación de la recta para G3DP, obtenida a través de PCR en tiempo real.

Una vez definidas las condiciones de trabajo para el PCR en tiempo real, se

determinó el efecto de TNFα y Dexametasona sobre la expresión del mRNA de TLR4.

Para ello, las células A549 fueron estimuladas con TNFα (10 ng/ml) en presencia o

ausencia de Dexametasona (100 nM) por 6 hrs., para luego extraer el RNA total de las

células, el cual se trató con DNasa, se cuantificó y se obtuvo el cDNA mediante la

reacción de transcriptasa reversa (RT). EL cDNA, se utilizó para la PCR en tiempo real

amplificando el TLR4 con los partidores específicos.

En la Figura 3 se observa que el TNFα aumentó significativamente la expresión

del mRNA de TLR4, con respecto al control. El estímulo con Dexametasona no

modificó la expresión de TLR4 con respecto al control. En cuanto a la co-estimulación

con ambas moléculas, Dexametasona revirtió significativamente el efecto de TNFα,

aportando una primera evidencia relacionada al efecto de los GCs sobre la expresión

del mRNA de TLR4 inducido por TNFα.

19

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

TNFαControl Dex TNFα+Dex

Indu

cció

n (m

RN

A T

LR4/

G3D

P)* *

Figura 3. Dexametasona revierte el efecto de TNFα sobre la expresión del mRNA de TLR4. La figura muestra la expresión del mRNA de TLR4 en células A549 tratadas con TNFα 10 ng/ml en presencia o ausencia de Dexametasona 100 nM por 6 hrs, cuantificada mediante PCR en tiempo real. Los datos fueron expresados como la media ± el error estándar (ES), n= tres experimentos independientes. El asterisco indica diferencias significativas entre los tratamientos (*, P < 0,05), análisis de comparación (Mann-Whitney test).

20

4.2 Los glucocorticoides modulan el efecto de TNFα sobre la actividad transcripcional del promotor del TLR4

4.2.1 Análisis bioinformático de los elementos de respuesta

putativos del promotor de TLR4 murino

Se diseñó un diagrama del promotor de TLR4 murino con los sitios de unión de

los diferentes factores de transcripción potencialmente involucrados en las rutas de

señalización de los estímulos utilizados en esta memoria, tales como AP-1, NFκB,

STAT1 y GR (Figura 4) (44; 45). Para identificar la posición de los sitios putativos de

interés en el promotor de TLR4, se usaron los programas computacionales Genomatix

y TFsearch, que aplican algoritmos determinados, según la base de datos que poseen

para los diferentes motivos consenso de los sitios de unión al promotor por parte de

los factores de transcripción.

Figura 4. Promotor de TLR4 murino El diagrama muestra los sitios de unión putativos para factores de transcripción potencialmente involucrados en las rutas de señalización de TNFα y Dexametasona. El número que aparece sobre cada sitio de unión indica la posición que ocupan en el promotor, río arriba con respecto al inicio de la transcripción (+1); Luc = Luciferasa. Se indican además, las diferentes deleciones de la construcción del promotor de TLR4 con el tamaño correspondiente en el extremo 5`.

21

4.2.2 Glucocorticoides contrarrestan el efecto de TNFα sobre

la actividad del promotor de TLR4 Los factores de transcripción, tales como NFκB, AP-1 e integrantes de la familia

STAT (46), forman parte de la ruta de señalización de TNFα en la regulación de la

transcripción de genes inflamatorios (47).

En este trabajo se evaluó el efecto de los GCs sobre la actividad transcripcional

del promotor de TLR4. Para ello se utilizaron distintas construcciones del promotor de

TLR4-Luc las que se transfectaron junto con el plasmidio control Renilla (pGL3-hRL)

en células A549, y se determinó posteriormente la expresión de los genes reporteros

luciferasa y renilla, siendo el primero un indicador de la activación transcripcional del

promotor de TLR4. En todos los experimentos se utilizaron las construcciones,

3xMHC-Luc y MMTV-Luc como controles para la respuesta a TNFα y Dexametasona,

respectivamente.

En la Figura 5 se muestra que TNFα induce la expresión de luciferasa de dos

de las deleciones del promotor de TLR4 (pGL3-2715 y pGL3-1864), mientras que

Dexametasona por si sola no la modificó. El co-tratamiento de Dexametasona con

TNFα revirtió la inducción de la expresión del gen reportero inducida por TNFα. Al

evaluar la expresión del reportero luciferasa en las deleciones del promotor pGL3-1183

y pGL3-336, TNFα no la modificó, tanto en presencia o en ausencia de

Dexametasona. Sin embargo, la actividad transcripcional de la deleción del promotor

de TLR4, pGL3-144, fue significativamente inducida con Dexametasona. En el inserto

de la Figura 5 se indican la activación de los plasmidios controles, 3xMHC-Luc y

MMTV-Luc, lo que sugiere que las células responden a los estímulos en estudio. Estos

resultados muestran que la regulación de la activación transcripcional de TLR4 por los

GCs involucra varios GREs descritos en el modelo teórico (Figura 4), sin embargo su

efecto activador o represor aun no se ha descrito (48).

22

2715 1864 1183 336 1440

2

4

ControlTNFαDEXTNFα+DEX

8

10

12

14

* *

*

* *

Deleciones de la Construcción del promotor de TLR4

Indu

cció

n R

elat

iva

de la

Act

ivid

ad L

ucife

rasa

p4-

Luc

CONTROL TNFα CONTROL DEX0

102030405060708090

3XMHC MMTV

Indu

cció

n R

elat

iva

de la

Act

ivid

ad L

ucife

rasa

TLR

Figura 5. Actividad transcripcional del promotor de TLR4. Las células A549 fueron co-transfectadas con las distintas construcciones del promotor de TLR4-Luc y con pGL3-hRL. Las células fueron tratadas por 24 horas con 10 ng/ml de TNFα, 100 nM de Dexametasona o la combinación de ambos, determinándose posteriormente la actividad de luciferasa utilizando un sustrato quimioluminiscente. Se consideraron aquellos experimentos donde se observó la inducción de la expresión de luciferasa de los vectores 3xMHC-Luc y MMTV-Luc para TNFα y Dexametasona, respectivamente (inserto). Las barras representan la razón entre las unidades de luciferasa (RLU) y las unidades de renilla (RRU) normalizadas al respectivo control. Todas las muestras fueron analizadas en duplicado y los valores significan ± S.E. de 3 experimentos. El asterisco indica diferencias significativas entre los tratamientos (*, P < 0,05), por análisis de comparación de pares (Mann-Whitney test) para cada condición control.

23

4.3. Los glucocorticoides revierten el aumento de la expresión de TLR4 a nivel proteico inducida por TNFα 4.3.1. Dexametasona antagoniza la inducción de TLR4 a nivel

de proteína total mediada por TNFα El paso siguiente fue evaluar la expresión de TLR4 a nivel de proteína total,

verificando si los cambios inducidos por TNFα y GC obedecen a lo observado a nivel

genómico.

La determinación de los cambios en la expresión de la proteína de TLR4 en

respuesta a los estímulos de interés se realizó mediante inmunoblot de lisados

celulares. Primero, se evaluó el efecto de TNFα (10 ng/ml) a diferentes tiempos (0, 6,

18 y 24 hrs.), observándose una mayor expresión a las 6 hrs. post-estimulo (Figura 6),

como una banda inmunoreactiva de 105 KDa que corresponde al receptor anclado a

membrana, y las otras de alrededor 75 y 50 kDa (TLR4s1 y TLR4s2) a isoformas

solubles de TLR4. Estos resultados reflejan una clara dependencia de la inducción de

la expresión de todas las isoformas del receptor con el tiempo de exposición a TNFα.

Luego se determinó el efecto de Dexametasona (100 nM) a los mismos tiempos (0, 6,

12 y 18 hrs.), no observándose variaciones significativas (Figura 7). El tratamiento de

las células con ambos estímulos, TNFα y Dexametasona por 6 hrs., indica que esta

última revierte el efecto inductor de TNFα sobre la expresión de TLR4 (Figura 8).

24

Figura 6. Curso temporal de la expresión de TLR4 inducida por TNFα. Las células fueron tratadas con TNFα (10 ng/ml) por 6, 18 y 24 hrs. y posteriormente lisadas. La figura muestra tres bandas inmunorreactivas con diferentes pesos moleculares: 105, 75 y 50 KDa, correspondiente al receptor anclado a la membrana (TLR4), y las formas solubles del receptor (TLR4s1 y TLR4s2), respectivamente, cuya expresión es dependiente del tiempo de exposición a TNFα. La inmunoreactividad de la isoforma TLR4s2 no se observa en lisados de células expuestas a la citoquina por 18-24 hrs. Los valores (*) representan la razón de inducción con respecto al control, el cual se realizó por análisis densitométrico de las bandas normalizadas a la β-actina en relación a la banda de TLR4 (105 KDa).

Figura 7. Curso temporal de la expresión de TLR4 total en células expuestas a Dexametasona. Las células fueron tratadas con Dexametasona (100 nM) por 6, 12 y 18 hrs. La figura muestra dos bandas inmunorreactivas de 105 y 75 KDa, correspondientes al receptor anclado a la membrana (TLR4) y la forma soluble (TLR4s1). La razón de inducción (*) con respecto al control se realizó por análisis densitométrico de las bandas normalizadas a la β-actina en relación a la banda de 105 KDa.

25

TLR4

TLR4s1

TLR4s2

β-actina

TNFα (10 ng/ml)

Dex (100 nM)

(*) 1 1,6 1,1 0,9

-- -

-++

++

Figura 8. Los glucocorticoides revierten el efecto inductor de TNFα sobre la expresión de la proteína de TLR4. La figura muestra la inmunoreactividad para TLR4 en células expuestas a TNFα (10 ng/ml), Dexametasona (100 nM) y el co-tratamientos de ambos por 6 hrs. La razón de inducción (*) con respecto al control se realizó por análisis densitométrico de las bandas normalizadas a la β-actina en relación a la banda inmunoreactiva de TLR4.

4.3.2 Efecto de glucocorticoides sobre la expresión del TLR4 a

nivel de superficie inducida por TNFα

La expresión de TLR4 en la membrana plasmática de las células A549, se

realizó mediante citometría de flujo. La expresión del receptor en este modelo celular

es menor con respecto a otros tipos celulares del sistema inmune innato, como los

macrófagos, sin embargo este estudio apoyará en la compresión de los mecanismos

involucrados en la regulación de la expresión de TLR4.

26

Las células se trataron con TNFα (10 ng/ml) en presencia o ausencia de

Dexametasona (100 nM) durante 24 horas. Los resultados obtenidos muestran que

TNFα induce la expresión de TLR4 a nivel de superficie, efecto que también es

revertido por Dexametasona. Sin embargo, esta última por sí sola no modificó la

expresión de TLR4 (Figura 9). Estos datos indican que los estímulos estudiados

modifican la expresión de la proteína de TLR4 a nivel de superficie como un

mecanismo de alerta frente en cuadros inflamatorios.

Control TNFα Dex TNFα + Dex

0

5

10

15

* *

% c

élul

as T

LR4+

Figura 9. Expresión de TLR4 en la membrana plasmática de células epiteliales humanas. La figura muestra el porcentaje de células positivas para TLR4 en función del tratamiento con TNFα (10ng/ml) en presencia o ausencia de Dexametasona (100 nM) por 24 horas. Los datos fueron expresados como la media ± el error estándar (ES), n= cuatro experimentos independientes. El asterisco indica diferencias significativas entre los tratamientos (*, P < 0,05), análisis de comparación (Mann-Whitney test).

27

5. DISCUSIÓN

El papel que juegan los Receptores Tipo Toll en el sistema inmune innato es

crucial, ya que censan la presencia de PAMPs específicos, desencadenando con esto

la activación de señales intracelulares que se traducen finalmente en la expresión de

moléculas vinculadas a procesos pro-inflamatorios (49).

Se han realizado numerosos estudios sobre la afinidad y especificidad de los

TLRs por sus ligandos (50), como también sobre la regulación de su expresión por

moléculas de diverso origen y en diferentes tipos celulares (19).

En esta memoria se propuso dilucidar el efecto de moléculas que ejercen

respuestas antagónicas en el sistema inmune, sobre la expresión de uno de estos

TLRs en particular, el TLR4. Por una parte, se estudió el efecto de una citoquina de

gran relevancia en procesos inflamatorios, como es TNFα y por otro lado los

glucocorticoides, que poseen propiedades anti-inflamatorias.

5.1 Efecto de TNFα y Dexametasona sobre la expresión del mRNA de TLR4 en células A549

Inicialmente se estudió la expresión del gen de tlr4, mediante PCR en tiempo

real, que permite cuantificar el mRNA sintetizado, donde TNFα indujo un aumento

significativo en células A549 de la expresión del mRNA de TLR4. Dexametasona por

si solo no afectó la expresión del mRNA de TLR4, sin embargo revirtió

significativamente el efecto de TNFα, lo que demuestra el gran poder que poseen los

glucocorticoides en este caso, de contrarrestar casi por completo el efecto que tiene

TNFα sobre la síntesis del mRNA de TLR4, lo que finalmente se traduce en una menor

28

presencia de este receptor para censar a su ligando específico y con ello no

desencadenar la expresión de otras moléculas pro-inflamatorias que exacerbarían este

cuadro.

Además de este importante resultado, el haber podido detectar mediante una

técnica sensible, los diferentes comportamientos de expresión génica que producen

moléculas antagónicas en células epiteliales pulmonares, es también la primera

evidencia que muestra el efecto de los glucocorticoides sobre la expresión de TLR4,

inducido por un estímulo inflamatorio, y que ayudará posteriormente a entender mejor

el comportamiento del sistema inmune innato, en relación a los patrones de expresión

de estos tipos de receptores.

5.2 Efecto de TNFα sobre la actividad transcripcional del promotor del TLR4 en presencia o ausencia de Dexametasona

El papel que juegan los distintos factores transcripcionales sobre la expresión

genética es crucial para la sobrevida celular (51), y en este caso en particular para el

gen de tlr4, depende de los elementos de respuesta que posea en su región promotora

(52).

La actividad transcripcional del promotor de TLR4 murino, que posee una alta

homología al humano (con una identidad del 85%), se analizó en diferentes deleciones

mutantes del mismo.

Los resultados obtenidos muestran la misma tendencia a nivel del transcrito, en

el que Dexametasona revierte el efecto de TNFα; este resultado fue observado

exclusivamente para el constructo del promotor completo y la siguiente en tamaño, las

cuales poseen sitios de unión putativos para AP-1 y GR (GRE). El sitio de unión para

29

AP-1 tendría mayor relevancia en la inducción de la transcripción del gen tlr4 por TNFα

y el GRE podría ser responsable del efecto inhibidor de Dexametasona sobre TNFα.

Las deleciones mutantes del promotor de TLR4 de menor tamaño (-336 y -144)

confirman que los efectos observados a nivel de mRNA y actividad transcripcional del

constructo completo dependen de, al menos, algunos de estos factores de

transcripción. Además, el análisis en silico del promotor con los programas descritos

identificó la presencia de tres mitades de GRE (mGRE) en las posiciones -269, -235 y

-41 río arriba con respecto al inicio de la transcripción. Estos mGRE están

conformados por las bases más conservadas, información que ayudaría a comprender

el nivel de actividad transcripcional de estas últimas deleciones. Dependiendo de la

cantidad y tipo (activador o represor) de GREs que posea un determinado promotor,

van a ejercer un patrón de expresión génica característico. Además el GR puede

ejercer su efecto inhibidor a través de la interacción proteína-proteína con otros

factores de transcripción (53).

5.3 Efecto de los glucocorticoides sobre la expresión de la proteína de TLR4 inducida por TNFα

Para detectar la presencia de la proteína se realizaron inmunoblots y citometría

de flujo, identificando con esto la proteína total y la asociada a membrana,

respectivamente. Las células A549 fueron estimuladas con TNFα y Dexametasona,

determinándose el efecto de cada uno de los estímulos sobre la expresión de TLR4 en

el tiempo. La máxima inducción de TLR4 por TNFα se observó a las 6 horas, tiempo

en el cual Dexametasona revirtió su efecto. Corroborándose el mismo patrón de

respuesta a nivel del TLR4 de superficie por citometría de flujo pero a las 24 horas.

30

5.4 Regulación de la expresión de TLR4 por glucocorticoides inducido por TNFα

En este trabajo se evidenció claramente el efecto de moléculas que ejercen

efectos antagónicos, tales como TNFα y Dexametasona, sobre la expresión del TLR4

(Figura 10). La figura muestra que la unión de TNFα a su receptor de membrana

activa factores transcripcionales, tales como NFκB, AP-1 y STAT1, que conducen a un

aumento en la expresión de TLR4. Por otro lado, la Dexametasona, un GC sintético

que por su naturaleza lipídica permea la membrana y se une a su receptor

citoplasmático el cual transloca al núcleo el cual revierte el efecto inducido por TNFα

sobre la expresión de TLR4, ya sea por interacción directa con GRE presentes en el

promotor del gen o por inhibición de AP-1 o NFκB mediante interacción proteína-

proteína. Estos resultados evidencian el papel de factores de transcripción activados

por vías pro y anti inflamatorias sobre la actividad transcripcional de TLR4 que

conducen a cambios en la expresión proteica en estados inflamatorios o infecciosos.

Los estudios que se proyectan de este trabajo están focalizados a dilucidar el

mecanismo molecular que estarían ejerciendo los glucocorticoides sobre la expresión

del TLR4, los que muy probablemente estén ocurriendo a nivel genómico. La

identificación de la secuencia de los GRE en el promotor del TLR4, ha sido un valioso

aporte para profundizar en el tipo de respuesta que puedan evocar diferentes tipos de

elementos de respuesta.

31

Figura 10. Modelo de la regulación de la expresión de TLR4 por glucocorticoides inducida por TNFα. La figura representa a modo general los factores que estarían involucrados en la regulación de la expresión del TLR4 por TNFα y glucocorticoides en células epiteliales de vías respiratorias. Las moléculas antagónicas TNFα y glucocorticoides son reconocidas por los respectivos receptores, uno localizado en la membrana plasmática y el otro a nivel citoplasmático, respectivamente, para posteriormente desencadenar la translocación de factores de trascripción específicos de cada vía los cuales regularían directamente la expresión génica a través de la regulación transcripcional de TLR4.

32

6. CONCLUSIONES

En este trabajo se demostró que TNFα incrementa la expresión de TLR4, tanto

a nivel del transcrito, de la proteína y de la actividad transcripcional del promotor en

células epiteliales A549. Por primera vez, este trabajo demuestra que los

glucocorticoides revierten el efecto de TNFα sobre la expresión de TLR4.

Los resultados obtenidos a nivel del transcrito y proteína de TLR4 evidencian el

gran efecto inhibidor de Dexametasona sobre TNFα y, los ensayos de actividad

transcripcional indican los sitios de unión y/o factores de transcripción presentes en el

promotor de TLR4 que tendrían un papel relevante en la respuesta antagónica de

estos compuestos.

Finalmente, los hallazgos presentados en este trabajo demuestran el poderoso

efecto que estarían ejerciendo los GCs, sobre la expresión de TLR4, uno de los más

importantes y estudiados miembros de la familia de los TLRs.

Queda aún por dilucidar los mecanismos moleculares específicos por los

cuales estas moléculas regularían la expresión de TLR4, para comprender más

cabalmente el efecto de estas moléculas sobre algunos integrantes de la inmunidad

innata.

33

7. REFERENCIAS

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8. ANEXO

Como parte del trabajo realizado durante esta memoria de título, se generaron

las siguientes presentaciones:

Trabajos presentados en congresos nacionales

Regulación negativa endógena de la Respuesta Inmune Innata mediada por los Toll-like Receptors (TLRs): Papel de los glucocorticoides. Frano Malinarich, Rodrigo Valenzuela, Ramón Pérez, Lucia Núñez, Sofía Sepúlveda,

Enzo Candia, Rodrigo Quera y Marcela A. Hermoso.

Presentación ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

Santiago, Chile, Septiembre 2007.

Regulación de la Expresión del Receptor Tipo Toll 4 (TLR4) por el Factor de Necrosis Tumoral α y Dexametasona Ramón Pérez, Rodrigo Valenzuela, Enzo Candia y Marcela Hermoso.

XXI Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile.

Pucón, Chile, Octubre 2007.

Trabajos presentados en congresos internacionales Regulation of The Toll-Like Receptor 4 expression by Tumor Necrosis Factor α and Dexamethasone.

R. D. Pérez, R. Valenzuela, A. Paredes, M. A. Hermoso.

Congreso Internacional de Inmunología

Rio de Janeiro, Brasil, Agosto 2007

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