Accademia dei Georgofili, 24 maggio 2012

Regolazione redox nel cloroplasto Mirko Zaffagnini

Laboratorio di Fisiologia Molecolare delle piante, Università di Bologna

Fase “luminosa” Fase “oscura”

La fotosintesi ossigenica

Alghe verdi (Cr)

Piante superiori (At)

La fase luminosa o fase luce-dipendente

Fase “oscura”

La fase oscura o Ciclo di Calvin-Benson

Proteina(e)?

La scoperta del sistema ferredossina/tioredossina

Proteina(e)?

Light

Fd: ferredossina

FTR: ferredossina:tioredossina reduttasi

TRX: tioredossina

La scoperta del sistema ferredossina/tioredossina

Piccole proteine di circa 12-14 kDa, solubili e termostabili

Struttura 3D: 5 foglietti β circondati da 4 α-eliche

Sito attivo: 2 cisteine conservate (W-CysN-(G/P)-P-CysC)

Presente in tutti gli organismi viventi

Nel cloroplasto: Trx-f e Trx-m

Tioredossine (Trx):

CysN CysC

Tioredossine cloroplastiche: informazioni generali

Tioredossine cloroplastiche: target e ruolo fisiologico

SH

SH Trx f

PSI

FTR Fd

Light

SH

SH Trx x

FBPase, GAPDH, DAHP synthase

PRK, SBPase, NADP-MDH, G6PDH, CF1 ATPase, Rubisco activase, ACCase, AGPase, TR-BAMY, GWD

SH

SH Trx m

SH

SH Trx y

Metabolismo del carbonio

2-cys PRX MSRB2, PRX-Q, GPX

Risposta antiossidativa

Tioredossine cloroplastiche: target e ruolo fisiologico

SH

SH Trx f

PSI

FTR Fd

Light

SH

SH Trx x

FBPase, GAPDH, DAHP synthase

PRK, SBPase, NADP-MDH, G6PDH, CF1 ATPase, Rubisco activase, ACCase, AGPase, TR-BAMY, GWD

SH

SH Trx m

SH

SH Trx y

Metabolismo del carbonio

2-cys PRX MSRB2, PRX-Q, GPX

Risposta antiossidante

1000 1500 2000 Mass (m/z)

Organismi fotosintetici (At e Cr): genoma disponibile

Approccio proteomico:

Cr Identificare nuove proteine bersaglio delle Trx

Proteomica redox

9 Tioredossine

>400 target potenziali (>130 nei cloroplasti)

Approcci proteomici

Proteomica redox: ponti S-S

9 Tioredossine

>400 target potenziali (>130 nei cloroplasti)

Approcci proteomici

Proteomica redox: ponti S-S

Ciclo di Calvin Metabolismo dell’amido

Metabolismo dello zolfo

Metabolismo dell’azoto

Trasporto fotosintetico

Biosintesi AA e lipidi

Biosintesi isoprenoidi Metabolismo dell’ATP

Risposta antiossidante

etc…

S1,7P

3 x RuBP

6 x 3 - PGA

6 x G3P

G3P

F1,6P

X5P E4P

G3P DHAP G3P DHAP G3P

3 x CO 2

X5P

F6P

S7P

R5P 3 x RuP

6 x 1,3 - PGA

or

RPI

PRK

PGK

Rubisco

FBA

RPE

Transketolase

Transketolase

A2B2 GAPDH

A4 GAPDH FBA

FBPase

SBPase

TPI

Regolazione redox del Ciclo di Calvin

Ciclo di Calvin

S

S

S

S

S

S

S

S

S1,7P

3 x RuBP

6 x 3 - PGA

6 x G3P

G3P

F1,6P

X5P E4P

G3P DHAP G3P DHAP G3P

3 x CO 2

X5P

F6P

S7P

R5P 3 x RuP

6 x 1,3 - PGA

or

RPI

PRK

PGK

Rubisco

FBA

RPE

Transketolase

Transketolase

A2B2 GAPDH

A4 GAPDH FBA

FBPase

SBPase

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

TPI

Regolazione redox del Ciclo di Calvin

Ciclo di Calvin

S

S

S

S

S

S

S

S

S1,7P

3 x RuBP

6 x 3 - PGA

6 x G3P

G3P

F1,6P

X5P E4P

G3P DHAP G3P DHAP G3P

3 x CO 2

X5P

F6P

S7P

R5P 3 x RuP

6 x 1,3 - PGA

or

RPI

PRK

PGK

Rubisco

FBA

RPE

Transketolase

Transketolase

A2B2 GAPDH

A4 GAPDH FBA

FBPase

SBPase

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

TPI

Regolazione redox del Ciclo di Calvin

Ciclo di Calvin

Produzione di ROS durante la fase luminosa

O2

O2-. 3O2

1O2*

Ossidazione

Residui contenenti zolfo: Cisteine e metionine

Co

nd

izio

ni d

i stre

ss

ab

iotic

o/b

iotic

o

DNA / RNA Lipidi

Proteine

Co

nd

izio

ni n

orm

ali

Specie reattive dell’ossigeno

(ROS: 1O2 , O2·ˉ, H2O2 )

HS

SH

SSG

HS

HS

SH

S‾ S HS

HS

S

ROS

TRX

ROS

Interazione ROS-proteine

Ridotta S-glutationilata Ossidata (ponte S-S)

HS

S‾

HS

SH

H2O2

GRX

Simili alle Trx (TrxX fold e famiglia ampia

Sito attivo: (CysN-X-X-(CysC/S)

Sito di binding per il GSH

Glutaredossine (Grx):

Ridotta

SSG

HS

HS

SH

GSH

GSSG

Buffer redox (GSH e GSSG)

S-glutationilazione

Deglutationilazione

Glutatione

8.17 Å

12.26 Å

8.12 Å

GSH

S-glutationilata

S-glutationilazione: informazioni generali

S-glutationilazione

>250 target potenziali (>50 nei cloroplasti)

Approcci proteomici

Proteomica redox: S-glutationilazione

Proteomica redox: S-glutationilazione

Ciclo di Calvin Metabolismo dell’amido

Metabolismo dei nucleotidi

Metabolismo dell’azoto

Biogenesi proteine

Biosintesi AA

Degradazione delle proteine Metabolismo della clorofilla

Risposta antiossidante

etc…

S-glutationilazione

>250 target potenziali (>50 nei cloroplasti)

Approcci proteomici

S

S

S

S

S

S

S

S

S1,7P

3 x RuBP

6 x 3 - PGA

6 x G3P

G3P

F1,6P

X5P E4P

G3P DHAP G3P DHAP G3P

3 x CO 2

X5P

F6P

S7P

R5P 3 x RuP

6 x 1,3 - PGA

or

RPI

PRK

PGK

Rubisco

FBA

RPE

Transketolase

Transketolase

A2B2 GAPDH

A4 GAPDH FBA

FBPase

SBPase

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

TPI

Ciclo di Calvin

Regolazione redox del Ciclo di Calvin

SG

SG

SG

SG

SG SG

SG

SG

SG

SG

SG

SG

S

S

S

S

S

S

S

S

S1,7P

3 x RuBP

6 x 3 - PGA

6 x G3P

G3P

F1,6P

X5P E4P

G3P DHAP G3P DHAP G3P

3 x CO 2

X5P

F6P

S7P

R5P 3 x RuP

6 x 1,3 - PGA

or

RPI

PRK

PGK

Rubisco

FBA

RPE

Transketolase

Transketolase

A2B2 GAPDH

A4 GAPDH FBA

FBPase

SBPase

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

SH

S-

TRX f

TPI

Ciclo di Calvin

Regolazione redox del Ciclo di Calvin

Glutationilazione della Tioredossina f

Tra le diverse Trx cloroplastiche solo la TRX-f subisce glutationilazione su una cisteina localizzata vicino al sito attivo

TRX-f

La glutationilazione della AtTRX f riduce la sua capacità di attivare gli enzimi target in condizioni di luce

Glutationilazione della Tioredossina f

Luce/Buio

Ciclo di Calvin

Trx f

Ottimizzazione dell’utilizzo del potere riducente (NADPH) e dell’energia (ATP) per l’organicazione della CO2

Regolazione del Ciclo di Calvin: luce vs buio e luce/ROS

Luce/Buio

Ciclo di Calvin

Trx f

Ottimizzazione dell’utilizzo del potere riducente (NADPH) e dell’energia (ATP) per l’organicazione della CO2

Stress ossidativo

ROS

Trx f

ROS

GRX

GSH

Signalling cellulare e redistribuzione del potere riducente verso il sistema antiossidante (glutatione, ascorbato ed enzimi)

Regolazione del Ciclo di Calvin: luce vs buio e luce/ROS

GSH

GSH

Luce/Buio

Ciclo di Calvin

Trx f

Ottimizzazione dell’utilizzo del potere riducente (NADPH) e dell’energia (ATP) per l’organicazione della CO2

Stress ossidativo

ROS

Trx f

ROS

Signalling cellulare e redistribuzione del potere riducente verso il sistema antiossidante (glutatione, ascorbato ed enzimi)

Regolazione del Ciclo di Calvin: luce vs buio e luce/ROS

GSH

GSH

Stress nitrosativo

RNS

Laboratorio di Fisiologia Molecolare delle Piante

Paolo Trost

Institut de Biologie Physico-Chimique (CNRS) Paris, FR

Myroslawa Miginiac-Maslow

Stéphane Lemaire

Paolo Pupillo

Francesca Sparla

Institut de Biotechnolgie des Plantes (CNRS) Orsay, FR