PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI β ... · Susu UHT adalah karya saya dengan arahan dari...

Click here to load reader

  • date post

    12-Mar-2019
  • Category

    Documents

  • view

    218
  • download

    1

Embed Size (px)

Transcript of PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI β ... · Susu UHT adalah karya saya dengan arahan dari...

PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI -GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT

SITARESMI YUNINGTYAS

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2011

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Purifikasi, Amobilisasi, dan

Karakterisasi -Galaktosidase dari Enterobacter cloacae dan Potensinya terhadap Susu UHT adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, April 2011 Sitaresmi Yuningtyas NIM G851090041

ABSTRACT SITARESMI YUNINGTYAS. Purification, Immobilization, and Characterization of -Galactosidase from Enterobacter cloacae with Potentiality to UHT Milk. Under direction of MARIA BINTANG and TATIK KHUSNIATI.

Enzymatic hydrolysis of lactose is an important biotechnological process because the hydrolyzed products can be consumed by people with lactose intolerance. The aim of this study was purification, immobilization, and characterization of -galactosidase from E. cloacae. This research also studied the hydrolysis of lactose in UHT milk. The stages of this research were production and purification -galactosidase from E. cloacae; characterization of enzyme; optimization of immobilization formula; and hydrolisis of UHT milk. The -galactosidase from E. cloacae was purified and showed a purification of 30.26-fold, a yield of about 6.18%, and a specific activity of 101.781 U/mg. Free and immobilized enzyme exhibited maximum activity at an optimal pH of 7.0 and an optimum temperature of 40C. This enzyme was activated by Co2+, Mn2+, and Mg2+; however, was inhibited by Ca2+, Zn2+, Cu2+, and Hg2+. KM for free and immobilized -galactosidase were 0.434 and 2.068 mM, respectively. Optimal formulation of cell and enzyme immobilization were consist of 10% (w/v) cell with 5% (w/v) sodium alginate and 10% (v/v) purified enzyme with 5% (w/v) sodium alginate, respectively. This researh found that entrapped -galactosidase was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (28.09%) after 6 hours in batch process as compared to entrapped E. cloacae (22.01%) after 18 hours. Free -galactosidase was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (78.20%) after 6 hours as compared to free E. cloacae (55.14%) after 18 hours.

Keyword: -galactosidase, Enterobacter cloacae, purification, immobilization

RINGKASAN SITARESMI YUNINGTYAS. Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi -Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TATIK KHUSNIATI. Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang dihubungkan dengan ikatan -(1,4)-glikosidik dengan proporsi 4,7% dari total susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh. Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim -galaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar. Orang-orang yang memiliki ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim -galaktosidase yang rendah pada brush border pada usus halus disebut penderita laktosa intoleran. Salah satu solusi untuk penderita laktosa intoleran adalah memodifikasi susu dengan cara menghidrolisis laktosa secara enzimatik menggunakan -galaktosidase. Penggunaan enzim dalam keadaan bebas yakni terlarut dalam air, kurang menguntungkan dalam skala industri karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi. Salah satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai berulang adalah menggunakan teknik amobilisasi. Sel atau enzim yang teramobil sering digunakan pada industri karena dapat digunakan secara terus menerus sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi. Enzim -galaktosidase dapat dihasilkan oleh Enterobacter colacae. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini menggali potensi -galaktosidase dari E. cloacae. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan karakterisasi -galaktosidase dari E. cloacae. Selain itu, untuk mengetahui aktivitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, -galaktosidase bebas, dan -galaktosidase teramobil. Tahap awal dari penelitian ini adalah penentuan waktu produksi -galaktosidase optimum dari E. cloacae. Selanjutnya dilakukan produksi -galaktosidase. Setelah memperoleh enzim -galaktosidase kasar maka dilanjutkan dengan tahap purifikasi enzim yang terdiri dari pengendapaan dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel. Tahap selanjutnya adalah enzim -galaktosidase terpurifikasi dan sel E. cloacae diamobilisasi dengan teknik penjebakan dengan kalsium alginat. Optimasi variasi konsentrasi alginat dan bobot sel yang digunakan untuk amobilisasi sel dilakukan terlebih dahulu sebelum dilakukan amobilisasi sedangkan untuk amobilisasi enzim dilakukan optimasi konsentrasi alginat saja. Setelah diperoleh konsentrasi optimum alginat maka dilakukan amobilisasi sel E. cloacae dan amobilisasi -galaktosidase. Penentuan karakterisasi -galaktosidase bebas dan -galaktosidase teramobil yang dilakukan meliputi suhu optimum, stabilitas suhu, pH optimum, stabilitas pH, aktivator dan inhibitor, serta parameter kinetik (KM dan Vmaks). Tahap terakhir adalah penentuan potensi -galaktosidase terhadap susu UHT yang meliputi hidrolisis laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, -galaktosidase

bebas, dan -galaktosidase teramobil. Analisis penurunan kadar laktosa menggunakan kit enzimatik GOD-POD (glukosa oksidase-peroksidase). Hasil penelitian ini menunjukan E. cloacae menghasilkan -galaktosidase optimum pada waktu inkubasi jam ke-24 dengan suhu 37C. Tahap purifikasi -galaktosidase E. cloacae dengan menggunakan perlakuan pengendapan amonium sulfat 30-40%, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 101,781 U/mg dengan rendemen 6,18% dan tingkat kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali dari enzim kasar yang diperoleh. Suhu optimum bagi -galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil adalah 40C. Stabilitas suhu pada -galaktosidase bebas berkisar pada suhu 25-40C sedangkan untuk enzim teramobil berkisar 25-45C. pH optimum bagi -galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil adalah pH 7. Stabilitas -galaktosidase bebas dan -galaktosidase teramobil pada kisaran pH 5,5-8,0. Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor -galaktosidase dari E. cloacae sedangkan Ca2+ dan Zn2+ merupakan inhibitor parsial. Kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ merupakan aktivator bagi enzim tersebut. Enzim -galaktosidase bebas dari E. cloacae mempunyai kecepatan maksimum sebesar 0,655 mol/menit dan nilai KM sebesar 0,434 mM. Pada -galaktosidase teramobil, kecepatan maksimumnya sebesar 0,012 mol/menit dengan nilai KM sebesar 2,068 mM. Konsentrasi optimum untuk amobilisasi sel adalah bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5% sedangkan konsentrasi optimum untuk amobilisasi enzim adalah larutan enzim terpurifikasi 10% (v/v) dan alginat 5%. E. cloacae bebas dapat menghidrolisis laktosa pada susu UHT sebesar 55,14% sedangkan E. cloacae teramobil sebesar 22,01% setelah 18 jam. Aktivitas hidrolisis laktosa oleh -galaktosidase bebas sebesar 77,99% sedangkan -galaktosidase teramobil sebesar 28,09% setelah 6 jam. Pemakaian berulang enzim amobil dan sel amobil masih dapat dilakukan hingga 6 kali pengulangan. Kata kunci: -galaktosidase, Enterobacter cloacae, purifikasi, amobilisasi

Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI -GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT

SITARESMI YUNINGTYAS

Tesis sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Magister Sains pada Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2011

Judul Tesis : Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi -Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT

Nama : Sitaresmi Yuningtyas NIM : G851090041

Disetujui

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S.

Dr. Ir. Tatik Khusniati, M. App. Sc. Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal Ujian: 7 April 2011 Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini berjudul Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi -Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT. Kegiatan Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juli hingga November 2010 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), di Jalan Raya Bogor km 46, Cibinong. Penelitian ini dibiayai Proyek Puslitbang Biologi LIPI dari dana Program Insentif Penelitian dan Perekayasa, Ristek 2010.

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc. yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan selama berlangsungnya penelitian serta dalam penyusunan karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. selaku penguji luar komisi yang telah memberikan saran dalam penulisan tesis. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik, dan Abi yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan doa kepada penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada staf Laboratorium Biokimia Mikroba LIPI Biologi, Neneng Karimaryati, A.Md. AL, Bapak Abdul Kholiq, S.Pd, dan Resti Siti Mutmainah atas kerja samanya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, April 2011 Sitaresmi Yuningtyas

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 13 Juni 1987 dari ayah Ir. Suyono dan ibu Lina Herlina. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 2004 penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB dan menamatkannya pada tahun 2008. Penulis pernah bekerja sebagai Asisten Peneliti di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) pada tahun 2009. Kesempatan untuk melanjutkan program pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun 2009.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ..............................................................................................xiii

DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xiii

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ................................................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA Enzim -Galaktosidase ................................................................................. 4

Enterobacter cloacae .................................................................................... 7 Susu UHT ..................................................................................................... 8 Purifikasi Enzim ......................................................................................... 10 Teknik Amobilisasi ..................................................................................... 12 Karakterisasi Enzim .................................................................................... 14

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ........................................................................................... 17 Metode Penelitian ....................................................................................... 18

HASIL DAN PEMBAHASAN Waktu Optimum Produksi -Galaktosidase ................................................. 26

Produksi dan Purifikasi -Galaktosidase ..................................................... 27 Karakterisasi -Galaktosidase ..................................................................... 32 Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae .................................................................................. 40 Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi -Galaktosidase .............. 42 Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT ................................................. 43 Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil ................................ 46

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .................................................................................................... 48 Saran .......................................................................................................... 48 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 49

LAMPIRAN ........................................................................................................ 53

DAFTAR TABEL Halaman

1 Mikroorganisme penghasil -galaktosidase ........................................................ 6

2 Komponen utama susu ....................................................................................... 9

3 Purifikasi -galaktosidase dari E.cloacae ......................................................... 30

DAFTAR GAMBAR Halaman

1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh -galaktosidase ................................................... 5

2 Mekanisme katalitik dari -galaktosidase .......................................................... 5

3 Enterobacter cloacae ........................................................................................ 7

4 Teknik amobilisasi enzim ................................................................................ 14

5 Kurva pertumbuhan E.cloacae dan kurva produksi -galaktosidase ................ 27

6 Reaksi hidrolisis oNPGal oleh -galaktosidase ................................................ 28

7 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan amonium sulfat .......... 29

8 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan matriks Superdex 200 ............................................... 31

9 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas -galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 32

10 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas -galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 34

11 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas -galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 35

12 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap stabilitas -galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 36

13 Aktivator dan inhibitor -galaktosidase dari E. cloacae ................................... 38

14 Kurva Lineweaver Burk dari enzim -galaktosidase bebas dan enzim -galaktosidase teramobil ...................................................................... 39

15 Variasi optimum penentuan sel amobil ............................................................ 41

16 Produk yang dihasilkan pada penentuan optimasi amobisisasi enzim ............... 43

17 Aktivitas hidrolisis laktosa oleh enzim teramobil dan sel teramobil ................. 46

18 Penggunaan berulang enzim teramobil dan sel teramobil ................................. 47

DAFTAR LAMPIRAN Halaman

1 Tahapan umum penelitian ............................................................................... 54

2 Perhitungan aktivitas -galaktosidase .............................................................. 55

3 Morfologi Enterobacter cloacae ...................................................................... 55

4 Kurva standar oNP .......................................................................................... 56

5 Kurva standar protein ...................................................................................... 57

6 Penentuan waktu produksi optimum ................................................................ 58

7 Hasil purifikasi -galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat ............. 58

8 Hasil kromatografi filtrasi gel .......................................................................... 59

9 Optimasi dan Stabilitas Suhu ........................................................................... 59

10 Optimasi dan stabilitas pH ............................................................................... 61

11 Aktivator dan inhibitor -galaktosidase ........................................................... 62

12 Penentuan parameter kinetik enzim bebas dan enzim teramobil ....................... 63

13 Produk oNP (mol) yang terbentuk saat optimasi variasi sel dan alginat untuk amobilisasi sel ....................................................................................... 65

14 Produk oNP (mol) yang terbentuk saat optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi enzim .................................................................................. 65

15 Potensi hidrolisis laktosa ................................................................................. 66

16 Penggunaan berulang enzim amobil dan sel amobil ......................................... 67

PENDAHULUAN

Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti

lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah

karbohidrat utama susu dengan proporsi 4,7% dari total susu (Chaplin 2004).

Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang

dihubungkan dengan ikatan -(1,4)-glikosidik (Fox & McSweeney 1981).

Keberadaan laktosa dalam susu merupakan salah satu keunikan dari susu itu

sendiri karena laktosa tidak terdapat di alam kecuali sebagai produk dari kelenjar

susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh.

Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim -

galaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan

kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar.

Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi

glukosa dan galaktosa karena enzim -galaktosidase yang rendah pada brush

border pada usus halus (Marsh & Riley 1998). Jika seseorang tidak mempunyai

cukup -galaktosidase maka laktosa menjadi tidak tercerna dan tidak dapat

diserap masuk ke dalam darah. Bahan-bahan ini akan menumpuk di dalam usus.

Oleh bakteri usus, tumpukan gula susu ini akan diubah menjadi asam-asam

organik dan gas karbon dioksida, gas metan, dan hidrogen. Deposit asam ini

merangsang timbulnya gerakan usus. Hal ini menyebabkan diare dengan tinja

berair, berbusa, dan berbau asam. Penderita laktosa intoleran di dunia terdapat

pada suku bangsa: Indian Amerika sekitar 95-100%, Mediterania 80-85%, Afrika

85-90%, Asia 90-100%, Eropa Utara 40-55%, dan Meksiko 50-75% (Rusynyk &

Still 2001).

Susu dapat dimodifikasi bagi penderita laktosa intoleran dengan ultrafiltrasi,

fermentasi (Fox & McSweeney 1981), dan hidrolisis (Winarno 1999). Proses

ultrafiltrasi akan menghilangkan makromolekul berbobot molekul besar seperti

laktosa dan protein akibat filtrasi sehingga ini akan mengurangi nutrisi (Fox &

McSweeney 1981). Proses fermentasi akan mengubah susu menjadi produk-

produk baru, misalnya susu asam dan yoghurt yang pada umumnya dapat

menurunkan 25% kadar laktosa (Winarno 1999). Hidrolisis laktosa dilakukan

2

secara enzimatik menggunakan -galaktosidase yang akan menghidrolisis laktosa

menjadi glukosa dan galaktosa yang masih memiliki nilai energi tinggi namun

aman bagi penderita laktosa intoleran. Selain itu, penderita laktosa intoleran dapat

juga mengkonsumsi suplemen -galaktosidase. Enzim -galaktosidase yang sudah

dijual di pasaran adalah Maxilact yaitu -galaktosidase dari Kluyveromyces lactis.

Enzim ini berupa kapsul maupun cairan. Jika enzim ini ditambahkan ke dalam

susu dan didiamkan selama semalam dalam suasana dingin akan mampu

menghidrolisis laktosa sebesar 70% (Mahoney 2004). Metode ini memang

terbukti efektif mereduksi gejala yang berhubungan dengan malabsorbsi laktosa

tetapi obat ini harganya mahal (Fox & McSweeney 1981).

Penggunaan enzim dalam keadaan bebas, yakni terlarut dalam air, kurang

menguntungkan karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi. Salah

satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai berulang adalah menggunakan

teknik amobilisasi (Palmer 1991). Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian

pergerakan dan pertumbuhan secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau

organel. Proses ini biasanya menghasilkan bentuk tidak larut dalam air. Sel atau

enzim yang teramobil sering digunakan pada industri karena dapat digunakan

secara terus menerus sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi

(Mahoney 2004).

Enzim -galaktosidase dapat dihasilkan dari hewan dan mikroorganisme.

Salah satunya adalah Enterobacter colacae. E. cloacae B5 menghasilkan -

galaktosidase dengan aktivitas transglikosilasi sebesar 55% (Lu et al. 2009).

Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong telah mengidentifikasi kemampuan E.

cloacae dalam memproduksi enzim ini. Isolat tersebut merupakan isolat dari

buah-buahan yang berasal dari Gunung Salak. Pemilihan E. cloacae karena isolat

ini belum diteliti dan diharapkan isolat ini menghasilkan enzim -galaktosidase

yang potensial dalam mendegradasi laktosa pada susu UHT.

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan

karakterisasi -galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Selain itu, untuk

mengetahui aktifitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae

bebas, sel E. cloacae teramobil, -galaktosidase bebas, dan -galaktosidase

teramobil. Hipotesis penelitian ini adalah Enterobacter cloacae menghasilkan

3

enzim -galaktosidase yang dapat menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.

Aktivitas penurunan kadar laktosa oleh sel E. cloacae teramobil, -galaktosidase

bebas, dan -galaktosidase teramobil berbeda satu sama lain. Penelitian ini

diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai aktivitas -

galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Enzim -galaktosidase ini dapat juga

digunakan dalam pembuatan susu UHT bebas laktosa untuk penderita laktosa

intoleran.

TINJAUAN PUSTAKA

Enzim -Galaktosidase

Enzim -galaktosidase (EC 3.2.1.23) termasuk enzim hidrolase yang dapat

menghidrolisis ikatan -D-galaktosida pada ujung nonreduksi residu -D-

galaktosa (Gambar 1). Nama sistematiknya adalah -D-galaktosida

galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain laktase (IUBMB Enzyme

Nomenclature 1980). Cara kerja enzim ini adalah menghidrolisis ikatan -(1,4)-

glikosida pada laktosa. Penggunaan enzim -galaktosidase dalam proses hidrolisis

ini mempunyai kekurangan dimana hidrolisis laktosa secara keseluruhan tidak

mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya galaktosa didalam

reaksi hidrolisis (Boyer 2002).

Enzim -galaktosidase bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast

sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler. Enzim ini pun bersifat induktif karena

akan diproduksi jika terdapat induser berupa laktosa (Mahoney 2004).

Mikroorganisme penghasil -galaktosidase dapat dilihat pada Tabel 1. Enzim -

galaktosidase dari bakteri seperti Lactobacillus bulgaricus bersifat aktif pada pH

rendah (dibawah pH 5,5) dengan suhu berkisar 30-60C (Itoh et al. 1980; Cesca et

al. 1984). Enzim -galaktosidase dari yeast seperti Kluyveromyces lactis dan

Kluyveromyces fragilis bersifat aktif pada pH 6-8 dengan suhu berkisar 25-40C.

Enzim yang sama hasil produksi dari fungi seperti Aspergillus niger dan

Aspergillus oryzae aktif pada pH rendah berkisar 2,5-6,0 serta bersifat

termostabil (Mahoney 2004).

Matthews (2005) menyatakan enzim ini berbentuk tetramer yang terdiri 4

rantai polipeptida (monomer) serta bobot molekul sekitar 464 kDa. Setiap

monomer terdiri dari 1023 asam amino. Enzim ini mempunyai situs aktif pada

Glu 461, Glu 537, dan Trp 999. Glu 461 terlibat pada stabilisasi elektrostatik pada

keadaan transisi. Glu 537 berperan sebagai nukleofili. Trp 999 berperan mengikat

ligan. Ion natrium akan berinteraksi dengan gugus hidroksil dari ligan (Huber et

al. 1994). Langkah pertama mekanisme katalitiknya adalah laktosa membentuk

intermediet dengan nukleofil Glu 537 dan dibantu dengan asam (A: Glu 461 atau

ion Magnesium). Selanjutnya Glu 461 mendonorkan proton dengan memberikan

5

H+ pada oksigen glikosidik yang disertai pemutusan ikatan glikosidik dan

pelepasan glukosa. Langkah kedua adalah pembentukan intermediet transient

triagonal oxocarbonium yang dibantu oleh basa (B: Glu 461) lalu terjadi

protonasi dari Glu 461 yang dikatalisis air dan diakhiri dengan transfer galaktosil

ke air atau gula lain. Jika akseptor berupa air maka akan terjadi proses hidrolisis

sehingga terbentuk glukosa dan galaktosa. Jika akseptornya berupa gula lain maka

akan terjadi proses transglikosilasi yang akan membentuk galaktooligosakarida

(Gambar 2) (Matthews 2005).

Gambar 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh -galaktosidase.

Gambar 2 Mekanisme katalitik dari -galaktosidase (Matthews 2005).

-Galaktosidase

Laktosa D-Galaktosa D-Glukosa

+ H2O +

Laktosa

Pembentukan intermediet

Glukosa

Pemutusan ikatan

Intermediet transient triagonal

6

Tabel 1 Mikroorganisme penghasil -galaktosidase (Mahoney 2004).

Sumber Jenis-jenis Yeast Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, Kluyveromyces

bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus, Pichia pastoris

Fungi Alternaria alternata, Alternaria palmi, Aspergillus foetidus, A. fonsecaeus, A. niger, A. oryzae, Bauvaria bassiana, Curvalaria inaequalis, Fusarium moniliforme, Mucor meihei, Mucor pusillus, Paecilomyces varioti, Penicillium conescens, P. chrysogenum, P. notatum, P. simplicissum, P. melloti, Rhizomucor spp., Saccharopolyspora rectivirgula, Scopulariopsis spp., Sirobasidium magnum, Streptomyces violaceus, Trichoderma reesei

Bakteri Arthrobacter spp., Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacilus subtilis, Bacteroides polypragmatus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Erwinia aroieae, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Lactobacillus acidophilus, L. crispatus, L. delbruecki, L. bulgaricus, L. kefiranofaciens, L. helveticus, L. lactis, L. sporogenes, L. thermophilus, Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento, Pseudoalteromonas haloplanktis, Pseudomonas fluorescens, Streptococcus thermophillus, Sulfolobus solfataricus, Thermoanaerobacter spp., Thermus ruber, Thermus thermophillus, Vibrio cholerae, Xanthomonas campestris

Perbandingan reaksi transglikosilasi laktosa dan hidrolisis laktosa

tergantung dari jumlah substrat yang tersedia. Reaksi transglikosilasi akan terjadi

pada konsentrasi laktosa yang tinggi sekitar 15-50% sehingga akan terbentuk

galaktooligosakarida (Greenberg & Mahoney 1983). Jika konsentrasi laktosa

rendah yaitu sekitar 5% maka akan terjadi reaksi hidrolisis yang akan membentuk

glukosa dan galaktosa (Burvall & Dahlqvist 1979). Oleh karena itu, enzim ini

digunakan pada industri pangan untuk mereduksi laktosa pada susu dan whey

serta produksi galaktooligosakarida (Mahoney 1998).

-galaktosidase terdapat pada usus halus manusia yang dapat menghidrolisis

laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta mempunyai pH optimum 6 (Campbell

7

et al. 2005). Jika laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh -galaktosidase, laktosa

yang mempunyai sifat osmotik yang tinggi ini dapat menarik air dan cairan tubuh

ke dalam saluran pencernaan usus kecil. Masuknya cairan tubuh ke dalam usus

kecil akan merangsang gerakan peristaltik dinding usus menjadi lebih cepat. Hal

ini akan mendorong isi usus kecil berpindah secara cepat pula ke dalam usus

besar. Di dalam usus besar ini bakteri-bakteri akan memfermentasikan laktosa

menghasilkan berbagai asam organik dan gas. Akibatnya, akan timbul gejala sakit

perut, mulas, kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). -

galaktosidase dapat diaplikasikan untuk penderita laktosa intoleran dengan cara

hidrolisis laktosa pada susu serta konsumsi suplemen -galaktosidase (Rusynyk &

Still 2001).

Enterobacter cloacae

Bakteri ini memiliki klasifikasi sebagai berikut kingdom Bacteria, filum

Proteobacteria, kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales, famili

Enterobacteriaceae, genus Enterobacter, dan spesies Enterobacter cloacae.

Bakteri ini mempunyai dua subspesies yaitu E. cloacae subsp. cloacae dan E.

cloacae subsp. dissolvens (Holt et al. 1994). E. cloacae merupakan bakteri

berbentuk batang (Gambar 3), Gram negatif, anaerobik fakultatif, ukurannya

berkisar (0,3-0,6) m (0,8-2,0) m, dan motil. Bakteri ini bergerak dengan

menggunakan flagelum peritrikus yaitu flagela yang secara merata tersebar

diseluruh permukaan sel. E. cloacae dapat hanya menggunakan sitrat dan asetat

sebagai sumber karbon. Bakteri tersebut dapat diisolasi dari buah-buahan, usus

hewan, tanah, dan perairan (Pelczar & Chan 1988).

Gambar 3 Enterobacter cloacae.

8

E. cloacae menghasilkan enzim -galaktosidase, arginin dihidrolase, dan

ornitin dekarboksilase (Huber 1999). -Galaktosidase dari E. cloacae B5 yang

diisolasi dari tanah mempunyai aktivitas transglikosilasi dan menghasilkan

galaktooligosakarida sekitar 55% dari 275 g/L laktosa pada suhu 50C selama 12

jam. Enzim -galaktosidase ini merupakan homotetramer dengan bobot molekul

442 kDa. Suhu optimumnya pada 35C dan aktif pada kisaran pH 6,5-10,5 (Lu et

al. 2009)

Susu UHT

Susu adalah hasil ekskresi normal kelenjar susu induk mamalia betina untuk

memberi makan anaknya. Secara kimiawi susu merupakan emulsi lemak dalam

air yang mengandung gula, garam-garam mineral, dan protein dalam bentuk

suspensi koloidal (Rahman et al. 1992). Menurut Walstra et al. (1999), komponen

utama susu adalah air, lemak, protein, laktosa, asam organik, dan mineral (Tabel

2). Selain komponen-komponen dengan persentase besar, di dalam susu juga

terdapat komponen lainnya seperti vitamin (vitamin B, C, dan D) dan enzim

(fosfatase, peroksidase, lipoprotein lipase, protease). Berdasarkan kandungan

lemaknya susu terbagi menjadi dua macam, yaitu susu berlemak (whole milk) dan

susu skim (skim milk). Susu skim mengandung lemak yang lebih rendah

dibanding susu berlemak.

Susu merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme

karena komposisinya yang sangat kompleks. Hal ini menyebabkan susu mudah

sekali mengalami kerusakan oleh mikroorganisme, terutama oleh beberapa jenis

bakteri patogen. Bakteri tersebut akan merusak susu sehingga menurunkan daya

simpannya (Kusnawati 2004). Salah satu upaya untuk mengurangi jumlah bakteri

patogen adalah dengan pemanasan.

Fennema (1996) menyatakan bahwa ada tiga jenis pemanasan pada proses

pengolahan susu, yaitu sterilisasi, pasteurisasi, dan ultra high temperature (UHT).

Sterilisasi biasa dilakukan pada suhu 107-115C selama 20-40 menit atau pada

suhu 120-130C selama 8-12 menit. Proses ini berpengaruh besar terhadap

kandungan protein karena protein akan tereduksi hingga lebih dari 20%.

Pasteurisasi terdiri dari Holding Methode dan High Temperature Short Time

9

(HTST). Holding Methode merupakan pemanasan dengan suhu 63C selama 30

menit. Sedangkan HTST merupakan pemanasan pada suhu 72C selama 15 detik.

Tujuan pasteurisasi adalah untuk menghilangkan bibit penyakit sehingga

mengurangi jumlah total bakteri untuk meningkatkan kualitas simpan. Semua

produk pasteurisasi harus disimpan pada suhu rendah karena masih mengandung

bakteri yang tahan panas seperti bakteri termofilik, bakteri asam laktat, bakteri

penghasil spora, dan beberapa jenis bakteri aerobik dan bakteri aerobik fakultatif

seperti Bacillus spp. (Early 1998). UHT merupakan pemanasan pada suhu yang

sangat tinggi diatas 135C dalam waktu yang sangat singkat.

Susu UHT dibuat dari susu cair segar yang diolah dengan menggunakan

pemanasan pada suhu tinggi dan dalam waktu yang singkat untuk membunuh

seluruh mikroba sehingga memiliki mutu yang baik. Proses UHT biasanya

dilakukan pada suhu 136-138C selama 5-8 detik atau pada suhu 140-145C

selama 2-4 detik (Fennema 1996). Kelebihan susu UHT adalah susu ini sangat

higienis karena bebas dari mikroba dan spora sehingga potensi kerusakan

mikrobiologis sangat kecil. Enzim-enzim pada susu seperti fosfatase, protease,

katalase, lipoprotein lipase, laktoperoksidase, sulfhidril oksidase, dan xantin

oksidase mengalami inaktivasi sehingga tidak akan merusak susu (Walstra et al.

1999). Oleh sebab itu, susu UHT mempunyai daya simpan yang panjang pada

suhu kamar hingga 6 bulan. Kontak panas yang sangat singkat pada proses UHT

menyebabkan mutu sensori seperti warna, aroma, dan rasa relatif tidak berubah

(Fennema 1996). Nutrisi yang terkandung sedikit menurun seperti terjadinya

reduksi protein berkisar 2-4%, menurunnya kadar vitamin B dan C, dan reaksi

Maillard yang lebih rendah. Reaksi Maillard merupakan reaksi pencoklatan non

enzimatik yang terjadi antara laktosa dan protein susu akibat proses pemanasan

(Walstra et al. 1999).

Tabel 2 Komponen utama susu (Walstra et al. 1999)

Komponen Rata-rata (%) Kisaran Normal (%) Air 87,1 85,3-88,7

Laktosa 4,6 3,8-5,3 Lemak 4,0 2,5-5,5 Protein 3,25 2,3-4,4 Mineral 0,7 0,57-0,83

Asam organik 0,17 0,12-0,21

10

Purifikasi Enzim

Pemekatan Enzim

Pemekatan enzim merupakan langkah awal dari proses purifikasi sebelum

tahap purifikasi selanjutnya (seperti kromatografi) dan dapat digunakan untuk

keperluan analisis enzim. Pemekatan enzim dapat dilakukan dengan dua metode

yaitu analitik dan preparatif. Metode analitik menggunakan pengendapan asam

(contohnya asam trikloroasetat) dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan

denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap

mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif

misalnya dengan pengendapan garam, pengendapan dengan senyawa organik,

ultrafiltrasi, liofilisasi, dan dialisis (Bollag & Edeistein 1991). Metode pemekatan

-galaktosidase biasanya menggunakan pengendapan dengan garam.

Pengendapan protein pada tahap awal purifikasi berfungsi untuk

memekatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan

memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian enzim yang tidak dikehendaki.

Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang

berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan

daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Pengendapan dengan garam

biasanya menggunakan garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, dan amonium

sulfat biasanya lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan

KCl (Boyer 2000). Efek salting-in tidak dipengaruhi oleh sifat garam netral tetapi

dipengaruhi oleh konsentrasi dan jumlah muatan pada tiap ion dalam larutan.

Kelarutan protein meningkat pada kenaikan konsentrasi garam, kenaikan

kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan

garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein akan menurun (salting-out).

Konsentrasi garam yang optimum ini sekaligus menurunkan aktivitas enzim, hal

ini karena sebagian protein mengalami denaturasi dan rusak oleh pengaruh

perlakuan selama pengendapan. Semakin banyak molekul air yang berikatan

dengan ion-ion garam akan menyebabkan penarikan molekul air yang

mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling

berinteraksi, teragregasi, dan mengendap (Scopes 1993).

11

Pemilihan garam amonium sulfat untuk pengendapan -galaktosidase

karena beberapa keuntungan seperti kelarutannya tinggi, tidak bersifat toksik,

murah, dan stabilitasnya terhadap enzim. Pada proses pengendapan, terjadi

penurunan kadar protein pada supernatan dan akan terjadi peningkatan protein

pada endapan. Penambahan garam dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk

pada suhu rendah, hal ini bertujuan untuk menghindari timbulnya buih yang dapat

menyebabkan denaturasi protein.

Tahap selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses pemisahan

molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh membran

semipermeabel. Kantong dialisis selofan (MWCO 10 kD) dalam bufer mampu

memisahkan molekul-molekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti

ion logam, inhibitor, peptida kecil, dan lainnya. Molekul yang besar dan

mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam membran

seperti -galaktosidase. Setelah enzim dimasukkan ke kantong dialisis dan

direndam dalam larutan bufer maka akan terjadi proses difusi dan osmosis.

Konsentrasi garam di dalam kantong dialisis lebih tinggi sehingga larutan bufer

akan masuk ke dalam kantong dialisis menggantikan garam yang keluar sehingga

terjadi proses kesetimbangan (Scopes 1993).

Kromatografi Filtrasi Gel

Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran

molekulnya. Pemisahan akan berlangsung di dalam kolom yang berisi gel dalam

bentuk granula dan terdiri atas struktur tiga dimensi dari polimer yang berikatan

silang. Ikatan silang ini menghasilkan pori-pori di dalam granula. Ukuran pori

dipengaruhi oleh tingkatan ikatan silang, makin besar tingkatan ikatan silang

maka makin kecil ukuran pori. Polimer yang membentuk gel matrik harus

mempunyai syarat: tidak mudah bereaksi; harus stabil di dalam kisaran pH, suhu,

dan kekuatan ionik yang lebar; kandungan gugus ion harus kecil untuk mencegah

efek pertukaran ion; mempunyai rigiditas mekanik yang tinggi untuk menahan

laju aliran yang cepat; ukuran partikel harus seragam; dan tersedia untuk berbagai

jenis gel sehingga dapat membedakan ukuran protein yang beraneka ragam

(Boyer 2000).

12

Gel yang dapat digunakan untuk kromatografi filtrasi gel berupa dekstran,

poliakrilamida, agarosa, kombinasi poliakrilamida-dekstran, dan kombinasi

dekstran-agarosa. Gel yang pertama dikembangkan adalah dekstran yang berasal

dari polisakarida. Dekstran mempunyai nama dagang sephadex. Jika dekstran

berikatan silang dengan N,N-metilenbisakrilamida dinamakan Sephacryl. Gel

poliakrilamida diproduksi dari kopolimerisasi akrilamida dengan N,N-

metilenbisakrilamida. Agarosa terbuat dari galaktosa dan anhidrogalaktosa. Nama

dagang gel agarosa adalah Bio Gel-A, Sepharose, dan Superose. Kombinasi

poliakrilamida-dekstran mempunyai nama dagang Ultragel. Sedangkan kombinasi

dekstran-agarosa dinamakan Superdex (Boyer 2000).

Superdex tersusun dari pengikatan kovalen antara dekstran dan agarosa.

Superdex 200 dapat memisahkan fraksi protein dengan bobot molekul sekitar

10.000-600.000 Dalton dengan ukuran gelnya berkisar 13 m. Superdex 200

stabil antara pH 1-14. Superdex 200 mempunyai keunggulan yaitu tingkat resolusi

yang tinggi walaupun dalam keadaan laju alir yang cepat (Hellberg, Ivarsson,

Johansson 1996).

Teknik Amobilisasi

Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian pergerakan dan pertumbuhan

secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau organel. Metode amobilisasi yang

ideal harus mudah pengerjaannya dan tidak merusak substansi yang mengalami

amobilisasi. Faktor-faktor seperti suhu, perubahan pH, dan radikal bebas selama

proses amobilisasi harus ditetapkan kondisi optimumnya (Cao 2005). Bahan

penyangga yang digunakan bersifat inert dan teraktivasi.

Menurut Illanes et al. (2008), teknik amobilisasi terdiri atas penempelan

pada permukaan padat (adsorpsi), ikatan kovalen (covalen bonding), ikatan silang

(crosslinking), mikroenkapsulasi, dan penjebakan (entrapment) (Gambar 4).

Teknik amobilisasi adsorpsi berdasarkan interaksi ikatan ionik, interaksi ikatan

hidrogen, ikatan hidrofobik atau gaya Van der Waals antara enzim atau sel mikrob

dan bahan penyangga (Ramakrishna & Prakasham 1999). Bahan penyangga yang

biasa digunakan adalah alumina, kaca, tanah liat dan penukar ion. Amobilisasi

dengan pengikatan kovalen adalah pembuatan ikatan antara gugus fungsi enzim

seperti OH, -SH, -NH2, dan -COOH atau sel mikrob dengan bahan penyangga

13

anorganik untuk membentuk ikatan kovalen yang stabil. Pembentukan ikatan

kovalen ini akibat penambahan agen pengikat. Bahan penyangga yang digunakan

adalah silika gel yang terlapisi glutaraldehida. Glutaraldehida digunakan untuk

membangun protokol antara gugus fungsi enzim dan bahan penyangga.

Amobilisasi dengan menggunakan teknik pengikatan silang dilakukan dengan

menggunakan dua atau lebih pereaksi. Bahan yang digunakan adalah

polietilenglikol (PEG) dan glutaraldehida. Polietilenglikol sebagai agen presipitasi

dan glutaraldehida sebagai pembentuk ikatan silang (Illanes et al. 2008). Teknik

mikroenkapsulasi adalah suatu teknik yang menggunakan enzim atau sel mikrob

dilingkupi oleh membran polimer semipermeabel yang bulat dengan diameter 1-

100 m. Walaupun molekul enzim atau sel mikrob dilingkupi oleh membran,

substrat maupun produk dapat berdifusi secara bebas melalui membran. Bahan

yang digunakan adalah liposom-polimer (Cao 2005). Teknik amobilisasi dengan

penjebakan adalah membuat enzim atau sel mikrob terjebak di dalam polimer

butiran gel (Illanes et al. 2008).

Prinsip metode penjebakan adalah inklusi sel atau enzim di dalam jaringan

rigid yang berfungsi mencegah sel atau enzim berdifusi keluar medium namun

substrat masih tetap dapat masuk ke dalam butiran gel (beads). Butiran gel berupa

polisakarida (seperti agar, alginat, karagenan, dan selulosa), protein (kolagen dan

gelatin), dan sintetik (poliakrilamida). Matriks alginat, karagenan, dan

poliakrilamid paling luas dipakai pada teknik amobilisasi sel maupun enzim.

Alginat adalah heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan L-guluronat

(Najafpour et al. 2004). Alginat berasal dari alga coklat yang secara luas telah

dipakai sebagai pengental, penstabil, gel, dan film.

Penjebakan sel atau enzim menggunakan alginat karena alginat tidak larut

air, pengerjaannya mudah, dan tidak berbahaya. Campuran sel atau enzim dengan

natrium alginat diteteskan ke dalam larutan yang mengandung kation multivalen

misalnya kalsium klorida akan membentuk reaksi antara alginat dan kation

multivalen menjadi kalsium alginat. Alginat akan mengalami pemadatan oleh

adanya ion kalsium tetapi tidak menyebabkan perubahan temperatur, pH, dan

tekanan osmotik yang drastis. Sel atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi

kalsium alginat dalam bentuk butiran gel (Najafpour et al. 2004). Namun, kalsium

14

alginat secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi

yang dapat meningkatkan kestabilan kimia butiran gel tanpa membatasi transfer

masa.

Keuntungan teknik amobilisasi adalah lebih mudah memisahkan produk

yang dihasilkan, sistem yang lebih stabil, penggunaan kembali biokatalis,

produktivitas volumetrik yang tinggi, dan mereduksi biaya produksi. Enzim yang

teramobilisasi mempunyai half-live lebih panjang dan dapat diprediksi rata-rata

kerusakannya (Cao 2005).

Gambar 4 Teknik amobilisasi enzim. (a) pengikatan kovalen; (b)pengikat silang;

(c) adsorpsi; (d) penjebakan; (e) enkapsulasi.

Karakterisasi Enzim

Suhu dan pH

Suhu mempunyai dua pengaruh yang saling bertentangan. Suhu dapat

meningkatkan aktivitas enzim, tetapi dapat pula merusak struktur enzim. Suhu

optimum merupakan batas keduanya (Dixon & Webb 1978). Peningkatan suhu

sebelum tercapai suhu optimum akan meningkatkan kecepatan reaksi katalitik

enzim karena energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi, yaitu pada saat

15

kompleks enzim-substrat melampaui energi aktivasi terlalu besar, sehingga

memecah ikatan sekunder pada konformasi enzim dan sisi aktifnya. Hal ini

mengakibatkan enzim terdenaturasi dan kehilangan sifat katalitiknya (Martin

1981).

Efek pH pada enzim berkaitan dengan keadaan ionisasi dari sistem yang

dikatalisis, termasuk substrat, dan enzim itu sendiri. Perubahan pH dapat

mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif enzim

sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Kadar pH

yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan menyebabkan ketidakstabilan pada

konformasi enzim sehingga menyebabkan struktur pada enzim rusak. Enzim

mempunyai pH optimum yang khas yang akan menyebabkan aktivitas maksimal.

Keadaan optimum ini dihubungkan dengan saat gugus pemberi proton atau

penerima proton yang aktif pada sisi enzim berada pada kondisi ionisasi yang

tepat. Keadaan optimum tidak harus sama dengan pH lingkungannya (Lehninger

2004).

Aktivator dan Inhibitor

Beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan bagi aktivitasnya. Bila

komponen tambahan tersebut berupa senyawa anorganik disebut kofaktor,

sedangkan jika senyawa organik disebut koenzim. Pada beberapa enzim, kofaktor

dan koenzim terlibat langsung pada proses katalitik, tetapi ada juga yang

berfungsi sebagai pembawa gugus fungsional tertentu. Hampir semua enzim dapat

dihambat oleh senyawa kimia tertentu misalnya ion logam, senyawa pengkelat,

senyawa organik, bahkan substrat enzim itu sendiri (Lehninger 2004). Ion K+ dan

Mg2+ dibutuhkan agar aktivitas enzim -galaktosidase optimum (Mahoney 2004).

Parameter Kinetik

Kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai

konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim

dijaga konstan. Konsentrasi substrat yang amat rendah menyebabkan kecepatan

reaksi amat rendah tetapi kecepatan akan meningkat dengan meningkatnya

konsentrasi substrat. Pada akhirnya, akan tercapai titik batas, dan setelah titik ini

16

dilampaui, kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian kecil dengan

bertambahnya konsentrasi substrat. Pada batas ini, enzim menjadi jenuh oleh

substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger 2004).

Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan yang dinyatakan

sebagai tetapan Michaelis-Menten (KM) adalah konsentrasi substrat tertentu pada

saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Kecepatan maksimum

(vmaks) adalah kecepatan yang berangsur-angsur dicapai pada konsentrasi substrat

tinggi. Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk

hiperbolik kurva tersebut dengan parameter pentingnya adalah konsentrasi

substrat ([S]), kecepatan awal (v0), vmaks, dan KM (Lehninger 2004). Persamaan

Michaelis-Menten adalah sebagai berikut.

[S] K[S] v

vM

maks0

Persamaan Michaelis Menten dapat ditransformasikan ke suatu

persamaan lain yang disebut persamaan Lineweaver-Burk. Persamaan ini akan

menghasilkan nilai vmaks dan KM yang lebih tepat karena pemetaan 1/v0 terhadap

1/[S] menghasilkan garis lurus. Garis ini akan memiliki sudut KM/vmaks,

perpotongan garis pada sumbu y sebesar 1/vmaks dan perpotongan pada sumbu x

sebesar -1/KM (Lehninger 2004). Persamaan Lineweaver-Burk adalah sebagai

berikut.

maksmaks

M

0 v

1

S

1K1

][.

vv

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan antara lain biakan berupa Enterobacter cloacae yang

merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong. Media kultur dan media

produksi terdiri atas 20 g laktosa, 10 g pepton, 20 g ekstrak khamir, dan 10 g

NaCl yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Bufer yang digunakan adalah bufer

fosfat 0,05 M. Bahan untuk penentuan aktivitas enzim -galaktosidase, pembuatan

kurva standar, dan penentuan karakterisasi enzin adalah enzim -

galaktosidase,bufer fosfat 0,1 M pH 7, o-nitrofenil--D-galaktopiranosida

(oNPGal), Na2CO3 1 M, o-nitrofenol (oNP), CaCl2.2H2O, CoCl2.6H2O,

ZnSO4.7H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, HgCl2, MgSO4.7H2O Bahan untuk

penentuan kadar protein metode Bradford dan kurva standar adalah enzim -

galaktosidase, pereaksi Bradford (100 mg coomassie briliant blue dalam 50 ml

etanol 95% kemudian ditambahkan 100 ml H3PO4 85% lalu ditera dengan

akuades hingga 1 liter), dan bovine serum albumin (BSA). Bahan untuk

pengendapan enzim yaitu amonium sulfat dan membran selofan. Pengisi kolom

kromatografi berupa Superdex 200 dan glasswol. Bahan untuk amobilisasi enzim

dan sel adalah Na-alginat dan CaCl2. Bahan untuk mengetahui potensi -

galaktosidase pada susu UHT adalah susu UHT, sel E. cloacae amobil, sel E.

cloacae bebas, enzim -galaktosidase amobil, dan enzim -galaktosidase hasil

kromatografi filtrasi gel, dan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD (Cypress

Diagnostics).

Alat-alat yang digunakan untuk penentuan waktu produksi optimum, uji

aktivitas enzim -galaktosidase dan karakterisasinya, penentuan kadar protein,

dan produksi -galaktosidase adalah mikropipet, tabung reaksi, erlenmeyer,

termometer, neraca analitik, vorteks, penangas air Memmert, penangas es,

stopwatch, pH meter HM-25G TOADKK, kuvet, spektrofotometer UV-Vis 1700

Shimadzu, inkubator Isuzu, botol sentrifus, High Speed Refrigerated Centrifuge

6500 KUBOTA, dan sonikator Eyela. Alat-alat yang digunakan untuk purifikasi

enzim adalah kolom kromatografi, kolektor fraksi, dan ruang pendingin. Alat

18

yang digunakan untuk amobilisasi dan aplikasi -galaktosidase pada susu UHT

adalah pengaduk bermagnet, syringe, dan penangas bergoyang.

Metode Penelitian

Penentuan Waktu Produksi -Galaktosidase Optimum

Sebanyak 2% inokulum bakteri Enterobacter cloacae dengan kerapatan

optik 0,7 diinokulasi ke dalam 300 ml media kultur kemudian diinkubasi pada

suhu 37C. Sampling dilakukan setiap 6 jam dalam dua hari pada hari ke-0 hingga

hari ke-2 sebanyak 15 ml. Jumlah bakteri diukur pada panjang gelombang 600 nm

kemudian sampel disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (15.880 g) selama 10

menit pada suhu 4C. Pelet yang diperoleh dicuci dengan bufer fosfat 0,05 M pH

6,5 kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit

pada suhu 4C. Peletnya dilarutkan dalam 1 ml bufer fosfat 0,05 M pH 6,5

kemudian dilakukan pemecahan sel dengan glass bead selama 5 menit.

Selanjutnya suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10

menit pada suhu 4C. Supernatannya kemudian digunakan untuk uji aktivitas -

galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009).

Produksi -Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997)

Sebanyak 2% inokulum E. cloacae dengan kerapatan optik 0,7 setara

dengan 1,401010 sel/ml diinokulasikan ke dalam 1.000 ml media produksi yang

telah steril, diinkubasi pada suhu 37C. Sel dipanen pada waktu fermentasi yang

menunjukkan waktu produksi -galatosidase optimum. Setelah fermentasi selesai,

cairan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4C.

Peletnya dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan bufer fosfat 0,05 M pH

6,5. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 kemudian

dilakukan pemecahan sel dengan sonikator 50 kHz selama 10 menit pada suhu

4C. Selanjutnya suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15

menit pada suhu 4C. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar -

galaktosidase.

19

Purifikasi -Galaktosidase

Pengendapaan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1993). Pengendapan

enzim dilakukan dengan membuat fraksi pengendapan amonium sulfat 10%, 20%,

30%, 40%, 50%, 60%, dan 70% secara bertahap. Ekstrak kasar -galaktosidase

diendapkan dengan amonium sulfat dengan cara ekstrak kasar ditambahkan

dengan amonium sulfat secara bertahap hingga konsentrasi 10% lalu diaduk

dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 60 rpm selama 20 menit pada

suhu 4C. Setelah itu campuran didiamkan selama 1 jam pada suhu 4C.

Selanjutnya campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15

menit dengan suhu 4C. Endapan enzim dipisahkan dan dilarutkan dalam bufer

fosfat 0,05 M pH 6,5 kemudian diukur aktivitas -galaktosidase dan kadar

protein. Supernatan ditambahkan amonium sulfat kembali seperti prosedur diatas

untuk fraksi pengendapan selanjutnya. Jumlah amonium sulfat (gram) yang

digunakan untuk melarutkan 1 liter larutan enzim menggunakan rumus dibawah

ini dengan S1 merupakan konsentrasi awal amonium sulfat sedangkan S2

merupakan konsentrasi akhir amonium sulfat. Angka 533 menunjukkan bahwa

untuk membuat larutan jenuh 100% dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per

liter. Aktivitas spesifik -galaktosidase yang tertinggi menunjukan persentase

kejenuhan amonium sulfat yang optimum dan selanjutnya digunakan dalam tahap

purifikasi berikutnya.

Jumlah amonium sulfat (gram/liter) = 0,3S2 - 100

S1) -(S2 533

Dialisis. Potongan membran selofan dibasahi dan direbus dengan natrium

bikarbonat 10 mM selama 10 menit. Selanjutnya membran selofan ditiriskan dan

direbus kembali dengan Na2EDTA 10 mM selama 10 menit. Membran selofan

dicuci beberapa kali dengan akuades. Salah satu ujung membran selofan diikat

dan enzim dimasukkan ke dalam kantung dialisis. Kantung dialisis dimasukkan ke

dalam bufer fosfat 0,01 M pH 6,5 sambil digoyang dengan pengaduk bermagnet

dengan kecepatan 100 rpm. Dialisis dilakukan pada suhu 4C selama 24 jam.

Kromatografi Filtrasi Gel (Rao & Dutta modifikasi 1981). Matriks

Superdex 200 dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang berdiameter 2,5 cm

dan tinggi 100 cm, pada bagian dasar kolom diberi glasswool sebagai penahan.

20

Volume enzim yang dimasukkan adalah 1 ml. Matriks dielusi dengan bufer fosfat

0,05 M pH 6,5 dengan kecepatan elusi 0,2 ml/menit. Volume fraksi yang

ditampung masing-masing sebanyak 3 ml. Fraksi eluen yang ditampung dalam

tabung diukur aktivitas enzim -galaktosidase dan kadar protein. Kadar protein

diukur dengan mengukur eluen pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

A280 merupakan panjang gelombang yang menyerap protein, A260 merupakan

panjang gelombang yang menyerap asam nukleat, 1,55 adalah koefisien serapan

maksimum dari protein, dan 0,76 adalah koefisien serapan maksimum dari asam

nukleat (Boyer 2002). Grafik profil elusi dibuat dengan memplotkan sumbu X

berupa nomor fraksi dan sumbu Y berupa nilai kadar protein dan nilai aktivitas -

galaktosidase.

Konsentrasi Protein (mg/ml) = 1,55 A280 0,76 A260

Uji Aktivitas Enzim -Galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009).

Uji aktivitas -galatosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1.000 l bufer

fosfat 0,1 M pH 7 dan 100 l enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu

diinkubasi pada suhu 35C selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 200 l o-

nitrofenil--D-galaktopiranosida (oNPGal) 2 mg/ml dan diinkubasi pada suhu

35C selama 10 menit. Pada menit ke-10 ditambahkan 1.000 l Na2CO3 1 M

untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer

UV VIS pada panjang gelombang 420 nm.

Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara membuat berbagai

konsentrasi oNP dari 0-0,500 mol dengan selang 0,010 mol yang dilarutkan

dalam bufer fosfat 0,01 M pH 7. Sebanyak 1.000 l bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan

100 l akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 200

l oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu 35C selama 10 menit.

Selanjutnya campuran ditambahkan 1.000 l Na2CO3 1 M. Larutan divorteks dan

intensitas warna kuning yang terbentuk diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 420 nm. Hasil pembacaan aktivitas -galatosidase sampel akan

diplotkan pada hasil kurva standar. Satu unit aktivitas -galaktosidase dinyatakan

sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 mol oNP dari

substrat oNPGal permenit pada kondisi percobaan.

21

Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976).

Enzim -galaktosidase sebanyak 20 l ditambahkan 1 ml pereaksi Bradford.

Larutan divorteks dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 595 nm. Pembuatan kurva standar protein yang digunakan

adalah bovine serum albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi dari 0,05-1,25

mg/ml dengan selang 0,05 mg/ml serta perlakuan yang sama dengan penentuan

kadar protein.

Karakterisasi Enzim -Galaktosidase

Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas -galaktosidase.

Pengaruh suhu terhadap aktivitas -galaktosidase diuji dengan cara mereaksikan

larutan enzim dengan substrat selama 10 menit pada berbagai suhu antara 25-50C

dengan selang 5C (Lu et al. modifikasi 2009). Aktivitas -galaktosidase dihitung

dengan mengukur oNP yang terbentuk. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji

dengan menginkubasikan larutan enzim pada berbagai suhu (25-50C dengan

selang 5C) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat

didinginkan di dalam penangas es. Selanjutnya aktivitas enzim tersisa diuji pada

kondisi standar reaksi enzimatis -galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009). Nilai

aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol

(enzim tanpa perlakuan).

Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas -galaktosidase.

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan

enzim dengan substrat pada suhu 35C selama 10 menit (Lu et al. modifikasi

2009) pada berbagai kondisi pH larutan bufer (pH 5,5-8,0 dengan selang 0.5 unit).

Aktivitas -galaktosidase dihitung dengan mengukur oNP yang terbentuk.

Stabilitas enzim terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim dalam

0,1 M larutan bufer berbagai pH (5,5-8,0 dengan selang 0.5 unit) selama 1 jam.

Setelah inkubasi selesai, dengan cepat diuji aktivitas enzim -galaktosidase

tersisanya pada kondisi optimum reaksi enzim -galaktosidase (Lu et al.

modifikasi 2009). Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase

dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). Bufer yang digunakan

yaitu bufer asetat (pH 5,5-6.0) dan bufer fosfat (pH 6,5-8,0).

22

Pengaruh logam kation terhadap aktivitas -galaktosidase. Pengaruh

kation terhadap aktivitas -galaktosidase diuji dengan cara menambahkan kation

(konsentrasi 0,01 M) ke dalam campuran substrat-bufer-enzim, dan diinkubasikan

pada kondisi optimal reaksi enzimatis (Lu et al. modifikasi 2009). Penghambatan

atau peningkatan aktivitas -galaktosidase oleh kation dinyatakan dalam

persentase aktivitas -galaktosidase dibandingkan dengan kontrolnya (tanpa

penambahan kation logam). Kation yang ditambahkan dalam bentuk larutan

CaCl2, CoCl2, ZnSO4, CuCl2, MnCl2, HgCl2, dan MgSO4.

Penentuan parameter kinetik. Sebanyak 1.000 l bufer fosfat 0,1 M pH

optimum, 100 l enzim, dan substrat oNPGal berbagai konsentrasi (0,01-5 mg/ml

dengan selang 0,5 mg/ml) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Campuran

diinkubasi selama 25 menit pada suhu optimum reaksi enzimatis. Setiap 5 menit

sekali campuran diangkat dan ditambahkan 1.000 l Na2CO3 1 M untuk

menghentikan reaksi. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV VIS

pada panjang gelombang 420 nm. Grafik dibuat dengan memplotkan hubungan

antara waktu (sumbu X) dan kadar oNP yang terbentuk (sumbu Y) dari berbagai

konsentrasi substrat awal dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai

kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk

menentukan nilai KM dan Vmaks. Grafik Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan

antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v)

diukur sebagai kecepatan pembentukan produk persatuan waktu.

Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae dan -Galaktosidase Optimasi Konsentrasi Alginat dan Jumlah Sel untuk Amobilisasi Sel

(Becerra et al. modifikasi 2001). Sebelum melakukan amobilisasi sel E.cloacae,

penentuan konsentrasi alginat dan sel optimum terlebih dahulu dilakukan dengan

menggunakan variasi natrium alginat steril 4%, 5%, dan 6% serta variasi bobot sel

sebanyak 10%, 20%, dan 40% (b/v). Variasi butiran gel yang diperoleh kemudian

diinkubasikan pada substrat o-nitrofenil--D-galaktopiranosida (oNPGal) selama

1 jam pada suhu 37C. Formula konsentrasi alginat dan bobot sel yang

menghasilkan aktivitas pembentukan produk yang paling tinggi merupakan

komposisi optimum yang digunakan untuk amobilisasi sel.

23

Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Enzim (Haider dan

Husain modifikasi 2007). Sebelum melakukan amobilisasi enzim, penentuan

konsentrasi alginat optimum terlebih dahulu dilakukan dengan menggunakan

variasi natrium alginat steril 4%, 5%, dan 6% serta enzim -galaktosidase 10%

(v/v). Variasi butiran gel yang diperoleh kemudian diinkubasikan pada substrat o-

nitrofenil--D-galaktopiranosida (oNPGal) selama 24 jam. Konsentrasi alginat

yang menghasilkan aktivitas pembentukan produk yang paling tinggi merupakan

konsentrasi optimum alginat yang digunakan untuk amobilisasi enzim.

Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae dan -Galaktosidase

Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae (Becerra et al. modifikasi 2001).

Sel E. cloacae hasil pemanen jam ke-18 ditambahkan ke dalam natrium alginat

steril. Butiran gel yang dibuat dengan meneteskan suspensi sel dalam natrium

alginat dengan syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 0,2 M steril sambil diaduk

dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 100 rpm selama proses

pembentukkan butiran gel. Butiran gel yang sudah terbentuk dibiarkan selama 2

jam dalam larutan CaCl2 0,2 M pada suhu 4C supaya gel yang terbentuk lebih

mengeras. Selanjutnya butiran gel disaring dengan kertas saring steril kemudian

dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer steril untuk dicuci dengan akuades steril

sebanyak 3 kali. Pencucian dengan akuades steril bertujuan untuk menghilangkan

larutan kalsium klorida yang masih menempel pada butiran gel dan sel yang tidak

terjebak oleh natrium alginat. Butiran gel yang telah dicuci diaplikasikan untuk

menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.

Amobilisasi Enzim -Galaktosidase (Haider & Husain modifikasi

2007). Enzim -galaktosidase hasil kromatografi filtasi gel ditambahkan ke dalam

natrium alginat steril (konsentrasi optimum). Butiran gel yang dibuat dengan

meneteskan suspensi dengan syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 0,2 M steril

sambil diaduk dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 100 rpm selama

proses pembentukkan butiran gel. Butiran gel yang sudah terbentuk dibiarkan

selama 2 jam dalam larutan kalsium klorida. Setelah 2 jam, butiran gel disaring

dengan kertas saring steril kemudian dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer steril

24

untuk dicuci dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Butiran gel yang telah dicuci

diaplikasikan untuk menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.

Aplikasi -Galaktosidase pada Susu UHT

Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT (Haider & Husein modifikasi 2007).

Sel amobil, sel bebas, -galaktosidase amobil, dan -galaktosidase hasil

kromatografi filtrasi gel masing-masing dimasukkan ke dalam susu UHT dengan

perbadingan susu UHT dan butiran gel adalah 1:1 (v/v). Sampel diinkubasi

goyang dengan kecepatan 100 rpm pada suhu optimum selama 24 jam. Setiap 3

jam dilakukan pengambilan sampel sebanyak 250 l. Analisis penurunan kadar

laktosa menggunakan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD (glukosa

oksidase-peroksidase).

Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil. Sel amobil dan

enzim amobil masing-masing dimasukan ke dalam susu UHT. Sampel diinkubasi

goyang pada suhu 37C untuk sel amobil dan 40C untuk enzim amobil.

Pengambilan sampel setelah waktu optimasi amobilisasi sel dan amobilisasi

enzim. Analisis penurunan kadar laktosa menggunakan kit enzimatik analisis

glukosa GOD-POD.

Analisis Laktosa Menggunakan Kit Enzimatik GOD-POD. Sampel

diambil sebanyak 10 l kemudian ditambahkan 1 ml reagen GOD-POD kemudian

diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37C. Larutan dianalisis menggunakan

spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 505 nm. Absorbansi yang

diperoleh dibandingkan dengan absorbansi standar glukosa 100 mg/dL. Jumlah

laktosa yang terhidrolisis setara dengan jumlah glukosa yang terbentuk pada

kondisi percobaan.

Analisis Statistika

Analisis statistik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam

Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini dilakukan dengan tiga kali

ulangan. Model linier (Matjik & Sumertajaya 2002) yang digunakan adalah:

Yij = + i + j+ ij

25

Keterangan:

: pengaruh rataan umum; i: pengaruh hidrolisis laktosa oleh -galaktosidase

pada jam ke-i; j: pengaruh ulangan ke-j; ij: pengaruh galat hidrolisis laktosa oleh

-galaktosidase pada jam ke-i dan ulangan ke-j; i= jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18,

21, dan 24; j = 1, 2, 3.

Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada

tingkat kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data dilakukan dengan program

SPSS 10.0. Jika hasil uji berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Waktu Optimum Produksi -Galaktosidase

Kultur Enterobacter cloacae ditumbuhkan pada media yang mengandung

substrat laktosa 2% yang berperan sebagai energi, karbon, dan induser enzim -

galaktosidase. Keberadaan suatu substrat tertentu dapat memicu suatu

mikroorganisme untuk mensekresi metabolit selnya. Pepton dan ekstrak khamir

sebagai sumber karbon, asam amino, nitrogen, dan vitamin. NaCl berperan

sebagai sumber mineral yang digunakan untuk metabolisme. Nutrisi-nutrisi

tersebut dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri, berkembang biak, dan

menghasilkan enzim yang diinginkan.

Pertumbuhan sel perlu diamati untuk mengetahui sel yang telah diinokulasi

dapat tumbuh di dalam media pertumbuhan. Tujuan lain dari pengamatan tersebut

adalah untuk mengamati pola pertumbuhan dari mikrob tersebut. Prinsip dari

penelitian ini adalah media tumbuh (cair) yang sudah diinokulasi sel diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm setiap interval waktu tertentu.

Penentuan waktu produksi optimum berdasarkan aktivitas enzim -

galaktosidase tertinggi. Satu unit aktivitas -galaktosidase dinyatakan sebagai

banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 mol oNP dari substrat

oNPGal permenit pada kondisi percobaan. Gambar 5 menunjukan bahwa aktivitas

enzim tersebut dari jam ke-12 hingga jam ke-24 mengalami peningkatan hingga

3,712 U/ml dan akan mengalami penurunan pada jam ke-30 hingga jam ke-48.

Penurunan aktivitas enzim ini disebabkan telah terbentuknya produk berupa

glukosa atau galaktosa. Menurut Mahoney (2004), glukosa dan galaktosa ini akan

menghambat kerja -galaktosidase dalam menghidrolisis substrat laktosa.

Pemanenan sel E. cloacae dilakukan pada waktu produksi -galaktosidase

optimum yaitu pada jam ke-24 dengan aktivitas sebesar 3,712 U/ml. Selain itu,

bakteri tersebut menghasilkan -galaktosidase pada fase eksponensial hingga jam

ke-24 dengan nilai OD berkisar 1,849 atau setara 3,701010 sel/ml (Lampiran 6).

Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju yang konstan, masa menjadi dua

kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolik yang konstan, dan

menghasilkan enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1988).

27

Bobot basah dan bobot kering sel perlu diamati untuk menyeragamkan sel

yang digunakan untuk fermentasi. Berdasarkan penelitian yang dilakukan,

didapatkan bobot basah sel sebesar 0,558 g/50 ml media setelah 24 jam masa

inkubasi pada suhu 37C. Hasil ini diikuti dengan didapatnya bobot kering sel

sebesar 0,066 g/50 ml media dan mempunyai jumlah sel sebanyak 3,701010

sel/ml.

Gambar 5 Kurva pertumbuhan E.cloacae () dan kurva

produksi -galaktosidase ().

Produksi dan Purifikasi -Galaktosidase

Produksi -galaktosidase dari E.cloacae dilakukan pada media cair yang

mengandung 2% laktosa lalu diinkubasi berdasarkan penentuan waktu produksi

optimum yaitu pada suhu 37C selama 24 jam tanpa pengocokan. Hal ini

disebabkan bakteri tersebut bersifat anaerobik fakultatif. Pemanenan sel dilakukan

dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu

4C, untuk mencegah kerusakan enzim. Dengan demikian, sel yang berbobot

molekul lebih besar dari larutan media akan mengendap karena gaya gravitasi. Sel

yang diperoleh kemudian dicuci dua kali dengan buffer fosfat 0,05 M pH 6,5 agar

terbebas dari pengotor yang berasal dari media. Selanjutnya sel mengalami

pemecahan sel dengan metode sonikasi. Metode ini bertujuan untuk memecah

dinding sel dengan frekuensi gelombang suara yang tinggi. Sel dipecah di dalam

buffer fosfat 0,05 M pH 6,5 pada suhu 4C agar enzim tidak rusak. Sel dipisahkan

dari ekstrak enzim dengan sentrifugasi. Menurut Lu et al. (2009), enzim -

galaktosidase pada bakteri E. cloacae merupakan enzim intraseluler sehingga

memerlukan pemecahan dinding sel.

28

Gambar 6 Reaksi hidrolisis oNPGal oleh -galaktosidase (Miller 1972).

Metode analisis aktivitas -galaktosidase pada penelitian ini menggunakan

substrat o-nitrofenil--galaktopiranosida (oNPGal). Dalam keadaan normal,

oNPGal tidak berwarna. Ketika -galaktosidase menghidrolisis oNPGal maka

akan menghasilkan galaktosa dan o-nitrofenol (oNP). Reaksi ini dihentikan

dengan penambahan Na2CO3 sehingga pH di dalam larutan menjadi basa sekitar

pH 10-11. Pada pH tersebut oNP akan berubah menjadi bentuk anionik yang

berwarna kuning dan -galaktosidase menjadi inaktif (Gambar 6). Jumlah oNP

sebanding dengan jumlah -galaktosidase yang bereaksi sehingga intensitas warna

kuning yang dihasilkan dari oNP dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi

enzim. Jumlah oNP yang terbentuk dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada

= 420 nm (Miller 1972). Berdasarkan hasil percobaan, aktivitas spesifik enzim

-galaktosidase kasar yang diperoleh sebesar 3,364 U/mg (Tabel 3).

Setelah didapatkan enzim kasar, proses purifikasi selanjutnya adalah dengan

pengendapan menggunakan garam amonium sulfat. Pengendapan protein pada

tahap awal pemurnian berfungsi untuk meningkatkan konsentrasi protein enzim,

mereduksi volume larutan enzim dan memisahkan protein target dari sebagian

kontaminan yang tidak dikehendaki. Terjadinya pengendapan protein pada saat

penambahan garam amonium sulfat dikarenakan terjadinya netralisasi muatan

pada permukaan protein enzim, pengurangan aktivitas kimia protein dan

pengurangan konsentrasi efektif air oleh garam amonium sulfat. Konsentrasi

garam yang diperlukan agar terjadi pengendapan suatu protein berhubungan

dengan jumlah dan distribusi residu bermuatan dan residu polar ionik pada

permukaan protein, jumlah dan distribusi residu hidrofobik yang terekspos pada

permukaan protein serta ukuran dan bentuk protein (Scopes 1993). Proses

pengendapan dengan amonium sulfat dilakukan dalam suasana dingin agar tidak

terjadi peningkatan suhu karena pembebasan energi selama penambahan amonium

sulfat dan mencegah terjadinya denaturasi protein. Amonium sulfat ditambahkan

oNPGal (tidak berwarna)

H2O

-Galaktosidase

Galaktosa oNP (kuning)

29

sedikit demi sedikit dengan kecepatan konstan agar konsentrasi amonium sulfat

dapat merata dalam berinteraksi dengan enzim. Enzim -galaktosidase diperoleh

dengan cara sentrifugasi karena enzim akan mengendap. Pelet yang diperoleh

kemudian dilarutkan dengan bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 untuk menjaga stabilitas

enzim.

Pengendapan dilakukan dengan cara penambahan amonium sulfat dengan

beberapa konsentrasi dimulai dari 10% hingga 70%. Gambar 7 menunjukan

bahwa pengendapan enzim dengan amonium sulfat mempunyai aktivitas spesifik

tertinggi pada fraksi 30% dan 40% (Data pada Lampiran 7). Aktivitas spesifik -

galaktosidase akan menurun pada fraksi lebih dari 40% karena pada fraksi

tersebut enzim yang terendapkan bukan enzim yang diinginkan sehingga aktivitas

-galaktosidase rendah sedangkan kadar protein tinggi. Oleh sebab itu fraksi

enzim hasil semipurifikasi amonium sulfat 30-40% yang diperoleh aktivitas

spesifik 22,804 U/mg. Aktivitas spesifik enzim hasil pengendapan dengan

amonium sulfat lebih tinggi dibandingkan dengan enzim kasar karena konsentrasi

protein yang diperoleh pada tahap semipurifikasi dengan amonium sulfat ini

mempunyai konsentrasi yang lebih sedikit yaitu 6,524 mg protein (Tabel 3).

Tingkat kemurnian presipitat pun meningkat dari 1 kali menjadi 6,78 kali.

Sementara itu, rendemen -galaktosidase pada tahap pengendapan dengan

amonium sulfat yang diperoleh sebesar 8,21%.

Gambar 7 Aktivitas total () dan protein total () hasil purifikasi dengan

amonium sulfat.

30

Tabel 3 Purifikasi -galaktosidase dari E.cloacae

Tahapan Total

Aktivitas (U)

Total Protein

(mg)

Aktivitas Spesifik (U/mg)

Rendemen (%)

Kemurnian (kali)

Enzim Kasar1 1812,057 538,645 3,364 100,00 1,00 Pengendapan amonium sulfat 30-40%

148,781 6,524 22,804 8,21 6,78

Dialisis 126,868 2,026 62,609 7,00 18,61 Superdex 200 111,939 1,100 101,781 6,18 30,26 1 Berasal dari 8 gram bobot basah pelet sel E.cloacae

Tahap purifikasi selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses

pemisahan molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh

membran semipermeabel serta proses yang terjadi adalah difusi dan osmosis. Pada

proses ini, kantong dialisis selofan yang digunakan adalah membran selofan

dengan MWCO (molecular weight cut-off) 10 kD. Tujuannya agar molekul-

molekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti ion logam, inhibitor,

peptida kecil, dan lainnya akan keluar dari membran tersebut sedangkan molekul

besar dan mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam

membran seperti -galaktosidase. Pada tahap dialisis ini total aktivitas yang

diperoleh adalah 126,868 U dan kadar protein 2,026 mg sehingga aktivitas

spesifiknya meningkat hingga 62,609 U/mg. Rendemen yang dihasilkan sekitar

7,00% dan kemurniannya meningkat hingga 18,61 kali (Tabel 3).

Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran

molekulnya. Saat sampel diaplikasikan ke dalam kolom maka partikel dengan

ukuran besar akan bergerak turun lebih cepat dari partikel yang berukuran kecil

karena partikel besar dapat bergerak turun tanpa melalui pori-pori gel. Sementara

itu, partikel yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori gel sehingga

mengalami hambatan untuk sampai ke ujung kolom bagian bawah. Profil elusi

filtrasi gel menggunakan Superdex 200 (Gambar 8) memperlihatkan adanya satu

puncak protein utama yang terelusi pada fraksi 7 hingga fraksi 20. Rendahnya

aktivitas -galaktosidase pada puncak protein menunjukkan bahwa pada fraksi

tersebut masih terdapat protein-protein lain yang memiliki bobot molekul yang

besarnya relatif lebih kecil dibandingkan bobot molekul -galaktosidase. Hasil

31

pengujian aktivitas -galaktosidase menunjukkan adanya satu puncak aktivitas

enzim dimana aktivitas yang tertinggi pada fraksi 12. Pada fraksi nomor 12

memiliki total aktivitas sebesar 111,939 U dan kadar protein 1,100 mg sehingga

aktivitas spesifiknya sebesar 101,781 U/mg (Data pada Lampiran 8). Rendemen

yang dihasilkan adalah 6,18% dan kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali.

Aktivitas spesifik -galaktosidase E. cloacae hasil purifikasi ini lebih besar

jika dibandingkan dengan aktivitas spesifik dari Arthrobacter psychrolactophilus

F2 yaitu 20,4 U/mg (Nakagawa et al. 2006). Tetapi hasil aktivitas spesifik -

galaktosidase dari penelitian ini lebih rendah jika dibandingkan Arthrobacter

acidocaldarius sebesar 112,7 U/mg (Gul-Guven et al. 2007), Bacillus

stearothermophilus sebesar 125 U/mg (Chen et al. 2008), dan Arthrobacter sp.

HB7 sebesar 108,7 U/mg (Trimbur et al. 1994). Perbedaan aktivitas ini

disebabkan perbedaan jumlah induser (laktosa) yang diberikan pada saat produksi

enzim dan perbedaan perlakuan pada saat purifikasi enzim. Selain itu, ekspresi

genetik -galaktosidase yang berbeda dari berbagai mikroorganisme juga

mempengaruhi perbedaan aktivitas spesifik enzim yang dihasilkan seperti pada

Streptococcus themophilus LMD9 sebesar 464 U/mg (Rhimi et al. 2010) dan

Lactobacillus acidophilus R22 sebesar 230 U/mg (Nguyen et al. 2002).

Peningkatan aktivitas enzim -galaktosidase dapat disebabkan akibat rekombinasi

genetik seperti pada S. themophilus LMD9 dan L. acidophilus R22.

Gambar 8 Aktivitas total () dan protein total () hasil purifikasi dengan

kromatografi filtrasi gel menggunakan matriks Superdex 200.

32

Karakterisasi -Galaktosidase

Suhu

Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kinerja enzim.

Penentuan suhu optimum dan stabilitas suhu dilakukan pada rentang suhu 25-

50C. Gambar 9 menunjukan aktivitas -galaktosidase E. cloacae bebas dan

teramobil meningkat hingga suhu 40C. Sebelum suhu optimum, aktivitas enzim

meningkat karena terjadi peningkatan energi kinetik yang mempercepat gerak

vibrasi, translasi, serta rotasi enzim dan substrat sehingga memperbesar peluang

keduanya untuk saling bertumbukan. Suhu yang lebih besar dari suhu optimum

menyebabkan protein enzim mengalami perubahan konformasi yang

menyebabkan aktivitasnya berkurang. Selain itu, penurunan aktivitas enzim

dikarenakan terputusnya ikatan sekunder enzim karena besarnya energi kinetik

dari molekul enzim melebihi untuk mempertahankan ikatan sekunder. Ikatan

sekunder yang terputus menyebabkan hilangnya struktur sekunder dan tersier

enzim disertai berkurangnya atau hilangnya aktivitas enzim. Substrat juga dapat

mengalami perubahan konformasi sehingga sisi reaktifnya tidak dapat lagi atau

mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim pada suhu tinggi.

Pengaruh suhu terhadap aktivitas -galaktosidase diperlihatkan pada

Gambar 9. Aktivitas -galaktosidase bebas maupun teramobil meningkat seiring

meningkatnya suhu hingga mencapai 40C. Enzim -galaktosidase bebas dan

teramobil pada suhu 40C menunjukkan aktivitas tertinggi dengan nilai aktivitas

masing-masing sebesar 17,620 U/ml dan 0,026 U/ml (Data pada Lampiran 9).

Selanjutnya aktivitasnya akan menurun pada suhu 45C dan akan kehilangan

aktivitasnya pada suhu 50C. Teknik amobilisasi enzim dengan penjebakan enzim

menggunakan kasium alginat tidak mengubah suhu optimum dari enzim yang

bersangkutan. Pada suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum, aktivitas relatif -

galaktosidase teramobil lebih besar dibandingkan aktivitas relatif -galaktosidase

bebas. Jika pada suhu 50C, aktivitas relatif -galaktosidase bebas hanya sebesar

0,95% tetapi aktivitas relatif -galaktosidase teramobil masih bisa dipertahankan

hingga 21,39%.

33

Gambar 9 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas -galaktosidase

bebas () dan teramobil ().

Kestabilan suatu enzim bergantung pada ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik,

interaksi ion, dan jembatan disulfida. Kestabilan enzim terhadap panas dapat

terjadi karena pelipatan asam amino penyusun protein membentuk konformasi

tertentu yang tahan terhadap efek denaturasi akibat panas. Gambar 10a

menunjukan pengaruh suhu terhadap stabilitas -galaktosidase bebas. Enzim -

galaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran

suhu 25-40C karena masih menyisakan aktivitasnya diatas 50%. Selanjutnya

mengalami penurunan pada suhu 45C dan 50C dengan menyisakan masing-

masing 7,41% dan 2,42% dari aktivitasnya (Data pada Lampiran 9).

Gambar 10b menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas -

galaktosidase teramobil. Enzim -galaktosidase teramobil relatif stabil setelah

diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran suhu 25-40C. Hal ini disebabkan pada

kisaran suhu tersebut aktivitas -galaktosidase masih dapat menyisakan

aktivitasnya sekitar 60%. Selanjutnya mengalami penurunan pada suhu 45C dan

50C dengan menyisakan masing-masing 40,31% dan 14,86% dari aktivitasnya

(Data pada Lampiran 9). Penurunan aktivitas pada enzim teramobil pada suhu 45-

50C tidak terlalu signifikan karena penjebakan enzim di dalam kalsium alginat

dapat meminimalkan protein enzim yang dapat terdenaturasi akibat peningkatan

suhu karena enzim terlingkupi dalam suatu gel.

Sebagai perbandingan, suhu optimum -galaktosidase E. cloacae B5 sekitar

35C dan enzim ini stabil pada suhu dibawah 30C (Lu et al. 2009). Enzim -

34

galaktosidase dari Streptococcus themophilus LMD9 mempunyai suhu optimum

berkisar 25-40C (Rhimi et al. 2010), Lactobacillus bulgaricus berkisar 35-50C

(Rhimi et al. 2009), dan Kluyveromyces lactis adalah 40C (Kim et al. 2003).

(a)

(b)

Gambar 10 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas -galaktosidase bebas (a) dan teramobil (b). Enzim -galaktosidase diinkubasi pada berbagai suhu selama 1 jam, selanjutnya aktivitas -galaktosidase diuji pada kondisi pH dan suhu optimum.

pH Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas -galaktosidase diuji dengan

menggunakan 2 jenis bufer yaitu bufer asetat (pH 5,5-6.0) dan bufer fosfat (pH

6,5-8,0). Gambar 11 menunjukkan -galaktosidase bebas dan teramobil

mempunyai aktivitas tertinggi pada pH 7,0 dengan masing-masing aktivitasnya

18,181 U/ml dan 0,025 U/ml (Data pada Lampiran 10). Selanjutnya aktivitas -

galaktosidase menurun seiring dengan penigkatan pH. Aktivitas relatif enzim -

galaktosidase bebas pada kondisi mendekati pH 7,0 meningkat dari 26,87%

35

menjadi 100%. Selain itu, aktivitas relatif enzim -galaktosidase teramobil

mendekati pH 7,0 pun meningkat dari 31,20% menjadi 100%. Berdasarkan

penelitian ini, pH optimum enzim bebas tidak berbeda dengan enzim teramobil

sehingga menunjukan penjerapan enzim di dalam kalsium alginat tidak akan

membuat perubahan pH yang dapat mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-

asam amino pada sisi aktif enzim sehingga akan mempengaruhi interaksinya

dengan molekul substrat.

Menurunnya aktivitas enzim karena perubahan pH larutan yang tidak terlalu

besar (sedikit dibawah atau diatas pH optimalnya) disebabkan oleh berubahnya

keadaan ion enzim dan seringkali juga keadaan ion substrat. Perubahan kondisi

ion enzim dapat terjadi pada residu asam amino yang berfungsi katalitik mengikat

substrat maupun pada residu asam amino yang berfungsi untuk mempertahankan

struktur tersier dan kuartener enzim yang aktif. Aktivitas enzim yang mengalami

penurunan tersebut dapat dipulihkan kembali dengan merubah kondisi reaksi

enzimatis pada pH optimalnya. Pada pH tertentu perubahan muatan ion pada

rantai samping yang dapat terionisasi dari residu asam amino enzim menjadi

terlalu besar sehingga mengakibatkan terjadinya denaturasi