PROTOCOLO PROTEÓLISE E ATIVIDADE PROTEOLÍTICA

John Warnens Canuto

O LEITE Sua  principal  proteína  é  a  caseína,    a  caseína  é 

formada  de  quatro  compostos  proteicos  a  kcaseína, αs1caseína e  αs2caseína e  caseínaβ

DEGRADAÇÃO DAS PROTEÍNAS

Metaloproteases  de  psicrotróficos,  são  enzimas extracelulares  produzidas  por  microorganismos mesófilos psicrotróficos com potencial de  crescimento em temperaturas acima de 4 ºC.

PROTEÓLISE

É avaliada pelos métodos de Hull (1947), e o Método de Winzler et al (1948);

Estes  métodos  são  baseados  na    quantificação  do aminoácido  tirosina  (Tir  ,  Tyr  ou  Y)  por  método colorimétrico.

LTIROSINA TIROSINA

CONSTITUINTES DA CASEÍNA

Tyr

Phe

Trp

CONSTITUINTES DA KCASEÍNA

CONSTITUINTES DAS PROTEÍNAS DO SORO

TIROSINA

Formula química: C9H11NO3

Massa Molar: 181.17 g mol1

METODOLOGIA DE HULL

AMOSTRA DE LEITE

5 ml da amostra de leite  +

10 mL de ácido Tricloroacétco (Cl3COOH) 0,72N

Agitação

Repouso por 10 minutos

Filtração em Papel Filtro

5 mL do Filtrado

+10 mL da solução de Hexametafosfato de 

sódio  e carbonato de sódio+3 mL sol Folin Ciocalteal

Agitar em Vortex, e encubar por 5 minutos a 37° C

Leitura em Espectrofotômetro650 nm

Leitura dos resultados pela função da curva padrão em mg/5mL de Tirosina

CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO

5 ml de solução L tirosina concentração conhecida em mg/5mL

  +10 mL de ácido Tricloroacétco 0,72N

Agitação

5 mL

10 mL da solução de Hexametafosfato de sódio  e carbonato de sódio+3 mL sol Folin Ciocalteal

Agitar em Vortex, encubar por 15 minutos a 37ºC

Leitura em Espectrofotômetro650 nm

 

CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO A  partir  de  uma  solução  estoque  1  mg/5mL  fazemos 

diluições  balão  volumétrico  de  50  mL,  devidamente secos  e  conferidos  quanto  a  sua  exatidão.  (curva padrão.xlsx; Curva padrão Final.xlsx)

Volume ( sol Ltirosina 1mg/5ml) Concentração

2,5 0,015 0,02

7,5 0,0310 0,04

12,5 0,0515 0,06

17,5 0,0720 0,08

22,5 0,0925 0,1

27,5 0,1130 0,12

32,5 0,1335 0,14

37,5 0,1540 0,16

42,5 0,1745 0,18

47,5 0,1950 0,2

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,600,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

f(x) = 1,49x  0R² = 0,99

Concentração

AbsorvânciaLinear (Absorvância)

concentração de ltirosina em mg/5mL

Absorvância

CURVA DESCRITA POR M.E. HULL (1947)

METODOLOGIA DE WINZLEI 

LEITE:01 mL da amostra de leite

+2,5 mL de agua destilada

+ 04 mL da Solução desproteinizante 

(ácido perclórico 1,2 mol.L1)

Repouso por 10 minutos

Filtração em papel filtro

03 mL do filtrado

+

0,5 mL da solução Precipitante(ácido 46 fosfotúngstico 8,7mmol.L1 em ácido clorídrico 2,0 mol.L1) 

Agitação

Repouso por 15 minutos

Centrifugação 2.500 rpm/10minutos

Descarte do sobrenadante em  papel toalha

LEITE

5 mL do Solvente Alcalino (solução de carbonato de sódio 0,85 mol.L1) 

0,2 mL do reagente de Folin Ciocalteau 2 N

Incubação 37°C por 15 minutos

Leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda 680nm

Anotar o resultado

BRANCO

0,5 mL do Solvente Alcalino (solução de carbonato de sódio 

0,85 mol.L1) 

0,2 mL do reagente de Folin ciocalteau 2 N

Incubação 37°C por 15 minutos

Leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda 

680nm

Anotar o resultado

Mesmo procedimento da amostra trocando a amostra por uma solução padrão de solução de L

tirosina a 5 mg.5mL1

PADRÃO

RESULTADOS Os resultados se dão através do calculo:

Faria et.al (2014)

REFERÊNCIAS HULL,  M.  E.  Studies  on  milk  proteins:  II

Colorimetric  determination  of  the  partial hydrolysis  of  the  proteins  in  milk.  Journal  of Dairy Science, v. 30, n. 11, p. 881884, 1947.

COSTA,  J.F.  DA  Atributos  de  qualidade associados  à  proteólise  no  leite  cru refrigerado.  Dissertação  de  mestrado. Universidade  Federal  de  Juiz  de  Fora.  2014.  Juiz de Fora, Minas Gerais.

ROSA,  D.T.  Atividades  proteolíticas  e  microorganismos  envolvidos  na  maturação  do queijo Serrano. Tese de doutorado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre 2005

MUITO OBRIGADO!John Warnens Canuto Técnico em Alimentos

Acadêmico do Bacharelado em Ciência e Tecnologia de Alimentos   IF Sudeste MG – Câmpus: Rio Pomba

Bolsista PETCiências AgráriasEmail: johnwarnens@gmail.com