Protocolo proteólise
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O LEITE Sua principal proteína é a caseína, a caseína é
formada de quatro compostos proteicos a kcaseína, αs1caseína e αs2caseína e caseínaβ
DEGRADAÇÃO DAS PROTEÍNAS
Metaloproteases de psicrotróficos, são enzimas extracelulares produzidas por microorganismos mesófilos psicrotróficos com potencial de crescimento em temperaturas acima de 4 ºC.
PROTEÓLISE
É avaliada pelos métodos de Hull (1947), e o Método de Winzler et al (1948);
Estes métodos são baseados na quantificação do aminoácido tirosina (Tir , Tyr ou Y) por método colorimétrico.
LTIROSINA TIROSINA
AMOSTRA DE LEITE
5 ml da amostra de leite +
10 mL de ácido Tricloroacétco (Cl3COOH) 0,72N
Agitação
Repouso por 10 minutos
Filtração em Papel Filtro
5 mL do Filtrado
+10 mL da solução de Hexametafosfato de
sódio e carbonato de sódio+3 mL sol Folin Ciocalteal
Agitar em Vortex, e encubar por 5 minutos a 37° C
Leitura em Espectrofotômetro650 nm
Leitura dos resultados pela função da curva padrão em mg/5mL de Tirosina
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO
5 ml de solução L tirosina concentração conhecida em mg/5mL
+10 mL de ácido Tricloroacétco 0,72N
Agitação
5 mL
10 mL da solução de Hexametafosfato de sódio e carbonato de sódio+3 mL sol Folin Ciocalteal
Agitar em Vortex, encubar por 15 minutos a 37ºC
Leitura em Espectrofotômetro650 nm
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO A partir de uma solução estoque 1 mg/5mL fazemos
diluições balão volumétrico de 50 mL, devidamente secos e conferidos quanto a sua exatidão. (curva padrão.xlsx; Curva padrão Final.xlsx)
Volume ( sol Ltirosina 1mg/5ml) Concentração
2,5 0,015 0,02
7,5 0,0310 0,04
12,5 0,0515 0,06
17,5 0,0720 0,08
22,5 0,0925 0,1
27,5 0,1130 0,12
32,5 0,1335 0,14
37,5 0,1540 0,16
42,5 0,1745 0,18
47,5 0,1950 0,2
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,600,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
f(x) = 1,49x 0R² = 0,99
Concentração
AbsorvânciaLinear (Absorvância)
concentração de ltirosina em mg/5mL
Absorvância
LEITE:01 mL da amostra de leite
+2,5 mL de agua destilada
+ 04 mL da Solução desproteinizante
(ácido perclórico 1,2 mol.L1)
Repouso por 10 minutos
Filtração em papel filtro
03 mL do filtrado
+
0,5 mL da solução Precipitante(ácido 46 fosfotúngstico 8,7mmol.L1 em ácido clorídrico 2,0 mol.L1)
Agitação
Repouso por 15 minutos
Centrifugação 2.500 rpm/10minutos
Descarte do sobrenadante em papel toalha
LEITE
5 mL do Solvente Alcalino (solução de carbonato de sódio 0,85 mol.L1)
0,2 mL do reagente de Folin Ciocalteau 2 N
Incubação 37°C por 15 minutos
Leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda 680nm
Anotar o resultado
BRANCO
0,5 mL do Solvente Alcalino (solução de carbonato de sódio
0,85 mol.L1)
0,2 mL do reagente de Folin ciocalteau 2 N
Incubação 37°C por 15 minutos
Leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda
680nm
Anotar o resultado
Mesmo procedimento da amostra trocando a amostra por uma solução padrão de solução de L
tirosina a 5 mg.5mL1
PADRÃO
REFERÊNCIAS HULL, M. E. Studies on milk proteins: II
Colorimetric determination of the partial hydrolysis of the proteins in milk. Journal of Dairy Science, v. 30, n. 11, p. 881884, 1947.
COSTA, J.F. DA Atributos de qualidade associados à proteólise no leite cru refrigerado. Dissertação de mestrado. Universidade Federal de Juiz de Fora. 2014. Juiz de Fora, Minas Gerais.
ROSA, D.T. Atividades proteolíticas e microorganismos envolvidos na maturação do queijo Serrano. Tese de doutorado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre 2005
MUITO OBRIGADO!John Warnens Canuto Técnico em Alimentos
Acadêmico do Bacharelado em Ciência e Tecnologia de Alimentos IF Sudeste MG – Câmpus: Rio Pomba
Bolsista PETCiências AgráriasEmail: [email protected]