Protéines : Structure et fonctions quad/UE1/Proteines... · 2019. 10. 14. · I- Structure...

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Protéines : Structure et fonctions : Plan : Version 2.0 - 14/10/2019 I- Structure Secondaire : 3 Les structures β : 4 Le feuillet β plissé : 4 Les boucles : 5 Les coudes β : 5 II- La structure tertiaire : 6 III- La Structure quaternaire : 7 La dénaturation des protéines : 8 Le processus de repliement des protéines (folding) : 8 Rôle des ponts disulfures : 9 Oxydation/réduction de ponts disulfures : 9 Autre exemple : Fermeture Leu Zipper (= fermeture éclair à leucine): 10 Les forces de cohésion : 10 Les interactions hydrophobes : (liaison faible) 10 Les liaisons hydrogènes : (liaison faible) 10 Les liaisons salines : (liaison forte) : 11 Exemples de protéines : 11 Les protéines fi breuses: 11 La kératine : 11 Le collagène : 12 Les protéines globulaires : 13 Les protéines membranaires : 13 Structure et fonction de quelques protéines : 14 Page sur 1 26
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  • Protéines : Structure et fonctions :

    Plan : Version 2.0 - 14/10/2019

    I- Structure Secondaire : 3

    Les structures β : 4

    Le feuillet β plissé : 4

    Les boucles : 5

    Les coudes β : 5

    II- La structure tertiaire : 6

    III- La Structure quaternaire : 7

    La dénaturation des protéines : 8

    Le processus de repliement des protéines (folding) : 8

    Rôle des ponts disulfures : 9

    Oxydation/réduction de ponts disulfures : 9

    Autre exemple : Fermeture Leu Zipper (= fermeture éclair à leucine): 10

    Les forces de cohésion : 10

    Les interactions hydrophobes : (liaison faible) 10

    Les liaisons hydrogènes : (liaison faible) 10

    Les liaisons salines : (liaison forte) : 11

    Exemples de protéines : 11

    Les protéines fi breuses: 11

    La kératine : 11

    Le collagène : 12

    Les protéines globulaires : 13

    Les protéines membranaires : 13

    Structure et fonction de quelques protéines : 14

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  • POMC : Pro-opio-mélano-cortine : 14

    Donc la POMC est le précurseur de l’ACTH, des MSH, de la β-lipotropine, et de la β-endorphine. 15

    Opioïdes endogènes : 16

    Histoire des opioïdes : 16

    Structure des opïoides endogènes (OE) : 17

    La structure 3D de la β-endorphine : 18

    Conclusion : 20

    Méthodes d’études des protéines : 21

    A- Chromatographie liquide haute pression (100-120 bars) : 21

    B) Chromatographie par échange d’ions : 22

    C -Techniques immunologiques : 23

    - Néphélémétrie et turbidimétrie: 23

    D) Analyse en spectrométrie de masse : poly : 24

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  • I- Structure Secondaire :

    Protos en grec : le premierProtéine vient du dieu de la mer Proté fils de Poseidon, qui avait la propriété de se transformer selon sa volonté.

    Le milieu biologique dans lequel évolue les protéines est constitué essentiellement d’eau.

    Les acides aminés regroupés à l’intérieur des protéines ont des chaines latérales hydrophobes (des AA constitutifs) tandis que les AA situés en périphérie des protéines et donc au contact de l’eau, sont hydrophiles soit car leur chaine latérale est chargée, soit car elle est polaire. Pour amener les chaines latérales à l’intérieur de la molécule, la chaîne principale constituée de liaisons peptidiques doit au moins partiellement être repliée vers l’intérieur.

    Or, les liaisons peptidiques sont polaires et donc hydrophiles.
Ces groupements polaires de la chaîne peptidique doivent être maintenus vers l’intérieur de la protéine, c’est à dire au contact d’un milieu hydrophobe. Ceci est rendu possible grâce aux liaisons hydrogènes. (schéma poly).

    Le tout dans un environnement extérieur hydrophile (eau)

    Cette configuration est rendue possible grâce à des structures secondaires particulières: hélices alpha (α) et feuillets Bêta (β). Ils constituent la structure secondaire de la protéine.

    Les hélices sont les éléments caractéristiques, avec les structures β, de la structure secondaire des protéines (la structure primaire correspond à l’enchaînement des acides aminés).
L’hélice est caractérisée par son pas (p), c’est à dire le taux de translation par tour d’hélice qui s’exprime généralement en Angström mais aussi caractérisée par n, le nombre de résidus d’acides aminés par tour d’hélice.

    Cette hélice protéique est une structure chirale (non superposable à son image dans un miroir).

    Cette hélice n’a ni axe, ni plan de symétrie (chiralité).

    Le pas peut être à droite ou à gauche. En revanche, une hélice formée d’acides aminés de la série D est l’image en miroir de la même hélice formée d’acides aminés de la série L.

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  • n et p identifient le type d’hélice :

    Lorsque n est négatif, on dit que le pas est à gauche (hélice alpha à gauche).


    Lorsque n est positif, on dit que le pas est à droite (hélice alpha à droite).


    Dans la nature on a surtout des acides aminés de la série L et donc des hélices de la série L(schéma poly)

    L’hélice α est l’hélice la plus communément rencontrée en biologie.

    Elle possède 3,6 résidus d’AA par tour d’hélice. (n = 3,6) et elle possède un pas de 5,4 Angström.

    Cette hélice est maintenue par des liaisons hydrogènes (intra chaîne) qui vont s’établir entre le carbonyle du nième résidu d’acide aminée et l’hydrogène de la fonction amine du n + 4ème résidu.
Cela permet d’exposer des résidus hydrophobes vers l’extérieur ou des résidus hydrophiles vers l’intérieur. Une hélice est donc définie par son pas et son nombre de résidus par tour d’hélice.

    Les structures β :

    Le feuillet β est le deuxième élément de structure dominant des protéines globulaires.

    Cette structure résulte de la combinaison de brins β.
Ces brins sont eux même formés de 5 à 10 résidus d’acides aminés.
Dans ces structures bêtas, on distingue une structure particulière :


    Le feuillet β plissé :

    Dans le feuillet β plissé, comme pour l’hélice α, la conformation du feuillet est conditionnée par les angles φ (phi) et ψ (psi) qui doivent se situer dans les valeurs autorisées par le diagramme de RAMACHANDRAN (poly 45).

    φ = Angle entre l’atome de carbone α et l’atome d’azote.ψ = Angle entre le carbone α du carbonyle et celui de la liaison C == O

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  • Il existe deux types de feuillet β plissé :

    - Les feuillets parallèles.- Les feuillets antiparallèles.


    Que ce soit une hélice α ou un feuillet β, les liaisons hydrogènes s’établissent entre l’atome d’oxygène des carbonyles et l’atome d’hydrogène porté par l’atome d’azote de la fonction amine. 


    À la différence de l’hélice α, dans les feuillets β, les liaisons hydrogènes s’établissent entre chaînes polypeptidiques voisines différentes (liaison inter-chaîne) plutôt qu’à l’intérieur d’une chaîne pour les hélices α.


    Dans les protéines peuvent se succéder des feuillets β parallèles et antiparallèles sachant que les feuillets antiparallèles sont généralement plus stables que les feuillets β parallèles.

    Généralement ces feuillets β sont formés de 5 à 6 segments, de brins beta.

    Les structures dites non répétitives (secondaires elles aussi) :
Les boucles :

    Les boucles peuvent être des éléments de raccord entre :- Deux hélices - Deux feuillets- Une hélice et un feuillet

    Sachant que statistiquement dans une protéine, 50% de la structure secondaire va être représentée par une hélice α ou un feuillet β (et donc 50% de structure non répétitive).
Généralement ces boucles se retrouvent à la surface des protéines plutôt qu’à l’intérieur. (car ils sont volontiers hydrophiles).

    Toujours dans la structure secondaire non répétitive… :


    Les coudes β :

    Ils relient le plus souvent plusieurs segments successifs de feuillets β antiparallèles et se trouvent presque toujours à la surface des protéines (donc eux aussi sont plutôt hydrophiles).

    Le coude représente un changement brusque de direction à 180°. Ce coude qui impose ce changement de direction est maintenu par des liaisons hydrogènes.

    Dans les structures en coude, on retrouve souvent (pas toujours) un résidu proline car ce résidu a la propriété d’être un briseur d’hélice alpha et favoriserait donc la formation de coudes. En général, quand il y a beaucoup de proline, cela casse l’hélice alpha et donne un coude ß.

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  • On distingue le coude β de type 1 :
(cf poly) : C’est une portion d’hélice déformée.

    Le coude β de type 2 : Il est formé par des liaisons hydrogènes entre une proline et une glycine.

    Les épingles à cheveux : Ce sont des boucles qui connectent 2 brins β adjacents antiparallèles.

    L’hélice β (rare) est en réalité un feuillet β mis en hélice

    II- La structure tertiaire :

    Ce terme désigne la façon dont les motifs secondaires sont disposés entre eux et correspond en réalité à la façon dont une chaîne polypeptidique unique va se replier dans l’espace.


    Les domaines ayant des séquences homologues se replient presque toujours de la même façon (exceptions selon les propriétés physico-chimiques du milieu).

    On est toujours à l’échelle du monomère (concerne toujours une structure unique!).

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  • III- La Structure quaternaire :

    C’est la manière dont plusieurs monomères vont s’organiser dans l’espace.Beaucoup des protéines sont constituées d’une seule chaîne polypeptidique. On parle de protéines monomériques.

    Certaines protéines sont constituées de plusieurs chaînes polypeptidiques qui peuvent être identiques ou non pour former un complexe multimérique. 


    Chaque monomère est appelé sous unité. La façon dont les sous unités s’associent constituent alors la structure quaternaire de la protéine (s'associent souvent avec des liaisons covalentes)

    L’hémoglobine est formée de 4 sous unités deux α deux β codées par des gènes différents qui vont s’associer par des liaisons salines et former des chaine monomériques
—> Permet de donner à la protéine des propriétés d’allostérie.

    Propriétés de coopérativité et d’allostérie (« autre forme » en grec) peuvent apparaître si il y a plusieurs sous unités (lorsqu’on active une sous unité, cela modifie toutes les sous unités de la protéine).→ Une protéine monomérique ne peut pas avoir de structure quaternaire. 

Allostérie : Mode de régulation de l’activité biologique par lequel la fixation d’une molécule effective sur un site, modifie la fixation d’autres molécules sur un site distant.

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  • La dénaturation des protéines :


    Exemple de la Température :

    À 60° : Rupture des liaisons hydrogènes (intra-chaine pour α , et inter-chaine pour β) autres que celles établies par l’eau car celles-ci sont très résistantes.

    À 100 ° : Rupture des liaisons salines et des liaisons covalentes, rupture des liaisons peptidiques en particulier, dénaturation des liaisons irréversibles.

    Le processus de repliement des protéines (folding) :

    Il faut conditionner l’aspect macroscopique de l’organe de l’individu

    Au départ on pensait que la structure primaire, c’est à dire l’ordre dans lequel les acides aminés étaient associés sous la dictée du code génétique conditionnait à lui seul la structure tridimensionnelle et donc le repliement des protéines.

    Cependant, d’autres facteurs vont intervenir :

    - Au moment de la synthèse protéique, des protéines spécialisées appelées protéines chaperonnes vont servir de moule biologique pour le bon repliement et pour assurer une bonne conformation à la protéine néosynthétisée/native. 


    Exemple du Prion : protéine anormale qui oblige une protéine saine à adopter sa propre conformation.

    Les conditions physico-chimiques : 

Le repliement final et la conformation des protéines va être dépendant de:

    - La force ionique- La température- Du pH.

    Les possibilités de repliement d’une protéine vont de 2500 à 21000 possibilités.Le bon repliement va être dicté par le niveau thermodynamiques de plus faible énergie.

Exemple : En jetant une pelote de laine même en la jetant un grand nombre de fois on n’obtiendra jamais le même repliement.

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  • Rôle des ponts disulfures :

    Oxydation/réduction de ponts disulfures :

    La façon la plus simple de diminuer le nombre de conformations possibles d’une protéine est d’introduire des ponts disulfures, ce sont des éléments stabilisateurs. 


    Ces ponts vont s’établir entre deux résidus cystéines (possède une fonction thiol) non contiguës (= au moins un acide aminé entre les deux).

    Le nombre de ponts théoriques possible est donné par la formule :

    N = n-1 + n-2 + n-3…+1. (+1 car le dernier terme est forcément 1)N = nombre de cystéines non contiguës

    Exemple : avec 4 cystéines: 3 + 2 + 1 = 6 PDS

    Le passage oxydation/réduction des ponts est un moyen rapide pour une protéine de changer de forme voire de changer de fonction sans passer par le code génétique.


    On parle d’oxyde réduction de ces ponts parce que dans la fonction thiol l’atome de souffre est plus électronégatif que l’atome d’hydrogène et va donc substituer l’hydrogène par un autre soufre, il est à la fois oxydé et réduit.


    Cette réaction ne se fait pas spontanément, elle se fait généralement sous l’action d’une enzyme : La PDI (pont disulfure isomérase). (S-H sous forme réduite / S-S sous forme oxydée). La PDI permet de faire et de défaire les PDS.

    Certains éléments de structure secondaire sont caractéristiques de la reconnaissance d’autres molécules et/ou d’une fonction.

    Par exemple : les enchaînements hélice-boucle-hélice ou hélice-coudeβ-hélice sont assez caractéristiques des facteurs de transcription, c’est à dire des protéines qui vont se lier à l’ADN.

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    NDLR : Pas exactement cette diapo qui a été montré, mais c’est

    pour la compréhension

  • Autre exemple : Fermeture Leu Zipper (= fermeture éclair à leucine):

    Elles sont caractéristiques des processus de dimérisation des protéines. 

Ce sont des hélices qui s’associent entre elles par l’intermédiaire de Leucine. 

Ce sont aussi des caractéristiques des facteurs de transcription.Leucine : AA hydrophobe ++ (via des liaisons électrostatique faibles)


    Les forces de cohésion :

    Les interactions hydrophobes : (liaison faible)

    Ces interactions découlent des propriétés hydrophobes des chaînes latérales des acides aminés.


    Lorsqu’un résidu hydrophobe se trouve au contact de l’eau, les interactions avec les molécules d’eau sont thermodynamiquement défavorisées car elles supposent un réarrangement du réseau des molécules d’eau qui serait couteux sur un plan énergétique.
Il est énergétiquement moins couteux pour les résidus hydrophobes de se regrouper à l’intérieur de la protéine afin d’exposer au milieu aqueux une surface minimale.


    Liaisons hydrophobes : Elles n’existent qu’en milieu aqueux, elles sont faibles mais si elles sont nombreuses elles deviennent globalement fortes (ex du spaghetti collé au mur)

    Autres liaisons intervenant dans la cohésion des protéines :

    Les liaisons hydrogènes : (liaison faible)

    Elles s’établissent entre l’atome d’oxygène (charge partielle négative du carbonyle) et la fonction amine (charge partielle positive et + électrophile que oxygène donc attirera les H) dans les hélices α.

    Ces liaisons hydrogènes s’établissent également entre l’eau du milieu et la protéine. L’eau est indissociable, on parle d’eau constitutive, elles résistent à la lyophilisation parce qu’elles sont trop nombreuses.

    L’énergie de rupture est entre 10 et 20 kJ/mol alors que pour une liaison covalente, l’énergie de rupture est d’environ 110 kJ/mol

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  • Les liaisons salines : (liaison forte) :

    Ces liaisons s’établissent par exemple entre les sous unités d’une protéine multimérique.

    Ce sont des liaisons de type électrostatique entre résidus d’acide aminés qui sont de charges opposées. Entre une lysine/histidine (chargée + au pH physiologique) et l’acide glutamique (chargé - au pH physiologique) par exemple.

    Elles peuvent également s’établir entre l’extrémité C-terminale (chargée - à pH physiologique) d’une sous unité protéique et l’extrémité N-terminale d’une autre sous unité (chargée +).

    Exemples de protéines :


    Les protéines fi breuses:

    Ce sont des protéines très allongées qui ont un rôle essentiellement structural (dans l’os, les tendons, la peau) mais qui peuvent également intervenir dans un rôle fonctionnel comme dans le muscle.

    La kératine :

    Le prototype de la protéine fi breuse est la kératine.Les kératines sont des protéines mécaniquement très résistantes. Les kératines de type α sont prédominantes chez les mammifères avec des variantes en fonction du pHi :

    - Type 1 : acide - Type 2 : basique

    Les cheveux et les ongles sont essentiellement composés de kératines α elles même composées d’un ensemble d’hélices α. Ces hélices α sont elle même regroupées en hélice, généralement regroupées par triplets qui vont se torsader les uns sur les autres.

    Ces kératines sont riches en cystéines qui vont établir des ponts disulfures (donc augmentation de la résistance de la protéine). Il faut 120° pour provoquer la rupture des ponts disulfure de la kératine par exemple.

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  • Le collagène :

    1/4 (donc 25%) de la masse totale d’un mammifère est constituée de collagène.

    - C’est le constituant principal de la matrice extracellulaire. C’est un des constituants principal des os, des cartilages et des tendons.

    - Il est riche en glycine et en proline. 


    - Il existe au cours de sa synthèse des modifications post-traductionnelles de certains AA du collagène (proline et lysine).

    - Ces modifications portent essentiellement sur la proline et la lysine qui vont être hydroxylées (avec la vitamine C en co facteur) grâce à une hydroxylase en hydroxyproline et hydroxylysine.

    - Ceci aura pour conséquence d’autoriser de nouvelles liaisons hydrogènes inter-chaînes, ce qui va expliquer la solidité exceptionnelle de ce type de protéine.

    (certains collagènes, à poids égal, sont plus résistants que l’acier). 

On trouvera en revanche peu de cystéines, donc peu de ponts disulfures.
Certains résidus de lysine vont être hydroxylés et combinés au galactose par l’intermédiaire d’une glycosylation atypique qui fait du collagène une glycoprotéine.


    • Scorbut : Anomalie du collagène, secondaire à un déficit en vitamine C qui intervient comme co-facteurs dans la synthèse d’hydroxyproline : on a une fragilité des tissus conjonctifs

    La structure de base du collagène est une triple hélice.


    Il est essentiellement synthétisé par les fibroblastes.

    On va distinguer plusieurs types de collagène en fonction de leur composition :

    - Type 1 : Pauvre en hydroxylysine et en sucres (dans la peau et les tendons).


    - Type 2 : Riche en hydroxylysine et sucres (présent dans le cartilage)


    - Type 3 : Riche en cystéines, il est riche en glycines, pauvre en sucres et en 
hydroxylysines (peau du nourrisson et les tissus souples comme la paroi artérielle).


    - Type 4 : Riche en hydroxylysines, sucres et hydroxyproline. Collagène constitutif de la membrane basale des cellules.


    - Type 5 : Pauvre en Alanine et on le trouve essentiellement à la surface des cellules.

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  • Les protéines globulaires :

    Elles regroupent un ensemble de protéines très varié. La plupart des enzymes et des protéines de transport sont des protéines globulaires. 


    Ces protéines globulaires ont pour prototype les anticorps, l’hémoglobine et la myoglobine, qui sont des protéines de transports et d’oxygène. 


    Elles sont formées par la succession d’hélice α et feuillet β. Elles sont généralement solubles dans l’eau grâce aux liaisons hydrogènes grâce aux fonctions hydroxyles. Elles peuvent aussi jouer le rôle de messager intracellulaire.


    Elles peuvent être réticulées ou non par la présence de ponts disulfures. On retrouve aussi d’autres enzymes, et des anticorps dans cette catégorie. elles sont généralement solubles dans l’eau avec leurs liaisons hydrogènes grâce à leur fonction hydroxyle.
Les protéines membranaires :

    Associées à la membrane cellulaire, retrouvées pour la plupart sous forme de récepteurs membranaires et constitutifs des canaux ioniques. Leur fonction principale est la communication intercellulaire.

    D’une manière générale elles peuvent avoir plusieurs fonctions:Structurale / Enzymatique / Régulation / Récepteur / Messager / Réserve d’énergie 
(4kcal/mol quand absence d’alimentation).

    Réponses aux questions 2017:

    Tous les AA peuvent être source d’énergie mais à des degrés différents , pas de questions la dessus au concours.

    Pas de liaisons salines dans les structures tertiaires, elles font plutôt partie de la structure quaternaire 


    Liaisons H: structure secondaire Structure secondaire presque que HTertiaire et quaternaire: presque tous types de liaisons possibles

    FIN DU COURS 11/10/2019

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    Myoglobine

  • Rôle des protéines : (x6)Structural

    Enzymatique (Certaines enzymes ne sont pas des protéines)Régulation (chaperon) Récepteur (chaperon)

    Messager : hormones (insuline) Réserve d’énergie (1 gr de protétines = 4 kilos calories)

    Structure et fonction de quelques protéines :

    Nous allons voir comment une protéine codée par un seul gène peut répondre à plusieurs fonctions en créant des molécules plus petites aux fonctions différentes :

    POMC : Pro-opio-mélano-cortine :

    Précurseur des opioïdes endogènes et mélano-stimulante (commande la couleur de la peau) et cortine (hormone du stress) pour ACTH.

    ☞ Elle possède 264 AA, elle est sécrétée par les cellules du noyau arqué de l’hypothalamus et par le lobe antérieur de l’hypophyse.Le CRF hypothalamique va stimuler l’ACTH qui va lui stimuler la production de cortisol.Dans sa séquence on distingue plusieurs peptides d’actions différentes :

    (schéma HC pour illustrer)

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  • N-terminal :

    - Elle va libérer des peptides actifs en particulier la corticotrophine qui comporte 39 résidus et qui est aussi appelée ACTH (adréno-corticotrophine-hormone). Celle-ci a la propriété de stimuler la sécrétion de cortisol par les glandes surrénales.

    Le peptide entier stimule le cortisol.

    Si on ne prend que la séquence 4-10 (indispensable à l’activité de l’ACTH), mais elle aura une activité plus faible que le peptide entier 1-39.
Dans la séquence 1-24, on aura la même action que le peptide complet (1-39). 
Si on prend la séquence 11-24 isolée, on aura une action d’inhibition de la sécrétion de cortisol → propriété antagoniste de l’ACTH.

    Si on enlève un résidu on peut avoir des fonctions différentes = l’ordre et le repliement des protéines très important pour les rôles biologiques. Pour les médicaments : on peut moduler l’activité sur les cibles par modification de la structure et de la fonction.

    C-Terminal :

    - Elle contient aussi des hormones mélano-stimulantes : MSH (mélano stimulating hormone, impliquées dans la synthèse des mélanocytes): α, β et γ MSH. Coloration de la peau. La libération de ces hormones entraîne la coloration de la peau (bronzage).

    - La β-lipotropine qui est une hormone peu active mais qui interviendrait dans la dégradation des lipides. Elle possède une action sur la prolifération des tissus lipidiques.


    - Les 31 derniers résidus : β-endorphine fait partie du groupe des peptides opioïdes endogènes (du côté C terminal). Les clivages enzymatiques se font en majorité dans le sang circulant. Contient dans sa séquence un noyau enképhaline mais n’est pas à l’origine du groupe enképhaline. Elle a une action qui mime celle de la morphine

    Donc la POMC est le précurseur de l’ACTH, des MSH, de la β-lipotropine, et de la 
β-endorphine.

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  • Opioïdes endogènes : 
On désigne sous ce nom un groupe de peptides qui, à divers degrés ont des effets identiques à ceux de l’opium (jus de pavot) ou de ses dérivés. Mêmes effets que la morphine et est synthétisé (pas naturel).


    Dans l’opium il y a des alcaloïdes végétaux qui miment l’action de la morphine (c sont des antalgiques) et dans notre corps on a aussi des molécules qui la miment (mais rien à voir entre elles : certaines sont issues des végétaux et d’autres sont des protéines pourtant même action). L’enképhaline a donc une action qui mime celle de la morphine.

    Histoire des opioïdes :

    Dans les années 70 il a été mis en évidence chez l’animal des sites de fixations spécifiques pour la morphine radioactive et ses dérivés à l’intérieur du SNC (administration de morphine radioactive montrait qu’il existait des sites de fixation spécifiques de cette morphine sur certaines régions du SNC). Il existe donc des récepteurs spécifiques pour la morphine (pour les morphiniques)


    Il doit alors exister circulant dans le système nerveux (sang circulant des mammifères), des ligands endogènes qui comme la morphine devraient se fixer sur ces sites spécifiques du cerveau. 


    1975: Le groupe de HUGHES isole 2 penta-peptides (5 résidus d’AA) à partir du cerveau et de l’hypophyse d’animaux : 


    - Leu-enkephaline- Met-enkephaline

    Ils ont été purifiés à partir de l’hypophyse de l’animal.


    Ces deux pentapeptides injectés à l’animal ont la même action que la morphine et les dérivés de l’opium (soulage la douleur, etc)…

    Toujours dans les années 75-80, le groupe de GUILLEMIN isole la β-endorphine (dans l’hypophyse animale) qui a des actions analogues à la morphine mais provient directement des sécrétions du SNC.

    AKIL à la fin des années 80 a montré que la stimulation électrique substance grise du cerveau (SGPA) chez l’Homme s’accompagnait d’une libération massive de β-endorphine et d’enképhaline dans le liquide céphalo-rachidien. 


    Parallèlement à cette élévation, les patients sont soulagés : effet antalgique puissant.Augmentation de concentration de bêta-enképhaline dans le liquide rachidien.

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  • Les précurseurs de la β-endorphine endogènes dérivent de 3 précurseurs :

    - La β-endorphine a pour précurseur le côté C terminal de la POMC (31 derniers résidus).
 
- Les enképhalines (actifs pour l’essentiel dans la MO) qui sont des peptides plus courts (5-6 résidus) ont pour précurseur la pro-enképhaline A ( 4 noyaux met-enképhaline et un noyau Leu-enképhaline).

- Le groupe des dynorphines (petit peptide aussi, libérés au niveau de la moelle épinière) (autre groupes d’opioïdes endogènes) ont pour précurseur la pro-dynorphine (tronc cérébral, moelle). 

Les dynorphines sont assez semblables aux enképhalines mais touchent la moelle épinière tandis que les enképhalines touchent aussi la zone supra spinale.

    Structure des opïoides endogènes (OE) :
→ Ils possèdent tous du côté N-terminal commun, la séquence consensus Tyr-Gly-Gly-Phe (-X)

    Entre la morphine (des plantes) et les opioïdes du corps, l’analogie se situe au niveau des deux phénols, et de la fonction amine quaternaire, homologie de structure qui explique l’homologie de fonction même si l’un est un opioïde et l’autre des peptides.

    La structure tri-dimensionnelle des enképhalines est essentiellement représentée par l’existence d’un coude β, ce coude est maintenu par des liaisons hydrogènes. Les enképhalines (5AA) sont trop petites pour avoir des hélices α. Mais la β-endorphine, elle, a une hélice α car 31AA.

    Ce coude s’établit grâce à des liaisons hydrogènes qui s’établissent de manière réciproque entre: d’une part la fonction amine de la tyrosine N-terminale avec le carbonyle de la phénylalanine et réciproquement et une deuxième liaison entre l’hydrogène de la fonction amine de la phénylalanine et l’oxygène du carbonyle tyrosine N-terminal.

    Ce coude est indispensable à l’activité de la molécule, sans cela elle ne pouvait plus reconnaitre son récepteur. si on augmente la température ou si on fait une substitution d’acides aminés, on perd le coude et donc la fonction.

    La morphine est issue du monde végétal (jus de pavot), elle n’est donc pas endogène.La di-acylation de la morphine conduit à une augmentation de l’hydrophobicité, on obtient donc le diacétylmorphine ou héroïne

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    Schéma dynorphine HC

  • ENKEPHALINE : coude ENDORPHINE : hélice

    La structure 3D de la β-endorphine :

    C’est un peptide de 31 résidus, structure sous forme d’une hélice α en milieu hydrique.Il y a une corrélation du nombre d’hélice ɑ et l’activité de la β endorphine. Si on réduit le nombre d’hélices ɑ, on réduit l’activité de la β-endorphine 

On reconnaitra du côté N-terminal de la β-endorphine la séquence Tyr-Gly-Gly-Phe.


    Les sites de fixation spécifiques où viennent se fixer les morphiniques radiotracés sont en réalité des récepteurs pour la morphine et ses dérivés.


    Ces récepteurs opiacés ou morphiniques font partie de la superfamille des récepteurs G hétérotrimériques (RCPG).

    Ce sont des récepteurs à 7 domaines transmembranaires (μ (morphine), δ et κ) couplés à une protéine G.
Ils sont présents dans le système nerveux. 
Ces 3 sous types de récepteurs (alpha i, beta, gamma) possèdent de grandes homologies de séquence, tous couplés à adényl-cyclasique (transforme l’ATP en AMPc) de la cellule, leur stimulation va conduire à la modulation de la production d’adényl-cyclique.


    Niveau d’AMPc: niveau d’activation biologique de la celluleLa neurotransmission est dépendante de l’AMPc.

    3 types de conséquences : 2 effets concernent la membrane pré-synaptique, et 1 concerne la membrane post-sympathique.

    ββ α

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    H

  • Pour les effets pré-synaptiques :

    Quand le ligand se fixe : transduction du signal.

    Ce récepteur μ est couplé à une protéine G hétérotrimérique.
(formée de 3 sous-unités, α,β et γ). μ est couplé a une protéine Gi, c’est à dire inhibitrice de l’activité adényl-cyclasique.

    1er effet : pré synaptique


    Via α : Après fixation de GTP sur la protéine Gi, détachement de αi qui migre pour inhiber l’adényl-cyclase membranaire (transforme l’ATP en AMPc), donc baisse de la concentration en adényl-cyclique et donc inhibition de la neurotransmission AMPc- dépendante de certains neurotransmetteurs impliqués dans les messages douloureux (Glutamate, substance P et acétylcholine).Blocage de la transduction → le message douloureux ne 
va pas passer.Il y a donc une baisse de l’AMPcyclique dueà l’action du récepteur mu.

    2ème effet : pré synaptique (explique les effets secondaires)

Via β-γ, lorsque le récepteur μ est activé, il va venir inhiber 
pré-synaptiquement un groupe de protéines canaux (canaux calcium voltage dépendants) et donc bloquer l’entrée de calcium à l’intérieur de la cellule 
→ Inhibition de la neurotransmission calcium dépendante avec deux conséquences : 


    - Relâchement de la cellule (vasodilatation), car l’entrée de Ca+ fait contracter la cellule-Arrêt de la libération de neurotransmetteurs Ca++ dépendants. Ceci entrainant une hypotension (vasodilatation).

Le relâchement des fibres lisses : si cette fibre lisse est contenue dans le colon, on aura un ralentissement du transit ce qui entraine une constipation. Si le muscle lisse se situe autour d’une paroi artérielle on aura une vasodilatation qui explique l’effet hypotenseur.

    Donc double inhibition pour ces récepteurs, l’une est un inhibition de la neurotransmission AMPc-dépendante et l’autre est calcium dépendante. 


    3ème effet (post-synaptique) :


    - Activation du récepteur mu post-synaptique induite, via la sous-unité alpha i, non pas une inhibition mais une activation (ouverture) d’un groupe de canaux potassium appelés KIR (inward retified potassium channel = canal potassium rectifiant rentrant) et K-ATP. Il y a une sortie de K, et hyperpolarisation.

    - Contrôle les entrées et sorties mais surtout les sorties de Potassium. 
A l’état physiologique (2,5 mM de K à l’extérieur et environ 100mM de K dans le milieu intracellulaire)

    - Dans une cellule excitable au repos, il y a du potassium en grande concentration à l’intérieur, et en faible concentration à l’extérieur, et inversement pour le sodium. 


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    Relâchement des fibres lisses :- Constipation (au niveau gastrique)

    - Hypotension (au niveau des vaisseaux)

    - Vasodilatation

  • - Comme l’ion sodium est plus concentré à l’extérieur, il y a des charges négatives à l’intérieur, et positives à l’extérieur. Le neurone est polarisé. 


    -Quand on active le canal, il y a une sortie massive de potassium donc de charges positives, ce qui accentue l’hyperpolarisation de la cellule post synaptique au repos, ce qui rend la synapse inopérante (=non stimulable).

    - Une des actions de la morphine est d’hyperpolariser la membrane post-synaptique, il n’y a donc pas d’influx nerveux, pas de message douloureux.

    Résumé :

    A l’intérieur du système nerveux, il existe des protéines qui ont des effets analogues à la morphine. Comment savoir quel est le rôle des peptides : en stimulant le système nerveux, les peptides sont libérés dans le LCR et ont un effet antalgique.

    Dans le cerveau sont localisés des récepteurs spécifiques pour les opioïdes, avec trois effets principaux sur les cellules cibles ; appartenant essentiellement au système nerveux, avec 3 impacts. 


    Une des actions de la morphine est une inhibition de la libération de neurotransmetteurs, qui est calcium-dépendante. Les opioïdes agissent surtout au niveau de la sous unités µ des RCPG

    Conclusion :


    A partir d’un gène unique, l’organisme peut synthétiser, de par le code génétique, un précurseur clivé en petits morceaux, pour donner des peptides d’actions très différentes. 


    Cellules cibles : SNC

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  • Méthodes d’études des protéines :

    A- Chromatographie liquide haute pression (100-120 bars) :

    On a un liquide biologique à identifier présent dans un solvant A (généralement de l’eau) et un solvant B (solvant organique apolaire, très hydrophobe, par exemple du méthanol), c'est la phase mobile (A), on injecte ce mélange dans une colonne

    Dans celle-ci qui s'appelle phase X ou stationnaire sous pression, on a des millions de microbilles de silice sur lesquelles on a greffé des polyétylènes, résidus hydrophobes comme CH2 – CH2 (plusieurs milliers), à la sortie, on a le lecteur qui lie à une longueur d'onde que l'on peut choisir mais en général c'est à 230 nm pour les protéines.

    Comme les résidus sont hydrophobes, les protéines hydrophobes vont être retenues entre les molécules de silice aux résidus éthylènes tandis que les résidus hydrophiles (donc l’eau) passent librement. 
Pour enlever les hydrophobes qui sont restées collés, on injecte par gradient un solvant B qui est un liquide organique (80%) hydrophobe de manière progressive. A diminue et le B augmente, 99% de A pour 1% de B pendant une minute, puis 98% de A pour 2% de B pendant une minute etc… jusqu’à arriver à 60% de A et 40% de B en général.

    Le solvant organique va petit à petit chasser les protéines hydrophobes. Les moins hydrophobes partiront avec une quantité faible de solvant organique et les plus hydrophobes sortent plus lentement avec une grande quantité de solvant organique.

En fonction du temps et de la quantité de solvant organique, on va petit à petit faire une élution / émission et ainsi décrocher les molécules hydrophobes, puis elles vont passer dans le lecteur à 230 nm et on va avoir plusieurs pics et l'aire sous le pic est proportionnelle à la quantité de résidus hydrophobes.


    Deux facteurs pour identifier les protéines : le temps d'émission et la quantité (pic proportionnel à la concentration en protéines dans l'échantillon). 


    Ce procédé est appelé chromatographie CLHP en phase inverse (phase reverse) car le solvant qui est hydrophile (sortiront en premier) sera en opposition avec les composés hydrophobes (sortiront en dernier).

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  • B) Chromatographie par échange d’ions :


    On peut aussi greffer des ions carboxylates (COO-) (au lieu des résidus hydrophobes dans la technique précédente) dans la phase stationnaire sur les résidus de silice. Le solvant A sera toujours de l’eau mais le B sera cette fois ci du sel NaCl (ou quelque chose de très chargé).À ce moment là, dans le solvant A, on fait passer des molécules de silices avec les ions carboxylates et on va mettre les protéines.

    Mais là, les protéines dans la colonne vont être retenues non pas avec leur hydrophilie, mais avec leurs charges, les résidus de silice couplés aux ions carboxylates vont retenir les protéines chargées positivement, et vont rester collés par des liaisons électrostatiques par les ions carboxylates. Pour les décrocher, on va utiliser non pas un solvant organique, mais un solvant ionique comme le chlorure de sodium NaCl.

    Au départ, quand on a que du solvant A, toutes les protéines chargées positivement restent collées, donc on va progressivement ajouter du NaCl. Gradient : On a 99% de A et 1% de B, puis 98% de A et 2% de B, puis 97% de A et 3% de B, puis 96% de A et 4% de B, puis 95% de A et 5% de B… (c’est chiant hein 🙂 ).

    Petit à petit, les charges + du Na vont déplacer les protéines chargées positivement pour former un sel avec les ions carboxylates et ces protéines vont être éluées en fonction de leur charge et on va les identifier avec un lecteur.

    C'est une chromatographie par échange d'ions car on échange une protéine par un ion. On peut cumuler les deux procédés, on peut greffer une autre colonne avec des résidus hydrophobes et des ions. On peut très bien mettre des charges positives et dans ce cas, ce sont les protéines chargées négativement qui vont être collées.

    On injecte un solvant B qui contient du Chlorure de sodium, gradient de solvant Bcroissant et gradient de solvant A décroissant.

    Les charges + du NaCl vont chasser les molécules sur les ions carboxylates et on décroche petit à petit les protéines chargées +.Longueur d’onde de 230 nm (pour les liaisons peptidiques)À la sortie on a un chromatogramme.

    Chaque protéine va être décrochée à un temps spécifique (car elles possèdent une concentration de sel spécifique).

    On met sur l’aire sous la courbe et on quantifie les protéines de chacun de ces picsDonc phase inverse = séparation par hydrophobicité (phase mobile aqueuse, phase stationnaire hydrophobe), et échange d’ion = séparation par la charge (phase mobile aqueuse, phase stationnaire chargée).

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  • C -Techniques immunologiques :

    - Néphélémétrie et turbidimétrie:

    Pour mesurer les concentrations en protéines on utilise la néphélémétrie et la turbidimétrie.

    On injecte des antigènes (AG) à un lapin qui va produire des anticorps (AC), que l’on récupère et qu’on purifie. On fabrique un kit de dosage avec des AC dirigés contre la protéine d’intérêt.Puis on les compte pour ensuite doser ceux ci en présence d’un sérum. Il y a la formation d’un complexe immun. 

Ce complexe immun en présence d’un milieu adapté, soumis à une lumière incidente entraine deux types de phénomènes lumineux.

    D’une part, la lumière transmise, d’autre part la lumière dispersée :


    Si on mesure la Lumière dispersée (= diffusée) : Néphélémétrie (plus sensible et plus spécifique)—> explication par les excréments de poissons : si on mélange l’aquarium et qu’on éclaire, on voit que tout l’aquarium est éclairé. On mesure l’éclairement, c’est plus interessant car on a une sensibilité 10 fois supérieure à celle de la turbidimétrie. Elle reste une méthode de dosage de référence, on peut descendre jusqu’à 10-9 (nanomolaire) en sensibilité. 


    Si on mesure l’intensité de la lumière transmise : Turbidimétrie (moins sensible car le faisceau ne traverse que quelques microlitres alors que la néphélémétrie éclaire la cellule entière). Si dans ce mélange on fait pénétrer un rayon incident de lumière et qu’on le récupère, il aura été affaibli. Si on mesure la différence, on peut déduire la C en complexes immuns et donc en protéine d’intérêt.

    Facteur de 10 voire 100 entre la détection par la néphélémétrie et turbidimétrie

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  • Turbidimétrie :

    On injecte la protéine d’intérêt a un lapin. On va pouvoir récupérer dans son sang circulant des anticorps spécifique à la protéine d’intérêt. Puis on prend le sérum du patient dans lequel on va injecter une grand quantité d’anticorps. 


    S’en suit d’un rinçage afin de retirer les anticorps qui ne ce sont pas fixer aux protéines. L’anticorps et la protéine d’intérêt forme un complexe immun. On fait ensuite passer un faisceau lumineux (lumière incidente), qui va s’affaiblir en traversant les complexes immuns (brouillards crées par les complexes immuns). 

On a besoin d’un blanc pour comparer le témoin sans complexes immuns. En mesure la différence l’intensité entre le faisceau au départ et a la sortie (faisceau incident), on peut mesurer de façon spécifique la quantité de protéine présente.

    D) Analyse en spectrométrie de masse : poly :

    → Identification de la protéine en fonction de la masse.

    Imaginons un support (plateau) à sur lequel on a mis un liquide organique comme du sérum physiologique (goutte de serum), là-dessus on va faire tomber un rayon laser qui va exploser les molécules et les ioniser (donc on aura des charges + et -).

    Ensuite ces molécules ionisées vont être accélérées par l'intermédiaire d'un champ magnétique intense dans un canon et au bout du canon il y a une cible. 

Plus la molécule est lourde (PM), plus elle va fléchir dans sa trajectoire et va se trouver sous la cible. Et les molécules légères vont aller vers la cible.

    Et en mesurant la distance par rapport au centre de la cible, on va en déduire le PM de la molécule qui a été ionisée par le rayon laser. L’emplacement des protéines sur la cible est spécifique a celle-ci.

    On peut mesurer le temps de vol (time of fly :+ c’est lourd, plus le temps de vol long). 
→ C'est la durée de vol.

    En sachant que lorsque l'on a de grosses protéines, le laser va les casser, donc on aura des morceaux de protéines qui vont être transportés sauf si ce sont de petits peptides, dans ce cas, ils ne seront pas cassés.

    Grâce à des logiciels informatiques / bioinformatiques, on va pouvoir recoller les morceaux et donc savoir la structure de la protéine mère de départ.

    On peut aussi mesurer la concentration en protéines, identifier un ensemble de protéines. Le défaut de ces systèmes, c’est la distance entre la protéine et le centre, limite de 1 – 2m (donc très court) et on peut différencier des protéines qui diffèrent de 5 – 6Da (de 5 – 6 protons).

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  • Pour augmenter la sensibilité, on va augmenter le temps de vol (= ToF), donc pour cela, au lieu d'utiliser un champ continu, on utilise un quadripôle (courant alternatif avec 4 pôles). On va ioniser, les molécules auront un trajet hélicoïdal au lieu de rectiligne.

    Du coup, le trajet des molécules ne va pas être linéaire mais en hélice avant de frapper la cible. En allongeant le temps de vol, on va être plus discriminant au niveau des protéines.

    Donc ici, on va pouvoir séparer des protéines qui ne diffèrent que de 1 proton (1Da) pour la spectro de masse.

    Ce dispositif ne sert pas que pour les protéines, il sert aussi pour d'autres molécules.

    Réponses aux questions 2019 :

    - Les PDS font parti des deux structures tertiaire et quaternaire, donc de la structure tridimensionnelle. 


    -Les PDS peuvent s’établir entre 2 chaines polypeptidiques.

    - Les protéines composées par des chaine identiques sont elles mêmes codées par des gènes identiques 
- La sous unités d’hémoglobine par exemple possède des gènes différents mais si la protéine a la même structure et la même compositions, elle est logiquement codée par le même gène.
- La logique voudrait que les résidus hydrophobe => intérieur et hydrophile => vers l’extérieur, mais dans l’hélice alpha, c’est justement pour avoir cette structure en hélice qu’il y a des liaison H pour prendre la forme hélice …

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    Schéma HC

  • Réponses aux questions 2018 :

    - L’hémoglobine : Multimère formée de 4 sous unités différentes codes par 4 gènes différents (2 sous unités alpha et 2 sous unités béta) liées par des liaisons salines

    - Nombre de ponts disulfure : la formule est n = n-1 + n-2 + n-3 + … + 1. Pour ponts disulfures on s’arrête la ou la différence donne 1 donc pour 4 on s’arrête à n-3 on ne rajoute pas 1!!

    - Pour une protéine de 100 résidus d’AA, possibilité de nombre de repliement : 2^500 à 2^1000 (et pas 2^50) faute dans le cours.

    - Liaisons hydrogènes : entre l’hydrogène de la fonction amine et l’oxygène du carbonyle.

    - Les protéines sont pas toutes solubles dans l’eau, celles qui le sont sont riches en groupements latérales ou sont chargées soit pour prot fibreuse sil y a eu des modifications post traductionelles qui va augmenter leur solubilité.


    - Feuillet béta : association de brins béta par liaisons hydrogènesHélice alpha : liaison hydrogène à l’intérieur de l’hélice.

    Diagramme de Ramachandran : c’est une probabilité énergétique, la liaison peptique est limitée par les angles phi et psy, seulement certains angles peuvent être pris (sinon il y aurait une rupture), le diagramme nous dit que la probabilité qu’elle adopte des angles particuliers dépend des niveaux énergétiques.

    Réponses aux questions 2016:

    Lorsque les liaisons hydrogènes peuvent donner un ensemble fort lorsqu’elles sont nombreuses même si ce sont des liaisons faibles.La masse du collagène, représente 25% de la masse déshydratée du corps (après avoir enlevé l’eau)Les feuillets beta anti parallèles sont plus stables que les feuillets beta parallèlesLa structure quaternaire est la façon dont PLUSIEURS chaines sont organisées et sont attachées dans l’espace.

    Réponses aux questions 2017 :

    Dans une hélice, la chaine polypeptidique est maintenue par des liaisons peptidiques polaires (hydrophiles), et pourtant les liaisons peptidiques sont maintenues à l’intérieur de l’hélice alpha, possible grâce à des liaisons hydrogènes entre l’oxygène du carbonyle d’un des aa et l’hydrogène de la fonction amine n+4ème résidu. Grâce aux liaisons hydrogène, les liaisons peptidiques sont maintenus à l’intérieur dans un milieu hydrophobe.

    Ce sont les liaisons hydrogène qui permette de garder la position intra chaine. Les liaisons hydrogènes entre O du carbonyle et l’H porter par la fonction amine. Précurseur : beta endorphine stable. N’est pas a l’origine des enkephaline (pro-enkephaline)Hélice alpha : comme n peut être négatif : il fait juste faire tourner l’hélice. Pas de questions sur les n des cystéines

    Acides aminés :

    pHi il y a autant de forme acide cationique (donneuse de protons) et forme basique anionique (acceptrice de proton)

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    I- Structure Secondaire :Les structures β :Le feuillet β plissé :Les boucles :Les coudes β :

    II- La structure tertiaire :III- La Structure quaternaire :La dénaturation des protéines :Le processus de repliement des protéines (folding) :Rôle des ponts disulfures :Oxydation/réduction de ponts disulfures :Autre exemple : Fermeture Leu Zipper (= fermeture éclair à leucine):

    Les forces de cohésion :Les interactions hydrophobes : (liaison faible)Les liaisons hydrogènes : (liaison faible)Les liaisons salines : (liaison forte) :Exemples de protéines :Les protéines fi breuses:La kératine :Le collagène :Les protéines globulaires :Les protéines membranaires :

    Structure et fonction de quelques protéines :POMC : Pro-opio-mélano-cortine :Donc la POMC est le précurseur de l’ACTH, des MSH, de la β-lipotropine, et de la β-endorphine.Opioïdes endogènes :Histoire des opioïdes :Structure des opïoides endogènes (OE) :La structure 3D de la β-endorphine :Conclusion :

    Méthodes d’études des protéines :A- Chromatographie liquide haute pression (100-120 bars) :B) Chromatographie par échange d’ions :C -Techniques immunologiques :Néphélémétrie et turbidimétrie:D) Analyse en spectrométrie de masse : poly :