Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Alen Kovačević

Proteomska analiza promjena u stanicama tumora dojke

čovjeka MDA-MB-435S nakon utišavanja integrina αv

Diplomski rad

Zagreb, 2015.

II  

 

Ovaj rad, izrađen na Institutu Ruđer Bošković u Zagrebu, u Laboratoriju za

genotoksične agense Zavoda za molekularnu biologiju i u Laboratoriju za sistemsku

biomedicinu Zavoda za molekularnu medicinu , pod vodstvom dr. sc. Andreje

Ambriović Ristov, znanstvene savjetnice i doc. dr. sc. Maria Cindrića , predan je na

ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u

Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra molekularne biologije.

III  

 

Zahvaljujem se svojim mentorima dr. sc. Mariju Cindriću i dr. sc. Andreji Ambriović

Ristov, na stručnom vodstvu, prenesenom znanju, konstruktivnim kritikama, podršci i

strpljenju tijekom izrade diplomskog rada. Također, srdačno se zahvaljujem svim

djelatnicima Laboratorija za sistemsku biomedicinu i Laboratorija za genotoksične

agense na pomoći i suradnji, a posebno dr. sc. Ani Butorac, dipl. ing. Kristini Perica i

dr. sc. Nikolini Stojanović, na izdvojenom vremenu, prenesenom praktičnom znanju,

motivirajućoj radnoj atmosferi i ugodnom društvu.

Želim se zahvaliti svojim roditeljima i baki Draginji na svakodnevnoj potpori i

podršci te bezgraničnoj i bezuvjetnoj ljubavi koja me kroz cijeli život gura naprijed i

diže kad posustanem. Hvala i bratu Milanu na pomoći, podršci i toleranciji tijekom

svih ovih godina suživota.

Za kraj, htio bih se zahvaliti svojim kolegama i prijateljima Frani, Kruni, Mirni, Katji,

Vesni, Željki i Ivi za 5 prekrasnih godina druženja bez kojih ovo iskustvo ne bi bilo

potpuno. Hvala vam što ste uz mene čak i kad smo kilometrima razdvojeni. Hvala

Tamari, Tamsi, Moniki, Ivanu, Filipu i Luci na riječima ohrabrenja te ugodnim i

opuštenim razgovorima i druženjima.

IV  

 

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad

PROTEOMSKA ANALIZA PROMJENA U STANICAMA

TUMORA DOJKE ČOVJEKA MDA-MB-435S NAKON UTIŠAVANJA INTEGRINA αV

Alen Kovačević

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb

Integrini su transmembranski glikoproteini koji stanici omogućuju kontakt s izvanstaničnim matriksom i drugim stanicama. Sudjeluju u prijenosu molekularnih signala čime reguliraju brojne procese u stanici kao što su adhezija, rast, preživljenje, diferencijacija i pokretljivost. Stanice tumora dojke čovjeka MDA-MB-435S eksprimiraju na svojoj površini heterodimere integrina αVβ3 i αVβ5. Utišavanjem ovih integrina, transfekcijom αV-specifičnom siRNA, stanice MDA-MB-435S postaju osjetljivije na djelovanje vinkristina i paklitaksela te im se smanjuje migratorna sposobnost. U ovom radu opisane su promjene u proteomskom profilu stanica MDA-MB-435S nakon utišavanja integrina αV. Ovo istraživanje moglo bi doprinjeti otkrivanju molekularnog mehanizma povećanja osjetljivosti stanica na vinkristin i paklitaksel i smanjenja migratorne sposobnosti, nakon utišavanja podjedinice integrina αV.

(62 stranice, 8 slika, 18 tablica, 80 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: tumor dojke, MDA-MB-435S, protutumorski lijekovi, integrini, proteomika

Voditelji: doc. dr. sc. Mario Cindrić dr. sc. Andreja Ambriović Ristov, znanstveni savjetnik

Ocjenitelji: doc. dr. sc. Dubravko Pavoković izv. prof. dr. sc. Vesna Benković izv. prof. dr. sc. Antun Alegro

Rad prihvaćen: 18. veljače 2015.

V  

 

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb Faculty of Science Department of Biology Graduation Thesis

PROTEOMIC ANALYSIS OF HUMAN BREAST

CANCER CELLS MDA-MB-435S AFTER SILENCING INTEGRIN αV

Alen Kovačević

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb

Integrins are transmembrane glycoproteins that mediate cell-cell and cell-ECM interactions. They are a part of signal transduction pathways that regulate numerous cell processes such as cell adhesion, growth, proliferation, differentiation and migration. Human breast carcinoma cell line MDA-MB-435S expresses integrins αVβ3 and αVβ5. The silencing of integrins αvβ3 and αvβ5, achieved by αv-specific siRNA transfection, increases sensitivity of MDA-MB-435S cells to vincristine and paclitaxel and reduces their migratory potential. In this study we describe changes in MDA-MB-435S proteome profile upon integrin αV silencing. These results could contribute to better understanding of molecular mechanisms involved in MDA-MB-435S chemosensitation as well as mechanisms involved in decreased cell migration after integin αV silencing.

(62 pages, 8 figures, 18 tables, 80 references, original in: Croatian)

Thesis is deposited in Central biological library Key words: breast cancer, MDA-MB-435S, anti-cancer drugs, integrins, proteomics

Supervisors: Mario Cindrić, PhD, assistant professor Andreja Ambriović Ristov, PhD, senior scientist

Reviewers: Dubravko Pavoković, PhD, assistant professor Vesna Benković, PhD, associate professor Antun Alegro, PhD, associate professor

Thesis accepted: February 18th, 2015

VI  

 

Sadržaj

1. UVOD........................................................................................................................1

1.1. Tumori............................................................................................................................1 1.1.2. Tumori dojke ...........................................................................................................2 1.1.3. Trostruko negativni tumor dojke .............................................................................3

1.1.3.1. Stanična linija MDA-MB-435S kao model istraživanja ................................................4 1.2. Terapija tumora dojke..................................................................................................5

1.2.1. Tubulin vezujući agensi: vinkristin i paklitaksel .....................................................5 1.3. Integrini..........................................................................................................................7

1.3.1. Integrini αv: αvβ3 i αvβ5............................................................................................9

1.3.2. Integrini kao ciljne molekule u terapiji tumora .....................................................10 1.3.2.1. Ciljanje integrina αv s naglaskom na heterodimere αvβ3 i αvβ5....................................10

1.4. Otpornost tumora na protutumorske lijekove posredovana integrinima .............11 1.5. Proteomski pristup istraživanju tumora...................................................................12

1.5.1. Spektrometrija masa kao oruđe u proteomskim istraživanjima.............................14

2. CILJ ISTRAŽIVANJA .........................................................................................16

3. MATERIJALI I METODE...................................................................................17

3.1. Materijali .....................................................................................................................17 3.1.1. Stanična linija ........................................................................................................17 3.1.2. Osnovne kemikalije ...............................................................................................17 3.1.3. Transfekcija malih interferirajućih molekula RNA (siRNA) ................................19 3.1.4. Protutijela...............................................................................................................19 3.1.5. Otopine ..................................................................................................................19 3.1.6. Uređaji i drugi materijali .......................................................................................21 3.1.7. Programska podrška...............................................................................................22

3.2. Metode..........................................................................................................................23 3.2.1. Uzgoj stanica u kulturi...........................................................................................23 3.2.2. Presađivanje stanica...............................................................................................23 3.2.3. Zamrzavanje stanica ..............................................................................................23 3.2.4. Odmrzavanje stanica..............................................................................................24 3.2.5. Utišavanje gena RNA interferencijom...................................................................24 3.2.6. Određivanje ekspresije integrina metodom protočne citometrije ..........................24 3.2.7. MTT test ................................................................................................................26 3.2.8. Priprema staničnog lizata.......................................................................................26 3.2.9. Određivanje koncentracije proteina po Bradfordu ................................................27

VII  

 

3.2.10. Rehidratacija i izoelektrično fokusiranje .............................................................27 3.2.11. Ekvilibracija IPG traka ........................................................................................28 3.2.12. Denaturirajuća elektroforeza u poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) ................28 3.2.13. Bojanje proteina u gelovima Coomassie brilijant plavom bojom .......................29 3.2.14. Snimanje i analiza gelova ....................................................................................30 3.2.15. Odbojavanje izrezanih komadića gelova .............................................................30 3.2.16. Digestija proteina u gelu tripsinom......................................................................30 3.2.17. Pročišćavanje peptida tehnikom Zip-Tip pomoću C18 kolona ..........................31 3.2.19. Analiza peptida spektrometrom masa MALDI-TOF/TOF ..................................32 3.2.20. Pretraživanje baze podataka ................................................................................32

4. REZULTATI..........................................................................................................34

4.1. Utišavanje podjedinice integrina αv specifičnom siRNA čini stanice tumora dojke

čovjeka MDA-MB-435S osjetljivijim na djelovanje vinkristina i paklitaksela............34 4.2. Kvantitativna usporedba proteomskih profila stanica tumora dojke čovjeka

MDA-MB-435S nakon utišavanja integrina αv okriva nekoliko diferencijalno

eksprimiranih proteina......................................................................................................36 4.3. Rezultati analize staničnih proteina spektrometrijom masa i pretrage baze

podataka..............................................................................................................................39

5. RASPRAVA ...........................................................................................................44

6. ZAKLJUČCI..........................................................................................................54

7. LITERATURA.......................................................................................................55

8. ŽIVOTOPIS ...........................................................................................................61

1  

 

1. UVOD

1.1. Tumori

Tumori su skupina bolesti čije je glavno obilježje nekontrolirani rast stanica

koje u nekom trenutku stječu sposobnost prelaska iz jednog tkiva u drugo putem

krvožilnog i/ili limfnog sustava. Tkivo iz kojeg tumor nastaje određuje specifične

osobine pojedinog tumora, a do danas je klasificirano više od 100 različitih tipova.

Prema vrsti stanica iz kojih su nastali, mogu se podijeliti u 5 skupina: karcinomi

(nastali od epitelnih stanica), sarkomi (nastali od stanica vezivnog tkiva), leukemije

(tumori nastali u krvotvornim organima), limfomi i mijelomi (nastali iz stanica

imunosnog sustava) te tumori središnjeg živčanog sustava (http://www.cancer.gov).

U genomu tumorskih stanica postoje brojne mutacije - od točkastih, u kojima

je promijenjen samo jedan nukleotid, do većih kromosomskih aberacija kao što je npr.

translokacija. Uzevši to u obzir, tumore je moguće definirati kao bolest genoma na

staničnoj razini čiji nastanak uzrokuje višegodišnje nakupljanje mutacija u genomu

stanica nekog tkiva (Pecorino, 2012). Nastali tumor (neoplazma) zapravo je

kompleksno tkivo sastavljeno od različitih tipova stanica koje međusobno heterotipski

intereagiraju. Osim toga, tumorske stanice utječu i na normalne stanice koje ih

okružuju i čine tzv. tumoru pridruženu stromu. Stromalne stanice (tumorski

mikrookoliš) također pridonose procesu tumorigeneze. Na slici 1. prikazane su

značajke tumora odgovorne za nastanak i cjelokupni razvoj bolesti, a kao najvažniju

treba istaknuti nestabilnost genoma i podložnost mutacijama (Hanahan, 2011).

Mutacije bitne za razvoj tumora su one koje se događaju u proto-onkogenima

te tumor supresorskim genima. Prekomjernom ekspresijom ili mutacijama u proto-

onkogenima nastaju onkogeni, geni čiji produkt je sposoban transformirati normalne

stanice u tumorske (npr. geni koji kodiraju za proteine uključene u proces staničnog

rasta i proliferacije). Tumor supresorski geni su pak oni čiji produkt sprječava

nastanak tumora (npr. geni koji kodiraju za proteine uključene u popravak DNA).

Gubitak ekspresije ili mutacija u ovim genima dovodi do nastanka tumora (Pecorino,

2012).

2  

 

Slika 1. Obilježja tumora (preuzeto i prilagođeno iz Hanahan, 2011).

1.1.2. Tumori dojke

Tumor dojke najučestaliji je tip tumora u žena zapadnog svijeta. Nakon raka

pluća, drugi je po redu uzročnik smrti žena, a pojavnost je u porastu. U SAD-a, 2014.

godine, od ukupnog broja novonastalih tumora u ženskoj populaciji, čak 29% čine

tumori dojke (Siegel i sur., 2014). Iako vrlo rijetko, tumor dojke može se javiti i kod

djece, adolescenata te muškaraca (http://pathology.jhu.edu).

Tumori dojke su heterogena skupina bolesti koja se prema histološkoj

klasifikaciji može podijeliti na epitelne tumore i sarkome. Manje od 1% tumora dojke

čine sarkomi, tumori nastali u vezivnom tkivu dojke, dok ih je velika većina nastala u

epitelnom tkivu. Ovisno o tome nastane li epitelni tip raka dojke u stanicama žlijezda

koje stvaraju mlijeko ili u epitelnim stanicama mliječnih cjevčica, govorimo o

lobularnom ili duktalnom tipu raka dojke. Skoro 80% tumora dojke ubraja se u

skupinu invazivnih duktalnih karcinoma (http://pathology.jhu.edu).

3  

 

Estrogeni, ženski spolni hormoni, ključni su u procesu nastanka i razvoja ove bolesti.

Čimbenici koji utječu na povećanje rizika od nastanka raka dojke su brojni, a

uglavnom su povezani s produljenom izloženošću organizma djelovanju estrogena.

Rana prva menstruacija, kasna menopauza, oralna kontracepcija, konzumacija

alkohola i pretilost, samo su neki od rizičnih čimbenika (Pecorino, 2012). Osim

navedenih okolišnih i endogenih utjecaja, veliku ulogu igra i genetska predispozicija.

Čak 20-30% slučajeva nasljednog raka dojke povezano je s mutacijama u tumor

supresorskim genima BRCA1 i BRCA2 (Levanat i Cvok, 2010), čiji su proteinski

produkti zaduženi za regulaciju transkripcije, popravak DNA i regulaciju staničnog

ciklusa (Pecorino, 2012).

Razvoj medicine i molekularne biologije doveo je do boljeg razumijevanja

heterogenosti tumora dojke na molekularnoj razini. Na osnovu razlika u ekspresiji

receptora za estrogen (ER), receptora za progesteron (PR), receptora 2 za faktor rasta

epiderme (engl. Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) te citokeratina,

tumore dojke moguće je podijeliti na 5 različitih tipova: tip sličan normalnoj dojci,

luminalni A, luminalni B, HER2-bogati i tumori slični bazalnim/trostruko negativni

tumori (Hollestelle i sur., 2010). Potpunija slika molekularnog profila određenog tipa

tumora dojke dovela je do bolje njege pacijenata, a to se očituje ranijim otkrićem

bolesti te razvojem novih ciljanih lijekova (Pecorino, 2012).

1.1.3. Trostruko negativni tumor dojke

U velikoj raznolikosti do sada navedenih tipova tumora dojke, posebno se

ističe skupina tzv. trostruko negativnih tumora dojke (TNBC, engl. Triple negative

breast cancer) kakvih je 10 – 17% svih invazivnih tumora dojke (Badve i sur., 2011).

Stanice TNBC ne eksprimiraju značajne količine ER, PR niti HER2, što ovu bolest

čini teškom za liječenje. Pacijenti ne reagiraju ni na jednu do sada poznatu terapiju

osim konvencionalne kemoterapije koja je, s obzirom na visok metastatski potencijal

ovog tipa tumora i sklonost recidivu, ograničene učinkovitosti (Carey i sur., 2010).

TNBC se javljaju najčešće kod mlađih žena (<50 godina) s BRCA1 mutacijom

(Badve i sur., 2011), a karakteriziraju ga visok gradus, visok mitotski indeks te

prisutnost mutiranog p53. Oko 70% TNBC ekprimira bazalne markere te ih se ubraja

4  

 

u tumore slične bazalnima. Obilježja bazalnih tumora stanice stječu procesom

epitelno-mezenhimalne tranzicije kada dolazi do promjene u ekspresiji brojnih

proteina. Epitelne stanice ovim procesom poprimaju mezenhimalni fenotip što u

konačnici rezultira pojavom agresivnog tumora s visokim metastatskim potencijalom

(Carey i sur., 2010).

1.1.3.1. Stanična linija MDA-MB-435S kao model istraživanja

Istraživanja biologije tumora vrše se na modelima staničnih linija izoliranih iz

pacijenata (Cailleau i sur., 1978). U ovom istraživanju korištena je stanična linija

TNBC s visokim metastatskim potencijalom, MDA-MB-435S. Stanice su vretenastog

oblika, a u kulturi rastu pričvršćene za podlogu.

Stanična linija MDA-MB-435S izolirana je sedamdesetih godina dvadesetog

stoljeća iz pleuralne tekućine pacijentice s dijagnosticiranim tumorom dojke.

Korištena je u brojnim istraživanjima kao model tumora dojke sve do trenutka kada

Ross i suradnici (2000) objavljuju rad u kojem je zbog velike sličnosti sa staničnom

linijom melanoma M14, grupirana s nekoliko drugih staničnih linija melanoma,

dovodeći tako u pitanja stvarno podrijetlo stanica MDA-MB-435S. Usporedivši ove

dvije stanične linije 4 godine kasnije, (Rae i sur., 2004) zaključuju da se radi o istoj

staničnoj liniji: MDA-MB-435S su stanice melanoma i ne mogu se dalje koristiti u

istraživanju tumora dojke. Već iste godine, Sellappan i suradnici (2004) pokazali su

da stanice MDA-MB-435S ipak posjeduju svojstva karakteristična za stanice dojke

čovjeka (izlučivanje mliječnih proteina i lipida), no eksprimiraju i proteine

karakteristične za melanocite (tirozinaze i melan A). Napokon, Ann F. Chambers

(2009), rješava misterij o podrijetlu sporne stanične linije. Pregledaviši i usporedivši

sve dostupne literaturne podatke o obje stanične linije, zaključila je da stanice MDA-

MB-435S ipak potječu iz tumora dojke, no zbog slabe diferenciranosti eksprimiraju

proteine (markere melanoma) koji nisu uobičajeni za tumor dojke. Činjenicom da su

obje stanične linije ženskog kariotipa, a M14 stanice su inicijalno izolirane iz

muškarca, potvrdila je svoje sumnje. Analiza mikrosatelita ovih dviju staničnih linija

pokazala je da su one zaista identične (Hollestelle i sur., 2010), no nisu podrijetlom iz

melanoma, nego iz tumora dojke (Chambers 2009).

5  

 

1.2. Terapija tumora dojke

Uz konvencionalne kemoterapije, unazad dvadeset godina, za liječenje tumora

dojke razvijene su brojne ciljane terapije. Većina ciljanih terapije koje se danas

koriste u klinici zasnovane su na prisutnosti, odnosno odsutnosti, ER, PR i HER2

receptora. Pacijentice oboljele od tumora dojke čije stanice eksprimiraju sva tri

navedena receptora, imaju najbolju prognozu. U liječenju takvih slučajeva, kao jedna

od više mogućnosti, najčešće se primjenjuje hormonska terapija, npr. Tamoxifen,

kompetitivni inhibitor receptora za estrogen ili Arimidex, inhibitor aromataze (Tinoco

i sur., 2013; http://www.breastcancer.org/treatment/hormonal). Pacijentice s

prekomjerno eksprimiranim HER2 uobičajeno primaju terapiju usmjerenu na HER2

receptore, npr. Herceptin, humanizirano monoklonsko protutijelo, u kombinaciji s

citostaticima (Tinoco i sur. 2013; http://www.herceptin.com/). No, liječenje

pacijentica s TNBC otežano je odsustvom ekspresije ER, PR i HER2 receptora. Jedini

pristup liječenju TNBC za sada je konvencionalna kemoterapija (Tinoco, 2013;

Carey, 2010).

Nekolicina konvencionalnih citostatika izaziva veća oštećenja DNA te tako

uzrokuje staničnu smrt. Upravo je ciljanje DNA jedan od učinkovitih načina borbe

protiv TNBC, s obzirom da ih većina posjeduje mutacije u BRCA1 genu. Naime,

BRCA1 mutanti imaju poremećene mehanizme popravka DNA pa su osjetljivi na

tvari koje uzrokuju oštećenja DNA, kao što je npr. cisplatina ili drugi lijekovi na bazi

platine (Carey, 2010). Osim protutumorskih lijekova koji djeluju na DNA (cisplatina),

u liječenju tumora dojke koriste se i lijekovi koji ciljaju mikrotubule, vinkristin i

paklitaksel (Ganguly i Cabral, 2011), a detaljnije su opisati u idućem odjeljku.

 

1.2.1. Tubulin vezujući agensi: vinkristin i paklitaksel

Osim molekule DNA, meta konvencionalnih protutumorskih lijekova su

svakako elementi citoskeleta, i to njegov dinamički dio – mikrotubuli, polimeri

izgrađeni od α i β tubulina. Uz sudjelovanje u unutarstaničnom transportu i

održavanju oblika stanice i njene polarnosti, mikrotubuli obavljaju vrlo bitnu ulogu za

vrijeme diobe stanice. Tijekom mitoze, mikrotubuli formiraju diobeno vreteno te

osiguravaju pravilnu raspodjelu kromosoma u stanice kćeri (Zhou i Giannakakou

2005). Do danas je otkriveno nekoliko organskih spojeva koji se vežu na mikrotubule

6  

 

i uzrokuju poremećaje u funkcioniranju diobenog vretena. Ovi spojevi svojim

djelovanjem dovode do poremećaja u mitozi i nastanka poliploidnih stanica koje u

konačnici umiru. Ciljanje mikrotubula tumorskih stanica koje se brzo dijele jedan je

od najučinkovitijih pristupa u kemoterapiji, a otrovi diobenog vretena značajni za

liječenje raka dojke su vinkristin i paklitaksel (Ganguly i Cabral, 2011). Strukture

lijekova prikazane su na slici 2.

Slika 2. Strukturne formule (a) vinkristina i (b) paklitaksela (slike struktura preuzete s http://www.chemspider.com/).

Vinkristin (Slika 2a) je organski spoj izoliran iz lišća madagaskarske biljke

Catharanthus roseus još prije pedesetak godina. Naknadno je prepoznat kao lijek za

leukemiju te se počeo koristi u liječenju nekolicine tumora, uključujući i tumor dojke.

Vinkristin se veže na β tubulin, te u visokim koncentracijama uzrokuje

depolimerizaciju mikrotubula, narušava integritet diobenog vretena i zaustavlja

stanicu u mitozi. Drugi spoj, paklitaksel (Slika 2b), izloliran je iz kore biljke Taxus

brevifolia. Uspješan je u liječenju tumora dojke, jajnika, prostate, tumora pluća ne-

malih stanica te Kaposijevog sarkoma (Zhou i Giannakakou, 2005). Kao i vinkristin,

paklitaksel se veže na β tubulin te uzrokuje poremećaje u diobi stanice. Za razliku od

depolimerizirajućeg učinka vinkristina, paklitaksel je prije tridesetak godina

prepoznat kao stabilizator mikrotubula. Svojim vezanjem na β tubulin u visokim

koncentracijama potiče polimerizaciju mikrotubula i zaustavlja stanicu u mitozi nakon

čega slijedi indukcija apoptoze i/ili mitotska katastrofa. Zanimljiva je činjenica da oba

lijeka primijenjena u niskim koncentracijama također utječu na dinamiku

7  

 

mikrotubula, no pri tome ne utječu i na proces (de)polimerizacije. Ukupna masa

polimera mikrotubula u stanici ostaje ne promijenjena, a protutumorsko djelovanje je

unatoč niskoj koncentraciji i dalje zadržano, što upućuje na činjenicu da je glavni

mehanizam djelovanja ovih protutumorskih lijekova zapravo inhibicija dinamike

mikrotubula, a ne njihov učinak na masu polimera mikrotubula u stanici (Le i Bast,

2011; Zhou i Giannakakou, 2005).

1.3. Integrini

Integrini su skupina staničnih transmembranskih adhezijskih receptora

zaduženih za ostvarivanje kontakta stanice s drugim stanicama ili izvanstaničnim

matriksom (Takada i sur., 2007). Svojim prihvaćanjem za elemente izvanstaničnog

matriksa, integrini stanici služe kao mehanosenzori, sudjeluju u organizaciji

citoskeleta te su bitni za procese migracije, proliferacije, diferencijacije i preživljenja

stanice. Osim vrlo važne uloge prilikom oplodnje, embrionalnog razvoja ili

imunosnog odgovora, uključeni su i u patološke procese kao što su bolest mišićna

distrofija ili razvoj tumora (Millard i sur., 2011).

Strukturno, integrini su heterodimeri sastavljeni od nekovalentno povezanih

glikoproteinskih podjedinica α i β. U čovjeku 18 α i 8 β podjedinica integrina tvori

24 različita heterodimera. Obje integrinske podjedinice protežu se kroz staničnu

membranu te posjeduju kratke unutarstanične C-terminalne repove i duge

izvanstanične N-terminalne domene (Desgrosellier i Cheresh, 2010). Heterodimeri

integrina se N-terminalnim domenama vežu za specifične sljedove aminokiselina

elemenata izvanstaničnog matriksa (laminin, kolagen, vitronektin, fibrinogen,

fibronektin, itd.) ili za površine drugih stanica, dok unutarstanični dio stupa u

interakciju s aktinskim citoskeletom preko adaptornih molekula (talin, α aktinin,

vinkulin). Bitno je napomenuti da unutarstanični repovi ne posjeduju enzimatsku

aktivnost, te uz ostvarivanje kontakta s citoskeletom, služe kao vezna mjesta za

različite kinaze kao što su kinaza fokalne adhezije (engl. focal adhesion kinase, FAK),

kinaza vezana za integrin (engl. integrin linked kinase, ILK), i nereceptorska kinaza

Src. Stupajući u kontakt s ligandima ili nekim drugim faktorima (dvovalentni kationi)

integrini sudjeluju u provođenju signala između stanice i okoline dvosmjernom

signalizacijom: iz okoline u stanicu (engl. outside-in) te iz stanice u okolinu (engl.

8  

 

inside-out). Aktivirani različitim signalima iz okoline integrini utječu na proliferaciju,

polarnost, rast i migraciju stanica (slika 3). S druge strane, obrnutom signalizacijom

preko citoplazmatskih komponenti (npr. vezanjem talina) stanica modulira afinitet

integrina za vezanje s izvanstaničnim partnerima (Alberts, 2008, Takada, 2007).

 Slika 3. Signalni putevi posredovani integrinima (preuzeto i prilagođeno s http://www.sabiosciences.com/pathway.php?sn=Integrin_Pathway).

 

9  

 

1.3.1. Integrini αv: αvβ3 i αvβ5  

Do danas je kod čovjeka otkriveno 24 heterodimera integrina koji nastaju

kombinacijom 18 α i 8 β podjedinica (Millard, 2011). Različite kombinacije

podjedinica rezultiraju s heterodimernim strukturama integrina s različitim

funkcijama i vrlo često drugačijim afinitetom za određene ligande (Takada, 2007).

Sparujući se s podjedinicama β1, β3, β5, β6, β8, podjedinica αv tvori 5 poznatih

različitih heterodimera, bitnih u procesima zacjeljivanja rana, angiogeneze te razvoja

tumora. Svi integrini s αv podjedinicom vežu ligande s RGD motivom (arginin-glicin-

aspartat slijed), no razlika u specifičnosti za pojedine ligande postoji. Integrini αvβ5

svojim izvanstaničnim dijelom vežu isključivo vitronektin, dok heterodimer αvβ3

intereagira s nekoliko različitih liganada uključujući vitronektin, fibronektin i

fibrinogen.

U različitim tipovima stanica tumora dojke primijećena je ekspresija integrina

αvβ1, αvβ3, αvβ5 i αvβ6, a njihova prisutnost često je povezivana s migracijom i

adhezijom stanica. Na površinama stanica MDA-MB-435S uočeni su heterodimeri

αvβ3, αvβ5 te male količina αvβ6 (Taherian i sur,. 2011; Wong i sur., 1998).

Za razliku od zdravih epitelnih stanica, gdje integrina αvβ3 gotovo da i nema

(Desgrosellier i Cheresh, 2010), primijećena je njegova prekomjerna ekspresija u

melanomima, tumorima prostate, dojke, gušterače, jajnika te vrata maternice.

Eksprimiran na površini tumorskih stanica, integrin αvβ3 potiče rast primarnog

tumora, povećava metastatski potencijal stanica te im omogućuje preživljenje

neovisno o usidrenju (Weis i Cheresh, 2011). Sloan i suradnici (2006) u svom radu su

pokazali da povećana ekspresija integrina αvβ3 utječe na spontanu metastazu stanica

tumora dojke u kosti.

Integrin αvβ5 također je prekomjerno eksprimiranu u brojnim tumorima (npr. u

glioblastomu) i na površini endotelnih stanica u angiogenezi (Desgrosellier i Cheresh

2010; Weis i Cheresh, 2011), no za razliku od integrina αvβ3 prisutan je i na velikom

broju zdravih stanica (Pasqualini, 1993). Ima značajan utjecaj na metastatski

potencijal, a zanimljivo je da stanice koje eksprimiraju oba heterodimera, αvβ5 i αvβ3,

mogu spontano metastazirati, dok β3 negativne stanice (s integrinima αvβ5) za

migraciju zahtijevaju citokine i faktore rasta (Weis i Cheresh, 2011).

10  

 

1.3.2. Integrini kao ciljne molekule u terapiji tumora  

Jedan od glavnih elemenata bitnih za embrionalni razvoj organizma su

adhezijske molekule, uključujući i integrine. No, kao što je već spomenuto, i

tumorske stanice koriste biokemijska svojstva integrina prilikom rasta tumora,

invazije u okolno tkivo te metastaze (Tucker, 2006.). Kako bi se navedeni procesi

mogli odvijati uspješno, integrini za svoju aktivnost zahtijevaju aktivaciju, vezanje

liganda, stvaranje fokalnih adhezija te kontakt s citoskeletom. Inhibicijom nekog od

događaja potrebnih za njihovu aktivaciju dokida se funkcija integrina, što ih čini

prikladnom metom za razvoj protutumorskih lijekova (Millard, 2011).

Većina protutumorskih lijekova usmjerenih na integrine su antagonisti

integrina koji se vežu na ligand vezujuće mjesto, te na taj način sprječavaju aktivaciju

integrina. Antagonisti integrina svojim vezanjem oponašaju prirodne ligande, a kao

potencijalni učinkoviti agensi razmatrana su protutijela, ciklički peptidi, dezintegrini,

peptidomimetici i male antagonističke molekule. Osim ovog tipa inhibicije integrina,

razvijaju se i drugi lijekovi, a neki od njih usmjereni su na unutarstanične repove

integrina, mjesta stvaranja fokalnih adhezija (Millard, 2011). Dokidanje funkcije

integrina moguće je postići i na razini mRNA i to RNA interferencijom. Unosom

malih interferirajućih RNA molekula (engl. small interfering RNA, siRNA) moguće je

utišati gene za specifične podjedinice integrina te na taj način smanjiti koncentraciju

određenog heterodimera na površini tumorskih stanica (Cao, 2006). Unatoč velikom

potencijalu za liječenje tumora, u usporedbi s drugim ciljanim protutumorskim

lijekovima, lijekovi koji ciljaju integrine sporo pronalaze svoj put do kliničke

primjene (Tucker, 2006).

1.3.2.1. Ciljanje integrina αv s naglaskom na heterodimere αvβ3 i αvβ5

Antagonisti integrina αv mogu se podijeliti na monoklonska protutijela i RGD

oponašajuće peptide (Desgrosellier i Cheresh, 2010). Među prvim antagonistima

integrina koji su ušli u klinička istraživanja bili su lijekovi etaracizumab (MEDI-522,

humanizirano mišje protutijelo LM609 usmjereno protiv integrina αvβ3), i njegov

prekursor Vitaxin (Tucker, 2006). Vitaxin je u prvoj fazi kliničkih istraživanja

pokazao učinak na angiogenezu te stabilizirajući učinak na razvoj bolesti pacijenata

oboljelih od nekih tipova tumora bubrega. Etaracizumab također uspješno inhibira

11  

 

angiogenezu, i osim toga zaustavlja rast tumora izravno utječući na tumorske stanice.

Treće značajno monoklonsko protutijelo koje je pokazalo protutumorsko djelovanje u

prvoj fazi kliničkih ispitivanja je CNTO 95, usmjereno protiv heterodimera integrina

αv, uključujući αvβ3 i αvβ5 (Desgrosellier i Cheresh, 2010). Od navedenih protutijela

usmjerenih na integrine αv, trenutno je u aktivnim kliničkim istraživanjima CNTO 95

u kombinaciji s bevacizumabom (monoklonsko protutijelo usmjereno protiv

krvožilnih endotelnih faktora rasta (VEGF); Avastin) kod liječanja pacijenata s

uznapredovalim čvrstim tumorima (https://clinicaltrials.gov).

Drugi pristup ciljanju integrina αv je pomoću peptida s RGD motivom koji

oponašaju prirodne ligande integrina αIIβ3, αvβ3 i αvβ5. Pokazano je da minimalni

slijed potreban za blokiranje adhezije integrina pomoću RGD mimetika treba

sadržavati svega 4 aminokiseline (Tucker, 2006). Kao najuspješniji među RGD

peptidima, izdvaja se cilengitide, ciklički peptid, antagonist heterodimera αvβ3 i αvβ5.

Unatoč negativnom ishodu treće faze kliničke studije provedene na pacijentima s

glioblastomom u kojoj je ispitivana uspješnost djelovanja cilengitida u kombinaciji s

temozolomidom (Stupp i sur., 2014), cilengitid je trenutno u drugoj i trećoj fazi

kliničkih studija u kojima se ispituje njegova djelotvornost u kombinaciji s raznim

drugim protutumorskim lijekovima i/ili radioterapijom kod pacijenata s tumorima

glave i vrata, tumorom pluća malih stanica, te glioblastomom

(https://www.clinicaltrialsregister.eu).

1.4. Otpornost tumora na protutumorske lijekove posredovana

integrinima

Velik problem u liječenju tumora predstavlja otpornost tumora na

protutumorske lijekove, koja može nastati tijekom procesa tumorigeneze ili se razviti

mutacijama i/ili prilagodbom tumorskih stanica uslijed primjene terapije. Mehanizmi

stjecanja otpornosti povezani u s promjenama u (I) molekulama metama

protutumorskih lijekova, (II) nizvodnim događajima od ciljane molekule te (III)

staničnim adhezijama. Promjene u staničnim adhezijama zaslužne za stjecanje

otpornosti mogu biti posredovane integrinima (Ambriović-Ristov i Osmak, 2006).

12  

 

Vezanje integrina za komponente izvanstaničnog matriksa aktivira različite

signalne puteve koji tumorskim stanicama osiguravaju preživljenje nakon izlaganja

protutumorskim lijekovima. Ovaj fenomen primijećen je na nekoliko različitih

staničnih linija. U stanicama glioma, signali posredovani integrinima, αvβ3 i αvβ5, štite

stanice od izlaganja topotekanu (Uhm i sur., 1999). Stanice karcinoma grkljana

otporne su na cisplatinu, doksorubicin i mitomicin C, a mehanizam otpornosti

ostvaren je povećanom ekspresijom integrina αvβ3 koji utječe na povećanje ekspresije

glutationa, bitnog za uklanjanje reaktivnih oksidativnih vrsta nastalih uslijed

djelovanja navedenih citostatika (Brozović i sur., 2010.). Aoudijt i Vouri (2001)

pokazali su da stanice tumora dojke MDA-MB-231 i MDA-MB-435S vezanjem

integrina β1 na laminin-1 izbjegavaju apoptozu potaknutu djelovanjem vinkristina i

paklitaksela. No, budući da stanice MDA-MB-435S postaju osjetljivije na navedene

terapeutike nakon utišavanja integrina αvβ5 (Ferenčak, 2013) osim integrina β1 u

mehanizmu razvijanja otpornosti na vinkristin i paklitaksel u ovom staničnom modelu

sudjeluje i vitronektin vezujući protein αvβ5. U ovom diplomskom radu predstavljena

je proteomska analizom stanica MDA-MB-435S nakon utišavanja podjedinice

integrina αv kako bismo se približili mehanizmu kojim navedene stanice stječu tu

otpornost.

1.5. Proteomski pristup istraživanju tumora

Još od pojave biologije kao znanstvene discipline, jedan od glavnih ciljeva

svih istraživanja je razumjeti načela funkcioniranja stanica te u konačnici i cijelog

organizma. Prvi veliki korak ka tom cilju bio je projekt sekvenciranja humanog

genoma (engl. The Human Genome Project), započet 1990. godine (Venter i sur.

2001). Dostupnost podataka o skoro 3 milijuna parova baza ljudskog eukromatina

dovest će do boljeg razumijevanja patoloških stanja na molekularnoj razini, što će

rezultirati boljom kvalitetom liječenja. Kada su Venter i suradnici 2001. godine

objavili skoro pa potpuni slijed nukleotida ljudskog genoma, iznenađujuća je bila

spoznaja da u ljudskom genomu postoji oko 20 000 protein kodirajućih gena, koji ne

čine niti 2% cijelkupnog genoma. S obzirom na procjenu da u ljudskom organizmu

postoji minimalno 500 000 proteina (Banks i sur., 2000), postalo je jasno da iako je

13  

 

genetička informacija neophodna, proteini su glavni izvršitelji staničnih procesa i ono

što funkcionalno čini razlike među stanicama (Muñoz, 2014). Uzevši u obzir

postojanje nesinonimnih SNP-ova (engl. single nucleotide polymorphism), procese

alternativnog prikrajanja, posttranslacijske modifikacije te različite utjecaje okoliša i

patoloških stanja organizma, 20 000 identificiranih protein kodirajućih gena može u

konačnici rezultirati s preko 2 milijuna različitih proteinskih komponenti (Muñoz,

2014, Lane 2005). Ukupan sastav proteina u određenoj stanici, tkivu ili organizmu u

određenom trenutku i uvjetima naziva se proteom. Za razliku od genoma koji je

gotovo identičan u svakoj stanici ljudskog organizma, proteom je izrazito dimaničan

te se razlikuje od stanice do stanice, u različitim vremenskim okvirima i staničnim

uvjetima (Muñoz, 2014). Identificirati, okarakterizirati i kvantificirati ukupni sastav

proteina neke stanice, tkiva ili organizma u određenom trenutku i uvjetima, cilj je

proteomskih istraživanja (Lane, 2005).

The Human Genome Project rezultirao je brojnim korisnim otkrićima te na taj

način revolucionarizirao biomedicinska istraživanja. No, genomika sama po sebi ipak

ne daje uvid u mehanizme razvoja bolesti iako je to bila jedna od glavnih motivacija

za sekveciranje ljudskog genoma. Integracija dostupnih podataka o genomima,

transkriptomima i proteomima mogla bi ubrzati biomedicinska istraživanja ljudskog

organizma u zdravim i raznim patološkim stanjima (Tan i sur., 2012; Kim i sur.,

2014). Ubrzo nakon što su Venter i suradnici sekvecirali ljudski genom, i proteomika

pronalazi svoje mjesto u raznim biomedicinskim istraživanjima, uključujući biologiju

tumora. Znanstvenici i liječnici počeli su sve više koristiti proteomski pristup kako bi

odredili proteomske profile tumora, identificirali molekularne mete za nove lijekove

te se približili primjeni personalizirane medicine u liječenju tumora. Proteomskim

pristupom moguće je identificirati molekularne razlike među različitim tipovima

tumora te ih usporediti s kontrolnim tkivima, npr. zdravim tkivima. Jedan od velikih

ciljeva uporabe proteomike u biologiji tumora jest i otkrivanje specifičnih tumorskih

markera koji bi omogućili ranu dijagnozu, ali i praćenje razvoja bolesti. Osim

navedenog, proteomika bi mogla pomoći i u rasvjetljenju mehanizama kojim stanice

postaju otpornije na lijekove (Tan i sur., 2012), što je ujedno i glavna motivacija za

izradu ovog rada.

14  

 

1.5.1. Spektrometrija masa kao oruđe u proteomskim istraživanjima

Spektrometrija masa (engl. mass spectrometry, MS) je metoda korištena u

analitičke svrhe od 40.-ih godina prošlog stoljeća. Molekule analita se ioniziraju te se

ioni u plinskoj fazi razdvajaju i detektiraju prema omjeru mase i naboje (m/z,

bezdimenzijska veličina). Svoju primjenu prvo pronalazi u petrokemijskoj industriji,

gdje je korištena za kvantitativno određivanje smjese ugljikovodika (Galić, 2004). U

biološkim istraživanjima se počinje koristiti 40-ak godina kasnije, nakon otkrića

blagih načina ionizacije uzorka: ionizacije elektroraspršenjem (engl. electrospray

ionizationi, ESI) i matricom potpomognute ionizacije uz desorpciju laserskim

zračnjem (engl. matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI). ESI i MALDI

omogućili su prevođenje bioloških makromolekula u plinovitu fazu bez obzira na

njihovu veličinu, polarnost i termičku labilnost (Lane 2005). Od tada MS postaje

nezamjenjiva tehnika u proteomskim istraživanjima (Han i sur., 2008). Ova

revolucionarna otkrića, iza kojih stoje J. Fenn i K. Tanaka su prepoznata, te 2002.

godine nagrađena Nobelovom nagradom za kemiju (Lane, 2005).

Osnovni dijelovi spektrometra masa su sustav za uvođenje uzoroka, ionski

izvor (ionizator), jedan ili više analizatora masa te detektor, a izgled dobivenog

spektra izravno ovisi o načinu ionizacije analita i o vrsti analizatora masa. Shema

uređaja s naznačenim različitim tipovima pojedinih dijelova, prikazana je na slici 4.

Bitno je napomenuti da su svi dijelovi smješteni u vakuum kako bi se spriječilo

nastajanje neželjenih produkata i gubitak naboja analita.

 

Slika 4. Shema masenog spektrometra s naznačenim različitim tipovima ionskih izvora i analizatora masa (shema preuzeta i prilagođena prema Galić, 2004).

15  

 

Uzorak se unosi u ionizator preko sustava za uvođenje uzorka uz minimalno

narušavanje vakuuma. Potom, kako bi analiza bila moguća, analit je potrebno dovesti

u ionizirano stanje i plinsku fazu. Ioni u ionskom izvoru nastaju izbijanjem elektorna,

(de)protoniranjem, stvaranjem adukata ili prijenosom nabijene vrste iz kondenzirane u

plinsku fazu. Ovisno o tehnici ionizacije, tj. o količini primijenje energije na uzorak,

može doći do procesa fragmentacije molekula analita. Nakon ionizacije, dobiveni se

ioni odjeljuju u analizatoru masa na temelju njihovih m/z omjera. Tip analizatora

masa definira kvalitetu analize, a parametri o kojima ona ovisi su gornja mjerljiva

granica mase, razlučivost (sposobnost razdvajanja signala iona s malom razlikom u

masama) i mogućnost tandemske MS (MSn, gdje je n = 2, 3, 4 ...) koja podrazumijeva

barem dva stupnja analize masa nakon dodatne fragmentacije odabranog ionskog

prekursora. Nakon prolaska kroz analizator masa, ioni dolaze do detektora gdje se

prevode u mjerljiv signal koji se potom računalno obrađuje i analizira (Galić, 2004;

Lane, 2005).

U izradi ovog rada korišten je sustav MALDI-TOF/TOF, pogodan za analizu

bioloških makromolekula. Nakon što su proteini izolirani iz biološkog uzorka te

odijeljeni nekom od metoda (npr. dvodimenzionalna elektroforeza) podvrgavaju se

proteolizi. Smjesa nastalih peptida potom se pomiješa s UV apsorbirajućom matricom

(npr. sinapinska kiselina) i nakapa na MALDI pločicu gdje kokristaliziraju. Kada je

MALDI pločica smještena u uređaj, smjesa matrice i uzorka se pogađa laserom (npr.

dušikov laser, λ = 337 nm). Zbog velike količine energije dolazi do zagrijavanja,

sublimacije te ekspanzije matrice skupa s analitom u plinsku fazu. Molekule matrice

potom predaju protone peptidima koji na taj način postaju ionizirani te se pod

potencijalom od najmanje 20 kV počinju kretati prema detektoru kroz analizator koji

mjeri vrijeme leta (engl. time-of-flight, TOF). Ionizirani peptidi se prolaskom kroz

cijev analizatora odjeljuju na temelju različitih brzina. Zbog poboljšanja razlučivosti,

nakon prolaska kroz prvu TOF cijev, ioni se reflektiraju na ionskom zrcalu te se

usmjeravaju u drugu TOF cijev kroz koju u konačnici stižu do detektora. Analiza

rezultira spektrima masa pomoću kojih se vrši identifikacija proteina iz uzorka (Galić,

2004; Woods i sur., 2014).

16  

 

2. CILJ ISTRAŽIVANJA

Stanice trostruko negativnih tumora dojke ne eksprimiraju značajne količine

receptora za estrogen, receptora za progesteron niti receptora 2 za faktor rasta

epiderme, što ovaj tip tumora čini otpornim na danas poznate ciljane terapije. Jedini

pristup liječenju je primjena kemoterapije. Ovi tumori su inicijalno često otporni na

djelovanje kemoterapije, skloni recidivu i brzom metastaziranju, pa su

kemoterapeutici ograničene učinkovitosti u liječenju (Carey i sur., 2010). Prema tome

bilo koji postupak koji bi povećao učinkovitost kemoterapije povećao bi i

učinkovitost liječenja.

U stanica brojnih tumora, uključujući i tumore dojke, primijećena je

prekomjerna ekspresija integrina αvβ3 i αvβ5 (Desgrosellier i Cheresh, 2010). Integrini

αvβ3 pospješuju rast primarnog tumora i metastaziranje, dok integrini αvβ5 povećavaju

metastatski potencijal stanica (Weis i Cheresh, 2011). Neobjavljeni rezultati grupe

Ambriović-Ristov pokazuju da u stanicama tumora dojke MDA-MB-435S utišavanje

podjedinice integrina αv, čime se smanjuje ekspresija integrina αvβ3 i αvβ5, čini stanice

osjetljivijima na citostatike koji djeluju na mikrotubule (vikristin i paklitaksel), te im

smanjuje migratorni potencijal.

Cilj ovog istraživanja je identificirati, i ako je to moguće objasniti, promjene u

proteomskim profilima stanica trostruko negativnog tumora dojke MDA-MB-435S

nakon utišavanja podjedinice integrina αv. Podaci o diferencijalno eksprimiranim

proteinima mogli bi rasvijetliti mehanizam kojim stanice nakon utišavanja

podjedinice integrina αv postaju osjetljivije na vinkristin i paklitaksel. Važnost ovih

rezultata je u odgovoru na pitanje mogu li se integrin specifične siRNA molekule

koristiti zajedno s nekim od citostatika koji djeluju na mikrotubule u liječenju

trostruko negativnih tumora dojke.

17  

 

3. MATERIJALI I METODE

3.1. Materijali

 

3.1.1. Stanična linija

Svi pokusi u ovom radu provedeni su na stanicama tumora dojke čovjeka

MDA-MB-435S (ATCC® HTB-129™). Stanice su vretenastog oblika i rastu

pričvršćene za podlogu.

3.1.2. Osnovne kemikalije

U tablici 1. su prikazane kemikalije korištene u izvedbi eksperimenta.

Tablica 1. Osnovne kemikalije.

KEMIKALIJA PROIZVOĐAČ KEMIKALIJA PROIZVOĐAČ

Vinkristin Sigma, SAD Opti MEM (engl. Minimum Essential Media)

Invitrogen, SAD

Dulbeccova modifikacija Eaglove hranjive podloge (engl. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)

Invitrogen, SAD

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT)

Chemicon International INC, SAD

Dulbeccova modifikacija Eaglove hranjive podloge (engl. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)

Lonza, Švicarska Dimetilsulfoksid (DMSO), p. a. Kemika, Hrvatska

Serum fetusa goveda (engl. Fetal Calf Serum, FCS)

Invitrogen, SAD Albumin serum goveda (engl. Bovine Serum Albumin, BSA)

Sigma-Aldrich, Njemačka

Tripsin Invitrogen, SAD Inhibitori proteaza Roche, Švicarska

Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen, SAD DNaza I Roche, Švicarska

18  

 

Etilendiamin tetraoctena kiselina (EDTA) Kemika, Hrvatska Rnaza A Sigma-Aldrich,

Njemačka

Bisakrilamid, ≥98% Sigma, SAD Trifluoroctena kiselina (TFA), p.a. Merck, Njemačka

Amonijev persulfat (APS), ≥98% Sigma, SAD Tripsin Merck, Njemačka

Tetrametiletilendiamin (TEMED), ∼99% Sigma, SAD

α-cijano-4-hidroksicimetna kiselina (CHCA), ≥99%

Sigma, SAD

Agaroza Sigma, SAD Coomassie Brilliant Blue G250 Bio-Rad, SAD

Amonijev sulfat, ≥99,5% Kemika, Hrvatska Bromfenol modrilo Fluka, Njemačka

Amonijev hidrogenkarbonat (NH4HCO3), p.a.

Sigma, SAD Mineralno ulje Bio-Rad, SAD

Acetonitril (MeCN), p.a J. T. Baker, SAD Aceton, p.a. Kemika, Hrvatska

Urea za elektroforezu Sigma, SAD Etanol, p.a. Kemika, Hrvatska

Tiourea, ≥99% Sigma, SAD Metanol, p.a. Kemika, Hrvatska

Ditiotreitol (DTT), ≥99% Sigma, SAD 1-butanol, p.a. Kemika, Hrvatska

Jodoacetamid (IAA), ≥90% Sigma, SAD

Octena kiselina (CH3COOH) (99%; φ), p.a.

Kemika, Hrvatska

Natrijev dodecilsulfat (SDS), ∼95% Sigma, SAD Klorovodična kiselina

(HCl), (37%; φ), p.a. Kemika, Hrvatska

Glicin, ≥99% Sigma, SAD Fosforna kiselina (H3PO4), (85%; φ), p.a. Kemika, Hrvatska

CHAPS (3-[(3-kolamidopropil)-dimetilamonio]-1-propansulfonat), ≥98%

Sigma, SAD Glicerol, p.a. Kemika, Hrvatska

Trizma® base, ≥99,9% Sigma, SAD

Pročišćena destilirana voda, otpornost ≥18 MΩ/cm3 pri 25 °C, ukupna količina ugljika ≤ 5 µg dm-3

-

Akrilamid, ≥99% Sigma, SAD

19  

 

3.1.3. Transfekcija malih interferirajućih molekula RNA (siRNA)

Za utišavanje podjedinice integrina αV su korištene αV-specifične siRNA

molekule Silencer Select Predesigned & Validated siRNA i kontrolne, nespecifične

siRNA Silencer Select Negative Control proizvođača Ambion, navedene u tablici 2.

Tablica 2. siRNA molekule korištene za transfekciju stanica.

SPECIFIČNOST KONCENTRACIJA ZA UTIŠAVANJE / nM KATALOŠKI BROJ LOKUS ID

Nespecifična (engl. Scrambled) 50 4390844 -

αV 50 4390821 S7568

3.1.4. Protutijela

Protutijela korištena prilikom određivanja ekspresije integrina metodom

protočne citometrije prikazana su u tablici 3.

Tablica 3. Protutijela korištena u protočnoj citometriji.

SPECIFIČNOST PROIZVEDENO U ORGANIZMU PROIZVOĐAČ KATALOŠKI

BROJ

IgG1 (izotipska kontrola) Miš Sigma-Aldrich 088K4753 PRIMARNA

PROTUTIJELA αV Zec Calbiochem-SAD 407286

SEKUNDARNA PROTUTIJELA

Mišji imunoglobulini Zec Dako R0439

3.1.5. Otopine

Otopine korištene u izvedbi eksperimenta i njihov način pripreme prikazane su

u tablicama 4. i 5.

20  

 

Tablica 4. Otopine korištene u radu sa kulturama stanica.

OTOPINA RECEPT

Vinkristin (100 µg/mL) Otapa se u fosfatnom puferu (PBS), čuva se pri -20°C

DMEM-FCS 10% FCS u DMEM, φ

MTT Otapa se u fosfatnom puferu (PBS), čuva se u tamnoj boci pri 4°C

Tripsin

2,5 g tripsina + 0,01 g streptomicina + 0,006 g penicilina + 0,02 g fenol crvenog se otopi u otopini T, nadopuni se do 1L i podesi pH na 7 do 7,2 te se sterilizira filtriranjem kroz filtar veličine pora 0,22 µm

Fosfatni pufer bez Mg2+ i Ca2+, PBSΔ 1,37 mM natrijev klorid; 2,7 mM kalijev klorid; 4,3 mM natrijev hidrogenfosfat heptahidrat; 1,4 mM kalijev hidrogenfosfat

PBSΔ-BSA 0,1% BSA u PBSΔ, φ

 

Tablica 5. Otopine korištene u radu s proteinima.

OTOPINA RECEPT

Inkubacijski pufer (10x koncentriran) 400 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM CaCl2

Pufer za razbijanje stanica 1x inkubacijski pufer, 7x inhibitor proteaza, 10 µL DNaza I, 5 µL RNaza

Radni pufer 7 M urea, 2 M tiourea, 40 M CHAPS

M1 pufer 10 g/dm3 DTT; 14,28% smjesa inhibitora proteaza, 85,72% radni pufer; φ

Bradfordov reagens 100 g/dm3 Coomassie Brilliant Blue G-250; 10% fosforna kiselina, 5% etanol; φ

Pufer za elektroforezu 25 mM Tris, 192 mM glicin; 0,1% SDS; φ; pH 8,3

Ekvilibracijski pufer 75 mM Tris-HCl, pH 8,8, 6 M urea, 20 g/dm3 SDS, bromfenol modrilo na vrhu nastavka pipetora; 30% glicerol; φ

Otopina agaroze 0,5% agaroza, 0,0002% bromfenol modrilo, 95% 5x koncentriran pufer za elektroforezu; w

Tripsinski pufer 25 mM NH4HCO3

Otopina za razgradnju tripsinom 10 µg/mL tripsina koji je razrijeđen u tripsinskom puferu

Ekstrakcijska otopina 50% acetonitril, 45% voda, 5% TFA; φ

21  

 

Otopina acetonitrila za pročišćavanje peptida tehnikom Zip-Tip 80% i 50% acetonitril, 20% i 50% voda, 0,1% TFA; φ

Otopina TFA za pročišćavanje peptida tehnikom Zip-Tip 0,1% TFA; φ

Otopina matrice CHCA 5 mg cm-3 CHCA; 50% MeCN, 49,95% voda, 0,05% TFA; φ

 

3.1.6. Uređaji i drugi materijali

U tablicama 5. i 6. prikazani su svi uređaji i ostali materijali korišteni u

izvedbi eksperimenta.

Tablica 6. Uređaji.

UREĐAJ PROIZVOĐAČ

Kabinet za rad u sterilnim uvjetima Klimaoprema, Hrvatska

Inkubator za uzgoj stanica Heraeus, Njemačka

Centrifuga za stanice Heraeus, Njemačka

Tresilica IKA® MS 3 basic IKA, SAD

Tresilica GFL® 3006 GFL® - Gesellschaft für Labortechnik, Njemačka

Tresilica Tehtnica, Slovenija

Vodena kupelj Tehtnica, Slovenija

Automatski brojač stanica Coulter Counter Beckman Coulter, UK

Protočni citometar FACSCalibur, Becton-Dickinson, SAD

Svjetlosni mikroskop Opton Njemačka

Spektrofotometar za mikrotitarske pločice StatFax2100 Awareness Technology INC, SAD

Spektrofotometar BioPhotometer Eppendorf, Njemačka

Termomiješalica Comfort Eppendorf, Njemačka

Centrifuga 5415R Eppendorf, Njemačka

Centrifuga MiniSpin Eppendorf, Njemačka

Vakuum centrifuga 5301 Eppendorf, Njemačka

Jedinica za sastavljanje velikih gelova te jedinica za hlađenje sustava za vertikalnu elektroforezu, PROTEAN II XL cell

Bio-Rad, SAD

22  

 

PROTEAN IEF cell Bio-Rad, SAD

Uređaj za napajanje PowerPac™ 3000 Bio-Rad, SAD

VersaDoc Imaging System, model 4000 Bio-Rad, SAD

Sonifikacijska kupelj SONOREX Bandelin, Njemačka

4800 plus MALDI TOF/TOF™ Applied Biosystems, SAD

Tablica 7. Ostali materijali.

MATERIJAL PROIZVOĐAČ

Petrijeve zdjelice za uzgoj kultura stanica promjera 3,5 i 10 cm BD Falcon, SAD

Bočice za uzgoj kultura stanica površine 25 i 75 cm2, T-25 i T-75 BD Falcon, SAD

Pločice za uzgoj kulture stanica s 6 i 96 bunarića BD Falcon, SAD

Plastične epruvete od 15 i 50 mL BD Falcon, SAD

Mikropipete Eppendorf, Njemačka

Nastavci za mikropipete s filtrom i bez filtra Eppendorf, Njemačka

Staklene pipete Superior, Njemačka

Ampule za smrzavanje stanica Nunc, SAD

IPG trake, Immobiline™ DryStrip 18 cm, pH 3-10 NL GE Healthcare, Švedska

Zip-Tip, C18 Millipore, SAD

MALDI pločica za nanošenje uzoraka Applied Biosystems, SAD  

3.1.7. Programska podrška

U tablici 8. prikazani su računalni programi korišteni prilikom analize i obrade

rezultata.

Tablica 8. Računalni programi korišteni u analizi i obradi podataka.

RAČUNALNI PROGRAM PROIZVOĐAČ

PDQuest™ Bio-Rad, SAD

ProteinPilot™ Applied Biosystems, SAD

23  

 

3.2. Metode

3.2.1. Uzgoj stanica u kulturi

U ovom istraživanju korištene su stanice tumora dojke čovjeka MDA-MB-

435S. Uzgajane su in vitro u bočicama za uzgoj kulture stanica (T-75) u uvjetima

vlagom zasićene atmosfere pri 37°C uz 5% CO2. Kao hranjiva podloga za rast stanica

korištena je Dulbeccova modificirana Eaglova hranjiva podloga uz dodatak 10%

seruma fetusa goveda (DMEM-FCS). Nakon 3 do 4 dana stanice su presađene kako bi

se spriječilo umiranje zbog iscrpljenosti hranjive podloge.

3.2.2. Presađivanje stanica

Iz T-75 bočice uklonjena je hranjiva podloga DMEM-FCS te su stanice vrlo

kratko isprane s 1 mL prethodno zagrijanog tripsina (37°C). Nakon ispiranja, stanice

su inkubirane u 1 mL svježeg tripsina sve dok se nisu počele odvajati od podloge što

je pod svjetlosnim mikroskopom vidljivo kao promjena oblika iz vretenastog u

okruglasti. Dodatkom 9 mL hranjive podloge DMEM-FCS (prethodno zagrijane na

37°C u vodenoj kupelji) zaustavljeno je djelovanje tripsina. Stanice su potom nježno

resuspendirane višestrukim uvlačenjem i ispuštanjem iz pipete te ravnomjerno

raspodijeljene na dvije ili više bočica za uzgoj stanica (ovisno o broju stanica).

3.2.3. Zamrzavanje stanica

Stanice su odvojene od podloge otopinom tripsina prema postupku opisanom

u odjeljku 3.2.2. Nakon brojanja stanica, suspenzija stanica prebačena je u plastičnu

epruvetu od 15 mL te centrifugirana pri 1000 x g tijekom 10 min. Talog stanica

resuspendiran je u 900 µL hranjive podloge DMEM-FCS te prebačen u ampule za

zamrzavanje koje su odmah stavljene na led. Nakon 10 minuta, u suspenziju stanica

dodan je krioprezervans DMSO konačne koncentracije 10%. Ampule sa stanicama

pohranjene su u držač spremnika za tekući dušik (-80°C) te su idući dan pohranjene u

tekući dušik (-196°C).

24  

 

3.2.4. Odmrzavanje stanica

Ampula sa zamrznutim stanicama izvađena je iz tekućeg dušika te uronjena u

vodenu kupelj sve dok se stanice nisu potpuno odmrznule. Stanice su prebačene u T-

75 bočicu s 10 mL hranjive podloge DMEM-FCS, prethodno zagrijane na 37°C u

vodenoj kupelji. Idući dan, nakon provjere pod svjetlosnim mikroskopom, stanice su

presađene prema potrebi.

3.2.5. Utišavanje gena RNA interferencijom

Stanice su izbrojane pomoću automatskog brojača stanica te nasađene u 2

pločice za uzgoj kulture stanica sa 6 bunarića, i to 3 x 105 stanica po bunariću u

volumenu od 1,5 mL tako da popunjenost površine bude 30 do 50%. Zbog

transfekcije koja je vršena dan poslije, korištena je hranjiva podloga DMEM-FCS bez

antibiotika. Pločice su pohranjene u inkubator pri 37°C uz 5% CO2. Nakon 24 sata,

kada je pokrivenost podloge po bunariću bila 30 – 50%, stanice su transficirane

malim interferirajućim RNA (siRNA).

Utišavanje gena za αv podjedinicu integrina pomoću integrin αv specifične

siRNA molekule (Silencer Select Predesigned & Validated siRNA, Ambion)

postignuto je korištenjem komercijalno dostupnog transfekcijskog reagensa

Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Za pojedini bunarić priređene su otopine A

i B, svaka volumena 250 µL. Otopina A sadrži siRNA(αv) razrijeđenu u OptiMEM-

u u količini podešenoj tako da konačna koncentracija siRNA(αv) po transficiranom

bunariću bude 50 nM. Otopina B sadrži 3 µL Lipofectamine RNAiMAX i 247 µL

OptiMEM-a. Otopine A i B pomiješane su te ostavljene 20 min pri sobnoj

temperaturi, nakon čega je cijeli volumen (500 µL) nakapan u bunarić sa stanicama

MDA-MB-435S.

3.2.6. Određivanje ekspresije integrina metodom protočne citometrije

Uspješnost utišavanja podjedinice integrina αv provjerena je metodom

protočne citometrije. Korištena su primarna mišja protutijela specifična za

podjedinicu integrina αv, a praćenje ekspresije omogućeno je uporabom fikoeritrinom

25  

 

(engl. phycoerythrin, PE) obilježenih sekundarnih zečjih protutijela na mišje

imunoglobuline.

Nakon 48 sati od transfekcije, stanice su tripsinom odvojene od podloge,

resuspendirane u DMEM-FCS-u i centrifugirane 10 minuta pri 1200 rpm. Supernatant

je bačen, a talog stanica je resuspendiran u 10 mL PBSΔ te ponovno centrifugiran u

istim uvjetima. Supernatant je ponovno bačen, dok je talog resuspendiran ovaj put u 3

mL prethodno ohlađenog PBSΔ. Stanice su potom izbrojane pomoću automatskog

brojača stanica Coulter Counter, te centrifugirane 10 minuta pri 1200 rpm. Nakon

centrifugiranja, talog je resuspendiran u određenom volumenu hladnog PBSΔ-a tako

da u konačnici koncentracija stanica bude 107 stanica po mL. Za pojedino mjerenje na

protočnom citometru, izdvojeno je po 50 µL stanične suspenzije s po 5 x 105 stanica.

Protutijela korištena u eksperimentu su navedena u tablici 9. Stanice su prvo

inkubirane s primarnim protutijelima 60 minuta na ledu nakon čega su isprane 2 puta

s po 450 µL hladnog PBSΔ uz centrifugiranje po 4 minute pri 1200 rpm. U idućem

koraku stanice su inkubirane 30 minuta u mraku na ledu s po 2.8 µL fluorescentno

obilježenog sekundarnog protutijela. Uslijedilo je trostruko ispiranje stanica s hladnim

PBSΔ-om na prethodno opisan način. Prije samog mjerenja, talog stanica je

resuspendiran u 350 µL hladnog PBSΔ-a s 0,1% BSA. Uzorci pripremljeni na opisan

način, prebačeni su u plastične epruvete za protočni citometar te analizirani protočnim

citometrom. U postavkama uređaja podešene su valne duljine ekscitacije (488 nm) i

emisije (578 nm) fikoeritrina.

Tablica 9. Konačna koncentracija i volumen korištenih primarnih i sekundarnih protutijela prilikom

određivanja ekspresije integrina αv metodom protočne citometrije.

PROTUTIJELO KONAČNA KONCENTRACIJA / µg mL-1

VOLUMEN / µL

IgG1 izotipska kontrola 50 2,5 PRIMARNA PROTUTIJELA αv 0,01 0,5

SEKUNDARNA PROTUTIJELA

Zečja protutijela na mišje imunoglobuline 0,28 2.8

26  

 

3.2.7. MTT test

Osjetljivost stanica na djelovanje citostatika nakon utišavanja integrina

provjerena je MTT testom. MTT test je kolorimetrijska metoda za utvrđivanje

vijabilnosti stanica. Temelji se na mjerenju metaboličke aktivnosti stanice, odnosno

aktivnosti mitohondrijskog enzima sukcinat dehidrogenze koja u živim stanicama

reducira žutu topivu tetrazolijevu sol MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazolijev bromid) u ljubičaste kristale formazana.

Stanice su nasađene u pločicu za uzgoj kultura s 96 bunarića (104 stanica po

bunariću u 180 µL DMEM-FCS) 48 sati nakon transfekcije sa siRNA molekulama.

Idućeg dana stanicama je dodano 20 µL vinkristina u 2 različite koncentracije

(konačne koncentracije u bunariću: 0,0025; 0,01 µg/mL). Uzorci su rađeni u

triplikatima. Na kontrolne stanice dodano je po 20 µL hranjive podloge DMEM-FCS.

Nakon 72 sata okretanjem pločice naopako uklonjena je hranjiva podloga, a

eventualno zaostala tekućina pokupljena je okretanjem pločice na staničevinu.

Otopina MTT-a razrijeđena je 10x u DMEM-FCS, te je dodana na stanice (40 µL po

bunariću) koje su potom inkubirane 3 sata pri 37°C. Ovisno o metaboličkoj aktivnosti,

stanice reduciraju MTT u netopivi ljubičasti formazan. Kako bi se formazan otopio, u

svaki bunarić dodano je 170 µL dimetil-sulfoksida te je pločica trešena na treslici 20-

30 minuta. Pomoću spektrofotometra za mikrotitarske pločice izmjerena je

apsorbancija pri valnoj duljini od 600 nm. Metabolička aktivnost proporcionalna je

izmjerenoj apsorbanciji, a postotak preživljenja stanica izračunat je prema formuli:

preživljenje (%) = (AC – A0) / (AK – A0),

gdje AC predstavlja apsorbanciju stanica izloženih djelovanju citostatika, AK se odnosi

na apsorbanciju kontrolnih stanica, a A0 na apsorbanciju slijepe probe.

3.2.8. Priprema staničnog lizata

Talog stanica (7 x 106 stanica po uzorku) resuspendiran je u 260 µL pufera za

razbijanje stanica. U suspenziju je potom dodan sedmerostruko ukoncentrirani

inhibitor proteaza, nakon čega su stanice razbijene ultrazvukom pomoću sonifikatora.

Sonifikacija je ponovljena 6 puta po 1 min, a nakon svake minute uzorak je stavljen

27  

 

na led tijekom 1 minute. Stanični lizat centrifugiran je 20 min pri 4°C i 10000 rpm.

Nakon centrifugiranja talog je bačen, a u supernatant svakog uzorka dodano je 30 µL

DNaze i 5 µL RNaze. Uzorci su potom inkubirani u termomješalici tijekom 30 min

pri 37°C i 300 rpm.

3.2.9. Određivanje koncentracije proteina po Bradfordu

Proteinski uzorak razrijeđen je 100 puta u miliQ vodi te pomiješan sa 100 µL

Bradfordovog reagensa. Pomoću spektrofotometra izmjerena je apsorbancija za 3

jednako pripremljena uzorka. Na osnovu prethodno napravljene standardne krivulje

pomoću albumina seruma goveda, (BSA, engl. Bovine serum albumin) poznatih

koncentracija (1 µg/mL, 2 µg/mL, 4 µg/mL, 6 µg/mL, 8 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 30

µg/mL, 40 µg/mL, 50 µg/mL) izračunata je koncentracija proteina u uzorku. Ukoliko

izoelektično fokusiranje ne slijedi odmah, uzorci se pohranjuju pri 4°C.

3.2.10. Rehidratacija i izoelektrično fokusiranje

Pripremljeni je M1 pufer te je određen volumen proteinskog uzorka koji je

potrebno staviti na IPG traku (engl. Immobilized pH Gradients). M1 pufer (250 µL), s

naknadno dodanim bromfenol modrilom (pomoću vrha nastavka za pipetu),

pomiješan je sa 100 µL proteinskog uzorka tako da konačni volumen otopine iznosi

350 µL koliko je potrebno nanijeti na IPG traku. Uzorak pripremljen na ovaj način

smjesti se u kadicu za fokusiranje u koju je potom pažljivo uronjena IPG traka (18

cm, pI 3-10) na način da je plus kraj okrenut prama anodi, a strana na kojoj se nalazi

gel okrenuta prema dolje. Poželjno je ukloniti nastale mjehuriće zraka. Na svaku traku

stavljeno je 4 mL mineralnog ulja kako bi se spriječilo isušivanje i moguća

kontaminacija uzorka. Trake smještene u PROTEAN IEF cell (50 V, 20 °C)

rehidrirane su 14 sati kako bi peptidi uspješno i ravnomjerno ušli u gel. U idućem

koraku ispod svake trake se na području dodira s elektrodama postavljeni su filter

papirići prethodno navlaženi vodom. Pokrenuto je izoelektrično fokusiranje prema

uvjetima navedenim u tablici 10. Tijekom izoelektričnog fokusiranja proteini se

razdvajaju na osnovu razlika u pI vrijednosti.

28  

 

Tablica 10. Uvjeti provođenja izoelektričnog fokusiranja na IPG trakama pI 3-10.

KORAK PORAST NAPONA

OSTVARENI NAPON / V TRAJANJE / min TRAJANJE / V h

1 Spori 200 75 -

2 Spori 500 15 -

3 Brzi 500 60 -

4 Spori 1000 15 -

5 Brzi 1000 60 -

6 Spori 7000 240 -

7 Brzi 7000 - 90000

8 brzi 500 1440 (max. 24h) -

3.2.11. Ekvilibracija IPG traka

IPG trake su pincetom uronjene u staklene epruvete s prethodno

pripremljenim ekvilibracijskim puferom. Prilikom rukovanja s trakama bitno je paziti

da strana na kojoj je gel ne dodiruje stijenke epruvete. U svaku epruvetu s trakama

dodano je 10 mg/L ditiotreitola sa svrhom reduciranja disulfidnih veza. Epruvete su

položene na tresilicu na 15 min. IPG trake su potom prebačene u nove epruvete s

ekvilibracijskim puferom u kojeg je dodano 25 g/L jodoacetamida kako bi se spriječio

ponovni nastanak disulfidnih mostova. Nakon inkubacije na tresilici 15 min, trake su

bile spremne za SDS elektroforezu.

3.2.12. Denaturirajuća elektroforeza u poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE)

Nakon što su proteini razdvojeni prema pI vrijednosti, slijedi razdvajanje

prema masi pomoću denaturirajuće elektroforeze u poliakrilamidnom gelu. Prethodno

detaljno očišćena stakla složena se u jedinicu za sastavljanje prema uputama

proizvođača. Pripremljen je pufer za elektroforezu te smjesa za 2 gela dimenzija 20 x

18 cm i debljine 1 mm.

Od smjese za gelove izdvojen je mali volumen u koji je dodano 50 µL 100 g/L

amonijevog persulfata (APS) i 20 µL tetrametil etilendiamina (TEMED). Ovaj tzv.

29  

 

brzopolimerizirajući gel izliven je na dno između stakala kako bi se spriječilo curenje

smijese gela prije polimerizacije. Kada je polimerizacija brzopolimerizirajućeg gela

završena, u ostatak smjese za gel dodano je 750 µL 100 g/L APS-a i 75 µL TEMED-

a. Smjesa za gel je brzo izlivena pomoću pipete između stakala za elektroforezu do

vrha. Na samu površinu gelova dodano je 3 mL n-butanola kako bi se spriječila

oksidacija.

Nakon što je gel polimerizirao, s površina gel isprana je destiliranom vodom

kako bi se uklonio n-butanol. Stakla s gelovima instalirana su u jedinicu za hlađenje

sustava te su na površinu gela umetnute IPG trake prethodno isprane u puferu za

elektroforezu. Prilikom umetanja traka bitno je paziti da je strana na kojoj se nalazi

gel okrenuta prema velikom staklu te da na dodirnoj površini gela i trake nema

mjehurića zraka koji bi mogli smetati prelasku proteina s trake u gel za elektroforezu.

Na traku je izliveno 4 mL agaroze u svrhu zaštite. Nakon što je agaroza

ispolimerizirana gelovi (u jedinicama za hlađenje) prebačeni su u kadu za

elektroforezu u koju je uliveno 1500 mL pufera za elektroforezu. Sustav je potom

spojen za izvor vode kako bi se kontinuirano hladio. Pokrenuta je elektroforeza prema

uvjetima navedenim u tablici 11.

Tablica 11. Uvjeti provođenja SDS poliakrilamidne gel elektroforeze za dvodimenzionalne analitičke

gelove.

KORAK JAKOST STRUJE / mA TRAJANJE / min TRAJANJE / V h

1 15 60 -

2 20 - 600

3 30 300 -

3.2.13. Bojanje proteina u gelovima Coomassie brilijant plavom bojom

Boja Coomassie brilijant plavo u kiselom okružju ostvaruje elektrostatske

interakcije s amino skupinama proteina te se stoga koristi u svrhu detekcije

proteinskih mrlja u gelovima. Oko 300 mL prethodno pripremljene koloidne otopine

Coomassie brilijant plave boje izlije se u kadicu s gelovima. Bojanje se provodi preko

30  

 

noći na tresilici. Idući dan, gelovi su odbojani ponavljanom izmjenom redestilirane

vode.

3.2.14. Snimanje i analiza gelova

Obojani gelovi snimljeni su i analizirani uređajem za analizu VersaDoc

Imaging System. Denzitometrijska i kvantitativna obrada učinjena je pomoću

računalnog programa za analizu dvodimenzionalnih gelova PDQuest. Nakon što

program provede normalizaciju metodom ukupne gustoće na slici gela (engl. Total

Density in Gel Image), analizom pojedine proteinske mrlje izdvojena su mjesta

značajne razlike u gustoći. Pomoću nastavka pipetora (s malo odrezanim vrhom) iz

gelova su izvađene proteinske mrlja kod kojih je primijećena barem trostruka

promjena u ekspresiji.

3.2.15. Odbojavanje izrezanih komadića gelova

Izrezani komadići gelova sa željenim proteinskim mrljama stavljeni su u

plastične epruvete od 1,5 mL. Na svaki komadić gela dodan je 1 mL otopine za

odbojavanje. Epruvete s uzorcima su izložene mikrovalovima na 15 min (90W). Ako

se pri tome komadići gela nisu odbojali, otopina za odbojavanje je promjenjena i

postupak je ponavljan sve dok gelovi nisu postali bezbojni. Nakon odbojavanja

otopina je uklonjena pipetorom.

3.2.16. Digestija proteina u gelu tripsinom

U svaku plastičnu epruvetu s odbojanim komadićima gela dodano je 500 µL

50 mM otopine amonijevog hidrogenkarbonata. Uzorci su inkubirani 5 min na

tresilici (700 rpm, sobna temperatura). Nakon inkubacije, promijenjena je otopina i

postupak je ponovljen 2 puta. Potom je otopina ponovno promijenjena te su uzorci

inkubirani na tresilici u jednakim uvijetima 15 min. U idućem koraku uzorci su

inkubirani na tresilici 30 min u 500 µL otopine amonijevog hidrogenkarbonata i

acetonitrila pomiješanih u volumnom omjeru 1:1. Nakon inkubacije ostatak otopine je

bačen te je na uzorke dodano 100 µL acetonitrila. Uzorci su u acetonitrilu inkubirani

31  

 

na tresilici 5 min (700 rpm, sobna temperatura). Acetonitril je uklonjen iz plastičnih

epruveta. Na dnu epruveta ostaju samo pobijeljeli komadići gela te su takvi sušeni

pomoću vakum centrifuge sve dok nisu postali lepršavi.

Nakon što su gelovi posušeni, prebačeni su u plastične epruvete volumena 200

µL te je dodano 10 µL otopine za digestiju. Uzorci su inkubirani na tresilici 18 h na

37 °C i 500 rpm. Otopine za digestiju koje sada sadrži tripsinizirane peptide

prebačene su u nove plastične epruvete od 1,5 mL te su posušene u vakuum

centrifugi.

Na komadiće gela, koji u sebi sadrže još peptida dodano, je 10 µL

ekstrakcijske otopine. Gelovi su prvo inkubirani 30 min na sobnoj temperaturi u

sonifikacijskoj kupelji te potom još 15 min na tresilici (500 rpm, sobna temperatura).

Komadići gela su potom bačeni. Ekstrakti su spojeni s pripadajućim osušenim

tripsinskim puferima te ponovno posušeni u vakuum centrifugi.

3.2.17. Pročišćavanje peptida tehnikom Zip-Tip pomoću C18 kolona

Pripremljene su 80% i 50% otopine acetonitrila, te 0.1% otopina trifluoroctene

kiseline (TFA). Osušeni peptidi resuspendirani su u 10 µL 0.1% otopine TFA te su

kao takvi spremni za pročišćavanje pomoću Zip-Tip nastavka.

Zip-Tip nastavak stavljen je na pipetor i kondicioniran s prethodno

pripremljenim otopinama (3 puta s po 10 µL 80% otopine acetonitrila, 3 puta s po 10

µL 50 % otopine acetonitrila te 3 puta s po 10 µL 0.1% otopinom TFA). U idućem

koraku peptidi su nanešeni na kolonu kontinuiranim usisavanjem i izbacivanjem

uzorka (10 puta), pazeći pri tome da u kolonu ne uđe zrak. U svrhu uklanjanja soli i

mogućih onečišćenja uzorak je ispran 3 puta s po 10 µL 0.1% otopine amonijevog

formijata. Ponovljen je postupak nanošenja uzorka (10 puta) te je kolona ponovno

isprana s 0.1% otopine amonijevog formijata (5 puta po 10 µL). U idućem koraku

peptidi su eluirani s kolone pomoću 10 µL 80% otopine acetonitrila (10 puta) te su

potom prebačeni u čiste plastične epruvete od 1,5 mL. Nakon što su pročišćeni, uzorci

su posušeni u vakuum centrifugi.

32  

 

3.2.19. Analiza peptida spektrometrom masa MALDI-TOF/TOF

Smjesa pročišćenih i isušenih peptida resuspendirana je s po 4 µL matrice α-

cijano-4-hidroksicimetna kiseline (CHCA matrica). Osim uzoraka na pločicu je

nanešen i interni kalibrant, autodigerirani tripsin, pripremljen na isti način. Uzorci i

kalibrant nanešeni su na MALDI pločicu i analizirani pomoću spektrometra masa

MALDI-TOF/TOF. Snimljeni su MS spektri svih nanešenih uzoraka te su potom

odabrani prekursori za snimanje MS/MS spektara. Parametri analize prikazani su u

tablici 12.

Tablica 12. Parametri analize MALDI-TOF/TOF.

TIP ANALIZE MS MS/MS

DETEKCIJA IONA Pozitivna Pozitivna

ZRCALO Reflektron Reflektron

BROJ SNIMAKA / SPEKTRU 1000 2000

RASPON MASA / Da 1000 - 4000 9 - 3833

VRIJEME ODZIVA / ns 500 400

3.2.20. Pretraživanje baze podataka

Nakon provedene MS i MS/MS analize, u svrhu identifikacije proteina na

temelju dobivenih spektara pretražena je proteinska baza podataka NCBInr, uz zadane

uvjete pretrage (tablica 13). Prihvaćaju se oni rezultati kojima je signifikantnost (engl.

Score, S) veća od 67 za NCBInr. Granica signifikantnosti dobiva se kao značajna

vrijednost vjerojatnosti prema Mowse rezultatu (engl. Probability Based Mowse

Score; Perkins i sur. 1999). Analiza je izvršena pomoću računalnog programa

ProteinPilot™ povezanog s Mascot tražilicom.

33  

 

Tablica 13. Zadani uvjeti pretrage Mascot platforme, za dobivanje rezultata MS i MS/MS iona peptida izoliranih iz uzoraka tkiva tumora prostata, putem spektrometra masa.

ZADANI UVJET ODABRANI UVJET PRETRAGE

Značajna vrijednost ispod koje se ne gledaju rezultati p < 0,05

Dopuštena pogrešna cijepanja peptida tripsinom (engl. miscleavage) 2

Taksonomska podjedinica Homo sapiens

Fiksirane modifikacije -

Varijabilne modifikacije Fosforilacija serina, treonina i tirozina (te u malom broju slučajeva i aspartata i histidina); oksidacija i/ili hidroksilacija

Tolerancija na masu peptida 1,0 Da

Izotopna raspodjela -

Tolerancija na masu fragmentnog MS/MS iona 0,3 Da

Naboj peptida +1

Vrijednost mase Monoizotopna

Granična vrijednost prekursora -

Instrument MALDI-TOF/TOF

34  

 

4. REZULTATI

4.1. Utišavanje podjedinice integrina αv specifičnom siRNA čini

stanice tumora dojke čovjeka MDA-MB-435S osjetljivijim na

djelovanje vinkristina i paklitaksela

U svom diplomskom radu, koji prethodi ovom istraživanju, Ferenčak (2013) je

pokazao da utišavanje podjedinice integrina αv specifičnom siRNA povećava

osjetljivost stanica tumora dojke MDA-MB-435S na dijelovanje vinkristina i

paklitaksela, te im uveliko smanjuje migratornu sposobnost. Kako bi bolje razumjeli

navedene fenotipske promjene, u ovom diplomskom radu provedena je proteomska

analiza stanica MDA-MB-435s nakon utišavanja podjedinice integrina αv.

Prije same proteomske analize, stanice MDA-MB-435S transficirane su αv-

specifičnim siRNA molekulama siRNA(αv) i kontrolnom siRNA(-). S obzirom da

stanice MDA-MB-435S eksprimiraju integrine αvβ3, αvβ5, α3β1 i α4β1 (Palmieri i sur.,

2002; Taherian i sur., 2011; Wong i sur., 1998), nakon transfekcije sa siRNA(αv)

očekivano je smanjenje prisutnosti isključivo heterodimera αvβ3 i αvβ5 na površini

stanica. Nije vjerojatno da se ekspresija drugih integrina mijenja. Uspješnost

utišavanja provjerena je metodom protočne citometrije 48 sati nakon transfekcije

korištenjem fluorescentno obilježenih protutijela za podjedinicu integrina αv.

Histogram ekspresije podjedinice αv prikazan je na slici 5a. Transfekcija stanica

MDA-MB-435S sa siRNA(αv) uzrokovala je smanjenje ekspresije integrina αv (što

odražava ekspresiju heterodimera integrina αvβ3 i αvβ5), što je također vidljivo i iz

rezultata prikazanog kao relativne vrijednosti MFI (engl. mean fluorescence intensity;

slika 5b), Ekspresija podjedinice integrina αv u transficiranim stanicama smanjena je

za 94,6%.

35  

 

 

Slika  5.  Ekspresija  αvβ3, αvβ5 na MDA-MB-435S stanicama transficiranim sa siRNA(αV) i siRNA(-).

Uz potvrdu da je utišavanje podjedinice integrina αv bilo uspješno, potrebno

je provjeriti postaju li stanice MDA-MB-435S nakon transfekcije αv-specifičnom

siRNA osjetljivije na djelovanje vinkristina. Stanice transficirane kontrolnom siRNA i

siRNA molekulama specifičnim za podjedinicu integrina αv, izložene su djelovanju

vinkristina tijekom 72 sata. Preživljenje je praćeno MTT testom. Na slici 6. prikazani

su rezultati MTT testa. Iz histograma se jasno vidi da za obje koncentracije

vinkristina, 0,0025 i 0,001 µg/mL, vrijedi da je preživljenje stanica transficiranih

siRNA(αv) smanjeno u odnosu na stanice transficirane nespecifičnom siRNA(-).

 Slika 6. Preživljenje stanica MDA-MB-435S transficiranih sa siRNA(-) 50 nM i siRNA(αv) 50 nM tretiranih vinkristinom koncentracija: 0,0025; 0,01 µg/mL.

36  

 

4.2. Kvantitativna usporedba proteomskih profila stanica

tumora dojke čovjeka MDA-MB-435S nakon utišavanja

integrina αv okriva nekoliko diferencijalno eksprimiranih

proteina

Nakon uspješnog utišavanja podjedinice integrina αv, uzorci stanica su lizirani

te su iz njih izolirani ukupni proteini. Kako bi omogućili kvantitativnu usporedbu

proteomskih profila kontrolnih stanica MDA-MB-435S (transficiranih kontrolnom

siRNA) sa stanicama nakon utišavanja integrina αv, bitno je da nanešene

koncentracije proteina na IPG trake, a potom i na gel, budu jednake. Koncentracije

proteina određenu su metodom po Bradfordu te je na osnovu njih izračunata masa

proteina nanešena na gelove (tablica 14).

Tablica 14. Koncentracije proteina izoliranih iz stanica MDA-MB-435S transficiranih sa specifičnom siRNA(αv) i kontrolnom siRNA(-), te mase proteina nanešenih na IPG trake.

UZORAK KONCENTRACIJA PROTEINA NAKON IZOLACIJE / µg µL-1

MASA PROTEINA NANEŠENA NA GEL / µg

MDA-MB-435S si (-) 7,6 522

MDA-MB-435S si αv 5,2 522

Nakon što je određena koncentracija proteina u uzorcima, ukupni stanični

proteini razdvojeni su dvodimenzionalnom gel elektroforezom, a gelovi obojani

koloidnom otopinom boje Coomassie Briliant Blue. Gelovi su potom skenirani

uređajem za denzitometrijsku analizu gelova VersaDoc Imaging System te analizirani

računalnim programom PDQuest radi kvantifikacije promjene u ekspresiji proteina.

Na slikama 7. i 8. su prikazani gelovi kontrolnih stanica MDA-MB-435S

(transficiranih kontrolnom siRNA) i MDA-MB-435S stanica nakon utišavanja

integrina αv, s označenim diferencijalno eksprimiranim proteinima. Kvantitativni

rezultati denzitometrijske analize nalaze se u tablicama 15.-18. (odjeljak 4.5.) pod

stupcem Razlika u ekspresiji. Kao značajna vrijednost uzeta je minimalno trostruko

povećana/smanjena ekspresija proteina.

37  

 

 Slika 7. Profil ekspresije proteina stanica MDA-MB-435S transficiranih s kontrolnom (nespecifičnom) siRNA. Označene proteinske mrlje ukazuju na proteine s promijenjenom ekspresijom u odnosu na stanice MDA-MB-435S trasficirane s integrin-αv specifičnom siRNA. Oznake pojedinih proteinskih mrlja odgovaraju navodima identificiranih proteina u tablicama 15.-18.

38  

 

 Slika 8. Profil ekspresije proteina stanica MDA-MB-435S transficiranih s integrin-αv specifičnom siRNA. Označene proteinske mrlje ukazuju na proteine s promijenjenom ekspresijom u odnosu na stanice MDA-MB-435S trasficirane s kontrolnom (nespecifičnom) siRNA. Oznake pojedinih proteinskih mrlja odgovaraju navodima identificiranih proteina u tablicama 15.-18.

39  

 

4.3. Rezultati analize staničnih proteina spektrometrijom masa i

pretrage baze podataka

Nakon denzitometrijske analize gelova je izabrano ukupno 42 proteinske mrlje

sa značajnom promjenom ekspresije u odnosu na drugi gel. Proteinske mrlje su

izrezane iz gelova te odbojane od koloidne otopine boje Coomassie Briliant Blue, a

proteini unutar komadića gelova izloženi su proteolitičkom dijelovanju tripsina.

Nastali peptidi potom su pročišćeni od soli i drugih nečistoća Zip-Tip tehnikom.

Provedena je MS i MS/MS analiza te su dobiveni spektri analizirani pomoću

računalnog programa ProteinPilot™ povezanog s Mascot tražilicom. Pretražena je

NCBInr baza podataka (engl. National Center for Biotechnological Information non

redundant database), a prihvaćeni su oni rezultati čija je signifikantna vrijednost

(engl. score, S) veća od 67 (p>0,05; S = -10log(p), gdje je p vjerojatnost da je

promatrani pogodak rezultat slučajnosti).

Iz 42 proteinske mrlje ukupno je identificirano 49 različitih proteina. Od toga

su 4 proteinske mrlje isključene iz daljnje analize zbog niske S vrijednosti. U jednoj

proteinskoj mrlji je pronađeno zagađenje humanim keratinom koje je onemogućilo

identifikaciju proteina zbog preintenzivnih signala keratina u spektru. U 11

proteinskih mrlja pronađeno je više od jednog proteina (od toga njih 8 s po 2 različite

proteinske vrste i 3 s 3 različite proteinske vrste). Neki proteini su pronađeni na 2

različita mjesta u gelu, a razlog tome su postranslacijske modifikacije koje moduliraju

pI vrijednost proteina te mu mijenjaju masu. Diferencijalno eksprimirani proteini

prikazani su u tablicama 15.-18.

40  

 

Tablica 15. Proteini čija je ekspresija primijećena samo u stanicama MDA-MB-435S nakon transfekcije s kontrolnom siRNA(-), a izostaje u stanicama transficiranim s integrin-αv specifičnom siRNA, kvantitativno analizirani računalnim programom PDQuest te kvalitativno spektrometrijom masa.

OZ

NA

KA

NA

MA

LD

I PL

OČ

ICI PRIMARNI

PRISTUPNI BROJ

PROTEIN (engl.)

SIG

NIF

IKA

NT

NO

ST

MA

SA /

Da

pI

RA

ZL

IKA

U

EK

SPR

ESI

JI*

A1 gi|115527082 myosin-1 371 223006 5,6 +

A2 gi|119610412 hCG1986604, isoform CRA_c

86 222948 5,6 +

A5 gi|5729877 HSP70-8 (HSC70) 584 70854 5,4 +

A5 gi|48257068 HSPA8 protein, partial 560 64633 5,4 +

A8 gi|4504981 galectin-1 165 14706 5,3 +

A9 gi|48145673 HNRPH1 348 49099 5,8 +

A10 gi|119625804 moesin, isoform CRA_b 691 66564 5,9 +

A10 gi|6063147 ezrin 212 19224 9,2 +

A10 gi|28436809 radixin 190 68522 5,9 +

A15 gi|4503483 elongation factor 2 754 95277 6,4 +

A18 gi|119598292 pyruvate kinase, muscle, isoform CRA_c

501 60203 8,0 +

A21 gi|31645 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

296 36031 8,6 +

A21 gi|54303910 aging-associated gene 9 protein

288 36026 8,6 +

A21 gi|35053 uracil DNA glycosylase 196 35470 8,2 +

A22 gi|66346683 plasminogen activator inhibitor 1 RNA-binding protein isoform 3

209 43110 8,4 +

A22 gi|4929579 CGI-55 protein 209 43174 8,4 +

A23 gi|66346683 plasminogen activator inhibitor 1 RNA-binding protein isoform 3

242 43110 8,4 +

41  

 

Tablica 16. Proteini stanica MDA-MB-435S čija se ekspresija smanjila nakon transfekcije s integrin αv-specifičnom siRNA, u odnosu na stanice transficirane s kontrolnom (nespecifičnom) siRNA, kvantitativno analizirani računalnim programom PDQuest te kvalitativno spektrometrijom masa.

OZ

NA

KA

NA

MA

LD

I PL

OČ

ICI

PRIMARNI PRISTUPNI

BROJ PROTEIN (engl.)

SIG

NIF

IKA

NT

NO

ST

MA

SA /

Da

pI

RA

ZL

IKA

U

EK

SPR

ESI

JI*

A3 gi|62414289 vimentin 856 53619 5,1 8,20

A3 gi|21264345 peripherin 90 53618 5,4 8,20

A4 gi|62414289 vimentin 856 53619 5,1 10,90

A6 gi|15277503 ACTB protein, partial 300 40194 5,6 9,10

A12 gi|4502101 annexin A1 576 38690 6,6 3,01

A14 gi|34147630 elongation factor Tu, mitochondrial precursor

444 49843 7,3 3,84

A14 gi|833999 P43 287 49502 7,7 3,84

A17 gi|312208042 Chain A, Crystal Structure Of Human Transketolase (tkt)

653 67075 7.7 7,16

A19 gi|12653473 Proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 1

217 26446 8,3 4,73

A24 gi|62896605 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 variant

262 50167 9,0 3,56

A24 gi|22854566 CTCL tumor antigen HD-CL-08

104 38644 9,0 3,56

B1 gi|74746925 eEF1A-like 3 491 50153 9,2 3,80

42  

 

Tablica 17. Proteini čija je ekspresija primijećena samo u stanicama MDA-MB-435S nakon transfekcije s integrin-αv specifičnom siRNA(-), a izostaje u stanicama transficiranim s kontrolnom (nespecifičnom) siRNA, kvantitativno analizirani računalnim programom PDQuest te kvalitativno spektrometrijom masa.

OZ

NA

KA

NA

MA

LD

I PL

OČ

ICI

PRIMARNI PRISTUPNI

BROJ PROTEIN (engl.)

SIG

NIF

IKA

NT

NO

ST

MA

SA /

Da

pI

RA

ZL

IKA

U

EK

SPR

ESI

JI*

B5 gi|15010550 heat shock protein gp96 precursor 500 90138 4,7 +

B5 gi|61656607 tumor rejection antigen (gp96) 1 482 92282 4,8 +

B5 gi|4507677 endoplasmin precursor 482 92411 4,8 +

B6 gi|431822408 heat shock protein HSP 90-beta isoform c 663 82269 5,0 +

B7 gi|306891 90kDa heat shock protein 809 83242 5,0 +

B8 gi|189502784 mitochondrial heat shock 60kD protein 1 variant 1 719 60642 5,8 +

B8 gi|77702086 heat shock protein 60 718 61174 5,7 +

B8 gi|306890 chaperonin (HSP60) 647 60986 5,7 +

B11 gi|15277503 ACTB protein, partial 459 40194 5,6 +

B11 gi|145309046 POTE-2 alpha actin 204 121293 5,9 +

B14 gi|378404908 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoform 2

311 31528 7,2 +

B14 gi|378404908 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoform 2

223 31528 7,2 +

43  

 

Tablica 18. Proteini stanica MDA-MB-435S čija se ekspresija povećala nakon transfekcije s integrin αv-specifičnom siRNA, u odnosu na stanice transficirane s kontrolnom (nespecifičnom) siRNA, kvantitativno analizirani računalnim programom PDQuest te kvalitativno spektrometrijom masa.

OZ

NA

KA

NA

MA

LD

I PL

OČ

ICI

PRIMARNI PRISTUPNI

BROJ PROTEIN (engl.)

SIG

NIF

IKA

NT

NO

ST

MA

SA /

Da

pI

RA

ZL

IKA

U

EK

SPR

ESI

JI*

B3 gi|431822408 heat shock protein HSP 90-beta isoform c 991 82269 5,0 5,40

B3 gi|20149594 heat shock protein HSP 90-beta isoform a 988 83212 5,0 5,40

B3 gi|431822406 heat shock protein HSP 90-beta isoform b 905 78232 5,0 5,40

B9 gi|12654329 HSP90AA1 protein 577 64350 5,1 7,20

B10 gi|189502784 mitochondrial heat shock 60kD protein 1 variant 1 777 60642 5,8 4,60

B10 gi|77702086 heat shock protein 60 764 61174 5,7 4,60

B12 gi|73622130 BolA-like protein 2 165 16922 8,4 17,76

B13 gi|62896815 heat shock 70kDa protein 8 isoform 2 variant 284 53466 5,6 11,06

44  

 

5. RASPRAVA  

Integrini su transmembranski adhezijski receptori koji omogućuju stanicama

prihvaćanje za izvanstanični matriks i susjedne stanice. Osim što stanici služe kao

mehanosenzori, sudjeluju u organizaciji citoskeleta te su bitni za procese migracije,

proliferacije, diferencijacije i preživljenja. Uz ostvarivanje kontakta s citoskeletom,

citoplazmatski repovi integrina služe kao vezna mjesta za različite kinaze kao što su

FAK, ILK i Src čime izravno sudjeluju u provođenju signala između stanice i okoline

(Takada i sur., 2007).

Ekspresija integrina poremećena je brojnim tumorima uključujući i tumore

dojke. U ovom istraživanju korištene su stanice MDA-MB-435S kao model trostruko

negativnih tumora dojke koji se ne mogu liječiti lijekovima koji ciljaju receptore ER,

PR ili HER2. Ovi tumori su inicijalno često otporni na djelovanje kemoterapije te su

skloni recidivu i brzom metastaziranju pa su i kemoterapeutici ograničene

učinkovitosti u liječenju. Zbog svega navedenog pacijentice s ovim tipom tumora

imaju lošu prognozu liječenja (Carey, 2010).

Stanice tumora dojke MDA-MB-435S eksprimiraju integrine αvβ3 i αvβ5

(Taherian i sur., 2011). Ove su stanice prošle proces epitelno-mezenhimalne tranzicije

i posjeduju visok metastatski potencijal (Voss i suradnici, 2011). Neobjavljeni

rezultati grupe Ambriović-Ristov opisani u dva diplomska rada (Dekanić, 2012;

Ferenčak, 2013) pokazali su u ovim stanicama da utišavanjem podjedinice β3 dolazi to

smanjene ekspresije heterodimera integrina αvβ3, ali i do povećane ekspresije

heterodimera αvβ5 (vrijedi i obrnuto prilikom utišavanja podjedinice integrina β5). Pri

utišavanju (β3 ili β5), oslobođena se podjedinica integrina αv sparuje sa slobodnim

podjedinicama (β5 ili β3) prisutnim u stanici. Međutim, ekspresija oba integrina, αvβ3 i

αvβ5, na površini stanica MDA-MB-435S se može istovremeno smanjiti utišavanjem

podjedinice integrina αv. Utišavanje podjedinice integrina αv specifičnom siRNA

povećava osjetljivost stanica tumora dojke MDA-MB-435S na djelovanje vinkristina i

paklitaksela, te im uveliko smanjuje migratornu sposobnost. Pokazano je da je za

učinak na osjetljivost na citostatike odgovoran samo integrin αvβ5, jer se povećanje

45  

 

osjetljivosti na vinkristin i paklitaksel primjećuje nakon utišavanja podjedinice

integrina β5, ne i nakon utišavanja podjedinice integrina β3. Rezultati mjerenja

migratorne sposobnosti stanica nakon utišavanja podjedinica integrina αv, β3 i β5

pokazali su da oba integrina, αvβ3 i αvβ5, imaju ulogu u migratornoj sposobnosti

stanica. Ova tvrdnja temelji se na eksperimentalnom dokazu da utišavanjem

podjedinice β3, pri čemu dolazi to smanjene ekspresije heterodimera integrina αvβ3, ali

i do povećane ekspresije heterodimera αvβ5 (vrijedi i obrnuto prilikom utišavanja

podjedinice integrina β5), ne dolazi do promjene migratorne sposobnosti. Međutim

utišavanje podjedinice integrina αv, pri čemu se smanjuje ekspresija integrina αvβ3 i

αvβ5, dramatično smanjuje migratornu sposobnost stanica.

Vinkristin i paklitaksel su citostatici koji djeluju na mikrotubule i često su

korišteni u liječenju tumora dojke (Ganguly i Cabral, 2011). S obzirom na činjenicu

da pacijentice s trostruko negativnim tumorom dojke nemaju drugog izbora prilikom

liječenja osim konvencionalnih kemoterapija ograničenog djelovanja (Carey, 2010),

kombinacija utišavanja integrina αv i primjena vinkristina ili paklitaksela mogla bi

pospješiti terapiju. Osim toga, zbog smanjenje migratorne sposobnosti stanica nakon

utišavanja integrina αv, primjena ovakve terapije mogla bi utjecati i na smanjenje

metastatskog potencijala tumorskih stanica. Kako bi ovaj pristup liječenju što prije

pronašao svoj put prema kliničkim studijama, potrebno je rasvjetliti mehanizme kojim

stanice MDA-MB-435S nakon utišavanja integrina αv postaju osjetljivija na

spomenute citostatike, ali i mehanizam smanjene migratorne sposobnosti. Prvi korak

prema tom cilju predstavljen je u ovom diplomskom radu, a zasniva se na analizi

promjena u ekspresiji proteina uzrokovanih utišavanjem podjedinice integrina αv.

U svrhu proteomske analize, stanice MDA-MB-435S su transficirane integrin-

αv specifičnim siRNA molekulama, čime dolazi do smanjenja ekspresije heterodimera

integrina αvβ3 i αvβ5. Utišavanje je provjereno metodom protočne citometrije

korištenjem protutijela za podjedinicu integrina αv, a osjetljivost stanica na vinkristin

nakon utišavanja potvrđena je MTT testom. Budući da je grupa Ambriović-Ristov

višestruko dokazala povećanje osjetljivosti stanica MDA-MB-435S na vinkristin i

paklitaksel (neobjavljeni podaci; Ferenčak, 2013), u ovom diplomskom radu nije

praćeno preživljenje transficiranih stanica izloženih djelovanju paklitaksela. Također,

s obzirom da je razlika u osjetljivosti netransficiranih stanica i stanica transficiranih s

46  

 

nespecifičnom siRNA(-) statistički neznačajna (Ferenčak, 2013), te da je prava

kontrola transfekciji nekoj specifičnoj siRNA upravo transfekcija nespecifičnom

siRNA i to najviše zbog utjecaja same transfekcije na stanice, u izradi ovog

diplomskog rada kao kontrola su korištene samo stanice transficirane sa siRNA(-).

Proteini izolirani iz pojedine kulture stanica MDA-MB-435S, transficiranih sa (I)

specifičnom siRNA(αv) i (II) nespecifičnom siRNA(-), su razdvojeni

dvodimenzionalnom gel elektroforezom na temelju pI vrijednosti i masa. Gelovi su

međusobno uspoređeni, a promjene u ekspresiji pojedinih proteina su kvantificirane

denzitometrijskom analizom. Proteini sa značajnom promjenom u ekspresiji su

identificirani spektrometrijom masa, a uočene razlike mogle bi ukazati kojim

molekularnim mehanizmima utišavanje integrina αvβ3 i αvβ5 utječe na povećanje

osjetljivosti stanica MDA-MB-435S na protutumorske lijekove vinkristin i

paklitaksel. U daljnjem tekstu su opisani proteini za koje je pokazana promjena u

ekspresiji i koji bi mogli biti povezani sa spomenutim opaženim fenomenima, te su

navedeni literaturno dostupni podaci o njihovoj ulozi u pokretljivosti stanica,

metastaziranju i otpornosti na protutumorske lijekove.

Kao što je očekivano, zbog izravne povezanosti integrina s aktinskim

citoskeletom (Takada, 2007), utišavanje podjedinice integrina αV dovelo je do velike

promjene u ekspresiji citoskeletnih proteina. U stanicama transficiranim siRNA(αv)

primijećeno je smanjenje ekspresije beta aktina (ACTB) i vimentina čak 8 do 10 puta,

dok ekspresija miozina-1 potpuno izostaje. Vimentin je homopolimerni protein iz

skupine intermedijarnih filamenata (tipa 3) bitan za integraciju komponenti staničnog

citoskeleta (Chang i Goldman, 2004). Potvrđena je i njegova izravna interakcija s

aktinom (Esue i sur. 2006). Eckes i suradnici (1998) su pokazali prisutnost vimentina

u fokalnim adhezijama, strukturama bitnim za kretanje stanica. Utišavanjem

vimentina u endotelnim stanicama primijetili su aberantnu prostornu raspodjelu

fibrilnog aktina i komponenti adhezijskog kompleksa kao što su vinkulin, talin i

paksilin, čime zaključuju da je vimentin vrlo bitna komponenta fokalnih adhezija.

Točno 11 godina kasnije, Bhattachrya i suradnici (2009) pokazuju prisutnost

vimentina u fokalnim adhezijama, no ovaj put u stanicama bogatim integrinima αvβ3 i

αvβ5 (endotelne stanice koštane srži (TrHBMECs) i stanice ovarija kineskog hrčka

(CHO)). Oni u svom radu zaključuju da su za inkorporaciju vimentina u strukture

47  

 

fokalnih adhezija potrebni integrini β3, plektin, mikrotubuli te motorni proteini dinein

i kinezin. Utišavanjem integrina β3 u navedenim staničnim linijama primjetili su

lokalizaciju vimentina oko jezgre stanice, dok su u stanicama s ekspresijom

podjedinice integrina β3 uočili protezanje vimentinskih intermedijarnih filamenata sve

do fokalnih adhezija na membrani stanice. Uz to, ove stanice imaju veću sposobnost

adhezije u usporedbi sa stanicama transficiranim s siRNA(β3). Utišavanjem

podjedinice integrina β5 nisu postigli jednak učinak, čime postuliraju da je za

inkorporaciju vimentima u fokalne adhezije ključna podjedinica integrina β3 i to bočni

ogranci tirozina 747 i 759 u citoplazmatskim repovima podjedinice integrina β3.

Vizualizacijom paksilina, integrina β3 i vimentina fluorescentno obilježenim

protutijelima u stanicama transficiranim s siRNA(β3) potvrđuju nužnost ekspresije

integrina β3 za inkorporaciju vimentinskih filamenata na mjesta adhezija. Lokalizacija

paksilina u navedenim uvjetima je promjenjena u odnosu na kontrolne stanice, slično

rezultatima Eckes i suradnika (1998) koji su pokazali aberantnu lokalizaciju

komponentni fokalnih adhezija (uključujući paksilin) nakon utišavana vimentina.

Neobjavljeni rezultati grupe Ambriović Ristov u stanicama tumora dojke MDA-MB-

435S nakon utišavanja podjedinice integrina αv pokazuju smanjenje migratorne

sposobnosti stanica, nestanak organizacije aktinskog citoskeleta tj. smanjenje broja

stresnih niti koje završavaju u fokalnim adhezijama te smanjen broj fokalnih adhezija

vidljiv na temelju lokalizacijie fosfopaksilina (Ferenčak, 2013). Svi navedeni podaci u

skladu su s rezultatima proteomske analize provedene u ovom diplomskom radu na

istom modelu stanica, gdje je pokazana skoro 10 puta smanjena ekspresija vimentina

nakon utišavanja podjedinice integrina αv. Moguće je da utišavanjem podjedinice

integrina αv, čime dolazi do smanjenja ekspresije integrina αvβ3 i αvβ5, utječe na

smanjenje ekspresije vimentina što zajednički doprinosi dezintegraciji aktinskog

citoskeleta prilikom formiranja fokalnih adhezija u stanica MDA-MB-435S. Budući

da u stanicama MDA-MB-435S još uvijek nije potvrđena uloga vimentina u stvaranju

fokalnih adhezija, iznesena hipoteza trebala bi se provjeriti dodatnim eksperimentima,

kao što su test migracije nakon utišavanja vimentina ili mikroskopija stanica s

fluorescentno obilježenim protutijelima na vimentin, aktin, paksilin i podjedinicu

integrina β3.

48  

 

Intermedijarni filamenti, osim što stvaraju izravne kontakte s aktinom,

ostvaruju i interakcije s miozinima, motornim molekulama povezanim s aktinskim

citoskeletom (Chang i Goldman, 2004). U stanicama MDA-MB-435S nakon

utišavana podjedinice integrina αv, ekspresija miozina 1E potpuno izostaje. Miozin 1E

ima ulogu u formiranju ranih adhezivnih struktura bogatih aktinom u kojima je

pokazana i njegova kolokalizacija s podjedinicama integrina β3. Prekomjerna

ekspresija miozina s deletiranom SH3 domenom (bitnom za pokretanje miozina) u

više staničnih linija skraćuje vrijeme postojanja stabilnih adhezivnih struktura te

uzrokuje promjene u morfologiji membrana na mjestima adhezija. Prema tome miozin

1E sudjeluje u transportu polimerizacijskih proteina, a moguće je da prenosi i proteine

uključene u stabilizaciju adhezija (Gupta i sur., 2013). Nadalje, drugi tip miozina,

miozin-Va, povezuje intermedijarne filamente s aktinskim citoskeletom u neuronima,

a vrlo je vjerojatno da slične interakcije posredovane različitim tipovima molekula

miozina postoje i u drugim tipovima stanica (Chang i Goldman, 2004). Kao što je već

spomenuto, proteomskom analizom stanica MDA-MB-435S nakon utišavanja

podjedinice integrina αv, uočeno je da ekspresija miozina 1E potpuno izostaje. S

obzirom na sve navedeno, u kombinaciji s već spomenutim rezultatima grupe

Ambriović Ristov koji pokazuju smanjen broj fokalnih adhezija nakon utišavanja

podjedinice integrina αv na istom modelu stanica (Ferenčak, 2013), moguće je da

miozin 1 u stanicama MDA-MB-435S također sudjeluje u formiranju fokalnih

adhezija. Utišavanjem podjedinice integrina αv dokida se njegova ekspresija, a to bi,

uz pokazanu smanjenu ekspresiju vimentina, također moglo doprinjeti smanjenom

broju aktinskih stresnih niti i struktura fokalnih adhezija. Kretanje miozina 1E prema

fokalnim adhezijama stanica MDA-MB-435S trebala bi se potvrditi dodatnim

eksperimentima.

Diferencijalno eksprimirani proteini u stanicama MDA-MB-435S nakon

utišavanja podjedinice integrina αv opisani do sada su proteini povezani s aktinskim

citoskeletom (Clucas i Valderrama, 2014) te vimentin kao predstavnik intermedijarnih

filamenata (Chang i Goldman, 2004). U ovom eksperimentu nije primijećena

promijenjena ekspresija proteinskih sastavnica mikrotubula, kao treće bitne

komponenta staničnog citoskeleta (Alberts i suradnici, 2008), što ne znači da nisu

promijenjeni. Međutim, protein čija ekspresija u stanicama MDA-MB-435S izostaje

49  

 

nakon utišavanja podjedinice integrina αv, a može se dovesti u vezu s mikrotubulima

je HSP70-8 (HSC70), jedan od barem 8 postojećih HSP70 proteina s različitim

funkcijama (Daugaard i sur., 2007) koje stanice pojačano ekprimiraju kao odgovor na

stres (Alberts i suradnici, 2008). HSC70 je protein bitan za preživljenje zdrave, ali i

tumorske stanice, a prekomjerno je ekprimiran u nekoliko tumora uključujući tumor

dojke, gdje ga se povezuje s lošom prognozom za pacijenta (Daugaard i sur., 2007).

Promijenjena ekspresija HSC70 primijećena je u tumorskim stanicama otpornim na

vinka alkaloide (protutumorske lijekove u koje se ubraja i vinkristin). Protein HSC70

stanicama omogućuje rezistentan fenotip izravnim vezanjem na tubulin (Verills i

suradnici, 2003).

Utišavanje integrina αv utjecalo je na promjenu ekspresije još jedne skupine

proteina povezanih s aktinskim citoskeletom: ezrin, radiksin i moezin (ERM proteini).

Zbog visoke homologije i strukturne sličnosti (Fernando i sur., 2010), sva tri proteina

pronađena su u istoj proteinskoj mrlji u gelu kontrolnih stanica. U stanicama MDA-

MB-435S u kojima su integrini αvβ3 i αvβ5 utišani transfekcijom αv-specifične siRNA,

ekspresija navedenih proteina izostaje. ERM proteini inače imaju ulogu u povezivanju

aktinskog citoskeleta sa staničnom membranom te su u visokim koncentracijama

pronađeni u strukturama bogatim aktinom kao što su mikrovili, lamelipodiji i

filopodiji. Uključeni su u prijenos signala bitnih za adheziju i migraciju stanica, stoga

nije čudno da su prepoznati kao proteini koji utječu na razvoj tumora (Clucas i

Valderrama, 2014).

Visoka ekspresija ezrina primijećena je u tumorima dojke, pluća i prostate

(Clucas i Valderrama, 2014). Ezrin je povezan s proteinima koji kontroliraju signalne

puteve za preživljenje, proliferaciju i migraciju (Meng i sur., 2010). Mak i suradnici

(2012), pokazali su da je ezrin meta Src kinaze, koja se izravno i specifično veže na

podjedinice integrina β3 (Arias-Salgado i sur., 2003). Fosforilacija tirozina 477

(Y477) u strukturi ezrina bitna je za metastaziranje stanica tumora dojke MDA-MB-

231, što je pokazano smanjenjem migratorne sposobnosti stanica nakon zamjene

Y477 fenilalaninom (Mak i sur., 2012). Utišavanje ezrina na istom staničnom modelu

dovelo je do dezintegracije aktinskog citoskeleta te smanjenje pokretljivosti i

invazivnosti (Li i sur., 2008).

50  

 

Uloga radiksina u progresiji tumora je najmanje istražena u odnosu na druga

dva proteina iz ERM kompleksa. Valastyan i suradnici (Valastyan i sur., 2009)

pokazali su da vezanje mikro RNA molekule miR-31 na radiksin inhibira

metastaziranje stanica tumora dojke u mišjim modelima. Osim miR-31 u humanom

genomu pronađen je velik broj mikro RNA molekula koje mogu djelovati kao

onkogeni ili tumor supresori. Ista grupa je 2010. godine utišavanjem radiksina (meta

miR-31 molekule), RhoA proteina (GTPaza uključena u regulaciju aktinskog

citoskeleta prilikom stvaranja stresnih niti) i integrina α5 uspjela u stanicama MDA-

MB-231 inhibirati migraciju, čime su postigli jednak učinak kakav inače ima tumor-

supresorska miR-31. Doprinos pojedinog od navedena 3 proteina ovom učinku nije

poznat (Valastyan i sur., 2010).

Protein s najvećom razlikom u ekspresiji koji nije povezan sa staničnim

citoskeletom je transketolaza, čija ekspresija se smanjuje za čak 7 puta nakon što se

stanicama MDA-MB-435S utišaju integrini αvβ3 i αvβ5. Transketolaza je metabolički

enzim koji u zdravim animalnim stanicama sudjeluje u neoksidativnom putu pentoza

fosfata (Nelson i Cox, 2008). U tumorskom tkivu transketolaza omogućuje ragradnju

glukoze neovisnu o kisiku te je bitna u procesu sinteze riboze za nukleinske kiseline.

U humanom genomu postoje 3 gena za transketolazu, a prekomjerna ekspresija

TKTL1 inačice je povezana s lošom prognozom pacijenata s tumorima mokraćnog

sustava i debelog crijeva (Földi i sur., 2007). Nadalje, pokazano je da u stanicama

karcinoma jetre čovjeka HepG2 utišavanje ekspresije proteina TKTL1 RNA

interferencijom dovodi do smanjenja proliferacije (Zhang, 2007). U literaturi nisu

pronađeni podaci koji bi doveli ekspresiju TKTL1 u vezu sa signalnim putevima

potaknutim integrinima αvβ3 i αvβ5.

Aneksini su skupina proteina uglavnom smještenih na citosolnoj strani

membrana uz negativno nabijene fosfolipide, a osim uloge u fagocitozi uključeni su i

u procese diferencijacije i proliferacije. Prekomjerna ekspresija aneksina A1

primijećena je u tumorima hipofize, gušterače te u tumorima dojke i njihovim

metastazama u plućima. Utišavanje aneksina A1 specifičnim siRNA molekulama

dovodi do smanjene proliferacije stanica tumora dojke MDA-MB-231 (Khau i sur.,

2011.). Također, bitno je napomenuti da je ekspresija aneksina A1 povezana s

tumorima dojke bez receptora za estrogen i/ili progesteron (Khau i sur., 2011) što je

51  

 

skladu i s našim rezultatima koji pokazuju 3 puta povećanu ekspresiju aneksina A1

prije utišavanja podjedinice integrina αv. Osim toga, nedavno su Okano i suradnici

(2015) također potvrdili prekomjernu ekspresiju aneksina A1 u trostruko negativnim

tumorima dojke, te pokazali ulogu u invaziji u hipoksičnim uvjetima. Dostupni

literaturni izvori povezuju aneksin A1 s povećanjem preživljenja i invazivnosti

stanica tumora želuca, ali preko proteina koji intereagira s podjedinicom integrina β1

(Cheng i suradnici, 2012). Podaci koji bi doveli aneksin A1 u vezu sa signalnim

putevima potaknutim integrinima αvβ3 i αvβ5 nisu pronađeni.

Usporedbom proteomskih profila kontrolnih stanica MDA-MB-435S

transficiranih sa siRNA(-) molekulama i onih transficiranih sa siRNA(αv) vidljivo je

da utišavanje podjedinice integrina αv dovodi do smanjene ekspresije nekih proteina

povezanih sa staničnim citoskeletom, metaboličkih proteina, elongacijskih faktora te

još drugih proteina kao što su aneksin A1, galektin-1 i proteasomalna podjedinica

beta. Nakon utišavanja podjedinice integrina αv dolazi do povećane ekspresije

proteina uglavnom iz porodice HSP (HSP60, HSP70-2 i HSP90). Ekspresija HSP60

primijećena je samo u stanicama MDA-MB-435S kojima je utišana podjedinica

integrina αv. Ghosh i suradnici, (2008) pokazali su na više staničnih modela

(uključujući i staničnu liniju tumora dojke MDA-MB-231) da prekomjerno

ekprimiran HSP60 ima bitnu ulogu u preživljenju stanica. Protein HSP70 u stanicama

MDA-MB-435S čak je 11 puta više eksprimiran nakon utišavanja integrina αv. Ima

ulogu u sprječavanju stanične smrti potaknute hipotermijom, oksidativnim stresom ili

citotoksičnim lijekovima (Rerole i sur. 2011). Proteini HSP90 (izoforme a, b i c)

pronađeni u stanicama MDA-MB-435S nakon utišavanja podjedinice integrina αv

eksprimirani su 5 puta više nego u kontrolnim stanicama. U literaturi postoje podaci o

njegovoj ulozi u citoplazmi, ali i izvanstaničnom prostoru. HSP90 proteini sudjeluju u

smatanju proteina koji svoju funkciju obavljaju u izvanstaničnom prostoru, kao što je

matriks metaloproteinaza 9, bitna za remodeliranje izvanstaničnog matriksa prilikom

invazije stanica. Također, primijećeno je da HSP90 utječe na stvaranje izvanstaničnog

matriksa izravnim vezanjem na fibronektin. Na osnovu svega navedenog predložena

je njegova uloga u kontroli migracije stanica i invazije (Hunter i sur., 2014).

Navedene uloge HSP proteina povezane su preživljenjem stanica, što je na prvi

pogled suprotno očekivanom učinku utišavanja integrina αv. No, s obzirom na

52  

 

činjenicu da se HSP proteini inače više eksprimiraju u uvjetim stresa, a utišavanje

integrina stanicama vjerojatno i jest stresni stimulans, možemo ih protumačiti

pokušajem stanice da se prilagodi novonastalim promjenama. Utišavanje podjedinice

integrina αv, čime se smanjuje koncentracija integrina kao adhezivnih molekula na

površini stanica, za posljedicu ima odvajanje stanica od podloge pa samim tim i

dokidanje signala u stanicu. U skladu s tim, stanice MDA-MB-435S nakon utišavanja

podjedinice integrina αv povišenom ekspresijom proteina HSP90, koji sudjeluje u

formiranju izvanstaničnog matriksa formiranjem fibronektinskih mreža (Hunter i

suradnici, 2014) možebitno pokušavaju nadomjestiti gubitak kontakta s

izvanstaničnim matriksom uzrokovanog nedostatkon integrina αvβ3 i αvβ5.

Osim navedene de novo ili povišene ekspresije HSP proteina u stanicama

MDA-MB-435S nakon utišavanja podjedinice integrina αv pronađena je de novo

ekspresija proteina POTE-2α-aktina, fuzija aktina s POTE proteinom čiji je mRNA

transkript primijećen u HeLa stanicama. Biološka uloga proteina POTE još uvijek nije

razjašnjena, no primijećeno je da je pojačano eksprimiran u primarnim

spermatocitima, gdje ga se povezuje s procesom stanične smrti (Liu i Pastan, 2009).

Osim što ga se povezuje s apoptozom, Liu i Pastan (2009) su predložili njegovu ulogu

i u anoikisu, drugi tip stanične smrti uzrokovan odvajanjem stanica od podloge. S

obzirom da stanice MDA-MB-435S nakon utišavanja podjedinice integrina αv gube

dio interakcija s izvanstaničnim matriksom ujedno postaju i slabije adherentne.

Moguće je da POTE-2α-aktin barem djelomično upućuje na anoikis u stanicama

MDA-MB-435S nakon transfekcije sa siRNA(αv). Budući da u literaturi ne postoje

podaci o ekspresiji POTE-2α-aktina u stanicama MDA-MB-435S, njegova ekspresija

trebala bi se dodatno provjeriti nekom drugom metodom.

Provedena proteomska analiza stanica MDA-MB-435S otkrila je nekolicinu

značajno diferencijalno eksprimiranih proteina uslijed utišavanja podjedinice

integrina αv. Promjene se većim dijelom odnose na proteine koji izgrađuju stanični

citoskelet ili s njim ostvaruju specifične interakcije (beta aktin te proteine povezani s

aktinskim citoskelet, vimentin kao predstavnik intermedijarnih filamenta te HSC70

koji ostvaruje interakcije s mikrotubulima), što je i očekivano s obzirom na izravnu

povezanost integrina sa staničnim citoskeletom. Također, pronađeni su i proteini koji

sudjeluju u metaboličkim procesima, različiti elongacijski faktori i velik broj HSP

53  

 

proteina. Budući da je MS analiza učinjena samo jednom, trebalo bi ju višestruko

ponoviti kako bismo sa sigurnošću mogli potvrditi navedene promjene. Također, u

svrhu otkrivanja specifičnog mehanizma kojim stanice MDA-MB-435S postaju

osjetljivije na protutumorske lijekove nakon utišavanja podjedinice integrina αv,

potrebno je napraviti i dodatne testovi koji bi mogli uključivati (I) western analize,

gdje bi se specifičnim protutijelima izravno mogla potvrditi razlika u ekspresiji

identificiranih proteina, (II) kvantitativni RT-PCR kako bi pokazali postoji li

korelacija između ekspresije identificiranih proteina i njima pridruženih mRNA

transkripata, (III) konfokalna mikroskopija korištenjem specifičnih protutijela u svrhu

potvrde lokalizacije određenih identificiranih proteina u odnosu na njihove

potencijalne partnere i ulogu koju obavljaju, (IV) utišavanje određenih identificiranih

proteina RNA interferencijom te praćenje promjena u proliferaciji stanica,

osjetljivosti na citostatike i migraciji, (V) testove za dokazivanje proteinskih

interakcija kako bi identificirali partnere proteina potencijalno uključenih u proces

razvijanja osjetljivosti na citostatike i smanjenja migratorne sposobnosti nakon

utišavanja podjedinice integrina αv.

54  

 

6. ZAKLJUČCI

1. Utišavanjem podjedinice integrina αv, stanice trostruko negativnog tumora

dojke MDA-MB-435S postaju osjetljivije na djelovanje vinkristina i paklitaksela, te

im se uveliko smanjuje migratorna sposobnost (Ferenčak, 2012). U svrhu boljeg

razumjevanja navedenih fenotipskih promjena, provedena je proteomska analiza

stanica MDA-MB-435S nakon utišavanja podjedinice integrina αv kojom je

identificirano 45 diferencijalno eksprimirana proteina.

2. Usporedbom proteomskih profila stanica MDA-MB-435S transficiranih sa

kontrolnom siRNA i αv-specifičnom siRNA uočene su promjene u ekspresiji proteina

koji se mogu podijeliti u 5 skupina: 1. proteini uključeni u izgradnju staničnog

citoskeleta i oni koji s njim ostvaruju specifične interakcije; 2. proteini uključeni u

metaboličke procese; 3. elongacijski faktori; 4. HSP porodica proteina i 5. ostali

proteini. Na temelju dostupnih literaturnih podataka ovi su proteini opisani te je

pretpostavljeno mogu li doprinijeti (I) mehanizmu povećanja osjetljivosti stanica

MDA-MB-435S na vikristin i paklitaksel i/ili (II) smanjenoj migratornoj sposobnosti

stanica, nakon utišavanja podjedinice integrina αv.

3. S obzirom na činjenicu da je proteomska analiza provedena samo jednom,

te na ograničen broj literaturnih podataka izravno povezanih s ovim staničnim

modelom, trenutno nismo u mogućnosti u potpunosti objasniti navedene fenomene.

Međutim, ovaj diplomski rad poslužit će kao smjernica za daljnja kompleksnija

istraživanja, kako bi se u konačnici pridonijelo poboljšanju ograničenih dostupnih

terapija za pacijente oboljele od trostruko negativnih tumora dojke.

55  

 

7. LITERATURA  

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Rafi M., Roberts K., Walter P. (2008): Cell Junctions, Cell Adhesion, and the Extracellular Matrix. Molecular Biology of the Cell. New York, Garland Science, str. 1131-1204.

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Rafi M., Roberts K., Walter P. (2008): How Cells Read the Genome: From DNA to Protein. Molecular Biology of the Cell. New York, Garland Science, str. 329-410.

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Rafi M., Roberts K., Walter P. (2008): The Cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. New York, Garland Science, str. 965-1052.

Ambriovic-Ristov A., Osmak M. (2006): Integrin-Mediated Drug Resistance. Current Signal Transduction Therapy 1: 1-11.

Aoudjit F., Vuori K. (2001): Integrin signaling inhibits paclitaxel-induced apoptosis in breast cancer cells. Oncogene 20: 4995-5004.

Arias-Salgado E. G., Lizano S., Sarkar S., Brugge J. S., Ginsberg M. H., Shattil S. J. (2003): Src kinase activation by direct interaction with the integrin beta cytoplasmic domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 13298-302.

Badve S., Dabbs D. J., Schnitt S. J., Baehner F. L., Decker T., Eusebi V., i sur. (2011): Basal-like and triple-negative breast cancers  : a critical review with an emphasis on the implications for pathologists and oncologists.Modern Pathology 24:157-67.

Banks R. E., Dunn M. J., Hochstrasser D. F., Sanchez J. C., Blackstock W., Pappin D. J., Selby P. J. (2000): Proteomics: New perspectives, new biomedical opportunities. Lancet 356: 1749 – 1756.

Bhattacharya R., Gonzalez A. M., Debiase P. J., Trejo H. E., Goldman R. D., Flitney F. W., i sur. (2009): Recruitment of vimentin to the cell surface by β3 integrin and plectin mediates adhesion strength. ournal Of Cell Science 122: 1390–400.

Brozovic A., Ambriovic-Ristov A., Osmak M. (2010): The relationship between cisplatin-induced reactive oxygen species, glutathione, and BCL-2 and resistance to cisplatin. Critical Reviews in Toxicology 40: 347-359.

Cailleau R., Olivé M., Cruciger Q.V. (1978): Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro 14: 911–5.

56  

 

Cao Q., Cai W., Li T., Yang Y., Chen K., Xing L., Chen X. (2006): Combination of integrin siRNA and irradiation for breast cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications 351: 726-732.

Carey L., Winer E., Viale G., Cameron D., Gianni L. (2010): Triple-negative breast cancer  : disease entity or title of convenience  ? Nature Reviews Clinical Oncology 7: 683–92.

Chambers A. F. (2009): MDA-MB-435 and M14 Cell Lines  : Identical but not M14 Melanoma ? Cancer Research 69: 5292–4.

Chang L., Goldman R. D. (2004): Intermediate filaments mediate cytoskeletal crosstalk. Nature Reviews 5: 601-613.

Cheng T. Y., Wu M. S., Lin J. T., Lin M. T., Shun C. T., Huang H. Y. (2012): Annexin A1 is associated with gastric cancer survival and promotes gastric cancer cell invasiveness through the formyl peptide receptor/extracellular signal-regulated kinase/integrin beta-1-binding protein 1 pathway. Cancer 118: 5757-67.

Clucas J., Valderrama F. (2014): ERM proteins in cancer progression. Journal of Cell Science 127: 267–275.

Daugaard M., Rohde M., Ja M. (2007): The heat shock protein 70 family  : Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions. FEBS Letters 581:3702–10.

Dekanić A. (2012): Utjecaj utišavanja integrina αvß3 i αvß5 na osjetljivost stanica tumora na cisplatinu. Diplomski rad. Zagreb : Prirodoslovno-matematički fakultet.

Desgrosellier J. S., Cheresh D. A. (2010): Integrins in cancer: biological implications and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer 10: 9-22.

Eckes B., Dogic D., Colucci-Guyon E., Wang N., Maniotis A., Ingber D., i sur. (1998): Impaired mechanical stability, migration and contractile capacity in vimentin- deficient fibroblasts. Journal Of Cell Science 1907: 1897–907.

Esue O., Carson A. A., Tseng Y., Wirtz D. (2006): A Direct Interaction between actin and vimentin filaments mediated by the tail domain of vimentin. The Journal of Biological Chemistry 281: 30393–9.

Ferenčak K. (2012): Utjecaj utišavanja integrina αv ili α4 na osjetljivost stanica tumora dojke na vinkristin i paklitaksel. Diplomski rad. Zagreb: Prirodoslovno-matematički fakultet.

Fernando H., Martin T. A., Douglas-Jones A., Kynaston H. G., Mansel R. E., Jiang W. G. (2010): Expression of the ERM family members (ezrin , radixin and moesin) in breast cancer. Experimental and Therapeutic Medicine 1: 153–60.  

57  

 

Földi M., Stickeler E., Bau L., Kretz O., Watermann D., Gitsch G., i sur. (2007): Transketolase protein TKTL1 overexpression  : A potential biomarker and therapeutic target in breast cancer. Oncology Reports 7: 841-5.

Galić N. (2004): Spektrometrija masa – za kolegij Instrumentalne analitičke metode II. Interna skripta. Zagreb: Prirodoslovno-matematički fakultet.

Ganguly A., Cabral F. (2011): New insights into mechanisms of resistance to microtubule inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta 1816: 164-171.

Ghosh J. C., Dohi T., Kang H., Altieri D. C. (2008): Hsp60 Regulation of Tumor Cell Apoptosis. Journal of Biological Chemistry 283: 5188-9.

Gupta P., Gauthier N. C., Cheng-Han Y., Zuanning Y., Pontes B., Ohmstede M., i sur. (2013): Myosin 1E localizes to actin polymerization sites in lamellipodia, affecting actin dynamics and adhesion formation. Biology Open 2: 1288-1299.

Han X., Aslanian A., Iii J. R. Y. (2008): Mass spectrometry for proteomics. Current Opinion in Chemical Biology 12: 483-90.

Hanahan D., Weinberg R. A. (2011): The Hallmarks of Cancer. Cell 144: 646-74.

Hollestelle A., Nagel J. H. A., Smid M., Lam S., Elstrodt F., Wasielewski M., i sur. (2010): Distinct gene mutation profiles among luminal-type and basal-type breast cancer cell lines. Breast Cancer Research and Treatment 121: 53-64.

Hunter M. C., Hagan K. L. O., Kenyon A., Dhanani K. C. H., Prinsloo E., Edkins A. L. (2014): Hsp90 Binds Directly to Fibronectin (FN) and Inhibition Reduces. PloS One 9: e86842.

Khau T., Langenbach S. Y., Schuliga M., Harris T., Johnstone C. N., Anderson R. L., i sur. (2011): Annexin-1 signals mitogen-stimulated breast tumor cell proliferation by activation of the formyl peptide receptors (FPRs) 1 and 2. FASEB Journal 25: 483-96

Kim M., Pinto S. M., Getnet D., Nirujogi R. S., Manda S. S., Chaerkady R., i sur. (2014): A draft map of the human proteome. Nature 509: 575–81.

Lane C. S. (2005): Mass spectrometry-based proteomics in the life sciences. Cellular And Molecular Life Sciences 62: 848–869.

Le X. F., Bast R. C. (2011): Src family kinases and paclitaxel sensitivity. Cancer Biology and Therapy 12: 260-9.

Levanat S., Cvok M. L. I. (2010): Molekularna osnova raka dojke vezana uz gene BRCA1 i BRCA2 : karakteristike i ciljana terapija. Liječnički vjesnik 132: 34-37.

58  

 

Li Q., Wu M., Wang H., Xu G., Zhu T., Zhang Y., i sur. (2008): Ezrin silencing by small hairpin RNA reverses metastatic behaviors of human breast cancer cells. Cancer Letters 261: 55-63.

Liu L. J., Pastan I. (2009): A primate-specific POTE-actin fusion protein plays a role in apoptosis. Apoptosis 14: 1237-44.

Mak H., Naba A., Varma S., Schick C., Day A., Sengupta S. K., i sur. (2012): Ezrin phosphorylation on tyrosine 477 regulates invasion and metastasis of breast cancer cells. BMC Cancer 12: 82.

Meng Y., Lu Z., Yu S., Zhang Q., Ma Y., Chen J. (2010): Ezrin promotes invasion and metastasis of pancreatic cancer cells. Journal of Translational Medicine 8: 61.

Millard M., Odde S., Neamati N. (2011): Integrin targeted therapeutics. Theranostics 1: 154-188.

Muñoz J., Heck A. J. R. (2014): From the human genome to the human proteome. Angewandte Chemie International Edition 53: 2–5.

Nelson D. L., Cox M. M. (2008): Glycolysis, Gluconeogenesis, and the Penthose Phosphate Pathway. Lehninger Principles of Biochemistry. New York, W. H. Freeman, str. 527-568.

Okano M., Kumamoto K., Saito M., Onozawa H., Saito K., Abe N. i sur. (2015): Upregulated Annexin A1 promotes cellular invasion in triple-negative breast cancer. Oncology Reports 33:1064-70.

Palmieri D., Lee J. W., Juliano R. L., Church F.C. (2002): Plasminogen activator inhibitor-1 and -3 increase cell adhesion and motility of MDA-MB-435 breast cancer cells. The Journal of Biological Chemistry 277: 40950-40957.

Pasqualini R., Bodorova J., Ye S., Hemler M.E. (1993): A study of the structure, function and distribution of b5 integrins using novel anti-b5 monoclonal antibodies. Journal of Cell Science 105: 101–11.

Pecorino L. (2012): Introduction. Molecular biology of cancer. Oxford, Oxford University Press, str. 1-20.

Pecorino L. (2012): Nutrients, hormones, and gene interactions. Molecular biology of cancer. Oxford, Oxford University Press, str. 254-281.

Rae J. M., Ramus S. J., Waltham M., Armes J. E., Campbell I. G., Clarke R., i sur. (2004): Common origins of MDA-MB-435 cells from various sources with those shown to have melanoma properties. Clinical and Experimental Metastasis 21: 543-552.

Rérole A. L., Jego G., Garrido C. (2011): Hsp70: Anti-apoptotic and Tumorigenic Protein.

59  

 

Methods In Molecular Biology 787:205-30.

Ross D. T., Scherf U., Eisen M. B., Perou C. M., Rees C., Spellman P., i sur. (2000): Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines. Nature Genetics 24: 227-235.

Sellappan S., Grijalva R., Zhou X., Yang W., Eli M. B., Mills G. B., Yu D. (2004): Lineage infidelity of MDA-MB-435S cells: expression of melanocyte proteins in a breast cancer cell line. Cancer Research 64: 3479-3485.

Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. (2014): Cancer Statistics. A Cancer Journal for Clinicians 64: 9–29.

Sloan E. K., Pouliot N., Stanley K. L., Chia J., Moseley J. M., Hards D. K., Aanderson R. L. (2006): Tumor-specific expression of αvβ3 integrin promotes spontaneous metastasis of breast cancer to bone. Breast Cancer Research 8: R20.

Stupp R., Hegi M. E., Gorlia T., Erridge S. C., Perry J., Hong Y., i sur. (2014): Cilengitide combined with standard treatment for patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter 3 trial. The Lancet Oncology 5: 1100-8.

Taherian A., Li X., Liu Y., Haas T. A. (2011): Differences in integrin expression and signaling within human breast cancer cells. BMC Cancer 11: 1-15.

Tan H.T., Lee Y.H., Chung M.C.M. (2012): Cancer proteomics. Mass Spectrometry Reviews 31: 583-605.

Takada Y., Ye X., Simon S. (2007): The integrins. Genome Biology 8: 215.

Tinoco G., Warsch S., Glück S., Avancha K., Montero A. J. (2013): Treating Breast Cancer in the 21st Century  : Emerging Biological Therapies. Journal of Cancer 4: 117-132.

Tucker G. C. (2006): Integrins  : Molecular Targets in Cancer Therapy. Current Oncology Reports 8: 96-103.

Uhm J. H., Dooley N. P., Kyritsis A. P., Rao J. S., Gladson C. L. (1999): Vitronectin, a glioma-derived extracellular matrix protein, protects tumor cells from apoptotic death. Clinical Cancer Research 5: 1587-1594.

Valastyan S., Chang A., Benaich N., Reinhardt F., Weinberg R. A. (2010): Concurrent Suppression of Integrin α5 , Radixin , and RhoA Phenocopies the Effects of miR-31 on Metastasis. Cancer Research 70: 5147–54.  

60  

 

Valastyan S., Reinhardt F., Benaich N., Calogrias D., Szász A. M., Wang Z. C., i sur. (2009): A pleiotropically acting microRNA, miR-31, inhibits breast cancer metastasis. Cell 137: 1032-46.

Venter J. C., Adams M. D., Myers E. W., Li P. W., Mural R. J., Sutton G. G. i sur. (2001): The Sequence of the Human Genome. Science 292: 1838.

Verrills N. M., Walsh B. J., Cobon G. S:, Hains P. G., Kavallaris M. (2003): Proteome analysis of vinca alkaloid response and resistance in acute lymphoblastic leukemia reveals novel cytoskeletal alterations. The Journal Of Biological Chemistry 278: 45082-93.

Voss M. J., Möller M. F., Powe D. G., Niggemann B., Zänker K. S., Entschladen F. (2011): Luminal and basal-like breast cancer cells show increased migration induced by hypoxia, mediated by an autocrine mechanism. BMC Cancer 11: 158.

Weis S. M., Cheresh D. A. (2011): αv Integrins in Angiogenesis and Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine 1: 1–14.

Wong N. C., Mueller B. M., Barbas C. F., Ruminski P., Quaranta V., Lin E. C. K., i sur. (1998): αv Integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma cell lines. Clinical & Experimental Metastasis 16: 50–61.

Woods A. G., Sokolowska I., Wetie A. G. N., Wormwood K., Aslebagh R., Patel S., i sur. (2014): Mass Spectrometry for Proteomics-Based Investigation. Advances in Experimental Medicine and Biology 806: 1-32.

Zhang S. (2007): Gene silencing of TKTL1 by RNAi inhibits cell proliferation in human hepatoma cells. Cancer Letters 253: 108-14.

Zhou J., Giannakakou P. (2005): Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents 5: 65-71.

http://www.breastcancer.org/treatment/hormonal

http://www.cancer.gov  

http://www.chemspider.com

http://www.clinicaltrials.gov  

http://www.clinicaltrialsregister.eu

http://www.herceptin.com

http://www.pathology.jhu.edu

61  

 

8. ŽIVOTOPIS  

Alen Kovačević Osobni podaci

Adresa prebivalište: Pere Cara 65, 32 213 Markušica, Hrvatska boravište: Donje Vrapče 4C, 10 090 Zagreb, Hrvatska

Datum rođenja 27. ožujka 1990.

Obrazovanje

2012 - 2015 Diplomski studij molekularne biologije

Naziv i status ustanove Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Biološki odsjek

2009 - 2012 Preddiplomski studij molekularne biologije

Stečeni akademski naziv Sveučilišni prvostupnik molekularne biologije (univ. bacc. biol. mol.)

Naziv i status ustanove Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Biološki odsjek

Osposobljavanja i dosadašnja radna iskustva

prosinac 2013. – prosinac 2014.

27. rujna – 06. listopada

2014.

17. – 20. rujna 2014.

01. svibnja – 01. rujna 2014. .

ožujak – svibanj 2013.

ožujak – svibanj 2012.

Izrada diplomskog rada u Laboratoriju za genotoksične agense i Laboratoriju za sistemsku biomedicinu Institut Ruđer Bošković, Zagreb Tema diplomskog rada: Proteomska analiza promjena u stanicama tumora dojke čovjeka MDA-MB-435S nakon utišavanja integrina αv 12th Greta Pitaf Mrzljak International School of Biophysics Sudjelovanje u ljetnoj školi; Primošten, Hrvatska Power of Viral Vectors in Gene Therapy and Basic Science Sudjelovanje u ljetnoj školi; Primošten, Hrvatska Laboratorijska stručna praksa u laboratoriju za molekularnu biofiziku (u okviru Erasmus programa) Sveučilište u Leidenu, Leiden Institute of Physics, Aartsma & Canters Lab, Nizozemska Tema projekta: Single molecule electron transfer in SLAC Laboratorijska stručna praksa u laboratoriju za biokemiju Sveučilištu u Zagrebu, Prirodoslovno – matematički fakultet, Kemijski odsjek Laboratorijska stručna praksa u laboratoriju za staničnu kulturu Sveučilištu u Zagrebu, Prirodoslovno – matematički fakultet, Biološki odsjek

62  

 

Stečene vještine

Metode molekularne biologije i biokemije

Biofizičke metode

ostalo

Uspostava, održavanje te izrada pokusa s kulturama animalnih stanica; imunocitokemija; transformacija bakterija (heat shock i elektroporacija); PCR; utišavanje gena RNA interferencijom; elektroforeza DNA u agaroznom gelu; FISH; ekspresija rekombinantnih proteina u bakterijskom sustavu; izolacija i purifikacija proteina (dijaliza, afinitetna kromatografija, gel filtracija, kromatografija ionske izmjene (UPLC)); SDS-PAGE; yeast two-hybrid; izoelektrično fokusiranje; 2D gel elektroforeza UV-Vis spektroskopija; fluorimetrija; single-molecule spektroskopija Rad s laboratorijskim životinjama (miševi i štakori); Rad s biomedicinskim bazama podataka i bioinformatičkim metodama Vještine stečene tijekom preddiplomskog i diplomskog studija molekularne biologije, te tijekom obavljanja laboratorijskih stručnih praksi.

Osobne vještine

Materinski jezik Hrvatski Strani jezici (samoprocjena prema europskim standardima)

engleski

njemački

razumjevanje Slušanje Čitanje

govor pisanje

C1 C1 C1 B2 Certifikat: TOEFL, 96 bodova

(čitanje: 24 / slušanje: 29 / govor: 23 / pisanje: 20)

A2 A2 A1 A1 Certifikat: Centar za strane jezike, Filozofski fakultet u Zagrebu

Svjedodžba o znanju stranog jezika; stupanj A1

Računalne vještine Upoznat s radom u Mac OS X i Windows operacijskim sustavima; vješt u korištenju Microsoft Office programa. Vještine stečene tijekom osnovnoškolskog i srednjoškolskog obrazovanja (I. gimnazija Osijek).

Organizacijske vještine Sudjelovanje u organizaciji edukacijskog projekta Noć biologije.

Volontiranje na javnom događaju Zagreb Film Festival.

Vozačka dozvola B