Alessandro LibraRosario Alfio Umberto Lizzio

Sebastiano Maria MianoStefano Perez

Prof.ssa Cinzia Di Pietro

Cos'é la clonazione ? La parola "clone" deriva dal greco κλων, che

significa germoglio o ramoscello In biologia indica la possibilità di duplicare il

patrimonio biologico (genetico) di qualsiasi essere vitale con produzione di individui biologicamente uguali

si tratta di una forma di riproduzione a-sessuata e a-gamica

Brevi cenni storici 1938 lo studioso tedesco Hans Spemann propose un esperimento di trasferimento nucleare dal

nucleo di una cellula differenziata 1952 R. Briggs e T.J. King misero in pratica l’esperimento proposto da Spemann 14 anni prima,

applicandolo sulla rana leopardo 1962 J. Gurdon prelevò nuclei di cellule differenziate dall’intestino di girino e le trasferì in una cellula

uobo enucleata. Utilizzando il trapianto in serie ottenne un successo del 7 % e solo / si trasformarono in rane adulte fertili.

1972: clonazione di un frammento di DNA (molto importante per il proseguimento della ricerca) 1979: clonazione di mammiferi: si è trattato della formazione multipla di embrioni da uno solo

(separazione dei blastomeri di un embrione). 1997: prima clonazione di mammifero. Nasce la pecora Dolly dopo 297 tentativi falliti (ad opera di

Wilmut e Campbell, Glasgow – Scozia, Nature 27/2/1997). Dolly morirà nel 2003. 2000: Corea: viene interrotto lo sviluppo di cloni umani ai primi stadi di crescita 2003: Corea: viene iniziato lo sviluppo di cloni a fini terapeutici

21/01/2004: La Società Europea di Riproduzione Umana ed Embriologica (ESHRE) condanna con forza l’esperimento di clonazione umana annunciato il 17/01/04 dall’andrologo Zavos dell’Università del Kentucky. Il presidente Arne Sunde ha dichiarato: E’ completamente irresponsabile e non etico ogni tentativo di clonazione umana riproduttiva…ci sono anche seri problemi di carattere pratico, non ultimo l’alto rischio delle nascita di bambini con anomalie anche non apparenti”

12/02/2004: Scienziati americani e sud-coreani hanno annunciato negli Usa di aver clonato per la prima volta un embrione umano ed essere riusciti a selezionare le cosiddette cellule staminali embrionali per una clonazione terapeutica

Cellule staminali Sono cellule primitive non specializzate dotate della

singolare capacità di trasformarsi in qualunque altro tipo di cellula del corpo, si possono riprodurre illimitatamente dando vita ad altre staminali e a cellule precursori di una progenie cellulare destinata a differenziarsi e a dar vita a tessuti e organi, come i muscoli, il cuore, il fegato, le ossa ecc.

Esistono tre tipi di clonazione: Clonazione embrionale: è simile al processo che produce gemelli

identici. Le cellule vengono rimosse da un embrione fecondato e incoraggiati a sviluppare in duplice copia embrioni con DNA identico.

La clonazione riproduttiva: Mira creare una copia di un animale esistente. DNA viene rimosso da un uovo e sostituito con il DNA prelevato da un animale adulto, facendo un gemello genetico. Poi l'uovo fecondato,viene impiantato in un utero e che permette di sviluppare un nuovo animale identico al primo.

La clonazione terapeutica: segue le stesse fasi iniziali della clonazione riproduttiva, ma una volta che la copia di pre-embrione è stata creata le cellule staminali vengono rimosse. Le cellule staminali possono svilupparsi in qualsiasi tipo di cellula, così i ricercatori sperano di raccoglierle e utilizzarle.

LA CLONAZIONE

RIPRODUTTIVA

“SNCT is a technique that combines an enucleated egg and the nucleus of a somatic

cell to make an embryo”.

“SNCT è una tecnica che combina una cellula uovo enucleata con il nucleo di una cellula

somatica per creare un embrione

Praticata per la prima volta nel 1920 da Hans Spemann per esperimenti genetici, la SCNT è la tecnica attualmente utilizzata per produrre cloni. Necessita di due cellule: una donatrice e una cellula uovo. Le ricerche dimostrano che la cellula uovo, se fecondata, accetta meglio il trasferimento nucleare. Questa cellula infatti dovrà essere enucleata e accogliere il nuovo nucleo prelevato dal donatore. La cellula donatrice viene forzata ad entrare in fase G0. Il nucleo è adesso pronto per essere inserito nella cellula uovo tramite fusione cellulare o trapianti . L’ovocita viene stimolato a crescere e poi viene impiantato nella madre surrogata. Se la gravidanza sarà ottimale, questo processo darà vita a perfette repliche animali.

SCNTsomatic cell nuclear transfer

http://www.youtube.com/watch?v=Ss-z-d4mcp0&feature=related

La SCNT applicata al mondo animale

La pecora Dolly 5 luglio 1996 - 14 febbraio 2003Ian Wilmut- Roslin Institute in Scozia Narture 1997

•Topi-1997 Nature 1998-Università delle Hawaii

•Bovino- Giappone

Science 1998

•Capra-Cina

Nature Biotechnology 1999•Maiali-5 Marzo 2000

Science 2000•Snuppy- cane Sud Corea

Nature 2005

•Inyaz- Dromedario 8 Aplile 2009

Dubai- Biology of Reproduction 2009

La clonazione più famosa la SCNT della pecora Dolly Cellule utilizzate Metodologia Problematiche

Due pubblicazioni a confronto

La clonazione dei topi

Tecniche, successi e innovazioni dal 1998 al 2010

La clonazione dei topi e la tecnica di Honolulu

Nel Luglio del 1997 un gruppo di scienziati dell’università delle

Hawaii, guidati da Teruhiko Wakayama e Ryuzo Yanagimachi, annunciò di aver clonato tre generazioni di topi. Questi erano considerati animali molto difficili da clonare, perché, una volta fecondato, l’uovo iniziava subito a dividersi. A Rosilin fu scelta la pecora perché le uova non si duplicavano prima di alcune ore, e questo diede il tempo a Wilmut di riprogrammare il nuovo nucleo.

Wakayama ha affrontato il problema della sincronizzazione dei cicli cellulari in modo diverso rispetto Wilmut. Wilmut infatti usò le cellule della mammella, che dovevano essere costrette alla fase G0. Wakayama, inizialmente, utilizzò tre tipi di cellule: Le cellule del Sertoli, le cellule del cervello e cellule del cumulo. Sia le cellule del cervello che le cellule di Sertoli, permangono nello stato G0 naturalmente mentre cellule del cumulo sono quasi sempre in entrambi gli stati G0 o G1. Cellule uovo non fecondate del topo sono state usate come i destinatari dei nuclei del donatore. Dopo essere state enucleate, nelle cellule uovo sono stati inseriti i nuclei. I nuclei donatore sono stati prelevati dalle cellule a pochi minuti dalla estrazione da un topo. Dopo un'ora, le cellule avevano accettato il nuovo nucleo. Dopo altre cinque ore, la cellula uovo è stata poi collocata in una cultura chimica per avviare la crescita cellulare, proprio come avviene in natura.

Nella cultura vi era una sostanza (citocalasina B), che blocca la formazione di un corpo polare, cellula secondaria che si crea di norma prima della fecondazione. Queste possono poi essere trapiantate in madri surrogate e può essere così portata a termine la gravidanza. Il maggior successo delle cellule per il processo è stato dato dalle cellule del cumulo, per cui la ricerca si è concentrata sulle cellule di quel tipo. I risultati furono più incoraggianti di quelli di Wilmut in quanto nelle Hawaii si ottennero tre successi su cento tentativi, contro l’unico clone su 277 esperimenti su pecora.

a, Live oocyte surrounded by cumulus cells. The egg coat (the zona pellucida) appears in this micrograph as a relatively clear zone around the oocyte. b–e, Behaviour of cumulus cell nuclei following injection into enucleated oocytes, photographed after fixation and staining. b, A cumulus cell nucleus within 10 min of injection. c, Transformation of the nucleus into disarrayed chromosomes 3 h after injection. The disorder reflects an unusual situation in which single, condensed chromatids are each attached to a single pole of the spindle and are therefore not aligned on a metaphase plate. d, 1 h after Sr2+ activation, chromosomes are segregated into two groups (mb, midbody). e, 5 h after Sr2+ activation, two pseudo-pronuclei (left and right panels) with a varying number of distinct nucleolus-like structures are discernible in each egg. The size and number of pseudo-pronuclei varied, suggesting that segregation of chromosomes was random after oocyte activation. f, Live blastocysts produced following injection of enucleated oocytes with cumulus cell nuclei.

Come migliorare il tasso di successi nella tecnologia di clonazione dei topidi Thuan, Kishigami, Wakayama 2010

Problematiche e soluzioni Sono passati quattordici anni da quando il primo animale è stato creato, e il tasso

di successo per tali processi ha raggiunto circa il 20% , ma solamente il 2% circa è tipico dei topi. In questi anni sono state utilizzate molte tipologie di cellule e di tecniche, ma i risultati non sono molto variati. Con tale pubblicazione i ricercatori hanno dimostrato che con l’aggiunta di TSA (histone deacetylation inhibitor trichostatin A) il tasso di successi aumentava, favorito anche dall’utilizzo di cellule ES il cui nucleo aveva subito il processo di SCNT. Gli embrioni clonati presentavano delle anomalie embrionali e placentari, Dna metilato e istoni modificati, altri ancora morivano subito dopo la nascita per tumori eccetera. Queste anomalie probabilmente riflettono un’errata regolazione della funzione dei geni nelle cellule, causato da un aberrante riprogrammazione genica o dalla fallita cancellazione dello stato differenziato della cellula. Ma alcuni esemplari, come Cumulina, il primo topo clonato prodotto, hanno vissuto a lungo. La cosa importante è che queste anomalie non sono ereditabili e non derivano nemmeno da stirpi di topi clonati. La causa di queste anomalie poteva essere attribuita alla SCNT o alle cellule somatiche donatrici. Si scoprì infatti che buona parte dei cromosomi, durante lo sviluppo del pre-impianto, mostrava una segregazione aberrante.

Si pensò allora che la causa di tutto potevano essere dei fattori di riprogrammazione cellulare che si perdevano durante i meccanismi di SCNT presenti nel citoplasma. Ci si accorse che pur cercando di mantenere intatto il citoplasma, durante il processo di enucleazione, la percentuale dei successi non variava. Si ipotizzò allora che non tutti i fattori erano localizzati nel citoplasma, ma che alcuni erano presenti anche a livello del nucleo. Una possibile spiegazione deriva dall’incapacità dell’ovocita di accogliere una nucleo somatico diploide, in quanto naturalmente pronto ad accoglierne uno aploide. Ciò poteva portare ad un basso livello di fattori di riprogrammazione. Si provò allora a creare degli ovociti più grandi tramite elettrofusione, ma ciò non cambiò i risultati. Si capì allora, dopo molti tentativi, che il problema risiedeva nella conformazione dei cromosomi. L’utilizzo di TSA favorì la nascita di alcuni cloni ma questi morirono dopo 19 giorni. Si utilizzò allora un HDACi (histone deacetylase inhibitor) , lo scriptaid, che era meno tossico del TSA. Ciò ha portato ad un aumento di dieci volte del numero di nascite. Non si sa come i meccanismi intrinseci HDACi agiscano, ma si sa che questo provoca un’iperacetilazione , influenzando la conversione in cromatina, che permette la trascrizione, e aumentando la demetilazione del DNA, necessaria per la riprogrammazione genica.

Si è anche applicata la SCNT su cellule di animali congelati. Si è riusciti a clonare i blastocisti di un bovino le cui cellule somatiche erano state congelate da tre anni, ma non si poté stabilire se questi blastocisti fossero sani. I ricercatori di questa review hanno allora deciso di sperimentare la SCNT, con tutte queste conoscenze acquisite, su topi congelati per sedici anni a -20 °C senza alcuna protezione, alle stesse condizioni del permafrost. Si sono prelevate le cellule del cervello. Queste normalmente comportano alcune difficoltà nella clonazione, ma in tal caso furono le uniche utilizzabili. Sorprendentemente si ebbero cloni sani alla seconda generazione di topi tramite ntES. Questo potrebbe dar via a numerose tecniche atte a salvaguardare specie in via di estinzione o a resuscitare animali ormai scomparsi!!!

La clonazione del dromedario tecniche del XXI secolo

Injaz 1. I donatori sono indotti a ovulare su effetto di ormoni (GnRH, Gonadotropin

Releasing Hormone, e buserelin)2. Dopo aver sedato l’animale, vengono prelevate le cellule uovo tramite un trasduttore.3. Le cellule donatrici (cumulo, pelle dell’orecchio, e fibroblasti embionali) sono stati

sottoposte a “lavaggi” di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) capace di far accrescere le cellule, con l’aggiunta di FCS e tenute in coltura a determinate condizioni di temperatura e di umidificazione.

4. Le cellule donatrici, impiantate in ambiente perivitellino degli ovociti enucleati, vengono sottoposte ad elettrofusione (100 V/cm per 15 μs)

5. Quelli che, tenuti in coltura per 7 giorni, hanno raggiunto lo stato di morula e blastula vengono poi impiantati nella parte sinistra del corno uterino al sesto giorno della fase luteinica.

6. Solamente 6 embrioni si sono sviluppati (3 dai fibroblasti, 1 dalle cellule somatiche dell’orecchio e 2 dalle cellule del cumulo)

7. Delle sei gravidanze, ha avuto vita un solo un’esemplare femmina di dromedario chiamata Injaz. Dopo una gestazione di 378 giorni, il parto è avvenuto naturalmente l’8 Aprile 2009, la piccola pesava 32 kg e da allora ha continuato a svilupparsi normalmente.

The first cloned camelid, a female dromedary camel calf named Injaz: on the day of birth (a); and 2 mo old (b), growing well (photograph taken on 8 June 2009).

Wani N A et al. Biol Reprod 2010;82:373-379

Clonazione terapeutica Questo tipo di clonazione ha come fine la produzione

di cellule e tessuti somatici con un genoma nucleare identico a quello della cellula di partenza, anche se non corrisponde alla vera e propria formazione dell'embrione, perché è possibile interromperne la crescita molto prima, per la sola estrazione delle cellule staminali.

E’ definita terapeutica perché grazie ad essa si possono curare molte patologie alle quali non si sono trovate altre terapie.

La clonazione terapeutica del Prof. Liam Donaldson

Ipotizziamo un paziente affetto da Alzheimer, una malattia degenerativa che colpisce innanzitutto i neuroni, le cellule del cervello. Con la clonazione terapeutica, è tecnicamente possibile

creare un "clone" pre-embrionale del paziente, dal quale estrarre le cellule staminali embrionali perfettamente e geneticamente compatibili con quelle del paziente.

Una volta ottenute e moltiplicate, queste fungono da "mattoncini di riparazione" per le cellule già morte, frenando notevolmente l'esito della malattia.

Clonare le cellule T per sconfiggere il cancro

•Il Centro di Ricerca contro il Cancro "Fred Hutchinson" ha scoperto che clonando le cellule T (T-cell) dello stesso paziente si può bloccare il melanoma in stato avanzato, senza l’impiego di altre terapie.

L’esperimento L'esperimento è stato fatto su un paziente di 52 anni con

un melanoma in stato avanzato diffuso,da cui sono state prelevate delle cellule T CD4+, linfociti T chiamati anche Helper cell.

Le cellule T del sistema immunitario, clonate in laboratorio, sono state poi iniettate nel paziente senza che questo avesse mai effettuato terapie contro il cancro.

Due mesi dopo l’iniezione di cellule T, l’esame PET/TAC ha dimostrato l’assenza di masse tumorali fino a due anni dopo la somministrazione.

Cos’è successo:E' stato ipotizzato che l’iniezione di una grande quantità di cellule T CD4+ persista a lungo nel corpo perché le cellule sono in grado di produrre il proprio fattore di crescita, l’interleuchina 2, mentre stimolano l’effetto antitumorale delle cellule T CD8+, linfociti citotossici che distruggono qualsiasi tipo di cellula infettata, tumorale o non riconosciuta come accade nei rigetti associati ai trapianti.

Interleuchina-2, viene impiegata nei laboratori per clonare le cellule T. Studi clinici hanno testato la sua utilità contro le forme tumorali, ma comporta una tossicità troppo elevata,se messa a confronto con i risultati.

Fino a poco tempo fa non era ritenuto possibile isolare e far espandere le cellule T CD4+ antitumorali in laboratorio.Il paziente, invece, ha ricevuto 5 miliardi di cellule CD4+ clonate e cresciute appositamente per riconoscere e distruggere le cellule metastatiche del melanoma presentanti l’antigene NY-ESO-1 (EOC) .

Il risultato finale Le cellule sono rimaste per circa 80 giorni nel corpo

del paziente, anche se soltanto il 50 – 75 % delle cellule tumorali esprimono l’antigene NY-ESO-1. Il risultato finale è stato che l’intero tumore è regredito dopo l’iniezione.

Gli scienziati hanno quindi pensato che la risposta immunitaria dell’organismo si è estesa ad altri antigeni espressi dalle cellule del tumore.

È possibile trasferire tessuto cutaneo da una parte all'altra della stessa persona (trapianto autogeno), come pure da un donatore a un ricevente (trapianto allogenico).

Il trapianto di pelle autogeno è considerato la miglior terapia in caso di

lesioni estese, ad esempio in caso di ustioni gravi.

Il trapianto allogenico è impiegato per la

copertura temporanea di difetti cutanei estesi

o ferite problematiche. La pelle trapiantata è

rigettata, ma la secrezione di determinati

messaggeri chimici indotta dalla terapia può

aiutare la ferita a cicatrizzarsi.

Nella prima fase si prelevano dalla pelle del paziente tre tipi di cellule staminali con diverse caratteristiche: i cheratinociti, che consentono di riparare la pelle; i fibroblasti, che consentono di ricostruire lo strato profondo; i melanociti, che hanno il compito di dare colore alla pelle.

Successivamente si deve attendere circa un mese per la coltivazione delle staminali dalle quali si sviluppa la pelle.In seguito viene divisa in pezzi da 8x8 cm, ( il numero di quadrati preparati dipende dell'estensione dell'area da coprire ).Infine viene impiantata la pelle e questa attecchisce coprendo l'area della lesione.

Se gli ustionati hanno ancora sufficienti aree di pelle intatta, queste vengono utilizzate per il trapianto autogeno.

Le zone di prelievo si rigenerano spontaneamente, seppure di tonalità diversa.

Gli innesti vengono suturati oppure fissati con collanti o bendaggi.

Se l'innesto prelevato è a forma di rete, è possibile estenderlo per coprire una superficie fino a tre volte superiore a quella originale. Con il tempo, tuttavia, questi cosiddetti innesti a maglia (Meshgraft) tendono a contrarsi, formare cicatrici e a mostrare un colore diverso dalla cute adiacente.

Se gli ustionati gravi non hanno più sufficiente pelle sana, per coprire le zone ustionate si deve ricorrere alla pelle di un donatore. Il trapianto allogenico di pelle completa, però, viene rigettato dal sistema immunitario del paziente dopo 10-20 giorni. Questo lasso di tempo viene spesso sfruttato per far crescere piccoli lembi di tessuto del paziente stesso in cultura tessutale, in modo da ottenere lembi più grandi da innestare.

Le cellule sono trattate con virus che hanno inserito il gene Oct4 e proteine immuno-stimolanti chiamate citochine; esse si legano al DNA ed agiscono come un interruttore on / off , accendendo o spegnendo circa 2.000 geni. Così facendo le cellule cutanee vengono riprogrammate in cellule progenitrici del sangue.

Oct4 è uno dei pochi fattori utilizzato da Yamanaka per trasformare i fibroblasti in cellule iPS, ma la squadra di Bhatia, durante gli esperimenti, non ha trovato alcuna prova che le cellule progenitrici del sangue erano passate attraverso uno stato embrionale. Pattern di espressione genica delle cellule non somigliavano a quelle delle cellule staminali embrionali e le cellule progenitrici del sangue non sviluppavano nei topi teratomi, tumori caratteristici delle cellule pluripotenti.

http://www.frontsidebus.net/2010/11/scientists-turn-skin-into-blood-vidoe/

Il ricorso alla clonazione terapeutica è controverso per diversi motivi. Sotto il profilo scientifico il non è chiaro se il metodo funzioni effettivamente anche sull’uomo. Permane il dubbio che le cellule staminali così ottenute siano troppo “vecchie”, visto che il loro genotipo proviene da una cellula matura. Il tessuto ottenuto partendo da queste cellule potrebbe perdere la propria funzionalità o degenerare in un cancro.Tuttavia nel contesto medico oltre ai problemi di natura biologica, si inseriscono i problemi etici…

Orientamento della comunità scientificaDue fronti di pensiero esistono per la clonazione terapeutica•Il fronte dei laici considera l’embrione persona dal 14° giorno di vita, quindi ammette il sacrificio per il prelievo delle cellule staminali prima di tale periodo (Americani e Inglesi)•Il fronte cattolico considera l’embrione come persona fin dal suo concepimento, quindi è contrario al sacrificio degli embrioni.Tuttavia sono favorevoli all’uso delle cellule staminali prelevate dall’adulto

La via del TNSA, se facilmente percorribile, sarebbe la più idonea in quanto eluderebbe il problema etico delle cellule embrionali, perché non può essere considerato embrione se questo deriva da una replicazione asessuata, ed eviterebbe anche il grave problema del rigetto, trattandosi di cellule autologhe provenienti, cioè, dallo stesso individuo e quindi con lo stesso patrimonio genetico. In pratica, il procedimento definito TNSA, trasferimento nucleare di cellule staminali autologhe, consiste nell'inserire un nucleo di cellula adulta prelevata dal paziente in un ovocita privato del proprio nucleo.

“Che cosa fa di un uomo un uomo? La circostanza del suo concepimento o quella della sua vita? chi ci garantisce che il perfetto clone di un pugile possa decidere di indossare i guantoni, anziché suonare il violino? Un

genitore che clonasse se stesso ha almeno il cinquanta per cento di probabilità di rimanere deluso"

Leo Klass“Nuova biologia e vecchia morale”

•Metodologia della clonazione•http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20203432•http://www.aaas.org/spp/cstc/briefs/cloning/•http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19812298•http://www.biolreprod.org/content/82/2/373.long•http://stemcells.nih.gov/StemCells/Templates/StemCellContentPage.aspx?NRMODE=Published&NRNODEGUID=%7b3C35BAB6-0FE6-4C4E-95F2-2CB61B58D96D%7d&NRORIGINALURL=%2finfo%2fglossary%2easp&NRCACHEHINT=NoModifyGuest#scnt•http://www.accessexcellence.org/WN/SUA12/mouseclub798.php•http://www.nature.com/nature/journal/v394/n6691/full/394369a0.html•http://www.nature.com/news/1998/980730/full/news980730-1.html•http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/5098286.stm•http://library.thinkquest.org/24355/data/details/media/honoluluanim.html•http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech/biotechnology/cloning/index.htm•Applicazioni terapeutiche 1http://medgadget.com/archives/2008/06/t_cell_cloning_as_potential_cancer_treatment.htmlhttp://salute.aduc.it/staminali/articolo/cosa+sono+cellule+staminali+perche+clonazione_6895.php•Applicazioni terapeutiche 2•http://www.canada.com/health/Canadian+scientists+transform+human+skin+into+blood/3793787/story.html#ixzz16UPmTqz3•http://www.nature.com/news/2010/101107/full/news.2010.588.html•http://www.universonline.it/_scienza/articoli_med/06_03_02_a.php•http://www.physorg.com/news/2010-11-scientists-skin-blood.html